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JP2010536367A - 癌関連遺伝子、ｃｄｃａ５、ｅｐｈａ７、ｓｔｋ３１及びｗｄｈｄ１ - Google Patents

癌関連遺伝子、ｃｄｃａ５、ｅｐｈａ７、ｓｔｋ３１及びｗｄｈｄ１ Download PDF

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Abstract

本発明は、正常な器官に比べて、過剰に発現した遺伝子；ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１を用いて、癌、特に肺癌及び／又は食道癌を検出する方法を特徴とする。また、癌におけるＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１の過剰発現又は生物活性、特にＥＰＨＡ７とＥＧＦＲとの間の相互作用に基づき、癌を治療及び予防する化合物を同定する方法も開示する。また、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子に対する二本鎖分子を投与することによって癌を治療する方法を特徴とする。本発明は、この提供する方法で有用である、二本鎖分子及びこれらをコードするベクター、並びに分子又はベクターを包含する組成物を含む製品も特徴とする。

Description

本発明は、生物科学分野、より具体的には癌研究の分野に関する。特に本発明は、癌を検出及び診断する方法と、癌を治療及び予防する方法とに関する。さらに本発明は、癌を治療及び予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法に関する。
本願は、２００７年８月２４日付で出願された米国仮特許出願第６０／９５７，９３４号、及び２００７年１０月３日付で出願された米国仮特許出願第６０／９７７，３３５号の利益を主張するものである。双方の特許出願の内容全体は、あらゆる観点で参照により本明細書中に援用される。
肺癌及び食道癌
肺、食道及び鼻咽頭の癌を含む気道消化管癌は、日本における全ての癌死の４分の１近くを占める。肺癌は、世界における癌関連死の主因であり、１年で１３０万人の患者が亡くなっている（WHO Cancer World Health Organization. 2006）。主に組織学的に異なる２種類の癌である、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）とで病態生理学的特徴と臨床特徴とが異なる。ＮＳＣＬＣは肺癌の８０％近くを占める一方で、ＳＣＬＣは肺癌の２０％を占める（Morita T & Sugano H. Acta Pathol Jpn. 1990 Sep;40（9）:665-75、Simon GR, et al., Chest. 2003 Jan;123（1 Suppl）:259S-271S）。様々な治療モダリティ、例えば放射線療法及び化学療法と組み合わせて、手術法を採用しているにもかかわらず、肺癌の全体の５年生存率は約１５％と依然として低いままである（Parkin DM. Lancet Oncol. 2001 Sep;2（9）:533-43）。食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）は、消化管の最も致死的な悪性腫瘍の１つであり、肺癌の全体の５年生存率はわずか１５％である（Shimada H, et al., Surgery. 2003 May;133（5）:486-94）。罹患率が最も高い食道癌は、カスピ海東岸部から中国中央部に広がる「アジア食道癌ベルト（Asian esophageal cancer belt）」と呼ばれる地域で報告されてきた（Mosavi-Jarrahi A & Mohagheghi MA. Asian Pac J Cancer Prev. 2006 Jul-Sep;7（3）:375-80）。肺及び食道の癌の発症及び／又は進行に関与する多くの遺伝子変化が報告されているが、正確な分子機構は未だ明らかになっていない（Sozzi G. Eur J Cancer. 2001 Oct;37 Suppl 7:S63-73）。
様々な治療モダリティ、例えば放射線療法及び化学療法と組み合わせて、最新の手術法を用いているにもかかわらず、肺癌及びＥＳＣＣは、悪性腫瘍の中でも最も不良な予後を示すことが分かっている。全ての病期を包含する肺癌患者の５年生存率は依然として１５％に留まり、ＥＳＣＣ患者の５年生存率は１０％〜１６％である（Parkin Dm et al., CA Cancer J Clin 2005; 55:74-108 Global cancer statistics, 2002）。したがって、分子標的作用物質及び抗体、並びに癌ワクチンの開発を含む治療戦略の改善が待ち望まれている。肺癌の分子基盤の理解の増大によって、腫瘍成長及び増殖における特定の鍵となる分子を阻害する標的戦略が特定された。例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＮＳＣＬＣで一般的に過剰発現し、その発現が予後不良と相関付けられることが多い（Brabender J, et al., Clin Cancer Res. 2001 Jul;7（7）: 1850-5）。近年、２つの主分類のＥＧＦＲ阻害剤が開発されている：チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）として作用する低分子、例えばゲフィチニブ及びエルロチニブ；並びにＥＧＦＲの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体、例えばセツキシマブ。上述の標的療法では、ＮＳＣＬＣの予後の改善が期待されたが、その結果は未だ十分ではない。エルロチニブは、プラシーボに比べて生存利益を示し、生存期間の中央値が、プラシーボでは４．７ヶ月であったのに比べて、エルロチニブでは６．７ヶ月であった（Shepherd FA. et al., N Engl J Med. 2005 Jul 14;353（2）: 123-32）。他方では、ゲフィチニブのみが、優れた反応速度と症状制御とを示した（Giaccone G, et al., J Clin Oncol. 2004 Mar 1;22（5）:777-84、Baselga J. J Clin Oncol. 2004 Mar 1;22（5）:759-61）。セツキシマブの場合、現在の第２相データは、ＮＳＣＬＣにおけるこの作用物質の役割について何らかの確定的な結論を出すには十分成熟されていない（Azim HA & Ganti AK. Cancer Treat Rev. 2006 Dec;32（8）:630-6. Epub 2006 Oct 10）。したがって、分子標的作用物質及び抗体、並びに癌ワクチンの開発を含む、有効な治療戦略が待ち望まれている。
腫瘍マーカー
肺癌に現在利用可能な腫瘍マーカー、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、血清シトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ ２１−１）、及びプロガストリン放出ペプチド（ｐｒｏ−ＧＲＰ）は、癌細胞の存在を検出する際に、感度及び特異度が比較的低いため、早期に診断する又は疾患をモニタリングするのには十分ではない（Shinkai T, et al., Cancer. 1986 Apr 1;57（7）: 1318-23、Pujol JL, et al., Cancer Res. 1993 Jan 1;53（1）:61-6）。同様に、食道癌に現在利用可能な腫瘍マーカー、例えば扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、血清シトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ ２１−１）は、早期に診断する又は疾患をモニタリングするのには十分ではない。肺及び食道の腫瘍形成に関与する正確な経路は依然として明らかになっていないが、幾つかの証拠は、腫瘍細胞が特定の分化段階で各組織型に特有の細胞表面マーカーを発現することを示している（Mahomed F, et al., Oral Dis. 2007 Jul;13（4）:386-92）。細胞表面タンパク質が免疫機構及び薬剤送達系により到達しやすいと考えられるため、癌特異的細胞表面タンパク質及び分泌タンパク質の同定は、有効な診断マーカー及び治療戦略の開発への効果的なアプローチとなる。
ｃＤＮＡマイクロアレイ解析
ｃＤＮＡマイクロアレイでの数千の遺伝子の発現レベルの系統的解析は、発癌経路に関与する分子を同定するのに効果的なアプローチであり、これらの遺伝子又はそれらの製品の幾つかが、疾患の信頼性のある指標である有効な抗癌剤及び腫瘍マーカーの開発に対する標的となる。かかる分子を単離するために、本発明者らは、レーザーマイクロダイセクション（laser microdissection：レーザー顕微解剖）によって調製された腫瘍細胞の純粋集団を用いて、肺癌及びＥＳＣＣの全ゲノム発現プロファイルを解析している（Kikuchi T, et al., Oncogene. 2003 Apr 10;22（14）:2192-205、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May; 1（7）:485-99、Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13（24）:3029-43. Epub 2004 Oct 20、Kikuchi T, et al., Int J Oncol. 2006 Apr;28（4）:799-805、Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29（3）:567-75、Yamabuki T, et al., Int J Oncol. 2006 Jun;28（6）: 1375-84）。
ｓｉＲＮＡ
例えば近年、遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを用いた癌治療の新規のアプローチが臨床試験で試みられてきた（Bumcrot D et al., Nat Chem Biol 2006 Dec, 2（12）: 711-9）。ＲＮＡｉは既に、主要な技術基盤の中での地位を確立している（Putral LN et al., Drug News Perspect 2006 Jul-Aug, 19（6）: 317-24、Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 Jul, 5（7）: 528-9、Dykxhoorn DM et al., Gene Ther 2006 Mar, 13（6）: 541-52）。それにもかかわらず、ＲＮＡｉを臨床用途に適用することができるようになるには、取り組む必要がある課題が幾つかある。これらの課題には、ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮＡの安定性不足（Hall AH et al., Nucleic Acids Res 2004 Nov 15, 32（20）: 5991-6000, Print 2004、Amarzguioui M et al., Nucleic Acids Res 2003 Jan 15, 31（2）: 589-95）、作用物質としての毒性（Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 Jul, 5（7）: 528-9）、送達様式、用いるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの正確な配列、及び細胞型の特異度が含まれる。
部分的に相同な遺伝子のサイレンシング、又はインターフェロン反応を活性化することによる普遍的遺伝子抑制の導入に関連する毒性が存在する可能性があることは既知である（Judge AD et al., Nat Biotechnol 2005 Apr, 23（4）: 457-62, Epub 2005 Mar 20、Jackson AL & Linsley PS, Trends Genet 2004 Nov, 20（11）: 521-4）。そのため、悪性の副作用がない、癌特異的遺伝子を標的とする二本鎖分子が抗癌剤の開発には必要である。
遺伝子機能
（１）ＣＤＣＡ５
細胞周期制御タンパク質であるＣＤＣＡ５は、姉妹染色分体接着の調節因子として同定された。この３５ｋＤａのタンパク質は、Ｇ１期において後期促進複合体（ＡＰＣ）依存性のユビキチン化を通して分解する。これまでの研究によって、ＣＤＣＡ５が、クロマチン上のコヒーシン（cohesin）と相互作用し、また間期に姉妹染色分体接着を支持するように機能することが示されている。姉妹染色分体は通常、ほとんどのＧ２期細胞でさらに分離し、このことはＳ期において既に、接着の樹立にＣＤＣＡ５が必要であることを示している（Schmitz J, et al., Curr Biol. 2007 Apr 3;17（7）:630-6. Epub 2007 Mar 8）。今までのところ、接着樹立に特に必要となる他のタンパク質が１つだけ知られている：出芽酵母アセチルトランスフェラーゼＥｃｏ１／Ｃｔｆ７（Skibbens RV, et al., Genes Dev. 1999 Feb l;13（3）:307-19; Toth A, et al., Genes Dev. 1999 Feb 1;13（3）:320-33、Ivanov D, et al., Curr Biol. 2002 Feb 19;12（4）:323-8）。また、ショウジョウバエ（Drosophila）及びヒトの細胞における接着には、この酵素の相同体も必要となるが（Williams BC, et al., Curr Biol. 2003 Dec 2;13（23）:2025-36、Hou F & Zou H. Mol Biol Cell. 2005 Aug;16（8）:3908-18. Epub 2005 Jun 15）、これらのタンパク質がＳ期でも機能するか否かは未だ分かっていない。したがって、ＣＤＣＡ５及びＥｃｏ１／Ｃｔｆ７相同体が癌細胞での接着を樹立するのに共働するか否かを検討することが目的となる。
姉妹染色分体接着は、効果的に正確な染色体分離を確実にするために、細胞周期の適切な時点で樹立及び解体しなければならない。ＡＰＣＣｄｃ２０の活性化が、分解に関して、後期阻害剤のセクリンを標的とすることによって接着の崩壊を制御することがこれまでに示されてきた。このことが、Ｓｃｃ１／Ｒａｄ２１のセパラーゼ依存性開裂を可能にし、後期を誘発する。ＡＰＣのほとんどの細胞周期基質の分解は、それらの機能に関して論理的であり、分解は、活性が早くから存在するのを防ぎ、ラチェット様で、細胞周期の進行を促進する。
ＣＤＣＡ５の機能はまた、接着を調節する他の因子の機能と重複しており、それらの複合活性が確実に染色体を複製及び分離させる（Rankin S, et al., Mol Cell. 2005 Apr 15; 18（2）: 185-200）。また本発明者らのマイクロアレイデータによると、ＡＰＣ及びＣＤＣ２０は肺癌及び食道癌で強く発現するが、正常な組織でのこれらの発現は低い。さらにＣＤＣ２０は、半定量ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学解析を用いて、臨床小細胞肺癌での発現が強いことが確認された（Taniwaki M, et al, Int J Oncol. 2006 Sep;29（3）:567-75）。
これらのデータは、ＣＤＣＡ５がＣＤＣ２０と共に、細胞周期の進行を促進することによって癌細胞の成長を促進するという結論に一致するが、これらの分子がＣＤＣＡ５と直接相互作用することができることを示す証拠はない。このタンパク質は、間期細胞の核に局在し、有糸分裂の際に染色分体から分散し、後期に接着複合体と相互作用する（Rankin S, et al., Mol Cell. 2005 Apr 15;18（2）:185-200）。ＣＤＣＡ５は、染色分体の接着の安定結合と、間期における姉妹染色分体接着とに必要であることが報告された（Schmitz J, et al., Curr Biol. 2007 Apr 3;17（7）:630-6. Epub 2007 Mar 8）。これらの生物学的研究にもかかわらず、本発明以前に、ヒトの発癌におけるＣＤＣＡ５の活性化の重要性と、診断標的及び治療標的としてのその使用とに対する報告はない。
（２）ＥＰＨＡ７
ＥＰＨ受容体は、最も大きい群の受容体チロシンキナーゼを含み、発達中の組織と成熟組織とにおける広範な細胞型に見られる。ＥＰＨタンパク質の顕著な一機能には、細胞の位置確立、及び細胞構成の維持が含まれる。中枢神経系の多くの発達中の領域において、ＥＰＨ受容体及びエフリンは、相補的パターンの発現を示す（Murai KK & Pasquale EB. J Cell Sci. 2003 Jul 15;116（Pt 14）:2823-32）。ＥＰＨ受容体は、これらの対応するリガンドの性質と、それらの配列相同性とに基づき、２つの群に分けられている：ＥｐｈＡ受容体及びＥｐｈＢ受容体（Eph Nomenclature Committee, 1997）。
ヒトゲノムで見出される全ての受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の中で、Ｅｐｈ受容体ファミリーは、１３個の成員を有し、最も大きいファミリーを構成する。ＥＰＨ受容体は、配列相同性及びリガンド親和性に基づき、８つの成員（ＥＰＨＡ１〜ＥＰＨＡ８）を含有するＡサブクラスと、哺乳動物で５つの成員（ＥＰＨＢ１〜ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６）を含有するＢサブクラスとに分けられる。これらのリガンドであるエフリンは、２つのサブクラスである、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞膜と繋がるＡサブクラス（エフリンＡ１〜エフリンＡ５）と、その成員が膜貫通ドメインを有し、その後に短い細胞質領域が続くＢサブクラス（エフリンＢ１〜エフリンＢ３）とに分けられる（Kullander K & Klein R. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002 Jul;3（7）:475-86）。
ＥＰＨ／エフリン軸に関して、幾つかのシグナル伝達経路が知られている。例えば、ＥＰＨＡ４はＪＡＫ／Ｓｔａｔ経路に関与する（Lai KO, et al., J Biol Chem. 2004 Apr 2;279（14）: 13383-92. Epub 2004 Jan 15）、またＥＰＨＢ４受容体シグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ経路を介して内皮細胞の移動及び増殖を媒介する（Steinle JJ, et al., J Biol Chem. 2002 Nov 15;277（46）:43830-5. Epub 2002 Sep 13）。さらに、ＥＰＨ／エフリン軸は、ＲａｓファミリーのＲｈｏシグナル伝達又は小ＧＴＰアーゼの活性を調節する（Lawrenson ID, et al., J Cell Sci. 2002 Mar 1;115（Pt 5）:1059-72: Murai KK & Pasquale EB. J Cell Sci. 2003 Jul 15;116（Pt 14）:2823-32）。
細胞増殖及び形質転換に関するシグナル伝達経路におけるＥＰＨ受容体ファミリータンパク質の重要性に関して幾つかの報告があるにもかかわらず、ＥＰＨＡ７が四肢発生中に、神経系で発現されるという報告しかなかった（Salsi V & Zappavigna V. J Biol Chem. 2006 Jan 27;281（4）: 1992-9. Epub 2005 Nov 28、Rogers JH et al., Brain Res Mol Brain Res. 1999 Dec 10;74（1-2）:225-30、Araujo M & Nieto MA. Mech Dev. 1997 Nov;68（1-2）: 173-7）。ヒト腫瘍においては、Ｅｐｈファミリー遺伝子の中でＥＰＨＡ７に対して余り注意が向けられてこなかったので、ヒト腫瘍学におけるＥＰＨＡ７の役割は明らかではなかった。
（３）ＳＴＫ３１
ＳＴＫ３１は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質キナーゼファミリーの成員であり、Ｎ末端に、ＲＮＡ結合に関与することが知られたチューダードメインと、Ｃ末端に、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼタンパク質キナーゼドメインとを含有する１１５ｋＤａのタンパク質をコードするが、その生理学的機能は依然として明らかになっていない。ＳＴＫ３１は、Ｋｉｎｏｍｅの系統樹によって非常に特徴的なカテゴリに分類される（http://www.cellsignal.com/reference/kinase/kinome.jsp）。ＰＫＲはＳＴＫ３１の構造的相同体と考えられる。
ＰＫＲタンパク質キナーゼはまた、Ｎ末端ドメインを有する二本鎖ＲＮＡと結合し、Ｃ末端Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインを有する。活性化ＲＮＡ及びＡＴＰと結合すると、ＰＫＲは、自己リン酸化反応を受け、真核生物の開始因子２のαサブユニット（ｅｌＦ２α）をリン酸化し、ｅｌＦ２複合体の機能及び翻訳の連続開始を阻害する（Manche L, et al., Mol Cell Biol. 1992 Nov;12（11）:5238-48、Jammi NV & Beal PA. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 15;29（14）:3020-9、Kwon HC, et al., Jpn J Clin Oncol. 2005 Sep;35（9）:545-50. Epub 2005 Sep 7）。
近年、幾つかのセリンスレオニンキナーゼが、癌に良好な治療標的であると考えられている。セリンスレオニンキナーゼの成員に属するタンパク質キナーゼＣβ（ＰＫＣβ）は、致死／難治性の広範な大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）で過剰発現し、抗腫瘍療法に対する標的であることが見出された（Goekjian PG & Jirousek MR. Expert Opin Investig Drugs. 2001 Dec;10（12）:2117-40）。第ＩＩ相試験は、再発性又は難治性のＤＬＢＣＬの患者において、ＰＫＣβの阻害剤であるエンザスタウリンを用いて実施した（Goekjian PG & Jirousek MR. Expert Opin Investig Drugs. 2001 Dec;10（12）:2117-40）。ＳＴＫ３１は、マウスにおいて減数分裂／胚細胞分化に関連することが知られている（Wang PJ, et al., Nat Genet. 2001 Apr;27（4）:422-6、Olesen C, et al., Cell Tissue Res. 2007 Apr;328（1）:207-21. Epub 2006 Nov 25）。しかしながら、本発明以前には、その正確な生理学的機能及び発癌に対するその関連性は知られていなかった。
（４）ＷＤＨＤ１
ＷＤＨＤ１は、高移動度群（ＨＭＧ）ボックスドメインとＷＤ反復ドメインとを有する１１２９アミノ酸タンパク質をコードする。ＨＭＧボックスは良好に保存されており、Ｌ字型に配置された３つのαへリックスから成り、ＤＮＡ副溝（minor groove）と結合する（Thomas JO & Travers AA. Trends Biochem Sci. 2001 Mar;26（3）: 167-74）。ＨＭＧタンパク質は、配列特異的に又は配列非特異的にＤＮＡと結合し、ＤＮＡ屈曲を誘導し、且つクロマチン機能及び遺伝子発現を調節する（Sessa L & Bianchi ME. Gene. 2007 Jan 31;387（1-2）:133-40. Epub 2006 Nov 10）。
一般的に、ＨＭＧタンパク質は、ヌクレオソームと結合し、基礎的な転写機構と相互作用することによって転写を抑制し、転写コアクチベータとして作用し、又は特定の調節因子が転写の活性因子として機能するのか若しくは抑制因子として機能するのかを決定することが知られている（Ge H & Roeder RG. J Biol Chem. 1994 ;269: 17136-40、Paranjape SM, et al., Genes Dev 1995;9: 1978-91、Sutrias-Grau M, et al., J Biol Chem. 1999; 274: 1628-34、Shykind BM, et al., Genes Dev 1995; 9:354-65、Lehming N, et al., Nature 1994;371:175-79）。この広範な機能は一部、ＨＭＧドメインによって与えられたＤＮＡ結合活性に加えて、タンパク質−タンパク質相互作用によっても達成することができる。ＷＤＨＤ１の場合、タンパク質−タンパク質相互作用に関する候補ドメインはＷＤ反復である。
ＷＤ反復タンパク質は、シグナル伝達から細胞周期制御までの範囲の細胞機能に寄与し、真核生物及び原核生物にわたって保護される（Li D & Roberts R. Cell Mol Life Sci. 2001; 58:2085-97）。ＡＮＤ−１は、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインとして一般的に見出された保存ＷＤ反復ドメインと、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞及び様々な他の細胞においてＤＮＡ結合ドメイン又はクロマチン結合ドメインであることが求められたＨＭＧボックスドメインとを有する核タンパク質である（Kohler A, et al., J Cell Sci. 1997 May;110（Pt 9）: 1051-62）。タンパク質のＤＮＡ結合能は、四方向連結（four-way junction）ＤＮＡを用いた、ＤＮＡアフィニティクロマトグラフィと電気泳動移動度シフトアッセイとによって実証された（Kohler A, et al., J Cell Sci. 1997 May;110（Pt 9）: 1051-62）。構造解析によって、ＷＤ反復タンパク質が、四本鎖逆並行βシートから成る幾つかのブレードを備えるプロペラ様構造を形成することが明らかにされた。このβプロペラ様構造は、タンパク質が安定して又は可逆的に結合することができるプラットフォームとして働く（Li D & Roberts R. Cell Mol Life Sci. 2001; 58:2085-97）。タンパク質とＷＤＨＤ１との相互作用の証拠は、ＷＤＨＤ１機能（複数可）を理解するのに役立つ。しかしながら、本発明以前には、ＷＤＨＤ１／ＡＮＤ−１の生理学的機能、及びヒト癌進行におけるＷＤＨＤ１トランス活性化の重要性を明らかにした報告はない。
本発明は、一般的に腫瘍で上方制御される癌関連遺伝子、特にＣＸ遺伝子（ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１を含む）と、ＣＸ遺伝子を用いた癌治療のための分子標的薬物及び癌ワクチンの開発戦略とに関する。
一態様において、本発明は、指標としてＣＸ遺伝子の発現レベル又は生物活性を用いて、癌、例えばＣＸ遺伝子によって媒介される癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）を診断する方法を提供する。本発明は、患者において指標としてＣＸ遺伝子の発現レベル又は生物活性を用いる療法である、癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）の進行を予測する方法も提供する。さらに、本発明は、指標としてＣＸ遺伝子の発現レベル又は生物活性を用いて、患者において癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）の予後を予測する方法を提供する。幾つかの実施の形態では、癌はＣＸ遺伝子によって媒介又は促進される。幾つかの実施の形態では、癌は肺癌及び／又は食道癌である。
別の実施の形態において、本発明は、指標としてＣＸ遺伝子の発現レベル又は生物活性を用いて、癌、例えばＣＸ遺伝子によって媒介される癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）を治療又は予防する作用物質をスクリーニングする方法を提供する。特に、本発明は、指標としてＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチドとの間、又はＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチドとの間の相互作用を用いて、ＣＤＣＡ５を発現する癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）を治療又は予防する作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
さらなる実施の形態において、本発明は、ＣＸ遺伝子、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１に対する二本鎖分子、例えばｓｉＲＮＡを提供し、これは本方法によってスクリーニングされた。本発明の二本鎖分子は、ＣＸ遺伝子によって媒介される癌又はＣＸ遺伝子の過剰発現をもたらす癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）を治療又は予防するのに有用である。そのため本発明はさらに、癌性細胞を、本方法によってスクリーニングされる作用物質、例えばｓｉＲＮＡに接触させることを含む、癌を治療する方法に関する。
肺癌と食道癌と正常組織とにおけるＣＤＣＡ５発現を表す図である。Ａ、半定量ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット法によって試験された肺癌試料におけるＣＤＣＡ５遺伝子の発現。Ｂ、半定量ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット法によって試験された食道癌試料におけるＣＤＣＡ５遺伝子の発現。Ｃ、ＣＯＳ−７細胞における外因性ＣＤＣＡ５タンパク質の局在性。アフィニティ精製した抗ｃ−Ｍｙｃウサギポリクローナル抗体（緑色）ＤＡＰＩ（青色）によって細胞を免疫細胞化学的に染色し、核を識別した（材料及び方法を参照されたい）。Ｄ、様々な正常ヒト組織におけるＣＤＣＡ５転写のノーザンブロット解析。ＣＤＣＡ５は、睾丸でのみ発現された。 肺癌細胞に及ぼすＣＤＣＡ５に対するｓｉＲＮＡの成長阻害効果、及び外因性ＣＤＣＡ５の成長促進効果を表す図である。２つの肺癌細胞株Ａ５４９及びＬＣ３１９に、ＣＤＣＡ５に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした（Ａ、Ｂ）。上部パネル、ｓｉＲＮＡによるＣＤＣＡ５発現のノックダウン効果が半定量ＲＴ−ＰＣＲ解析によって確認された。ＡＣＴＢの発現は転写レベルで定量的対照として働いた。中央パネル、ＣＤＣＡ５に対する特定のオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ（ｓｉ−＃１及びｓｉ−＃２）又は対照オリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたＡ５４９細胞及びＬＣ３１９細胞のコロニー形成アッセイ。下部パネル、対照のものと比較して、ｓｉ−＃１及びｓｉ−＃２の両方に応じてＭＴＴアッセイによって評価されたＡ５４９細胞及びＬＣ３１９細胞の生存率。Ｃ、ＭＴＴアッセイは、モックベクターと比較して、哺乳動物細胞に及ぼすＣＤＣＡ５の成長促進効果を示す。 肺癌及び食道癌と、正常組織とにおけるＥＰＨＡ７発現を表す図である。Ａ、上部パネル、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって試験された臨床肺癌及び正常肺組織におけるＥＰＨＡ７の発現。下部パネル、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって試験された肺癌細胞株におけるＥＰＨＡ７の発現。本発明者らは、定量的対照としてβ−アクチン（ＡＣＴＢ）の発現レベルを採用した、肺癌試料のｍＲＮＡから調製された適当な希釈の各一本鎖ｃＤＮＡを調製した。Ｂ、上部パネル、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって試験された、ＥＳＣＣ及び正常食道組織の臨床試料におけるＥＰＨＡ７の発現。下部パネル、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって試験された、食道癌細胞株におけるＥＰＨＡ７の発現。Ｃ、ノーザンブロット解析によって検出された、正常ヒト組織におけるＥＰＨＡ７の発現。Ｄ、ノーザンブロット解析によって検出された、肺癌細胞及び胎児組織におけるＥＰＨＡ７の発現。Ｅ、免疫組織学的染色（２００倍）によって検出された、正常ヒト組織におけるＥＰＨＡ７タンパク質の発現。Ｆ、上部パネル、ＳＢＣ−３細胞における外因性ＥＰＨＡ７タンパク質の細胞内局在性。下部パネル、ＥＰＨＡ７は、ＥＰＨＡ７のＮ末端に対する抗ＥＰＨＡ７抗体によって、細胞の細胞質及び細胞膜で染色した。ＥＰＨＡ７は、ＥＰＨＡ７のＣ末端に対する抗ＥＰＨＡ７抗体によって、細胞の細胞質及び核で染色した。Ｇ、培養培地の免疫細胞化学法及びＥＬＩＳＡによって試験された、ＥＰＨＡ７陽性肺癌細胞株及び陰性肺癌細胞株におけるＥＰＨＡ７タンパク質の発現レベル。 肺癌組織及び食道癌組織におけるＥＰＨＡ７タンパク質の発現を表す図である。Ａ、肺癌組織及び食道癌組織を用いた、ＥＰＨＡ７タンパク質発現の免疫組織学的評価。左側のパネル、免疫組織化学的染色によって検出され、正常な肺では発現されない、ＳＣＬＣ、肺ＡＤＣ及び肺ＳＣＣにおけるＥＰＨＡ７の発現（上部１００倍、下部２００倍）。陽性染色は主に細胞質及び細胞膜で現れた。右側のパネル、免疫組織化学的染色によって検出され、正常な食道では発現されない、ＥＳＣＣにおけるＥＰＨＡ７の発現（上部１００倍、下部２００倍）。Ｂ、ＥＰＨＡ７過剰発現と、ＮＳＣＬＣ患者での臨床転帰の不良との関連性。ＥＰＨＡ７発現に従った、ＮＳＣＬＣ患者における腫瘍特異的な生存率のカプラン・マイヤー解析（Ｐ＝０．００６、ログランク検定）。Ｃ、ＥＰＨＡ７過剰発現と、ＥＳＣＣ患者での臨床転帰の不良との関連性。ＥＰＨＡ７発現に従った、ＮＳＣＬＣ患者における腫瘍特異的な生存率のカプラン・マイヤー解析（Ｐ＝０．０２６３、ログランク検定）。 ＥＰＨＡ７の血清レベルを表す図である。Ａ、肺癌患者、食道癌患者及び子宮頸癌患者と、ＣＯＰＤ患者及び健常なドナーとにおけるＥＰＨＡ７の血清レベル。Ｂ、左側のパネル、これらの４３９人の癌（ＮＳＣＬＣ＋ＳＣＬＣ＋ＥＳＣＣ）患者と１２７人の健常な対照とのデータによって示された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。右側のパネル、原発腫瘍の外科的切除の前後における血清ＥＰＨＡ７の濃度。Ｃ、上部パネル、ＥＰＨＡ７及びＣＥＡのＲＯＣ曲線。下部パネル、ＥＰＨＡ７及びＰｒｏＧＲＰのＲＯＣ曲線。 ＥＰＨＡ７の成長促進効果及び浸潤効果を表す図である。Ａ、左側及び右側のパネル、ＥＰＨＡ７に対するｓｉＲＮＡによるＮＣＩ−Ｈ５２０細胞又はＳＢＣ−５細胞の成長阻害。半定量ＲＴ−ＰＣＲによって解析された、癌細胞におけるｓｉ−ＥＰＨＡ７又は対照のｓｉＲＮＡに応じたＥＰＨＡ７の発現（上部パネル）。ＥＰＨＡ７に特異的なｓｉＲＮＡ又は対照のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞のコロニー形成アッセイ（中央パネル）。ｓｉ−ＥＰＨＡ７又は対照のｓｉＲＮＡに応じた、ＭＴＴアッセイによって評価された細胞生存率（下部パネル）。全てのアッセイを３回、３重のウェルで実施した。 ＥＰＨＡ７に対する下流標的としてのＥＧＦＲ、ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ、及びＣＤＣ２５のリン酸化を表す図である。Ａ、ＥＰＨＡ７発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に及ぼすＥＰＨＡ７の成長促進効果。上部パネル、ウェスタンブロット法によって検出されたＣＯＳ−７細胞におけるＥＰＨＡ７の一時的発現。下部パネル、ＣＯＳ−７細胞の細胞生存率をＭＴＴアッセイで測定した。Ｂ、ヒトＥＰＨＡ７に対する発現プラスミドのトランスフェクション後のマトリゲルマトリクスにおけるＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＣＯＳ−７細胞の浸潤性を示すアッセイ。最上部のパネル、ウェスタンブロット法によって検出されたＣＯＳ−７細胞及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＥＰＨＡ７の一時的発現。中央及び下部のパネル、ギムーザ染色（１００倍）、及びマトリゲルコーティングフィルタを通って移動する細胞の相対数。アッセイを３回、３重のウェルで実施した。 Ａ、ＥＧＦＲのＴｙｒ−８４５、ＰＬＣγのＴｙｒ−７８３、及びＣＤＣ２５のＳｅｒ−２１６は、ＥＰＨＡ７発現ベクターをトランスフェクトした細胞において、モックベクターをトランスフェクトした細胞と比較して強くリン酸化した。Ｂ、免疫沈降実験による内因性ＥＧＦＲと外因性ＥＰＨＡ７との間の類似の相互作用。 腫瘍試料及び正常組織におけるＳＴＫ３１の発現を表す図である。Ａ、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって検出された、正常肺組織と、１５個の臨床肺癌試料（肺ＡＤＣ、肺ＳＣＣ、及びＳＣＬＣ、上部パネル）と、２３個の肺癌細胞株（下部パネル）とにおけるＳＴＫ３１の発現。Ｂ、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって検出された、正常食道と、１０個の臨床ＥＳＣＣ組織試料と、１０個のＥＳＣＣ細胞株とにおけるＳＴＫ３１の発現。Ｃ、ＮＣＩ−Ｈ２１７０の肺癌細胞における内因性ＳＴＫ３１タンパク質の細胞内局在性。ＳＴＫ３１は、癌細胞の細胞質及び核で染色された。Ｄ、２３個の正常な成人ヒト組織におけるＳＴＫ３１転写のノーザンブロット解析。強いシグナルが睾丸で観察された。 正常ヒト組織におけるＳＴＫ３１タンパク質の発現、及びＳＴＫ３１過剰発現とＮＳＣＬＣ患者での予後不良との関連性を表す図である。Ａ、正常組織（心臓、肺、腎臓、肝臓、睾丸）におけるＳＴＫ３１の発現。Ｂ、肺癌組織及び正常な肺組織における陽性及び陰性のＳＴＫ３１発現の例（元の倍率１００倍）。Ｃ、ＳＴＫ３１発現に従った、ＮＳＣＬＣ患者の生存率のカプラン・マイヤー解析（Ｐ＝０．０１７８、ログランク検定）。 ＳＴＫ３１に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長抑制、及び外因性ＳＴＫ３１の成長促進効果を表す図である。Ａ、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって解析された、ＬＣ３１９細胞におけるｓｉ−ＳＴＫ３１−＃１、ｓｉ−ＳＴＫ３１−＃２、又は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＰ及びｓｉ−ＬＵＣ）に応じた遺伝子ノックダウン効果。Ｂ、Ｃ、特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞又は対照のコロニー形成及びＭＴＴアッセイの結果。バー、３重アッセイのＳＤ。Ｄ、上部パネル、ウェスタンブロット解析によって検出された、ＣＯＳ−７細胞におけるＳＴＫ３１の一時的発現。下部パネル、ＭＴＴアッセイは、モックベクターと比較して、ＳＴＫ３１の一時発現の成長促進効果を示す。 ＳＴＫ３１組換えタンパク質のキナーゼ活性、及びＳＴＫ３１の下流標的を表す図である。Ａ、基質としてＳＴＫ３１キナーゼのＧＳＴ融合組換えタンパク質とＭＢＰとを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施した。リン酸化ＭＢＰを検出した。Ｂ、ウェスタンブロット解析によって検出された、ＣＯＳ−７細胞におけるＳＴＫ３１の一時的発現の後のＥＧＦＲ（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）及びＥＲＫ（ＥＲＫ１／２、Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のリン酸化レベル。Ｃ、組換えＳＴＫ３１とＣＯＳ−７細胞から調製された全抽出物とを用いて実施されたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ。ＳＴＫ３１によって誘導されるＥＲＫ（ＥＲＫ１／２、Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）のリン酸化は用量依存的に検出された。Ｄ、ウェスタンブロット解析によって検出された、ＣＯＳ−７細胞におけるＳＴＫ３１の一時的発現の後のＭＥＫ（ＭＥＫ１／２）（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）のリン酸化レベル。Ｅ、ＳＴＫ３１発現がＳＴＫ３１に対するｓｉＲＮＡによってノックダウンされた場合のＥＲＫ１／２及びＭＥＫ１／２の脱リン酸化。Ｆ、ＳＴＫ３１とＭＡＰＫカスケードとの相互作用。 肺癌組織と、食道癌組織と、正常組織とにおけるＷＤＨＤ１の発現を表す図である。Ａ、半定量ＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出された、正常肺組織と、１５個の臨床肺癌試料（肺ＡＤＣ、肺ＳＣＣ、及びＳＣＬＣ、上部パネル）と、２３個の肺癌細胞株（下部パネル）とにおけるＷＤＨＤ１の発現。Ｂ、半定量ＲＴ−ＰＣＲ解析によって検出された、正常食道と、１０個の臨床ＥＳＣＣ組織試料と、１０個のＥＳＣＣ細胞株とにおけるＷＤＨＤ１の発現。Ｃ、ウェスタンブロット解析によって試験された、５つの肺癌細胞株と４つの食道癌細胞株とにおけるＷＤＨＤ１タンパク質の発現。Ｄ、ＬＣ３１９細胞における内因性ＷＤＨＤ１タンパク質の細胞内局在性。ＷＤＨＤ１は、細胞周期を通して核で強く、細胞質で弱く染色された。有糸分裂期では、ＷＤＨＤ１は有糸分裂クロマチンで染色された。 正常組織におけるＷＤＨＤ１の発現、及びＷＤＨＤ１過剰発現とＮＳＣＬＣ患者及びＥＳＣＣ患者での予後不良との関連性を表す図である。Ａ、２３個の正常な成人ヒト組織におけるＷＤＨＤ１転写のノーザンブロット解析。強いシグナルが睾丸で観察された。Ｂ、肺癌におけるＷＤＨＤ１タンパク質発現を伴う、５つの正常組織（肝臓、心臓、腎臓、肺及び睾丸）におけるＷＤＨＤ１タンパク質発現の免疫組織化学的解析。ＷＤＨＤ１は睾丸（主に一次精母細胞の核及び／又は細胞質）並びに肺癌で十分に発現されたが、その発現は残りの４つの正常組織ではほとんど検出することができなかった。Ｃ、Ｄ、ＷＤＨＤ１と予後不良との関連性。上部パネル、肺癌組織におけるＷＤＨＤ１発現の陽性及び陰性の染色の例（元の倍率１００倍）；Ｃ、肺ＳＣＣ、Ｄ、ＥＳＣＣ。下部パネル、ＷＤＨＤ１発現に従った、ＮＳＣＬＣ患者（Ｃ、Ｐ＝０．０２０８、ログランク検定）及びＥＳＣＣ（Ｄ、Ｐ＝０．０２８５、ログランク検定）の生存率のカプラン・マイヤー解析。 ＷＤＨＤ１の成長促進効果を示す図である。Ａ、Ｂ、ＷＤＨＤ１に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞株Ａ５４９（Ａ、左側のパネル）と、肺癌細胞株ＬＣ３１９（Ａ、右側のパネル）と、食道癌細胞株ＴＥ９（Ｂ）の成長阻害。最上部、ＲＴ−ＰＣＲによって解析された、２つのｓｉ−ＷＤＨＤ１（ｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃１及びｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃２）と、２つの対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＰ及びｓｉ−ＳＣＲ）によるＡ５４９細胞、ＬＣ３１９細胞及びＴＥ９細胞におけるＷＤＨＤ１タンパク質発現に及ぼす遺伝子ノックダウン効果。中央及び下部のパネル、ｓｉ−ＷＤＨＤ１又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞、ＬＣ３１９細胞及びＴＥ９細胞のコロニー形成及びＭＴＴアッセイ。カラム、３重のアッセイの相対的吸光度；バー、ＳＤ。Ｃ、ｓｉ−ＷＤＨＤ１で処理したＮＳＣＬＣ細胞のフローサイトメトリ解析。ＬＣ３１９細胞に、ｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃２をトランスフェクトし、フローサイトメトリ解析のためにトランスフェクトの７２時間後に回収した。パネル以外の数は、各相での総細胞の割合を示す。Ｄ、ＷＤＨＤ１発現プラスミドを一時的にトランスフェクトした哺乳動物細胞の成長増大。ｈＷＤＨＤ１に関する発現プラスミドをトランスフェクトした後のＣＯＳ−７細胞の成長性を示すアッセイ。ｈＷＤＨＤ１又は対照プラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞のＭＴＴアッセイを実施した。Ｅ、Ｆ、ｓｉ−ＷＤＨＤ１をトランスフェクトしたＮＳＣＬＣ細胞のフローサイトメトリ解析。Ａ５４９細胞にｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃２又はｓｉ−ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）をトランスフェクトし、フローサイトメトリのために２４時間、４８時間及び７２時間後に回収した（Ｅ）。ｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃２又はｓｉ−ＬＵＣをトランスフェクトしたＡ５４９細胞をＧ０／Ｇ１期で同期させ、フローサイトメトリのために細胞周期放出の０時間、４．５時間及び９時間後に回収した（Ｆ）。パネル以外の数は、各相での細胞の割合を示す。Ｇ、ｓｉ−ＷＤＨＤ１で処理したＮＳＣＬＣ細胞の低速度画像解析。Ａ５４９細胞にｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃２又はｓｉ−ルシフェラーゼをトランスフェクトし、３０分毎に画像を取り込んだ。１２時間毎の細胞の外観を示す（２４時間〜１０８時間）。Ｈ、ＷＤＨＤ１ノックダウンによって誘導された有糸分裂異常（failure）及び細胞死。 ＰＩ３Ｋシグナル伝達を通したリン酸化によるＷＤＨＤ１安定性の調節を表す図である。Ａ、セリン残基及びチロシン残基でのＷＤＨＤ１のリン酸化。左側のパネル、λ−ホスファターゼでの処理によるＡ５４９細胞における内因性ＷＤＨＤ１タンパク質の脱リン酸化。右側のパネル、セリン残基及びチロシン残基でのＷＤＨＤ１のリン酸化は、抗ＷＤＨＤ１抗体での免疫沈降、その後のパン−ホスホ（pan-phospho）特異的抗体による免疫ブロット法によって示された。Ｂ、細胞周期を通してのＷＤＨＤ１タンパク質の発現。ＬＣ３１９細胞は、Ｇ０／Ｇ１期で、２４時間、１％ＦＢＳと、４μｇ／ｍｌのアフィジコリンとを含有するＲＰＭＩ１６４０に同期させ、アフィジコリンの除去によってＧ１期停止から開放された（released）。フローサイトメトリ解析（上部パネル）及びウェスタンブロット法（下部パネル）は、アフィジコリンの除去の０時間、４時間及び９時間（ｈ）後に実施した。Ｃ、またＡ５４９細胞は、Ｇ０／Ｇ１期で、１８時間、１％ＦＢＳと、１μｇ／ｍｌのアフィジコリンとを含有するＲＰＭＩ１６４０に同期させ、アフィジコリンの除去によってＧ１期停止から開放された。フローサイトメトリ解析（上部パネル）及びウェスタンブロット法（下部パネル）は、アフィジコリンの除去の０時間、２時間、４時間、６時間及び８時間（ｈ）後に実施した。Ｄ、ＬＹ２９４００２を用いたＰＩ３Ｋ阻害によるＷＤＨＤ１タンパク質の還元。２４時間、ＬＣ３１９を０μＭ〜２０μＭの範囲の濃度のＬＹ２９４００２で処理し、ウェスタンブロット解析に利用した。Ｅ、ＡＫＴ１に対するｓｉＲＮＡを用いたＡＫＴ１阻害によるＷＤＨＤ１タンパク質の還元。ＬＣ３１９にＡＫＴ１又はＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、ウェスタンブロット解析に利用した。Ｆ、Ｇ、ＡＫＴ１によるＷＤＨＤ１タンパク質のリン酸化。ＷＤＨＤ１の免疫沈降体を、抗ホスホＡＫＴ基質（ＰＡＳ）抗体で検出した（Ｆ）。組換えヒトＡＫＴ１（ｒｈＡＫＴ１）によるＷＤＨＤ１タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化（Ｇ）。Ｈ、Ｉ、ＡＫＴ１によるＷＤＨＤ１タンパク質におけるセリン−３７４のリン酸化状態。セリン３７４をアラニンに置き換えた（Ｓ３７４Ａ）ＷＤＨＤ１の免疫沈降体をＰＡＳ抗体で免疫ブロットし（Ｈ）、ｒｈＡＫＴ１を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイに適用した（Ｉ）。 ＣＤＣ２及びＥＲＫによるＣＤＣＡ５のｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化を表す図である。Ａ、ＣＤＣ２及びＥＲＫに対するＣＤＣＡ５におけるコンセンサスリン酸化部位。上部パネル、他の種の相同体とのＣＤＣ２（Ｓ／Ｔ−Ｐ−ｘ−Ｒ／Ｋ）に対するヒトＣＤＣＡ５のリン酸化部位の相同性（アミノ酸残基６８〜８２）。中央及び下部のパネル、他の種の相同体とのＥＲＫ（ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ）に対するリン酸化部位の相同性（アミノ酸残基７６〜８６及び１０９〜１２２）。Ｂ、Ｃ、ＣＤＣ２及びＥＲＫによるＣＤＣＡ５のｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化。Ｄ、ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化ＣＤＣＡ５のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光解析。８つの部位をＥＲＫによって直接リン酸化することで同定し、３つの部位がＣＤＣ２依存性リン酸化部位であることを求めた。 培養細胞におけるＣＤＣＡ５でのＥＲＫ依存性リン酸化部位の同定を表す図である。Ａ、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６を用いて又は用いずにＥＧＦ刺激した後、内因性ＣＤＣＡ５をＨｅｌａ細胞においてＥＲＫによってリン酸化した。Ｂ、Ｈｅｌａ細胞では、外因性ＣＤＣＡ５を、ＥＧＦ刺激で酸性ｐＩ値に移行させた。しかしながら、ＣＤＣＡ５を細胞においてＵ０１２６処理で阻害し、非処理細胞でのスポットパターンのようにした。 培養細胞におけるＣＤＣＡ５でのＣＤＫ１／ＣＤＣ２依存性リン酸化部位の同定を表す図である。Ａ、肺癌細胞株Ａ５４９及び肺癌細胞株ＬＣ３１９をアフィジコリン処理によってＧ１／Ｓ期で同期した。Ｇ１／Ｓ期から開放された後、細胞周期を通しての内因性ＣＤＣＡ５タンパク質のリン酸化をウェスタンブロット法によって検出した。Ｂ、ＴＥ８細胞株をアフィジコリンによってＧ１／Ｓ期で同期した。細胞を１２時間２時間毎に回収した。有糸分裂が終わる（exit）のを防ぐために、Ｇ１／Ｓ期からの開放の５時間後にノコダゾールを添加した。同時に、ＣＤＫ１／ＣＤＣ２阻害剤を添加した。Ｃ、非標識野生型ＣＤＣＡ５とＳ２１Ａ、Ｓ７５Ａ及びＴ１５９Ａアラニン置換体とをＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。Ｇ１／Ｓ期からの開放の２４時間後、ノコダゾールで同期させた。Ｄ、内因性ＣＤＣＡ５を、ノコダゾール処理した食道癌細胞株ＴＥ８と、小細胞肺癌細胞株ＳＢＣ３とに移した。Ｅ、有糸分裂同期のためにノコダゾールを使用しながら、Ｇ１／Ｓ期からの開放の５時間後に、ＴＥ８細胞株を１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭのＣＤＫ１／ＣＤＣ２阻害剤ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎで処理した。 ＥＰＨＡ７に対する新規の相互作用タンパク質としてのＥＧＦＲ及びＭＥＴの同定を表す図である。Ａ、Ｂ、ＥＰＨＡ７相互作用タンパク質としてのＭＥＴの同定。ＣＯＳ−７細胞由来の抽出物は、ＥＰＨＡ７、ＭＥＴを外因的に発現し、及び／又はモックベクターを抗ｍｙｃアガロース又は抗Ｆｌａｇアガロースのいずれかで免疫沈降し、抗Ｆｌａｇ抗体又は抗ｍｙｃ抗体で免疫ブロットした。同じ膜を剥離し、再び免疫ブロットすることによる免疫沈降の効率評価のために、免疫沈降と同じ抗体で免疫ブロット法を実施した。ＩＰ、免疫沈降；ＩＢ、免疫ブロット法。Ｃ、Ｄ、ＥＰＨＡ７相互作用タンパク質としてのＥＧＦＲの同定。ＩＰ、免疫沈降；ＩＢ、免疫ブロット法。Ｅ、肺癌細胞におけるＥＰＨＡ７タンパク質、ＥＧＦＲタンパク質及びＭＥＴタンパク質の発現プロファイル。ＡＣＴＢ、βアクチン。 ＥＰＨＡ７キナーゼによるＥＧＦＲ及びＭＥＴのチロシンリン酸化を示す図である。Ａ、組換えＥＧＦＲ及びＭＥＴの概略図。数字はアミノ酸の数を示す。ＴＭ、膜貫通障害（transmembrane lesion）。Ｂ、組換えＥＰＨＡ７及びＥＧＦＲを用いた後に、抗パン−ホスホＴｙｒ抗体で免疫ブロットしたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ。＃１、＃２及び＃３は、Ａで示される全細胞質領域ＥＧＦＲと部分断片ＥＧＦＲとを示す。矢尻、細胞質領域ＥＧＦＲのリン酸化。矢印、＃３ ＥＧＦＲのリン酸化。Ｃ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いたＥＰＨＡ７及びＥＧＦＲのｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ。矢印、＃３ ＥＧＦＲのリン酸化。Ｄ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いたＥＰＨＡ７及びＭＥＴのｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ。矢尻、細胞質領域ＭＥＴのリン酸化。Ｅ、ＥＰＨＡ７を外因的に発現するＣＯＳ−７細胞におけるＥＧＦＲ／ＭＥＴリン酸化の増大。全ての抽出物は、ベクター又はモックベクターを発現するＥＰＨＡ７のトランスフェクションの４８時間後に得られた。 ＥＰＨＡ７による細胞増殖／生存シグナル伝達に重要である、ＥＧＦＲ及びＭＥＴの下流（downstream）の増大を表す図である。全ての抽出物は、ベクター又はモックベクターを発現するＥＰＨＡ７のトランスフェクションの４８時間後に得られた。
定義
単語「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、本明細書中で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも１つの」を意味する。
物質（例えばポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に対して使用される「単離（isolated）」及び「精製（purified）」という用語は、物質が、天然源に包含され得る少なくとも１つの物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離又は精製抗体は、細胞材料、例えば炭水化物、脂質若しくは細胞由来の他の夾雑タンパク質又はタンパク質（抗体）の由来となる組織源を実質的に含まないか、又は化学合成の際の化学前駆体若しくは他の化学物質を含まない抗体を表す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、ポリペプチドの調製を含み、このポリペプチドは、該ポリペプチドが細胞から単離又は組換え生成される細胞の細胞成分から分離される。
したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、異種タンパク質（本明細書で「夾雑タンパク質」とも称される）を約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量）未満しか有しないポリペプチド調製物を含む。ポリペプチドが組換え生成されると、幾つかの実施形態では、培養培地も実質的に含まず、これにはタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、又は５％未満の培養培地しか有しないポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって生成されると、幾つかの実施形態では、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まず、これにはタンパク質調製物の体積の約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満のタンパク質の合成に関与する化学前駆体又は他の化学物質を有するポリペプチド調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が単離又は精製ポリペプチドを含有することは例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の単一バンドの出現と、ゲルのクマシーブリリアントブルー染色等によって示され得る。一実施形態では、本発明の抗体を含むタンパク質が単離又は精製される。
「単離」又は「精製」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技法によって生成される場合、他の細胞材料若しくは培養培地を実質的に含まない可能性があるか、又は化学合成する場合、化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。一実施形態では、本発明のタンパク質をコードする核酸分子が単離又は精製される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は本明細書中でアミノ酸残基の重合体を指すのに互換可能に使用される。該用語は天然アミノ酸重合体に加えて、１つ又は複数のアミノ酸残基が修飾残基であるか、又は対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣体（chemical mimetic）のように天然に存在しない残基であるアミノ酸重合体にも適用される。
「アミノ酸」という用語は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を表す。天然アミノ酸は、遺伝子コードでコードされるもの、並びに細胞における翻訳後に修飾されるもの（例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基及びＲ基と結合したα炭素）を有するが、修飾Ｒ基又は修飾骨格（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチルメチオニンスルホニウム）を有する化合物を表す。「アミノ酸模倣体」という語句は、異なる構造を有するが、一般的なアミノ酸と同様に機能する化学物質を表す。
本明細書では、アミノ酸は一般的に知られる３文字記号、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎで推奨される１文字記号で表すことができる。
特に指定のない限り、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」という用語は本明細書中で互換可能に使用され、一般的に許容される１文字コードで表されるアミノ酸と同様のものである。アミノ酸と同様に、これらの用語は、天然及び非天然の核酸ポリマーの両方を包含する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸又は核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せから成り得る。
本明細書中で使用される場合、「生体試料」という用語は生物体全体又はその組織、細胞又は構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血（amniotic cord blood）、尿、膣液、及び精液を含む（これらに限定されない）体液）のサブセットを指す。「生体試料」という用語はさらに、生物体全体又はその細胞、組織又は構成部分のサブセット、又はその画分若しくは一部分から調製されるホモジネート、可溶化物、抽出物、細胞培養物、又は組織培養物を指す。最後に、「生体試料」は、タンパク質又はポリヌクレオチド等の細胞成分を含有する、生物を繁殖させたニュートリエントブロス又はゲル等の培地を指す。
（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物
本明細書中で互換可能に使用される「癌関連遺伝子（複数可）」、「癌関連ポリヌクレオチド（複数可）」、「ＣＸ遺伝子（複数可）」及び「ＣＸポリヌクレオチド（複数可）」という単語は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子を表す。
本明細書中で使用される「癌関連タンパク質（複数可）」、「癌関連ポリペプチド（複数可）」、「ＣＸタンパク質（複数可）」及び「ＣＸポリペプチド（複数可）」は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子でコードされるタンパク質又はポリペプチドである。
（ｉ）ＣＤＣＡ５
ヒトＣＤＣＡ５遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示し、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０８０６６８又はＢＣ０１１０００としても利用可能である。本明細書で、「ＣＤＣＡ５遺伝子」という語句は、ヒトＣＤＣＡ５遺伝子と、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシを含む（がこれらに限定されない）他の動物のＣＤＣＡ５遺伝子とを包含し、対立遺伝子突然変異体と、ＣＤＣＡ５遺伝子に対応するものとして他の動物で見出された遺伝子とを含む。
ヒトＣＤＣＡ５遺伝子でコードされたアミノ酸配列は配列番号２として示し、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ１１０００としても利用可能である。本発明では、ＣＤＣＡ５遺伝子でコードされたポリペプチドは、「ＣＤＣＡ５」とも称され、「ＣＤＣＡ５ポリペプチド」又は「ＣＤＣＡ５タンパク質」と称されることもある。
本発明の一態様によれば、機能的等価物もＣＤＣＡ５に含まれる。本明細書では、タンパク質の「機能的等価物」は、タンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。即ち、ＣＤＣＡ５の少なくとも１つの生物活性を保持する任意のポリペプチドを、このような本発明の機能的等価物として使用することができる。例えば、ＣＤＣＡ５の機能的等価物は、細胞増殖の促進活性を保持する。さらに、ＣＤＣＡ５の生物活性は、ＣＤＣ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１７８６、配列番号４８）又はＥＲＫ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０４００５６、配列番号５０）に対する結合活性及び／又はＣＤＣ２媒介性又はＥＲＫ媒介性のリン酸化を含有する。ＣＤＣＡ５の機能的等価物は、ＣＤＣ２結合領域、ＥＲＫ結合領域、及び／又はリン酸化モチーフ、例えば配列番号２（ここで配列番号２のセリン−２１、セリン−７５及びスレオニン−１５９にリン酸化部位がある）のアミノ酸残基６８〜８２でのＣＤＣ２（Ｓ／Ｔ−Ｐ−ｘ−Ｒ／Ｋ）に対するコンセンサスリン酸化モチーフ、及び／又は配列番号２（ここで配列番号２のセリン−２１、スレオニン−４８、セリン−７５、セリン−７９、スレオニン−１１１、スレオニン−１１５、スレオニン−１５９及びセリン−２０９にリン酸化部位がある）のアミノ酸残基７６〜８６若しくは１０９〜１２２でのＥＲＫ（ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ）に対するコンセンサスリン酸化モチーフの少なくとも１つを含有し得る。
ＣＤＣＡ５の機能的等価物としては、ＣＤＣＡ５タンパク質の天然アミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸、例えば１個〜５個のアミノ酸（例えば最大５％のアミノ酸）が置換、欠失、付加又は挿入されるものが挙げられる。
（ｉｉ）ＥＰＨＡ７
ヒトＥＰＨＡ７遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３に示し、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４４０．２としても利用可能である。本明細書で、「ＥＰＨＡ７遺伝子」という語句は、ヒトＥＰＨＡ７遺伝子と、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシを含む（がこれらに限定されない）他の動物のＥＰＨＡ７遺伝子とを包含し、対立遺伝子突然変異体と、ＥＰＨＡ７遺伝子に対応するものとして他の動物で見出された遺伝子とを含む。
ヒトＥＰＨＡ７遺伝子でコードされたアミノ酸配列は配列番号４として示し、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４３１．１としても利用可能である。本発明では、ＥＰＨＡ７遺伝子でコードされたポリペプチドは、「ＥＰＨＡ７」とも称され、「ＥＰＨＡ７ポリペプチド」又は「ＥＰＨＡ７タンパク質」と称されることもある。
本発明の一態様によれば、機能的等価物もＥＰＨＡ７に含まれる。本明細書では、タンパク質の「機能的等価物」は、タンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。即ち、ＥＰＨＡ７の少なくとも１つの生物活性を保持する任意のポリペプチドを、このような本発明の機能的等価物として使用することができる。ＥＰＨＡ７の例示的な生物活性は、細胞増殖の促進活性、チロシンキナーゼ活性又はＥＧＦＲに対する結合活性である。幾つかの実施形態では、ＥＰＨＡ７の機能的等価物は、Ｔｙｒキナーゼドメイン（配列番号４の６３３ａａ〜８９０ａａ）及び／又はＥＧＦＲ結合ドメインを含有する。
ＥＰＨＡ７の機能的等価物としては、ＥＰＨＡ７タンパク質の天然アミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸、例えば１個〜５個のアミノ酸（例えば最大５％のアミノ酸）が置換、欠失、付加又は挿入されるものが挙げられる。
（ｉｉｉ）ＳＴＫ３１
ヒトＳＴＫ３１遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号５に示し、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３１４１４．２としても利用可能である。本明細書で、「ＳＴＫ３１遺伝子」という語句は、ヒトＳＴＫ３１遺伝子と、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシを含む（がこれらに限定されない）他の動物のＳＴＫ３１遺伝子とを包含し、対立遺伝子突然変異体と、ＳＴＫ３１遺伝子に対応するものとして他の動物で見出された遺伝子とを含む。
ヒトＳＴＫ３１遺伝子でコードされたアミノ酸配列は配列番号６として示し、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１１６５６２．１としても利用可能である。本発明では、ＳＴＫ３１遺伝子でコードされたポリペプチドは、「ＳＴＫ３１」とも称され、「ＳＴＫ３１ポリペプチド」又は「ＳＴＫ３１タンパク質」と称されることもある。
本発明の一態様によれば、機能的等価物もＳＴＫ３１に含まれる。本明細書では、タンパク質の「機能的等価物」は、タンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。即ち、ＳＴＫ３１の少なくとも１つの生物活性を保持する任意のポリペプチドを、このような本発明の機能的等価物として使用することができる。ＳＴＫ３１の例示的な生物活性は、細胞増殖の促進活性、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−キナーゼ活性又はＥＧＦＲのリン酸化反応に対する促進活性（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（配列番号５０、（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０４００５６）及びＭＥＫ（ＭＥＫ１／２）（配列番号７２又は配列番号７４、ＮＭ＿００２７５５又はＮＭ＿０３０６６２）である。幾つかの実施形態では、ＳＴＫ３１の機能的等価物は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメイン（配列番号６の７４５ａａ〜９７２ａａ）及び／又はｃ−ｒａｆ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２８８０，配列番号５０）、ＭＥＫ１／２及び／又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）結合ドメインを含有する。
ＳＴＫ３１の機能的等価物としては、ＳＴＫ３１タンパク質の天然アミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸、例えば１個〜５個のアミノ酸（例えば最大５％のアミノ酸）が置換、欠失、付加又は挿入されるものが挙げられる。
（ｉｖ）ＷＤＨＤ１
ヒトＷＤＨＤ１遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号７に示し、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７０８６．２としても利用可能である。本明細書で、「ＷＤＨＤ１遺伝子」という語句は、ヒトＷＤＨＤ１遺伝子と、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシを含む（がこれらに限定されない）他の動物のＷＤＨＤ１遺伝子とを包含し、対立遺伝子突然変異体と、ＷＤＨＤ１遺伝子に対応するものとして他の動物で見出された遺伝子とを含む。
ヒトＷＤＨＤ１遺伝子でコードされたアミノ酸配列は配列番号８として示し、またＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００９０１７．１としても利用可能である。本発明では、ＷＤＨＤ１遺伝子でコードされたポリペプチドは、「ＷＤＨＤ１」とも称され、「ＷＤＨＤ１ポリペプチド」又は「ＷＤＨＤ１タンパク質」と称されることもある。
本発明の一態様によれば、機能的等価物もＷＤＨＤ１に含まれる。本明細書では、タンパク質の「機能的等価物」は、タンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。即ち、ＷＤＨＤ１の少なくとも１つの生物活性を保持する任意のポリペプチドを、このような本発明の機能的等価物として使用することができる。ＷＤＨＤ１の例示的な生物活性は、細胞増殖の促進活性である。幾つかの実施形態では、ＷＤＨＤ１の機能的等価物は、リン酸化部位を含有する。
ＷＤＨＤ１の機能的等価物としては、ＳＴＫ３１タンパク質の天然アミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸、例えば１個〜５個のアミノ酸（例えば最大５％のアミノ酸）が置換、欠失、付加又は挿入されるものが挙げられる。
概して、タンパク質において１つ又は複数のアミノ酸の修飾は、タンパク質の機能に影響を与えないことが知られている（Mark DF, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Sep;81（18）:5662-6、Zoller MJ & Smith M. Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10（20）:6487-500、Wang A, et al., Science. 1984 Jun 29;224（4656）:1431-3、Dalbadie-McFarland G, et.al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Nov;79（21）:6409-13）。当業者は、単一アミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を改変する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入又は置換は、タンパク質の改変によって同様の機能を有するタンパク質が生じる「保存的修飾」であることを認識している。
アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、バリン）、親水性アミノ酸（アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、セリン、スレオニン）、及び共通して以下の官能基又は特徴を有する側鎖：脂肪族側鎖（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン(praline)）；側鎖（セリン、スレオニン、チロシン）を含有するヒドロキシル基；側鎖（Ｃ、Ｍ）を含有する硫黄原子；側鎖（アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン）を含有するカルボン酸及びアミド；側鎖（アルギニン、リシン、ヒスチジン）を含有する塩基；及び側鎖（ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）を含有する芳香族基である。さらに、機能的に同様のアミノ酸を規定する保存的置換表は当該技術分野で既知である。例えば、以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Thomas E. Creighton, Proteins Publisher: New York: W.H. Freeman, c1984を参照されたい）。
このように保存的に修飾されたポリペプチドがＣＸタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、ＣＸタンパク質は、ＣＸタンパク質の生物活性のいずれか１つを保持していれば非保存的修飾を含む。このような修飾タンパク質で突然変異するアミノ酸の数は概して、１０アミノ酸未満、例えば６アミノ酸未満、例えば３アミノ酸未満である。
１つ又は複数のアミノ酸残基の付加によって修飾されたタンパク質の例は、ＣＸタンパク質の融合タンパク質である。融合タンパク質には、ＣＸタンパク質と、他のペプチド又はタンパク質との融合体が含まれ、これは本発明にも使用することができる。当業者にとって既知の技法、例えばフレームが一致するように、ＣＸ遺伝子をコードするＤＮＡを、他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡと連結させ、融合ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、それを宿主で発現させることによって融合タンパク質を作製することができる。得られた融合タンパク質がＣＸタンパク質の対象となる生物活性のいずれか１つを保持していれば、ＣＸタンパク質に融合するペプチド又はタンパク質には制限がない。
ＣＸタンパク質に融合するペプチドとして使用することができる既知のペプチドとしては例えば、ＦＬＡＧ（Hopp TP, et al., Biotechnology 6: 1204-10（1988））、６つのＨｉｓ（ヒスチジン）残基を含有する６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザアグルチニン（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、ＶＳＰ−ＧＰ断片、ｐ１８ＨＩＶ断片、Ｔ７−タグ、ＨＳＶ−タグ、Ｅ−タグ、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、αチューブリン断片、Ｂ−タグ、プロテインＣ断片等が挙げられる。本発明のタンパク質に融合することができるタンパク質の例としては、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、インフルエンザアグルチニン（ＨＡ）、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
さらに、修飾タンパク質には、多型変異体、種間相同体、これらのタンパク質の対立遺伝子でコードされるものは除外されない。
機能的に同等なタンパク質を単離する、当該技術分野で既知の方法としては例えば、ハイブリダイゼーション技法（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）が挙げられる。当業者は、ヒトＣＸタンパク質をコードするヒトＣＸ ＤＮＡ配列（例えばＣＤＣＡ５に対する配列番号１、ＥＰＨＡ７に対する配列番号３、ＳＴＫ３１に対する配列番号５、ＷＤＨＤ１に対する配列番号７）の全体又は一部と高い相同性（即ち配列同一性）があるＤＮＡを容易に単離することができ、また単離ＤＮＡからヒトＣＸタンパク質に対して機能的に同等なタンパク質を単離することができる。したがって、本発明に使用されるタンパク質は、ヒトＣＸタンパク質をコードするＤＮＡ配列の全体又は一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされるものを含み、ヒトＣＸタンパク質と機能的に同等である。これらのタンパク質としては、ヒト又はマウス由来のタンパク質（例えば、サル、ラット、ウサギ又はウシの遺伝子でコードされるタンパク質）に対応する哺乳動物相同体が挙げられる。単離の際には、肺癌若しくは食道癌の組織若しくは細胞株、又は睾丸（ＣＤＣＡ５、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１に対して）、脳若しくは腎臓（ＥＰＨＡ７に対して）の組織由来のヒトＣＸ遺伝子をコードするＤＮＡに高い相同性があるｃＤＮＡを使用することができる。
ヒトＣＸ遺伝子と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、当業者によって定常的に選択され得る。「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子が、典型的に核酸の混成物において、その標的配列とハイブリダイズする（が他の配列とは検出可能なハイブリダイズはしない）条件を表す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況下で異なる。配列が長くなれば、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"（1993）に見られる。概して、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、ｐＨで特定の配列のために、熱融解点（Ｔｍ）より約５℃〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度で）標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍで、プローブの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件は、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成することができる。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、例えばバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
例えば、ハイブリダイゼーションは、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂバッファ」（Amersham LIFE SCIENCE）を用いて、６８℃で、３０分以上、前ハイブリダイゼーションを行ない、標識プローブを添加して、６８℃で１時間以上温めることによって実施することができる。以下の洗浄工程は、例えば低いストリンジェント条件で実施することができる。低いストリンジェント条件は例えば、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、例えば５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳである。幾つかの実施形態では、高いストリンジェント条件を用いる。高いストリンジェント条件は例えば、室温で２０分間、２×ＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳにおける３回の洗浄、その後の３７℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおける３回の洗浄、及び５０℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおける２回の洗浄である。しかしながら、幾つかの因子、例えば温度及び塩濃度は、ハイブリダイゼーションの緊縮度（stringency）に影響を与える可能性があり、当業者は、必要な緊縮度を達成するために因子を好適に選択することができる。
ヒトＣＸタンパク質（ＣＤＣＡ５では配列番号２、ＥＰＨＡ７では配列番号４、ＳＴＫ３１では配列番号６、又はＷＤＨＤ１では配列番号８）をコードするＤＮＡ（ＣＤＣＡ５では配列番号１、ＥＰＨＡ７では配列番号３、ＳＴＫ３１では配列番号５、又はＷＤＨＤ１では配列番号７）の配列情報に基づき合成されたプライマーを用いて、ヒトＣＸ遺伝子と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するために、ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。プライマー配列の例は、実施例１における（３）半定量ＲＴ−ＰＣＲで示す。
上記のハイブリダイゼーション技法又は遺伝子増幅技法によって単離したＤＮＡでコードされるヒトＣＸタンパク質と機能的に同等なタンパク質は通常、ヒトＣＸタンパク質のアミノ酸配列に対して高い相同性（配列同一性とも称される）を有する。「高い相同性」（「高い配列同一性」とも称される）は典型的に、２つの最適にアラインメントした配列（ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列のいずれか）間の同一性の程度を表す。典型的に、高い相同性又は配列同一性は、４０％以上、例えば６０％以上、例えば８０％以上、例えば８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上の相同性を表す。２つのポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列との間の相同性又は同一性の程度は、アルゴリズムに従って求めることができる（Wilbur WJ & Lipman DJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Feb; 80（3）:726-30）。
配列同一性及び配列相同性の割合を求めるのに好適なアルゴリズムの付加的な例はＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これには以下で記載がある（Altschul SF, et al., J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215（3）:403-10、Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1 ;25（17）:3389-402）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）で公的に利用可能である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。アルゴリズムは、クエリ（query）配列におけるショートワード（short words：短いワード）（データベース配列において同じ長さのワードとアラインメントすると、幾つかの正の値の閾値スコアＴに一致するか又はこれを満たす）の長さＷを同定することによって、値が高い配列対（ＨＳＰ）を初めに同定することを伴う。Ｔは近傍ワードのスコア閾値として表される（Altschul et al、同上）。これらの初期近傍ワードヒット（word hit）は、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるために、検索を開始する足掛かり（seed：シード）として作用する。
それから、ワードヒットは、累積アラインメントスコア（cumulative alignment score）が増加することができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。パラメータＭ（マッチ残基対に対するリワード（reward）スコア、常に０より大きい）とパラメータＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア、常に０未満）をヌクレオチド配列に用いて累積スコアをを算出する。アミノ酸配列では、累積スコアを算出するために、スコアリングマトリクスを用いる。累積アラインメントスコアが、最大到達値から量Ｘだけ低下するか、１つ又は複数の負のスコアの残基アラインメントの集積のために累積スコアが０以下になるか、又はいずれかの配列の末端に達すると、各方向でのワードヒットの延長が停止する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度及び速度を求める。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列では）は、ワードサイズ（Ｗ）が２８、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝１、Ｎ＝−２及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワードサイズ（Ｗ）が３、期待値（Ｅ）が１０及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Henikoff S & Henikoff JG. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15;89（22）:10915-9）。
本発明に関して有用なタンパク質は、生成に使用する細胞若しくは宿主、又は利用する精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無又は形態を変えることができる。それにもかかわらず、タンパク質がＣＸタンパク質（ＣＤＣＡ５では配列番号２、ＥＰＨＡ７では配列番号４、ＳＴＫ３１では配列番号６、ＷＤＨＤ１では配列番号８）の生物活性のいずれか１つを有していれば、そのタンパク質は本発明において有用である。
本発明は、ＣＸタンパク質の部分ペプチドの使用も包含する。部分ペプチドは、ＣＸタンパク質のタンパク質に特異的なアミノ酸配列を有し、約４００アミノ酸未満、通常約２００アミノ酸未満及び多くは１００アミノ酸未満で、少なくとも約７アミノ酸、例えば約８アミノ酸以上、例えば約９アミノ酸以上から成る。
好適には、本発明のスクリーニングに使用する部分ペプチドは少なくとも、ＣＤＣＡ５のコヒーシン結合ドメイン及び／又はリン酸化部位、ＥＰＨＡ７のＴｙｒキナーゼドメイン（配列番号４の６３３ａａ〜８９０ａａ）及び／又はＥＧＦＲ結合ドメイン、ＳＴＫ３１のＳｅｒ／Ｔｈｒ−キナーゼドメイン（配列番号６の７４５ａａ〜９７２ａａ）、及び／又はＷＤＨＤ１のリン酸化部位を含有する。さらに、好適には、本発明のスクリーニングに使用する部分ＣＤＣＡ５ペプチドは、ＣＤＣ２結合領域、ＥＲＫ結合領域、及び／又はリン酸化モチーフ、例えば配列番号２（ここで配列番号２のセリン−２１、セリン−７５及びスレオニン−１５９にリン酸化部位がある）のアミノ酸残基６８〜８２（Ｓ／Ｔ−Ｐ−ｘ−Ｒ／Ｋ）でのＣＤＣ２に対するコンセンサスリン酸化モチーフ、配列番号２（ここで配列番号２のセリン−２１、スレオニン−４８、セリン−７５、セリン−７９、スレオニン−１１１、スレオニン−１１５、スレオニン−１５９及びセリン−２０９にリン酸化部位がある）のアミノ酸残基７６〜８６若しくは１０９〜１２２でのＥＲＫ（ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ）に対するコンセンサスリン酸化モチーフの少なくとも１つを含有する。好適には、本発明のスクリーニングに使用する部分ＣＤＣ２ペプチドは、ＣＤＣＡ５結合領域及び／又はセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ触媒ドメイン、例えば配列番号４８のアミノ酸残基４〜２８７（ＣＤＣ２）を含有する。また好適には、本発明のスクリーニングに使用する部分ＥＲＫペプチドは、ＣＤＣＡ５結合領域及び／又はタンパク質キナーゼドメイン、例えば配列番号５０のアミノ酸残基７２〜３６９（ＥＲＫ）を含有する。かかる部分ペプチドは、ＣＸタンパク質の「機能的等価物」という語句によっても包含される。
本方法に使用するポリペプチド又は断片は、選択アミノ酸配列に基づき、従来の精製法によって又は化学合成を通じて自然界から天然タンパク質として得ることができる。例えば、合成に利用することができる従来のペプチド合成法としては、
（１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966、
（２）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976、
（３）ペプチド合成（日本語版）、丸善株式会社、1975、
（４）ペプチド合成の基礎と実験（日本語版）、丸善株式会社、1985、
（５）続医薬品の開発（日本語版）、第１４巻（ペプチド合成）、株式会社廣川書店、1991、
（６）国際公開第９９／６７２８８号パンフレット、及び
（７）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118が挙げられる。
代替的に、タンパク質は、ポリペプチドを生成する任意の既知の遺伝子組換え法を利用して得ることができる（例えばMorrison DA., et al., J Bacteriol. 1977 Oct;132（1）:349-51、Clark-Curtiss JE & Curtiss R 3rd. Methods Enzymol. 1983;101:347-62）。例えば初めに、発現形態で対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む好適なベクター（例えばプロモーターを含む下流の調節配列）を調製し、好適な宿主細胞に形質転換した後、宿主細胞を培養してタンパク質を生成した。より具体的には、ＨＪＵＲＰをコードする遺伝子は、外来遺伝子、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、又はｐＣＤ８を発現するために、遺伝子をベクターに挿入することによって、宿主（例えば動物）細胞等で発現する。
プロモーターを発現に使用することができる。例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson（ed.） Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim DW, et al. Gene. 1990 Jul 16;91（2）:217-23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa H, et al., Gene. 1991 Dec 15;108（2）:193-9）、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（Cullen BR. Methods Enzymol. 1987; 152:684-704）、ＳＲαプロモーター（Takebe Y, et al., Mol Cell Biol. 1988 Jan; 8（1）:466-72）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed B & Aruffo A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May;84（10）:3365-9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen D & Fiers W. J Mol Appl Genet. 1982; 1（5）:385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman RJ, et al., Mol Cell Biol. 1989 Mar;9（3）:946-58）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター等を含む、一般的に使用される任意のプロモーターを用いることができる。
ＣＸ遺伝子を発現するために、任意の方法、例えば電気穿孔法（Chu G, et al., Nucleic Acids Res. 1987 Feb 11;15（3）: 1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen C & Okayama H. Mol Cell Biol. 1987 Aug;7（8）:2745-52）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata MA, et al., Nucleic Acids Res. 1984 Jul 25;12（14）:5707-17、Sussman DJ & Milman G. Mol Cell Biol. 1984 Aug;4（8）: 1641-3）、リポフェクチン法（Derijard B, et al., Cell. 1994 Mar 25;76（6）:1025-37、Lamb BT, et al., Nat Genet. 1993 Sep;5（1）:22-30、Rabindran SK, et al., Science. 1993 Jan 8;259（5092）:230-4）等に従って、ベクターの宿主細胞への導入を実施することができる。
ＣＸタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ利用（adopting）系とｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系とで生成することもできる。
本発明に関して、「ＣＸ遺伝子」という語句は、ヒトＣＸ遺伝子、又はヒトＣＸ遺伝子の機能的等価物のいずれかをコードするポリヌクレオチドを包含する。
ＣＸ遺伝子は、選択ヌクレオチド配列に基づき、従来のクローニング法によって又は化学合成を通じて自然界から天然タンパク質として得ることができる。ｃＤＮＡライブラリ等を用いて遺伝子をクローニングする方法は当該技術分野で既知である。
（２）抗体
「抗体」という用語は本明細書中で使用される場合、指定のタンパク質又はそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリン及びその断片を含むことが意図される。抗体はヒト抗体、霊長類化（primatized）抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質、又は放射性標識と融合させた抗体、及び抗体断片を含み得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成される多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は全てのクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）を示す。
本発明は、例えばＥＰＨＡ７のＮ末端部分（例えばＥＰＨＡ７の配列番号４の５２６ａａ残基〜５８０ａａ残基）に対する抗体を含む、ＣＸタンパク質に対する抗体を用いる。これらの抗体は、肺癌又は食道癌を診断するのに有用であり得る。ＣＤＣＡ５ポリペプチドに対する抗体、特にＣＤＣＡ５ポリペプチドのリン酸化領域、例えば配列番号２のアミノ酸残基６８〜８２（Ｓ／Ｔ−Ｐ−ｘ−Ｒ／Ｋ）（ＣＤＣＡ５）、配列番号２のアミノ酸残基７６〜８６（ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ）（ＣＤＣＡ５）及び／又は配列番号２のアミノ酸残基１０９〜１２２（ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ）（ＣＤＣＡ５）でのＣＤＣ２に対するコンセンサスリン酸化モチーフの少なくとも１つに対する抗体も用いられる。これらの抗体は、ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２媒介性リン酸化又はＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ媒介性リン酸化を阻害及び／又は阻止するのに有用であり得ると共に、ＣＤＣＡ５を（過剰）発現する癌、例えば肺癌又は食道癌を治療及び／又は予防するのに有用であり得る。さらに、本発明には、ＣＤＣＡ５ポリペプチドに対する抗体又はそれらの部分ペプチドに対する抗体、特にＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２結合領域又はＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ結合領域に対する抗体を用いる。
これらの抗体は、ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチドとの間の相互作用（例えば結合）、又はＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチドとの間の相互作用（例えば結合）を阻害及び／又は阻止するのに有用であり得ると共に、ＣＤＣＡ５を（過剰）発現する癌、例えば肺癌又は食道癌を治療及び／又は予防するのに有用であり得る。代替的に、ＣＤＣ２ポリペプチド、ＥＲＫポリペプチド又はこれらの部分ペプチド、例えばこれらのＣＤＣＡ５結合領域に対する抗体も用いる。これらの抗体は既知の方法によって与えられる。本発明に従って用いられる抗体を生成する例示的な技法が記載されている。
（ｉ）ポリクローナル抗体：
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により生じさせるのが好ましい。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する共役）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、又はＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲは異なるアルキル基である）を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
例えば１００μｇ又は５μｇのタンパク質又は複合体（それぞれウサギ又はマウスの場合）を３倍量の完全フロインドアジュバントと合わせ、この溶液を複数の部位で皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性のある複合体、又は誘導体に対して免疫化する。１ヵ月後、ペプチド又は複合体の初期量の１／５〜１／１０量を完全フロインドアジュバントに加え、複数の部位で皮下注射することにより動物を追加免疫する。７日〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価について検定する。力価が平衡に達するまで動物を追加免疫する。同じ抗原の異なるタンパク質を共役させた複合体及び／又は異なる架橋試薬による複合体で動物を追加免疫するのが好ましい。
複合体は、融合タンパク質（protein fusion）として、組換え細胞培養物においても作製することができる。また、ミョウバン等の凝集剤が、免疫反応を増強するのに適切に使用される。
（ｉｉ）モノクローナル抗体：
モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団内に含有される個々の抗体が起こり得る自然発生突然変異（若干存在し得る）以外は同一である集団から得ることができる。したがって、「モノクローナル」という修飾詞は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を意味する。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler G & Milstein C. Nature. 1975 Aug 7; 256 (5517):495-7に初めて記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得るか、又は組み換えＤＮＡ法により作製され得る（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。
ハイブリドーマ法においては、マウス又は他の適当な宿主動物（ハムスター等）を以上に記載されるように免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を生成するか、又は生成することが可能なリンパ球を誘導する。代替的には、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。リンパ球を次に、ポリエチレングリコール等の適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
このように調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含有する、適切な培養培地に播種して成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
幾つかの実施形態において、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、また培地、例えばＨＡＴ培地に対して感受性がある。例示的な骨髄腫細胞株としては、ネズミ骨髄腫細胞株、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Manassas, Virginia, USA）から入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来のものが挙げられる。 ヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Kozbor D, et al., J Immunol. 1984 Dec;133(6):3001-5、Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が成長している細胞培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関して検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって求められる。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson PJ & Rodbard D. Anal Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39のスキャッチャード解析によって決定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）によって成長させてもよい。この目的に適した培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＬ−１６４０培地が含まれる。また、ハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫瘍として、ｉｎ ｖｉｖｏで成長させてもよい。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィー等によって培養培地、腹水、又は血清から適切に分離することができる。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に単離及び配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源となる。ＤＮＡを単離した後、発現ベクターに入れ、それを次に宿主細胞（免疫グロブリンタンパク質を本来産生しない、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞等）にトランスフェクトすることにより、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に関する総説としては、Skerra A. Curr Opin Immunol. 1993 Apr; 5 (2):256-62 及びand Pluckthun A. Immunol Rev. 1992 Dec;130:151-88が挙げられる。
ＣＸタンパク質に対して反応性を有する特異的抗体又は抗体断片を作り出す別の方法は、ＣＸタンパク質又はペプチドによって細菌において発現される、免疫グロブリン遺伝子又はその一部分をコードする発現ライブラリをスクリーニングすることである。例えば、完全Ｆａｂ断片、ＶＨ領域、及びＦｖ領域を、細菌においてファージ発現ライブラリを用いて発現させることができる。例えば、Ward ES, et al., Nature. 1989 Oct 12; 341（6242）: 544-6、Huse WD et al., Science 1989 Dec 8; 246（4935）: 1275-81、及びMcCafferty J et al., Nature. 1990 Dec 6; 348（6301）: 552-4を参照されたい。かかるライブラリをＣＸタンパク質、例えばＣＸペプチドを用いてスクリーニングすることにより、ＣＸタンパク質と反応する免疫グロブリン断片を同定することができる。代替的には、抗体又はその断片を生成するためにＳＣＩＤ−ｈｕマウス（Genpharmから入手可能）を使用することができる。
さらなる実施形態においては、抗体又は抗体断片を、McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4に記載されている技法を用いて作り出される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8;及びMarks JD, et al., J MoL BioL, 222: 581-597 (1991) J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97はそれぞれ、ファージライブラリを用いたマウス抗体及びヒト抗体の単離について記載している。その後の刊行物には、鎖シャッフリング（chain shuffling）による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生成(Marks JD, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Jul;10(7):779-83)、並びに非常に大きいファージライブラリを構築する戦略として、組合せ感染（combinatorial infection）及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え(Waterhouse P, et al., Nucleic Acids Res. 1993 May 11;21(9):2265-6)が記載されている。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体の単離のための、伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替手段である。
また、例えば、コード配列を相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインで置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Morrison SL, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Nov;81(21):6851-5)）、又は非免疫グロブリンポリペプチドに関するコード配列の全部又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、ＤＮＡを修飾してもよい。
典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドで、抗体の定常ドメインを置換するか、又は抗体の一抗原結合部位の可変ドメインを置換することによって、第１の抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作成する。
（ｉｉｉ）ヒト化抗体：
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には、ヒト以外の供給源に由来する１つ又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入（import）」残基と称されることが多く、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的に、Winter及び共同研究者らの方法((Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5; Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7; Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6))に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行なうことができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインよりかなり小さな部分が、ヒト以外の種の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）である。実際には、ヒト化抗体は典型的に、幾つかの超可変領域残基、及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が、齧歯動物抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
抗原性を低下させるためには、ヒト化抗体の作製に使用するヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方）の選択が非常に重要である。いわゆる「最良適合（best-fit）」法によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次に、齧歯動物の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体に関するヒトフレームワーク領域（ＦＲ）とする（Sims MJ et al., J Immunol. 1993 Aug 15;151(4):2296-308、Chothia et al., J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17)。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。幾つかの異なるヒト化抗体に同じフレームワークを使用してもよい（Carter P, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285-9; Presta LG, et al., J Immunol. 1993 Sep 1;151(5):2623-32)。
ヒト化される抗体は、抗原に対する高い親和性、及び他の好適な生物学的特性を保持していることがさらに重要である。この目標を達成するには、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて分析するプロセスによって調製され得る。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の、考え得る三次元立体配座構造を図解及び表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する増大した親和性等の所望の抗体特徴が達成されるように、受容（recipient）配列及び移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は抗原結合の影響に直接的且つ最も実質的に関与する。
（ｉｖ）ヒト抗体：
ヒト化の代替手段として、ヒト抗体を作り出すことができる。例えば、免疫化の際に内因性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を引き起こす。例えば、Jakobovits A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15;90(6):2551-5、 Nature. 1993 Mar 18;362(6417):255-8、 Bruggemann M, et al., Year Immunol. 1993;7:33-40;並びに米国特許第５,５９１，６６９号明細書、同第５，５８９，３６９号明細書、及び同第５，５４５，８０７号明細書を参照されたい。
代替的には、ファージディスプレイ法（McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4）を使用して、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体及び抗体断片を生成することができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄ等の糸状バクテリオファージの主要又は微量コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択は、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。したがって、ファージはＢ細胞の特性の幾つかを模倣する。ファージディスプレイは多様な形式で行なうことができるが、それらの概説については、例えば、Johnson KS & Chiswell DJ. Curr Opin Struct Biol. 1993 ;3:564-71を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源をファージディスプレイに使用することができる。
Clackson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8は、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小ランダム組み合わせライブラリから抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを単離した。Marks JD, et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97、又はGriffiths AD, et al., EMBO J. 1993 Feb;12(2):725-34.によって記載される技法に基本的に従って、非免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築し、抗原（自己抗原を含む）の種々のアレイに対する抗体を単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号明細書及び同第５，５７３，９０５号明細書を参照されたい。
ヒト抗体はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって作り出してもよい（米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照）。
（ｖ）非抗体結合タンパク質
本発明は、ＣＸタンパク質に対する、例えばＥＰＨＡ７のＮ末端部分に対する非抗体結合タンパク質も考慮する。「非抗体結合タンパク質」又は「非抗体リガンド」又は「抗原結合タンパク質」という用語は下記でより詳細に論じられる、アドネクチン、アビマー、一本鎖ポリペプチド結合分子、及び抗体様結合ペプチド模倣薬を含む非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する抗体模倣体を互換可能に指す。
抗体と同様に標的化し、標的に結合する他の化合物も開発されている。これらの「抗体模倣体」の一部は、非免疫グロブリンタンパク質骨格をタンパク質フレームワークの代替として抗体の可変領域に使用する。
例えば、Ladner et al.（米国特許第５，２６０，２０３号明細書）には、凝集しているが分子的には分離した、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と同様の結合特異性を有する一本鎖ポリペプチド結合分子が記載されている。該一本鎖結合分子は、ペプチドリンカーにより連結した抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方の抗原結合部位を含有し、２つのペプチド抗体と同様の構造に折り畳まれる。一本鎖結合分子は、サイズがより小さい、安定性がより大きい、及びより容易に修飾される等、従来の抗体に優る幾つかの利点を示す。
Ku et al. (Proc Natl Acad Sci USA 92(14):6552-6556 (1995))は、シトクロムｂ５６２に基づく抗体の代替手段を記載している。Ku et al. (1995)は、シトクロムｂ５６２のループの２つを無作為化し、ウシ血清アルブミンに対する結合に関して選択したライブラリを作り出した。個々の突然変異体は、抗ＢＳＡ抗体と同様に選択的にＢＳＡに結合することが見出された。
Lipovsek et al.（米国特許第６，８１８，４１８号明細書及び同第７，１１５，３９６号明細書）は、フィブロネクチン又はフィブロネクチン様タンパク質骨格、及び少なくとも１つの可変ループを特徴とする抗体模倣体を記載している。アドネクチンとして知られるこれらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、任意の標的リガンドに関する高い親和性及び特異性を含む、自然抗体又は改変抗体と同じ特徴の多くを示す。新たな又は改善された結合タンパク質を発展させる任意の技法を、これらの抗体模倣体と共に使用することができる。
これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の可変領域の構造と同様である。したがって、これらの模倣体は、天然抗体と本質的に同様の抗原結合特性及び親和性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、抗体及び抗体断片に優る或る特定の利点を示す。例えば、これらの抗体模倣体は固有の折り畳み安定性に関してジスルフィド結合に依存せず、したがって、通常は抗体を分解する可能性のある条件下で安定である。また、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の構造と同様であるため、ループの無作為化及びシャフリングのプロセスは、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ親和性成熟のプロセスと同様、ｉｎ ｖｉｔｒｏで採用することができる。
Beste et al.（Proc Natl Acad Sci USA 96(5): 1898-1903 (1999)）は、リポカリン骨格（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標））に基づく抗体模倣体を記載している。リポカリンは、タンパク質末端に４つの超可変ループを有するβバレルから成る。Beste（1999）は、該ループにランダム突然変異誘発を行ない、例えばフルオレセインとの結合に関して選択した。３つの変異体がフルオレセインと特異的な結合を示し、１つの変異体が抗フルオレセイン抗体と同様の結合を示した。さらなる分析によって、無作為化位置が全て可変であることが明らかとなったが、これはＡｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）が抗体の代替手段としての使用に適切であり得ることを意味する。
Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）は、典型的には１６０残基〜１８０残基の小さな一本鎖ペプチドであり、生産コストの減少、貯蔵安定性の増大、及び免疫反応の減少を含む、抗体に優る幾つかの利点を提供する。
Hamilton et al.（米国特許第５，７７０，３８０号明細書）は、結合部位として使用される複数の可変ペプチドループが付着した、カリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を使用した合成抗体模倣体を記載している。ペプチドループは全て、互いにカリックスアレーンの幾何学的に同じ側から突出する。この幾何学的構造のために、全てのループが結合に利用可能であり、リガンドに対する結合親和性が増加する。しかしながら、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンベースの抗体模倣体はペプチドのみから成るものではなく、したがってプロテアーゼ酵素による攻撃を受けにくい。上記骨格も純粋にペプチド、ＤＮＡ、又はＲＮＡから成るものではなく、これはこの抗体模倣体が厳しい環境条件において比較的安定であり、寿命が長いことを意味する。さらに、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は比較的小さいため、免疫原性反応をもたらす可能性は低い。
Murali et al.（Cell Mol Biol. 49(2): 209-216 (2003)）は、抗体をより小さいペプチド模倣体にする方法論を記載している。該ペプチド模倣体は「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）と称され、これも抗体に対する代替手段として有用であり得る。
Silverman et al.（Nat Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561）は、「アビマー」と称される複数のドメインを含む一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質を記載している。アビマーは、ヒト細胞外受容体ドメインからｉｎ ｖｉｔｒｏエキソンシャフリング及びファージディスプレイにより開発されたため、様々な標的分子に対する親和性及び特異性において抗体と幾らか類似した結合タンパク質群である。得られた多ドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して改善された親和性（場合によってはｎＭ以下の）及び特異性を示し得る、複数の独立した結合ドメインを含み得る。アビマーを構築及び使用する方法に関するさらなる詳細は、例えば米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書、同第２００５００４８５１２号明細書、同第２００５００５３９７３号明細書、同第２００５００８９９３２号明細書、及び同第２００５０２２１３８４号明細書に開示されている。
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、抗体特性はまた、ＲＮＡ分子及び非天然オリゴマー（例えばプロテアーゼ阻害剤、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、及びβターン模倣体）（全て本発明による使用に適切である）を含むがこれらに限定されない化合物において模倣されてきた。
当該技術分野において知られるように、アプタマーは、特異的な分子標的に強く結合する核酸から成る巨大分子である。Tuerk and Gold（Science. 249: 505-510 (1990)）は、アプタマーの選択に関するＳＥＬＥＸ法（試験管内進化法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment））を開示している。ＳＥＬＥＸ法では、標的分子を用いて核酸分子の大きなライブラリ（例えば、１０１５個の異なる分子）を生成及び／又はスクリーニングする。単離したアプタマーを次にさらに精製して、標的の結合及び／又はアプタマー構造に寄与しないヌクレオチド（すなわち、コア結合ドメインを欠くアプタマー）を取り除いてもよい。アプタマー技術の概説に関しては、例えばJayasena, 1999, Clin. Chem. 45: 1628-1650を参照されたい。
試験薬剤ライブラリの構築は当該技術分野においてよく知られているが、以下に、本スクリーニング方法のための試験薬剤の同定及びかかる薬剤のライブラリの構築に関するさらなる指針を与える。
（ｖｉ）抗体断片：
抗体断片の生成について、様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク分解によって誘導されていた（例えば、Morimoto K & Inouye K.J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar; 24（1-2）: 107-17、Brennan M et al., Science. 1985 Jul 5; 229（4708） 81-3を参照されたい）。しかしながら、現在では、これらの断片は組換え宿主細胞によって直接生成することができる。例えば、上述の抗体ファージライブラリから抗体断片を単離することができる。代替的には、Ｆａｂ'−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的カップリングを行なってＦ（ａｂ’）２断片を形成することもできる（CarterP et al., BioTechnology（NY）. 1992 Feb; 10（2）: 163-7）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を生成するための他の技法は、当業者には明らかである。他の実施形態において、好適な抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号パンフレット、米国特許第５，５７１，８９４号明細書、及び米国特許第５，５８７，４５８号明細書を参照されたい。抗体断片はまた、例えば米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されるような「線状抗体」であってもよい。かかる線状抗体断片は単一特異的であっても、又は二重特異的であってもよい。
（ｖｉｉ）抗体又は抗体断片の選択
上述の方法によって調製される抗体又は抗体断片が、癌細胞のような細胞を発現するＣＸ遺伝子の親和性を検出することによって選択される。これらの細胞との非特異的な結合は、室温で３０分間、３％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで処理することによって阻止される。細胞を室温で６０分間、候補抗体又は抗体断片とインキュベートする。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で６０分間、ＦＩＴＣ結合二次抗体によって染色し、蛍光光度計によって検出した。代替的に、表面プラズモン共鳴現象を利用するバイオセンサを、本発明における抗体又は抗体断片を検出又は定量する手段として使用することができる。細胞表面上でＣＸペプチドを検出することができる抗体又は抗体断片が本発明で選択される。
（３）二本鎖分子
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に指定のない限り、本明細書中で互換可能に使用され、一般的に許容される１文字コードで表される。この用語は、１つ又は複数の核酸がエステル結合で連結する核酸（ヌクレオチド）ポリマーに適用する。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せから成り得る。
本明細書で使用されるように、「単離二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子（例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））及び低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）又はＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む）の発現を阻害する核酸分子を表す。
本明細書で使用されるように、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ二本鎖ＲＮＡ分子を表す。ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技法（ＤＮＡが、ＲＮＡが転写される鋳型であるものを含む）を用いる。ｓｉＲＮＡとしては、ＣＸ遺伝子のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）に対応するリボヌクレオチド、ＣＸ遺伝子のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）に対応するリボヌクレオチド又はその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築することができる。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。
本明細書で使用されるように、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補配列を含み、且つ二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つのＲＮＡ分子の構築物を表す。２つの鎖の配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」又は「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
本明細書で使用されるように、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的である、第１の領域及び第２の領域、即ちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡを表す。領域の相補性及び配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域及び第２の領域がループ領域によって連結し、そのループは、ループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠失によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間にある一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で使用されるように、「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡとの両方から成る二本鎖分子を表し、ＲＮＡ及びＤＮＡのハイブリッド及びキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ。本明細書中で、ハイブリッドは、ＤＮＡから成るオリゴヌクレオチドとＲＮＡから成るオリゴヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する分子を示し、キメラは、二本鎖分子を含む鎖の一方又は両方がＲＮＡ及びＤＮＡを含有し得ることを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技法が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡとしては、ＣＸ遺伝子のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＣＸ遺伝子のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）又はその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築することができる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。
本明細書で使用されるように、「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補配列を含み、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つの分子の構築物を表す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」又は「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の１つ又は両方が、ＲＮＡとＤＮＡとの両方から成るか（キメラ分子）、又は代替的に分子の１つがＲＮＡから成り、もう一方がＤＮＡから成る（ハイブリッド二本鎖）。
本明細書で使用されるように、「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的である、第１の領域及び第２の領域、即ちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを表す。領域の相補性及び配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域及び第２の領域がループ領域によって連結し、そのループは、ループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠失によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間にある一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
概説
（１）ＣＤＣＡ５
癌治療に対するバイオマーカー及び／又は治療標的を同定するために、本発明者らは、２７６４８個の遺伝子を含有するｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、１２０症例の臨床的な肺癌及び食道癌の遺伝子発現プロファイルを解析した。これらの腫瘍において共通して上方制御した遺伝子の中で、後期促進複合体の基質をコードするＣＤＣＡ５が同定された。ノーザンブロット解析によって、試験した２３個の正常組織の中で睾丸でのみＣＤＣＡ５転写が同定された。ＣＤＣＡ５に対するｓｉＲＮＡによる癌細胞の治療が、その発現を抑制し、細胞成長を抑制した。他方で、ＣＤＣＡ５の外因性発現の誘導が、哺乳動物細胞での成長促進活性をもたらした。ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイが、ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２媒介性リン酸化又はＣＤＣＡ５のＥＲＫ媒介性リン酸化を検出した。ＣＤＣＡ５は、癌−睾丸抗原に分類することができ、細胞成長及び／又は生存に必須であるので、ＣＤＣＡ５及び／又はＣＤＣＡ５ポリペプチド上のＣＤＣ２ポリペプチド又はＥＲＫポリペプチドの酵素活性の標的となるのは、肺癌及び食道癌の開発中の治療に有望な戦略、例えば分子標的薬物及び癌ワクチンである。
（２）ＥＰＨＡ７
本発明者らは、肺癌及び食道癌の遺伝子発現プロファイルを研究し、肺癌及び食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）の大部分でタンパク質−チロシンキナーゼファミリーのエフリン受容体サブファミリーに属するエフリン受容体Ａ７（ＥＰＨＡ７）の発現の上昇を同定した。４０２個のアーカイブ非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と、２９２個のＥＳＣＣ試料とから成る腫瘍組織マイクロアレイを用いる免疫組織化学染色によって、高レベルのＥＰＨＡ７発現がＮＳＣＬＣ及びＥＳＣＣ患者での予後不良に関連があることが実証され、多変量解析によって、ＮＳＣＬＣに対する予後値が独立していることが確認された。本発明者らは、血清ＥＰＨＡ７を測定するためにＥＬＩＳＡを確立し、血清ＥＰＨＡ７陽性症例の割合は、２６４人の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の内１４９人（５６．４％）、７９人のＳＣＬＣ患者の内３５人（４４．３％）、及び９６人のＥＳＣＣ患者の内８１人（８４．４％）であったことが見いだされたが、１２７人の健常なボランティアの内６人（４．７％）しか間違って診断されなかった。ＥＰＨＡ７及びＣＥＡの両方に関する複合ＥＬＩＳＡは、ＮＳＣＬＣ患者の７７．２％を陽性として分類し、ＥＰＨＡ７及びＰｒｏＧＲＰの両方の使用によって、最大７７．５％までＳＣＬＣ検出における感受性を増大させたが、偽陽性率は７％〜８％であった。さらに、ＥＰＨＡ７に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の治療によって細胞成長が抑制され、ＥＰＨＡ７の誘導によって、細胞浸潤及び成長促進活性が増大した。その機能を研究するために、本発明者らは、癌細胞シグナル伝達に関連するホスホタンパク質に対する抗体パネルを用いて、ＥＰＨＡ７キナーゼに対する下流標的をスクリーニングし、ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ−８４５）、ＰＬＣγ（Ｔｙｒ−７８３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号:ＮＭ＿００２６６０、配列番号５２）、ＣＤＣ２５（Ｓｅｒ−２１６）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１７９０、配列番号５４）、ＭＥＴ（Ｔｙｒ−１２３０／１２３４／１２３５、Ｔｙｒ−１３１３、Ｔｙｒ−１３４９、Ｔｙｒ−１３６５）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００２４５、配列番号５６）、Ｓｈｃ（Ｔｙｒ３１７、Ｔｙｒ２３９／２４０）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１３００４１、配列番号５８）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０４００５６、配列番号５０）、Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１４４３１、配列番号６０）、及びＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１３９２７６）のＥＰＨＡ７誘導性リン酸化を同定した。これらのデータは、ＥＰＨＡ７が癌細胞の成長及び浸潤に重要な役割を果たし、有効な腫瘍バイオマーカー及び治療標的として有用であろうという結論と一致している。
（３）ＳＴＫ３１
１２０個の肺癌及び食道癌を用いた、２７６４８個の遺伝子の遺伝子発現プロファイル解析によって、セリン／スレオニンキナーゼ３１（ＳＴＫ３１）をコードする遺伝子がこれらの癌で頻繁に転写活性化することが示された。ＳＴＫ３１は、正常組織で睾丸特異的発現を示した。ＳＴＫ３１は癌細胞の細胞質及び核に局在していた。３６８個の肺癌を含有する組織マイクロアレイでのＳＴＫ３１の免疫組織化学染色によって、ＳＴＫ３１発現と、臨床転帰の不良との関連性が示され（Ｐ＝０．０１７８、ログランク検定）、これによりＳＴＫ３１が予後バイオマーカーとして有用ではないことが実証された。ＳＴＫ３１に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の治療がその発現を抑制し、成長抑制が起こった。他方で、ＳＴＫ３１の外因性発現の誘導が、哺乳動物細胞での成長促進活性をもたらした。組換えＳＴＫ３１タンパク質を用いたリン酸化アッセイが、そのキナーゼ活性を証明し、ＳＴＫ３１発現の導入が哺乳動物細胞でのＥＧＦＲ（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０４００５６、配列番号５０）及びＭＥＫ（Ｓｅｒ２１７／Ｓｅｒ２２１）のリン酸化をもたらした。本発明者らのデータは、ＳＴＫ３１の酵素活性の選択的阻害が分子標的作用物質及び癌ワクチンの開発に有望な治療戦略であるという結論と一致している。
（４）ＷＤＨＤ１
３２０００個の遺伝子のｃＤＮＡマイクロアレイ解析を通して、本発明者らは、肺癌及び食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）の大部分におけるＷＤ反復及びＨＭＧ−ボックスＤＮＡ結合プロテイン１（ＷＤＨＤ１）の広範な発現を見出した。ノーザンブロット解析は、睾丸以外の試験した任意の正常組織ではＷＤＨＤ１発現を同定しなかった。ＷＤＨＤ１は癌細胞の核に局在していた。抗ＷＤＨＤ１抗体によるＷＤＨＤ１の免疫沈降、その後のパン−ホスホ特異的抗体による免疫ブロット法によって、そのセリン残基及びチロシン残基でのＷＤＨＤ１のリン酸化が示された。２９７個のＥＳＣＣと２６４個の肺癌細胞をカバーする組織マイクロアレイ解析は、高レベルのＷＤＨＤ１発現と予後不良との関連性を示していた（それぞれＰ＝０．０２８５及び０．０２０８、ログランク検定）。ｓｉＲＮＡによるＷＤＨＤ１発現の抑制は癌細胞の成長を効率的に抑制した。
これに一致して、ＣＯＳ−７細胞におけるＷＤＨＤ１の外因性発現の誘導によって、その成長促進活性が示された。ＷＤＨＤ１をそのセリン残基及びチロシン残基でリン酸化した。ＷＤＨＤ１のレベルは、Ｇ１期からＳ期の移行期間で増大し、Ｓ期で最大レベルに達したが、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、ＬＹ２９４００２によって低減した。これらのデータは、ＷＤＨＤ１が癌−睾丸抗原に分類され、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を通した細胞周期進行に重要な役割を果たすことを示唆していた。発現性のＷＤＨＤ１活性の選択的阻害は、食道癌及び肺癌を治療する分子標的作用物質を開発するのに有望なアプローチである。
ＣＸ遺伝子（複数可）に対する二本鎖分子
（ｉ）標的配列
標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする、ＣＸ遺伝子（複数可）に対する二本鎖分子は、遺伝子の通常一本鎖のｍＲＮＡ転写産物に関連付け、それにより翻訳に干渉することにより、標的遺伝子でコードされるタンパク質の発現を阻害することによって、ＣＸ遺伝子（複数可）でコードされるＣＸタンパク質（複数可）の生成を阻害又は低減する。癌細胞株におけるＣＸ遺伝子（複数可）の発現は、本発明の二本鎖分子によって阻害され、癌細胞株におけるＣＤＣＡ５の発現は２つの二本鎖分子によって阻害され（図２Ａ及び図２Ｂ、上部パネル）、癌細胞株におけるＥＰＨＡ７の発現は二本鎖分子によって阻害され（図６Ａ、上部パネル）、癌細胞株におけるＳＴＫ３１の発現は二本鎖分子によって阻害され（図１１Ａ）、癌細胞株におけるＷＤＨＤ１の発現は二本鎖分子によって阻害された（図１５Ａ及び図１５Ｂ、上部パネル）。
したがって本発明は、細胞に導入されると癌細胞においてＣＸ遺伝子の発現を阻害又は低減する特性がある単離二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、以下で言及されるｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計される。
ＣＤＣＡ５標的配列としては例えば、ヌクレオチド
５’−ＧＣＡＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＴ−３’（配列番号４０）（配列番号１の８０８〜８２７ｎｔの位置で）又は
５’−ＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴ−３’（配列番号４１）（配列番号１の４７０〜４８８ｎｔの位置で）が挙げられる。
ＥＰＨＡ７標的配列として例えば、ヌクレオチド
５’−ＡＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＴＡ−３’（配列番号４２）（配列番号３の２１８２〜２２００ｎｔの位置で）又は
５’−ＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４３）（配列番号３の１９６８〜１９８７ｎｔの位置で）が挙げられる。
ＳＴＫ３１標的配列としては例えば、ヌクレオチド
５’−ＧＧＡＧＡＴＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴ−３’（配列番号３８）（配列番号５の１７１３〜１７３２ｎｔの位置で）又は
５’−ＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＴＳ−３’（配列番号３９）（配列番号５の２２８９〜２３０８ｎｔの位置で）が挙げられる。
ＷＤＨＤ１標的配列としては例えば、ヌクレオチド
５’−ＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＡ−３’（配列番号４４）（配列番号７の位置で）又は
５’−ＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡ−３’（配列番号４５）（配列番号７の位置で）が挙げられる。
具体的に、本発明は、以下の二本鎖分子［１］〜［１９］を提供する：
［１］単離二本鎖分子であって、
（ｉ）細胞に導入されると、ＣＤＣＡ５遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現と細胞増殖とを阻害し、上記二本鎖（double-attanded）分子が、配列番号４０（配列番号１の８０８〜８２７ｎｔの位置で）及び配列番号４１（配列番号１の４７０〜４８８ｎｔの位置で）から成る群から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡで作用し、
（ｉｉ）細胞に導入されると、ＥＰＨＡ７遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現と細胞増殖とを阻害し、上記二本鎖分子が、配列番号４２（配列番号３の２１８２〜２２００ｎｔの位置で）及び配列番号４３（配列番号３の１９６８〜１９８７ｎｔの位置で）から成る群から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡで作用し、
（ｉｉｉ）細胞に導入されると、ＳＴＫ３１遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現と細胞増殖とを阻害し、上記二本鎖分子が、配列番号３８（配列番号５の１７１３〜１７３２ｎｔの位置で）及び配列番号３９（配列番号５の２２８９〜２３０８ｎｔの位置で）から成る群から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡで作用し、
（ｉｖ）細胞に導入されると、ＷＤＨＤ１遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現と細胞増殖とを阻害し、上記二本鎖分子が、配列番号４４（配列番号７の位置で）及び配列番号４５（配列番号７の位置で）から成る群から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡで作用する
、単離二本鎖分子。
［２］センス鎖と、それに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成し、
（ｉ）上記センス鎖は、ＣＤＣＡ５では配列番号４０及び配列番号４１から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含み、
（ｉｉ）上記センス鎖は、ＥＰＨＡ７では配列番号４２及び配列番号４３から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含み、
（ｉｉｉ）上記センス鎖は、ＳＴＫ３１では配列番号３８及び配列番号３９から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含み、
（ｖｉ）上記センス鎖は、ＷＤＨＤ１では配列番号４４及び配列番号４５から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む
、［１］に記載の二本鎖分子。
［３］上記標的配列が、ヌクレオチド配列由来のＣＤＣＡ５では配列番号１、ＥＰＨＡ７では配列番号３、ＳＴＫ３１では配列番号５又はＷＤＨＤ１では配列番号７から選択される少なくとも約１０個の連続ヌクレオチドを含む、［１］に記載の二本鎖分子。
［４］上記標的配列が、ヌクレオチド配列由来のＣＤＣＡ５では配列番号１、ＥＰＨＡ７では配列番号３、ＳＴＫ３１では配列番号５又はＷＤＨＤ１では配列番号７から選択される少なくとも約１９〜約２５個の連続ヌクレオチドを含む、［３］に記載の二本鎖分子。
［５］約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［２］に記載の二本鎖分子。
［６］約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［５］に記載の二本鎖分子。
［７］約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［６］に記載の二本鎖分子。
［８］約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［７］に記載の二本鎖分子。
［９］約１９〜約２５ヌクレオチドの間の長さを有する、［８］に記載の二本鎖分子。
［１０］介在一本鎖によって連結したセンス鎖とアンチセンス鎖との両方を含む単一オリゴヌクレオチドから成る、［１］に記載の二本鎖分子。
［１１］一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、
［Ａ］はＣＤＣＡ５では配列番号４０及び配列番号４１、ＥＰＨＡ７では配列番号４２及び配列番号４３、ＳＴＫ３１では配列番号３８及び配列番号３９、ＷＤＨＤ１では配列番号４４及び配列番号４５から成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
［Ｂ］は介在一本鎖であり、
［Ａ’］は［Ａ］で選択された配列と相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である）を有する、［１０］に記載の二本鎖分子。
［１２］ＲＮＡを含む、［１］に記載の二本鎖分子。
［１３］ＤＮＡとＲＮＡとの両方を含む、［１］に記載の二本鎖分子。
［１４］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１３］に記載の二本鎖分子。
［１５］センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡ及びＲＮＡから構成される、［１４］に記載の二本鎖分子。
［１６］ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１３］に記載の二本鎖分子。
［１７］センス鎖における標的配列の５’末端領域、及び／又はアンチセンス鎖における標的配列の相補的な配列の３’末端領域がＲＮＡから成る、［１６］に記載の二本鎖分子。
［１８］ＲＮＡ領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［１７］に記載の二本鎖分子。
［１９］３’オーバーハングを含有する、［２］に記載の二本鎖分子。
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
細胞において標的遺伝子発現を阻害する能力がある二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば米国特許第６，５０６，５５９号明細書（その全体が本明細書中で参照により援用される）を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するコンピュータプログラムは、Ambionのウェブサイトから入手可能である（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）。
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
標的部位の設計
１． 転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、それぞれのアミノ酸の発生とその３’側に隣接した１９個のヌクレオチドとを記録する。Tuschl et al.は、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び開始コドン近くの領域（７５塩基以内）に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質及び／又は翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
２． 潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でのＮＣＢＩサーバーにあるＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25（17）:3389-402）。
３． 合成のために条件を満たす標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って評価する標的配列を幾つか選択するのが一般的である。
該プロトコルにより、本発明の単離二本鎖分子の標的配列は、以下のように設計された。
ＣＤＣＡ５標的配列としては例えば、ヌクレオチド
５’−ＧＣＡＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＴ−３’（配列番号４０）（配列番号１の８０８〜８２７ｎｔの位置で）又は
５’−ＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴ−３’（配列番号４１）（配列番号１の４７０〜４８８ｎｔの位置で）が挙げられる。
ＥＰＨＡ７標的配列として例えば、ヌクレオチド
５’−ＡＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＴＡ−３’（配列番号４２）（配列番号３の２１８２〜２２００ｎｔの位置で）又は
５’−ＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４３）（配列番号３の１９６８〜１９８７ｎｔの位置で）が挙げられる。
ＳＴＫ３１標的配列としては例えば、ヌクレオチド
５’−ＧＧＡＧＡＴＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴ−３’（配列番号３８）（配列番号５の１７１３〜１７３２ｎｔの位置で）又は
５’−ＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＴＳ−３’（配列番号３９）（配列番号５の２２８９〜２３０８ｎｔの位置で）が挙げられる。
ＷＤＨＤ１標的配列としては例えば、ヌクレオチド
５’−ＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＡ−３’（配列番号４４）（配列番号７の位置で）又は
５’−ＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡ−３’（配列番号４５）（配列番号７の位置で）が挙げられる。
具体的に、本発明は、上述の標的配列を標的とする以下の二本鎖分子を提供し、これらをそれぞれ標的遺伝子を発現する細胞の成長を阻害又は低減する能力に関して調べた。ＣＸ遺伝子（複数可）を発現する癌細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、ＣＸ遺伝子（複数可）を発現する細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、ＣＤＣＡ５発現細胞、例えば肺癌細胞株Ａ５４９及び肺癌細胞株ＬＣ３１９の成長は、２つの二本鎖分子によって阻害され（図２Ａ及び図２Ｂ、中央及び下部のパネル）、ＥＰＨＡ７発現細胞、例えば肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０及び肺癌細胞株ＳＢＣ−５の成長は、２つの二本鎖分子によって阻害され（図６Ａ、中央及び下部のパネル）、ＳＴＫ３１発現細胞、例えば肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７０の成長は、２つの二本鎖分子によって阻害され（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）、ＷＤＨＤ１発現細胞、例えば肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株ＴＥ９の成長は、２つの二本鎖分子によって阻害された（図１５Ａ、中央及び下部のパネル）。したがって、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する。
ＣＤＣＡ５標的配列としては例えば、ヌクレオチド
５’−ＧＣＡＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＴ−３’（配列番号４０）（配列番号１の８０８〜８２７ｎｔの位置で）又は
５’−ＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴ−３’（配列番号４１）（配列番号１の４７０〜４８８ｎｔの位置で）が挙げられる。
ＥＰＨＡ７標的配列として例えば、ヌクレオチド
５’−ＡＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＴＡ−３’（配列番号４２）（配列番号３の２１８２〜２２００ｎｔの位置で）又は
５’−ＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４３）（配列番号３の１９６８〜１９８７ｎｔの位置で）が挙げられる。
ＳＴＫ３１標的配列としては例えば、ヌクレオチド
５’−ＧＧＡＧＡＴＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴ−３’（配列番号３８）（配列番号５の１７１３〜１７３２ｎｔの位置で）又は
５’−ＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＴＳ−３’（配列番号３９）（配列番号５の２２８９〜２３０８ｎｔの位置で）が挙げられる。
ＷＤＨＤ１標的配列としては例えば、ヌクレオチド
５’−ＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＡ−３’（配列番号４４）（配列番号７の位置で）又は
５’−ＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡ−３’（配列番号４５）（配列番号７の位置で）が挙げられる。
本発明の二本鎖分子は単一標的ＣＸ遺伝子配列に関し、又は複数の標的ＣＸ遺伝子配列に関し得る。
ＣＸ遺伝子の上述の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子としては、標的配列の核酸配列及び／又は標的配列に相補的な配列のいずれかを含む単離ポリヌクレオチド（複数可）が挙げられる。ＣＤＣＡ５遺伝子を標的とする二本鎖分子の例としては、配列番号４０又は配列番号４１に対応する配列を含むオリゴヌクレオチドとそれに対する相補配列とが挙げられ、ＥＰＨＡ７遺伝子を標的とする二本鎖分子の例としては、配列番号４２又は配列番号４３に対応する配列を含むオリゴヌクレオチドとそれに対する相補配列とが挙げられ、ＳＴＫ３１遺伝子を標的とする二本鎖分子の例としては、配列番号３８又は配列番号３９に対応する配列を含むオリゴヌクレオチドとそれに対する相補配列とが挙げられ、ＷＤＨＤ１遺伝子を標的とする二本鎖分子の例としては、配列番号４４又は配列番号４５に対応する配列を含むオリゴヌクレオチドとそれに対する相補配列とが挙げられる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、修飾分子がＣＸ遺伝子の発現を抑制する能力を保持していれば、上述の核酸配列においてわずかな（minor）な修飾が許容可能である。本明細書で核酸配列における「わずかな修飾」は、配列への核酸の１つ、２つ又は幾つかの置換、欠失、付加又は挿入を示す。
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる（実施例１における（１２）ＲＮＡ干渉アッセイを参照されたい）。実施例では、ＣＸ遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含む二本鎖分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標準的な方法に従って癌細胞株におけるＣＸ遺伝子産物の産出を低減させる能力に関して試験した（例えば、ＣＤＣＡ５ではＬＣ３１９及びＡ５４９、ＥＰＨＡ７ではＮＣＩ−Ｈ５２０及びＳＢＣ−５、ＳＴＫ３１ではＬＣ３１９及びＮＣＩ−Ｈ２１７０、並びにＷＤＨＤ１ではＬＣ３１９を用いて）。さらに例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べて、候補二本鎖分子と接触させた細胞でのＣＸ遺伝子産物の低減は、言及された例えばＣＸ遺伝子のｍＲＮＡに対するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲで検出することができる（実施例１における（３）半定量ＲＴ−ＰＣＲを参照されたい）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースのアッセイにおけるＣＸ遺伝子産物の産生を低減する配列は、細胞成長に及ぼすこれらの阻害効果に関して試験することができる。それから、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースのアッセイにおける細胞成長を阻害する配列は、ＣＸ遺伝子産物の産生の低減及び癌細胞成長の低減を確認するために、癌を有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いてこれらのｉｎ ｖｉｖｏ能力に関して試験することができる。
単離ポリヌクレオチドがＲＮＡ又はそれらの誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用されるように、「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドユニット間のワトソンクリック型又はフーグスティーン型の塩基対合を表し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的な又は化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチド及び／又は非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドは同じように互いに結合することもできる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件化でハイブリダイズして、ほとんど又は全くミスマッチを含有しない安定二本鎖を形成する。さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子又はヘアピンループ構造を形成することができる。一実施形態において、このような二本鎖は１０個のマッチ毎にわずか１個のマッチしか含有していない。幾つかの実施形態では、二本鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二本鎖はミスマッチを含有しない。
ポリヌクレオチドはＣＤＣＡ５では２５０７ヌクレオチド長未満、ＥＰＨＡ７では５２２９ヌクレオチド長未満、ＳＴＫ３１では３２４４ヌクレオチド長未満、及びＷＤＨＤ１では１１２９ヌクレオチド長未満である。例えば、ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子では５００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、又は２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離ポリヌクレオチドは、ＣＸ遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、又は二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子を形成するのに使用される場合、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長く、例えば２１ヌクレオチドより長く、例えば約１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドであり得る。
本発明の二本鎖分子は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド及び／又は非ホスホジエステル結合を含有し得る。当該技術分野に既知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性及び／又は細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に取り込むことができる他の種類の化学修飾にも気づくであろう（国際公開第０３／０７０７４４号パンフレット、国際公開第２００５／０４５０３７号パンフレット）。一実施形態では、分解耐性の改善又は取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（universal base）」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び逆デオキシ脱塩基残基の組み込み（米国特許出願第２００６０１２２１３７号明細書）が挙げられる。
別の実施形態では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、又は標的化の効率を増大させるために修飾を用いることができる。修飾としては、二本鎖分子の２つの相補鎖間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３’末端又は５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾及び／又は骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチド及び２’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（国際公開第２００４／０２９２１２号パンフレット）。
別の実施形態において、標的ｍＲＮＡにおける、及び／又は相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性の増減に修飾を用いることができる（国際公開第２００５／０４４９７６号パンフレット）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、又は５−プロピルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デザプリン、７−アルキルプリン、又は７−アルケニルプリンに置換することができる。別の実施形態では、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端のヌクレオチドが突き出た（overhanging）ヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらに詳細には、公開文献、例えば米国特許出願第２００６０２３４９７０号明細書が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られた分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持していれば、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に利用することができる。
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡとＲＮＡとの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチド又はＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合物、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とから成るハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方又は両方上でＤＮＡとＲＮＡとの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に、標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるか、又はその反対のいずれかであってもよい。
幾つかの実施形態において、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に、標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖とアンチセンス鎖との両方がＤＮＡとＲＮＡとから成るか、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡとＲＮＡとから成ってもよい。二本鎖分子の安定性を向上するために、幾つかの実施形態では、分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する方が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、分子には発現の十分な阻害を誘導する範囲内でＲＮＡが必要である。キメラ型二本鎖分子の一例では、二本鎖分子の上流部分領域（即ちセンス鎖又はアンチセンス鎖内の標的配列又はその相補配列に隣接する領域）がＲＮＡである。
幾つかの実施形態では、上流部分領域は、センス鎖の５’側（５’末端）及びアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。即ち、幾つかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域との両方がＲＮＡから成る。例えば、本発明のキメラ又はハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：５’−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、及び
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−５’：アンチセンス鎖。
上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖内で、標的配列又はこれに対する相補配列の末端から数えて約９個〜１３個のヌクレオチドから成るドメインであり得る。さらに、かかるキメラ型二本鎖分子の例としては、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５’側領域及びアンチセンス鎖では３’側領域）がＲＮＡであり、もう半分がＤＮＡである１９個〜２１個のヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。かかるキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現阻害効果がかなり高くなる（米国特許出願第２００５０００４０６４号明細書）。
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びＤＮＡとＲＮＡとから成るショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成することができる。ｓｈＲＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができるタイトヘアピンカーブ（tight hairpin turn）を作る、ＲＮＡの配列又はＲＮＡとＤＮＡとの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分けられる。一般的に、ヘアピン構造は、細胞機構によってｄｓＲＮＡ又はｄｓＤ／Ｒ−ＮＡに切断され、続いてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合すると共に、これを切断する。
任意ヌクレオチド配列から成るループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列との間に位置し得る。したがって、本発明は、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、［Ａ］は標的配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である）を有する二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えば、ヌクレオチド
ＣＤＣＡ５では配列番号４０若しくは配列番号４１のヌクレオチド、又は
ＥＰＨＡ７では配列番号４２若しくは配列番号４３のヌクレオチド、
ＳＴＫ１では配列番号３８若しくは配列番号３９のヌクレオチド、
ＷＤＨＤ１では配列番号４４若しくは配列番号４５のヌクレオチドから成る群から選択され得る。
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、標的となるＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現を抑制する能力を保持し、これによりこれらの遺伝子を発現する細胞の阻害又は低減がもたらされれば、これらの例から修飾された配列であってもよい。［Ａ］領域は［Ａ’］領域とハイブリダイズし、［Ｂ］領域を含むループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、即ちループ配列は３ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列から成る群から選択することができる（http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドから成るループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、又はＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；及び
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
本発明のヘアピンループ構造を有する例示的な二本鎖分子は以下に示される。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ及びＵＵＣＡＡＧＡＧＡから成る群から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＣＤＣＡ５では、ＧＣＡＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＴ−［Ｂ］−ＡＣＣＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＴＧＣ（標的配列番号４０）；及び
ＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴ−［Ｂ］−ＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＴＧＧＣ（標的配列番号４１）；
ＥＰＨＡ７では、ＡＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＴＡ−［Ｂ］−ＴＡＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴ（標的配列番号４２）；及び
ＴＡＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡ−［Ｂ］−ＴＴＣＴＴＧＧＴＣＡＧＣＴＴＴＧＣＴＡ（標的配列番号４３）；
ＳＴＫ３１では、ＧＧＡＧＡＴＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴ−［Ｂ］−ＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＴＣＴＣＣ（標的配列番号３８）；及び
ＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＴ−［Ｂ］−ＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＣ（標的配列番号３９）；並びに
ＷＤＨＤ１では、ＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＡ−［Ｂ］−ＴＡＡＴＡＧＣＡＣＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣ（標的配列番号４４）；及び
ＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＴＡ−［Ｂ］−ＴＡＧＧＡＧＴＣＣＡＣＧＴＡＴＴＡＣＣ（標的配列番号４５）。
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、ヌクレオチド「ｕ」を３’オーバーハングとして標的配列のアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。付加される「ｕ」の数は少なくとも２、概して２〜１０、例えば２〜５である。付加される「ｕ」は二本鎖分子のアンチセンス鎖の３’末端で一本鎖を形成する。
二本鎖分子を調製する方法は、当該技術分野で既知の化学合成方法のいずれかを利用することができる。化学合成方法に従って、センス鎖及びアンチセンス鎖の一本鎖ポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する一実施形態では、合成一本鎖ポリヌクレオチドは少なくとも約３：７、例えば約４：６、例えば実質的に等モル量（即ち約５：５のモル比）のモル比で混合される。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリング二本鎖ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製方法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用するか、又は残存一本鎖ポリヌクレオチドが、例えば適当な酵素による分解によって取り除かれる方法が挙げられる。
標的配列に隣接する調節配列は同一であっても又は異なっていてもよく、このためこれらの発現は別々に又は一時的に又は空間的に調整することができる。二本鎖分子は、ＣＸ遺伝子鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニット又はヒトＨ１ ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって細胞内で転写することができる。
（ｉｉ）ベクター
本明細書に記載の二本鎖分子を１つ又は複数含有するベクター、及び該ベクターを含有する細胞も本発明に包含される。本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書中で、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入される場合、ベクターが前記分子を発現するであろうことを示す。一実施形態では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な制御要素を含む。かかる本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに、又は癌を治療するための活性成分として直接使用することができる。
本発明のベクターは、例えば、両方の鎖を（ＤＮＡ分子の転写によって）発現されるような方法で制御配列が機能的に連結するように、標的配列を含む配列を発現ベクターにクローニングすることによって生成することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖であるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングＤＮＡの３’末端と隣接するプロモーター配列）によって転写され、ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えばクローニングＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがｉｎ ｖｉｖｏでハイブリダイズし、遺伝子をサイレンシングするために二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれコードする２つのベクター構築物は、センス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現した後、二本鎖分子構築物を形成するために利用する。さらに、クローニング配列は二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列と相補的なアンチセンス配列との両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる（例えば相同的な組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書、同第５，８０４，５６６号明細書、同第５，７３９，１１８号明細書、同第５，７３６，５２４号明細書、同第５，６７９，６４７号明細書、及び国際公開第９８／０４７２０号パンフレットを参照されたい。ＤＮＡベースの送達技法の例としては、「ネイキッド（naked：裸）ＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン（bupivicaine）、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子媒介性（「遺伝子銃」）又は圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号明細書を参照されたい）。
本発明のベクターは例えば、ウイルス又は細菌ベクターであり得る。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主、例えば牛痘又は鶏痘が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号明細書を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての牛痘ウイルスの使用を含む。標的遺伝子を発現する細胞に導入する際、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin）（ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与及び生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、及びHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
（ｉｉｉ）癌細胞の成長を阻害若しくは低減する、又は二本鎖分子を用いて癌を治療若しくは予防する方法
本発明において、上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、標的遺伝子を（過剰）発現する細胞の成長を阻害又は低減する能力に関して試験した。ＣＸ遺伝子（複数可）を（過剰）発現する癌細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、ＣＸ遺伝子（複数可）を（過剰）発現する細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、ＣＤＣＡ５（過剰）発現細胞、例えば肺癌細胞株Ａ５４９及び肺癌細胞株ＬＣ３１９の成長は２つの二本鎖分子によって阻害され（図２Ａ及び図２Ｂ、中央及び下部のパネル）、ＥＰＨＡ７発現細胞、例えば肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０及び肺癌細胞株ＳＢＣ−５の成長は２つの二本鎖分子によって阻害され（図６Ａ、中央及び下部のパネル）、ＳＴＫ３１発現細胞、例えば肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７０の成長は２つの二本鎖分子によって阻害された（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。ＷＤＨＤ１発現細胞、例えば肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株ＴＥ９の成長は２つの二本鎖分子によって阻害された（図１５Ａ、中央及び下部のパネル）。
したがって本発明は、ＣＸ遺伝子の発現を阻害することによって、細胞成長、即ちＣＸ遺伝子の過剰発現から生じる又はＣＸ遺伝子によって媒介される、癌由来の細胞の癌性細胞成長を阻害する方法を提供する。ＣＸ遺伝子の発現は、特に相補的なＣＸ遺伝子の発現を標的とする、上述の本発明の二本鎖分子、又は二本鎖分子のいずれかを発現することができる本発明のベクターのいずれかによって阻害することができる。
本発明の二本鎖分子及びベクターの癌性細胞の細胞成長を阻害するような能力は、これらが癌、即ちＣＸ遺伝子の過剰発現によって生じる、又はＣＸ遺伝子によって媒介される癌を治療する方法に使用することができることを示している。したがって、本発明は、これらの遺伝子が正常器官ではほとんど検出されなかったので、有害な効果なくＣＸ遺伝子に対する二本鎖分子、即ち阻害核酸又は分子を発現するベクターを投与することによって、ＣＸ遺伝子の過剰発現によって生じる、又はＣＸ遺伝子によって媒介される癌を有する患者を治療する方法を提供する。
特に本発明は、以下の方法［１］〜［２２］を提供する：
［１］ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるＣＸ遺伝子を（過剰）発現する細胞の成長を阻害若しくは低減する方法、又はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子を（過剰）発現する癌を治療若しくは予防する方法であって、該方法が少なくとも１つの二本鎖分子を与える工程を含み、該二本鎖分子が細胞に導入され、該ＣＸ遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現を阻害又は低減する、方法。
［２］上記二本鎖分子が、ＣＤＣＡ５では配列番号４０（配列番号１の８０８〜８２７ｎｔ位で）及び配列番号４１（配列番号１の４７０〜４８８ｎｔ位で）と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２（配列番号３の２１８２〜２２００ｎｔ位で）及び配列番号４３（配列番号３の１９６８〜１９８７ｎｔ位で）と、ＳＴＫ３１では配列番号３８（配列番号５の１７１３〜１７３２ｎｔ位で）及び配列番号３９（配列番号５の２２８９〜２３０８ｎｔ位で）と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４（配列番号７の５７７〜５９６ｎｔ位で）及び配列番号４５（配列番号７の２０４１〜２０６０ｎｔ位で）とから成る群から選択される標的配列と配列同一性を共有する、又はこれに対して相補的であるｍＲＮＡで作用する、［１］に記載の方法。
［３］上記二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、該センス鎖が、ＣＤＣＡ５では配列番号４０及び配列番号４１と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２及び配列番号４３と、ＳＴＫ３１では配列番号３８及び配列番号３９と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４及び配列番号４５とから成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、［２］に記載の方法。
［４］複数の二本鎖分子が投与される、［１］に記載の方法。幾つかの実施形態では、二本鎖分子は異なる核酸配列を含む。
［５］複数の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、［４］に記載の方法。
［６］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［１］に記載の方法。
［７］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［６］に記載の方法。
［８］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［７］に記載の方法。
［９］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［８］に記載の方法。
［１０］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長の間である、［９］に記載の方法。
［１１］上記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一オリゴヌクレオチドから成る、［１］に記載の方法。
［１２］上記二本鎖分子が一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、
［Ａ］は、ＣＤＣＡ５では配列番号４０及び配列番号４１と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２及び配列番号４３と、ＳＴＫ３１では配列番号３８及び配列番号３９と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４及び配列番号４５とから成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
［Ｂ］は介在一本鎖であり、
［Ａ’］は［Ａ］で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む前記アンチセンス鎖である）を有する、［１１］に記載の方法。
［１３］二本鎖分子がＲＮＡを含む、［１］に記載の方法。
［１４］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとの両方を含む、［１］に記載の方法。
［１５］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１４］に記載の方法。
［１６］センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、ＤＮＡとＲＮＡとから成る、［１５］に記載の方法。
［１７］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１４］に記載の方法。
［１８］センス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの１つ又は両方の５’末端に隣接する領域がＲＮＡから成る、［１７］に記載の方法。
［１９］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［１８］に記載の方法。
［２０］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有する、［１］に記載の方法。
［２１］二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］に記載の方法。
［２２］上記二本鎖分子が一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、
［Ａ］は、ＣＤＣＡ５では配列番号４０及び配列番号４１と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２及び配列番号４３と、ＳＴＫ３１では配列番号３８及び配列番号３９と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４及び配列番号４５とから成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
［Ｂ］は介在一本鎖であり、
［Ａ’］は［Ａ］で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む前記アンチセンス鎖である）を有する、［２１］に記載の方法。
［２３］二本鎖分子が、分子の他にトランスフェクション増強剤と細胞浸透剤とを含む組成物中に含有される、［１］に記載の方法。
本方法は以下でより詳細に説明される。
ＣＸ遺伝子を（過剰）発現する細胞の成長は、細胞を、ＣＸ遺伝子に対する二本鎖分子、分子を発現するベクター、又はこれを含む組成物に接触させることによって阻害される。さらに細胞を、トランスフェクション剤に接触させる。好適なトランスフェクション剤は当該技術分野で既知である。「細胞成長の阻害」という語句は、細胞が、分子に曝露されない細胞に比べて、より遅い速度で増殖するか、又は生存率が低減する。細胞成長は、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いた当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現又は過剰発現していれば、いずれかの種類の細胞の増殖も本発明に従って抑制することができる。例示的な細胞としては癌細胞が挙げられる。
したがって、ＣＸ遺伝子に関連する疾患を患う又は発症する危険性がある患者は、少なくとも１つの本発明の二本鎖分子、少なくとも１つの分子を発現する少なくとも１つのベクター、又は少なくとも１つの分子を含む少なくとも１つの組成物を投与することによって治療することができる。例えば、癌患者は本方法に従って治療することができる。癌の種類は、診断される特定種類の腫瘍に従って、標準的な方法によって同定することができる。幾つかの実施形態では、本方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション又はイムノアッセイによって、患者由来の生検材料で、ＣＸ遺伝子の（過剰）発現を検出することによって選択される。幾つかの実施形態では、本発明の治療の前に、被検体由来の生検標本が、当該技術分野で既知の方法、例えば免疫組織化学解析、ハイブリダイゼーション又はＲＴ−ＰＣＲによって、ＣＸ遺伝子を過剰発現することが確認される（実施例１における（３）半定量ＲＴ−ＰＣＲ、（４）ノーザンブロット解析、（５）ウェスタンブロット法、（８）免疫組織化学又は（１０）ＥＬＩＳＡを参照されたい）。
細胞成長を阻害又は低減し、それにより癌を治療する本方法によれば、複数の種類の二本鎖分子（又はこれを発現するベクター又はこれを含有する組成物）を投与する場合、それぞれの分子は、同じ遺伝子の異なる標的配列、又は異なる遺伝子の異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば、方法は、同じＣＸ遺伝子転写産物に指向性を有する異なる二本鎖分子を利用することができる。代替的に例えば、方法は、同じＣＸ遺伝子から選択される１つ、２つ又はそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を利用することができる。
細胞成長を阻害するために、本発明の二本鎖分子は、分子と対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成する形態で、細胞に直接導入することができる。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡは、ベクターとして細胞に導入することができる。二本鎖分子及びベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Roche diagnostics）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Invitrogen）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬工業株式会社）を利用することができる。
治療は、臨床的利点、例えばＣＸ遺伝子の発現の低減、又は被検体における癌のサイズ、有病率若しくは転移能の減少をもたらすかどうかで有効であるかを求められる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、治療が癌の形成を遅らせる若しくは防ぐか、又は癌の臨床症状を緩和するという意味である。有効性（Efficaciousness）は、特定の腫瘍型を診断又は治療する任意の既知の方法に関連して求められる。
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量で標的ｍＲＮＡ（ＣＸ遺伝子転写産物）を分解することが理解される。理論に束縛されないが、本発明の二本鎖分子によって、触媒的に標的ｍＲＮＡの分解が起こると考えられている。したがって、標準的な癌治療に比べて、治療効果を発揮するために癌部位に又はその近くに送達される必要のある二本鎖分子は、有意に少ない。
当業者は、因子、例えば被検体の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状及び他の状態；投与経路；並びに投与が局所的又は全身的のいずれであるかを考慮して、所定の被検体に投与されるべき、本発明の二本鎖分子の有効量を容易に求めることができる。概して、有効量の本発明の二本鎖分子は、癌部位に又はその近くに、細胞内濃度が約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、例えば約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、例えば約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭの二本鎖分子を含む。より多くの又はより少ない量の二本鎖分子を投与することができることが考慮される。
本方法は、癌、例えばＣＸ遺伝子の過剰発現によって生じる、又はＣＸ遺伝子によって媒介される癌、例えば肺癌又は食道癌の成長又は転移を阻害するのに使用することができる。特に、ＣＤＣＡ５では配列番号４０（配列番号１の８０８〜８２７ｎｔ位で）及び配列番号４１（配列番号１の４７０〜４８８ｎｔ位で）と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２（配列番号３の２１８２〜２２００ｎｔ位で）及び配列番号４３（配列番号３の１９６８〜１９８７ｎｔ位で）と、ＳＴＫ３１では配列番号３８（配列番号５の１７１３〜１７３２ｎｔ位で）及び配列番号３９（配列番号５の２２８９〜２３０８ｎｔ位で）と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４（配列番号７の５７７〜５９６ｎｔ位で）及び配列番号４５（配列番号７の２０４１〜２０６０ｎｔ位で）とから成る群から選択される標的配列に指向性を有する二本鎖分子は、癌の治療のための使用が見出される。
癌、例えばＣＸ遺伝子によって促進される癌を治療するために、本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子とは異なる医薬品と併用して被検体に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子は、癌を治療するために設計される別の治療法と併用して被検体に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、癌を治療する又は癌転移を予防するのに現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術及び化学療法剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン又はタモキシフェン）を用いた治療）と併用して投与することができる。
本方法において、二本鎖分子は、送達試薬と共にネイキッド二本鎖分子、又は該二本鎖分子を発現する組換えプラスミド若しくはウイルスベクターとしてのいずれかで被検体に投与することができる。
本発明の二本鎖分子と共に投与するのに好適な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、又はポリカチオン（例えばポリリシン）又はリポソームが挙げられる。一実施形態では、送達試薬はリポソームである。
リポソームは、特定の組織、例えば網膜組織又は腫瘍組織への二本鎖分子の送達に役立ち、二本鎖分子の血液半減期も増大させ得る。本発明での使用に好適なリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、概してこれには、中性又は負に帯電したリン脂質とステロール、例えばコレステロールとが含まれる。一般的には、所望のリポソームのサイズ及び血流中におけるリポソームの半減期などの因子を考慮して、脂質の選択が導かれる。リポソームを調製するのに、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、及び米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第５，０１９，３６９号明細書（その開示全体が参照により本明細書に引用される）で記載されるような様々な方法が知られている。
幾つかの実施形態において、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、リポソームを癌部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍又は小胞内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原又は内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体のための使用が見出される。
幾つかの実施形態では、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン阻害部分を有することによって、単核マクロファージ及び網内系によるクリアランスを避けるように修飾される。一実施形態では、本発明のリポソームは、オプソニン阻害部分とリガンドとの両方を含み得る。
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン阻害部分は、例えば脂質−可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、又は膜脂質の活性基への直接結合によって、膜と化学的に又は物理的に接着する場合に、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン阻害親水性ポリマーは、例えば米国特許第４，９２０，０１６号明細書（その開示全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）及び網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもかなり長く循環血液中に留まる。このため、かかるリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
ステルスリポソームは、多孔性又は「漏出性（leaky）」微小血管系によって送り込まれる組織中で集積することが知られている。したがって、かかる微小血管系の欠陥を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍は効率的にこれらのリポソームを集積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減が、肝臓及び脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
リポソームを修飾するのに好適なオプソニン阻害部分は、分子量が約５００ダルトン〜約４００００ダルトン、例えば約２０００ダルトン〜約２００００ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。かかるポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧ又はＰＰＧ、及びＰＥＧ又はＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド又はポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分岐又は樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えばカルボン酸基又はアミノ基が化学結合したポリビニルアルコール及びポリキシリトール、並びにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ若しくはメトキシＰＰＧのコポリマー、又はそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、又はポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン阻害ポリマーは、アミノ酸又はカルボン酸を含有する天然多糖（例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン）；アミノ化多糖又はオリゴ糖（直鎖又は分岐）；又はカルボン酸基の連結を有するカルボン酸の誘導体と反応させたカルボキシル化多糖又はカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
幾つかの実施形態では、オプソニン阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ又はその誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体によって変性したリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
オプソニン阻害部分は、多くの既知の技法のいずれか１つによってリポソーム膜と結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃でＮａ（ＣＮ）ＢＨ３及び溶媒混合物（例えばテトラヒドロフランと水とを３０：１２の比で）を用いて還元アミノ化によってステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で検討される。少なくとも１つの本発明の二本鎖分子を発現するかかるベクターもまた、直接又は好適な送達試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、又はポリカチオン（例えばポリリシン）又はリポソームを含む）と共に投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者の癌領域に送達する方法は当該技術分野内である。
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子を癌部位に送達するのに好適な任意の手段によって、被検体に投与することができる。例えば、二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、又は他の好適な非経口投与経路若しくは腸内投与経路によって投与することができる。
好適な腸内投与経路としては、経口、直腸又は鼻腔送達が挙げられる。
好適な非経口投与経路としては、静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入及び血管系へのカテーテル点滴）；傍組織及び組織内注射（例えば傍腫瘍及び腫瘍内注射、網膜内注射、又は網膜下注射）；皮下注入を含む皮下注射又は皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによって）；例えばカテーテル若しくは他の留置装置（placement device）（例えば、多孔性、非孔性又はゼラチン様材料を含む、網膜ペレット又は坐剤又はインプラント）による癌部位の領域又はその近くの領域への直接適用；並びに吸入が挙げられる。幾つかの実施形態では、二本鎖分子又はベクターの注射又は注入は、癌の部位で又はその近くで行われる。
本発明の二本鎖分子は、単回投与又は複数回の投与で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続投与で行うか、又は複数回の注入によって送達することができる。作用物質の注射は、癌部位の組織、又は癌部位の近くの組織に直接行うことができる。癌部位の組織に又は癌部位の近くの組織に作用物質を複数回注射することによって、投与することができる。
当業者は容易に、本発明の二本鎖分子を所定の被検体に投与するのに適当な投薬計画（dosage regimen）を決定することもできる。例えば、二本鎖分子は、例えば癌部位での又はその近くでの単回注射又は沈着として被検体に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子は、約３日〜約２８日、例えば約７日〜約１０日の間、１日１回又は２回、被検体に投与することができる。例示的な一投与計画では、二本鎖分子は７日間、１日１回、癌部位に又はその近くに注射される。投与計画に複数回の投与が含まれる場合、被検体に投与される二本鎖分子の有効量は、投与計画全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことが理解される。
（ｉｖ）組成物
さらに本発明は、分子をコードする、本発明の二本鎖分子又はベクターの少なくとも１つを含む医薬組成物を提供する。特に本発明は、以下の組成物［１］〜［２４］を提供する：
［１］ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子を発現する細胞の成長を阻害若しくは低減する組成物、又はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるＣＸ遺伝子を発現する癌を治療若しくは予防する組成物であって、該組成物が少なくとも１つの二本鎖分子を含み、該二本鎖分子が細胞に導入され、該遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現を阻害又は低減する、組成物。
［２］上記二本鎖分子が、ＣＤＣＡ５では配列番号４０（配列番号１の８０８〜８２７ｎｔ位で）及び配列番号４１（配列番号１の４７０〜４８８ｎｔ位で）と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２（配列番号３の２１８２〜２２００ｎｔ位で）及び配列番号４３（配列番号３の１９６８〜１９８７ｎｔ位で）と、ＳＴＫ３１では配列番号３８（配列番号５の１７１３〜１７３２ｎｔ位で）及び配列番号３９（配列番号５の２２８９〜２３０８ｎｔ位で）と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４（配列番号７の５７７〜５９６ｎｔ位で）及び配列番号４５（配列番号７の２０４１〜２０６０ｎｔ位で）とから成る群から選択される標的配列と適合するｍＲＮＡで作用する、［１］に記載の組成物。
［３］上記二本鎖分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、該センス鎖が、ＣＤＣＡ５では配列番号４０及び配列番号４１と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２及び配列番号４３と、ＳＴＫ３１では配列番号３８及び配列番号３９と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４及び配列番号４５とから成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、［２］に記載の組成物。
治療される癌が、ＣＸ遺伝子の過剰発現によって生じる、又はＣＸ遺伝子によって媒介される癌である、［１］に記載の組成物。
［４］治療される癌が肺癌又は食道癌である、［１］に記載の組成物。
［５］肺癌が小細胞肺癌又は非小細胞肺癌である、［４］に記載の組成物。
［６］組成物が複数種類の二本鎖分子を含有する、［１］に記載の組成物。
［７］複数種類の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、［６］に記載の組成物。
［８］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［１］に記載の組成物。
［９］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［８］に記載の組成物。
［１０］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［９］に記載の組成物。
［１１］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［１０］に記載の組成物。
［１２］二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長の間である、［１１］に記載の組成物。
［１３］上記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一オリゴヌクレオチドから成る、［１］に記載の組成物。
［１４］上記二本鎖分子が一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、
［Ａ］は、ＣＤＣＡ５では配列番号４０及び配列番号４１と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２及び配列番号４３と、ＳＴＫ３１では配列番号３８及び配列番号３９と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４及び配列番号４５とから成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
［Ｂ］は介在一本鎖であり、
［Ａ’］は［Ａ］で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス鎖である）を有する、［１３］に記載の組成物。
［１５］二本鎖分子がＲＮＡを含む、［１］に記載の組成物。
［１６］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとを含む、［１］に記載の組成物。
［１７］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１６］に記載の組成物。
［１８］センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、ＤＮＡとＲＮＡとから成る、［１７］に記載の組成物。
［１９］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１８］に記載の組成物。
［２０］センス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖ポリヌクレオチドの１つ又は両方の５’末端に隣接する少なくとも１つの領域がＲＮＡから成る、［１９］に記載の組成物。
［２１］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［２０］に記載の組成物。
［２２］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有する、［１］に記載の組成物。
［２３］二本鎖分子がベクターによってコードされ、組成物に含有される、［１］に記載の組成物。
［２４］トランスフェクション増強剤と、細胞浸透剤と、薬学的に許容可能な担体とをさらに含む、［１］に記載の組成物。
本方法は以下でより詳細に説明される。
本発明の二本鎖分子は、当該技術分野で既知の技法に従って、被検体に投与する前に医薬組成物として配合することができる。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり且つパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書で使用されるように、「薬学的製剤（pharmaceutical formulation）」は、ヒト及び獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.（1985）（その開示全体が参照により本明細書に援用される）に記載のように当該技術分野内である。
本発明の薬学的製剤は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合して、本発明の二本鎖分子又はこれをコードするベクターの少なくとも１つ（例えば０．１重量％〜９０重量％）、又は該分子の生理学的に許容可能な塩を含む。例示的な生理学的に許容可能な担体媒体としては例えば、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等が挙げられる。
本発明によれば、組成物は、複数種類の二本鎖分子を含有することができ、その分子のそれぞれが、ＣＸ遺伝子の同じ標的配列又は異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば、組成物は、ＣＸ遺伝子に指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。代替的に、例えば組成物は、ＣＸ遺伝子から選択される、１つ、２つ又はそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。
さらに本発明の組成物は、１つ又は複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有することができる。例えばベクターは、１つ、２つ又は幾つかの種類の本発明の二本鎖分子をコードすることができる。代替的に本発明の組成物は、複数種類のベクターを含有することができ、そのベクターのそれぞれが異なる二本鎖分子をコードする。
その上、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「癌を治療する方法」の項を参照されたい。
本発明の医薬組成物は、従来の薬学的賦形剤及び／又は添加剤も含み得る。好適な薬学的賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、バッファ及びｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性があるバッファ（例えば塩酸トロメタミン）、キレート剤（chelant）の添加物（例えばＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミド）又はカルシウム錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、又は任意でカルシウムキレート塩若しくはナトリウム塩の添加物（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、又は凍結乾燥されていてもよい。
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば医薬品品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
例えば、経口投与するための固体医薬組成物は、上記で列挙された担体及び賦形剤のいずれかと、１０％〜９５％、例えば２５％〜７５％の１つ又は複数の本発明の二本鎖分子とを含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、上記のようにリポソームに封入される０．０１重量％〜２０重量％、例えば１重量％〜１０重量％の１つ又は複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含み得る。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達ではレシチンが含まれ得る。
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のｉｎ ｖｉｖｏ機能を阻害しなければ、他の薬学的に活性のある成分を含有することができる。例えば組成物は、癌を治療するのに従来使用される化学療法剤を含有することができる。
本発明は、ＣＸ遺伝子を（過剰）発現する癌を治療するための医薬組成物を製造する際の本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば本発明は、ＣＸ遺伝子を（過剰）発現する癌を治療するための医薬組成物を製造するための、ＣＸ遺伝子を過剰発現する細胞での該遺伝子の（過剰）発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用であって、ＣＸ遺伝子は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択され、この分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、配列番号３８〜配列番号４５から成る群から選択される配列を標的とする、二本鎖核酸分子の使用に関する。
本発明はさらに、ＣＸ遺伝子を（過剰）発現する癌を治療するための医薬組成物を製造する方法又はプロセスであって、この方法又はプロセスが、ＣＸ遺伝子を過剰発現する細胞で活性成分としての該遺伝子の（過剰）発現を阻害する二本鎖核酸分子に、薬学的に又は生理学的に許容可能な担体を配合する工程を含み、ＣＸ遺伝子はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択され、この分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、配列番号３８〜配列番号４５から成る群から選択される配列を標的とする、方法又はプロセスを提供する。
本発明は、ＣＸ遺伝子を（過剰）発現する癌を治療するための医薬組成物を製造する方法又はプロセスであって、この方法又はプロセスが、活性成分を薬学的に又は生理学的に許容可能な担体と混和させる工程を含み、活性成分は、ＣＸ遺伝子を過剰発現する細胞で該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、ＣＸ遺伝子はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択され、この分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成する、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、配列番号３８〜配列番号４５から成る群から選択される標的配列を標的とする、方法又はプロセスも提供する。
ＣＸ遺伝子媒介性癌を診断する方法
ＣＸ遺伝子（複数可）の発現は、対応する正常組織に比べて、肺癌及び食道癌の組織で特に上昇することが見出された（ＣＤＣＡ５に関しては図１、ＥＰＨＡ７に関しては図３、ＳＴＫ３１に関しては図９、及びＷＤＨＤ１に関しては図１３）。したがって、本明細書で同定された遺伝子、並びにその転写産物及び翻訳産物は、１つ又は複数のＣＸ遺伝子によって媒介される癌に対するマーカーとして診断有用性を有し、癌を患っている疑いがある患者由来の試料においてＣＸ遺伝子（複数可）の発現を測定することによって、これらの癌を診断することができる。特に本発明は、被検体においてＣＸ遺伝子（複数可）の発現レベルを測定することによって、１つ又は複数のＣＸ遺伝子によって媒介される癌を診断する方法を提供する。本方法によって診断することができるＣＸ遺伝子促進癌としては、肺癌及び食道癌が挙げられる。肺癌としては、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌が挙げられる。ＣＸ遺伝子は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択され得る。
本発明に従って、被検体の状態を試験する中間結果が与えられ得る。かかる中間結果は、医者、看護師又は他の療法士（practitioner）が、被検体が疾患を患っていると診断するのを補助する付加的情報と組み合わせることができる。代替的に、本方法は、被検体から得た組織において癌性細胞を検出するため、及び被検体が疾患を患っていることを診断するのに有用な情報を医者に与えるために使用することができる。
特に本発明は、以下の方法［１］〜［１０］を提供する：
［１］癌、例えばＣＸ遺伝子によって媒介又は促進される癌を診断する方法であって、
（ａ）生体試料において、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子の発現レベルを検出する工程と、
（ｂ）遺伝子の正常対照レベルに対する発現レベルの増大を疾患と関連付ける工程とを含む、方法。
［２］発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、［１］に記載の方法。
［３］発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドを検出すること、並びに
（ｃ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドの生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか１つによって検出される、［２］に記載の方法。
癌がＣＸ遺伝子の過剰発現によって生じるか、又はＣＸ遺伝子によって媒介若しくは促進される、［１］に記載の方法。
［４］癌が肺癌又は食道癌である、［１］に記載の方法。
［５］肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、［４］に記載の方法。
［６］発現レベルが、プローブと、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子転写産物とのハイブリダイゼーションを検出することによって求められる、［３］に記載の方法。
［７］発現レベルが、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドに対する抗体の結合を検出することによって求められる、［３］に記載の方法。
［８］生体試料が生検材料、痰又は血液を含む、［１］に記載の方法。
［９］被検体から得た生体試料が、上皮細胞、血清、胸水又は食道粘液を含む、［１］に記載の方法。
［１０］被検体から得た生体試料が癌細胞を含む、［１］に記載の方法。
［１１］被検体から得た生体試料が癌性上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
癌を診断する方法が以下でより詳細に説明される。
本方法によって診断される被検体は哺乳動物であり得る。例示的な哺乳動物としては例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが挙げられるが、これらに限定されない。
本方法を実施する際に、生体試料を、診断する被検体から採取し、診断を実施する。任意の生体材料は、ＣＸ遺伝子（複数可）の目的となる転写産物又は翻訳産物を含んでいれば、測定のための生体試料として使用することができる。生体試料としては、身体組織及び体液、例えば血液（例えば血清、痰、尿及び胸水）が挙げられる。幾つかの実施形態では、生体試料は、上皮細胞、例えば癌性上皮細胞又は癌性である疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含有する。さらに、必要であれば、細胞を得られた身体組織及び体液から精製した後、生体試料として使用することができる。
本発明に従って、被検体から得た生体試料におけるＣＸ遺伝子（複数可）の発現レベルが求められる。発現レベルは、当該技術分野で既知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで求めることができる。例えば、ＣＸ遺伝子（複数可）のｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンブロット解析）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップ又はアレイで実施することができる。アレイの使用は、ＣＸ遺伝子を含む複数の遺伝子（例えば様々な癌特異的遺伝子）の発現レベルを検出するためのものであり得る。当業者は、ＣＤＣＡ５（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１１０００）、ＥＰＨＡ７（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４４０）、ＳＴＫ３１（配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２９４４．１）又はＷＤＨＤ１（配列番号７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７０８６．２）の配列情報を利用して、かかるプローブを調製することができる。例えば、ＣＸ遺伝子（複数可）のｃＤＮＡはプローブとして使用することができる。必要であれば、プローブは、好適な標識、例えば染料、蛍光色素及びアイソトープで標識することができ、遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイズされた標識の強度として検出することができる（実施例１における（４）ノーザンブロット解析を参照されたい）。
さらに、ＣＸ遺伝子の転写産物は、増幅ベースの検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）でプライマーを用いて定量することができる。かかるプライマーは、利用可能な遺伝子の配列情報に基づき調製することもできる。例えば、実施例で使用されるプライマー（ＣＤＣＡ５では配列番号１１及び配列番号１２又は配列番号１９及び配列番号２０、ＥＰＨＡ７では配列番号１３及び配列番号１４、ＳＴＫ３１では配列番号１５及び配列番号１６又は配列番号２１及び配列番号１６、並びにＷＤＨＤ１では配列番号１７及び配列番号１８又は配列番号２２及び配列番号１８）は、ＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロット解析による検出に利用することができるが、本発明はそれらに限定されない（実施例１における（３）半定量ＲＴ−ＰＣＲ及び（４）ノーザンブロット解析を参照されたい）。
特に、本方法で使用されるプローブ又はプライマーは、ストリンジェント、中程度ストリンジェント、又は低ストリンジェントの条件下でＣＸ遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。
代替的に翻訳産物は、本発明の診断のために検出することができる。例えば、ＣＸタンパク質の量を求めることができる。翻訳産物としてタンパク質の量を求める方法としては、タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾断片（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）は、断片がＣＸタンパク質との結合能を保持していれば、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる（定義における（２）抗体を参照されたい）。
その翻訳産物に基づきＣＸ遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＣＸタンパク質に対する抗体を用いて、免疫組織化学解析によって染色の強度を観察することができる。即ち、強い染色の観察は、タンパク質の存在の増大と同時に、ＣＸ遺伝子の高い発現レベルとを示す（実施例１における（８）免疫組織化学及び組織マイクロアレイの解析を参照されたい）。
さらに、診断の正確性を改善するために、ＣＸ遺伝子の発現レベルに加えて、他の癌関連遺伝子、例えば癌によって異なる発現をすることが知られる遺伝子の発現レベルも求めることができる。
生体試料においてＣＸ遺伝子を含む癌マーカー遺伝子の発現レベルは、（例えば正常細胞又は非癌性細胞における）対応する癌マーカー遺伝子の対照レベルから、例えば１０％、２５％若しくは５０％増大していれば、又は１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超若しくはそれ以上に増大していれば、増大していると考えることができる。
疾患状態（癌性又は非癌性）が既知の被検体（複数可）からこれまでに採取し、保管した試料（複数可）を使用することによって、対照レベルを試験生体試料と同時に求めることができる。代替的に、疾患状態が既知の被検体の試料において、これまでに測定されたＣＸ遺伝子の発現レベル（複数可）を解析することによって得られたデータに基づき、統計的方法によって対照レベルを求めることができる。さらに、対照レベルは、これまでに試験された細胞由来の発現パターンのデータベースであり得る。その上、本発明の一態様によれば、生体試料におけるＣＸ遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から求められる複数の対照レベルと比較することができる。幾つかの実施形態では、患者から得た生体試料のものと同程度の組織型に由来する参照試料から求められる対照レベルが用いられる。幾つかの実施形態では、疾患状態が既知である集団におけるＣＸ遺伝子の発現レベルの標準値が用いられる。標準値は、当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．又は平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
本発明に関して、癌性でないことが既知の生体試料から求められる対照レベルは「正常対照レベル」と呼ばれる。他方で、対照レベルが癌性生体試料から求められる場合、これは「癌性対照レベル」と呼ばれる。
ＣＸ遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、又は癌性対照レベルと同程度である場合、被検体は、癌、例えばＣＸ遺伝子の過剰発現によって媒介される若しくはこれから生じる癌を患っているか又は発症する危険性があると診断され得る。さらに、複数のＣＸ遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似は、被検体が、癌、例えばＣＸ遺伝子の過剰発現によって媒介される若しくはこれから生じる癌を患っているか又は発症する危険性があることを示す。
試験生体試料の発現レベルと対照レベルとの間の相違は、発現レベルが細胞の癌性状態又は非癌性状態に応じて変わらない対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子としては、βアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ及びリボソームタンパク質Ｐ１が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＸ遺伝子媒介性癌の予後を判定する方法
本発明は、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１の（過剰）発現は、ＣＸ遺伝子媒介性癌（例えば肺癌又は食道癌）の患者の予後が悪くなることに有意に関連があるという発見に一部基づいている。したがって本発明は、患者の生体試料においてＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルを検出すること、検出発現レベルを対照レベルと比較すること、及び予後不良（poor prognosis）（低い生存率）の指標として、対照レベルに対する発現レベルの増大を求めることによって、ＣＸ遺伝子の過剰発現によって媒介される若しくはこれから生じる癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）の患者の予後を求める又は判定する方法を提供する。
本明細書中で、「予後」という用語は、疾患の見込み転帰、並びに症例の性質及び症状によって示されるような、疾患からの回復の可能性（prospect）に関する予測（forecast）を表す。したがって、良好ではない、陰性又は不良である予後は、治療後の生存期間又は生存率の低下によって規定される。反対に、陽性、良好な（favorable, or good）予後は、治療後の生存期間又は生存率の上昇によって規定される。
「予後を判定する」という用語は、患者の癌の今後の転帰（例えば悪性度、癌の治癒見込み、推定の生存時間等）によって、所定の検出又は測定を予測する（predicting, forecasting）又は相互に関連付ける能力を表す。例えば、経時的にＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１の発現レベルを求めることで、患者に対する転帰（例えば悪性度の増減、癌の進行度（grade）の増減、癌の治癒見込み、生存率等）の予測が可能となる。
本発明に関して、「予後を判定する（求める）」という語句は、癌の進行、特に癌の再発、転移拡散及び疾患再発の予測及び見込み解析を包含することが意図される。本発明の予後を判定する方法は、治療的介入、診断基準、例えば疾患の病期分類、並びに腫瘍性疾患の転移又は再発に関する疾患モニタリング及び監視を含む、治療法について結論を出す際に臨床的に使用されることが意図される。
本方法に使用される患者から得た生体試料は、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子を試料で検出することができれば、判定される被検体由来の任意の試料であってもよい。幾つかの実施形態では、生体試料は、肺細胞（肺又は食道から得られる細胞）を含む。さらに、生体試料としては、体液、例えば痰、血液、血清、血漿、胸水、食道粘液等が挙げられる。その上、試料は組織から精製される細胞であってもよい。生体試料は、治療前、治療中及び／又は治療後を含む様々な時点で、患者から得ることができる。
本発明に従って、患者から得た生体試料において測定されるＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルが高ければ、治療後の寛解、回復及び／又は生存に関する予後が不良になり且つ不良な臨床転帰の見込みが高くなることが示された。したがって、本方法によれば、比較に使用される「対照レベル」は例えば、治療後に癌の良好な又は陽性の予後を示した個体又は個体集団において、任意の種類の治療の前に検出されたＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルであり、本明細書で「良好な予後対照レベル」とも称される。代替的に、「対照レベル」は、治療後に癌の不良な又は陰性の予後を示した個体又は個体集団において、任意の種類の治療の前に検出されたＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルであり、本明細書で「不良な予後対照レベル」とも称される。「対照レベル」は、単一の参照集団に由来する単一発現パターン又は複数の発現パターンである。したがって、対照レベルは、癌の患者、又は疾患状態（良好又は不良な予後）が既知の患者の集団における任意の種類の治療の前に検出されたＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルに基づき求めることができる。幾つかの実施形態では、癌は肺癌である。幾つかの実施形態では、疾患状態が既知の患者群においてＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルの標準値が用いられる。標準値は、当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．又は平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
対照レベルは、任意の種類の治療の前に、疾患状態（良好な予後又は不良な予後）が既知の癌患者（複数可）（対照又は対照群）からこれまでに採取及び保存された試料（複数可）を使用することによって、試験生体試料と同時に求めることができる。
代替的に、対照レベルは、対照群からこれまでに採取及び保存された試料におけるＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて統計的方法によって求めることができる。さらに、対照レベルは、これまでに試験された細胞又は患者由来の発現パターンのデータベースであり得る。その上、本発明の一態様によれば、生体試料におけるＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から求められる複数の対照レベルと比較することができる。幾つかの実施形態では、患者から得た生体試料のものと同程度の組織型に由来する参照試料から求められる対照レベルが用いられる。
本発明によれば、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルと良好な予後対照レベルとの類似が患者のより良好な予後を示し、良好な予後対照レベルに対する発現レベルの増大が、治療後の寛解、回復、生存及び／又は臨床転帰に対する、より良好ではない不良な予後を示す。他方で、不良な予後対照レベルに対するＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルの低減が、患者のより良好な予後を示し、発現レベルと不良な予後対照レベルとの類似が治療後の寛解、回復、生存及び／又は臨床転帰に対する、より良好ではない不良な予後を示す。
生体試料におけるＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルは、対照レベルと１．０倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、又はそれ以上異なる場合に変化（即ち増大又は低減）していると考えられ得る。
試験生体試料レベルと対照レベルとの間の発現レベルの相違は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に正規化することができる。例えば、発現レベルが癌性細胞と非癌生細胞との間で異ならないことが知られるポリヌクレオチド（βアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ及びリボソームタンパク質Ｐ１をコードするものを含む）を、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルを正規化するのに使用することができる。
発現レベルは、当該技術分野で既知の技法を用いて患者から得た生体試料において遺伝子転写産物を検出することによって求めることができる。本発明の方法によって検出される遺伝子転写産物には、転写産物及び翻訳産物、例えばｍＲＮＡ及びタンパク質の両方が含まれる。
例えば、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の転写産物は、遺伝子転写産物に対するＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子プローブを使用するハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析によって検出することができる。検出はクリップ又はアレイ上で行うことができる。ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルを検出するために、アレイを使用することができる。別の例として、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子に特異的なプライマーを使用する増幅ベースの検出法、例えば逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を検出に利用することができる（実施例１における（３）半定量ＲＴ−ＰＣＲを参照されたい）。ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子に特異的なプローブ又はプライマーは、ＥＰＨＡ７（配列番号３）、ＳＴＫ３１（配列番号５）及びＷＤＨＤ１（配列番号７）の配列全体を参照することにより従来の技法を用いて設計及び調製することができる。例えば、実施例で使用されるプライマー（配列番号１３及び配列番号１４（ＥＰＨＡ７）、配列番号１５及び配列番号１６（ＳＴＫ３１）、配列番号１７及び配列番号１８（ＷＤＨＤ１））は、ＲＴ−ＰＣＲによる検出に利用することができるが、本発明はそれらに限定されない。
特に、本発明の方法で使用されるプローブ又はプライマーは、ストリンジェント、中程度ストリンジェント、又は低ストリンジェントの条件下でＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用されるように、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブ又はプライマーがその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況下で異なる。長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェント条件の温度は、規定のイオン強度及びｐＨで特定の配列のために、熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である。一般的にＴｍでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的に、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的に約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン（又はその塩）であり、温度が、短いプローブ又はプライマー（例えば１０個〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ又はプライマーでは少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件は、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成することができる。
代替的に翻訳産物は、本発明の判定のために検出することができる。例えば、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質の量を求めることができる。翻訳産物としてタンパク質の量を求める方法としては、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾断片（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）は、断片がＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質との結合能を保持していれば、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる。
その翻訳産物に基づきＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質に対する抗体を用いて、免疫組織化学解析によって染色の強度を観察することができる。即ち、強い染色の観察は、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質の存在の増大と同時に、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の高い発現レベルを示す。
さらに、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。したがって、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルは、指標としてかかる細胞増殖活性を用いて求めることができる。例えば、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１を発現する細胞は、生体試料の存在下で調製及び培養し、それから増殖速度を検出すること又は細胞周期若しくはコロニー形成能を測定することによって、生体試料の細胞増殖活性を求めることができる。
その上、判定の正確性を改善するために、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現レベルに加えて、他の肺細胞関連遺伝子、例えば肺癌又は食道癌で異なる発現をすることが知られる遺伝子の発現レベルも求めることができる。かかる他の肺癌関連遺伝子としては、国際公開第２００４／０３１４１３号パンフレット及び国際公開第２００５／０９０６０３号パンフレットに記載されるものが挙げられ、かかる他の食道癌関連遺伝子としては、国際公開第２００７／０１３６７１号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
本方法に従って癌の予後を判定される患者は哺乳動物であってもよく、これにはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが挙げられる。
代替的に、本発明に従って、被検体の予後を判定する他の試験結果に加えて、中間結果も与えられ得る。かかる中間結果は、医者、看護師又は他の療法士が被検体の予後を判定、判断又は推測するのを補助することができる。予後を判定するために、本発明によって得られる中間結果と組み合わせて考慮することができる付加的情報としては、被検体の臨床症状及び身体状態が挙げられる。
癌を診断する又は癌の予後を判定するキット
本発明は、癌を診断する又は癌の予後を判定するキットを提供する。幾つかの実施形態では、癌は、ＣＸ遺伝子によって媒介されるか、又はＣＸ遺伝子、例えば肺癌及び／又は食道癌の過剰発現によって生じる。特にキットは、患者から得た生体試料においてＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子の発現を検出する試薬を少なくとも１つ含み、この試薬は、
（ａ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子のｍＲＮＡを検出する試薬、
（ｂ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質を検出する試薬、及び
（ｃ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質の生物活性を検出する試薬から成る群から選択され得る。
ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに好適な試薬としては、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１のｍＲＮＡと特異的に結合する又は同定する核酸、例えばＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１のｍＲＮＡの一部に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１のｍＲＮＡに特異的なプライマー及びプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の方法に基づき調製することができる。必要であれば、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１のｍＲＮＡを検出する試薬は固体マトリクス上に固定することができる。その上、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１のｍＲＮＡを検出する試薬を２つ以上キットに包含させることができる。
他方で、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質を検出するのに好適な試薬としては、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質に対する抗体が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾断片（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）は、断片がＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質との結合能を保持していれば、試薬として使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる。さらに抗体は、直接連結又は間接的な標識法によってシグナル生成分子で標識することができる。抗体を標識し、抗体とそれらの標的との結合を検出するための標識及び方法が当該技術分野で既知であり、任意の標識及び方法を本発明に利用することができる。その上、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質を検出する試薬を２つ以上キットに包含させることができる。
さらに生物活性は、例えば生体試料で発現したＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質によって細胞増殖活性を測定することによって求めることができる。例えば、細胞を患者から得た生体試料の存在下で培養し、それから増殖速度を検出すること又は細胞周期若しくはコロニー形成能を測定することによって、生体試料の細胞増殖活性を求めることができる。必要であれば、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１のｍＲＮＡを検出する試薬は固体マトリクス上に固定することができる。その上、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質の生物活性を検出する試薬を２つ以上キットに包含させることができる。
キットは、上述の試薬を２つ以上含み得る。さらに、キットは、固体マトリクスと、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１若しくはＷＤＨＤ１遺伝子に対するプローブと結合する試薬又はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１若しくはＷＤＨＤ１タンパク質に対する抗体と、細胞を培養するための培地及び容器と、陽性及び陰性の対照試薬と、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体とを含み得る。例えば、予後が良好な又は予後不良の患者から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットはさらに、商業的視点及び使用者視点から望まれる他の材料（バッファ、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ、及び使用者用取扱説明書に同封された添付文書（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む）を含み得る。これらの試薬等が、標識を備える容器内に含まれ得る。好適な容器としては、ボトル、バイアル及び試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックで構成され得る。
本発明の一実施形態として、試薬がＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１のｍＲＮＡに対するプローブである場合、試薬は、固体マトリクス、例えば多孔性ストリップ上で固定し、少なくとも１つの検出部位を形成することができる。多孔性ストリップの測定領域又は検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含有する複数の部位を含み得る。試験ストリップは、陰性及び／又は陽性の対照に関する部位も含有し得る。代替的に、対照部位は、試験ストリップから分けられたストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定化核酸、即ち第１の検出部位ではより多量に及びその後の部位ではより少量に含有することができる。試験試料の添加の際、検出シグナルを提示する部位の数は、試料中に存在するＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１のｍＲＮＡ量の定量的指標を与える。検出部位は、任意の好適に検出可能な形状で構成されていてもよく、典型的に試験ストリップ幅に広がるバー又はドットの形状である。
本発明のキットはさらに、陽性対照試料又はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１標準試料を含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１陽性血液試料を採取することによって調製することができ、それからそのＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１レベルを分析する。代替的に、精製ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１若しくはＷＤＨＤ１タンパク質又はポリヌクレオチドを、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１無含有血清に添加し、陽性試料又はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１若しくはＷＤＨＤ１標準を形成することができる。本発明では、精製ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１は組換えタンパク質であり得る。陽性対照試料のＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１レベルは例えば、カットオフ値を超える。
以下で、実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の材料、方法及び実施例は本発明の態様を説明しているにすぎず、決して本発明の範囲の限定を意図するものではない。同様に、本明細書で記載のものと同様又は同等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができる。
癌を診断する方法
本発明では、ＥＰＨＡ７タンパク質のＮ末端ドメインが切断され、細胞外の空間に分泌されることを確認した（図３Ｇ）。したがって、ＥＰＨＡ７タンパク質のＮ末端ドメイン（配列番号４の５２６ａａ〜５８０ａａ）に対する特異性を認識する作用物質は分泌型ＥＰＨＡ７の検出に有用である。例えば、作用物質は、実施例３で使用される、ヒトＥＰＨＡ７のＮ末端部分由来のエピトープ（複数可）に対する、ＥＰＨＡ７タンパク質のＮ末端ドメインに対する抗体、特に配列番号４の５２６ａａ〜５８０ａａに対する抗体、例えばウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ２５４５９、Santa Cruz, Santa Cruz, CA）であり得る。生体試料、例えば体液は、ＥＰＨＡ７が含有されているかにかかわらず、作用物質によって試験することができる。体液としては、全血、血清、血漿、唾液、胸水、食道粘液等が挙げられる。検出系は、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット法であり得る。
さらに本発明者らは、血清ＥＰＨＡ７を測定するためにＥＬＩＳＡを確立し、血清ＥＰＨＡ７陽性症例の割合は、２６４人の非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）患者の内の１４９人（５６．４％）、７９人のＳＣＬＣ患者の内の３５人（４４．３％）、及び９６人のＥＳＣＣ患者の内の８１人（８４．４％）であることを見出したが、１２７人の健常なボランティアの内６人（４．７％）だけは誤って診断された（図５、上部パネル）。血清ＥＰＨＡ７の濃度は、原発腫瘍の外科的切除後に劇的に低減した（図５Ｂ、右側のパネル）。
被検体から得た生体試料においてＥＰＨＡ７のレベルを測定することによって、被検体における癌の発生率又は癌を発症する素因を求めることができる。幾つかの実施形態では、癌はＣＸ遺伝子によって媒介されるか、又はＣＸ遺伝子の過剰発現によって生じ、例えば肺癌及び／又は食道癌である。したがって本発明は、生体試料においてＥＰＨＡ７のレベルを求める（例えば測定する）ことを含む。代替的に本発明に従って、被検体の状態を試験するための中間結果を与えることができる。かかる中間結果は、医者、看護師又は他の療法士が被検体が疾患を患っていると診断するのを補助する付加的情報と組み合わせることができる。代替的に、被検体から得た組織において癌性細胞を検出し、被検体が疾患を患っていると診断するのに有用な情報を医者に与えるために、本発明の方法を使用することができる。さらに、肺癌及び／又は食道癌の疑いがある被検体は、本発明によってスクリーニングすることができる。特に本発明は、以下の二本鎖分子［１］〜［５］を提供する：
［１］被検体において癌を診断する又は癌に対する治療の有効性を判定する方法であって、
（ａ）診断すべき被検体から体液を採取する工程と、
（ｂ）イムノアッセイによって、体液中のＥＰＨＡ７タンパク質又はその断片のレベルを測定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で測定されたレベルを、正常な対照ものと比較する工程と、
（ｄ）正常対照に比べて、血液試料中のレベルが高いことが、被検体が癌を患っていることを示すと判断する工程とを含む、方法。
［２］体液が全血、血清及び血漿から成る群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］イムノアッセイがＥＬＩＳＡである、［１］に記載の方法。
［４］癌が肺癌及び／又は食道癌である、［１］に記載の方法。
［５］方法が他の血清バイオマーカーと組み合わされる、［３］に記載の方法。
［６］他の血清バイオマーカーがＣＥＡ及びＰｒｏＧＲＰから成る群から選択される、［５］に記載の方法。
［７］治療が手術である、［１］に記載の方法。
任意の生物学的材料は、試料において検出することができるＥＰＨＡ７タンパク質のレベルを求めるための生体試料として使用することができる。幾つかの実施形態では、生体試料は、血液、血清又は他の体液、例えば唾液、胸水、食道粘液等を含む。幾つかの実施形態では、生体試料は、血液又は血液由来の試料である。血液由来の試料としては、血清、血漿又は全血が挙げられる。本方法に従って癌に関して診断される被検体は哺乳動物であってもよく、これにはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが挙げられる。
実施形態において、ＥＰＨＡ７のレベルは、生体試料においてＥＰＨＡ７タンパク質の量を測定することによって求められる。生体試料においてＥＰＨＡ７タンパク質の量を求める方法としてはイムノアッセイ法が挙げられる。一実施形態では、イムノアッセイ法はＥＬＩＳＡを含む。
それから、生体試料におけるＥＰＨＡ７レベルは、参照試料、例えば正常対照試料と関連したＥＰＨＡ７レベルと比較される。「正常対照レベル」という語句は、癌を患っていない集団の生体試料で通常見られるＥＰＨＡ７のレベルを表す。参照試料は、試験試料のものと同様の性質を有し得る。例えば、試験試料が患者血清を含む場合、参照試料も血清である必要がある。対照及び試験被検体由来の生体試料におけるＥＰＨＡ７レベルを同時に求めることができ、又は代替的に正常対照レベルは、対照群からこれまでに採取された試料においてＥＰＨＡ７のレベルを解析することによって得られた結果に基づき、統計的方法によって求めることができる。
ＥＰＨＡ７レベルは、癌の治療経過をモニタリングするのに使用することもできる。この方法では、試験生体試料は、癌の治療を受ける患者から提供される。幾つかの実施形態では、癌は肺癌及び／又は食道癌である。幾つかの実施形態では、複数の試験生体試料は、治療の前、治療中、又は治療後の様々な時点で被検体から得られる。それから治療後の試料におけるＥＰＨＡ７のレベルを、治療前の試料、又は代替的に参照試料におけるＥＰＨＡ７のレベル（例えば正常対照レベル）と比較することができる。例えば、治療後のＥＰＨＡ７レベルが、治療前のＥＰＨＡ７レベルよりも低い場合、治療が有効であったと結論付けることができる。同様に、治療後のＥＰＨＡ７レベルが正常対照ＥＰＨＡ７レベルと同程度である場合も、治療が有効であったと結論付けることができる。
「有効な」治療は、被検体におけるＥＰＨＡ７のレベルの低減、又は癌のサイズ、有病率若しくは転移能の低減をもたらすものである。治療が予防的に適用される場合、「有効な」は、治療が癌の発症を遅らせ若しくは防ぐか、又は癌の臨床症状を緩和することを意味する。癌の判定は、標準的な臨床プロトコルを用いて為され得る。さらに、治療の有効性は、癌を診断又は治療する任意の既知の方法に関連して求めることができる。例えば癌は通常、組織病理学的に、又は症候性異常、例えば慢性咳、嗄声、喀血、体重減少、食欲不振、息切れ、喘鳴、気管支炎若しくは肺炎の発作及び胸痛を同定することによって診断される。
その上、癌を診断する本発明の方法は、患者から得た生体試料におけるＥＰＨＡ７のレベルを参照試料のものと比較することによって、癌の患者の予後を判定するためにも適用することができる。幾つかの実施形態では、癌は肺癌である。代替的に、生体試料におけるＥＰＨＡ７のレベルは、患者の予後を判定するために広範な疾患段階にわたって測定することができる。正常対照レベルに比べてのＥＰＨＡ７のレベルの増大は良好ではない予後を示している。正常対照レベルに比べてのＥＰＨＡ７のレベルの類似は、患者のより良好な予後を示している。
本発明の診断方法において、肺癌を検出するために、ＥＰＨＡ７の血液濃度に加えて、ＣＥＡ若しくはｐｒｏＧＲＰのいずれか、又はその両方の血液濃度を参照することができる。したがって本発明は、肺癌を診断する方法であって、ＥＰＨＡ７の血液濃度に加えて、ＣＥＡの血液濃度が健常な個体に比べて高い場合、ＮＳＣＬＣが検出される、方法を提供する。代替的に本発明は、肺癌を診断する方法であって、ＥＰＨＡ７の血液濃度に加えて、ｐｒｏＧＲＰの血液濃度が健常な個体に比べて高い場合、ＳＣＬＣが検出される、方法を提供する。
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、臨床的に適用される腫瘍胎児抗原の１つであった。これは、腫瘍細胞の原形質膜と結び付く、分子量２００００の複合体糖タンパク質であり、この抗原が原形質膜から血中へ放出され得る。
ＣＥＡは初めに結腸癌で同定されたが、異常なＣＥＡ血液レベルは、結腸癌だけでなく一般的な悪性腫瘍に特異的である。ＣＥＡレベルの上昇が、肺癌、膵臓癌、胃癌及び乳癌を含む、結腸以外の多種多様の癌で見られる。上記のように、ＣＥＡは、肺癌を診断又は検出するための血清学的マーカーとして既に使用されている。しかしながら、肺癌、特にＮＳＣＬＣに対するマーカーとしてのＣＥＡの感度は、完全に肺癌を検出するには幾らか不十分である。代替的に、ガストリン放出ペプチド前駆体（ｐｒｏＧＲＰ）がＳＣＬＣに対する血清学的腫瘍マーカーであることも知られている。上記のように、ｐｒｏＧＲＰは、ＳＣＬＣを診断又は血清するための血清学的マーカーとして既に使用されている。しかしながら、ＳＣＬＣに対するマーカーとしてのｐｒｏＧＲＰの感度は、完全にＳＣＬＣを検出するには幾らか不十分である。したがって、肺癌、例えばＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣを診断する感度を改善することが要求される。
本発明では、肺癌に対する血清学的マーカーＥＰＨＡ７が提供される。肺癌に対する診断又は検出方法の感度の改善は、本発明によって達成することができる。
ＥＰＨＡ７とＣＥＡ及び／又はｐｒｏＧＲＰとの間の組合せによって、肺癌、即ちＮＳＣＬＣ及び／又はＳＣＬＣ癌の検出に対する感度が有意に改善され得る。例えば、後述の実施例において解析される群では、ＮＳＣＬＣに対するＣＥＡの感度が３７．９％（８８／２３２）であり、特異度が８９．８％（１１４／１２７）である（図５Ｃ、上部パネル）。一方、ＥＰＨＡ７とＣＥＡとの組合せは、ＮＳＣＬＣの検出に対する感度全体を７６．７％（１７８／２３２）に改善する。本発明では、「ＥＰＨＡ７とＣＥＡとの組合せ」は、ＥＰＨＡ７及びＣＥＡのレベルのいずれか又は両方がマーカーとして用いられることを表す。幾つかの実施形態では、ＥＰＨＡ７及びＣＥＡのいずれかに関して陽性であると試験された患者は、ＮＳＣＬＣを患っていると判断することができる。ＮＳＣＬＣのための血清学的マーカーとしてのＥＰＨＡ７とＣＥＡとの組合せの使用は、当該技術分野で開示されていない。
同様に、例えば、後述の実施例で解析される群では、ＳＣＬＣに対するｐｒｏＧＲＰの感度が約６４．８％（４６／７１）であり、特異度が９７．６％（１２０／１２３）である（図５Ｃ、下部パネル）。一方、ＥＰＨＡ７とｐｒｏＧＲＰとの組合せは、ＳＣＬＣの検出に対する感度全体を７７．５％（５５／７１）に改善する。本発明では、「ＥＰＨＡ７とｐｒｏＧＲＰとの組合せ」は、ＥＰＨＡ７及びｐｒｏＧＲＰのレベルのいずれか又は両方がマーカーとして用いられることを表す。幾つかの実施形態では、ＥＰＨＡ７及びｐｒｏＧＲＰのいずれかに関して陽性であると試験された患者は、ＳＣＬＣを患っていると判断することができる。ＳＣＬＣのための血清学的マーカーとしてのＥＰＨＡ７とｐｒｏＧＲＰとの組合せの使用は、当該技術分野で開示されていない。
したがって本発明は、単独でＣＥＡ又はｐｒｏＧＲＰを測定する結果に基づいた測定に比べて、ＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣの患者を検出する感度を大きく改善させることができる。ＣＥＡ陽性患者又はｐｒｏＧＲＰ陽性患者の群と、ＥＰＨＡ７陽性患者の群とが完全には適合していないことが、この改善の基になっている。このことはさらに具体的に説明される。
初めに、ＣＥＡ又はｐｒｏＧＲＰ測定の結果として、標準値よりも低い値を有する（即ち肺癌ではない）ことが測定された患者の中に、実際に或る特定の割合の肺癌（即ちＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣ）の患者が存在する。かかる患者は、ＣＥＡ偽陰性患者又はｐｒｏＧＲＰ偽陰性患者と称される。ＣＥＡ又はｐｒｏＧＲＰに基づく測定をＥＰＨＡ７に基づく測定と組み合わせることによって、ＥＰＨＡ７値が標準値を超える患者をＣＥＡ偽陰性患者又はｐｒｏＧＲＰ偽陰性患者の中に見出すことができる。即ち、ＣＥＡ又はｐｒｏＧＲＰの血中濃度が低いために「陰性」であると誤って判断された患者の中から、本発明は、実際に肺癌である患者を見つけることを可能にする。したがって、肺癌患者を検出する感度が本発明によって改善された。概して、複数のマーカーを用いた測定結果を単純に組み合わせることで検出感度を増大させることができるが、他方で特異度の低減が引き起こされることが多い。しかしながら、感度と特異度との間の最良のバランスを求めることによって、本発明は、特異度を落とすことなく検出感度を増大させることができる特徴的な組合せを求めている。
本発明において、同時にＣＥＡ又はｐｒｏＧＲＰ測定の結果を考慮して、例えばＣＥＡ又はｐｒｏＧＲＰの血液濃度を測定し、ＥＰＨＡ７の測定値と標準値との上述の比較と同じように、標準値と比較することができる。例えば、どのようにＣＥＡ又はｐｒｏＧＲＰの血液濃度を測定し、どのようにそれを標準値と比較するかは既に知られている。さらに、ＣＥＡ又はｐｒｏＧＲＰに対するＥＬＩＳＡキットも市販されている。既知のレポートに記載のこれらの方法は、肺癌を診断又は検出するために本発明の方法に用いることができる。
本発明においては、ＥＰＨＡ７の血中濃度の標準値は統計的に求めることができる。例えば、健常個体におけるＥＰＨＡ７の血中濃度を測定して、標準的なＥＰＨＡ７の血中濃度を統計的に決定することができる。統計的に十分な集団を集めることができる場合、平均値から標準偏差（Ｓ．Ｄ．）の２倍又は３倍の範囲にある値が大抵の場合、標準値として使用される。したがって、平均値＋２×Ｓ．Ｄ．又は平均値＋３×Ｓ．Ｄ．に対応する値が標準値として使用され得る。記載のように設定した標準値には、理論的には健常個体のそれぞれ９０％及び９９．７％が含まれる。
代替的には、標準値はまた、肺癌患者における実際のＥＰＨＡ７の血中濃度に基づいて設定され得る。通常、このように設定される標準値は偽陽性率を最小限に抑え、検出感度を最大にすることのできる条件を満たす値の範囲から選択される。本明細書においては、偽陽性率とは、健常個体におけるＥＰＨＡ７の血中濃度が標準値より高いと判断される患者の割合を指す。これに対し、健常個体におけるＥＰＨＡ７の血中濃度が標準値より低いと判断される患者の割合は、特異度を示す。すなわち、偽陽性率と特異度との和は常に１となる。検出感度とは、肺癌の存在が断定された個体集団のうち全ての肺癌患者における、ＥＰＨＡ７の血中濃度が標準値より高いと判断される患者の割合を指す。
さらに、本発明において、ＥＰＨＡ７の濃度が標準値より高いと判断される患者における肺癌患者の割合は、陽性予測値を表す。一方、ＥＰＨＡ７の濃度が標準値より低いと判断される患者における健常個体の割合は、陰性予測値を表す。これらの値の間の関係を表１にまとめる。下記に示す関係により示唆されるように、肺癌の診断精度を評価するための指標である感度、特異度、陽性予測値、及び陰性予測値に関する値は各々、ＥＰＨＡ７の血中濃度のレベルを判断するための標準値に応じて変化する。
（表１）
Figure 2010536367
既に述べたように、標準値は通常、偽陽性率が低く、感度が高いように設定される。しかしながら、上記に示す関係からまた明らかなように、偽陽性率と感度との間にはトレードオフがある。すなわち、標準値を下げると、検出感度は増大する。しかしながら、偽陽性率も増大するため、「低い偽陽性率」を有するという条件を満たすのは困難である。この状況を鑑みて、本発明においては、例えば以下の予測結果をもたらす値が代表的な標準値として選択され得る：
偽陽性率が５０％以下である標準値（すなわち、特異度が５０％以上である標準値）、
感度が２０％以上である標準値。
本発明において、標準値はＲＯＣ曲線を用いて設定することができる。受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線は、縦軸に検出感度、及び横軸に偽陽性率（すなわち、「１−特異度」）を示すグラフである。本発明においては、ＲＯＣ曲線は、高度／低度のＥＰＨＡ７血中濃度を求めるための標準値を連続的に変化させて得られた、感度及び偽陽性率における変化をプロットすることにより得ることができる。
ＲＯＣ曲線を得るための「標準値」は、統計的分析のために一時的に使用される値である。ＲＯＣ曲線を得るための「標準値」は一般に、全ての選択可能な標準値を包含する範囲内で、連続的に変化させることができる。例えば、標準値は、分析集団における最小及び最大のＥＰＨＡ７測定値の間で変化させることができる。
本発明において使用される代表的な標準値は、得られたＲＯＣ曲線に基づいて、上述の条件を満たす範囲から選択することができる。代替的には、標準値は、標準値を変化させることで作成したＲＯＣ曲線に基づいて、大部分のＥＰＨＡ７測定値を包含する範囲から選択することができる。
血中のＥＰＨＡ７は、タンパク質を定量化することのできる任意の方法により測定され得る。例えば、イムノアッセイ、液体クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、質量分析等を、タンパク質を定量化する方法として適用することができる。質量分析においては、タンパク質は適切な内部標準を用いて定量化され得る。同位体標識ＥＰＨＡ７等を内部標準として使用することができる。ＥＰＨＡ７の血中濃度は、血中のＥＰＨＡ７のピーク強度及び内部標準のピーク強度から求めることができる。一般に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法がタンパク質の質量分析のために使用される。また、質量分析又は液体クロマトグラフィーを使用する分析法を用いて、他の腫瘍マーカー（例えばＣＥＡ及び／又はｐｒｏＧＲＰ）と同時にＥＰＨＡ７を分析することができる。
本発明においては、ＥＰＨＡ７を測定する例示的な方法はイムノアッセイである。ＥＰＨＡ７のアミノ酸配列は既知である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ−００４４３１．１）。ＥＰＨＡ７のアミノ酸配列を配列番号に示し、それをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号に示す。したがって、当業者は、ＥＰＨＡ７のアミノ酸配列に基づいて必要な免疫原を合成することにより抗体を調製することができる。免疫原として使用されるペプチドは、ペプチドシンセサイザーを用いて容易に合成され得る。合成ペプチドは、担体タンパク質に結合させることにより免疫原として使用することができる。幾つかの実施形態では、抗原ぺプチドはＥＰＨＡ７のＮ末端領域を含むか、又はＥＰＨＡ７のＮ末端領域の断片とすることができる（配列番号４の５２６ａａ〜５８０ａａ）。
キーホールリンペットヘモシアニン、ミオグロビン、アルブミン等を担体タンパク質として使用することができる。例示的な担体タンパク質はＫＬＨ、ウシ血清アルブミン等である。合成ペプチドを担体タンパク質に結合させるために、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（hydrosuccinimide）エステル法（以下、ＭＢＳ法と略記する）等が一般に使用される。
具体的には、システインを合成ペプチドに導入し、ペプチドをシステインのＳＨ基を用いてＭＢＳによりＫＬＨと架橋させる。システイン残基は、合成ペプチドのＮ末端に導入しても、又はＣ末端に導入してもよい。
代替的には、ＥＰＨＡ７はＥＰＨＡ７のヌクレオチド配列に基づく遺伝子組み換え体として得ることができる（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ−００４４４０）。必要なヌクレオチド配列を含むＤＮＡは、ＥＰＨＡ７発現組織から調製されるｍＲＮＡを用いてクローニングされ得る。代替的には、市販のｃＤＮＡライブラリをクローニング供給源として使用することができる。得られたＥＰＨＡ７の遺伝子組み換え体、又はその断片も免疫原として使用することができる。このように発現されるＥＰＨＡ７組み換え体は、本発明において使用される抗体を得るための免疫原として使用することができる。市販のＥＰＨＡ７組み換え体もまた、免疫原として使用することができる。本発明の抗体は定義における（２）抗体で述べられている従来の方法によって調製することができる。
ＥＰＨＡ７に対する抗体がＥＰＨＡ７と接触すると、抗体は、抗原−抗体反応を介して抗体により認識される抗原決定基（エピトープ）と結合する。抗体と抗原との結合は、様々なイムノアッセイ原理により検出することができる。イムノアッセイは、異種分析法と同種分析法とに大きく分類され得る。イムノアッセイの感度及び特異度を高レベルに維持するためには、モノクローナル抗体の使用が望ましい。ＥＰＨＡ７を様々なイムノアッセイ方式により測定する本発明の方法を、具体的に説明する。
最初に、ＥＰＨＡ７を異種イムノアッセイを用いて測定する方法を記載する。異種イムノアッセイにおいては、ＥＰＨＡ７に結合した抗体を、ＥＰＨＡ７と結合しなかった抗体と分離した後で検出するための機構が必要とされる。
分離を容易にするために、固定化試薬が一般に使用される。例えば、ＥＰＨＡ７を認識する抗体が固定化された固相を初めに調製する（固定化抗体）。ＥＰＨＡ７をこれらに結合させ、第２の抗体をさらにそれらに反応させる。
固相を液相から分離し、必要に応じてさらに洗浄した後、固相上に残留する第２の抗体はＥＰＨＡ７の濃度に比例する。第２の抗体を標識すると、ＥＰＨＡ７は標識に由来するシグナルを測定することにより定量化することができる。
抗体を固相に結合させるために、任意の方法が使用され得る。例えば、抗体は例えばポリスチレンの疎水性材料に物理的に吸着させることができる。代替的には、抗体は表面上に官能基を有する多様な材料に化学的に結合させることができる。さらに、結合リガンドで標識した抗体を、リガンドの結合パートナーを用いて捕捉させることにより、固相に結合させることもできる。結合リガンドとその結合パートナーとの組み合わせには、アビジン−ビオチン等が含まれる。固相と抗体とは一次抗体とＥＰＨＡ７との反応と同時に、又はその前に共役させることができる。
同様に、第２の抗体を直接標識する必要はない。すなわち、第２の抗体は抗体に対して抗体を用いて、又は例えばアビジン−ビオチン反応の結合反応を用いて間接的に標識することができる。
試料中のＥＰＨＡ７濃度は、ＥＰＨＡ７濃度が既知の標準的な試料を用いて得られるシグナル強度に基づいて求められる。
上述した異種イムノアッセイのための固定化抗体及び第２の抗体として、それが抗体であるか、又はＥＰＨＡ７を認識するその抗原結合部位を含む断片である限り、任意の抗体を使用することができる。したがって、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は両方の混合物若しくは組み合わせであり得る。例えば、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組み合わせが本発明において例示的な組み合わせである。代替的には、両方の抗体がモノクローナル抗体である場合、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を組み合わせることに使用が見出される。
測定される抗原が抗体の間に挟まれるため、かかる異種イムノアッセイはサンドイッチ法と呼ばれる。サンドイッチ法は測定感度及び再現性に優れるため、本発明において好適な測定原理である。
競合的阻害反応の原理も異種イムノアッセイに適用され得る。具体的には、異種イムノアッセイは、試料中のＥＰＨＡ７が既知濃度のＥＰＨＡ７と抗体との結合を競合的に阻害する現象に基づくイムノアッセイである。試料中のＥＰＨＡ７の濃度は、既知濃度のＥＰＨＡ７を標識して、抗体と反応した（又は反応しなかった）ＥＰＨＡ７の量を測定することにより求めることができる。
既知濃度の抗原及び試料中の抗原が、同時に抗体と反応すると競合的反応系が確立される。さらに、抗体を試料中の抗原と反応させ、その後既知濃度の抗原を反応させると阻害反応系による分析が可能である。どちらのタイプの反応系においても、操作性に優れる反応系は、試薬成分として使用される既知濃度の抗原、又は抗体のいずれか一方を標識成分として、他方を固定化試薬として設定することにより構築することができる。
放射性同位体、蛍光物質、発光物質、酵素活性を有する物質、肉眼で観察可能な物質、磁気的に観察可能な物質等がこれらの異種イムノアッセイにおいて使用される。これらの標識物質の具体的な例を下記に示す。
酵素活性を有する物質には、
ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、
ウレアーゼ、
カタラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、
乳酸脱水素酵素、又は
アミラーゼ等が挙げられる。
蛍光物質には、
フルオレセインイソチオシアネート、
テトラメチルローダミンイソチオシアネート、
置換ローダミンイソチオシアネート、又は
ジクロロトリアジンイソチオシアネート等が挙げられる。
放射性同位体には、
トリチウム、
１２５Ｉ、又は
１３１Ｉ等が挙げられる。
これらのうち、例えば酵素の非放射活性標識が安全性、操作性、感度等の観点から有利な標識である。酵素標識は抗体又はＥＰＨＡ７に、例えば過ヨウ素酸法又はマレイミド法の既知の方法により結合させることができる。
固相として、ビーズ、容器の内壁、微粒子、多孔質担体、磁性粒子等が使用される。例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、ガラス、金属、セラミック等の材料を用いて形成される固相を使用することができる。抗体等を化学的に結合する官能基を表面に導入した固体材料も知られている。例えばポリ−Ｌ−リシン処理又はグルタルアルデヒド処理の化学的結合、及び物理吸着を含む既知の結合法を、固相及び抗体（又は抗原）に適用することができる。
本明細書中に例示される全ての異種イムノアッセイにおいて、固相を液相から分離する工程及び洗浄する工程が必要とされるが、これらの工程はサンドイッチ法の変形である免疫クロマトグラフィー法を用いて容易に行なうことができる。
具体的には、固定化される抗体を、試料溶液を毛管現象により輸送することが可能な多孔質担体に固定化し、次にＥＰＨＡ７及び標識抗体を含有する試料の混合物をこの毛管現象によりその中に展開する。展開の間、ＥＰＨＡ７は標識抗体と反応し、固定化抗体とさらに接触すると、その配置に捕捉される。ＥＰＨＡ７と反応しなかった標識抗体は、固定化抗体により捕捉されることなく通過する。
結果として、固定化抗体の上記配置に残留する標識抗体のシグナルを指標として用いて、ＥＰＨＡ７の存在を検出することができる。標識抗体を予め多孔質担体において上流に維持する場合、単に試料溶液中に滴下することで全ての反応を開始及び完了することができ、極めて単純な反応系を構築することができる。免疫クロマトグラフィー法においては、例えば着色粒子を肉眼で区別することのできる標識成分を組み合わせて、特別な読取装置さえも必要としない分析装置を構成することができる。
さらに、免疫クロマトグラフィー法では、ＥＰＨＡ７に対する検出感度を調節することができる。例えば、検出感度を下記に記載されるカットオフ値近くに調節することにより、カットオフ値を超えた場合にも上述の標識成分を検出することができる。かかる装置を用いることにより、被検体が陽性であるか、又は陰性であるかを非常に単純に判断することができる。肉眼による標識の区別を可能にする構成を採用することによって、単に血液試料を免疫クロマトグラフィー用の装置に適用することで必要な検査結果が得られ得る。
免疫クロマトグラフィー法の検出感度を調節する様々な方法が知られている。例えば、検出感度を調節するための第２の固定化抗体を、試料が適用される位置と固定化抗体との間に位置付けることができる（特開平６−３４１９８９号公報（公開特許公報）（未審査）。試料中のＥＰＨＡ７は、試料を適用した位置から、標識検出のための第１の固定化抗体の位置へと展開される間に第２の固定化抗体により捕捉される。第２の固定化抗体が飽和した後、ＥＰＨＡ７は下流に位置する第１の固定化抗体の位置に到達し得る。結果として、試料中に含まれるＥＰＨＡ７の濃度が予め定められている濃度を超える場合、標識抗体に結合したＥＰＨＡ７が第１の固定化抗体の位置で検出される。
次に、同種イムノアッセイを説明する。上記で記載されるように反応溶液の分離を必要とする異種イムノアッセイ法とは対照的に、ＥＰＨＡ７は同種分析法を用いても測定することができる。同種分析法は、抗原−抗体反応の生成物の検出を、それらを反応溶液から分離することなく可能にする。
代表的な同種分析法は、免疫沈降反応であるが、この場合抗原性物質は、抗原−抗体反応の後に生成される沈降物を検査することにより定量的に分析される。免疫沈降反応にはポリクローナル抗体が一般に使用される。モノクローナル抗体を適用する場合、ＥＰＨＡ７の異なるエピトープに結合する、複数のタイプのモノクローナル抗体を使用することができる。免疫反応に続く沈降反応の生成物は肉眼で観察するか、又は光学的に測定して数量データに変換することができる。
抗原による抗体感作した微粒子の凝集を指標として使用する、免疫学的粒子凝集反応は一般的な同種分析法である。上述の免疫沈降反応と同様に、ポリクローナル抗体又は複数のタイプのモノクローナル抗体の組み合わせを、この方法においても使用することができる。微粒子は、抗体の混合物で感作することにより抗体で感作するか、又は各々の抗体で別個に感作した粒子を混合することにより調製することができる。このようにして得られる微粒子は、ＥＰＨＡ７と接触するとマトリクス様反応生成物を生じる。該反応生成物は、粒子の凝集として検出することができる。粒子の凝集は肉眼で観察され得るか、又は光学的に測定して数量データに変換することができる。
エネルギー移動及び酵素チャネリングに基づく免疫学的分析法は、同種イムノアッセイとして知られる。エネルギー移動を利用する方法において、ドナー／アクセプタ関係を有する異なる光学標識が、抗原上の隣接エピトープを認識する複数の抗体に結合する。免疫反応が起こると、この２つの部分が接近してエネルギー移動現象が起こり、例えば消光又は蛍光波長における変化等のシグナルが生じる。一方、酵素チャネリングは隣接エピトープに結合する複数の抗体の標識を利用するが、この場合標識は、一方の酵素の反応生成物が他方の酵素の基質であるような関係を有する酵素の組み合わせである。この２つの部分が免疫反応により接近すると、酵素反応が促進され、したがって、それらの結合は酵素反応速度における変化として検出することができる。
本発明においては、ＥＰＨＡ７の測定のための血液は、患者から採血した血液から調製することができる。例示的な血液試料は血清又は血漿である。血清又は血漿の試料は測定の前に希釈することができる。代替的には、全血を試料として測定することができ、得られた測定値を補正して血清中濃度を求めることができる。例えば、全血における濃度は、同じ血液試料中の血球体積百分率を求めることにより血清中濃度に補正され得る。
一実施形態では、イムノアッセイはＥＬＩＳＡを含む。本発明者らは、相当数の肺癌を有する患者における血清ＥＰＨＡ７を検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。
次に、血液試料中のＥＰＨＡ７レベルを、例えば正常対照試料の参照試料に関するＥＰＨＡ７レベルと比較した。「正常対照レベル」という表現は、典型的には肺癌を患っていない集団の血液試料において見られるＥＰＨＡ７レベルを指す。参照試料は試験試料と同様の性質を有し得る。例えば、試験試料が患者の血清を含む場合、参照試料も血清でなくてはならない。対照被検体及び試験被検体に由来する血液試料におけるＥＰＨＡ７レベルは、同時に求めてもよく、又は代替的には、対照群から予め採取した試料におけるＥＰＨＡ７レベルを分析することにより得られる結果に基づく統計的方法によって、正常対照レベルを求めてもよい。
ＥＰＨＡ７レベルはまた、肺癌の治療過程をモニタリングするために使用してもよい。この方法において、試験血液試料は肺癌に対する治療を受けている被検体から提供される。幾つかの実施形態では、複数の試験血液試料を治療前、治療中、又は治療後の様々な時点で被検体から得る。次に、治療後の試料におけるＥＰＨＡ７レベルを治療前の試料におけるＥＰＨＡ７レベル、又は代替的には参照試料におけるＥＰＨＡ７レベル（例えば正常対照レベル）と比較してもよい。例えば、治療後のＥＰＨＡ７レベルが治療前のＥＰＨＡ７レベルより低い場合、その治療は効果的であったと結論付けることができる。同様に、治療後のＥＰＨＡ７レベルが正常対照ＥＰＨＡ７レベルと同様である場合にも、その治療は効果的であったと結論付けることができる。
「効果的な」治療は、ＥＰＨＡ７レベルを低下させるか、又は被検体における肺癌のサイズ、有病率、又は転移能を減少させる治療である。治療を予防的に適用する場合、「効果的な」とは、治療が肺癌の発生を遅らせる若しくは予防するか、又は肺癌の臨床症状を緩和することを意味する。肺癌の判定は標準的な臨床プロトコルを用いて行なうことができる。さらに、治療の有効性は、肺癌を診断又は治療する任意の既知の方法に関して求められ得る。例えば、肺癌は病理組織学的に、又は症状の異常を同定することにより日常的に診断される。
肺癌の診断及び検出は、高度な問題に直面している。本発明は血清ＥＰＨＡ７に対するＥＬＩＳＡを提供し、これは、他の血清マーカー、例えばＣＥＡ及び／又はｐｒｏＧＲＰと組み合わせることによって肺癌をスクリーニングするのに有望な手段である。
本発明による肺癌の診断を実行するために使用される成分を予め組み合わせて、試験キットとして供給することができる。したがって、本発明は、
（ｉ）血液試料におけるＥＰＨＡ７レベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｉ）ＥＰＨＡ７に対する陽性対照試料を含有する、肺癌を検出するためのキットを提供する。
幾つかの実施形態では、本発明のキットは、
（ｉｉｉ）血液試料におけるＣＥＡ及びｐｒｏＧＲＰレベル又はその両方を求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｖ）ＣＥＡ及び／又はｐｒｏＧＲＰに対する陽性対照試料をさらに含有し得る。
本発明のキットを構成するイムノアッセイ用の試薬は、上記に記載される様々なイムノアッセイに必要な試薬を含み得る。具体的には、イムノアッセイ用の試薬には、測定される物質を認識する抗体が含まれる。抗体はイムノアッセイのアッセイ形式に応じて修飾することができる。本発明の例示的なアッセイ形式としてＥＬＩＳＡを使用することができる。ＥＬＩＳＡにおいては、例えば固相上に固定化される第１の抗体、及び標識を有する第２の抗体が一般に使用される。
したがって、ＥＬＩＳＡ用のイムノアッセイ試薬は、固相担体上に固定化される第１の抗体を含み得る。微粒子又は反応容器の内壁を固相担体として使用することができる。微粒子として磁性粒子を使用することができる。代替的には、例えば９６ウェルマイクロプレートのマルチウェルプレートが、反応容器として使用されることが多い。９６ウェルマイクロプレートよりも体積の小さいウェルを高密度で備える、多数の試料を処理するための容器も知られている。本発明においては、これらの反応容器の内壁を固相担体として使用することができる。
ＥＬＩＳＡ用のイムノアッセイ試薬は、標識を有する第２の抗体をさらに含み得る。ＥＬＩＳＡ用の第２の抗体は、酵素が直接又は間接的に結合した抗体であり得る。酵素を抗体に化学的に結合させる方法は既知である。例えば、免疫グロブリンを酵素的に切断して、可変領域を含む断片を得ることができる。これらの断片に含まれる−ＳＳ−結合を−ＳＨ基に還元することにより、二官能性リンカーを付着させることができる。酵素を二官能性リンカーに予め結合させることにより、酵素を抗体断片に結合させることができる。
代替的には、酵素を間接的に結合させるために、例えばアビジン−ビオチン結合を使用してもよい。すなわち、ビオチン化した抗体をアビジンが付着した酵素と接触させることにより、酵素を抗体に間接的に結合させることができる。また、第２の抗体を認識する酵素で標識した抗体である第３の抗体を用いて、酵素を第２の抗体に間接的に結合させることができる。例えば、酵素（例えば上記で例示される酵素）を、抗体を標識するための酵素として使用することができる。
本発明のキットは、ＥＰＨＡ７に対する陽性対照をさらに含む。ＥＰＨＡ７に対する陽性対照は、濃度を予め求めたＥＰＨＡ７を含む。例示的な濃度は、例えば本発明の試験方法における標準値として設定された濃度を含む。代替的には、より濃度の高い陽性対照も組み合わせることができる。本発明のＥＰＨＡ７に対する陽性対照は、濃度が予め求められているＣＥＡ及び／又はｐｒｏＧＲＰをさらに含むことができる。ＣＥＡ若しくはｐｒｏＧＲＰ又はその両方及びＥＰＨＡ７を含む陽性対照は本発明の陽性対照としての使用が見出される。
したがって、本発明はＥＰＨＡ７に加えて、ＣＥＡ若しくはｐｒｏＧＲＰ又はその両方を正常値より高い濃度で含む、肺癌を検出するための陽性対照を提供する。代替的には、本発明は、肺癌の検出のための陽性対照の生成における、ＣＥＡ及び／又はｐｒｏＧＲＰ並びにＥＰＨＡ７を正常値より高い濃度で含有する血液試料の使用に関する。ＣＥＡ及びｐｒｏＧＲＰは、肺癌に関する指標としての役割を果たすことができることが知られている。しかしながら、肺癌に関する指標としてのＥＰＨＡ７の使用は記載されていない。したがって、ＣＥＡ又はｐｒｏＧＲＰの他にＥＰＨＡ７を含む陽性対照は、本発明以前は知られていなかった。本発明の陽性対照は、ＣＥＡ及び／又はｐｒｏＧＲＰ並びにＥＰＨＡ７を標準値よりも高い濃度で血液試料に添加することによって調製されることができる。例えば、標準値よりも高い濃度でＣＥＡ及び／又はｐｒｏＧＲＰ並びにＥＰＨＡ７を含む血清を本発明の陽性対照として使用することができる。
幾つかの実施形態では、本発明における陽性対照は液体形態である。本発明においては、血液試料が試料として使用される。したがって、対照として使用される試料も液体形態である必要がある。代替的には、乾燥陽性対照を使用時に所定の量の液体で溶解することにより、試験濃度を与える対照を調製することができる。乾燥陽性対照と共に、それを溶解するのに必要な量の液体を梱包することにより、使用者はそれらを単に混合するだけで必要な陽性対照を得ることができる。陽性対照として使用されるＥＰＨＡ７は天然由来のタンパク質であっても、又は組み換えタンパク質であってもよい。同様に、ＣＥＡの場合も、天然由来のタンパク質を使用してもよい。陽性対照だけでなく、陰性対照を本発明のキットにおいて組み合わせることもできる。陽性対照又は陰性対照は、イムノアッセイにより示される結果が正確であることを確認するために使用される。
スクリーニング方法
（１）スクリーニングのための試験化合物
本発明に関して、本スクリーニング法により同定される薬剤は任意の化合物であっても、又は幾つかの化合物を含む組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞又はタンパク質に曝露される試験薬剤は、単一の化合物であっても、又は化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを方法に使用する場合、化合物は順次又は同時に接触させることができる。
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験薬剤、例えば細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等の核酸構築物等を含む）、及び天然化合物を使用することができる。本発明の試験薬剤はまた、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相又は溶液相ライブラリ法、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、及び（５）アフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当該技術分野で既知の組み合わせライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。
アフィニティクロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、又は低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当該技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照）、又はビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、及び同第５，２２３，４０９号明細書）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、若しくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２−１０３３６０号明細書）上で提供され得る。
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングした化合物の構造の一部を付加、欠失、及び／又は置換により変換した化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる薬剤に含まれる。
さらに、スクリーニングした試験作用物質がタンパク質である場合、タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、タンパク質の全アミノ酸配列を求めて、タンパク質をコードする核酸配列を推測するか、又は得られるタンパク質の部分アミノ酸配列を分析して、該配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。得られるＤＮＡは、癌を治療又は予防するための候補である試験作用物質を調製する上での使用が見出される。
本明細書中に記載されるスクリーニングに有用な試験作用物質はまた、ＣＸペプチド、又はパートナーと結合する活性若しくは基質をリン酸化する活性を欠く又はｉｎ ｖｉｖｏでキナーゼによってその部分ＣＸタンパク質に特異的に結合する抗体又は非抗体結合タンパク質であり得る。かかる部分タンパク質又は抗体は、本明細書に記載の方法によって調製することができ（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物又は抗体を参照されたい）、また、ＣＸタンパク質のリン酸化の阻止能、又はタンパク質（例えばＥＰＨＡ７／ＥＧＦＲ、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１）とその結合パートナーとの結合能について試験することができる。
（ｉ）分子モデリング：
試験作用物質ライブラリの構築は、求められる特性を有することが知られる化合物の分子構造、及び／又は阻害される標的分子、すなわちＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１の分子構造の情報により容易になる。さらなる評価に適切な試験作用物質を予備スクリーニングする一アプローチは、試験作用物質とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、及び該分子と相互作用する新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元構成は典型的には選択した分子のｘ線結晶学的分析又はＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測可能にし、結合特異性を完全なものにする化合物及び標的分子の構造の実験的操作を可能にする。軽微な変化が一方又は両方に加えられる場合に、分子−化合物相互作用何であるか予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェア及び計算主体の（computationally intensive）コンピュータが必要とされる。
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラム及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation，Waltham，Mass）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化及び分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子の互いの相互作用的構築、修飾、可視化、及び挙動分析を可能にする。
Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、及び核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90等の多数の論文が、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを概説している。
化学物質をスクリーニング及び図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc.（Mississauga，Ontario，Canada）、及びHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）等の会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
ＣＸ活性の阻害剤を同定した後、下記に詳述するように、コンビナトリアル化学技法を採用し、同定した阻害剤の化学的構造に基づいて、任意の数の変異体を構成することができる。得られた候補阻害剤又は「試験作用物質」のライブラリを本方法を用いてスクリーニングし、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１活性を障害するライブラリの試験作用物質を同定してもよい。
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成
試験作用物質のコンビナトリアルライブラリは、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１活性の既知の阻害剤中に存在するコア構造の情報を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製することができる。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを促す適度なサイズにライブラリを維持することが可能になる。代替的には、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより単純な、特に短い重合体分子ライブラリが構築され得る。この後者のアプローチの一例は、６アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。かかるペプチドライブラリは６アミノ酸おきの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に既知であり、化学合成又は生物学的合成のいずれかにより作り出すことができる。コンビナトリアル化学ライブラリとしては、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号明細書、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作り出すための他の化学を使用することもできる。かかる化学としては、ペプチド（例えば国際公開第９１／１９７３５号パンフレット）、コード化ペプチド（例えば国際公開第９３／２０２４２号パンフレット）、ランダムバイオオリゴマー（random bio-oligomer）（例えば国際公開第９２／０００９１号パンフレット）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号明細書）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチド等のダイバーソマー（diversomer）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニル性ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（nonpeptidal）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（oligocarbamate）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、及び／又はペプチジルホスホネート（peptidylphosphonate）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1990-2008, John Wiley Interscience、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdEd., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号明細書を参照）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号明細書を参照）、炭水化物ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号明細書を参照）、並びに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号明細書）、チアゾリジノン及びメタチアゾノン（metathiazanone）（米国特許第５，５４９，９７４号明細書）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号明細書及び同第５，５１９，１３４号明細書）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号明細書）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号明細書）等を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉｉｉ）ファージディスプレイ：
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組み換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きいライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、及びFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号明細書）、及びRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号明細書）は、アゴニスト又はアンタゴニストとして試験することのできるペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ（Advanced Chem Tech，Louisville KY）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Rainin，Woburn，MA）、４３３Ａ（Applied Biosystems，Foster City，CA）、９０５０ Ｐｌｕｓ（Millipore，Bedford，MA）を参照）。また、多数のコンビナトリアルライブラリ自体も市販されている（例えば、ComGenex（Princeton，N.J.）、Tripos, Inc.（St. Louis，MO）、3D Pharmaceuticals（Exton，PA）、Martek Biosciences（Columbia，MD）等を参照）。
（２）スクリーニング方法
（ｉ）一般的なスクリーニング方法
ＣＸタンパク質と結合する化合物をスクリーニングするために、免疫沈降において、これらの抗体又は非抗体結合タンパク質を、適当な洗浄剤を用いて調製された細胞溶解物に添加することによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ポリペプチドと、ポリペプチドに対する結合親和性を有するポリペプチドと、抗体又は非抗体結合タンパク質とから成る。免疫沈降は、上記のエピトープに対する抗体を使用するのに加えて、ポリペプチドに対する抗体を使用しても実施することができ、これらの抗体は上記のように調製することができる（抗体を参照されたい）。
抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインＡセファロース又はプロテインＧセファロースによって沈降され得る。本発明のポリペプチドがエピトープを有する融合タンパク質、例えばＧＳＴとして調製される場合、免疫複合体は、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて、ポリペプチドに対する抗体を使用するのと同じように形成することができる。
免疫沈降は以下のように、又は例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)）における方法に従って行なうことができる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、免疫沈降タンパク質の分析に一般に使用され、結合したタンパク質は、適当な濃度のゲルを用いてタンパク質の分子量により分析される。ポリペプチドに結合したタンパク質は、例えばクマシー染色又は銀染色等の一般の染色法によって検出することが困難であるため、タンパク質に対する検出感度は細胞を、細胞中のタンパク質を標識する放射性同位体３５Ｓ−メチオニン又は３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で培養し、タンパク質を検出することにより改善され得る。標的タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、タンパク質の分子量が明らかとなっている場合にその配列を求めることができる。
ＣＸポリペプチドに結合するタンパク質を、該ポリペプチドを用いてスクリーニングする方法として、例えばウエストウエスタンブロット分析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））を使用することができる。具体的には、ＣＸポリペプチドに結合するタンパク質は、細胞、組織、器官（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）、又はＣＸポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが期待される培養細胞からｃＤＮＡライブラリを、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて調製し、ＬＢ−アガロース上でタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質をフィルタ上に固定し、精製及び標識したＣＸポリペプチドを該フィルタと反応させ、ＣＸポリペプチドに結合したタンパク質を発現するプラークを標識によって検出することにより得ることができる。ＣＸポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの間の結合を利用するか、又はＣＸポリペプチドと特異的に結合する抗体、又はＣＸポリペプチドに融合させたペプチド若しくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することにより標識してもよい。放射性同位体又は蛍光等を用いる方法も使用することができる。
「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、本明細書では、分光的手段、光化学的手段、生物学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物を表すのに用いられる。かかる標識としては、標識されたストレプトアビジン複合体による染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光染料（例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射線標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びＥＬＩＳＡに共通して使用される他のもの）、及び熱量測定標識、例えばコロイド金又は着色ガラス若しくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズが挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，９３９，３５０号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，２７５，１４９号明細書、及び同第４，３６６，２４１号明細書が挙げられる。かかる標識を検出する手段は当業者にとって既知である。このようにして例えば、放射線標識は写真フィルム又はシンチレーションカウンタを使用して検出することができ、蛍光マーカーは発光を検出するために光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は典型的に、酵素に基質を与え、基質に対する酵素作用によって生成された反応生成物を検出することによって検出され、熱量測定標識は着色標識を単純に視覚化することによって検出される。
代替的には、本発明のスクリーニング法の別の実施形態では、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）；参考文献は"Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)"、"Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)"）。
ツーハイブリッドシステムにおいては、本発明のポリペプチドをＳＲＦ−結合領域又はＧＡＬ４−結合領域に融合させ、酵母細胞において発現させる。ｃＤＮＡライブラリを、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが期待される細胞から、ライブラリが発現される場合に、ＶＰ１６転写活性化領域又はＧＡＬ４転写活性化領域に融合するように調製することができる。次に、ｃＤＮＡライブラリを上記酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するｃＤＮＡを検出される陽性クローンから単離する（本発明のポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、その２つの結合がレポーター遺伝子を活性化するため、陽性クローンが検出可能となる）。ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、上記で単離されるｃＤＮＡを大腸菌に導入し、タンパク質を発現させることにより調製することができる。
レポーター遺伝子として、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等も使用することができる。
ＣＸポリペプチドに結合する化合物は、アフィニティクロマトグラフィーを用いてもスクリーニングすることができる。例えば、ＣＸポリペプチドをアフィニティーカラムの担体上に固定化させ、ＣＸポリペプチドに結合することが可能なタンパク質を含有する試験化合物をカラムに適用してもよい。本明細書における試験化合物は、例えば細胞抽出物、細胞可溶化物等であり得る。試験化合物を投入した後、カラムを洗浄し、ＣＸポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られるタンパク質のアミノ酸配列を分析して、該配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、オリゴＤＮＡをプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
本発明においては、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサーを、結合した化合物を検出又は定量化する手段として使用してもよい。かかるバイオセンサーを使用する場合、CXポリペプチドと試験化合物との間の相互作用は、わずかな量のポリペプチドを用いて、標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとして即時に観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia））。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いて、本発明のＣＸポリペプチドと試験化合物との間の結合を評価することが可能である。
ＣＸタンパク質とその結合パートナーとの結合（例えばＥＰＨＡ７／ＥＧＦＲ、ＣＤＣＡ５／ＣＤＣ２、ＣＤＣＡ５／ＥＲＫ、ＳＴＫ３１／ｃ−ｒａｆ、ＳＴＫ３１／ＭＥＫ及びＳＴＫ３１／ＥＲＫ）を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に既知の多くの方法を使用することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系、例えば細胞系としてスクリーニングを実施することができる。より具体的には、初めにＣＸタンパク質又はその結合パートナーのいずれかを支持体に結合させ、それにもう一方のタンパク質を試験化合物と共に加える。例えば、ＣＤＣＡ５ポリペプチド、ＣＤＣ２ポリペプチド又はＥＲＫポリペプチドのいずれかを支持体に結合させ、それに結合パートナーポリペプチドを試験化合物と共に加える。次に、混合物をインキュベート及び洗浄して、支持体に結合したもう一方のタンパク質を検出及び／又は測定する。
本発明に関して、２つのタンパク質間の「結合の阻害」は、タンパク質間の結合を少なくとも低減することを表す。したがって場合によって、試験作用物質の存在下で試料において結合対の割合が適当な（例えば、試験化合物で処理しない、又は非癌試料由来の、又は癌試料由来の）対照に比べて低減する。結合タンパク質量の低減は例えば、対照試料で結合した対の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満又はそれより少なくなり得る（例えば０％）。
タンパク質の結合に使用することができる支持体の例としては例えば、不溶性多糖、例えばアガロース、セルロース及びデキストラン；及び合成樹脂、例えばポリアクリルアミド、ポリスチレン及びシリコンが挙げられる。例えば上記の材料から調製された市販のビーズ及びプレート（例えばマルチウェルプレート、バイオセンサチップ等）を使用することができる。ビーズを使用する場合、カラムに充填してもよい。代替的に、磁気ビーズの使用も当該技術分野で既知であり、磁性を介してビーズ上で結合したタンパク質を容易に単離することを可能にする。
タンパク質と支持体との結合は、常法、例えば化学結合及び物理的吸着に従って実施することができる。代替的に、タンパク質は、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体と結合することができる。その上、タンパク質と支持体との結合は、アビジン及びビオチンによっても実施することができる。
固定化ポリペプチドが合成化学物質、又は天然物質バンク又はランダムファージペプチド提示ライブラリに曝されたときに結合するところの分子をスクリーニングする方法と、タンパク質だけでなく、タンパク質と結合する化学物質（アゴニスト及びアンタゴニストを含む）も単離するための、コンビナトリアル化学的技法（combinatorial chemistry technique）に基づくハイスループットを用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-63（1996）、Verdine, Nature 384: 11-3（1996））とが当業者に既知である。
さらに、ポリペプチド又はその機能的等価物のリン酸化レベルは、当該技術分野で既知の任意の方法に従って検出することができる。例えば、試験化合物をポリペプチド発現細胞に接触させ、ポリペプチドをリン酸化させるのに十分な時間、細胞をインキュベートした後、リン酸化したポリペプチドの量を検出することができる。代替的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験化合物をポリペプチドに接触させ、ポリペプチドをリン酸化させる条件下でポリペプチドをインキュベートした後、リン酸化したポリペプチドの量を検出することができる（（１４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのキナーゼアッセイを参照されたい）。
本発明において、リン酸化に好適な条件は、リン酸供与体、例えばＡＴＰの存在下での基質と酵素タンパク質とのインキュベーションによって与えられ得る。またリン酸化に好適な条件としては、ポリペプチドを発現する細胞を培養する際の条件が挙げられる。例えば細胞は、ＣＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを保有する形質転換細胞である（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。インキュベーション後、例えばリン酸化基質を認識する抗体を用いて、又はＡＴＰリン酸供与体によって伝達された標識γホスフェートを検出することによって、基質のリン酸化レベルを検出することができる。リン酸化基質の検出の前に、基質を形質転換細胞の他の要素又は細胞溶解物から分離することができる。例えば、ゲル電気泳動を基質の分離に使用することができる。代替的に、基質に対する抗体を有する担体と接触させることによって、基質を捕捉することができる。
リン酸化タンパク質の検出のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は免疫沈降を使用することができる。さらに、リン酸化残基又は伝達された標識ホスフェートを認識する抗体を、リン酸化タンパク質レベルを検出するのに使用することができる。リン酸化ポリペプチドを認識する抗体を用いた任意の免疫学的技法を検出に使用することができる。リン酸化ポリペプチドを認識する抗体によるＥＬＩＳＡ又は免疫ブロット法を本発明に用いることができる。標識リン酸供与体を使用する場合、標識を追跡することによって、基質のリン酸化レベルを検出することができる。例えば、放射標識ＡＴＰ（例えば３２Ｐ−ＡＴＰ）をリン酸化供与体として使用することができ、分離した基質の放射能は基質のリン酸化レベルと相関関係にある。代替的に、非リン酸化基質からリン酸化基質を特異的に認識する抗体を、リン酸化基質の検出に使用することができる。
試験化合物と接触したリン酸化ＣＸポリペプチドの検出量が、試験化合物と接触してない場合に検出された量まで減少する場合、試験化合物は、ＣＸタンパク質のポリペプチドリン酸化を阻害し、これにより肺癌及び／又は食道癌抑制能があると見なされる。本明細書で、リン酸化レベルは、試験作用物質と接触していない細胞で検出されたものに比べて、例えば１０％、２５％若しくは５０％、又は少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍若しくは少なくとも１０倍又はそれ以上減少した場合に「減少」したと見なすことができる。例えば、スチューデントｔ検定、マンホイットニーＵ検定又はＡＮＯＶＡを統計的解析に使用することができる。
さらに、ポリペプチド又はその機能的等価物の発現レベルは、当該技術分野で既知の任意の方法に従って検出することができる。例えば、レポーターアッセイを用いることができる。好適なレポーター遺伝子及び宿主細胞が当該技術分野で既知である。スクリーニングに要求されるレポーター構築物は、ＣＸ遺伝子又はその下流の遺伝子の転写調節領域を用いることによって調製することができる。遺伝子の転写調節領域が当業者にとって既知である場合、レポーター構築物はこれまでの配列情報を用いることによって調製することができる。転写調節領域が同定されないままである場合、遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づき、ゲノムライブラリから転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントを単離することができる。特に、スクリーニングに要求されるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列を対象のＣＸ遺伝子の転写調節領域と連結させることによって調製することができる。ＣＸ遺伝子の転写調節領域は、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流、例えば１０００ｂｐ、例えば５０００ｂｐ又は１００００ｂｐ上流の領域にある。転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができるか、又はＰＣＲによって伝播することができる。転写調節領域を同定する方法、及びアッセイプロトコルも既知である（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
様々なロースループット（low-throughput）及びハイスループットの酵素アッセイフォーマットが当該技術分野で既知であり、ＣＸポリペプチドのリン酸化レベルの検出又は測定に容易に適合させることができる。便宜上、ハイスループットアッセイのために、基質を固体支持体上に固定することができる。反応後に、上記の方法によって、リン酸化した基質を固体支持体上で検出することができる。代替的に、接触させる工程を溶液中で実施することができ、その後基質を固体支持体上に固定し、リン酸化した基質を検出することができる。かかるアッセイを容易にするために、固体支持体を、ストレプトアビジンとビオチンで標識した基質とでコーティングすることができるか、又は固体支持体を基質に対する抗体でコーティングすることができる。当業者は、スクリーニングの所望のスループット能に応じて好適なアッセイフォーマットを求めることができる。
本発明のアッセイは、ハイスループットスクリーニングを容易にする自動化手法にも好適である。多くの既知のロボットシステムが溶液相化学分野で開発されている。これらのシステムとしては、武田薬品工業株式会社（日本、大阪）で開発された自動化合成装置及びロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ ＩＩ，Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.、Orca, Hewlett Packard, Palo Alto, Calif.）のような自動化ワークステーションが挙げられ、これらは化学者によって行われる手動の合成操作の代わりをする。上記の装置のいずれかが、本発明での使用に好適である。これらの装置の性質、及び（必要であれば）これらの装置を本明細書で考慮されるように操作することができるような、これらの装置に対する改良の実施は、関連技術分野における当業者にとって明らかになる。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリ自体が市販されている（例えばComGenex, Princeton, N.J.、Asinex, Moscow, Ru、Tripos, Inc., St. Louis, MO、ChemStar, Ltd, Moscow, RU、3D Pharmaceuticals, Exton, PA、Martek Biosciences, Columbia, MD等を参照されたい）。
（ｉｉ）ＣＸタンパク質（複数可）と結合する化合物のスクリーニング
本発明において、ＣＤＣＡ５は睾丸を除く正常な器官では発現しないにもかかわらず、肺癌及び食道癌においてＣＤＣＡ５の過剰発現が検出された（図１）。ＥＰＨＡ７は胎児脳及び胎児腎臓を除く正常な器官で発現しないにもかかわらず、肺癌及び食道癌においてＥＰＨＡ７の過剰発現が検出された（図３）。ＳＴＫ３１は睾丸を除く正常な器官で発現しないにもかかわらず、肺癌及び食道癌においてＳＴＫ３１の過剰発現が検出された（図９）。ＷＤＨＤ１は睾丸を除く正常な器官で発現しないにもかかわらず、肺癌及び食道癌においてＷＤＨＤ１の過剰発現が検出された（図１３、図１４Ａ及び図１４Ｂ）。したがって、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子、遺伝子によってコードされるタンパク質又は遺伝子の転写調節領域を用いて、遺伝子の発現、又は遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物活性を変える化合物をスクリーニングすることができる。かかる化合物は、肺癌及び食道癌を治療若しくは予防するための調合薬、又は肺癌及び食道癌を診断する作用物質を検出し、肺癌及び／又は食道癌の患者の予後を判定するための検出剤として使用される。
特に本発明は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１ポリペプチドを用いて癌を診断、治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法の一実施形態は、
（ａ）試験作用物質をＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１タンパク質から成る群から選択されるポリペプチド又はその断片に接触させる工程と、
（ｂ）ポリペプチドと上記試験作用物質との結合を検出する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の上記ポリペプチドと結合する試験作用物質を選択する工程とを含む。
本方法を以下により詳細に説明する。
スクリーニングに使用されるＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドは、天然ポリペプチド又はその部分ペプチドに由来する組換えポリペプチド又はタンパク質であり得る。試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、又は他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドを用いて、例えばＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に既知の多くの方法を用いることができる。かかるスクリーニングは、例えば免疫沈降法によって実施することができる。ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドをコードする遺伝子は、遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ及びｐＣＤ８に挿入することによって宿主（例えば、動物）細胞等で発現する。
発現に使用されるプロモーターは、一般的に使用することができる任意のプロモーターであってもよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson（ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141（1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23（1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193(1991)）、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989)）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター等が挙げられる。
外来遺伝子を発現するために、任意の方法、例えば電気穿孔法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993)）等に従って、遺伝子の宿主細胞への導入を実施することができる。
ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１遺伝子によってコードされるポリペプチドは、特異性が明らかになっているモノクローナル抗体のエピトープをポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として発現され得る。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。その複数のクローニング部位の使用によって、例えばｂ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等を有する融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。また、融合によってＣＸポリペプチドの特性が変わらないように、数個から十数個のアミノ酸から成る小さいエピトープのみを導入することによって調製される融合タンパク質も報告されている。エピトープ、例えばポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等、及びこれらを認識するモノクローナル抗体は、ＣＸポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。
免疫沈降において、免疫複合体は、適当な洗剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって形成される。免疫複合体は、ＣＸポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とから成る。また上記のように調製することができる、上記エピトープに対する抗体を使用することに加えて、ＣＸポリペプチドに対する抗体を使用して、免疫沈降を実施することができる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインＡセファロース又はプロテインＧセファロースによって沈降され得る。ＣＸ遺伝子によってコードされるポリペプチドがエピトープを有する融合タンパク質、例えばＧＳＴとして調製される場合、免疫複合体は、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて、ＣＸポリペプチドに対する抗体を使用するのと同じように形成することができる。
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York（1988））における方法に従って又は準じて実施することができる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合タンパク質は、適当な濃度のゲルを用いて、タンパク質の分子量によって解析することができる。ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色又は銀染色等の一般的な染色法では検出することが困難であるため、タンパク質に対する検出感度は、細胞を、細胞中の該タンパク質を標識する放射性同位体、３５Ｓ−メチオニン又は３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で培養し、該タンパク質を検出することにより改善され得る。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
ポリペプチドを用いて、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、例えばウェスト−ウェスタンブロット法解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））を使用することができる。特に、ＣＸポリペプチドと結合するタンパク質は、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて、ＣＸポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが期待される培養細胞（例えば肺癌細胞株又は食道癌細胞株）からｃＤＮＡライブラリを調製すること、ＬＢ−アガロース上でタンパク質を発現すること、フィルター上で発現したタンパク質を固定すること、精製及び標識したＣＸポリペプチドを上記のフィルターと反応させること、並びに標識に従って、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドと結合したタンパク質を発現するプラークを検出することによって得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用すること、又はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体、又はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドに融合するペプチド若しくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することによって標識することができる。放射性同位体又は蛍光色素等を使用する方法も用いることができる。
代替的に、本発明のスクリーニング方法の別の実施形態において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用することができる（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）。
ツーハイブリッドシステムにおいて、本発明のポリペプチドは、ＳＲＦ結合領域又はＧＡＬ４結合領域に融合し、酵母細胞で発現する。ｃＤＮＡライブラリは、発現するとＶＰ１６又はＧＡＬ４の転写活性化領域と融合するように、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが期待される細胞から調製される。それから、ｃＤＮＡライブラリを上記の酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するｃＤＮＡを検出される陽性クローンから単離する（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現する場合、２つの結合がレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能にさせる）。ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質は、上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入すること及びタンパク質を発現することによって調製することができる。ＨＩＳ３遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
ＣＸ遺伝子によってコードされたポリペプチドと結合する化合物は、アフィニティクロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティカラムの担体上に固定することができ、本発明のポリペプチドとの結合が可能なタンパク質を含有する試験化合物をカラムに適用する。本明細書での試験化合物は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験化合物を充填した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、プローブとしてオリゴＤＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする。
表面プラズモン共鳴現象を用いたバイオセンサが、本発明において結合化合物を検出又は定量する手段として使用され得る。かかるバイオセンサが使用される場合、本発明のポリペプチドと試験化合物との相互作用は、微量のポリペプチドだけを用いて、標識を用いずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、バイオセンサ、例えばＢＩＡｃｏｒｅを用いて、本発明のポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。
固定化ＣＸポリペプチドが合成化学物質、又は天然物質バンク又はランダムファージペプチド提示ライブラリに曝されると、結合する分子をスクリーニングする方法と、タンパク質だけでなく、ＣＸタンパク質と結合する化学物質（アゴニスト及びアンタゴニストを含む）も単離するために、コンビナトリアル化学的技法に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64（1996）、Verdine, Nature 384: 11-13（1996）、Hogan, Nature 384: 17-9(1996)）とが当業者に既知である。
（ｉｉｉ）ＣＸ遺伝子（複数可）の生物活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明において、ＣＤＣＡ５タンパク質は癌細胞の細胞増殖を促進する活性と（図２）、リン酸化活性と（図１７Ｃ）とを有し、ＥＰＨＡ７タンパク質は細胞の細胞増殖を促進する活性と（図６）、細胞浸潤を促進する活性と（図７）、ＥＧＦＲとの結合活性と（図８Ｂ）、ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ−８４５、Ｔｙｒ−１０６８、Ｔｙｒ−１０８６、Ｔｙｒ−１１７３）に対するキナーゼ活性と（図８Ａ、図２０Ｅ、図２１）、ＰＬＣγ（Ｔｙｒ７８３）、ＣＤＣ２５（Ｓｅｒ−２１６）、ＭＥＴ（Ｔｙｒ−１２３０／１２３４／１２３５、Ｔｙｒ−１３１３、Ｔｙｒ−１３４９、Ｔｙｒ−１３６５）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００２４５、配列番号５６）のリン酸化を促進する活性と（図８Ａ、図２１）を有し、ＳＴＫ３１タンパク質は癌細胞の細胞増殖を促進する活性と（図１１）、キナーゼ活性と（図１２Ａ）、ＥＧＦＲ（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）、ＥＲＫ（ＥＲＫ１／２、Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｈｒ２０４）及びＭＥＫのリン酸化を促進する活性と（図１２Ｂ、図１２Ｄ）を有し、ＷＤＨＤ１タンパク質は癌細胞の細胞増殖を促進する活性と（図１５Ａ）、細胞生存を促進する活性と（図１５Ｃ）、リン酸化活性と（図１６Ａ）を有する。この生物活性を用いて、このタンパク質のこの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。したがって本発明は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いて、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１若しくはＷＤＨＤ１遺伝子を発現する癌、例えば肺癌（非小細胞肺癌又は小細胞肺癌）又は食道癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
特に本発明は、以下の［１］〜［１９］の方法を提供する：
［１］ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子を少なくとも１つ発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を、癌で発現する遺伝子によってコードされるポリペプチド、又はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞に接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の上記ポリヌクレオチド又は上記ポリペプチドのレベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出された上記レベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の上記レベルを低減又は阻害する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］上記レベルが、
（ａ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物をコードするｍＲＮＡの量を検出すること、
（ｂ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物の量を検出すること、並びに
（ｃ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物の生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか１つによって検出される、［１］に記載の方法。
［３］上記生物活性が、
（ａ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物を発現する細胞の増殖活性、
（ｂ）ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物を発現する細胞の浸潤活性、並びに
（ｃ）ＥＰＨＡ７ポリペプチド及びＳＴＫ３１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物のキナーゼ活性から成る群から選択される活性のいずれか１つである、［２］に記載の方法。
本方法を以下でより詳細に説明する。
任意のポリペプチドは、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質の生物活性を含んでいればスクリーニングに使用することができる。かかる生物活性としては、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１若しくはＷＤＨＤ１に対する細胞増殖活性、ＥＰＨＡ７に対する細胞浸潤を促進する活性、ＥＰＨＡ７に対するＥＧＦＲ結合活性、又はＥＰＨＡ７タンパク質に対する細胞外分泌活性、ＥＰＨＡ７若しくはＳＴＫ３１に対するキナーゼ活性、ＷＤＨＤ１に対するリン酸化活性、又はＷＤＨＤ１に対する細胞生存促進活性が挙げられる。例えば、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１タンパク質を使用してもよく、これらのタンパク質と機能的に同等なポリペプチドを使用してもよい。かかるポリペプチドは、細胞によって内因的に又は外因的に発現され得る。
このスクリーニングによって単離される化合物は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補物質である。「アンタゴニスト」という用語は、その結合によってポリペプチドの機能を阻害する分子を表す。この用語は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１をコードする遺伝子の発現を低減又は阻害する分子も表す。その上、このスクリーニングによって単離される化合物は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１ポリペプチドと分子（ＤＮＡ及びタンパク質を含む）とのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用を阻害する化合物の候補物質である。
本方法で検出される生物活性が細胞増殖である場合、これは、例えばＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドを発現する細胞を調製し、試験化合物の存在下で前記細胞を培養して細胞周期等を測定して、細胞増殖の速度を決定することにより、並びに例えば実施例２〜実施例５で示されるコロニー形成能を測定すること、ＭＴＴアッセイ、コロニー形成アッセイ又はＦＡＣＳによって検出することができる。
本方法で検出される生物活性がＥＰＨＡ７の細胞外分泌である場合、これは、例えば培養培地中のＥＰＨＡ７タンパク質の量、例えば図２Ｇの下部パネルで示されるように試験化合物の存在下でＥＰＨＡ７ポリペプチドを発現する細胞を培養することによって検出することができる。
本明細書で規定されるような「生物活性を抑制する」という用語は、化合物の非存在下に比べてのＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１の生物活性の少なくとも１０％の抑制、例えば少なくとも２５％、５０％又は７５％の抑制、例えば少なくとも９０％の抑制を表す。
（ｉｖ）ＣＸ遺伝子（複数可）の発現を変える化合物のスクリーニング
本発明において、ＣＸ遺伝子（複数可）に特異的な二本鎖分子によるＣＸ遺伝子（複数可）の発現の低減が癌細胞の増殖の阻害を引き起こす（ＣＤＣＡ５では図２、ＥＰＨＡ７では図６、ＳＴＫ３１では図１１及びＷＤＨＤ１では図１５）。したがって、膀胱癌の治療又は予防に使用することができる化合物は、指標としてＣＸ遺伝子（複数可）の発現レベルを用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明に関して、かかるスクリーニングは例えば以下の工程を含み得る：
（ａ）候補化合物を、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤを発現する細胞と接触させる工程、及び
（ｂ）対照と比較して、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤの発現レベルを低下させる候補化合物を選択する工程。
本方法を下記により詳細に記載する。
ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤを発現する細胞には、例えば肺癌又は食道癌から樹立される細胞株が含まれ、かかる細胞は本発明の上記スクリーニングに使用することができる（例えばＣＤＣＡ５ではＡ５４９及びＬＣ３１９；ＥＰＨＡ７ではＮＣＩ−Ｈ５２０及びＳＢＣ−５；ＳＴＫ３１ではＬＣ３１９及びＮＣＩ−Ｈ２１７０；及びＷＤＨＤ１ではＬＣ３１９及びＴＥ９）。発現レベルは当業者に既知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリー分析により予想することができる。本明細書中に規定する「発現レベルを低下させる」という用語は、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤの発現レベルを、化合物の非存在での発現レベルと比較して、少なくとも１０％、例えば少なくとも２５％、５０％、又は７５％、例えば少なくとも９５％レベルを低下させることである。本明細書における化合物は化学物質、二本鎖ヌクレオチド等を含む。二本鎖ヌクレオチドの調整は上述の通りである。スクリーニング法においては、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤの発現レベルを低下させる化合物を、癌、例えば肺癌及び／又は食道癌の治療又は予防に使用される候補作用物質として選択することができる。
代替的には、本発明のスクリーニング法には、
（ａ）候補化合物を、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤの転写調節領域及び転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を備えるベクターを導入した細胞と接触させる工程、
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、並びに
（ｃ）上記レポーター遺伝子の発現又は活性を低下させる候補化合物を選択する工程が含まれ得る。
適切なレポーター遺伝子及び宿主細胞は当該技術分野で既知である。例えば、レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Discosoma sp.）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、及びβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が挙げられる。宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列とＣＸの転写調節領域とを連結することにより調製することができる。本明細書におけるＣＸの転写調節領域は、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流、例えば１０００ｂｐ、例えば５０００ｂｐ又は１００００ｂｐ上流までの領域であるが、それに制限されない。転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができ、又はＰＣＲによって増幅させる（propagated）ことができる。転写調節領域を同定する方法、さらにアッセイプロトコルは既知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
上記レポーター構築物を含有するベクターを、宿主細胞に感染させ、レポーター遺伝子の発現又は活性を当該技術分野で既知の方法により（例えばルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書中に規定する「発現又は活性を低下させる」とは、レポーター遺伝子の発現又は活性を、化合物の非存在での発現又は活性と比較して、少なくとも１０％、例えば少なくとも２５％、５０％、又は７５％、例えば少なくとも９５％低下させることに言及する。
本発明の態様を以下の実施例で説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定する意図はない。
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を以下で説明する。
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
（ｖ）指標としてのＥＰＨＡ７とＥＧＦＲとの結合を用いるスクリーニング
本発明において、ＥＰＨＡ７タンパク質がＥＧＦＲタンパク質と相互作用し（図８Ｂ）、ＥＧＦＲタンパク質のＴｙｒ−８４５でリン酸化する（図８Ａ）ことが確認された。さらに、ＥＰＨＡ７タンパク質の存在下でのＰＬＣγ（Ｔｙｒ−７８３）、ＣＤＣ２５（Ｓｅｒ−２１６）、ＭＥＴ（Ｔｙｒ−１２３０／１２３４／１２３５、Ｔｙｒ−１３１３、Ｔｙｒ−１３４９、Ｔｙｒ−１３６５）、Ｓｈｃ（Ｔｙｒ３１７、Ｔｙｒ２３９／２４０）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１３００４１、配列番号５８）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１４４３１、配列番号６０）及びＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１３９２７６、配列番号６２）（図８Ａ、図２１、図２２）のリン酸化の促進も確認された。ＥＰＨＡ７は、６３３ａａ〜８９０ａａにおいて、タンパク質キナーゼドメインのコンセンサス配列を有することが知られている。したがって本発明者らは、その経路が細胞増殖及び細胞浸潤に関与することが知られた、ＥＰＨＡ７の基質としてＥＧＦＲを同定した。このようにして、ＥＰＨＡ７タンパク質とＥＧＦＲタンパク質との結合を阻害する化合物は、指標としてＥＰＨＡ７タンパク質とＥＧＦＲタンパク質とのかかる結合、又はＥＧＦＲタンパク質（Ｔｙｒ−８４５）のリン酸化レベルを用いてスクリーニングすることができる。さらに本発明者らは、ＭＥＴとＥＰＨＡ７との相互作用を同定した。それにより本発明は、ＥＰＨＡ７タンパク質とＥＧＦＲタンパク質又はＭＥＴタンパク質との結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法も提供し、この化合物は指標としてＥＰＨＡ７タンパク質とＥＧＦＲタンパク質若しくはＭＥＴタンパク質とのかかる結合、又はＥＧＦＲタンパク質（Ｔｙｒ−８４５）のリン酸化レベルを用いてスクリーニングすることができる。さらに本発明は、ＥＰＨＡ７を発現する癌細胞（例えば肺癌細胞及び／又は食道癌細胞）の成長を阻害又は低減する化合物と、癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）を治療又は予防する化合物とをスクリーニングする方法も提供する。
特に本発明は、以下の［１］〜［５］の方法を提供する：
［１］ＥＰＨＡ７ポリペプチドとＥＧＦＲポリペプチド又はＭＥＴポリペプチドとの結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下で、ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物をＥＧＦＲポリペプチド若しくはＭＥＴポリペプチド又はその機能的等価物に接触させる工程と、
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを試験作用物質の非存在下で検出されたものと比較する工程と、
（ｄ）結合レベルを低減又は阻害する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下で、ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物をＥＧＦＲポリペプチド若しくはＭＥＴポリペプチド又はその機能的等価物に接触させる工程と、
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを試験作用物質の非存在下で検出されたものと比較する工程と、
（ｄ）結合レベルを低減又は阻害する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［３］ＥＰＨＡ７の機能的等価物がＥＧＦＲ結合ドメインを含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ＥＧＦＲ又はＭＥＴの機能的等価物がＥＰＨＡ７結合ドメインを含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［１］に記載の方法。
本発明に関して、ＥＰＨＡ７、ＥＧＦＲ又はＭＥＴポリペプチドの機能的等価物はそれぞれ、ＥＰＨＡ７ポリペプチド（配列番号４）、ＥＧＦＲポリペプチド又はＭＥＴポリペプチドに同等の生物活性を有するポリペプチドである（（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物又は実施例１の定義における（６）発現ベクターを参照されたい）。より具体的には、ＥＧＦＲの機能的等価物は配列番号７５のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片であり、ＭＥＴの機能的等価物はＥＰＨＡ７結合ドメインを含む配列番号７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である。
ＥＰＨＡ７とＥＧＦＲとの結合を調整、例えば阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に既知の多くの方法を用いることができる。
スクリーニングに使用されるポリペプチドは、組換えポリペプチド若しくは天然源由来のタンパク質、又はその部分ペプチドであり得る。任意の上述の試験化合物をスクリーニングに使用することができる。
ＥＰＨＡ７ポリペプチド若しくはＥＧＦＲポリペプチド、又はその機能的等価物を用いて、例えばポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）、当業者に既知の多くの方法を用いることができる。かかるスクリーニングは、例えば免疫沈降、ウェスト−ウェスタンブロット法解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））、細胞を利用するツーハイブリッドシステム（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）、アフィニティクロマトグラフィ、及び表面プラズモン共鳴現象を利用するバイオセンサを用いて実施することができる（（ｉ）一般的なスクリーニング方法を参照されたい）。
上述の任意の試験化合物を使用することができる（（１）スクリーニングのための試験化合物を参照されたい）。
幾つかの実施形態において、この方法はさらに、候補化合物と、ＥＰＨＡ７タンパク質若しくはＥＧＦＲタンパク質との結合を検出する工程、又はＥＰＨＡ７タンパク質とＥＧＦＲタンパク質との結合レベルを検出する工程を含む。ＥＰＨＡ７タンパク質及びＥＧＦＲタンパク質を発現する細胞としては例えば、癌、例えば肺癌及び／又は食道癌から樹立される細胞株が挙げられ、かかる細胞は、これらの２つの遺伝子を発現していれば、本発明の上記のスクリーニングに使用することができる。代替的にこれらの２つの細胞を発現するように、細胞に、ＥＰＨＡ７及びＥＧＦＲの発現ベクターの両方又はいずれかをトランスフェクトすることができる。ＥＰＨＡ７タンパク質とＥＧＦＲタンパク質との結合は、抗ＥＰＨＡ７抗体と抗ＥＧＦＲ抗体とを使用して、免疫沈降アッセイによって検出することができる（図８Ｂ）。
（ｖｉｉ）指標としてＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化を用いるスクリーニング
本発明の別の態様によれば、ＥＧＦＲ、ＰＬＣ−γ（配列番号５２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２６６０）、ＣＤＣ２５（配列番号５４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１７９０）、ＭＥＴ（配列番号５６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００２４５）、Ｓｈｃ（配列番号５８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１３００４１）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）（配列番号５０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０４００５６）、Ａｋｔ（配列番号６０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１４４３１）又はＳＴＡＴ３（配列番号６２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１３９２７６）のＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化を阻害又は低減する作用物質は、ＥＰＨＡ７を発現する癌細胞、例えば肺癌細胞又は食道癌細胞の成長を阻害又は低減するために使用することができ、またＥＰＨＡ７を発現する癌、例えば肺癌又は食道癌を治療又は予防するために使用することができ、指標としてＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化レベルを用いてスクリーニングされる。
特に本発明は、以下の［１］〜［５］の方法を提供する：
［１］ＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化を調整する作用物質、又はＥＰＨＡ７遺伝子を発現する癌を予防若しくは治療する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）基質をリン酸化させる条件下で、試験作用物質を
（ｉ）ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物、及び
（ｉｉ）基質として、ＥＧＦＲ、ＰＬＣ−γ、ＣＤＣ２５、ＭＥＴ、Ｓｈｃ、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ若しくはＳＴＡＴ３ポリペプチド、又はその機能的等価物と接触させる工程と、
（ｂ）基質のリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出されたリン酸化レベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたものと比較する工程と、
（ｄ）阻害剤としてリン酸化レベルを阻害又は低減する試験作用物質を選択する工程、又は促進剤としてリン酸化レベルを促進する又は高める試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）基質をリン酸化させる条件下で、試験作用物質を
（ｉ）ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物、及び
（ｉｉ）基質として、ＥＧＦＲ、ＰＬＣ−γ、ＣＤＣ２５、ＭＥＴ、Ｓｈｃ、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ若しくはＳＴＡＴ３ポリペプチド、又はその機能的等価物と接触させる工程と、
（ｂ）基質のリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出されたリン酸化レベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたものと比較する工程と、
（ｄ）リン酸化レベルを阻害又は低減する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［３］ＥＧＦＲ、ＰＬＣ−γ、ＣＤＣ２５、ＭＥＴ、Ｓｈｃ、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ又はＳＴＡＴ３ポリペプチドの機能的等価物がポリペプチドのＥＰＨＡ７媒介性リン酸化部位を少なくとも１つ含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ＥＰＨＡ７媒介性リン酸化部位が、ＥＧＦＲポリペプチドのＴｙｒ８４５、Ｔｙｒ−１０６８、Ｔｙｒ−１０８６若しくはＴｙｒ−１１７３、ＰＬＣγポリペプチドのＴｙｒ−７８３、ＣＤＣ２５ポリペプチドのＳｅｒ−２１６、ＭＥＴポリペプチドのＴｙｒ−１２３０／１２３４／１２３５、Ｔｙｒ−１３１３、Ｔｙｒ−１３４９若しくはＴｙｒ−１３６５、ＳｈｃポリペプチドのＴｙｒ３１７若しくはＴｙｒ２３９／２４０、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）ポリペプチドのＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、又はＡｋｔポリペプチドのＳｅｒ４７３である、［３］に記載の方法。
［５］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［２］に記載の方法。
スクリーニングに使用されるＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物は、当業者に既知の方法によって組換えタンパク質又は天然タンパク質として調製することができる。ポリペプチドは、上述のように、ポリペプチドを生成する任意の既知の遺伝子組換え法（例えばMorrison J., J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology（eds. Wu et al.） 1983, 101: 347-62）を利用して得ることができる（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。
さらに、ＥＰＨＡ７タンパク質の部分ペプチドも、タンパク質のキナーゼ活性を保持していれば本発明に使用することができる。かかる部分ペプチドは、遺伝子組換えによって、ペプチド合成の既知の方法によって、又は適当なペプチダーゼで天然ＥＰＨＡ７タンパク質を消化することによって生成することができる（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。
試験作用物質及びＥＧＦＲタンパク質と接触させるＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物は例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、又は他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
ＥＰＨＡ７ポリペプチドと同様に、本発明のスクリーニングのためのＥＧＦＲポリペプチドは、組換えタンパク質又は天然たんぱく質として調製することができる。さらに、ＥＧＦＲポリペプチドは、得られる融合タンパク質をＥＰＨＡ７ポリペプチドによってリン酸化することができれば、融合タンパク質として調製することができる。ＥＧＦＲのヌクレオチド配列は当該技術分野で既知である。さらに、ＥＧＦＲも市販されている。
これらの実施形態において、ＥＧＦＲポリペプチドをリン酸化させる条件は、ＥＧＦＲポリペプチド及びＡＴＰをリン酸化させるために、ＥＧＦＲポリペプチドをＥＰＨＡ７ポリペプチドとインキュベートすることによって与えられ得る（実施例１における（１４）ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを参照されたい）。さらに本発明では、ＥＰＨＡ７ポリペプチドのキナーゼ活性を高める物質は、スクリーニングの反応混合物に添加することができる。基質のリン酸化が物質の添加によって高まる場合、基質のリン酸化レベルをより高感度で求めることができる。
ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物、その基質と、試験作用物質との接触は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングは、バッファがＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物による基質のリン酸化を阻害しなければ、バッファ、例えばこれらに限定されないが、リン酸バッファ及びＴｒｉｓバッファ中で行うことができる。
本発明では、基質のリン酸化レベルを当該技術分野で既知の方法によって求めることができる（（２）一般的なスクリーニング方法を参照されたい）。
（ｖｉｉｉ）指標としてＳＴＫ３１キナーゼ活性を用いるスクリーニング
本発明において、ＳＴＫ３１タンパク質の存在下でのＥＧＦＲ（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）、ＥＲＫ（Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）及びＭＥＫ（Ｓ２１７／２２１）（図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ）のリン酸化の促進も確認された。ＳＴＫ３１タンパク質は、７４５ａａ〜９７２ａａにおいてＳＴＹＫｃドメインのコンセンサス配列を有することが知られている。これにより本発明者らは、ＳＴＫ３１の下流の標的としてＥＧＦＲ、ＥＲＫ（Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）及びＭＥＫを同定した。ＥＧＦＲのＳｅｒ１０４６／１０４７はＣａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭキナーゼＩＩ）によってリン酸化され、そのリン酸化がＥＧＦＲキナーゼ活性を減衰させたことが示された。ＣａＭキナーゼＩＩは、細胞成長を調節したＥＲＫ（Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）活性化を引き起こすことも報告された。これにより、ＳＴＫ３１キナーゼ活性を阻害又は低減する化合物は、ＳＴＫ３１を発現する癌細胞、例えば肺癌細胞及び／又は食道癌細胞を阻害又は低減するのに有用であり、ＳＴＫ３１を発現する癌、例えば肺癌及び／又は食道癌を治療又は予防するのに有用であり得る。さらに本発明者らは、基質としてＭＢＰを使用してＳＴＫ３１キナーゼ活性を確認した。これにより、ＳＹＫ３１キナーゼ活性を阻害する化合物は、ＭＢＰのリン酸化レベルを用いてスクリーニングすることができる。したがって本発明は、指標としてかかるＳＴＫ３１キナーゼ活性を用いて、癌細胞の成長を阻害又は低減する化合物をスクリーニングする方法も提供する。さらに本発明は、ＥＰＨＡ７を発現する癌細胞、例えば肺癌細胞及び／又は食道癌細胞を阻害又は低減する化合物をスクリーニングする方法も提供する。この方法は、ＥＰＨＡ７を発現する癌、例えば肺癌及び／又は食道癌で使用することができる作用物質をスクリーニングするのに特に適している。
特に本発明は、以下の［１］〜［３］の方法を提供する：
［１］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）基質をリン酸化させる条件下で、試験作用物質を
（ｉ）ＳＴＫ３１ポリペプチド又はその機能的等価物、及び
（ｉｉ）基質と接触させる工程と、
（ｂ）基質のリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出されたリン酸化レベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたものと比較する工程と、
（ｄ）リン酸化レベルを阻害又は低減する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］基質がＭＢＰ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ（Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）又はＭＥＫである、［１］に記載の方法。
［３］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［１］に記載の方法。
スクリーニングに使用されるＳＴＫ３１ポリペプチド又はその機能的等価物は、当業者に既知の方法によって組換えタンパク質又は天然タンパク質として調製することができる。ポリペプチドは、上述のように、ポリペプチドを生成する任意の既知の遺伝子組換え法（例えばMorrison J., J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology（eds. Wu et al.） 1983, 101: 347-62）を利用して得ることができる（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。
さらに、ＳＴＫ３１タンパク質の部分ペプチドも、タンパク質のキナーゼ活性を保持していれば本発明に使用することができる。かかる部分ペプチドは、遺伝子組換えによって、ペプチド合成の既知の方法によって、又は適当なペプチダーゼで天然ＳＴＫ３１タンパク質を消化することによって生成することができる（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。
試験作用物質及び基質、例えばＭＢＰ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ（Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）、又はＭＥＫと接触させるＳＴＫ３１ポリペプチド又はその機能的等価物は例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、又は他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
これらの実施形態において、基質をリン酸化させる条件は、基質及びＡＴＰをリン酸化させるために、基質をＳＴＫ３１ポリペプチドとインキュベートすることによって与えられ得る（実施例１における（１４）ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを参照されたい）。さらに本発明では、ＳＴＫ３１ポリペプチドのキナーゼ活性を高める物質は、スクリーニングの反応混合物に添加することができる。基質のリン酸化が物質の添加によって高まる場合、基質のリン酸化レベルをより高感度で求めることができる。
ＳＴＫ３１ポリペプチド又はその機能的等価物、その基質と、試験作用物質との接触は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングは、バッファがＳＴＫ３１ポリペプチド又はその機能的等価物による基質のリン酸化を阻害しなければ、バッファ、例えばこれらに限定されないが、リン酸バッファ及びＴｒｉｓバッファ中で行うことができる。
本発明では、基質のリン酸化レベルを当該技術分野で既知の方法によって求めることができる（（２）一般的なスクリーニング方法を参照されたい）。
（ｉｘ）指標としてＳＴＫ３１と、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）との結合を用いるスクリーニング
本発明において、ＳＴＫ３１タンパク質がｃ−ｒａｆ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２８８０、配列番号６４）、ＭＥＫ又はＥＲＫタンパク質と相互作用し（図１２Ｆ）、またＥＧＦＲタンパク質のＳｅｒ−１０４６／１０４７、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）及びＭＥＫのＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４でリン酸化することが確認された（図１２Ｂ、図１２Ｄ）。ＳＴＫ３１タンパク質と、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）タンパク質との結合を阻害する化合物は、指標としてＳＴＫ３１タンパク質と、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）タンパク質とのかかる結合を用いてスクリーニングすることができる。それにより本発明は、ＳＴＫ３１タンパク質とｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）との結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法も提供し、この化合物はＳＴＫ３１タンパク質とｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）とのかかる結合を用いてスクリーニングすることができる。さらに本発明は、ＳＴＫ３１を発現する癌細胞（例えば肺癌細胞及び／又は食道癌細胞）の成長を阻害又は低減する化合物と、癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）を治療又は予防する化合物とをスクリーニングする方法も提供する。
特に本発明は、以下の［１］〜［５］の方法を提供する：
［１］ＳＴＫ３１ポリペプチドとｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）との結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下で、ＳＴＫ３１ポリペプチド又はその機能的等価物をｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）ポリペプチド又はその機能的等価物に接触させる工程と、
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを試験作用物質の非存在下で検出されたものと比較する工程と、
（ｄ）結合レベルを低減又は阻害する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下で、ＳＴＫ３１ポリペプチド又はその機能的等価物をｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）ポリペプチド又はその機能的等価物に接触させる工程と、
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを試験作用物質の非存在下で検出されたものと比較する工程と、
（ｄ）結合レベルを低減又は阻害する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［３］ＳＴＫ３１の機能的等価物がｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）結合ドメインを含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）の機能的等価物がＳＴＫ３１結合ドメインを含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［１］に記載の方法。
本発明に関して、ＳＴＫ３１、ｃ−ｒａｆ（配列番号６４）、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）ポリペプチドの機能的等価物はそれぞれ、ＳＴＫ３１ポリペプチド（配列番号６）、又はｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ若しくはＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）に同等の生物活性を有するポリペプチドである（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物又は実施例１における（６）発現ベクターを参照されたい）。
ＥＰＨＡ７とＥＧＦＲとの結合を調整、例えば阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に既知の多くの方法を用いることができる。
スクリーニングに使用されるポリペプチドは、組換えポリペプチド若しくは天然源由来のタンパク質、又はその部分ペプチドであり得る。任意の上述の試験化合物をスクリーニングに使用することができる。
ＳＴＫ３１、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）ポリペプチド、又はその機能的等価物を用いて、例えばポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）、当業者に既知の多くの方法を用いることができる。かかるスクリーニングは、例えば免疫沈降、ウェスト−ウェスタンブロット法解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））、細胞を利用するツーハイブリッドシステム（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）、アフィニティクロマトグラフィ、及び表面プラズモン共鳴現象を利用するバイオセンサを用いて実施することができる（（ｉ）一般的なスクリーニング方法を参照されたい）。
上述の任意の試験化合物を使用することができる（（１）スクリーニングのための試験化合物を参照されたい）。
幾つかの実施形態において、この方法はさらに、候補化合物と、ＳＴＫ３１タンパク質、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）との結合を検出する工程、又はＳＴＫ３１タンパク質、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）タンパク質との結合レベルを検出する工程を含む。ＳＴＫ３１タンパク質及びｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）タンパク質を発現する細胞としては例えば、癌、例えば肺癌及び／又は食道癌から樹立される細胞株が挙げられ、かかる細胞は、これらの２つの遺伝子を発現していれば、本発明の上記のスクリーニングに使用することができる。代替的にこれらの２つの細胞を発現するように、細胞に、ＳＴＫ３１及びｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）の発現ベクターの両方又はいずれかをトランスフェクトすることができる。ＳＴＫ３１タンパク質と、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）タンパク質との結合は、抗ＳＴＫ３１抗体と抗ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）抗体とを使用して、免疫沈降アッセイによって検出することができる（図１２）。
（ｘ）指標としてＷＤＨＤ１のリン酸化レベルを用いるスクリーニング
さらに、本発明において、ＷＤＨＤ１タンパク質がリン酸化によって修飾されたことが確認された。またＷＤＨＤ１のリン酸化領域の１つが、ＡＫＴキナーゼに対するコンセンサスリン酸化部位（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１４４３１）（Ｒ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｓ３７４、ｒｅｆ．３３）を有する。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達は、細胞増殖及び生存に重要である。そして、ＬＹ２９４００２を用いたＰＩ３Ｋ活性の阻害は、総ＷＤＨＤ１とリン酸化ＷＤＨＤ１との発現レベルを低減した（図１６Ｃ）。この結果は、ＷＤＨＤ１がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の構成要素の１つであり、リン酸化によって安定化されることを示している。さらに、ＷＤＨＤ１発現の阻害は、細胞成長の阻害に関与し、その結果アポトーシスを誘導させた（図１５Ｃ）。このため、ＷＤＨＤ１タンパク質のリン酸化を阻害する化合物は、指標としてかかる修飾を用いてスクリーニングして、ＷＤＨＤ１を発現する癌細胞の成長を阻害又は低減するのに有用であり得るか、癌細胞にアポトーシスを誘導するのに有用であり得るか、又はＷＤＨＤ１を発現する癌を治療又は予防するのに有用であり得る。癌は、肺癌、例えば非小細胞肺癌及び／又は小細胞肺癌、又は食道癌であり得る。したがって本発明は、ＷＤＨＤ１タンパク質のリン酸化を阻害する化合物をスクリーニングする方法も提供する。さらに本発明は、ＷＤＨＤ１を発現する癌細胞の成長を阻害又は低減する化合物と、ＷＤＨＤ１を発現する癌細胞にアポトーシスを誘導する化合物とをスクリーニングする方法も提供する。この方法は特に、ＷＤＨＤ１を発現する癌を治療又は阻害する際に使用することができる作用物質をスクリーニングするのに適している。癌は、肺癌、例えば非小細胞肺癌若しくは小細胞肺癌、又は食道癌である。
特に本発明は、以下の［１］〜［２］の方法を提供する：
［１］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を、ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞に接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の上記ポリペプチドをリン酸化させる条件下で培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の上記ポリペプチドのホスホセリン又はホスホチロシンレベルを検出する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で検出されたリン酸化レベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程と、
（ｅ）リン酸化レベルを阻害又は低減する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］ＷＤＨＤ１のホスホセリンがＳ３７４である、［１］に記載の方法。
［４］試験作用物質が、ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物と結合する、［１］に記載の方法。
［５］作用物質が、ＷＤＨＤ１の部位でＡＫＴのリン酸化活性を阻害又は低減する、［１］に記載の方法。
本明細書で、ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物を発現すれば、任意の細胞を使用することができる（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。本発明のスクリーニングに使用する細胞は、ＷＤＨＤ１ポリペプチドを自然状態で発現する細胞、例えば肺癌、食道癌及び睾丸に由来する細胞及びこれらで樹立された細胞株であり得る。肺癌細胞及び／又は食道癌細胞の細胞株、例えばＬＣ３１９、ＴＥ９等を利用することができる。
代替的に、スクリーニングに使用する細胞は、ＷＤＨＤ１ポリペプチドを自然状態では発現せず、且つＷＤＨＤ１ポリペプチド発現ベクター又はＷＤＨＤ１機能的等価物発現ベクターをトランスフェクトした細胞であり得る。このような組換え細胞は、上述のように、既知の遺伝子組換え法（例えばMorrison DA., J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology（eds. Wu et al.） 1983, 101: 347-62）によって得ることができる（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。
上述の試験化合物のいずれかを本発明のスクリーニングに使用することができる。幾つかの実施形態では、細胞に浸透させることができる化合物が選択される。代替的に、試験化合物がポリペプチドである場合、本発明のスクリーニングにおける細胞と試験作用物質との接触は、試験作用物質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで細胞を形質転換すること、及び細胞において試験作用物質を発現することによって実施することができる。
本発明において、上述のように、ＷＤＨＤ１タンパク質の生物活性としてはリン酸化活性が挙げられる。当業者は、上述のようにリン酸化レベルを推測することができる（（２）一般的なスクリーニング方法を参照されたい）。
本方法で検出される生物活性が細胞増殖である場合、これは、例えば本発明のポリペプチドを発現する細胞を調製すること、試験化合物の存在下で細胞を培養すること、及び細胞増殖速度を求めること、細胞周期を測定すること等、並びに実施例に記載されるようにコロニー形成能を測定することによって検出することができる。
（ｘｉ）指標として、ＣＤＣＡ５とＣＤＣ２との相互作用、又はＣＤＣＡ５とＥＲＫとの相互作用を用いるスクリーニング
本発明において、ＣＤＣＡ５ポリペプチドがＣＤＣ２ポリペプチド及びＥＲＫポリペプチドと相互作用し、またＣＤＣＡ５ポリペプチドが、ＣＤＣ２ポリペプチド及びＥＲＫポリペプチドによってリン酸化されることが確認された（図２）。さらに、ＣＤＣＡ５ポリペプチドは、アミノ酸残基６８〜８２（Ｓ／Ｔ−Ｐ−ｘ−Ｒ／Ｋ）でＣＤＣ２に対するコンセンサスリン酸化モチーフを有し、配列番号２のセリン−７５はリン酸化された領域又は部位である（図１）。ＣＤＣＡ５ポリペプチドは、アミノ酸残基７６〜８６及びアミノ酸残基１０９〜１２２（ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ）でＥＲＫに対するコンセンサスリン酸化モチーフを有し、配列番号２のセリン−７９及びスレオニン−１１５はリン酸化された領域又は部位である（図１）。これらのデータは、ＣＤＣＡ５ポリペプチドがＥＲＫポリペプチド及びＣＤＣ２ポリペプチドによってリン酸化されたという結論に一致している。
ＥＲＫ遺伝子によってコードされるタンパク質は、複数の生化学的シグナルに対する統合点として機能し、且つ様々な細胞過程、例えば増殖、分化、転写調節及び発生に関与するＭＡＰキナーゼファミリータンパク質の成員である。ＭＡＰＫカスケードは、基質をリン酸化することによって様々な細胞外シグナルを統合及び処理し、このことがそれらの触媒活性と立体構造とを変えるか、又はタンパク質−タンパク質相互作用に関する結合部位を作製する。
他方で、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、触媒性キナーゼサブユニットと調節サイクリンサブユニットとから成るヘテロ二量体複合体であり、細胞周期の進行及び転写調節におけるそれらの役割に基づき、２つの群に分けられたファミリーを含む。ＣＤＣ２／ＣＤＫ１（ＣＤＣ２−サイクリンＢ錯体）は、第１の群の成員であり、順番通りのＧ２期からＭ期への移行に必要である。最近になって、ＣＤＣ２が有糸分裂チェックポイントの活性化中の細胞生存に関与していることが分かった（O'Connor DS, et al. Cancer Cell. 2002 Jul;2（1）:43-54.）。
これにより、これらのデータは、ＥＲＫ及びＣＤＣ２によるＣＤＣＡ５のリン酸化が、腫瘍の悪性度を増大させる癌細胞周期の進行を促進することを示した。要するに、これらのデータは、ＣＤＣＡ５がＭＡＰＫ経路又はＣＤＫ経路によってそのリン酸化を通して肺癌及び食道癌の成長を促進することを明らかにした。
特に本発明は、以下の［１］〜［１４］の方法を提供する：
［１］ＣＤＣＡ５ポリペプチドと、ＣＤＣ２ポリペプチドとの間の相互作用又は結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下で、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）のポリペプチドを接触させる工程と、
（ｉ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物、及び
（ｉｉ）ＣＤＣ２又はその機能的等価物
（ｂ）ポリペプチド間の相互作用又は結合のレベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出されたレベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）上記レベルを低減又は阻害する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］作用物質がＣＤＣＡ５を発現する癌を治療又は予防するのに有用である、［１］に記載の方法。
［３］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［２］に記載の方法。
［４］肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、［３］に記載の方法。
［５］試験作用物質がＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物と結合する、［１］に記載の方法。
［６］ＣＤＣＡ５の機能的等価物がＣＤＣ２相互作用ドメインを含む、［１］に記載の方法。
［７］ＣＤＣ２の機能的等価物がＣＤＣＡ５相互作用ドメインを含む、［１］に記載の方法。
［８］ＣＤＣＡ５ポリペプチドと、ＥＲＫポリペプチドとの間の相互作用又は結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）のポリペプチドを接触させる工程と、
（ｉ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物、及び
（ｉｉ）ＥＲＫポリペプチド又はその機能的等価物
（ｂ）ポリペプチド間の相互作用又は結合のレベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出されたレベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）上記レベルを低減又は阻害する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［９］作用物質がＣＤＣＡ５を発現する癌を治療又は予防するのに有用である、［８］に記載の方法。
［１０］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［９］に記載の方法。
［１１］肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、［１０］に記載の方法。
［１２］試験作用物質がＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物と結合する、［８］に記載の方法。
［１３］ＣＤＣＡ５の機能的等価物がＣＤＣ２相互作用ドメインを含む、［８］に記載の方法。
［１４］ＣＤＣ２の機能的等価物がＣＤＣＡ５相互作用ドメインを含む、［８］に記載の方法。
本発明に関して、ＣＤＣＡ５ポリペプチド、ＣＤＣ２ポリペプチド又はＥＲＫポリペプチドの機能的等価物は、ＣＤＣＡ５ポリペプチド（配列番号２）、ＣＤＣ２ポリペプチド（配列番号４８）又はＥＲＫポリペプチド（配列番号５０）と同等の生物活性を有するポリペプチドである（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。
ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチドとの結合、又はＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチドとの結合を調整、例えば阻害する化合物をスクリーニングする方法として、機能的等価物は結合活性を保持する。ＣＤＣＡ５ポリペプチドの機能的等価物は、ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣＡ２結合領域又はＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ結合領域を含有し得る。ＣＤＣ２ポリペプチドの機能的等価物は、ＣＤＣ２ポリペプチドのＣＤＣＡ５結合領域を含有し得る。また、ＥＲＫポリペプチドの機能的等価物は、ＥＲＫポリペプチドのＣＤＣＡ５結合領域を含有し得る。
当業者に知られている、ポリペプチド間の相互作用又は結合のレベルを検出する多くの方法を用いることができる。スクリーニングに使用されるポリペプチドは、組換えポリペプチド若しくは天然源由来のタンパク質、又はその部分ペプチドであり得る。
上述の任意の試験化合物をスクリーニングに使用することができる（定義における（１）スクリーニングのための試験化合物を参照されたい）。例えば、試験作用物質は、ＣＤＣＡ５ポリペプチドに対する抗体、ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２結合領域に対する抗体、若しくはＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ結合領域に対する抗体であり得るか、又は試験作用物質は、ドミナントネガティブ（dominant negative）として作用する、ＣＤＣＡ５ポリペプチド、ＣＤＣ２ポリペプチド若しくはＥＲＫポリペプチドの部分ペプチド、例えばＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２結合領域、ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ結合領域、ＣＤＣ２ポリペプチドのＣＤＣＡ５結合領域、若しくはＥＲＫポリペプチドのＣＤＣＡ５結合領域であり得る。
例えば、ＣＤＣＡ５ポリペプチド、ＣＤＣ２ポリペプチド、ＥＲＫポリペプチド又はその機能的等価物を用いて、ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）、当業者に既知の多くの方法を用いることができる。かかるスクリーニングは、例えば免疫沈降、ウェスト−ウェスタンブロット法解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））、細胞を利用するツーハイブリッドシステム（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）、アフィニティクロマトグラフィ、及び表面プラズモン共鳴現象を利用するバイオセンサを用いて実施することができる（（ｉ）一般的なスクリーニング方法を参照されたい）。
任意の上述の試験化合物を使用することができる（（１）スクリーニングのための試験化合物を参照されたい）。
幾つかの実施形態において、この方法はさらに、候補化合物と、ＣＤＣＡ５ポリペプチド、ＣＤＣ２ポリペプチド若しくはＥＲＫポリペプチドとの結合を検出する工程、又はこれらの遺伝子を発現する細胞においてＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチドとの結合レベル、若しくはＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチドとの結合レベルを検出する工程を含む。これらの遺伝子を発現する細胞としては例えば、癌、例えばＣＸ遺伝子の過剰発現から生じる、又はＣＸ遺伝子によって媒介される癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）から樹立された細胞株が挙げられ、かかる細胞は、これらの遺伝子を発現していれば、本発明の上記のスクリーニングに使用することができる。代替的にこれらの遺伝子を発現するように、細胞に、ＣＤＣＡ５及びＣＤＣ２、又はＣＤＣＡ５及びＥＲＫの発現ベクターの両方又はいずれかをトランスフェクトすることができる。ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチドとの結合、又はＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチドとの結合は、抗ＣＤＣＡ５抗体と抗ＣＤＣ２抗体と抗ＥＲＫ抗体とを使用して、免疫沈降アッセイによって検出することができる。
（ｘ）指標としてＣＤＣＡ５のリン酸化を用いるスクリーニング
本発明の別の態様によれば、ＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性のリン酸化又はＣＤＣＡ５のＥＲＫ媒介性のリン酸化を阻害又は低減する作用物質は、ＣＤＣＡ５を発現する癌細胞、例えばＣＸ遺伝子の過剰発現から生じる、又はＣＸ遺伝子によって媒介される癌（例えば肺癌細胞又は食道癌細胞）由来の細胞の周期の進行を阻害又は低減するのに使用することができ、且つＣＤＣＡ５を発現する癌（例えば肺癌又は食道癌）を治療又は予防するのに使用することができ、またこれは指標として、ＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性のリン酸化レベル又はＣＤＣＡ５のＥＲＫ媒介性のリン酸化レベルを用いてスクリーニングされる。
特に本発明は、以下の［１］〜［１４］の方法を提供する：
［１］ＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性のリン酸化を調整する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下で、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）のポリペプチドを接触させる工程と、
（ｉ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物、及び
（ｉｉ）ＣＤＣ２ポリペプチド又はその機能的等価物
（ｂ）（ａ）（ｉ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出されたリン酸化レベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程と、
（ｄ）阻害剤としてリン酸化レベルを阻害又は低減する試験作用物質を選択する工程、又は促進剤としてリン酸化レベルを促進する又は高める試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］試験作用物質がＣＤＣＡ５を発現する癌を予防又は治療するのに有用である、［１］に記載の方法。
［３］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［２］に記載の方法。
［４］肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、［３］に記載の方法。
［５］試験作用物質がＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物と結合する、［１］に記載の方法。
［６］ＣＤＣＡ５ポリペプチドの機能的等価物がＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２媒介性のリン酸化部位を少なくとも１つ含む、［１］に記載の方法。
［７］ＣＤＣ２媒介性のリン酸化部位が、配列番号２（ＣＤＣＡ５）のセリン−２１、セリン−７５又はスレオニン−１５９である、［６］に記載の方法。
［８］ＣＤＣＡ５のＥＲＫ媒介性のリン酸化を調整する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下で、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）のポリペプチドを接触させる工程と、
（ｉ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物、及び
（ｉｉ）ＥＲＫポリペプチド又はその機能的等価物
（ｂ）（ａ）（ｉ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で検出されたリン酸化レベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程と、
（ｄ）阻害剤としてリン酸化レベルを阻害又は低減する試験作用物質を選択する工程、又は促進剤としてリン酸化レベルを促進する又は高める試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［９］作用物質がＣＤＣＡ５を発現する癌を予防又は治療するのに有用である、［８］に記載の方法。
［１０］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［９］に記載の方法。
［１１］肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、［１０］に記載の方法。
［１２］試験作用物質がＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物と結合する、［８］に記載の方法。
［１３］ＣＤＣＡ５ポリペプチドの機能的等価物がＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ媒介性のリン酸化部位を少なくとも１つ含む、［８］に記載の方法。
［１４］ＥＲＫ媒介性のリン酸化部位が、配列番号２（ＣＤＣＡ５）のセリン−２１、スレオニン−４８、セリン−７５、セリン−７９、スレオニン−１１１、スレオニン−１１５、スレオニン−１５８、又はスレオニン−２０９である、［１３］に記載の方法。
別の実施形態において、本発明は、以下の［１］〜［９］の方法を提供する：
［１］癌を予防又は治療するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を、ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞に接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の上記ポリペプチドをリン酸化させる条件下で培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の上記ポリペプチドのリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で検出されたリン酸化レベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程と、
（ｅ）リン酸化レベルを阻害又は低減する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］作用物質がＣＤＣＡ５を発現する癌を予防又は治療するのに有用である、［１］に記載の方法。
［３］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［２］に記載の方法。
［４］肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、［３］に記載の方法。
［５］作用物質がＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性のリン酸化活性を阻害又は低減する、［１］に記載の方法。
［６］作用物質がＣＤＣＡ５のＥＲＫ媒介性のリン酸化を阻害又は低減する、［１］に記載の方法。
［７］リン酸化レベルがホスホセリンレベル又はホスホスレオニンレベルである、［１］に記載の方法。
［８］ＣＤＣＡ５のホスホセリンが、配列番号２（ＣＤＣＡ５）のセリン−２１、セリン−７５、セリン−７９又はセリン−２０９である、［６］に記載の方法。
［９］ＣＤＣＡ５のホスホスレオニンが、配列番号２（ＣＤＣＡ５）のスレオニン−４８、スレオニン−１１１、スレオニン−１１５又はスレオニン−１５９である、［５］に記載の方法。
本発明に関して、ＣＤＣＡ５ポリペプチド、ＣＤＣ２ポリペプチド又はＥＲＫポリペプチドの機能的等価物は、ＣＤＣＡ５ポリペプチド、ＣＤＣ２ポリペプチド又はＥＲＫポリペプチドと同等の生物活性を有するポリペプチドである（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。上述の方法では、生物活性は相互作用、例えばＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２媒介性のリン酸化又はＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ媒介性のリン酸化である。
好適には、本発明のスクリーニングに使用するＣＤＣＡ５ポリペプチドの機能的等価物は、ＣＤＣＡ２結合領域、ＥＲＫ結合領域及び／又は少なくとも１つのリン酸化部位、例えばアミノ酸残基６８〜８２（Ｓ／Ｔ−Ｐ−ｘ−Ｒ／Ｋ）でのＣＤＣ２に対するコンセンサスリン酸化モチーフ（ここで配列番号２のセリン−７５がリン酸化されている）、アミノ酸残基７６〜８６（ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ）でのＥＲＫに対するコンセンサスリン酸化モチーフ（ここで配列番号２のセリン−７９がリン酸化されている）及び／又はアミノ酸残基１０９〜１２２（ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ）でのＥＲＫに対するコンセンサスリン酸化モチーフ（ここで配列番号２のスレオニン−１１５がリン酸化されている）を含有し、好適には本発明のスクリーニングに使用するＣＤＣ２ペプチドの機能的等価物は、ＣＤＣＡ５結合領域及び／又はセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ触媒ドメイン、例えば配列番号４８（ＣＤＣ２）のアミノ酸残基４〜２８７を含有し、また好適には本発明のスクリーニングに使用するＥＲＫペプチドの機能的等価物は、ＣＤＣＡ５結合領域及び／又はタンパク質キナーゼドメイン、例えば配列番号５０（ＥＲＫ）のアミノ酸残基７２〜３６９を含有する（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。
本明細書で、ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物を発現すれば、任意の細胞を使用することができる（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。本発明のスクリーニングに使用する細胞は、ＣＤＣＡ５ポリペプチドを自然状態で発現する細胞、例えば肺癌、食道癌及び睾丸に由来する細胞及びこれらで樹立された細胞株であり得る。肺癌細胞及び／又は食道癌細胞の細胞株、例えばＡ５４９、ＬＣ３１９等を利用することができる。
代替的に、スクリーニングに使用する細胞は、ＣＤＣＡ５ポリペプチドを自然状態では発現せず、且つＣＤＣＡ５ポリペプチド発現ベクター又はＣＤＣＡ５機能的等価物発現ベクターをトランスフェクトした細胞であり得る。このような組換え細胞は、上述のように、既知の遺伝子組換え法（例えばMorrison DA., J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology（eds. Wu et al.） 1983, 101: 347-62）によって得ることができる（定義における（１）癌関連遺伝子及び癌関連タンパク質、並びにその機能的等価物を参照されたい）。
上述の試験化合物のいずれかを本発明のスクリーニングに使用することができる。幾つかの実施形態では、細胞に浸透させることができる化合物が選択される。代替的に、試験化合物がポリペプチドである場合、本発明のスクリーニングにおける細胞と試験作用物質との接触は、試験作用物質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで細胞を形質転換すること、及び細胞において試験作用物質を発現することによって実施することができる。
本発明において、上述のように、ＣＤＣＡ５タンパク質の生物活性としてはリン酸化活性が挙げられる。当業者は、上述のようにリン酸化レベルを推測することができる（（ｉｉ）一般的なスクリーニング方法を参照されたい）。
本方法で検出される生物活性が細胞周期促進である場合、これは、例えば本発明のポリペプチドを発現する細胞を調製すること、試験化合物の存在下で細胞を培養すること、及び細胞増殖速度を求めること、細胞周期を測定すること等、並びに実施例に記載されるようにコロニー形成能を測定すること又はＦＡＣＳ解析によって検出することができる。
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）により一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先される。
これらの実施形態において、ＣＤＣＡ５ポリペプチドをリン酸化させる条件は、ＣＤＣＡ５ポリペプチド及びＡＴＰをリン酸化させるために、ＣＤＣ２ポリペプチドをＣＤＣＡ５ポリペプチド又はＥＲＫポリペプチドとインキュベートすることによって与えられ得る（実施例１における（１４）ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを参照されたい）。さらに本発明では、ＣＤＣＡ５ポリペプチドのリン酸化活性を高める物質は、スクリーニングの反応混合物に添加することができる。ＣＤＣＡ５ポリペプチドのリン酸化が物質の添加によって高まる場合、リン酸化レベルをより高感度で求めることができる。
ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物、ＣＤＣ２ポリペプチド、ＥＲＫポリペプチド、その機能的等価物と、試験作用物質との接触は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングは、バッファーがＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物のリン酸化を阻害しなければ、バッファー、例えばこれらに限定されないが、リン酸バッファー及びＴｒｉｓバッファー中で行うことができる。
本発明では、基質のリン酸化レベルを当該技術分野で既知の方法によって求めることができる（（２）一般的なスクリーニング方法を参照されたい）。他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）により一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先される。
単離化合物及び医薬組成物
上記のスクリーニングによって単離された化合物は、本発明のＣＸポリペプチドの活性を阻害する薬剤に対する候補物質であり、ＣＸ遺伝子の過剰発現から生じる、又はＣＸ遺伝子によって媒介される癌、例えば肺癌及び／又は食道癌の治療における用途を見出す。より具体的には、指標としてＣＸタンパク質の生物活性を用いる場合、本方法によってスクリーニングされる化合物は、ＣＸ遺伝子を発現する癌、例えば肺癌及び／又は食道癌の治療のための薬剤に対する候補物質として有用である。例えば本発明は、癌細胞の成長を阻害又は低減する組成物、癌細胞にアポトーシスを誘導する化合物、癌細胞の成長を阻害又は低減する組成物及び癌を治療又は予防する化合物を提供し、該組成物は、
（ａ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物の発現レベルを阻害すること、
（ｂ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物を発現する細胞の増殖活性を阻害すること、
（ｃ）ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物を発現する細胞にアポトーシスを誘導すること、
（ｄ）ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物を発現する細胞の浸潤活性を阻害すること、
（ｅ）ＥＰＨＡ７ポリペプチドとＥＧＦＲポリペプチド（又はその機能的等価物）との結合活性を阻害すること、
（ｆ）ＥＰＨＡ７及びＳＴＫ３１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物のキナーゼ活性を阻害すること、並びに
（ｇ）ＷＤＨＤ１タンパク質又はその機能的等価物のリン酸化レベルを阻害すること、
（ｈ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物を発現する細胞の細胞周期を阻害すること、並びに
（ｉ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチド（又はその機能的等価物）との相互作用又は結合を阻害すること、
（ｊ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチド（又はその機能的等価物）との相互作用又は結合を阻害すること、
（ｋ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物のリン酸化レベルを阻害することから成る群から選択される機能を少なくとも１つ有する阻害剤を薬学的に有効な量含む。
癌を治療又は予防する候補化合物の有効性は、癌の治療剤を同定するための二次的な及び／又はさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、ＣＤＣＡ５ポリペプチドの発現を阻害する化合物が癌の活性、例えば細胞成長又は浸潤を阻害する場合、かかる化合物がＣＤＣＡ５特異的な治療効果を有すると結論付けることができる。
化合物の「薬学的に有効な量」は、個体において癌を治療及び／又は緩和するのに十分な量である。薬学的に有効な量の例としては、動物に投与すると、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１の発現又は生物活性を低減するのに必要な量が挙げられる。その低減は例えば、発現の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％変化であり得る。
ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１遺伝子から成る群から選択されるいずれか１つの遺伝子の発現を阻害するこのような活性成分（ａ）〜（ｋ）は、上記のように、遺伝子に対する阻害オリゴヌクレオチド（例えばアンチセンス−オリゴヌクレオチド、二本鎖分子又はリボザイム）、又は誘導体、例えばアンチセンス−オリゴヌクレオチド、二本鎖分子若しくはリボザイムの発現ベクターでもあり得る（（３）二本鎖分子を参照されたい）。代替的に、活性成分（ｅ）〜（ｆ）は例えば、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＥＧＦＲ、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１のドミナントネガティブ突然変異体であり得る。さらに、ＥＰＨＡ７のアンタゴニストは、ＥＰＨＡ７とＥＧＦＲとの結合を阻害する活性成分として使用することができる。さらに、ＣＤＣＡ５のアンタゴニストは、ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチドとの結合、又はＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチドとの結合を阻害する活性成分として使用することができる。代替的に、かかる活性成分は、上記のようにスクリーニング方法によって選択することができる。（スクリーニング方法を参照されたい）。
その上、ＣＸタンパク質の１つの活性を阻害する化合物の構造の一部が付加、欠失及び／又は置換によって変換される化合物も、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる化合物に含まれる。
本方法のいずれかによって単離される作用物質は、調合薬として投与することができるか、又はＣＸ遺伝子を発現する癌、例えば肺癌及び／又は食道癌を治療又は予防するための、ヒト及び他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ及びチンパンジーに対する薬学的（治療的又は予防的）組成物の製造に使用することができる。本方法によってスクリーニングされる作用物質によって治療又は予防される例示的な癌としては、ＣＸ遺伝子（複数可）を過剰発現する、又はＣＸ遺伝子（複数可）の非制御機能によって媒介される癌、例えば肺癌（例えば非小細胞肺癌又は小細胞肺癌）、食道癌等が挙げられる。
単離作用物質は、直接投与することができるか、又は既知の薬学的調製法を用いて剤形態に配合することができる。医薬製剤としては、経口、直腸、鼻腔、局所（口腔及び舌下を含む）、膣若しくは非経口（筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に、又は吸入若しくは通気（insufflation）による投与に好適なものが挙げられ得る。例えば、必要に応じて、作用物質を経口で、糖衣錠、カプセル、エリキシル及びマイクロカプセルとして、又は非経口で水若しくは任意の他の薬学的に許容可能な液体と共に滅菌溶液又は懸濁液の注射形態で摂取することができる。例えば、作用物質は、一般的に許容される薬剤の実現（drug implementation）に要求される単位用量形態で、薬学的に許容可能な担体又は媒体、特に滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、香味剤、賦形剤、ビヒクル、保存料、結合剤等と混合することができる。これらの製剤における活性成分の量によって、指定範囲内の好適な投与量が達成可能となる。
「薬学的に許容可能な担体」という語句は、薬剤のための希釈剤又はビヒクルとして使用される不活性物質を表す。
錠剤及びカプセルと混合することができる添加剤の例は、結合剤、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム及びアラビアゴム；賦形剤、例えば結晶セルロース；膨張剤、例えばコーンスターチ、ゼラチン及びアルギン酸；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；甘味料、例えばスクロース、ラクトース又はサッカリン；香味剤、例えばペパーミント、アカモノ（Gaultheria adenothrix）オイル及びチェリーである。さらにその単位投与形態がカプセルである場合、液体担体、例えばオイルも上記成分にさらに含まれ得る。注射のための滅菌合成物は、ビヒクル、例えば注射に使用される蒸留水を用いて、通常の薬剤の実現に従って配合することができる。
生理食塩水、グルコース及び他の等張液（アジュバント（adjuvants：補助剤）、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール及び塩酸ナトリウムを含む）を注射のための水溶液として使用することができる。これらは、好適な可溶化剤、例えばアルコール、特にエタノール、多価アルコール、例えばプロピレングリコール及びポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０（商標）及びＨＣＯ−５０と併用して使用することができる。
ゴマ油又はダイズ油は、油性液体としてとして使用することができ、可溶化剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと併用して使用することができ、且つバッファ、例えばリン酸バッファ及び酢酸ナトリウムバッファ；鎮痛剤、例えば塩酸プロカイン；安定化剤、例えばベンジルアルコール、フェノール；並びに抗酸化剤と共に配合することができる。調製された注射液は好適なアンプルに充填することができる。
経口投与に好適な薬学的製剤は便宜的に、それぞれ所定の量の活性成分を含有する別個のユニット、例えばカプセル、カシェ若しくは錠剤として；粉末若しくは顆粒として；又は溶液、懸濁液若しくはエマルションとして提示することができる。活性成分は、ボーラス舐剤又はペーストとしても提示することができ、純粋形態であり、即ち担体を有しなくてもよい。経口投与のための錠剤及びカプセルは、従来の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、滑剤、崩壊剤又は湿潤剤を含有し得る。錠剤は、任意で１つ又は複数の製剤成分と共に圧縮又は成形することによって製造することができる。圧縮錠は、好適な機械において、任意で結合剤、滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、界面活性剤又は分散剤と混合した自由流形態、例えば粉末又は顆粒で活性成分を圧縮することによって調製することができる。成形錠は、好適な機械において、不活性化希釈液で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することによって作製することができる。錠剤を当該技術分野で既知の方法に従ってコーティングすることができる。経口液体製剤は例えば、水性若しくは油性懸濁液、溶液、エマルション、シロップ、若しくはエリキシルの形態であり得るか、又は使用前に水若しくは他の好適なビヒクルと共に構成させるために乾燥生成物として提示され得る。かかる液体製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）又は保存料を含有し得る。任意で錠剤は、その中で活性成分の徐放又は制御放出を与えるように配合することができる。
非経口投与のための製剤としては、製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする、抗酸化剤、バッファ、静菌薬及び溶質を含有し得る、水性及び非水性の滅菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る、水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量又は複数用量の容器、例えば封止アンプル及びバイアル中に提示され、使用の直前に滅菌液体担体、例えば生理食塩水、注射用水を添加することだけが要求される、フリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保存することができる。代替的に製剤は、連続注入のために提示することができる。即席の注射溶液及び懸濁液を、これまでに記載した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
直腸投与のための製剤は、通常の担体、例えばココアバター又はポリエチレングリコールを有する坐剤として提示することができる。口腔、例えば頬又は舌下における局所投与のための製剤としては、香味基剤、例えばスクロース及びアカシアに活性成分を含むロゼンジ、トラガカント、並びに基剤、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアに活性成分を含むトローチが挙げられる。鼻内投与のために、本発明で得られる化合物を噴霧液若しくは分散粉末として、又はドロップ形態で使用することができる。ドロップは、１つ又は複数の分散剤、可溶化剤又は懸濁剤も含む、水性又は非水性の基剤と共に配合することができる。噴霧液は加圧パックから送達されることが便利である。
吸入による投与のために、化合物は吸入器、ネブライザ、加圧パック又は他の噴霧エアロゾルを送達する他の便利な手段から送達されることが便利である。加圧パックは、好適な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適な気体を含み得る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は定量送達する弁を設けることによって求めることができる。
代替的に、吸入又は通気による投与のために、化合物は、乾燥粉末組成物、例えば化合物と、好適な粉末基剤（例えばラクトース又はデンプン）との粉末混合物の形態を取り得る。粉末組成物は、粉末を吸入器又は通気器（insufflator）を用いて投与することができる、単位投与形態、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチン又はブリスターパックで提示することができる。
所望の場合には、活性成分の持続放出を与えるように適合させた上記の製剤を利用することができる。医薬組成物は、他の活性成分、例えば抗菌剤、免疫抑制剤又は保存料も含有し得る。
例示的な単位投与製剤は、以下で列挙されるように、有効な用量又は適切な割合の活性成分を含有するものである。
例えば、動脈内、静脈内、経皮注射として、また鼻内、経気管支、筋肉内又は経口投与として、患者に本発明の薬学的化合物を投与するために、当業者に既知の方法を用いることができる。投与の用量及び方法は、患者の体重及び年齢並びに投与方法によって変わるが、通常当業者はこれらを選択することができる。該化合物がＤＮＡによってコード可能である場合、ＤＮＡは、遺伝子療法のためのベクター、及びこの療法を実施するのに投与されたベクターに挿入することができる。投与の用量及び方法は、患者の体重、年齢及び症状によって変わるが、当業者はこれらを好適に選択することができる。
例えば、症状によって幾らかの違いがあるが、本発明のポリペプチドと結合し、その活性を調節する化合物の用量は、通常の成人（体重６０ｋｇ）に経口投与する場合、１日当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、例えば１日当たり約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ、例えば１日当たり約１．０ｍｇ〜約２０ｍｇである。
非経口投与の場合、通常の成人（体重６０ｋｇ）への注射液において、患者、標的器官、症状及び投与方法によって幾らかの違いがあるが、１日当たり約０．０１ｍｇ〜約３０ｍｇ、例えば１日当たり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ、例えば１日当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量を静脈注射するのが好都合である。また、他の動物の場合でも、体重６０ｋｇに変換した量を投与することが可能である。
作用物質を経口又は注射（静脈内又は皮下）で投与することができ、被検体の年齢及び性別、治療する正確な障害、並びにその重症度を含む多くの要因を考慮して、主治医の責任の下、被検体に投与される正確な量が求められる。また、投与経路は症状及びその重症度に応じて変わり得る。
その上、本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体を使用して、ＣＸ遺伝子を発現する癌、例えば肺癌及び／又は食道癌を治療又は予防する方法を提供する。この方法に従って、本発明のポリペプチドに対する薬学的に有効な量の抗体を投与する。癌細胞においてＣＸタンパク質の発現が上方制御され、これらのタンパク質の発現の抑制が細胞増殖活性の低減をもたらすので、抗体とこれらのタンパク質との結合によって、肺癌及び／又は食道癌を治療又は予防することができることが期待される。したがって、本発明のポリペプチドに対する抗体を、本発明のタンパク質の活性を低減するのに十分な用量（これは１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇである）で投与することができる。成人の用量範囲は一般的に約５ｍｇ／日〜約１７．５ｇ／日、例えば約５ｍｇ／日〜約１０ｇ／日、例えば約１００ｍｇ／日〜約３ｇ／日である。
一般的に、１つ又は複数のＣＸタンパク質阻害剤の有効量又は効果的な量は、初めに低用量又は低量のＣＸタンパク質阻害剤を投与した後、毒性副作用がごくわずかであるか又は全くなく、肺癌及び／又は食道癌の阻害又は予防の所望の効果が治療被検体で観察されるまで、投与用量（dose or dosage）を徐々に増やす、及び／又は必要であれば第２のＣＸタンパク質阻害剤を添加することによって求められる。本発明の医薬組成物の投与のために適当な用量及び投与スケジュールを求めるのに適用可能な方法は例えば、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, et al., Eds., McGraw-Hill（2006）及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia（USIP）, Lippincott Williams & Wilkins（2005）（その両方が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
さらに本方法によってスクリーニングされる作用物質は、被検体においてＣＸ遺伝子を発現する癌、例えば肺癌及び／又は食道癌を治療又は予防するのに使用することができる。投与は、ＣＸタンパク質の異常なリン酸化活性に関連した障害である危険性がある（この障害の疑いがある）又はこの障害を有する被検体に対して、予防的又は治療的であり得る。この方法は、肺癌細胞及び／又は食道癌細胞においてＣＸタンパク質の機能を低減することを含む。この機能は、本発明のスクリーニング方法によって得られる作用物質の投与によって阻害され得る。
本明細書で、「予防する（preventing）」という用語は、腫瘍の形成を遅らせる若しくは抑制させるために、又は癌の少なくとも１つの臨床症状を遅らせる、抑制若しくは緩和させるために作用物質が予防的に投与されることを意味する。被検体における腫瘍の状態の判定は、標準的な臨床プロトコルを用いて為され得る。
代替的に、腫瘍細胞に特異的な細胞表面マーカーと結合する抗体は、薬剤送達のためのツールとして使用することができる。例えば、細胞毒性物質と結合する抗体を、腫瘍細胞を損傷させるのに十分な用量で投与する。
スクリーニングキット：
本発明は、癌、特に乳癌、膀胱癌又は肺癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングするための材料を含有する、製品又はキットも提供する。かかる製品は、使用のための取扱説明書と共に本明細書で記載された材料の１つ又は複数の標識容器を含み得る。好適な容器としては例えば、ボトル、バイアル及び試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックで作られ得る。
［１］ＥＰＨＡ７ポリペプチドとＥＧＦＲポリペプチドとの結合を妨げる作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＥＰＨＡ７ポリペプチドのＥＧＦＲ結合ドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）ＥＧＦＲポリペプチドのＥＰＨＡ７結合ドメインを含むポリペプチドと、
（ｃ）ポリペプチド間の相互作用又は結合を検出する手段とを含む、キット。
幾つかの実施形態において、（ａ）のポリペプチド、即ちＥＧＦＲ結合ドメインを含むポリペプチドはＥＰＨＡ７ポリペプチドを含む。同様に、他の実施形態では、（ｂ）のポリペプチド、即ちＥＰＨＡ７結合ドメインを含むポリペプチドはＥＧＦＲポリペプチドを含む。
［２］ＥＧＦＲのＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化を調整する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＥＰＨＡ７ポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｂ）ＥＧＦＲポリペプチドのＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化部位を含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｃ）（ｂ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
幾つかの実施形態において、（ａ）のポリペプチド、即ちＥＧＦＲポリペプチドの機能的等価物はポリペプチドのＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化部位を少なくとも１つ含む。また、ＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化部位はＥＧＦＲポリペプチドのＴｙｒ８４５である。
［３］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＳＴＫ３１ポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）基質と、
（ｃ）（ｂ）の基質のリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
幾つかの実施形態において、基質はＢＭＰである。
［４］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞と、
（ｃ）（ａ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
幾つかの実施形態において、本発明のスクリーニングのためのポリペプチドは生細胞で発現される。
［５］ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチドとの相互作用又は結合を妨げる作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２相互作用ドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＣ２ポリペプチドのＣＤＣＡ５相互作用ドメインを含むポリペプチドと、
（ｃ）ポリペプチド間の相互作用又は結合を検出する手段とを含む、キット。
［６］ＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性のリン酸化を調整する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２媒介性のリン酸化部位を含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｃ）（ｂ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［７］ＣＤＣＡ５を発現する癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｂ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２媒介性のリン酸化部位を含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｃ）（ｂ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［８］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞と、
（ｃ）（ａ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［９］ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチドとの相互作用又は結合を妨げる作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ相互作用ドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）ＥＲＫポリペプチドのＣＤＣＡ５相互作用ドメインを含むポリペプチドと、
（ｃ）ポリペプチド間の相互作用又は結合を検出する手段とを含む、キット。
［１０］ＣＤＣＡ５のＥＲＫ媒介性のリン酸化を調整する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＥＲＫポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ媒介性のリン酸化部位を含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｃ）（ｂ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［１１］ＣＤＣＡ５を発現する癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＥＲＫポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｂ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ媒介性のリン酸化部位を含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｃ）（ｂ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［１２］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞と、
（ｃ）（ａ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
本発明はさらに、本明細書で記載の病的状態を治療するのに有用な材料を含有する、製品及びキットを提供する。かかる製品は、ラベルと共に、本明細書で記載の薬物の容器を含み得る。上述のように、好適な容器としては例えば、ボトル、バイアル及び試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成され得る。本発明に関して、容器は、細胞増殖性疾患、例えば肺癌又は食道癌を治療するのに効果的な活性剤を有する組成物を保持する。組成物中の活性剤は、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＰＨＡ７／ＥＧＦＲ、ＣＤＣＡ５／ＣＤＣ２又はＣＤＣＡ５／ＥＲＫの結び付きを破壊すること、ＥＧＦＲのＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化を阻害すること、ＳＴＫ３１キナーゼ活性を阻害すること、又はＷＤＨＤ１若しくはＣＤＣＡ５のリン酸化を阻害することが可能な、同定された試験化合物（例えば抗体、低分子）であり得る。容器上のラベルは、組成物が異常な細胞増殖を特徴とする１つ又は複数の状態を治療するのに用いられることを示し得る。ラベルは、投与及びモニタリング技法、例えば本明細書で記載のものに対する方向性も示し得る。
上記の容器に加えて、本発明のキットは任意で、薬学的に許容可能な希釈剤を収容する第２の容器を含み得る。本発明のキットはさらに、使用のための取扱説明書と共に、最終使用者の商業的視点から所望の他の材料（他のバッファー、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ及びパッケージ挿入物を含む）を含み得る。
所望であれば、活性成分を含有する単位投与形態を１つ又は複数含有し得るパック又はディスペンサ装置内で組成物を提示することができる。パックは例えば、金属又はプラスチックのホイル、例えばブリスターパックを含み得る。パック又はディスペンサ装置は、投与のための取扱説明書を伴っていてもよい。相溶性薬学的担体で配合された本発明の作用物質を含む組成物を調製し、適当な容器に入れ、また指定状態の治療のためにラベルを付すこともできる。
以下で実施例を参照して、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の材料、方法及び実施例は、本発明の態様の説明にすぎず、決して本発明の範囲の限定を意図しない。このようにして、本明細書で記載のものと同様の又は同等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができる。
本発明は以下の実施例においてさらに記載されるが、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
（１）細胞株及び臨床試料
この試験で使用される２３個のヒト肺癌細胞株としては、９個の腺癌（ＡＤＣ；Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＰＣ−３、ＰＣ−９、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ１６６６及びＮＣＩ−Ｈ１７８１）と、９個の扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ；ＥＢＣ−１、ＬＵ６１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ２２６及びＮＣＩ−Ｈ６４７）と、１個の大細胞癌（ＬＣＣ；ＬＸ１）と、４つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ；ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３及びＳＢＣ−５）とが挙げられる。この試験で使用されるヒト食道癌細胞株は以下の通りであった：９個のＳＣＣ細胞株（ＴＥ１、ＴＥ２、ＴＥ３、ＴＥ４、ＴＥ５、ＴＥ６、ＴＥ８、ＴＥ９及びＴＥ１０）及び１つの腺癌（ＡＤＣ）細胞株（ＴＥ７）（Nishihira T, et al., J Cancer Res Clin Oncol 1993; 119: 441-49）。
全ての細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した適当な培地中で単層で成長させ、５％ＣＯ２で加湿空気雰囲気下で３７℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）をCambrex Bio Science Inc.（Walkersville, MD）から購入した最適化培地（ＳＡＧＭ）中で成長させた。初代の肺癌及びＥＳＣＣ試料は、インフォームドコンセントにより早期に取得した（Kikuchi T, et al., Oncogene 2003;22: 2192-205、Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006;29: 567-75、Yamabuki T, et al., Int J Oncol 2006;28: 1375-84）。
国際対癌連合のＴＮＭ分類に従って臨床病期を求めた（Sobin L & Wittekind Ch. TNM Classification of Malignant Tumours, 6th edition. New York: Wiley-Liss; 2002）。組織マイクロアレイでの免疫染色のために、ホルマリン固定した初代ＮＳＣＬＣ（ＥＰＨＡ７では総数４０２症例、ＳＴＫ３１では総数３６８症例、ＷＤＨＤ１では総数２６４症例）及び付近の正常な肺組織試料も、手術を受けた患者から得た。ホルマリン固定した初代ＥＳＣＣ（ＥＰＨＡ７では総数２９２症例、ＷＤＨＤ１では総数２９７症例）及び付近の正常な食道組織試料も、根治的外科手術を受けた患者から得た。ＥＰＨＡ７では、根治的外科手術を受けた患者から２７個のＳＣＬＣ試料を得た。この試験及び全ての臨床材料の使用は、特定の（individual）施設内倫理委員会によって承認された。
（２）血清試料
血清試料は、インフォームドコンセントに署名して、１２７人の健常な対照個人（１００人の男性及び２７人の女性、３１歳〜６１歳の範囲で年齢の中央値が５３歳）、及び日本のオーダーメイド医療実現化プロジェクト（BioBank Japan）の一部として登録された又は広島大学病院に入院した、８９人の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である非腫瘍性肺疾患患者（７８人の男性及び１１人の女性、５４歳〜８４歳の範囲で年齢の中央値が６８歳）から得た。これらの患者は全て、現在及び／又は以前に喫煙者であった（生涯喫煙量（pack-year index）（ＰＹＩ）の平均［±１ＳＤ］が７１．９±４５．４であった。ＰＹＩは、１日で消費したタバコ箱数［１パック２０本］に喫煙年数を乗算した数として規定された）。
血清試料は、インフォームドコンセントに署名して、広島大学病院及び神奈川県立がんセンター病院に入院した２１４人の肺癌患者、並びにBioBank Japanに登録した１２９人の肺癌患者（２２９人の男性及び１１４人の女性、３０歳〜８９歳の範囲で年齢の中央値が６８歳±１０．８歳（ＳＤ））からも得た。これらの３４３症例には、２０５の肺ＡＤＣ、５９のＳＣＣ及び７９のＳＣＬＣが含まれていた。また血清試料は、インフォームドコンセントに署名して、恵佑会札幌病院に入院しているか又はBioBank Japanに登録した９６人のＥＳＣＣ患者（７９人の男性及び１７人の女性、３７歳〜７４歳の範囲で年齢の中央値が６３歳）、及びBioBank Japanに登録した１０２人の子宮頸癌患者（１０２人の女性、４０歳〜５５歳の範囲で年齢の中央値が４６歳）からも得た。
以下の基準に基づき、試験のために試料を選択した：（ａ）患者は、新たに診断され、これまでに治療しておらず、（ｂ）患者の腫瘍を肺癌として病理的に診断した（段階Ｉ−ＩＶ）。診断時に血清を得て、−１５０℃で保存した。
（３）半定量ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD）を使用して培養細胞から抽出した。抽出ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（株式会社ニッポンジーン、日本、東京）で処理し、オリゴ（ｄＴ）プライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩとを用いて逆転写した。増幅のためのプライマー組は以下の通りであった：
ＡＣＴＢでは、ＡＣＴＢ−Ｆ：５’−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３’（配列番号９）及び
ＡＣＴＢ−Ｒ：５’−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３’（配列番号１０）
ＣＤＣＡ５では、ＣＤＣＡ５−Ｆ：５’−ＣＧＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴ−３’（配列番号１１）及び
ＣＤＣＡ５−Ｒ：５’−ＧＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴ−３’（配列番号１２）、
ＥＰＨＡ７では、ＥＰＨＡ７−Ｆ：５’−ＧＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＣＡＡＧ−３’（配列番号１３）及び
ＥＰＨＡ７−Ｒ：５’−ＣＡＧＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴ−３’（配列番号１４）、
ＳＴＫ３１では、ＳＴＫ３１−Ｆ：５’−ＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＡＴ−３’（配列番号１５）及び
ＳＴＫ３１−Ｒ：５’−ＣＡＡＴＧＡＧＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡ−３’（配列番号１６）、
ＷＤＨＤ１では、ＷＤＨＤ１−Ｆ：５’−ＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号１７）及び
ＷＤＨＤ１−Ｒ：５’−ＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＴＣＣＣＴＡＧＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号１８）。
ＰＣＲ反応は、増幅の対数増殖期内での産物強度を確実にするために、サイクル数で最適化させた。
（４）ノーザンブロット解析
ヒト多重組織ブロット（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、結腸、白血球、胃、甲状腺、脊髄、リンパ節、気管、副腎、骨髄を含む２３個の正常組織、BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）をＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１の［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識ＰＣＲ産物とハイブリサイズさせた。部分長ｃＤＮＡを以下のようなプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによって調製した：
ＣＤＣＡ５では、ＣＤＣＡ５−Ｆ：５’−ＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＴＣＣＴＣＧＧＡＡＡＧＴＴ−３’（配列番号１９）及び
ＣＤＣＡ５−Ｒ：５’−ＡＴＣＴＣＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴ−３’（配列番号２０）、
ＥＰＨＡ７では、ＥＰＨＡ７−Ｆ：５’−ＧＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＣＡＡＧ−３’（配列番号１３）及び
ＥＰＨＡ７−Ｒ：５’−ＣＡＧＡＴＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴ−３’（配列番号１４）、
ＳＴＫ３１では、ＳＴＫ３１−Ｆ：５’−ＧＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号２１）及び
ＳＴＫ３１−Ｒ：５’−ＣＡＡＴＧＡＧＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡ−３’（配列番号１６）（５１６ｂｐ）、
ＷＤＨＤ１では、ＷＤＨＤ１−Ｆ：５’−ＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＡＡＡＧＣＣＧＡＡＧ−３’（配列番号２２）及び
ＷＤＨＤ１−Ｒ：５’−ＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＴＣＣＣＴＡＧＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号１８）（５３５ｂｐ）。
供給業者の推奨に従って、前ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄を実施した。増感ＢＡＳスクリーン（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を用いて、ＣＤＣＡ５では−８０℃で７日間、ＥＰＨＡ７では−８０℃で２週間、ＳＴＫ３１では室温で３０時間、又はＷＤＨＤ１では−８０℃で７日間、プロットのオートラジオグラフィを行った。
（５）ウェスタンブロット法
腫瘍組織又は腫瘍細胞を溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸Ｎａ、０．１％ ＳＤＳ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA））中で溶解した。それぞれの溶解物のタンパク質含量は、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて、Bio-Radのタンパク質アッセイ（Hercules, CA）によって求めた。それぞれの溶解物１０μｇを１０％〜１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で（３％ポリアクリルアミドスタッキングゲルと共に）分解させ、ニトロセルロース膜（GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ）に電気泳動で移動させた。ＳＴＫ３１では、ＴＢＳＴ中の５％脱脂粉乳でブロッキングした後、膜を室温で１時間、一次抗体とインキュベートした。ＷＤＨＤ１では、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中のＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本製薬株式会社（Dainippon Seiyaku：現大日本住友製薬株式会社）、日本、大阪）でブロッキングした後、−４℃で一晩、膜を一次抗体とインキュベートした。免疫反応性タンパク質を室温で１時間、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（GE Healthcare Bio-sciences）とインキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄後、反応物を増強化学発光キット（GE Healthcare Bio-sciences）を用いて現像した。
この試験で使用される市販の抗体は以下の通りであった：
ヒトＥＰＨＡ７のＮ末端部分由来のエピトープ（複数可）に対するウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ２５４５９、Santa Cruz, Santa Cruz, CA）、
ヒトＥＰＨＡ７のＣ末端部分由来のエピトープ（複数可）に対するウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ａｂ５４１１、Abcam）、
ヒトＳＴＫ３１に対するウサギポリクローナル抗体（ABGENT, San Diego, CA）、及び
ヒトＷＤＨＤ１に対するウサギポリクローナル抗体（ATLAS Antibodies AB（Stockholm, Sweden））。
ＥＰＨＡ７シグナル伝達によってリン酸化され、細胞増殖シグナル伝達を活性化させる、基質及び／又は下流の標的タンパク質を同定するために、本発明者らは、ＥＰＨＡ７発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞溶解物と、癌細胞シグナル伝達に関連したリンタンパク質に特異的な一連の抗体とを用いて、ＥＰＨＡ７に対するキナーゼ基質の免疫ブロットスクリーニングを実施した（表２を参照されたい）。
（表２）癌細胞シグナル伝達に関連したリンタンパク質に特異的な一連の抗体リスト
Figure 2010536367
Figure 2010536367
（６）発現ベクター
ＣＤＣＡ５（配列番号１の７４〜８２９ｎｔ）又はＥＰＨＡ７（配列番号３の２１４〜３２１０ｎｔ）又はＷＤＨＤ１（配列番号５の７９〜３４６８ｎｔ）の全コード配列をｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓプラスミドベクター（invitrogen）の適当な部位にクローニングした。ＳＴＫ３１（配列番号７の４６７〜３４５７ｎｔ）の全コード配列をｐＣＡＧＧＳｎ３ＦＣベクターの適当な部位にクローニングした。
ｃ−Ｍｙｃタグ付きＣＤＣＡ５（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＣＤＣＡ５）、ｃ−Ｍｙｃタグ付きＥＰＨＡ７（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＥＰＨＡ７）、ｃ−Ｍｙｃタグ付きＷＤＨＤ１（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＷＤＨＤ１）又はＦＬＡＧタグ付きＳＴＫ３１（ｐＣＡＧＧＳｎ３ＦＣ−ＳＴＫ３１）又はモックベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ又はｐＣＡＧＧＳｎ３ＦＣ）を、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Roche）を用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。
（７）免疫細胞化学解析
培養細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、室温で３０分間、４％ホルムアルデヒド溶液中に固定した後、室温で３分間、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ（−）で浸透可能にさせた。非特異的な結合は、ＣＤＣＡ５及びＷＤＨＤ１では室温で１０分間、Ｃａｓｂｌｏｃｋ（ZYMED, San Francisco, CA）によって、ＥＰＨＡ７では室温で７分間、Ｃａｓｂｌｏｃｋ（ZYMED, San Francisco, CA）によって、ＳＴＫ３１では室温で７分間、ＰＢＳ（−）中の３％ウシ血清アルブミンによってブロッキングした。それから細胞を室温で６０分間（ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７又はＳＴＫ３１では）又は１０分間（ＷＤＨＤ１では）、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈した一次抗体とインキュベートした。ＰＢＳ（−）で洗浄した後、細胞を、室温で６０分間、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８と結合したロバ抗ウサギ二次抗体（Molecular Probes）（ＣＤＣＡ５及びＥＰＨＡ７では）又はＦＩＴＣ結合二次抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）（ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１では）によって染色した。ＰＢＳ（−）でさらに洗浄した後、それぞれの生検材料は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を備え、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴＳＣ ＳＰ２ ＡＯＢＳ、Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）で視覚化した。
この試験で一次抗体として使用される市販の抗体は以下の通りであった：
外因性ＣＤＣＡ５では、ウサギポリクローナル抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、
ヒトＥＰＨＡ７のＮ末端部分由来のエピトープ（複数可）では、ウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ２５４５９、Santa Cruz, Santa Cruz, CA）、
ヒトＥＰＨＡ７のＣ−末端部分由来のエピトープ（複数可）では、ウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ａｂ５４１１、Abcam）、
ＳＴＫ３１では、ヒトＳＴＫ３１に対するウサギポリクローナル抗体（ABGENT, San Diego, CA）、及び
ＷＤＨＤ１ではウサギポリクローナル抗ＷＤＨＤ１抗体（ATLAS Antibodies AB）。
（８）免疫組織化学及び組織マイクロアレイの解析
組織切片を、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋ Ｋｉｔ／ＨＲＰ（DakoCytomation, Glostrup, Denmark）を用いて染色組織切片にした。内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後、一次抗体を加え、それぞれの切片を、二次抗体としてＨＲＰ標識化抗ウサギＩｇＧ（ヒストファインシンプルステインＭＡＸ ＰＯ（Ｇ）、株式会社ニチレイバイオサイエンス、日本、東京）とインキュベートした。基質−色原体を加え、生検材料をヘマトキシリンで対比染色した（counterstained）。腫瘍組織マイクロアレイを、ホルマリン固定ＮＳＣＬＣ（Chin SF, et al., Mol Pathol. 2003 Oct;56（5）: 275-9、Callagy G, et al., Diagn Mol Pathol. 2003 Mar;12（1）: 27-34; J Pathol. 2005 Feb;205（3）:388-96）を用いて、これまでに公開されたように構築した。サンプリングのための組織領域を、スライド上の対応するＨＥ染色切片との視覚化アラインメントに基づき選択した。ドナー−腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ又は５つの組織芯（直径０．６ｍｍ、高さ３ｍｍ〜４ｍｍ）を、組織マイクロアレイ（Beecher Instruments, Sun Prairie, WI）を用いてレシピエントのパラフィンブロックに入れた。それぞれの症例由来の正常な組織芯に穴を開けて、得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を免疫組織化学解析に使用した。染色の陽性は、臨床病理学的データと臨床追跡調査データとの予備知識なく、３人の別々の研究者らによって半定量的に判定された。染色の強度は、以下の基準を用いて評価した：
陽性（１＋）、腫瘍細胞の核及び細胞質における相当の茶色染色；
陰性（０）、腫瘍細胞における微量の（no appreciable）染色。
評価人（reviewer）が別々に症例を強度に陽性と規定する場合のみ、症例は強度に陽性であるとして認められた。
この試験で一次抗体として使用される市販の抗体は以下の通りであった：
ヒトＥＰＨＡ７のＮ末端部分由来のエピトープ（複数可）では、ウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ２５４５９、Santa Cruz, Santa Cruz, CA）；
ＳＴＫ３１では、ヒトＳＴＫ３１に対するウサギポリクローナル 抗体（ABGENT, San Diego, CA）；及び
ＷＤＨＤ１では、ウサギポリクローナル抗ＷＤＨＤ１抗体（ATLAS Antibodies AB）。
（９）統計解析
統計解析をＳｔａｔ Ｖｉｅｗ統計プログラム（SaS, Cary, NC, USA）を用いて実施した。本発明者らは、ＮＳＣＬＣ患者又はＥＳＣＣ患者におけるＣＸ遺伝子発現と臨床病理学的変数との関連性を解析するのに分割表を用いた。腫瘍特異的な生存曲線を、手術日からＮＳＣＬＣ又はＥＳＣＣ関連死の時点又は最後の追跡調査観察まで算出した。カプラン−マイヤー曲線をそれぞれの関連変数及びＣＸ遺伝子発現に関して算出し、患者亜群間の生存時間の違いを、ログランク検定を用いて解析した。単変量解析及び多変量解析を、臨床病理学的変数と、ＣＸ死亡率との間の関連性を求めるのにＣｏｘ比例ハザード回帰モデルによって実施した。初めに、本発明者らは、致死と、年齢、性別、喫煙歴、組織型、ｐＴ分類及びｐＮ分類を含む予後因子（或る時点で１つの因子を考慮する）との間の関連性を解析した。次に、０．０５未満のＰ値の開始レベル（entry level）を満たした任意の及び全ての変数と併せて、常にＣＸ遺伝子発現をモデルとした後方（backward）（段階的）手法に多変量Ｃｏｘ解析を適用した。このモデルが因子を付加し続けたので、独立因子の終了レベル（exit level）はＰ＜０．０５を超えなかった。
（１０）ＥＬＩＳＡ
独創的に構築したＥＬＩＳＡシステムでＥＰＨＡ７の血清レベルを測定した。まず初めに、ヒトＥＰＨＡ７のＮ末端部分に特異的なウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ２５４５９、Santa Cruz, Santa Cruz, CA）を、捕捉抗体として９６ウェルマイクロプレート（Apogent, Denmark）に加え、室温で２時間インキュベートした。いかなる非結合抗体も洗い流した後、５％ ＢＳＡをウェルに加え、ブロッキングのために４℃で１６時間インキュベートした。洗浄後、３倍希釈血清を捕捉抗体で前コーティングした９６ウェルマイクロプレートに加え、室温で２時間インキュベートした。いかなる非結合物質も洗い流した後、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（株式会社同仁化学研究所、日本、熊本）を使用して、ＥＰＨＡ７に特異的なビオチン化ポリクローナル抗体をウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄し、いかなる非結合抗体−酵素試薬も取り除いた後、ＨＲＰ−ストレプトアビジンをウェルに加え、２０分間インキュベートした。洗浄後、基質溶液（R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN）をウェルに加え、３０分間反応させた。２Ｎの硫酸１００μｌを添加することによって反応を停止させた。着色強度を、４５０ｎｍの波長、５７０ｎｍの参照波長で光度計によって求めた。血清中のＣＥＡのレベルは、供給業者の推奨に従って、市販の酵素試験キット（HOPE Laboratories, Belmont, CA）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。血清中のＰｒｏＧＲＰのレベルは、供給業者のプロトコルに従って、市販の酵素試験キット（株式会社テイエフビ、日本、東京）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。腫瘍群と健常な対照群との間のＥＰＨＡ７、ＣＥＡ及びＰｒｏＧＲＰのレベルにおける差異はマンホイットニーＵ検定によって解析した。最適な診断精度及び見込み比率を有するカットオフレベルを求めるために、ＥＰＨＡ７、ＣＥＡ及びＰｒｏＧＲＰのレベルを受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析によって評価した。ＥＰＨＡ７とＣＥＡ／ＰｒｏＧＲＰとの間の相関係数をスピアマンの順位相関係数を用いて算出した。有意差は、Ｐ＜０．０５として規定した。
（１１）ＲＮＡ干渉アッセイ
（ｉ）オリゴベースのアッセイ
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖（Dharmacon, Inc., Lafayette, CO）（６００ｐＭ）は、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen, Carlsbad, CA）３０μｌを使用して、ＣＤＣＡ５では肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株Ａ５４９、ＥＰＨＡ７では肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０及び肺癌細胞株ＳＢＣ−５、ＷＤＨＤ１では肺癌細胞株ＬＣ３１９、並びにＷＤＨＤ１では食道癌細胞株ＴＥ９にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養して、コロニーの数をギムザ染色によって計測し、トランスフェクションの７日後に、細胞の生存を、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ（細胞計測キット−８溶液、株式会社同仁化学研究所、日本、熊本）によって評価した。遺伝子発現の抑制を確認するために、半定量ＲＴ−ＰＣＲを上記の合成プライマーを用いて実施した。使用されるｓｉＲＮＡ配列は以下の通りであった：
対照−１（ｓｉ−ＬＵＣ：フォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis）由来のルシフェラーゼ遺伝子）：５’−ＮＮＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３’（配列番号２３）；
対照−２（ＣＮＴ：ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ＋ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非標的ｓｉＲＮＡプール）：５’−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ−３’（配列番号２４）、５’−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＵＧＡ−３’（配列番号２５）、５’−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＣＵＡ−３’（配列番号２６）及び５’−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡ−３’（配列番号２７）の混合物；
対照−３（Ｓｃｒａｍｂｌｅ／ＳＣＲ：５Ｓ及び１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする葉緑体ミドリムシ（Euglena gracilis）遺伝子）：５’−ＮＮＧＣＧＣＧＣＵＵＵＧＵＡＧＧＡＵＵＣＧ−３’（配列番号２８）；
対照−４（ＥＧＦＰ：増強緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、オワンクラゲ（Aequorea victoria）ＧＦＰの突然変異体）：５’-ＮＮＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＵＵＣＵＵＣ−３’（配列番号２９）
ｓｉ−ＣＤＣＡ５−＃１：５’−ＧＣＡＧＵＵＵＧＡＵＣＵＣＣＵＧＧＵＵＵ−３’（配列番号３０）；
ｓｉ−ＣＤＣＡ５−＃２：５’−ＧＣＣＡＧＡＧＡＣＵＵＧＧＡＡＡＵＧＵＵＵ−３’（配列番号３１）；
ｓｉ−ＥＰＨＡ７−＃１（Ｄ−００３１１９−０５）：５’−ＡＡＡＡＧＡＧＡＵＧＵＵＧＣＡＧＵＡ−３’（配列番号３２）；
ｓｉ−ＥＰＨＡ７−＃２（Ｄ−００３１１９−０８）：５’−ＵＡＧＣＡＡＡＧＣＵＧＡＣＣＡＡＧＡＡ−３’（配列番号３３）；
ｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃１（Ｄ−０１９７８０−０１）：５’−ＧＡＵＣＡＧＡＣＡＵＧＵＧＣＵＡＵＵＡＵＵ−３’（配列番号３４）；及び
ｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃２（Ｄ−０１９７８０−０２）：５’−ＧＧＵＡＡＵＡＣＧＵＧＧＡＣＵＣＣＵＡＵＵ−３’‘（配列番号３５）。
（ｉｉ）ベクターベースのアッセイ
本発明者らは、哺乳動物細胞において低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を合成するように設計されたベクターベースのＲＮＡｉシステム、ｐｓｉＨ１ＢＸ３．０を以前に確立している（Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov 1;63（21）: 7038-41）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen）３０μＬを用いて、ｓｉＲＮＡ発現ベクター１０μｇを肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７０にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適当な濃度のジェネテシン（Ｇ４１８）の存在下で７日間培養し、コロニーの数をギムザ染色によって計測し、Ｇ４１８処理の７日後に、細胞の生存を、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ（細胞計測キット−８溶液、株式会社同仁化学研究所、日本、熊本）によって評価した。ＳＴＫ３１タンパク質発現の抑制を確認するために、標準的なプロトコルに従って、ＳＴＫ３１に対してアフィニティ精製したポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロット法を実施した。ＲＮＡｉに対する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった：
対照１（増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、オワンクラゲＧＦＰの突然変異体）、５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号３６）；
対照２（ルシフェラーゼ／ＬＵＣ：フォチヌス・ピラリスルシフェラーゼ遺伝子）、５’−ＣＧＴＡＣＧＣＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＡ−３’（配列番号３７）；
ｓｉ−ＳＴＫ３１−＃１、５’−ＧＧＡＧＡＴＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴ−３’（配列番号３８）；及び
ｓｉ−ＳＴＫ３１−＃２、５’−ＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号４９）。
（１２）細胞成長アッセイ
ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付きＥＰＨＡ７、ＦＬＡＧタグ付きＳＴＫ３１を発現するプラスミド又はモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、適当な濃度のジェネテシン（Ｇ４１８）の存在下で、１０％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で８日間成長させた。細胞の生存をＭＴＴアッセイで評価した。要約すると、細胞計測キット−８溶液（株式会社同仁化学研究所）を１／１０の体積濃度でそれぞれのディッシュ（dish）に加え、プレートをさらに２時間３７℃でインキュベートした。それからＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ５５０（BIO-RAD, Hercules, CA）を用いて、参照として４９０ｎｍ及び６３０ｎｍで吸光を測定した。
ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Roche）を使用して、ｃ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付きＣＤＣＡ５発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｃ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ−ＣＤＣＡ５）又はモックベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｃ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ）をＣＯＳ−７細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌのネオマイシンを含有する培養培地（ジェネテシン、Invitrogen）中でインキュベートした。７日後に、細胞の生存をＭＴＴアッセイで評価した。
プライマー組（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＴＣＧ−３’（配列番号６５）及び５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＴＴＧＡＡＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＴＡＡ−３’（配列番号６６））を用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅されたＥＰＨＡ７の全コード配列を、ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓプラスミドベクター（invitrogen）の適当な部位にクローニングした。ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付きＥＰＨＡ７を発現するプラスミド又はモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、適当な濃度のジェネテシン（Ｇ４１８）の存在下で、１０％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で８日間成長させた。細胞の生存をＭＴＴアッセイで評価した。要約すると、細胞計測キット−８溶液（株式会社同仁化学研究所）を１／１０の体積濃度でそれぞれのディッシュに添加し、プレートをさらに２時間３７℃でインキュベートした。それからＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ５５０（BIO-RAD, Hercules, CA）を用いて、参照として４９０ｎｍ及び６３０ｎｍで吸光を測定した。
（１３）マトリゲル浸潤アッセイ
ＣＯＳ−７細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＥＰＨＡ７を発現するプラスミド又はモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトし、１０％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭにおいて集密状態（confluence）近くになるまで成長させた。細胞をトリプシン処理によって採取し、血清又はプロテイナーゼ阻害剤を添加せずにＤＭＥＭで洗浄して、５×１０５細胞数／ｍｌでＤＭＥＭ中で懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲル基質（Becton Dickinson Labware）の乾燥層を室温で２時間ＤＭＥＭによって再水和した。１０％ ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ（０．７５ｍｌ）を２４ウェルマトリゲル浸潤チャンバにおけるそれぞれの下部チャンバに加え、細胞懸濁液の０．５ｍｌ（２．５×１０５個の細胞）を上部チャンバのそれぞれの挿入部（insert）に加えた。挿入部のプレートを３７℃で２２時間インキュベートした。インキュベート後、チャンバを処理し、供給業者（Becton Dickinson Labware）の指示通りにマトリゲルを通って浸潤する細胞を固定化し、ギムザで染色した。
（１４）ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ
本発明者らは、全長組換えＳＴＫ３１タンパク質（Invitrogen）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施した。要約すると、ＳＴＫ３１タンパク質０．５μｇをキナーゼバッファー（２５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／５０μｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２／５ｍｍｏｌ／ＬのＮａＦ／１０ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ／２０μｍｏｌ／ＬのＡＴＰ）３０μｌ中でインキュベートした後、５μＣｉの［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（GE Healthcare）を添加した。基質のために、本発明者らは反応溶液中でＭＢＰ １０μｇを添加した。３０℃での３０分のインキュベーションの後、ＳＤＳ試料バッファーを添加することで反応を停止させた。煮沸後に、タンパク質試料を１５％ゲル（Bio-Rad Laboratories）上で電気泳動し、それからオートラジオグラフィを行った。また、組換えＳＴＫ３１は、３０℃で３０分のインキュベーションのために、反応溶液中でＣＯＳ−７細胞から調製された全抽出物とインキュベートし、ＳＤＳ試料バッファーを添加することで反応を停止させた。煮沸後、タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、それからウェスタンブロット法を行った。
また、全長組換えＧＳＴ−ＣＤＣＡ５（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅで切断されたｐＧＥＸ−６ｐ−１／ＣＤＣＡ５）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施した。要約すると、ＧＳＴ−ＣＤＣＡ５、Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１（Upstate）、ＭＢＰ又はＧＳＴそれぞれ１．０μｇを、３０℃で２０分間、１μＣｉの［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（GE Healthcare）と２単位のＣＤＣ２（BioLabs）又はＥＲＫ２（Upstate）５０ｎｇとを添加した、２０μｌのキナーゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、０．０１％ Ｂｒｉｊｉ ３５、１ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．５、２５℃）中でインキュベートした。最終容量３０μｌまでＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳ試料バッファーを用いて反応を停止させ、試料の半分を５％〜１５％勾配ゲル（Bio-Rad Laboratories）上で電気泳動にかけ、オートラジオグラフィによってリン酸化を視覚化した。ＭＢＰをＥＲＫ基質として、及びＨ１をＣＤＣ２基質として使用した（陽性対照）。ＧＳＴは陰性対照基質として有用であった。
野生型又は突然変異型のＷＤＨＤ１タンパク質の免疫沈降体を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイをさらに実施した。野生型又は突然変異型のＷＤＨＤ１タンパク質の免疫沈降体は、プロテアーゼ阻害剤と、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＦと、５ｎｍｏｌ／ＬのミクロシスチンＬＲと、５０μｍｏｌ／ＬのＡＴＰとの混合物を添加したキナーゼバッファー［２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、２ｍｍｏｌ／ＬのＭｎＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌのフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ］中で、組換えＡＫＴ１（ＡＫＴ１、Invitrogen, Carlsbad, CA）とインキュベートした（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１４４３１、配列番号６０）。０．２体積の５×タンパク質試料バッファを添加することで、反応を停止させ、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
（１５）フローサイトメトリー
細胞をＰＢＳ中で採取し、７０％冷エタノール中で３０分間固定した。１００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ（Sigma/Aldrich, St. Louis, MO）で処理した後、細胞を、ＰＢＳ中の５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Sigma/Aldrich, St.）で染色した。フローサイトメトリーをＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎで実施し、ＭｏｄＦｉｔソフトウェア（Verity Software House, Inc., Topsham, ME）によって解析した。少なくとも２００００個の非ゲート（ungated）細胞から選択される細胞のＤＮＡ含量を解析した。
（１６）細胞周期進行中のＷＤＨＤ１発現の解析
５×１０５細胞数／１００ｍｍディッシュの密度のＬＣ３１９細胞を、Ｇ０／Ｇ１期で、２４時間、１％ＦＢＳと、４μｇ／ｍｌのアフィジコリン（Sigma/Aldrich, St. Louis, MO）とを含有するＲＰＭＩ１６４０に同期させ、アフィジコリンの除去によってＧ１期停止から開放させた。それから、アフィジコリンの除去の０時間、４時間及び９時間後に細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリー解析及びウェスタンブロット解析のために採取した。５×１０５細胞数／１００ｍｍディッシュの密度のＡ５４９細胞を、Ｇ０／Ｇ１期で、１８時間、１％ＦＢＳと、１μｇ／ｍｌのアフィジコリン（Sigma/Aldrich, St. Louis, MO）とを含有するＲＰＭＩ１６４０に同期させ、アフィジコリンの除去によってＧ１期停止から開放させた。それから、アフィジコリンの除去の０時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び１０時間後に細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリー解析及びウェスタンブロット解析のために採取した。
（１７）生細胞画像化
３５ｍｍガラス底ディッシュ上、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するフェノールレッド無含有ダルベッコ変性イーグル培地中で細胞を成長させた。細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、対物レンズ（オリンパス株式会社、ＵＡＰＯ ４０×／３４０ Ｎ．Ａ．＝０．９０）、ハロゲンランプ、赤色ＬＥＤ（６２０ｎｍ）、ＣＣＤカメラ（オリンパス株式会社、ＤＰ３０）、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）光学部品及び干渉フィルタを搭載したコンピュータ支援蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社、ＬＣＶ１００）を使用して、低速度撮影による画像化を行った。ＤＩＣ画像化のために、分析器を含有するフィルタキューブによって、赤色ＬＥＤを使用した。画像の獲得及び解析は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ６．１３ソフトウェア（Universal Imaging, Media, PA）を用いることによって行った。
（１８）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル解析
ＣＤＣＡ５組換えタンパク質を、３７℃で３．５時間、ＥＲＫ又はＣＤＣ２とインキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。電気泳動後、ゲルをＲ−２５０（Bio-Rad）によって染色した。以前に記載されたように、ＣＤＣＡ５に対応する特定バンドをトリプシンで消化し（Kato T., et al. Clin Cancer Res 2008; 14:2363-70）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量スペクトル分析法（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ、株式会社島津製作所（バイオテック）、日本、京都）による解析に用いた。質量スペクトルデータを、Ｍａｓｃｏｔサーチエンジン（http://www.matrixscience.com）を用いて評価し、一次配列データベースからタンパク質を同定した。
（１９）有糸分裂での細胞同期化及びＥＧＦ刺激アッセイ
培養されたＡ５４９及びＬＣ３１９肺癌細胞及び頸部扁平上皮癌Ｈｅｌａ細胞を、１６時間のインキュベーションの間、２μｇ／ｍｌのアフィジコリンによって、Ｇ１／Ｓ期で同期させた。有糸分裂同期のために、細胞を０時間で、Ｇ１／Ｓ期から開放させた。ノコダゾールを５時間目に添加し、有糸分裂が止まるのを防いだ。この時点で、ＣＤＣ２阻害剤又はＰＢＳを細胞培養液に添加した。ＥＧＦ模擬（simulation）アッセイのために、Ｈｅｌａ細胞を２０時間、ＦＢＳ無含有培地中で培養した。それから、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（Promega）を用いて又は用いずに、３０分間、５０μｇ／ｍｌのＥＧＦによって細胞を刺激した。
（２０）ＥＰＨＡ７関連タンパク質の同定
ＥＰＨＡ７を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＥＰＨＡ７）又は空ベクター（対照としてｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ）をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞（５×１０６）を、プロテイナーゼ（EMD, San Diego, CA）及びホスファターゼ（EMD）に対する阻害剤の存在下で、１ｍＬの溶解バッファ（０．５％ ＮＰ４０、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ）中でインキュベートした。プロテイナーゼ阻害剤の存在下で、最終容量が１．２ｍＬの免疫沈降バッファ（０．５％ ＮＰ４０、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ）中で、６０μＬのプロテインＧ−アガロースビーズ（Invitrogen）と４℃で１時間、インキュベートすることによって、細胞抽出物をプレ精製した（precleared）。４℃で１分間、１５００ｒｐｍの遠心分離の後、上清を４℃で２時間、抗ｃ−ｍｙｃアガロース（Sigma）とインキュベートした。３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって、それぞれの試料からビーズを回収し、１ｍＬの免疫沈降バッファーで６回洗浄した後、ビーズを３０μＬのＬａｅｍｍｌｉ試料バッファー中で再懸濁し、５分間煮沸した後、タンパク質を５％〜１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Bio-Rad）上で分離した。電気泳動後、ゲルを銀で染色した。ＥＰＨＡ７トランスフェクト抽出物で特異的に見出されたタンパク質バンドは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量スペクトル分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲプラス、株式会社島津製作所（バイオテック）、日本、京都）による解析に用いるために切り取られた。ＥＰＨＡ７とＭＥＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００２４５）との相互作用を確認するために、本発明者らは免疫沈降実験を実施した。ＦＬＡＧタグ付きＭＥＴを達成するために、本発明者らは、全コード配列をクローニングし、これはプライマー組（５’−ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧ−３’（配列番号６７）及び５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧ−３’（配列番号６８））を用いたＲＴ−ＰＣＲによって、ｐＣＡＧＧＳｎ−３Ｆｃプラスミドベクターの適当な部位に増幅された。ｐＣＣＡＧＧＳｎ−３Ｆｃ−ＭＥＴ及びｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＥｐｈＡ７をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞由来の抽出物を抗ｃ−Ｍｙｃ−アガロースによって免疫沈降した。抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Sigma-Aldrich）を用いて免疫ブロット法を実施した。さらに確認するために、本発明者らはまた、抗ｃ−ｍｙｃポリクローナル抗体（Santa-Cruz）を用いて免疫ブロット法を実施した後、抗Ｆｌａｇアガロースを用いて同じ抽出物の免疫沈降を行った。ＥＰＨＡ７とＥＧＦＲとの相互作用を確認するために、本発明者らは、全コード配列をｐＣＡＧＧＳｎ−３Ｆｃプラスミドベクターの適当な部位にクローニングした。ｐＣＣＡＧＧＳｎ−３Ｆｃ−ＥＧＦＲ及びｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＥｐｈＡ７をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞由来の抽出物を免疫沈降し、ＭＥＴと同じ方法で免疫ブロット法を実施した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＰＨＡ７キナーゼアッセイ
活性のある組換えＥＰＨＡ７（カルナバイオサイエンス株式会社、日本、神戸）、ＥＧＦＲ（Millipore, Billerica, MA）、ＭＥＴ（Millipore）、ＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８（EMD）、及びＭＥＴ阻害剤ＳＵ１１２７４は市販のものを購入した。本発明者らは、そのＮ末端にＧＳＴタグ付きエピトープを含有していたＥＧＦＲ（＃１：コドン６９２〜８９１、＃２：コドン８８９〜１０４５、＃３：コドン１０４６〜１１８６）の部分断片を発現するプラスミドを構築し、これはｐＧＥＸベクター（GE Healthcare Bio-sciences）を用いて調製した。組換えペプチドを大腸菌、ＢＬ２１コドン＋株（Stratagene, La Jolla, CA）で発現し、供給業者のプロトコルに従ってＴＡＬＯＮ樹脂（BD Biosciences Clontech）を用いて精製した。精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で抽出した。ＥＧＦＲ又はＭＥＴの自己リン酸化を防ぐために、本発明者らは事前に、ＡＧ１４７８又はＳＵ１１２７４の最小阻害濃度を求め、これらの阻害剤がかかる濃度でＥＰＨＡ７の自己リン酸化を阻害しないことを確認した。基質としてＥＧＦＲを用いたＥＰＨＡ７キナーゼアッセイは、以下の反応混合物を含んでいた：２０ｎｇのＥＰＨＡ７タンパク質、５０ｎｇのＥＧＦＲタンパク質（１ｍＭのＡＧ１４７８を有する活性組換えタンパク質［ＥＧＦＲ阻害剤、上記を参照されたい］又は阻害剤を有しない部分不活性ＥＧＦＲ断片）、５０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＮａＦ及び０．１μＬのプロテアーゼ阻害剤。その後に３μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（GE Healthcare Bio-sciences）を含有する１ｍＭのＡＴＰの添加が続いた。３０℃での３０分のインキュベーションの後、ＳＤＳ試料バッファーを添加することによって、反応を停止させた。煮沸後、タンパク質試料を５％〜１５％の勾配ゲル（Bio-Rad）上で電気泳動し、それからシグナルをＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（Bio-Rad）によって視覚化した。基質としてＭＥＴを用いるＥＰＨＡ７キナーゼアッセイでは、本発明者らは、ＥＧＦＲ及びＡＧ１４７８の代わりに、５０ｎｇのＭＥＴと１２．５μＭのＳＵ１１２７４（ＭＥＴ阻害剤、上記を参照されたい）を用いて、上述のＥＰＨＡ７−ＥＧＦＲキナーゼ反応と同じプロトコルを採用した。キナーゼ反応におけるチロシンリン酸化タンパク質の存在を求めるために、本発明者らは、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含有していなかった１ｍＭのＡＴＰを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施し、抗パン−ホスホチロシン抗体（Invitrogen）を用いてリン酸化タンパク質を検出した。
ＥＰＨＡ７の下流のシグナル伝達経路の同定
ＥＧＦＲ／ＭＥＴに関連した活性化シグナル伝達経路の同定のために、本発明者らは、ＥＰＨＡ７を外因的に発現するＣＯＳ−７細胞の抽出物を用いて免疫ブロットスクリーニングを実施した。要約すると、ＣＯＳ−７細胞を１×１０６の数でディッシュに播種し、２４時間後、細胞に、ＥＰＨＡ７を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＥＰＨＡ７）、又は空ベクター（対照としてｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ）をトランスフェクトし、それを４８時間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、その直後にプロテイナーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤の存在下で、溶解バッファー０．５ｍＬを適用した。それから、抽出物を超音波処理し、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上清を試料として集めた。免疫ブロット法に使用する特異的な抗体は、抗ＥＧＦＲ、抗ホスホＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８、Ｔｙｒ１０８６及びＴｙｒ１１７３）、抗ホスホＭＥＴ（Ｔｙｒ１３４９）抗ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）、抗ホスホｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、抗Ａｋｔ、抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、抗Ｓｈｃ、抗ホスホＳｈｃ（Ｔｙｒ３１７）、抗ホスホＳｈｃ（Ｔｙｒ２３９／２４０）、抗ＳＴＡＴ１、抗ホスホＳＴＡＴ１（Ｔｙｒ７０１）、抗ＳＴＡＴ３、抗ホスホＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）、抗ＳＴＡＴ５及び抗ホスホＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）（これらはCell Signaling technology（Danvers, MA）から購入した）、抗ＭＥＴ及び抗ホスホＭＥＴ（Ｔｙｒ１３１３）抗体（これらはSanta-Cruzから購入した）、抗ホスホＭＥＴ（Ｔｙｒ１２３０／１２３４／１２３５、Ｔｙｒ１３６５）抗体（Invitrogen製）であった。
実施例２ ＣＤＣＡ５
（１）肺癌及び食道癌及び正常な組織におけるＣＤＣＡ５の発現
本発明者らはこれまでに、ｃＤＮＡマイクロアレイで２７６４８個の遺伝子をスクリーニングし、解析した臨床試料の４０％超で、正常な対照細胞よりも癌細胞で３倍以上の発現を示す転写産物を検出した（国際公開第２００４／０３１４１３号パンフレット、国際公開第２００７／０１３６６５号パンフレット、国際公開第２００７／０１３６７１号パンフレット）。上方制御遺伝子の中で、本発明者らは、ＣＤＣＡ５転写産物を同定し、半定量ＲＴ−ＰＣＲ実験によって、代表的なＮＳＣＬＣの１０症例の内の９症例で、ＳＣＬＣの５症例全て、及び２３個の肺癌細胞株全てでその発現の増大を確認した（図１Ａ、上部及び中央のパネル）。また、ＥＳＣＣの１０症例全て、及び１０個の食道癌細胞株全てで高レベルのＣＤＣＡ５発現が観察されたが、ＰＣＲ産物は正常な末梢気道上皮（ＳＡＥＣ）及び正常な食道試料由来の細胞ではほとんど検出されなかった（図１Ｂ、上部及び中央のパネル）。さらに、内因性ＣＤＣＡ５タンパク質の強い発現が、抗ＣＤＣＡ５抗体を用いて肺癌細胞株及び食道癌細胞株で確認された（図１Ａ、図１Ｂ、下部パネル）。
ＣＯＳ−７細胞株における外因性ＣＤＣＡ５の細胞内局在化を調べるために、免疫蛍光解析を実施し、ＣＤＣＡ５が間期細胞の核に位置していたが（図１Ｃ）、Ｍ期細胞内で拡散的に観察されたことを見出した（データ図示せず）。プローブとしてＣＤＣＡ５のｃＤＮＡ断片を用いたノーザンブロット解析によって、睾丸で強く発現する２．８ｋｂの転写産物が同定されたが、その転写産物は他の正常な組織ではほとんど検出することはできなかった（図１Ｄ）。
（２）ＣＤＣＡ５の成長促進活性
本発明者らは、ＣＤＣＡ５に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによって、高レベルのＣＤＣＡ５発現を示した肺癌細胞株Ａ５４９及び肺癌細胞株ＬＣ３１９において内因性ＣＤＣＡ５の発現をノックダウンさせた。本発明者らは、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって、ＣＤＣＡ５の発現レベルを調べ、２つのＣＤＣＡ５特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＣＤＣＡ５−＃１及びｓｉ−ＣＤＣＡ５−＃２）が、対照ｓｉＲＮＡ構築物（ｓｉ−ＬＵＣ及びｓｉ−ＣＮＴ）に比べて、ＣＤＣＡ５の発現を有意に抑制させることを見出した（図２Ａ及び図２Ｂ、上部パネル）。コロニー形成及びＭＴＴアッセイによって、ｓｉ−ＣＤＣＡ５の導入が、ＣＤＣＡ５発現に対するそのノックダウン効果によって、Ａ５４９細胞及びＬＣ３１９細胞の両方の成長を有意に抑制することを明らかにした（図２Ａ及び図２Ｂ、中央及び下部のパネル）。次に、本発明者は細胞成長促進の際のＣＤＣＡ５の役割を調べた。本発明者らは、ＣＤＣＡ５を発現するように設計されたプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＤＣＡ５−ｃ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ）を調製し、それらをＣＯＳ−７細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。図２Ｃで示されるように、ＣＤＣＡ５のｃＤＮＡのＣＯＳ−７細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションが、モックベクターのものに比べて、細胞成長を有意に高めた。
（３）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＲＫタンパク質キナーゼ及びＣＤＣ２タンパク質キナーゼによるＣＤＣＡ５のリン酸化
発癌におけるＣＤＣＡ５の機能を解析するために、本発明者らは、ＣＤＣＡ５タンパク質上のリン酸化部位に注目した。プロテオームホスホペプチドスクリーニングを用いたこれまでの報告によると、ＣＤＣＡ５は、セリン−７５、セリン−７９及びスレオニン−１１５でリン酸化されるものと推定されていた（Olsen JV, Blagoev B, Gnad F. Global, In vivo and Site-Specific Phosphorylation Dynamics in Signaling Networks. Cell 2006;127（3）:635-648.）。ＣＤＣＡ５リン酸化に対する類似キナーゼを同定するために、本発明者らは、セリン−７５、セリン-７９及びスレオニン−１１５を含むＣＤＣＡ５のペプチド配列をリン酸化部位と比較し、ＣＤＣＡ５のセリン−７５は、コンセンサスＣＤＣ２タンパク質キナーゼリン酸化部位［Ｓ／Ｔ−Ｐ−ｘ−Ｒ／Ｋ］には完全に一致したが、セリン−７９及びスレオニン−１１５は、ＥＲＫリン酸化部位［ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ］には調和（concordantly）一致したことを見出した（図１７Ａ）。これらのコンセンサス配列は、多くの種で強く保存された（図１７Ａ）。その後本発明者らは、組換えＣＤＣ２又はＥＲＫをＣＤＣＡ５とインキュベートすることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施し、ＣＤＣＡ５がＥＲＫ及びＣＤＣ２の両方によって直接リン酸化されることを見出した（図１７Ｂ）。この結果は、ＣＤＣＡ５がＣＤＣ２経路及び／又はＥＲＫ経路に関与するという結論に一致している。
これらのキナーゼによって、ＣＤＣＡ５上の直接リン酸化部位を求めるために、本発明者らは、その後のＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ解析と結び付いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施した。組換えＣＤＣＡ５タンパク質を３７℃で３．５時間、ＥＲＫタンパク質キナーゼ又はＣＤＣ２タンパク質キナーゼとインキュベートした。ゲル上で、ＥＲＫとインキュベートしたＣＤＣＡ５タンパク質は、キナーゼアッセイ後に２つのバンドを含んでいたが、ＣＤＣ２とインキュベートしたＣＤＣＡ５は単一バンドであるように見えた。本発明者らは、ＭＳ解析のために４つのバンドを切り取り（図１７Ｃ）、８つのＥＲＫ依存性リン酸化部位と、３つのＣＤＣ２依存性リン酸化部位とを同定した（図１７Ｄ）。セリン−２１、セリン−７５及びスレオニン−１５９をＥＲＫ及びＣＤＣ２の両方でリン酸化した。
（４）ＣＤＣＡ５のＥＲＫ依存性ｉｎ ｖｉｖｏリン酸化の同定
哺乳動物細胞において、内因性ＣＤＣＡ５がＥＲＫによってリン酸化されたことを証明するために、血清飢餓Ｈｅｌａ細胞を、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の存在又は非存在下でＥＧＦで刺激した。抗ＥＲＫ抗体を用いたウェスタンブロット法によって、ＥＲＫがＥＧＦ刺激の１５分後及び３０分後に強く活性化したが、そのレベルは６０分及び１２０分で低減したことが示された（図１８Ａ、左側のパネル）。ＥＲＫリン酸化レベルの増大に伴い、抗ＣＤＣＡ５抗体によって検出されたＣＤＣＡ５バンドは、より高い分子量に移行した。これに対して
、ＥＧＦ及びＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の両方による細胞の処理は、ＥＲＫリン酸化レベルを低減させ、ＣＤＣＡ５バンドの上方移行を完全に阻害した（図１８Ａ、右側のパネル）。これらの結果によって、ＥＲＫ経路による内因性ＣＤＣＡ５タンパク質のリン酸化の可能性があることが示される。
ＣＤＣＡ５のＭＡＰキナーゼ経路依存性リン酸化を確認し、培養細胞におけるリン酸化部位を同定するために、ｍｙｃタグ付きＣＤＣＡ５を発現するように設計されたプラスミドをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞を、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の存在又は非存在下でＥＧＦで刺激し、これらの細胞抽出物は、抗ｍｙｃ抗体を使用した２Ｄウェスタンブロット法に用いた。ＥＧＦ及びＵ０１２６の処理をしないＨｅｌａ細胞では、２つのスポットが検出されたが（スポット番号１及び番号２）、ＥＧＦによる処理によって、これらのスポットの１つのシグナルで比較的目立った増大が起こり（スポット番号２）、より酸性のｐＩ値で２つの新たなスポットシグナルが誘導された（スポット番号３及び番号４）。より酸性のｐＩを有するこれらの移行スポットは、細胞とＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６との前インキュベーションによって有意に低減した（図１８Ｂ）。さらに、ＥＧＦ刺激によって増大したスポット番号２のシグナルもＵ０１２６処理によって低減した。これらの結果によって、ＣＤＣＡ５が、ＥＧＦリガンド刺激に応じて、ＭＡＰＫカスケードによって特異的にリン酸化したことが示唆されている。
（５）ＣＤＣＡ５のＣＤＫ１／ＣＤＣ２依存性のｉｎ ｖｉｖｏリン酸化の同定
ＣＤＫ１／ＣＤＣ２及びその結合タンパク質サイクリンＢ１は、哺乳動物細胞におけるＭ期開始及び有糸分裂状態の維持に必要であることが知られており、有糸分裂におけるＣＤＣ２キナーゼの基質タンパク質（複数可）のリン酸化が高まる可能性があることを示唆している（Minshull L, et al. Cell 1989; 56: 947-956., Nurse P, et al. Nature 1990; 344: 503-508.）。この仮説に基づき、肺癌細胞株Ａ５４９及び肺癌細胞株ＬＣ３１９をアフィジコリン処理によってＧ１／Ｓ期で同期した。Ｇ１／Ｓ期からの開放後、細胞周期を通しての内因性ＣＤＣＡ５タンパク質のリン酸化状態をウェスタンブロット法によって検出した。興味深いことに、Ｍ期（主に１０時間〜１１時間）中に、上方移行バンドが観察され、このことはＣＤＣＡ５がＣＤＣ２経路によってリン酸化され得ることを示唆していた（図１９Ａ）。移行バンドは、ノコダゾールでの処理によってＭ期で同期した、食道癌細胞株ＴＥ８及び小細胞肺癌細胞株ＳＢＣ−３でも観察された（図１９Ｄ）。
有糸分裂における内因性ＣＤＣＡ５リン酸化がＣＤＣ２依存性であるか否かを求めるために、本発明者らはさらに、Ｇ１／Ｓ期からの解放の５時間後に、ノコダゾール単独又はノコダゾールとＣＤＣ２阻害剤ＣＧＰ７４５１４Ａの両方で肺癌細胞を処理し、ウェスタンブロット法によってＣＤＣＡ５のリン酸化状態を測定した。ノコダゾール単独で処理した有糸分裂細胞は、リン酸化ＣＤＣＡ５を段階的に発現した（移行バンド）（図１９Ｂ）。しかしながら、ノコダゾールとＣＧＰ７４５１４Ａの両方で処理した細胞は、上方移行バンドを全く示しておらず、このことは有糸分裂におけるＣＤＣＡ５リン酸化が有意に阻害されたことを示していた（図１９Ｂ）。これらの結果によって、有糸分裂における内因性ＣＤＣＡ５のリン酸化がＣＤＣ２活性に依存的であることが示された。本発明者らは、他のＣＤＣ２阻害剤、アルステルポーロンを用いてもこの実験を行い、４μＭのアルステルポーロンはＣＤＣＡ５リン酸化を厳格に阻害することができるが、そのＣＤＣ２阻害活性は、他のＣＤＣ２阻害剤、ＣＧＰ７４５１４Ａに比べて低いようであった（図１９Ｅ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイによって、ＣＤＣＡ５で３つのリン酸化部位（セリン−２１、セリン−７５及びスレオニン−１５９）が同定された。培養細胞においてＣＤＣＡ５でのＣＤＣ２依存性のリン酸化部位を求めるために、本発明者らは、コドン２１、コドン７５又はコドン１５９でのセリン／スレオニンのアラニンへのアミノ酸置換（それぞれ、Ｓ２１Ａ、Ｓ７５Ａ又はＴ１５９Ａ）を有する突然変異型ＣＤＣＡ５発現プラスミドを構築し、非タグ付き野生型ＣＤＣＡ５発現プラスミド又は３つの突然変異型ＣＤＣＡ５構築物のいずれかをＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。それから本発明者らは、アフィジコリン処理によってＧ１／Ｓ期で細胞を同期させた。Ｇ１／Ｓ期からの開放、及びその後のノコダゾールによるＭ期での同期の２４時間後、野生型ＣＤＣＡ５に対応する３つの異なるバンドを、野生型ＣＤＣＡ５発現ベクターをトランスフェクトした細胞で検出したが、セリン−２１、セリン−７５又はスレオニン−１５９でのアラニン置換体をトランスフェクトした細胞は、野生型ＣＤＣＡ５とは異なるＣＤＣＡ５の移行バンドパターンを示した（図１９Ｃ）。この結果によって、ＣＤＣＡ５が哺乳動物細胞でリン酸化したことが示される。さらに、細胞をＣＤＣ２阻害剤ＣＧＰ７４５１４Ａで処理した場合、又はコドン２１でのそのセリン残基がリン酸化されなかった場合、ＣＤＣＡ５タンパク質は不安定であると考えられる（図１９Ｃ）。
これらのデータは、ＣＤＣ５がＥＲＫ及びＣＤＣ２によってリン酸化されるという結論に一致している。ＥＲＫ遺伝子によってコードされるタンパク質は、複数の生化学的シグナルに対する統合点として機能し、且つ様々な細胞過程、例えば増殖、分化、転写調節及び発生に関与するＭＡＰキナーゼファミリータンパク質の成員である。ＭＡＰＫカスケードは、基質をリン酸化することによって様々な細胞外シグナルを統合及び処理し、このことがそれらの触媒活性と立体構造とを変えるか、又はタンパク質−タンパク質相互作用に関する結合部位を作製する。他方で、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、触媒性キナーゼサブユニットと調節サイクリンサブユニットとから成るヘテロ二量体複合体であり、細胞周期の進行及び転写調節におけるそれらの役割に基づき、２つの群に分けられたファミリーを含む。ＣＤＣ２／ＣＤＫ１（ＣＤＣ２−サイクリンＢ錯体）は、第１の群の成員であり、順番通りのＧ２期からＭ期への移行に必要である。最近になって、ＣＤＣ２が有糸分裂チェックポイントの活性化中の細胞生存に関与していることが分かった（O'Connor DS, Wall NR, Porter ACG. A p34cdc2 survival checkpoint in cancer. Cancer Cell 2002;2:43-54.）。これにより、本発明者らのデータによって、ＥＲＫ及びＣＤＣ２によるＣＤＣ５のリン酸化が腫瘍の悪性度を増大する癌の細胞周期進行を促進することが示された。
（６）考察
分子標的化薬剤は、悪性細胞に対する特異性が高く、またこれらの既に規定の作用機構のために有害事象が最小限であることが期待される。モデルとなる手術法及び補助的な化学放射線療法が改良されているにもかかわらず、肺癌及びＥＳＣＣは、悪性腫瘍の中でも最も不良な予後を示すことが知られている。したがって今日では、一刻も早く癌の早期検出及び個々の患者に対する補助的な治療法のより良い選択のための有効な診断バイオマーカー、並びに新たな種類の抗癌剤及び／又は癌ワクチンを開発することが要求されている。適当な診断標的分子及び治療標的分子を同定するために、本発明者らは、ＲＮＡｉ技法（Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov 1;63（21）: 7038-41、Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res. 2004 Dec 15;10（24）: 8363-70、Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65（13）: 5638-46、Furukawa C, et al., Cancer Res. 2005 Aug 15;65（16）: 7102-10、Ishikawa N, et al., Cancer Res. 2005 Oct 15;65（20）: 9176-84、Suzuki C, et al., Cancer Res. 2005 Dec 15;65（24）: 11314-25、Ishikawa N, et al., Cancer Sci. 2006 Aug;97（8）: 737-45、Takahashi K, et al., Cancer Res. 2006 Oct 1;66（19）: 9408-19、Hayama S, et al., Cancer Res. 2006 Nov 1;66（21）: 10339-48、Kato T, et al., Clin Cancer Res. 2007 Jan 15;13（2 Pt 1）: 434-42、Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther. 2007 Feb;6（2）:542-51、Yamabuki T, et al., Cancer Res. 2007 Mar 15;67（6）: 2517-25、Hayama S, et al., Cancer Res. 2007 May 1;67（9）: 4113-22）による機能喪失効果のハイスループットスクリーニングによる肺癌細胞及び食道癌細胞で過剰発現した遺伝子を選択するために、全ゲノムの発現解析を組み合わせた（Kikuchi T, et al., Oncogene. 2003 Apr 10;22（14）: 2192-205、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May;1（7）: 485-99、Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13（24）: 3029-43. Epub 2004 Oct 20、Kikuchi T, et al. Int J Oncol. 2006 Apr;28（4）: 799-805、Taniwaki M, et al, Int J Oncol. 2006 Sep;29（3）: 567-75、Yamabuki T, et al., Int J Oncol. 2006 Jun;28（6）:1375-84）。この系統的アプローチを用いて、本発明者らは、ＣＤＣＡ５が臨床肺癌試料及びＥＳＣＣ試料で頻繁に過剰発現することを見出し、この遺伝子産物の過剰発現が肺癌細胞の成長において必須の役割を果たすことを示した。
これまでの研究によって、ＣＤＣＡ５が、クロマチン上のコヒーシンと相互作用し、また間期に機能して、姉妹染色分体接着を支持することが示されている。姉妹染色分体は通常、ほとんどのＧ２細胞でさらに分離し、このことはＳ期において既に、接着の樹立にＣＤＣＡ５が必要であるという結論と一致していることを示している（Schmitz J, et al., Curr Biol. 2007 Apr 3;17（7）:630-6. Epub 2007 Mar 8）。今までのところ、接着樹立に特に必要となる他のタンパク質が１つだけ知られている：出芽酵母アセチルトランスフェラーゼＥｃｏ１／Ｃｔｆ７（Skibbens RV, et al., Genes Dev. 1999 Feb l;13（3）:307-19; Toth A, et al., Genes Dev. 1999 Feb 1;13（3）:320-33、Ivanov D, et al., Curr Biol. 2002 Feb 19;12（4）:323-8）。また、ショウジョウバエ及びヒトの細胞における接着には、この酵素の相同体も必要となるが（Williams BC, et al., Curr Biol. 2003 Dec 2;13（23）:2025-36、Hou F & Zou H. Mol Biol Cell. 2005 Aug;16（8）:3908-18. Epub 2005 Jun 15）、これらのタンパク質がＳ期でも機能するか否かは未だ分かっていない。したがって、ＣＤＣＡ５及びＥｃｏ１／Ｃｔｆ７相同体が癌細胞での接着を樹立するのに共働するか否かを検討することが目的となる。
姉妹染色分体接着は、効果的に正確な染色体分配を確実にするために、細胞周期の適切な時点で樹立及び解体しなければならない。ＡＰＣＣｄｃ２０の活性化が、分解に関して、後期阻害剤のセクリンを標的とすることによって接着の崩壊を制御することがこれまでに示されてきた。このことが、Ｓｃｃ１／Ｒａｄ２１のセパラーゼ依存性開裂を可能にし、後期を誘発する。ＡＰＣのほとんどの細胞周期基質の分解は、それらの機能に関して論理的であり、分解は、活性が早くから存在するのを防ぎ、ラチェット様で、細胞周期の進行を促進する。ＣＤＣＡ５の機能は、接着を調節する他の因子の機能と重複していてもよく、それらの複合活性が確実に染色体を複製及び分離させる（Rankin S, et al., Mol Cell. 2005 Apr 15; 18（2）: 185-200）。また本発明者らのマイクロアレイデータによると、ＡＰＣ及びＣＤＣ２０は肺癌及び食道癌で強く発現するが、正常な組織でのこれらの発現は低い。さらにＣＤＣ２０は、半定量ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学解析を用いて、臨床小細胞肺癌での発現が強いことが確認された（Taniwaki M., et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29（3）:567-75）。これらのデータは、ＣＤＣＡ５がＣＤＣ２０と共に、細胞周期の進行を促進することによって癌細胞の成長を促進するという結論に一致するが、これらの分子がＣＤＣＡ５と直接相互作用することを示す証拠はない。
ＣＤＣＡ５はこれまでに、間期では核に、有糸分裂では細胞質に位置することが報告された（Rankin S, et al., Mol Cell. 2005 Apr 15;18（2）: 185-200）。しかしながら、その生理学的機能は依然として明らかになっていない。ＣＤＣＡ５が核に局在化していることが確認された。核は遺伝子材料を含有し、その主な機能は、遺伝子の完全性を維持し、遺伝子発現を調節することである。核は、細胞の要求に応じて変化する動的構造体である。核機能を制御するために、核からの侵入及び排出プロセスが調節される。核内でのＣＤＣＡ５の局在化は、この分子が細胞周期を制御するのに必須の因子として作用し得ることを示している（Kho CJ, et al., Cell Growth Differ. 1996 Sep;7（9）:1157-66、Bader N, et al., Exp Gerontol. 2007 Apr 10; [Epub ahead of print]）。ＣＤＣＡ５が細胞周期制御に重要な役割を果たすことが知られているが、ＣＤＣＡ５が発癌過程とどのような関連性があるのかを証明した研究はない。本発明者らは、ｓｉ−ＣＤＣＡ５の導入が肺癌細胞の成長を有意に抑制し、ＣＤＣＡ５が哺乳動物細胞に対する成長促進作用を有することを確認し、このことによって、ＣＤＣＡ５が癌細胞成長／生存に対する重要な役割を果たすことを実証した。さらにＣＤＣＡ５発現は睾丸のみで観察され、このことは、この遺伝子が癌免疫療法、例えば副作用が最小限である癌ワクチンに有力な標的分子であることを意味する。
これらのデータは、ＣＤＣＡ５がＥＲＫ及びＣＤＣ２によってリン酸化されるという結論に一致している。ＥＲＫ遺伝子によってコードされるタンパク質は、複数の生化学的シグナルに対する統合点として機能し、且つ様々な細胞過程、例えば増殖、分化、転写調節及び発生に関与するＭＡＰキナーゼファミリータンパク質の成員である。ＭＡＰＫカスケードは、基質をリン酸化することによって様々な細胞外シグナルを統合及び処理し、このことがそれらの触媒活性と立体構造とを変えるか、又はタンパク質−タンパク質相互作用に関する結合部位を作製する。他方で、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、触媒性キナーゼサブユニットと調節サイクリンサブユニットとから成るヘテロ二量体複合体であり、細胞周期の進行及び転写調節におけるそれらの役割に基づき、２つの群に分けられたファミリーを含む。ＣＤＣ２／ＣＤＫ１（ＣＤＣ２−サイクリンＢ錯体）は、第１の群の成員であり、順番通りのＧ２期からＭ期への移行に必要である。最近になって、ＣＤＣ２が有糸分裂チェックポイントの活性化中の細胞生存に関与していることが分かった（O'Connor DS, Wall NR, Porter ACG. A p34cdc2 survival checkpoint in cancer. Cancer Cell. 2002 Jul;2:43-54.）。これにより、本発明者らのデータによって、ＥＲＫ及びＣＤＣ２によるＣＤＣ５のリン酸化が腫瘍の悪性度を増大する癌の細胞周期進行を促進することが示された。
要約すると、これらのデータによって、ＣＤＣＡ５が肺癌及び食道癌の成長を促進することが実証され、このことは、抗癌剤の開発に有効な治療標的としてのその用途を示す。
実施例３ ＥＰＨＡ７
（１）肺癌組織及び正常組織におけるＥＰＨＡ７の発現及び細胞局在化
かなりの割合の肺癌（国際公開第２００７／０１３６６５号パンフレット）及び／又は食道癌で強く転写活性化した要素をスクリーニングするのにｃＤＮＡマイクロアレイを使用して、本発明者らは、良好な候補としてＥＰＨＡ７遺伝子を同定した。この遺伝子は、大部分の肺癌及び食道癌において３倍以上のレベルの発現を示した。その後、本発明者らは、ＮＳＣＬＣの１０症例の内の７症例（ＡＤＣ５症例の内の３症例及びＳＣＣ５症例の内の４症例）及びＳＣＬＣの３症例全て（図３Ａ、上部パネル）、並びに１９個の内の９個のＮＳＣＬＣ細胞株及び４個の内の３個のＳＣＬＣ細胞株（図３Ａ、下部パネル）における半定量ＲＴ−ＰＣＲ実験によってその転写活性化を確認した。また、ＥＰＨＡ７の上方制御はＥＳＣＣの９症例の内の７症例、及び１０個の内の２個の食道癌細胞株で検出された（図３Ｂ、上部パネル及び下部パネル）。癌細胞において内因性ＥＰＨＡ７の細胞内局在化を求めるために、抗ＥＰＨＡ７ポリクローナル抗体を使用して、免疫細胞化学的解析を実施した。ＥＰＨＡ７の細胞外部分に対する抗体を使用する場合、ヒトＥＰＨＡ７のＮ末端部分は、肺癌由来のＳＢＣ−３細胞の細胞膜及び細胞質に局在化した（図３Ｆ、上部パネル）。また他方で、ＥＰＨＡ７の細胞内部分に対する抗体を使用する場合、ヒトＥＰＨＡ７のＣ末端部分がＳＢＣ−３細胞の核及び細胞質で検出された（図３Ｆ、下部パネル）。ＥＰＨＡ７がＩ型膜タンパク質であったので、本発明者らは、ＥＰＨＡ７タンパク質のＮ末端ドメインが切断され、ＥＲＢＢファミリーを含む他の受容体チロシンキナーゼタンパク質のような細胞外空間に分泌されると仮定した（McKay MM & Morrison DK. Oncogene. 2007 May 14;26（22）: 3113-21、Reinmuth N, et al., Int J Cancer. 2006 Aug 15;119（4）: 727-34、Lemmon MA. Breast Dis. 2003;18: 33-43）。したがって本発明者らは、ヒトＥＰＨＡ７のＮ末端部分（ＥＰＨＡ７の細胞外部分）に特異的なウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ２５４５９、Santa Cruz, Santa Cruz, CA）を用いたＥＬＩＳＡ法を適用し、肺癌細胞株の培養培地中でその存在を調べた。高レベルのＥＰＨＡ７タンパク質がＳＢＣ−３、ＤＭＳ１１４及びＮＣＩ−Ｈ１３７３培養物の培地中で検出されたが、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ２２６及びＡ５４９細胞の培地中では検出されなかった（図３Ｇ）。培養培地中で検出可能なＥＰＨＡ７の量を、半定量ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫細胞化学解析で検出されたＥＰＨＡ７の発現レベルに一致させた。
プローブとしてＥＰＨＡ７のｃＤＮＡを使用したノーザンブロット解析によって、２７個の成人ヒト組織及び胎児ヒト組織の中で胎児脳と胎児腎臓のみで非常に低レベルの６．８ｋｂの転写産物が同定された（図３Ｃ）。同じプローブを使用した付加的なノーザンブロット法によって、肺癌細胞株ＳＢＣ−３で、胎児脳及び胎児腎臓よりもかなり豊富に、ＥＰＨＡ７転写産物のみが検出された（図３Ｄ）。さらに本発明者らは、免疫組織化学解析によって、抗ＥＰＨＡ７ポリクローナル抗体を使用して、４つの正常組織（心臓、肺、肝臓、腎臓及び睾丸）でのＥＰＨＡ７タンパク質発現を、肺癌でのＥＰＨＡ７タンパク質発現と比較した。ＥＰＨＡ７は主に、肺癌細胞の細胞質及び／又は細胞膜で豊富に発現したが、その発現は、残りの４つの正常組織ではほとんど検出することができなかった（図３Ｅ）。
（２）ＥＰＨＡ７過剰発現と予後不良との関連性
４０２個のＮＳＣＬＣ及び２７個のＳＣＬＣから調製された組織マイクロアレイを用いて、本発明者らは、抗ＥＰＨＡ７ポリクローナル抗体による免疫組織化学解析を実施した。ＥＰＨＡ７の陽性染色がＮＳＣＬＣの７４．６％（３００／４０２）及びＳＣＬＣの８５．２％（２３／２７）で観察されたが、試験した正常な肺組織のいずれにおいても染色は観察されなかった（図４Ａ、左側のパネル）。これらのＥＰＨＡ７陽性ＮＳＣＬＣ症例の中で、１８９症例がＡＤＣであり（２５３症例の７４．７％）、７８症例がＳＣＣであり（１０９症例の７１．６％）、２３症例がＬＣＣであり（２７症例の８５．２％）、１０症例が腺扁平上皮癌であった（ＡＳＣ、１３症例の７６．９％）。
組織アレイ上でのＥＰＨＡ７発現パターンを、欠損（０でスコア付け）から弱／強陽性（１＋〜２＋とスコア付け）の範囲で分類した。４０２個のＮＳＣＬＣの中で、ＥＰＨＡ７は、１９０症例で強く染色され（４７．３％、スコア２＋）、１１０症例で弱く染色され（２７．３％、スコア１＋）、１０２症例では染色されなかった（２５．４％、スコア０）（詳細を表３Ａに示す）。それから本発明者らは、根治的外科手術を受けたＮＳＣＬＣ患者において、このタンパク質の発現を様々な臨床病理学的変数と関連付けようとした。同一のプロトコルで治療したＳＣＬＣの試料サイズは、さらに評価するのには小さすぎた。統計解析によって、腫瘍サイズ（ｐＴ１〜４でより高い、Ｐ＝０．０２５６、フィッシャーの直接確率検定）がＥＰＨＡ７の強陽性に有意に関連していることが示された（詳細を表３Ａに示す）。腫瘍が強いＥＰＨＡ７発現を示したＮＳＣＬＣ患者は、欠損／弱いＥＰＨＡ７発現のものに比べてより短い腫瘍特異的な生存期間を示した（Ｐ＝０．００６、ログランク検定、図２Ｂ）。
単変量解析によって、年齢（６５歳以上対６５歳未満）、性別（男性対女性）、ｐＴ段階（Ｔ２＋Ｔ３対Ｔ１）、ｐＮ段階（Ｎ１、Ｎ２対Ｎ０）、非ＡＤＣ病歴（非ＡＤＣ対ＡＤＣ）、及び強いＥＰＨＡ７発現は、ＮＳＣＬＣ患者では腫瘍特異的な生存率が低いことと有意に関連していた（表３Ｂ）。さらに、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた多変量解析では、高齢、大きい腫瘍サイズ、リンパ節転移、及び強いＥＰＨＡ７染色がＮＳＣＬＣに関する独立した予後因子であった（表３Ｂ）。
ＥＰＨＡ７の陽性染色は、２９２症例のＥＳＣＣの内の８８．３％のＥＳＣＣで免疫組織化学解析によって観察され（２５８／２９２）、試験した正常食道組織のいずれでも染色は全く観察されなかった（図４Ａ、右側のパネル）。調べたＥＳＣＣの２９２症例の中で、ＥＰＨＡ７は、１５３症例で強く染色され（５２．４％、スコア２＋）、１０５症例で弱く染色され（３６．０％、スコア１＋）、３４症例で染色されなかった（１１．６％、スコア０）（詳細を表４Ａに示す）。統計解析によって、腫瘍サイズ（ｐＴ２〜４でより高い、Ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定）及びリンパ節転移（ｐＮ１〜２でより高い、Ｐ＝０．０００６、フィッシャーの直接確率検定）がＥＰＨＡ７の強陽性に有意に関連していることが示された（表４Ａ）。
生存期間中央値が、ＥＰＨＡ７強陽性ＥＳＣＣの患者で、ＥＰＨＡ７弱陽性／陰性腫瘍を有する患者よりも有意に短かった（Ｐ＝０．０２６３、ログランク検定、図４Ｃ）。ＥＳＣＣ患者の予後と幾つかの因子との間の関連性を評価する単変量解析において、性別（男性対女性）、ｐＴ段階（Ｔ２＋Ｔ３対Ｔ１）、ｐＮ段階（Ｎ１、Ｎ２対Ｎ０）、及びＥＰＨＡ７状態（スコア２＋対０、１＋）は予後不良に有意に関連していた。多変量解析では、ＥＰＨＡ７状態は、この試験で登録された外科的治療をしたＥＳＣＣ患者では、独立した予後因子として統計的に有意なレベルには達しなかったが（Ｐ＝０．５５８６）、ｐＴ状態及びｐＮ状態、並びに性別は統計的に有意なレベルに達し、このことによって食道癌におけるＥＰＨＡ７発現とこれらの臨床病理学的因子との関連性が実証された（表４Ｂ）。
（表３Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＥＰＨＡ７強陽性と患者の特徴との関連性（ｎ＝４０２）
Figure 2010536367
（表３Ｂ）ＮＳＣＬＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
Figure 2010536367
（表４Ａ）ＥＳＣＣ組織におけるＥＰＨＡ７強陽性と患者の特徴との関連性（ｎ＝２９２）
Figure 2010536367
（表４Ｂ）ＥＳＣＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
Figure 2010536367
（３）肺癌患者及び食道癌患者におけるＥＰＨＡ７の血清レベル
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、肺癌細胞におけるＥＰＨＡ７タンパク質のＮ末端ドメインが切断され、細胞外空間に分泌されることが実証されたので、本発明者らはＥＰＨＡ７が肺癌若しくは食道癌を有する患者の血清に分泌されるか否かを研究した。ＥＬＩＳＡ実験によって、肺癌又は食道癌の４３９人の患者の大部分由来の血清学試料においてＥＰＨＡ７タンパク質が検出された。３４３人の肺癌患者における血清ＥＰＨＡ７の平均（±１ＳＤ）は４．３３±３．７３Ｕ／ｍｌであり、９６人のＥＳＣＣ患者のものは１０．７４±８．１２Ｕ／ｍｌであった。これに対して、１２７人の健常な個人におけるＥＰＨＡ７の平均（±１ＳＤ）血清レベルは１．６９±０．８０Ｕ／ｍｌであった。差異は、０．００１未満のＰ値で有意であった（マンホイットニーＵ検定）。
肺癌の組織型によると、ＥＰＨＡ７の血清レベルは、２０５人のＡＤＣ患者では４．４０±３．５４Ｕ／ｍｌであり、５９人のＳＣＣ患者では３．４１±２．３５Ｕ／ｍｌであり、７９人のＳＣＬＣ患者では４．８５±４．８３Ｕ／ｍｌであった（図５Ａ）。３つの組織型間の相違は有意ではなかった。高レベルの血清ＥＰＨＡ７が初期腫瘍の患者で検出された（データ図示せず）。
これらの４３９人の癌（ＮＳＣＬＣ＋ＳＣＬＣ＋ＥＳＣＣ）患者及び１２７人の健常な対照のデータによって作成した受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて（図５Ｂ、左側のパネル）、このアッセイにおけるカットオフレベルは、ＥＰＨＡ７に最適な診断精度と尤度比とを与えるように、即ち２．８３Ｕ／ｍｌ（６０．４％（２６５／４３９）の感度で、９５．３％（１２１／１２７）の特異度で）に設定された。腫瘍組織学に従うと、血清ＥＰＨＡ７陽性症例の割合は、ＡＤＣで５８．５％（１２０／２０５）、ＳＣＣで４９．２％（２９／５９）、ＳＣＬＣで４４．３％（３５／７９）及びＥＳＣＣで８４．４％（８１／９６）であった。
それから本発明者らは、同じ患者で血清ＥＰＨＡ７のレベルをモニタリングするために、対となる術前及び術後の（手術後２ヶ月の）肺癌患者由来の血清試料を使用してＥＬＩＳＡ実験を実施した。原発腫瘍の外科的切除後、血清ＥＰＨＡ７濃度が劇的に低減した（図５Ｂ、右側のパネル）。この結果は独立して、高感度、並びに早期の癌検出のため及び疾患の再発をモニタリングするためのバイオマーカーとしての血清ＥＰＨＡ７の使用を支持している。
腫瘍検出バイオマーカーとしての血清ＥＰＨＡ７レベルの臨床的有用性を評価するために、本発明者らはまた、癌患者及び対照個体由来の同じ組の血清試料において、２つの従来の腫瘍マーカー（ＮＳＣＬＣ患者ではＣＥＡ及びＳＣＬＣ患者ではＰｒｏＧＲＰ）の血清レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ＲＯＣ解析によって、ＮＳＣＬＣ検出でのＣＥＡのカットオフ値が２．５ｎｇ／ｍｌであることが測定された（３７．９％の感度で（８８／２３２）、８９．８％の特異度で（１１４／１２７）、図５Ｃ、上部パネル）。血清ＥＰＨＡ７値とＣＥＡ値との間の相関係数は有意ではなく（スピアマン順位相関係数：ρ（ｒｈｏ）＝−０．１７２、Ｐ＝０．００９）、このことは血清中の両方のマーカーの測定は、ＮＳＣＬＣの検出に対する感度全体を７６．７％（１７８／２３２）に改善することができることを示していた（ＮＳＣＬＣの診断に関しては、ＣＥＡ単独の感度は３７．９％であり（８８／２３２）、ＥＰＨＡ７の感度は５５．２％である（１２８／２３２））。正常なボランティア（対照群）間で２つの腫瘍マーカーのいずれかに関する偽陽性率は７．１％であったが（９／１２７）、同じ対照群におけるＣＥＡ及びＥＰＨＡ７の各々に関する偽陽性率はそれぞれ、２．４％（３／１２７）及び４．７％（６／１２７）であった。
ＳＣＬＣ患者のＲＯＣ解析によって、６４．８％の感度で（４６／７１）及び９７．６％の特異度で（１２０／１２３）、ＰｒｏＧＲＰのカットオフ値が４６．０ｐｇ／ｍｌであることが測定された（図５Ｃ、下部パネル）。血清ＥＰＨＡ７値とＰｒｏＧＲＰ値との間の相関係数は有意ではなく（スピアマン順位相関係数：ρ（ｒｈｏ）＝０．１４３、Ｐ＝０．２３２５）、このことも両方のマーカーの血清レベルの測定は、ＳＣＬＣの検出に対する感度全体を７７．５％（５５／７１）に改善することができることを示していた（ＳＣＬＣの診断に関しては、ＰｒｏＧＲＰ単独の感度は６４．８％であり（４６／７１）、ＥＰＨＡ７の感度は４５．１％である（３２／７１））。正常なボランティア（対照群）間で２つの腫瘍マーカーのいずれかに関する偽陽性症例は７．３％であったが（９／１２３）、同じ対照群におけるＰｒｏＧＲＰ及びＥＰＨＡ７に関する偽陽性率はそれぞれ、２．４％（３／１２３）及び４．９％（６／１２３）であった。
（４）哺乳動物細胞におけるＥＰＨＡ７の細胞成長及び浸潤効果
ＥＰＨＡ７に対する低分子干渉ＲＮＡによる肺癌細胞の成長阻害。ＥＰＨＡ７が肺癌細胞の成長又は生存に必須であるか否かを判定するために、本発明者らはＥＰＨＡ７に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＰＨＡ７）と対照プラスミドに対するｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ／ルシフェラーゼ及びスクランブル／ＳＣＲに対するｓｉＲＮＡ）を構築し、それらをＮＣＩ−Ｈ５２０細胞及びＳＢＣ−５細胞にトランスフェクトした。ｓｉ−ＥＰＨＡ７−＃２をトランスフェクトした細胞におけるｍＲＮＡレベルは、対照ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした細胞に比べて有意に低減した。本発明者らは、コロニー形成数と、ＭＴＴアッセイによって測定された生存細胞数との有意な低減を観察した（図６Ａ、右側及び左側のパネル）。ｓｉ−ＥＰＨＡ７−＃１のトランスフェクションによって、コロニー数と細胞生存率とのわずかな減少、及びＥＰＨＡ７発現の弱い低減が生じた。
哺乳動物細胞の成長及び形質転換に対するＥＰＨＡ７の効果を求めるために、本発明者らは、一時的にＥＰＨＡ７を発現したＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ−７−ＥＰＨＡ７）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施した。ＭＴＴアッセイによって求められるように、ＣＯＳ−７−ＥＰＨＡ７細胞の成長は空ベクター対照に比べて促進した（図７Ｂ）。
組織マイクロアレイでの免疫組織学的且つ統計学的な解析によって、ＥＰＨＡ７陽性がより短い癌特異的な生存期間に有意に関連していたことが示されたので、本発明者らは、ＥＰＨＡ７が細胞浸潤能に関与するか否かを求めるために、マトリゲル浸潤アッセイを実施した。ＣＯＳ−７−ＥＰＨＡ７細胞又はＮＩＨ３Ｔ３−ＥＰＨＡ７細胞のマトリゲルを通る浸潤は、モックプラスミドをトランスフェクトした対照細胞に比べて有意に高まり、またこれにより独立して、ＥＰＨＡ７が肺癌細胞の極めて悪性の表現型に寄与することが示される（図７Ｃ）。
（５）ＥＰＨＡ７に対する下流標的としてのＥＧＦＲ、ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ及びＣＤＣ２５の同定
発癌におけるＥＰＨＡ７キナーゼの機能を解明するために、本発明者らは、ＥＰＨＡ７シグナル伝達を介してリン酸化し、且つ細胞増殖シグナル伝達を活性化する、基質及び／又は下流の標的タンパク質を同定しようとした。本発明者らは、ＥＰＨＡ７発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞溶解物と、癌細胞シグナル伝達に関連したリンタンパク質に特異的な一連の抗体とを使用して、ＥＰＨＡ７に対するキナーゼ基質の免疫ブロットスクリーニングを実施した（表２を参照されたい）。本発明者らは、合計２８個のリンタンパク質をスクリーニングし、ＥＧＦＲのＴｙｒ−８４５、ＰＬＣγのＴｙｒ−７８３及びＣＤＣ２５のＳｅｒ−２１６が、モックベクターをトランスフェクトした細胞に比べて、ＥＰＨＡ７発現ベクターをトランスフェクトした細胞で有意にリン酸化したことを見出した（図８Ａ）。本発明者らは、免疫沈降実験によって、内因性ＥＧＦＲと外因性ＥＰＨＡ７との間の類似の相互作用を確認した（図７Ｂ）。
（６）ＥＰＨＡ７に対する新規の基質としてのＥＧＦＲ及びＭＥＴの同定
発癌におけるＥＰＨＡ７の機能を解明するために、本発明者らは、ＥＰＨＡ７によって直接リン酸化し、且つ細胞増殖及び／又は生存シグナル伝達を活性化する、ＥＰＨＡ７キナーゼに対する基質タンパク質を同定しようとした。本発明者らは、外因性ＥＰＨＡ７を発現するＣＯＳ−７細胞の免疫沈降体を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析を実施し、候補ＥＰＨＡ７−相互作用タンパク質として、このＭＥＴ癌原遺伝子（proto-oncogene：プロトオンコジーン）前駆体を同定した。本発明者らは、ＭＥＴ及びＥＰＨＡ７を外因的に発現するＣＯＳ−７抽出物を用いた免疫沈降によってこの相互作用を検証した（図２０Ａ及び図２０Ｂ）。ＥＰＨＡ７及びＭＥＴの両方が、受容体チロシンキナーゼタンパク質の成員であり、近年の報告によって、癌細胞で幾つかの受容体チロシンキナーゼが活性化され、これらが下流のシグナル変換を活性化するのに相補的な働きを示し得ることが示唆される（Reinmuth N et al. Int J Cancer. 2006 Aug 15;119（4）:727-34.）。実際に、ＥＰＨＡ７発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞溶解物と、癌細胞シグナル伝達に関連したリンタンパク質に特異的な一連の抗体とを使用した、ＥＰＨＡ７に対するキナーゼ基質の免疫ブロットスクリーニングによって、ＥＰＨＡ７過剰発現によってリン酸化されるタンパク質としてＥＧＦＲ及びＭＥＴが同定された（下記を参照されたい）。この所見に基づいて、本発明者らは、ＥＧＦＲ及びＥＰＨＡ７を外因的に発現するＣＯＳ−７の抽出物を用いて免疫沈降を実施し、ＥＰＨＡ７がＥＧＦＲと結合することができることを確認した（図２０Ｃ及び図２０Ｄ）。癌細胞におけるＥＧＦＲ及び／又はＭＥＴによるＥＰＨＡ７の相乗的活性化の可能性を評価するために、本発明者らは、肺癌細胞におけるウェスタンブロット法によってそれらの発現を調べた（図２０Ｅ）。或る特定の割合の肺癌細胞が、ＥＰＨＡ７とＭＥＴとの両方、又はＥＰＨＡ７とＥＧＦＲとの両方を発現し、このことが、これらのヘテロ二量体複合体が肺癌細胞に存在し得ることを示していた。
ＥＰＨＡ７とＥＧＦＲ／ＭＥＴとの間のキナーゼ基質反応を評価するために、本発明者らは、細胞質のＥＰＨＡ７、ＭＥＴ、ＥＧＦＲの活性組換えタンパク質を使用して、また細胞質ＥＧＦＲを覆う３つの不活性化部分タンパク質も使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施した（図２１Ａ）。予想通り、本発明者らは、ＥＰＨＡ７が、ＥＧＦＲの自己リン酸化を減衰させたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の存在下でＥＧＦＲを直接リン酸化することができることを見出した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。基質として３つの部分細胞質ＥＧＦＲを用いた、付加的なｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイによって、細胞質ＥＧＦＲ上のリン酸化チロシン残基が、ＣＯＯＨ末端部分に存在し得ることが示された（コドン１０４６〜コドン１１８６、図２１Ｂ及び図２１Ｃ）。この領域は幾つかのリン酸化チロシン残基を含有し、Ｔｙｒ１０６８及びＴｙｒ１１７３等のこれらの幾つかが、下流のシグナルを活性化するのに重要な役割を果たす。本発明者らはまた、ＥＰＨＡ７及びＭＥＴを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施し、ＥＰＨＡ７が、ＭＥＴを直接リン酸化することができることを見出した（図２１Ｄ）。興味深いことに、本発明者らは、ＡＴＰをＥＰＨＡ７に添加することによって、ＥＰＨＡ７自己リン酸化を観察することができたが、ＥＰＨＡ７リン酸化レベルは、ＭＥＴをＭＥＴキナーゼ阻害剤の存在下で共にインキュベートした場合に顕著に上昇し、このことは、ＥＰＨＡ７がＭＥＴと相互作用することによって活性化され得ることを示していた（図２１Ｄ）。次に本発明者らは、哺乳動物細胞においてＥＧＦＲ／ＭＥＴでＥＰＨＡ７依存性のリン酸化部位をスクリーニングした。このスクリーニングでは、本発明者らは、ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ−９９２、Ｔｙｒ−１０４５、Ｔｙｒ−１０６８、Ｔｙｒ−１０８６、Ｔｙｒ−１１４８及びＴｙｒ−１１７３、並びにホスホ−Ｓｅｒ−１０４６／１０４７）及びＭＥＴ（Ｔｙｒ−１２３０／１２３４／１２３５、Ｔｙｒ−１３１３、Ｔｙｒ−１３４９及びＴｙｒ−１３６５）の細胞質ドメイン内で様々なリン残基を認識したホスホ−ＥＧＦＲ及びホスホ−ＭＥＴに対する現在利用可能な抗体全てを試験したが、本発明者らは、ＥＧＦＲのＴｙｒ−１０６８、Ｔｙｒ−１０８６及びＴｙｒ−１１７３のリン酸化と、ＭＥＴのＴｙｒ−１２３０／１２３４／１２３５、Ｔｙｒ−１３１３、Ｔｙｒ−１３４９、Ｔｙｒ−１３６５のリン酸化が増大することを見出した（図２１Ｅ）。他のＴｙｒ残基のリン酸化レベルにおいては、有意な増大は観察されなかった（データ図示せず）。このデータによって、哺乳動物細胞で発現するＥＰＨＡ７は、内因性ＥＧＦＲ／ＭＥＴをリン酸化することができることが強く示唆される。
（７）ＥＰＨＡ７による発癌性の下流シグナル伝達の増強
ＥＧＦＲ／ＭＥＴが、癌細胞の細胞増殖、生存又は運動性に必須の役割を果たすという証拠があるので、本発明者らは、ＥＰＨＡ７によるＥＧＦＲ／ＭＥＴ活性の増強によって、ＥＧＦＲ／ＭＥＴ下流シグナル伝達が活性化される可能性に注目した。本発明者らは、ＥＰＨＡ７発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞溶解物と、ＥＧＦＲ／ＭＥＴ（ＭＡＰＫ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５及びＳｈｃ、表２も参照されたい）のリン酸化部位に関連したタンパク質を含む発癌性リンタンパク質に特異的な一連の抗体とを使用して、免疫ブロット解析を実施した。これらのタンパク質の中で、本発明者らは、モックトランスフェクトＣＯＳ−７に比べて、ＥＰＨＡ７発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞において、Ｓｈｃ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１４４３１）、ＳＴＡＴ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１３９２７６）、ＭＡＰＫ及びＡＫＴのリン酸化が高まることを見出した（図２２）。本発明者らは、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ５ではリン酸化の有意な増強を検出しなかった（データ図示せず）。このデータによって、哺乳動物細胞で発現したＥＰＨＡ７は、癌細胞の成長、生存及び／又は浸潤に重要である、ＥＧＦＲ／ＭＥＴの特定の下流経路を高めることができることが明らかに示唆される。
（６）考察
過去１０年で、療法剤及び放射線療法、並びに腫瘍の画像化における日進月歩の（daily）発展にもかかららず、肺癌患者の予後及び生活の質（quality of life）における改善はほとんど達成されていない。腫瘍の早期検出が、肺癌治療における最も有効な需要の１つであるため、強力な診断戦略及び診断ツール、例えば肺癌に対する腫瘍バイオマーカーが依然として世界中で望まれている。現在、癌特異的な膜貫通／分泌タンパク質を検出する利用可能な腫瘍特異的バイオマーカーはほんのわずかしかない（例えばＣＹＦＲＡ又はＰｒｏ−ＧＲＰ）（Pujol JL, et al., Cancer Res. 1993 Jan 1;53（1）: 61-6、Miyake Y, et al., Cancer Res. 1994 Apr 15;54（8）: 2136-40）。腫瘍特異的な膜貫通／分泌タンパク質は、細胞表面上又は細胞外空間のいずれかで提示されるため、分子標的としての用途が見出され、このことがこれらを分子療法標的として容易に接近可能にさせる。ＣＤ２０陽性リンパ腫に対するヒト化モノクローナル抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）によって、特異的細胞表面タンパク質の標的化が有意な臨床的利点をもたらし得るという裏付けが与えられる（Hennessy BT, et al., Lancet Oncol. 2004 Jun;5（6）:341-53）。したがって本発明者らは、癌細胞で過剰発現する腫瘍特異的な膜貫通／分泌タンパク質をコードするかかる遺伝子を選択するために、全ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイ解析能を利用して、肺癌の診断及び治療に効果的なツールの開発のための標的としてＥＰＨＡ７を同定した。
ヒトゲノムで見出される全ての受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の中で、Ｅｐｈ受容体ファミリーは、１３個の成員を有し、最も大きいファミリーを構成する。ＥＰＨ受容体は、配列相同性及びリガンド親和性に基づき、８つの成員（ＥＰＨＡ１〜ＥＰＨＡ８）を含有するＡサブクラスと、哺乳動物で５つの成員（ＥＰＨＢ１〜ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６）を含有するＢサブクラスとに分けられる。これらのリガンドであるエフリンは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞膜と繋がるＡサブクラス（エフリンＡ１〜エフリンＡ５）と、その成員が膜貫通ドメインを有し、その後に短い細胞質領域が続くＢサブクラス（エフリンＢ１〜エフリンＢ３）とに分けられる（Kullander K & Klein R. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002 Jul;3（7）:475-86）。ＥＰＨ／エフリン軸に関して、幾つかのシグナル変換経路が知られている。例えば、ＥＰＨＡ４はＪＡＫ／Ｓｔａｔ経路に関与する（Lai KO, et al., J Biol Chem. 2004 Apr 2;279（14）: 13383-92. Epub 2004 Jan 15）、またＥＰＨＢ４受容体シグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ経路を介して内皮細胞の移動及び増殖を媒介する（Steinle JJ, et al., J Biol Chem. 2002 Nov 15;277（46）:43830-5. Epub 2002 Sep 13）。さらに、ＥＰＨ／エフリン軸は、ＲａｓファミリーのＲｈｏシグナル伝達又は小ＧＴＰアーゼの活性を調節する（Lawrenson ID, et al., J Cell Sci. 2002 Mar 1;115（Pt 5）:1059-72: Murai KK & Pasquale EB. J Cell Sci. 2003 Jul 15;116（Pt 14）:2823-32）。
細胞増殖及び形質転換に関するシグナル伝達経路におけるＥＰＨ受容体ファミリータンパク質の重要性に関して幾つかの報告があるにもかかわらず、ＥＰＨＡ７が四肢発生中に、神経系で発現されるという報告しかなかった（Salsi V & Zappavigna V. J Biol Chem. 2006 Jan 27;281（4）: 1992-9. Epub 2005 Nov 28、Rogers JH, et al., Brain Res Mol Brain Res. 1999 Dec 10;74（1-2）:225-30、Araujo M & Nieto MA. Mech Dev. 1997 Nov;68（1-2）: 173-7）。
ＥＰＨＡ７の発現を低減させるための特定のｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の本発明者らの治療によって、成長の抑制が起こった。また、ＥＰＨＡ７の発現によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでの細胞の成長及び浸潤の有意な促進が起こった。その上、本発明者らの組織マイクロアレイ実験によって得られた臨床病理学的証拠によって、ＥＰＨＡ７を強く発現する腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者が、弱い又は欠損ＥＰＨＡ７発現を有する患者より短い癌特異的な生存期間を示すことが実証された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのアッセイによって得られた結果は、ＥＰＨＡ７の過剰発現が重要な成長因子であり、肺癌細胞の極めて悪性の表現型を誘導する、癌細胞の成長及び浸潤に関連するという結論に一致している。
さらに本発明者らは、ＥＰＨＡ７キナーゼの細胞内標的分子として、その経路が細胞の増殖及び浸潤に関与することが既知であった、ＥＧＦＲのＴｙｒ−８４５、ＰＬＣγのＴｙｒ−７８３及びＣＤＣ２５のＳｅｒ−２１６を見出した。例えば、チロシン８４５でのＥＧＦＲのリン酸化が肝細胞癌で報告された（Kannangai R, et al., Mod Pathol. 2006 Nov; 19（11）:1456-61. Epub 2006 Aug 25）。ＰＬＣγは、Ｔｙｒ−７８３でのリン酸化がＰＬＣγの活性化に必須なＰＤＧＦ誘導性のイノシトールリン脂質加水分解を媒介するＰＬＣアイソザイムである（Kim HK, et al., Cell. 1991 May 3;65（3）:435-41）。ＰＤＧＦによるチロシン７８３でのＰＬＣγのリン酸化は、有糸分裂誘発に加えて、細胞骨格再構築に重要な役割を果たす（Yu H, et al., Exp Cell Res. 1998 Aug 25;243（1）:113-22）。ＣＤＣ２５は、全ての真核細胞が有糸分裂へと入るのを調節するのに重要な工程である、ｃｄｃ２の脱リン酸化及び活性化に関与するタンパク質ホスファターゼである（Jessus C & Ozon R. Prog Cell Cycle Res. 1995; 1:215-28）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ｐ３８は、セリン３０９及び３６１で、ＣＤＣ２５Ｂと結合し、これをリン酸化させ、またセリン−２１６でＣＤＣ２５Ｃと結合し、これをリン酸化させる。これらの残基のリン酸化には、１４−３−３タンパク質との結合が要求され（Bulavin DV, et al., Nature. 2001 May 3;411（6833）:102-7）、１４−３−３タンパク質の結合と核輸送とが、ＣＤＣ２５の細胞内局在化を調節する（Kumagai A & Dunphy WG. Genes Dev. 1999 May 1; 13（9）: 1067-72）。
本発明者らは、ＥＰＨＡ７活性化が、ＭＡＰＫ、ＡＫＴ及びＳＴＡＴ３を含む下流の発癌性シグナル伝達経路を高める可能性があるＥＧＦＲ及び／又はＭＥＴと直接相互作用し、かつこれらをリン酸化することによって腫瘍の増殖及び浸潤における特有のシグナル伝達として機能するという興味深い証拠を特定した（Blume-Jensen P, et al. Nature 2001;411 :355-65., Birchmeier C, et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2003;4:915-25.）。近年の報告によって、ＲＴＫを癌細胞表面上で相乗的に活性化することができ、それによりＭＡＰＫ及びＡＫＴ等の下流シグナル伝達を相補的に活性化し得ることが示唆されたが（Stommel JM, et al. Science 2007;318:287-290.）、ＥＧＦＲとＥｐｈ−ＲＴＫとの間、又はＭＥＴとＥｐｈ−ＲＴＫとの間の新たな種類のＲＴＫヘテロ二量体形成がその後の下流シグナルを劇的に高め得ることを説明した報告はなかった。ＥＧＦＲ又はＭＥＴの新たなヘテロ二量体の活性化は、個々の発癌性シグナル伝達において相補的な機能を与え、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（即ちゲフィチニブ及びエルロチニブ）又はＭＥＴ阻害剤に対する癌細胞の天然の及び／又は獲得した耐性を引き起こし得る。本発明者らは、ＥＧＦＲ／ＭＥＴのＣ末端部分のチロシン残基は、ＥＰＨＡ７によって直接リン酸化することができ、このことが下流のシグナル伝達の増強をもたらし得ることを見出した。ＥＧＦＲ Ｔｙｒ１０６８及びＴｙｒ１０８６のリン酸化は、幾つかのアダプタタンパク質のドッキング部位であると考えられる（Batzer AG, et al. Mol Cell Biol 1994;14:5192-201.、Rodrigues GA, et al. Mol Cell Biol 2000;20: 1448-59.）。Ｇｒｂ２、Ｇａｂ１及びｐ８５は、かかるリン酸化残基と結合し、下流のＭＡＰＫ又はＡＫＴのシグナル伝達を活性化させることができる。リン酸化Ｔｙｒ１０６８及びＴｙｒ１０８６は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を直接及び間接的に活性化することができる（Shao H, et al. Cancer Res 2003 ;63:3923-30.、Xi S, et al. J Biol Chem 2003;278:31574-83.）。リン酸化Ｔｙｒ１１７３はＳｈｃ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１３００４１）に関連し、これによりその後のＭＡＰＫシグナル伝達がもたらされる（Batzer AG, et al. Mol Cell Biol 1994; 14:5192-201.）。他方で、Ｔｙｒ１３５６と共に、リン酸化ＭＥＴ Ｔｙｒ１３４９は、Ｇｒｂ２及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ等のアダプタタンパク質に対するドッキング部位として知られるが（Ponzetto C et al. Cell 1994;77:261-71.、Ponzetto C, et al. Mol Cell Biol 1993;13:4600-8.、Nguyen L, et al. J Biol Chem 1997;272:20811-9.）、発癌におけるホスホ−ＭＥＴ−Ｔｙｒ１３１３及びホスホ−ＭＥＴ−Ｔｙｒ１３６５の機能は解明されていない。どのＲＴＫが下流のシグナル伝達に重要であるかは、癌細胞間で変わる可能性があり、かかる「ドミナントＲＴＫ」を求める方法は依然として明らかでないが、ＥＰＨＡ７が癌の成長、生存及び浸潤に重要な役割を果たす肺癌及び食道癌が或る特定の割合存在し得る。本発明者らのデータによって、ＥＰＨＡ７が、ＥＧＦＲ／ＭＥＴシグナルが上方制御された癌細胞の発癌性依存症に寄与し得ること、及びＥＰＨＡ７活性の制御が癌患者の治療に有望な治療戦略であり得ることが強く示唆される。
また、肺癌及びＥＳＣＣ患者由来の血清学的試料において高レベルのＥＰＨＡ７タンパク質が見出された。診断ツールとしてＥＰＨＡ７を適用することの実現可能性を調べるために、本発明者らは、診断に対するその感度及び特異度に関して、ＥＰＨＡ７の血清レベルをＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣに対する２つの従来の診断マーカーであるＣＥＡ又はＰｒｏＧＲＰの血清レベルと比較した。両方のマーカー（ＥＰＨＡ７＋ＣＥＡ又はＥＰＨＡ７＋ＰｒｏＧＲＰ）を組み合わせたアッセイが、肺癌（ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ）ではＣＥＡ又はＰｒｏＧＲＰ単独の感度よりも有意に高い７５％超まで感度を増大させ、健常なボランティアの約７％が陽性として誤って診断された。本明細書で提示される本発明者らのデータによって、肺癌及び食道癌に対する血清学的マーカーとしてのＥＰＨＡ７の臨床的有用性が十分に実証される。
結論として、ＥＰＨＡ７の活性化は、肺癌細胞及び食道癌細胞の成長及び／又は悪性表現型に機能的な役割を果たす。血清ＥＰＨＡ７と他の腫瘍マーカーとの組合せが、肺癌診断の感度を有意に改善する。特異的にＥＰＨＡ７シグナル変換を標的とする新規の抗癌剤を設計することは、癌患者の治療に有望な治療及び診断戦略である。
実施例４ ＳＴＫ３１
（１）肺癌及び食道癌、並びに正常組織におけるＳＴＫ３１発現 癌細胞の生物学的特徴に基づき、治療に適用可能であり得る分子を同定するために、本発明者らは、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、肺癌及びＥＳＣＣの発現プロファイル解析を行った。スクリーニングした２７６４８個の遺伝子の中で、本発明者は、調べた肺癌及び食道癌の試料の大部分で、ＳＴＫ３１が過剰発現することを同定した。本発明者らは、１５個の内８個の肺癌組織、２３個の内１１個の肺癌細胞株（図９Ａ）、１０個の内４個のＥＳＣＣ組織、及び１０個の内７個のＥＳＣＣ細胞株（図９Ｂ）で、半定量ＲＴ−ＰＣＲ実験によってその過剰発現を確認した。癌細胞における内因性ＳＴＫ３１タンパク質の細胞内局在性を求めるために、本発明者らは、抗ＳＴＫ３１抗体及びＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞を使用して免疫蛍光解析を行い、ＳＴＫ３１が腫瘍細胞の細胞質及び核に位置することを見出した（図９Ｃ）。
プローブとしてＳＴＫ３１のｃＤＮＡ断片を使用したノーザンブロット解析によって、調べた２３個のヒト組織の中で睾丸のみで３．６ｋｂの転写産物が同定された（図９Ｄ）。さらに本発明者らは、免疫組織化学解析によって、抗ＳＴＫ３１ポリクローナル抗体を使用して、５つの正常組織（心臓、腎臓、肝臓、肺及び睾丸）でのＳＴＫ３１タンパク質発現を、肺癌でのＳＴＫ３１タンパク質発現と比較した。ＳＴＫ３１は睾丸（細胞質及び／又は核）および肺癌で発現したが、その発現は、残りの４つの正常組織ではほとんど検出することができなかった（図１０Ａ）。
（２）ＳＴＫ３１発現と予後不良との関連性
肺癌形成におけるＳＴＫ３１の生物学的及び臨床病理学的な有意性を研究するために、本発明者らは、根治性の外科的切除を受けたＮＳＣＬＣの３６８症例由来の組織切片を含有する組織マイクロアレイで、免疫組織化学染色を実施した。ＳＴＫ３１に特異的なポリクローナル抗体によるＳＴＫ３１染色は主に、腫瘍細胞の核及び細胞質で観察されたが、正常細胞では検出されなかった（図１０Ｂ）。３６８個のＮＳＣＬＣの中で、ＳＴＫ３１は、２３５症例（６３．９％）で陽性染色され（スコア１＋）、１３３症例（３６．１％）で染色されなかった（スコア０）。それから本発明者らは、ＳＴＫ３１発現（陽性対陰性）と様々な臨床病理学的パラメータとの相関関係を調べ、組織型（非ＡＤＣでより高い、Ｐ＝０．００３３、フィッシャーの直接確率検定）及び喫煙歴（喫煙者でより高い、Ｐ＝０．０４４６、フィッシャーの直接確率検定）との有意な相関関係を見出した（表５Ａ）。ＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値が、ＳＴＫ３１の発現に応じて有意に短くなった（Ｐ＝０．０１７８、ログランク検定、図１０Ｃ）。また本発明者らは、患者の予後と、年齢（６５歳未満対６５歳以下）、性別（男性対女性）、病理的腫瘍段階（腫瘍サイズ、Ｔ１＋Ｔ２対Ｔ３＋Ｔ４）、病理的節段階（節の状況、Ｎ０＋Ｎ１対Ｎ２）、組織型（ＡＤＣ対非ＡＤＣ）、及び喫煙歴（非喫煙者対喫煙者）を含む他の因子との関連性を評価するために、単変量解析を適用した。これらのパラメータの中で、ＳＴＫ３１状況（Ｐ＝０．０１７８）、男性（Ｐ＝０．０００５）、進行性ｐＴ段階（Ｐ＝０．０００５）、進行性ｐＮ段階（Ｐ＜０．０００１）、非ＡＤＣ組織分類（Ｐ＝０．０１１５）、及び喫煙歴（Ｐ＝０．０２９７）が、予後不良に有意に関連していた（表５Ｂ）。予後因子の多変量解析では、ＳＴＫ３１状況は、この試験で登録された外科的治療を受けたＮＳＣＬＣ患者に対する独立予後因子として統計的に有意なレベルに達していなかったが（Ｐ＝０．０８２９）、ｐＴ及びｐＮ段階、並びに性別は統計的に有意なレベルに達しており（それぞれ、Ｐ＝０．００１７、Ｐ＜０．００９０、及びＰ＜０．０００１）、このことは、肺癌におけるＳＴＫ３１発現とこれらの臨床病理学的因子との関連性を実証していた（表５Ｂ）。
（表５Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＳＴＫ３１陽性度と患者の特徴との間の関連性（ｎ＝３６８）
Figure 2010536367
（表５Ｂ）ＮＳＣＬＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
Figure 2010536367
（３）ＳＴＫ３１の成長促進効果
ＳＴＫ３１が肺癌細胞の成長又は生存に必須であるか否かを判定するために、本発明者らは、ＳＴＫ３１に対するｓｉＲＮＡを発現するプラスミドを構築した（ｓｉ−ＳＴＫ３１−＃１及びｓｉ−ＳＴＫ３１−＃２）。これらのｓｉＲＮＡのそれぞれ、又は対照としてＥＧＦＰ及びルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡをＬＣ３１９細胞及びＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞にトランスフェクトした（ＬＣ３１９の代表的なデータを図１１Ａ〜図１１Ｃに示す）。本発明者らがｓｉ−ＳＴＫ３１−＃１構築物及びｓｉ−ＳＴＫ３１−＃２構築物を使用した場合、ノックダウン効果をＲＴ−ＰＣＲで確認した（図１１Ａ）。ＬＣ３１９を用いたＭＴＴアッセイ及びコロニー形成アッセイによって、ｓｉ−ＳＴＫ３１−＃１及びｓｉ−ＳＴＫ３１−＃２をトランスフェクトした細胞の数が劇的に減少することが示された（図１１Ｂ及び図１１Ｃ、Ｐ＜０．００１）。次に本発明者らは、細胞成長の促進におけるＳＴＫ３１の役割を調べた。本発明者らは、ＳＴＫ３１を発現するように設計されたプラスミド（ｐＣＡＧＧＳｎ−ＳＴＫ３１−３×Ｆｌａｇ）を調製し、それらをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。図１１Ｄで示されるように、ＳＴＫ３１のｃＤＮＡのＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクションが、モックベクターのものに比べて、ＣＯＳ−７細胞の成長を有意に高めた。
（４）ＳＴＫ３１組換えタンパク質のキナーゼ活性
ＳＴＫ３１のキナーゼ活性を調べるために、本発明者らは、組換えＳＴＫ３１タンパク質及びＭＢＰ（普遍的（universal）基質として）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行い、１５ｋＤａのリン酸化ＭＢＰタンパク質を検出し、このことは、ＳＴＫ３１タンパク質がキナーゼ活性を有すると考えられることを示していた（図１２Ａ）。
（５）ＳＴＫ３１に対する下流標的としてのＥＧＦＲ（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）及びｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）の同定
発癌におけるＳＴＫ３１キナーゼの機能を解明するために、本発明者らは、ＳＴＫ３１シグナル伝達を介してリン酸化し、且つ細胞増殖シグナル伝達を活性化する、基質及び／又は下流の標的タンパク質を同定しようとした。本発明者らは、ＳＴＫ３１発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の細胞溶解物と、癌細胞シグナル伝達に関連したリンタンパク質に特異的な一連の抗体とを使用して、ＳＴＫ３１に対するキナーゼ基質の免疫ブロットスクリーニングを実施した（表２を参照されたい）。本発明者らは、合計２６個のリンタンパク質をスクリーニングし、ＥＧＦＲのＳｅｒ１０４６／１０４７及びＥＲＫのＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）が、モックベクターをトランスフェクトした細胞に比べて、ＳＴＫ３１発現ベクターをトランスフェクトした細胞で有意にリン酸化したことを見出した（図１２Ｂ）。その後本発明者らは、組換えＳＴＫ３１をＣＯＳ−７細胞から調製された全抽出物とインキュベートすることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを実施した。ＥＲＫ（Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）に対するリン特異的な抗体を用いたウェスタンブロット解析（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）によって、組換えＳＴＫ３１が、用量依存的にＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４でＥＲＫ（Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）のリン酸化を特異的に誘導することが見出された（図１２Ｃ）。
（６）ＭＡＰＫ経路におけるＳＴＫ３１の関与
ＳＴＫ３１によるＥＲＫ（ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のリン酸化機構を求めるために、ＳＴＫ３１発現ベクターをトランスフェクトした細胞でのＥＲＫの上流経路の活性化を調べようとした。ＳＴＫ３１の発現が、ＣＯＳ−７細胞及びＳＢＣ−５細胞でのＭＥＫ（ＭＥＫ１／２）のリン酸化を増大させた（図１２Ｄ）。さらに、ＳＢＣ−５細胞におけるＥＲＫ１／２及びＭＥＫの両方のリン酸化は、に対するｓｉＲＮＡによるＳＴＫ３１発現の抑制に応じて低減した（図１２Ｅ）。さらに本発明者らは、ＳＴＫ３１発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞由来の溶解物を用いた免疫沈降によって、外因性ＳＴＫ３１が内因性ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ及びＥＲＫ１／２と結合することができることが確認され、このことは、ＳＴＫ３１過剰発現によってＭＡＰＫシグナルが活性化する可能性があることを示唆していた。
（７）考察
肺癌及びＥＳＣＣは、近代的な手術法及び補助的な化学療法にもかかわらず、悪性腫瘍の中で最も不良な予後を示すと考えられる。近年になって、癌細胞で特異的に発現した分子の同定によって、癌治療に対する分子標的化剤が開発された。しかしながら、現在利用可能な治療に対して良好な応答を示す患者の割合は依然として非常に限定されている。したがって、有害反応の危険性が最小限である有効な抗癌治療剤を開発することが急務である。この目的に対して、本発明者らは、２７６４８個の遺伝子を含有するｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、レーザーマイクロダイセクションすることによる癌細胞の濃縮後に、１０１個の肺癌細胞及び１９個のＥＳＣＣ細胞の全ゲノム発現プロファイル解析を実施した（Kikuchi T, et al., Oncogene. 2003 Apr 10;22（14）:2192-205、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May;1（7）:485-99、Kikuchi T, et al., Int J Oncol. 2006 Apr;28（4）:799-805、Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29（3）:567-75、Yamabuki T, et al., Int J Oncol. 2006 Jun;28（6）: 1375-84）。この解析によって、本発明者らは、癌試料で有意に上方制御したが、正常組織ではほとんど発現しなかった、幾つかの候補分子標的遺伝子を同定した。本発明者らは、ｓｉＲＮＡ技法と、数百ものアーカイブＮＳＣＬＣ組織試料から成る組織マイクロアレイとを用いて、標的化遺伝子が、肺癌細胞の生存／成長及び腫瘍進行に必須であるか否かを検証した（Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov l;63（21）:7038-41; Cancer Res. 2005 Dec 15;65（24）:11314-25; Mol Cancer Ther. 2007 Feb;6（2）:542-51、Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res. 2004 Dec 15;10（24）:8363-70; Cancer Res. 2005 Oct 15;65（20）:9176-84; Cancer Sci. 2006 Aug;97（8）:737-45、Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65（13）:5638-46; Clin Cancer Res. 2007 Jan 15;13（2 Pt 1）:434-42、Furukawa C, et al., Cancer Res. 2005 Aug 15;65（16）:7102-10、Takahashi K, et al., Cancer Res. 2006 Oct 1;66（19）:9408-19、Hayama S, et al., Cancer Res. 2006 Nov 1;66（21）: 10339-48; Cancer Res. 2007 May 1;67（9）:4113-22、Yamabuki T, et al., Cancer Res. 2007 Mar 15;67（6）:2517-25）。この系統的アプローチによって、本発明者らは、ＳＴＫ３１が臨床肺癌試料及びＥＳＣＣ試料の大部分で過剰発現することを見出し、この分子が癌細胞の成長及び進行に必須であることを同定した。
マウスの精原細胞で発現するが、体細胞組織では発現しない遺伝子に関する系統的アプローチにおいて、Wang et al.（Wang PJ, et al., Nat Genet. 2001 Apr;27（4）:422-6）は、雄生殖細胞のみで発現する２５個の遺伝子（この内１９個はこれまでに知られていなかった）を同定し、これらの遺伝子の１つがＳＴＫ３１であった。ＳＴＫ３１は、Ｎ末端に、ＲＮＡ結合に関与することが知られたチューダードメインと、Ｃ末端にＳｅｒ／Ｔｈｒ−キナーゼタンパク質キナーゼドメインとを含有する１１５ｋＤａのタンパク質をコードするが、その生理学的機能は依然として明らかになっていない。ＳＴＫ３１は、Ｋｉｎｏｍｅの系統樹によって非常に特徴的なカテゴリに分類される（http://www.cellsignal.com/reference/kinase/kinome.jsp）。ＰＫＲはＳＴＫ３１の構造的相同体と考えられる。ＰＫＲタンパク質キナーゼはまた、Ｎ末端ドメインを有する二本鎖ＲＮＡと結合し、Ｃ末端Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインを有する。
活性化ＲＮＡ及びＡＴＰと結合すると、ＰＫＲは、自己リン酸化反応を受け、真核生物の開始因子２のαサブユニット（ｅｌＦ２α）をリン酸化し、ｅｌＦ２複合体の機能及び翻訳の連続開始を阻害する（Manche L, et al., Mol Cell Biol. 1992 Nov;12（11）:5238- 48、Jammi NV & Beal PA. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 15;29（14）:3020-9、Kwon HC, et al., Jpn J Clin Oncol. 2005 Sep;35（9）:545-50. Epub 2005 Sep 7）。近年、幾つかのセリンスレオニンキナーゼが、癌に良好な治療標的であると考えられている。セリンスレオニンキナーゼの成員に属するタンパク質キナーゼＣβ（ＰＫＣβ）は、致死／難治性の広範な大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）で過剰発現し、抗腫瘍療法に対する標的であることが見出された（Goekjian PG & Jirousek MR. Expert Opin Investig Drugs. 2001 Dec;10（12）:2117-40）。
第ＩＩ相試験は、再発性又は難治性のＤＬＢＣＬの患者において、ＰＫＣβの阻害剤であるエンザスタウリンを用いて実施した（Goekjian PG & Jirousek MR. Expert Opin Investig Drugs. 2001 Dec;10（12）:2117-40）。この試験では、ＳＴＫ３１は、肺癌及び食道癌で過剰発現したが、睾丸を除く正常組織では検出されなかったことを見出した。
本発明者らは、ＳＴＫ３１が哺乳動物細胞に対する成長促進効果を有し、またタンパク質キナーゼ活性を有することも証明し、このことによって、ＳＴＫ３１が治療標的として有用であることが実証された。興味深いことに、哺乳動物細胞におけるＳＴＫ３１の誘導によって、ＥＧＦＲ（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）及びＭＥＫ（Ｓ２１７／２２１）のリン酸化が促進され、ＳＴＫ３１はｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ１／２及びＥＲＫ１／２と相互作用し得る。このデータによって、これらの分子がＳＴＫ３１の下流の標的であることが示唆される。ＥＧＦＲのＳｅｒ１０４６／１０４７が、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭキナーゼＩＩ）によってリン酸化されることが示され、そのリン酸化がＥＧＦＲキナーゼ活性を減衰した（Robertson MJ, et al., J Clin Oncol. 2007 May l;25（13）:1741-6. Epub 2007 Mar 26、Feinmesser RL, et al., J Biol Chem. 1999 Jun 4;274（23）:16168-73、Countaway JL, et al., J Biol Chem. 1992 Jan 15;267（2）:1129-40）。またＣａＭキナーゼＩＩは、細胞の成長及び分化を調節するＥＲＫ（Ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）活性化を引き起こすことが報告された（Ginnan R & Singer HA. Am J Physiol Cell Physiol. 2002 Apr;282（4）:C754-61）。また本発明のこれらの結果によって、ＳＴＫ３１がＭＡＰＫカスケードの陽性モジュレータとしてのスキャフォールドタンパク質であるという仮説が立てられる。スキャフォールドタンパク質は、キナーゼシグナル伝達カスケードにおいて特異性に寄与する機構の１つを与える。これらのタンパク質が、シグナル伝達経路の上流及び下流の要素を物理的に結合しまとめることによって、シグナルの効率的且つ特異的な伝達を確実なものにする。ＲＡＳ１（ＫＳＲ１）のキナーゼサプレッサーは推定キナーゼ様ドメインを有するが、ＫＳＲ１が酵素活性を喪失し、またＭＡＰＫカスケードの真のキナーゼ構成要素に対するドッキングプラットフォームとして有用であることが報告されている（Erzsebet Szatmari et al. J. Neurosci. 2007 27: 11389-11400、Juergen Mueller et al. Molecular Cell 2001;8:983-993.、M Therrien, et al. Genes Dev. 1996 10: 2684-2695.、Scott Stewart, et al. Mol. Cell. Biol. 1999 19: 5523-5534.）。
要約すると、癌−睾丸抗原ＳＴＫ３１は、肺癌組織及び食道癌組織の大部分で過剰発現し、その機能的な役割は、癌細胞の成長及び／又は生存に関連があることが同定された。ＳＴＫ３１は肺癌では予後バイオマーカーとして、及び抗癌剤及び癌ワクチンの開発では治療標的として有用である。
実施例５ ＷＤＨＤ１
（１）肺癌及び食道癌、並びに正常組織におけるＷＤＨＤ１発現 早期に癌の存在を検出するのに有用な分子を同定するために、及び癌細胞の生物学的特徴に基づき、治療法を開発するために、本発明者らは、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、肺癌及びＥＳＣＣの全ゲノム発現プロファイル解析を実施した（Kikuchi T, et al., Oncogene. 2003 Apr 10;22（14）:2192-205; Int J Oncol. 2006 Apr;28（4）:799-805、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May;1（7）:485-99; Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13（24）:3029-43. Epub 2004 Oct 20、Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29（3）:567-75、Yamabuki T, et al., Int J Oncol. 2006 Jun;28（6）:1375-84）。
スクリーニングした２７６４８個の遺伝子の中で、本発明者は、調べた肺癌及び食道癌の試料の大部分で癌細胞におけるＷＤＨＤ１転写産物の発現の上昇（３倍以上）を同定した。本発明者らは、１５個の内１４個の肺癌組織、２４個の内２０個の肺癌細胞株、１０個の内６個のＥＳＣＣ組織、及び１０個の内６個のＥＳＣＣ細胞株で、半定量ＲＴ−ＰＣＲ実験によってその過剰発現を確認した（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。その後、本発明者らは、抗ＷＤＨＤ１抗体を使用して肺癌細胞株及び食道癌細胞株における１２６ｋＤａのＷＤＨＤ１タンパク質の過剰発現をウェスタンブロッティング解析によって確認した（図１３Ｃ）。ＮＳＣＬＣ細胞における内因性ＷＤＨＤ１の細胞内局在性を求めるために、本発明者らは、抗ＷＤＨＤ１抗体及びＬＣ３１９細胞を使用して免疫蛍光解析を実施した。ＷＤＨＤ１は、細胞周期を通して、核で豊富に局在化し、細胞質で弱く局在化して、有糸分裂期中、染色体で検出された（図１３Ｄ）。
プローブとしてＷＤＨＤ１のｃＤＮＡを使用したノーザンブロット解析によって、睾丸のみで約５ｋｂの転写産物が同定された（図１４Ａ）。さらに本発明者らは、免疫組織化学解析によって、抗ＷＤＨＤ１ポリクローナル抗体を使用して、５つの正常組織（肝臓、心臓、腎臓、肺及び睾丸）でのＷＤＨＤ１タンパク質発現を、肺癌でのＷＤＨＤ１タンパク質発現と比較した。ＷＤＨＤ１は睾丸（一次精母細胞の核及び／又は細胞質）及び肺癌で豊富に発現したが、その発現は、残りの４つの正常組織ではほとんど検出することができなかった（図１４Ｂ）。
（２）ＷＤＨＤ１発現と予後不良との関連性
肺癌形成及び食道癌形成におけるＷＤＨＤ１の生物学的及び臨床病理学的な有意性を研究するために、本発明者らは、根治性の外科的切除を受けたＮＳＣＬＣの２６４症例及びＥＳＣＣの２９７症例由来の組織切片を含有する組織マイクロアレイで、免疫組織化学染色を実施した。ＷＤＨＤ１に特異的なポリクローナル抗体によるＷＤＨＤ１染色は主に、腫瘍細胞の核及び細胞質で観察されたが、正常細胞では検出されなかった（図１４Ｃ、左側のパネル）。２６４個のＮＳＣＬＣの中で、ＷＤＨＤ１は、１３４症例（５０．８％）で強く染色され、１３０症例（４９．２％）で染色されなかった（詳細は表６Ａに示す）。それから本発明者らは、ＷＤＨＤ１発現と様々な臨床転帰との相関関係を調べた。ＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値が、高い発現レベルのＷＤＨＤ１に応じて有意に短くなった（Ｐ＝０．０２０８、ログランク検定、図２Ｃ、右側のパネル）。また本発明者らは、患者の予後と、年齢、性別、ｐＴ段階（腫瘍サイズ、Ｔ１対Ｔ２＋Ｔ３＋Ｔ４）、ｐＮ段階（節の状況、Ｎ０対Ｎ１＋Ｎ２）、組織型（非ＡＤＣ対ＡＤＣ）、及びＷＤＨＤ１状況（陽性対陰性）を含む幾つかの因子との関連性を評価するために、単変量解析を適用した。これらの全てのパラメータが、予後不良に有意に関連していた（表６Ｂ）。多変量解析では、ＷＤＨＤ１状況は、この試験で登録された外科的治療を受けた肺癌患者に対する独立予後因子として統計的に有意なレベルに達していなかったが（Ｐ＝０．８６６８）、このことは、肺癌におけるＷＤＨＤ１発現とこれらの臨床病理学的因子との関連性を実証していた（表６Ｂ）。
調べたＥＳＣＣの２９７症例の中で、ＷＤＨＤ１は、１８０症例で強く染色され（６０．６％）、１１７症例で染色されなかった（３９．４％）（図１４Ｄ、左側のパネル、詳細を表７Ａに示す）。ＥＳＣＣ患者の生存時間中央値は高い発現レベルのＷＤＨＤ１に応じて有意に短くなった（Ｐ＝０．０２８５、ログランク検定、図１４Ｄ、右側のパネル）。本発明者らは、ＥＳＣＣ患者の予後と、年齢、性別、ｐＴ段階（腫瘍深度、Ｔ１＋Ｔ２対Ｔ３＋Ｔ４）、ｐＮ段階（節の状況、Ｎ０対Ｎ１）、及びＷＤＨＤ１状況（陽性対陰性）を含む幾つかの因子との関連性を評価するために、単変量解析を適用した。年齢を除く全てのこれらのパラメータは予後不良に有意に関連していた（表７Ｂ）。Ｃｏｘ比例障害因子を用いた多変量解析によって、ＷＤＨＤ１（Ｐ＝０．００８５）及び他の３つの因子（男性、より大きい腫瘍サイズ及びリンパ節転移）が、外科治療したＥＳＣＣ患者に対する独立した予後因子であることが求められた（表７Ｂ）。
（表６Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＷＤＨＤ１陽性度と患者の特徴との間の関連性（ｎ＝２６４）
Figure 2010536367
（表６Ｂ）ＮＳＣＬＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
Figure 2010536367
（表７Ａ）ＥＳＣＣ組織におけるＷＤＨＤ１陽性度と患者の特徴との間の関連性（ｎ＝２９７）
Figure 2010536367
（表７Ｂ）ＥＳＣＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
Figure 2010536367
（３）癌細胞の成長に対するＷＤＨＤ１の効果
本発明者らは、ＷＤＨＤ１配列に特異的な幾つかのｓｉＲＮＡ発現オリゴヌクレオチドを構築し、それらを高レベルのＷＤＨＤ１を内因的に発現したＡ５４９細胞株、ＬＣ３１９細胞株及びＴＥ９細胞株にトランスフェクトした。本発明者らがｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃１構築物及びｓｉ−ＷＤＨＤ１−＃２構築物を使用した場合、ノックダウン効果をＲＴ−ＰＣＲで確認した（図１５Ａ及び図１５Ｂ、上部パネル）。ＭＴＴアッセイ及びコロニー形成アッセイによって、ＷＤＨＤ１−ｓｉ２をトランスフェクトした細胞の数が劇的に減少することが示された（図１５Ａ及び図１５Ｂ、中央及び下部のパネル）。フローサイトメトリー解析によって、ＷＤＨＤ１ノックダウンの７２時間後、サブＧ１期における細胞数が増大することが示され、これによってＷＤＨＤ１ノックダウンがアポトーシスを誘導することが実証された（図１５Ｃ）。他方で、ＷＤＨＤ１発現ベクターのＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクションが、モックベクターのものに比べて、細胞の生存率を増大させた（図１５Ｄ）。フローサイトメトリー解析によって、ｓｉ−ＷＤＨＤ１の肺癌細胞Ａ５４９へのトランスフェクションの２４時間〜７２時間後、Ｓ期における細胞数が連続的に減少し、トランスフェクション後４８時間〜７２時間の間で、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の割合が増大したことが示された（図１５Ｅ）。細胞周期に対するＷＤＨＤ１の効果をさらに研究するために、本発明者らは、３０分前にｓｉ−ＷＤＨＤ１に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞を同期させ、これらの細胞周期をモニタリングした。Ｇ０／Ｇ１期における細胞数が増大し、Ｓ期の進行を遅延させ、このことによって、一集団がＳ期に入るのを抑制し、Ｇ０／Ｇ１期に留まらせ、Ｓ期にある他の集団がＧ２／Ｍ期に入るのを抑制することが示唆された（図１５Ｆ）。細胞形態に対するＷＤＨＤ１ノックダウンの効果をさらに研究するために、本発明者らは、低速度顕微鏡法を用いて、ＷＤＨＤ１に対するｓｉＲＮＡで処理したＡ５４９細胞を調べた。対照細胞では約１０時間毎に細胞分裂が観察されたが、ＷＤＨＤ１ノックダウン細胞はゆっくりと分裂し、細胞分裂後すぐに死滅した（図１５Ｇ）。免疫細胞化学解析によって、ＷＤＨＤ１に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした有糸分裂細胞は、比較的正常な紡錘体を有するが、これらの染色体は紡錘体の中央部で集まることなく（congress）、紡錘体全体に分散することが示された。対して、ｓｉ−ＬＵＣで処理した対照細胞は、染色体が中期の赤道面（plate）に十分組織化された正常な中期状態のように集合化した（図１５Ｈ）。
（４）ＷＤＨＤ１のリン酸化
試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥでより長い時間分離すると、ＷＤＨＤ１タンパク質がウェスタンブロット解析により２本のバンドとして検出された。そのため本発明者らは初めに、タンパク質ホスファターゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）の存在又は非存在下でＡ５４９細胞由来の抽出物をインキュベートし、ウェスタンブロッティング解析によって、ＷＤＨＤ１タンパク質の分子量を解析した。予想通り、ホスファターゼで処理された抽出物中の大部分のＷＤＨＤ１タンパク質の測定分子量は、非処理細胞のものより小さかった。このデータによって、ＷＤＨＤ１が肺癌細胞でリン酸化されることが示された（図１６Ａ、左側のパネル）。抗ＷＤＨＤ１抗体でのＷＤＨＤ１の免疫沈降、その後のパン−ホスホ特異的抗体による免疫ブロット法によって、そのセリン残基及びチロシン残基でのＷＤＨＤ１のリン酸化が示された（図１６Ａ、右側のパネル）。
（５）ＷＤＨＤ１の細胞周期依存性の発現
ＷＤＨＤ１の過剰発現がＣＯＳ−７細胞の成長を促進させたので、本発明者らは、細胞周期中のＷＤＨＤ１の発現レベルを調べた。アフィジコリンを用いて、ＬＣ３１９細胞及びＡ５４９細胞を同期させ、Ｇ０／Ｇ１期停止から開放させた後、ウェスタンブロット法によって、ＷＤＨＤ１タンパク質の発現レベルを検出した。ＷＤＨＤ１レベルがＧ１期〜Ｓ期への移行期間で増大し、Ｓ期で最大レベルに達した後、Ｇ２期及びＭ期で低減し、このことによって細胞周期進行におけるその機能的な役割が実証された（図１６Ｂ、図１６Ｃ）。
（６）ＰＩ３Ｋシグナル伝達におけるＷＤＨＤ１の関与
ＷＤＨＤ１リン酸化の重要性を解明するために、次に本発明者らは、ＷＤＨＤ１タンパク質でリン酸化部位をスクリーニングし、これらの１つがＡＫＴキナーゼに対するコンセンサスリン酸化部位（Ｒ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｓ３７４、Olsen JV, et al., Cell. 2006 Nov 3;127（3）:635-48）を有することを見出した。ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ経路は、広範な腫瘍型で活性化されることが知られており、このことが、細胞の成長及び増殖から生存、運動性、上皮間葉転換及び血管形成までの応答カスケードを誘起する（Krystal GW, et al., Mol Cancer Ther. 2002 Sep;1（11）: 913-22、Nguyen DM, et al., J Thorac Cardiovasc Surg. 2004 Feb; 127（2）: 365-75、Kandel ES & Hay N. Exp Cell Res. 1999 Nov 25;253（1）: 210-29、Roy HK, et al., Carcinogenesis. 2002 Jan;23（1）: 201-5、Altomare DA, et al., J Cell Biochem. 2003 Jan 1;88（1）: 470-6、Tanno S, et al., Cancer Res. 2004 May 15;64（10）:3486-90）。
したがって本発明者らは、ＷＤＨＤ１がＰＩ３Ｋ及び／又はＡＫＴ経路に関与するか否かを調べた。ＷＤＨＤ１タンパク質のレベルは、様々な濃度のＬＹ２９４００２（０μｍｏｌ／Ｌ〜４０μｍｏｌ／Ｌ、２４時間）と、キナーゼのＡＴＰ結合部位に指向性を有する、ＰＩ３Ｋの触媒サブユニットの特異的阻害剤とで処理した後、測定し（Vlahos CJ, et al., J Biol Chem. 1994 Feb 18;269（7）:5241-8）、ＡＫＴのリン酸化を低減させ、細胞のＧ１期停止を誘導する（Suzuki C, et al., Cancer Res. 2005 Dec 15;65（24）:11314-25）。ＷＤＨＤ１とリン酸化ＷＤＨＤ１との総量は、ＬＹ２９４００２処理によって有意に低減し、このことによってＷＤＨＤ１がＰＩ３Ｋ経路に対する下流標的であることが示された（図１６Ｄ）。ＷＤＨＤ１がＡＫＴ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１４４３１）の標的であるか否かを調べるために、ＡＫＴ１に対するｓｉＲＮＡで処理したＡ５４９細胞におけるＷＤＨＤ１タンパク質の発現レベルを調べ、予想通りＷＤＨＤ１タンパク質のレベルは低減していた（図１６Ｅ）。本発明者らは次に、ホスホ−ＡＫＴ基質（ＰＡＳ）抗体を用いて、ＣＯＳ−７細胞で外因的に発現した免疫沈降ＷＤＨＤ１を免疫ブロッティングして、内因性ＡＫＴによってリン酸化された可能性があるとして表される陽性バンドを検出した（図１６Ｆ）。また、その後のＰＡＳ抗体による免疫ブロット法と組み合わせた、基質としてＷＤＨＤ１免疫沈降体とキナーゼとしてＡＫＴ１組換えタンパク質（ｒｈＡＫＴ）とを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイが、ＡＫＴによるＷＤＨＤ１の直接リン酸化を証明し（図１６Ｇ）、このことによってＷＤＨＤ１がＡＫＴキナーゼの基質であり得ることが示唆された。ＡＫＴ１によるＷＤＨＤ１上のリン酸化部位（複数可）を研究するために、本発明者らは、ＷＤＨＤ１でのセリン３７４又はセリン１０５８でのコンセンサスＡＫＴリン酸化配列がアラニン（Ｓ３７４Ａ、Ｓ１０５８Ａ）に置き換わり、またこれらのいずれかをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした、ＷＤＨＤ１発現ベクターを構築した。免疫沈降ＷＤＨＤ１の免疫ブロット法、又はその後のＰＡＳ抗体による免疫ブロット法と組み合わせた、免疫沈降ＷＤＨＤ１を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイによって、Ｓ３７４Ａ突然変異体をトランスフェクトした細胞におけるＷＤＨＤ１リン酸化レベルの低減が明らかに示され、このことによってセリン３７４が、ＷＤＨＤ１上の主なＡＫＴ１依存性のリン酸化部位の１つであることが示唆された（図１６Ｈ、図１６Ｉ）。
（７）考察
本発明者らは、２７６４８個の遺伝子を含有するｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、レーザーマイクロダイセクションをすることによる癌細胞の濃縮後に、１０１個の肺癌細胞及び１９個のＥＳＣＣ細胞の全ゲノム発現プロファイル解析を実施した（Kikuchi T, et al., Oncogene. 2003 Apr 10;22（14）:2192-205; Int J Oncol. 2006 Apr; 28（4）:799-805、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003 May; 1（7）:485-99、Hum Mol Genet. 2004 Dec 15;13（24）: 3029-43. Epub 2004 Oct 20、Taniwaki M, et al., Int J Oncol. 2006 Sep;29（3）:567-75、Yamabuki T, et al., Int J Oncol. 2006 Jun;28（6）: 1375-84）。
この解析によって、本発明者らは、有効な診断マーカー、治療剤及び／又は免疫療法の開発に良好な候補である多くの遺伝子を同定した（Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov 1;63（21）:7038-41; Cancer Res. 2005 Dec 15;65（24）:11314-25; Mol Cancer Ther. 2007 Feb;6（2）:542-51、Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res. 2004 Dec 15;10（24）:8363-70; Cancer Res. 2005 Oct 15;65（20）:9176-84; Cancer Sci. 2006 Aug;97（8）:737-45、Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul l;65（13）:5638-46; Clin Cancer Res. 2007 Jan 15;13（2 Pt 1）:434-42、Furukawa C, et al., Cancer Res. 2005 Aug 15;65（16）:7102-10、Takahashi K, et al., Cancer Res. 2006 Oct 1;66（19）:9408-19、Hayama S, et al., Cancer Res. 2006 Nov 1;66（21）: 10339-48; Cancer Res. 2007 May 1;67（9）:4113-22、Yamabuki T, et al., Cancer Res. 2007 Mar 15;67（6）:2517-25）。この試験では、本発明者らは、肺癌及び／又はＥＳＣＣに対する診断及び予後のバイオマーカー（複数可）並びに治療標的に良好な候補としてＷＤＨＤ１を選択し、ヒト肺癌形成及び食道癌形成における役割に対する証拠を与えた。
ノーザンブロット解析及び免疫組織化学解析の結果から、ＷＤＨＤ１は睾丸及び癌細胞でのみ発現された。癌−睾丸抗原（ＣＴＡ）が、癌ワクチンに対するかなり魅力的な標的群として認識された（Li M, et al., Clin Cancer Res. 2005 Mar 1;11（5）: 1809-14）。他の因子、例えばｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質の自然免疫原性（Wang Y, et al., Cancer Immun. 2004 Nov 1,4:11）も重要であるが、ＷＤＨＤ１は、肺癌及びＥＳＣＣの免疫療法に良好な標的である。
ＷＤＨＤ１は、高移動度群（ＨＭＧ）ボックスドメインとＷＤ反復ドメインとを有する１１２９アミノ酸タンパク質をコードする。ＨＭＧボックスは良好に保存されており、Ｌ字型に配置された３つのαへリックスから成り、ＤＮＡ副溝と結合する（Thomas JO & Travers AA. Trends Biochem Sci. 2001 Mar;26（3）: 167-74）。ＨＭＧタンパク質は、配列特異的に又は配列非特異的にＤＮＡと結合し、ＤＮＡ屈曲を誘導し、且つクロマチン機能及び遺伝子発現を調節する（Sessa L & Bianchi ME. Gene. 2007 Jan 31;387（1- 2）:133-40. Epub 2006 Nov 10）。一般的に、ＨＭＧタンパク質は、ヌクレオソームと結合し、基礎的な転写機構と相互作用することによって転写を抑制し、転写コアクチベータとして作用し、又は特定の調節因子が転写の活性因子若しくは抑制因子として機能するか否かを決定することが知られている（Ge H & Roeder RG. J Biol Chem. 1994 ;269: 17136-40、Paranjape SM, et al., Genes Dev 1995;9: 1978-91、Sutrias-Grau M, et al., J Biol Chem. 1999; 274: 1628-34、Shykind BM, et al., Genes Dev 1995; 9:354-65、Lehming N, et al., Nature 1994;371:175-79）。
本明細書で、ＷＤＨＤ１がＡＫＴ１によってリン酸化及び安定化されることが説明された。この広範な機能は一部、ＨＭＧドメインによって与えられたＤＮＡ結合活性に加えて、タンパク質−タンパク質相互作用によっても達成することができる。ＷＤＨＤ１の場合、タンパク質−タンパク質相互作用に関する候補ドメインはＷＤ反復である。ＷＤ反復タンパク質は、シグナル伝達から細胞周期制御までの範囲の細胞機能に寄与し、真核生物及び原核生物にわたって保護される（Li D & Roberts R. Cell Mol Life Sci. 2001; 58:2085-97）。構造解析によって、ＷＤ反復タンパク質が、四本鎖逆平行βシートから成る幾つかのブレードを備えるプロペラ様構造を形成することが明らかにされた。このβプロペラ様構造は、タンパク質が安定して又は可逆的に結合することができるプラットフォームとして働く（Li D & Roberts R. Cell Mol Life Sci. 2001; 58:2085-97）。タンパク質とＷＤＨＤ１との相互作用の証拠は、ＷＤＨＤ１機能（複数可）を理解するのに役立ち得る。
細胞シグナル伝達機構は頻繁に、最も重要な可逆的なタンパク質リン酸化である翻訳後タンパク質修飾を介して情報を伝達する。ＷＤＨＤ１配列において幾つかのリン酸化部位が検出されている（Tanno S, et al., Cancer Res. 2004 May 15;64（10）:3486-90 39、Beausoleil SA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Aug 17;101（33）:12130-5. Epub 2004 Aug 9）。抗ＷＤＨＤ１抗体による免疫沈降、その後のパン−ホスホ特異的抗体による免疫ブロット法を用いた本発明者らの実験において、セリン残基及びチロシン残基でのＷＤＨＤ１のリン酸化が示された。ＮｅｔＰｈｏｓ ２．０プログラムを用いて、ＧＳＫ３、ＣａＭＫ２、ＡＫＴ及びＡＬＫがこれらの残基のキナーゼであると予測された（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/、データ図示せず）。ＷＤＨＤ１のリン酸化領域の１つが、ＡＫＴキナーゼに対するコンセンサスリン酸化部位（Ｒ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｓ３７４、Olsen JV, et al., Cell. 2006 Nov 3;127（3）:635-48）を有する。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達は、細胞増殖及び生存に重要である（Liang J & Slingerland JM. Cell Cycle. 2003 Jul-Aug;2（4）:339-45、Hanahan D, Weinberg RA. Cell. 2000 Jan 7;100（1）:57-70、Bellacosa A, et al., Oncogene. 1998 Jul 23;17（3）:313-25）。さらに、ＡＫＴリン酸化は様々なヒト癌において起こることが多く、早期の疾患再発及び予後不良に対する危険因子として認識された（Chen YL, et al., Cancer Res. 2004 Dec 1;64（23）:8723-30、Nicholson KM, et al., Breast Cancer Res Treat. 2003 Sep;81（2）:117-28、Xu X, et al., Oncol Rep. 2004 Jan;11（1）:25-32、Nakanishi K, et al., Cancer. 2005 Jan 15;103（2）:307-12）。本発明者らのデータによって、ＬＹ２９４００２とＡＫＴ１に対するｓｉＲＮＡとを用いたＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の阻害が総ＷＤＨＤ１とリン酸化ＷＤＨＤ１との発現レベルを低減させることが示された。この結果は、ＷＤＨＤ１がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の構成要素の１つとして癌細胞の成長／生存に重要な役割を果たす可能性があることを示している。
この結果は、ＷＤＨＤ１がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の構成要素の１つであり、リン酸化によって安定化されることを示している。他方で、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６Ｋ１シグナル伝達は、サイクリン及びＣＤＫの発現の増大によって、Ｇ１細胞周期の進行を調節する。したがって、ＬＹ２９４００２を用いたＰＩ３Ｋ活性の阻害が、細胞増殖を低減し、且つＧ１細胞周期停止を誘導した（Gao N, et al., Am J Physiol Cell Physiol. 2004 Aug;287（2）:C281-91. Epub 2004 Mar 17）。ＬＹ２９４００２によるＷＤＨＤ１発現の低減がＧ１細胞周期停止に起因するので、本発明者らの実験では、ＷＤＨＤ１の発現レベルはＳ期で高かった。
結論として、ＷＤＨＤ１は、肺癌組織及び食道癌組織の大部分で過剰発現し、癌細胞の成長及び／又は生存に重要な役割を果たす。このデータによって、ＷＤＨＤ１が肺癌及び食道癌の患者を治療するための治療標的及び予後バイオマーカーとして有用であることが示された。
産業上の利用可能性
本発明者らは、細胞成長が、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって抑制されることを示している。したがって、これらの二本鎖分子は、抗癌剤の開発に有用な候補である。例えば、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子タンパク質の発現を阻止する又はその活性を抑える作用物質には、抗癌剤、特に肺癌又は食道癌の治療のための抗癌剤としての治療的有用性が見出され得る。
ヒト遺伝子ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１の発現は、肺癌又は食道癌で顕著に上昇する。したがってこれらの遺伝子は、癌の診断マーカーとして使用することができることが便利であり、これらによってコードされるタンパク質は、癌の診断アッセイに使用され得る。
また、ＥＰＨＡ７は、肺癌患者又は食道癌患者由来の血液試料中で検出される。したがって、ＥＰＨＡ７は血清学的診断マーカーとして使用することができる。
さらに、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１ポリペプチドは、抗癌剤又は癌診断剤の開発に有用な標的である。例えば、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１若しくはＷＤＨＤ１と結合する、又はＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１の発現を阻止する、又はＥＰＨＡ７若しくはＳＴＫ３１のリン酸化活性を抑える、又はＷＤＨＤ１のリン酸化を抑える、又はＥＰＨＡ７とＥＧＦＲとの結合を阻害する作用物質は、抗癌剤又は診断剤、特に肺癌又は食道癌の治療のための抗癌剤として治療的に有用であり得る。

Claims (72)

  1. 単離二本鎖分子であって、細胞に導入されると、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現及び細胞増殖を阻害し、該二本鎖分子は、ＳＴＫ３１では配列番号３８（配列番号５の１７１３〜１７３２ｎｔ位で）及び配列番号３９（配列番号５の２２８９〜２３０８ｎｔ位で）と、ＣＤＣＡ５では配列番号４０（配列番号１の８０８〜８２７ｎｔ位で）及び配列番号４１（配列番号１の４７０〜４８８ｎｔ位で）と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２（配列番号３の２１８２〜２２００ｎｔ位で）及び配列番号４３（配列番号３の１９６８〜１９８７ｎｔ位で）と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４（配列番号７の５７７〜５９６ｎｔ位で）及び配列番号４５（配列番号７の２０４１〜２０６０ｎｔ位で）とから成る群から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡで作用する、二本鎖分子。
  2. 二本鎖を形成するように互いにハイブリダイズする、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、該センス鎖が、ＣＤＣＡ５では配列番号４０及び配列番号４１と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２及び配列番号４３と、ＳＴＫ３１では配列番号３８及び配列番号３９と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４及び配列番号４５とから成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の二本鎖分子。
  3. 介在一本鎖によって連結した前記センス鎖と前記アンチセンス鎖との両方を含む単一オリゴヌクレオチドから成る、請求項２に記載の二本鎖分子。
  4. 一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
    を有する二本鎖であって、式中、
    ［Ａ］は、ＣＤＣＡ５では配列番号４０及び配列番号４１と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２及び配列番号４３と、ＳＴＫ３１では配列番号３８及び配列番号３９と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４及び配列番号４５とから成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
    ［Ｂ］は前記介在一本鎖であり、かつ、
    ［Ａ’］は［Ａ］で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む前記アンチセンス鎖である、請求項３に記載の二本鎖分子。
  5. ３’オーバーハングを含有する、請求項１に記載の二本鎖分子。
  6. 請求項１に記載の二本鎖分子を発現するベクター。
  7. ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子を発現する細胞の成長を阻害又は低減する方法であって、該方法は、少なくとも１つの二本鎖分子又は少なくとも１つの二本鎖分子を発現するベクターを与える工程を含み、該二本鎖分子又は該ベクターが細胞に導入され、該遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現を阻害又は低減する、方法。
  8. 前記二本鎖分子が請求項１に記載される二本鎖分子である、請求項７に記載の方法。
  9. ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子を発現する癌を治療又は予防する方法であって、該方法は、少なくとも１つの二本鎖分子又は少なくとも１つの二本鎖分子を発現するベクターを投与する工程を含み、該二本鎖分子又は該ベクターが細胞に導入され、該遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現を阻害又は低減する、方法。
  10. 前記二本鎖分子が請求項１に記載される二本鎖分子である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記癌が肺癌及び／又は食道癌である、請求項９に記載の方法。
  12. ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子を発現する細胞の成長を阻害又は低減する組成物であって、少なくとも１つの二本鎖分子又は少なくとも１つの二本鎖分子を発現するベクターを含み、該二本鎖分子又は該ベクターが細胞に導入され、該遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現を阻害又は低減する、組成物。
  13. 前記二本鎖分子が請求項１に記載される二本鎖分子である、請求項１２に記載の組成物。
  14. ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子を発現する癌を治療又は予防する組成物であって、前記方法が少なくとも１つの二本鎖分子又は少なくとも１つの二本鎖分子を発現するベクターを投与する工程を含み、該二本鎖分子又は該ベクターが細胞に導入され、該遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ発現及び細胞増殖を阻害又は低減する、組成物。
  15. 前記二本鎖分子が請求項１に記載される二本鎖分子である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 肺癌及び／又は食道癌を診断する方法であって、
    （ａ）生体試料において、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子の発現レベルを検出する工程と、
    （ｂ）前記遺伝子の正常対照レベルに対する前記発現レベルの増大を前記疾患と関連付ける工程とを含む、方法。
  17. 前記発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記発現レベルが、
    （ａ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出すること、
    （ｂ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドを検出すること、及び
    （ｃ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドの生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか１つによって検出される、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、請求項１６に記載の方法。
  20. 肺癌及び／又は食道癌の患者の予後を判定する方法であって、
    （ａ）生体試料において、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子の発現レベルを検出する工程と、
    （ｂ）前記検出された発現レベルを対照レベルと比較する工程と、
    （ｃ）（ｂ）の比較に基づいて、前記患者の予後を決定する工程とを含む、方法。
  21. 前記対照レベルが良好な予後対照レベルであり、該対照レベルに対する前記発現レベルの増大が予後不良と決定される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記増大が前記対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記発現レベルが、
    （ａ）ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出すること、
    （ｂ）ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドを検出すること、並びに
    （ｃ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択されるポリペプチドの生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか１つによって求められる、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、請求項２３に記載の方法。
  25. 被験体においてＥＰＨＡ７ポリペプチドを検出する方法であって、
    （ａ）診断すべき被験体から体液を採取する工程と、
    （ｂ）イムノアッセイによって前記体液中のＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその断片のレベルを求める工程とを含む、方法。
  26. 前記体液が全血、血清及び血漿から成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡである、請求項２５に記載の方法。
  28. さらに
    （ｄ）前記血液試料においてｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを測定する工程と、
    （ｅ）工程（ｅ）で測定された前記ｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを、正常対照のレベルと比較する工程とを含み、前記血液試料において、該正常対照のレベルに比べて高いＥＰＨＡ７及び高いｐｒｏ−ＧＲＰのレベルのいずれか又は両方が、前記被験体が肺癌を患っていることを示す、請求項２５に記載の方法。
  29. さらに
    （ｄ）前記血液試料においてＣＥＡのレベルを測定する工程と、
    （ｅ）工程（ｅ）で測定された前記ＣＥＡのレベルを、正常対照のレベルと比較する工程とを含み、前記血液試料において、該正常対照のレベルに比べて高いＥＰＨＡ７及び高いＣＥＡのレベルのいずれか又は両方が、前記被験体が肺癌を患っていることを示す、請求項２５に記載の方法。
  30. 肺癌及び／又は食道癌を検出するキットであって、
    （ａ）血液試料においてＥＰＨＡ７のレベルを測定する、イムノアッセイ試薬と、
    （ｂ）ＥＰＨＡ７で陽性の対照試料とを含む、キット。
  31. ＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰを検出する試薬をさらに含む、請求項３０に記載のキット。
  32. ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する癌を診断、治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験作用物質を前記遺伝子でコードされるポリペプチド又はその断片に接触させる工程と、
    （ｂ）前記ポリペプチドと前記試験作用物質との結合を検出する工程と、
    （ｃ）工程（ａ）の前記ポリペプチドと結合する前記試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  33. ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験作用物質を、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド又はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞に接触させる工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの発現レベルを検出する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  34. ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験作用物質を、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド又はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞に接触させる工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの生物活性を検出する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記生物活性を、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記生物活性を低減する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  35. 前記生物活性が、
    （ａ）増殖活性、
    （ｂ）浸潤活性、及び
    （ｃ）キナーゼ活性から成る群から選択される活性のいずれか１つである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記キナーゼ活性が、ＥＧＦＲ、ＰＬＣγ、ＣＤＣ２５、ＭＥＴ、Ｓｈｃ、ＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３及びＭＥＫ１／２から成る群から選択される遺伝子のリン酸化レベルによって検出される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記リン酸化レベルが、
    （ａ）ＥＧＦＲのＹ８４５、Ｙ１０６８、Ｙ１０８６、Ｙ１１７３、Ｓ１０４６又はＳ１０４７、
    （ｂ）ＰＬＣγのＹ７８３、
    （ｃ）ＣＤＣ２５のＳ２１６、
    （ｄ）ＭＥＴのＹ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５、Ｙ１３４９又はＹ１３６５、
    （ｅ）ＳｈｃのＹ３１７、Ｙ２３９、Ｙ２４０、
    （ｆ）ＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）のＴ２０２又はＹ２０４、
    （ｇ）ＡｋｔのＳ４７３、
    （ｈ）ＳＴＡＴ３のＹ７０５、及び
    （ｉ）ＭＥＫ１／２のＳ２１７又はＳ２２１から成る群から選択される残基で検出される、請求項３６に記載の方法。
  38. ＥＰＨＡ７遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＥＧＦＲ、ＰＬＣγ、ＣＤＣ２５、ＭＥＴ、Ｓｈｃ、ＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３及びその機能的等価物から成る群から選択される基質に、該基質をリン酸化させる条件下で試験化合物の存在下において接触させる工程と、
    （ｂ）基質のリン酸化レベルを検出する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて該レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  39. 前記基質のリン酸化レベルが、ＥＧＦＲのＹ８４５、Ｙ１０６８、Ｙ１０８６及び／又はＹ１１７３、ＰＬＣγのＹ７８３、ＣＤＣ２５のＳ２１６、ＭＥＴのＹ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５、Ｙ１３１３、Ｙ１３４９及び／又はＹ１３６５、ＳｈｃのＹ３１７、Ｙ２３９及び／又はＹ２４０、ＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）のＴ２０２及び／又はＹ２０４、ＡｋｔのＳ４７３、及びＳＴＡＴ３のＹ７０５から成る群から選択される残基で検出される、請求項３８に記載の方法。
  40. ＥＧＦＲの前記機能的等価物が配列番号７５のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項３９に記載の方法。
  41. ＭＥＴの前記機能的等価物が配列番号７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記癌が肺癌及び／又は食道癌である、請求項３８に記載の方法。
  43. ＥＰＨＡ７ポリペプチドとＥＧＦＲポリペプチド又はＭＥＴとの結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験作用物質の存在下で、ＥＧＦＲ若しくはＭＥＴポリペプチド又はその機能的等価物に接触させる工程と、
    （ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記結合レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記結合レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  44. ＥＰＨＡ７の前記機能的等価物が前記ＥＧＦＲ結合ドメインを含む、請求項３８に記載の方法。
  45. ＥＧＦＲの前記機能的等価物が配列番号７５のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項３８に記載の方法。
  46. ＭＥＴの前記機能的等価物が配列番号７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項３８に記載の方法。
  47. ＳＴＫ３１遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）ＳＴＫ３１ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）、ＥＧＦＲ及びＭＥＫ１／２から成る群から選択される基質に、該基質をリン酸化させる条件下で試験化合物の存在下において接触させる工程と、
    （ｂ）基質のリン酸化レベルを検出する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて該レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  48. 前記基質のリン酸化レベルが、ＥＲＫ１／２（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）のＴ２０２及び／又はＹ２０４、ＥＧＦＲのＳ１０４６及び／又はＳ１０４７、及びＭＥＫ１／２のＳ２１７及び／又はＳ２２１から成る群から選択される残基で検出される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  50. ＳＴＫ３１ポリペプチドとｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）ポリペプチドとの結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）ＳＴＫ３１ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験作用物質の存在下で、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ若しくはＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）ポリペプチド又はその機能的等価物に接触させる工程と、
    （ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記結合レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記結合レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  51. ＳＴＫ３１の前記機能的等価物が、前記ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）結合ドメインを含む、請求項５０に記載の方法。
  52. ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ）の前記機能的等価物が、前記ＳＴＫ３１結合ドメインを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 癌を治療又は予防する作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験作用物質を、ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞に接触させる工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の前記ポリペプチドをリン酸化させる条件下で培養する工程と、
    （ｃ）工程（ａ）の前記ポリペプチドのホスホセリン又はホスホチロシンレベルを検出する工程と、
    （ｄ）前記工程（ｃ）で検出された前記リン酸化レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程と、
    （ｅ）前記リン酸化レベルを阻害又は低減する前記試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  54. 前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. ＷＤＨＤ１のホスホセリン（phosphor-serine）がＳ３７４である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  57. ＷＤＨＤ１遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）ＷＤＨＤ１をリン酸化させる条件下で試験化合物の存在下において、Ａｋｔポリペプチド又はその機能的等価物をＷＤＨＤ１又はその機能的等価物に接触させる工程と、
    （ｂ）ＷＤＨＤ１のリン酸化レベルを検出する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  58. リン酸化の前記レベルがＷＤＨＤ１のＳ３７４の残基で検出される、請求項５７に記載の方法。
  59. ＣＤＣＡ５ポリペプチドと、ＣＤＣ２又はＥＲＫポリペプチドとの間の相互作用又は結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験作用物質の存在下で、以下の（ｉ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物、及び（ｉｉ）ＣＤＣ２若しくはＥＲＫポリペプチド又はその機能的等価物のポリペプチドを接触させる工程と、
    （ｂ）前記ポリペプチド間の前記相互作用又は前記結合のレベルを検出する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
    （ｄ）前記レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  60. ＣＤＣＡ５の前記機能的等価物が前記ＣＤＣ２相互作用ドメイン又は前記ＥＲＫ相互作用ドメインを含む、請求項５９に記載の方法。
  61. ＣＤＣ２又はＥＲＫの前記機能的等価物が前記ＣＤＣＡ５相互作用ドメインを含む、請求項５９に記載の方法。
  62. ＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性リン酸化又はＥＲＫ媒介性リン酸化を調整する作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験作用物質の存在下で、（ｉ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物、及び（ｉｉ）ＣＤＣ２若しくはＥＲＫポリペプチド又はその機能的等価物のポリペプチドを接触させる工程と、
    （ｂ）（ａ）（ｉ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記リン酸化レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
    （ｄ）阻害剤として前記リン酸化レベルを阻害又は低減する前記試験作用物質を選択する工程、又は促進剤として前記リン酸化レベルを促進する又は高める前記試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  63. ＣＤＣＡ５ポリペプチドの前記機能的等価物が、該ＣＤＣＡ５ポリペプチドの少なくとも１つのＣＤＣ２媒介性リン酸化部位又はＥＲＫ媒介性リン酸化部位を含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記ＣＤＣ２媒介性リン酸化部位が、配列番号２（ＣＤＣＡ５）のセリン−２１、セリン−７５又はスレオニン−１５９であり、前記ＥＲＫ媒介性リン酸化部位が、セリン−２１、スレオニン−４８、セリン−７５、セリン−７９、スレオニン−１１１、スレオニン−１１５、スレオニン−１５９又はセリン−２０９である、請求項６２に記載の方法。
  65. ＣＤＣＡ５を発現する癌を予防又は治療するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験作用物質を、ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞に接触させる工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の前記ポリペプチドをリン酸化させる条件下で培養する工程と、
    （ｃ）工程（ａ）の前記ポリペプチドのリン酸化レベルを検出する工程と、
    （ｄ）前記工程（ｃ）で検出された前記リン酸化レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程と、
    （ｅ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記リン酸化レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
  66. 前記作用物質が、ＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性リン酸化活性又はＥＲＫ媒介性リン酸化活性を阻害又は低減する、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記リン酸化レベルがホスホセリン又はホスホスレオニンのレベルである、請求項６５に記載の方法。
  68. ＣＤＣＡ５のホスホセリンが配列番号２（ＣＤＣＡ５）のセリン−２１、セリン−７５、セリン−７９又はセリン−２０９である、請求項６７に記載の方法。
  69. ＣＤＣＡ５のホスホスレオニンが配列番号２（ＣＤＣＡ５）のスレオニン−４８、スレオニン−１１１又はスレオニン−１１５である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項６５に記載の方法。
  71. ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１又はＷＤＨＤ１遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験作用物質を、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及び／又はＷＤＨＤ１遺伝子の転写調節領域を含むベクターと、該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とが導入された細胞に接触させる工程と、
    （ｂ）前記レポーター遺伝子の活性の発現を測定する工程と、
    （ｃ）前記試験化合物の非存在下でのレベルに比べて前記レポーター遺伝子の活性レベルの発現を低減する化合物を選択する工程とを含む、方法。
  72. 前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項７１に記載の方法。
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