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CN101253195A - 用于在乳酸菌中制备载脂蛋白基因产物的组合物和方法 - Google Patents

用于在乳酸菌中制备载脂蛋白基因产物的组合物和方法 Download PDF

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CN101253195A
CN101253195A CNA2006800312882A CN200680031288A CN101253195A CN 101253195 A CN101253195 A CN 101253195A CN A2006800312882 A CNA2006800312882 A CN A2006800312882A CN 200680031288 A CN200680031288 A CN 200680031288A CN 101253195 A CN101253195 A CN 101253195A
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acid bacteria
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CNA2006800312882A
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吉恩-路易斯·达瑟优克斯
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Cerenis Therapeutics Holding SA
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Abstract

本发明内容涉及用于在乳酸菌中制备重组载脂蛋白的组合物和方法。

Description

用于在乳酸菌中制备载脂蛋白基因产物的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典第35编第119条e款要求2005年8月26日提交的序列号60/712,295的美国申请的权益，其内容通过引用并入本申请。
2.背景技术
循环胆固醇通过两种主要的胆固醇载体一低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)来运输。认为LDL负责从肝脏(在其中它被合成或获自食物来源)运输胆固醇至机体的肝外组织。认为血浆HDL颗粒作为组织胆固醇的清道夫(scavengers)在胆固醇调节中起主要作用。
动脉粥样硬化是一种进行性疾病，其特征为动脉壁中胆固醇积聚。动脉粥样硬化病变中沉积的脂质主要来源于血浆LDL，因此，通常将LDL称为“坏”胆固醇。相比之下，HDL血清水平与冠心病负相关，且因此，认为高血清水平的HDL是负危险因素。因此，通常将HDL称为“好”胆固醇。
HDL的保护机制的最新研究集中于HDL的主要组分一载脂蛋白A-I(ApoA-I)。高血浆水平的ApoA-I与冠心病的缺无或减轻有关(Maciejko等，1983，N Engl J Med 309：385-89；Sedlis等，1986，Circulation 73：978-84)。然而，考虑到低的制备总产率，ApoA-I的治疗用途和ApoA-I的已知变体以及重构的HDL受治疗给药所需的大量载脂蛋白和蛋白质制备的成本限制。因此，需要开发用于制备可用于治疗和/或预防冠状动脉中胆固醇积聚的ApoA-I的可选方法。
3.发明内容
本发明内容提供了用于制备无内毒素的重组载脂蛋白的组合物和方法。可使用本文所述方法制备的重组载脂蛋白包括但不限于：ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V以及ApoE的前原载脂蛋白形式；人类ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV以及ApoE的前体形式和成熟形式；以及活性多晶形式、异构形式、变体和突变体以及截短形式，其中最常见的是ApoA-IM(APOA-IM)和ApoA-IP(ApoA-IP)。
在某些方面，本发明内容提供了表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞以及使用所述载体在不产生内毒素的细菌例如乳酸菌中制备感兴趣的载脂蛋白的方法。合适的乳酸菌包括但不限于乳球菌亚种(Lactococcusspp.)、链球菌亚种(Streptococcus spp.)、乳杆菌亚种(Lactobacillus spp.)、明串珠菌亚种(Leuconostoc spp.)、片球菌亚种(Prediococcus spp.)、短杆菌亚种(Brevibacterium spp.)以及丙酸杆菌亚种(Propionibacterium spp.)。合适的调控核苷酸序列与编码载脂蛋白的核苷酸编码序列操作性连接以在乳酸菌中表达载脂蛋白。调控核苷酸序列包括但不限于组成型启动子和可调节(即诱导型)的启动子。在某些实施方案中，调控序列包括乳酸菌调控序列。
在某些方面，所述方法包括构建重组乳酸菌的步骤，所述重组乳酸菌包含编码载脂蛋白并与合适的调控核苷酸序列操作性连接以控制编码序列的表达的核苷酸序列，所述方法还包括在有效表达载脂蛋白的条件下培养所述重组乳酸菌和从所述乳酸菌或从培养基中收集载脂蛋白的步骤。
所述重组载脂蛋白可用于治疗和/或预防多种疾病和病症，包括血脂障碍，和/或与之有关的各种疾病、疾患和/或病症。
4.详细描述
在候选治疗蛋白的高通量早期发现和高产率制备中，广泛使用基于大肠杆菌(E.coli)的表达系统。然而，并非所有蛋白都能够使用大肠杆菌作为宿主生物体高产率制备。另外，成功的大肠杆菌重组蛋白的表达/纯化取决于能够使纯化的蛋白无污染物例如内毒素的高保真系统。常检测不到获自大肠杆菌的纯化蛋白样品中内毒素的存在。另外，常用于去除污染物的方法例如阴离子交换色谱不能去除内毒素。见例如McKinstry等，2003，Biotechniques 35：724-6。
大肠杆菌中载脂蛋白A-I的产量低，见例如美国专利No.5,059,528及其引用的参考文献；还可见McGuire等，1996，J Lipid Res.37：1519-1528；Panagotopulos等，2002，Protein Expr Purif.25：353-61；以及Ryan等，2003，Protein Expr Purif.27：98-103。去除内毒素所需的纯化步骤可甚至更加减低产率。根据大肠杆菌中表达的重组蛋白，消除污染的内毒素并实现符合动态药品生产管理规范(cGMP)的纯度水平是不可能的。见例如Ma等，2004，Acta Biochim Biophys Sin.36：419-24。例如，载脂蛋白A-1结合内毒素(脂多糖(LPS))并中和其毒性(见例如Ma等，2004，Acta BiochimBiophys Sin.36(6)：419-24)。因此，开发能够使纯化的重组载脂蛋白无内毒素的大肠杆菌高保真度系统是不可能的。载脂蛋白在其他表达系统如酵母和昆虫细胞中的产量也低。见例如美国专利No.5,059,528及其引用的参考文献。
本发明内容提供了用于在不产生内毒素的细菌如乳酸菌中制备重组载脂蛋白的组合物和方法。使用非内毒素细菌例如乳酸菌制备载脂蛋白的优点包括：(1)无内毒素，内毒素是大多数革兰氏阴性细菌细胞壁的组分，但不作为细胞壁组分存在于乳酸菌中；(2)可利用不产生细胞外蛋白酶的乳酸菌菌株包括乳酸乳球菌株；(3)操作乳酸菌容易；(4)乳酸菌分泌稳定且较易于纯化的重组肽、多肽或蛋白的能力；(5)利用发酵代谢(即在缺乏氧气的情况下发生发酵)，发酵代谢通过减轻或消除对避免集中的氧气袋所需的特别设计的设备(如果存在，可减少细胞生长并减低产率)的需要来简化蛋白生产的规模放大；(6)可利用诱导型表达系统来增加表达的基因产物的产率；以及(7)乳酸菌在食品工业中安全使用的长久历史，使得它们成为制备治疗蛋白例如载脂蛋白的具有吸引力的克隆宿主。
4.1乳酸菌
根据上述，本发明内容提供了用于在乳酸菌中表达载脂蛋白的组合物和方法。如本文所使用，术语“乳酸菌”是指革兰氏阳性、微需氧或厌氧菌，其发酵糖而产酸，包括作为主要产生的酸的乳酸。通常，所述方法和组合物利用工业上使用的乳酸菌，例如乳球菌亚种、链球菌亚种、乳杆菌亚种、明串珠菌亚种、片球菌亚种、短杆菌亚种以及丙酸杆菌亚种。属于严格厌氧类的产乳酸菌一双歧杆菌(即双歧杆菌亚种(Bifidobaterium spp.)，也可包括在乳酸菌家族中，其通常单独或结合乳酸菌用作食品发酵剂。
应知道其他不产生内毒素的细菌包括本领域技术人员已知的其他革兰氏阳性细菌可用于制备重组载脂蛋白，使得重组载脂蛋白的制备范围不限于上述的乳酸菌。
可将重组乳酸菌构建成包含编码载脂蛋白的核苷酸序列。使用本领域公知的方法可将编码载脂蛋白的核苷酸序列任选连接至合适的调控核苷酸序列以调节编码序列的表达(见例如Sambrook等，1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY)。另外，已经分析了来自不同乳酸杆菌种的许多已测序基因的密码子使用模式，使得如果需要开发绕过密码子偏倚的方法成为可能。见例如Pouwels和Leunissen，1994，Nucleic Acids Res.22：929-936。
4.2载脂蛋白和载脂蛋白肽
乳酸菌中重组表达的载脂蛋白的性质对于成功来说并非关键。实际上如本文所述提供治疗性和/或预防性优点的任何载脂蛋白和/或其衍生物或类似物可于乳酸菌家族包括的较多成员之一中表达。另外，任何α螺旋肽或肽类似物或因当与脂质结合时可激活LCAT或形成盘状颗粒而“模拟”载脂蛋白(例如ApoA-I)活性的任何其他类型的分子可于乳酸菌中重组表达，并因此包括在“载脂蛋白”的定义中。合适的载脂蛋白的实例包括但不限于：ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V以及ApoE的前原载脂蛋白形式；人类ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV以及ApoE的前体形式和成熟形式；以及活性多晶形式、异构形式、变体和突变体以及截短形式，其中最常见的是ApoA-IM(APOA-IM)和ApoA-IP(ApoA-IP)。ApoA-IM是ApoA-I的R173C分子变体(见例如Parolini等，2003，J Biol Chem.278(7)：4740-6；Calabresi等，1999，Biochemistry 38：16307-14；以及Calabresi等，1997，Biochemistry 36：12428-33)。ApoA-IP是ApoA-I的R151分子变体(见例如Daum等，1999，J Mol Med.77(8)：614-22)。也已知并也可以使用含有半胱氨酸残基的载脂蛋白突变体(见例如美国公布2003/0181372)。载脂蛋白可为单体或二聚体形式，所述二聚体形式可为同二聚体或异二聚体。例如，可以使用前体ApoA-I和成熟ApoA-I(Duverger等，1996，ArteriosclerThromb Vase Biol.16(12)：1424-29)、ApoA-IM(Franceschini等，1985，J BiolChem.260：1632-35)，ApoA-IP(Daum等，1999，J Mol Med.77：614-22)、ApoA-II(Shelness等，1985，J Biol Chem.260(14)：8637-46；Shelness等，1984，J Biol Chem.259(15)：9929-35)、ApoA-IV(Duverger等，1991，Euro JBiochem.201(2)：373-83)、ApoE(McLean等，1983，J Biol Chem.258(14)：8993-9000)、ApoJ以及ApoH的同二聚体和异二聚体(可行的情况中)。载脂蛋白可包括对应于利于其分离的元件例如His标签或设计用于其他目的的其他元件的残基，只要当载脂蛋白包括在络合物中时保留某些生物活性。
在某些实施方案中，编码载脂蛋白的核苷酸序列获自人类。人类载脂蛋白序列的非限制性实例公开于美国专利No.5,876,968、5,643,757和5,990,081，以及WO 96/37608；它们的内容通过引用完整并入本申请。
除了上述参考文献以外，人类载脂蛋白的序列包括可于各序列数据库获得的序列，例如Genbank。例如人类ApoA-1的Genbank登录号包括但不限于NP_000030和AAB59514、P02647、CAA30377以及AAA51746。人类ApoA-II的Genbank登录号包括但不限于NP_001634和P02652。人类ApoA-IV的Genbank登录号包括但不限于AAB50137、P06727、NP_000473以及NP_001634。人类ApoA-V的Genbank登录号包括但不限于NP_443200、AAB59546以及Q6Q788。人类ApoE的Genbank登录号包括但不限于Q6Q788、P02649、AAB50137、BAA96080、AAG27089、AAL82810、AAB59546、AAB59397、AAH03557、AAD02505、NP_000032以及AAB59518。
在某些实施方案中，编码载脂蛋白的核苷酸序列获自非人类(见例如美国公布2004/0077541，其内容通过引用完整并入本申请)。载脂蛋白A-I蛋白已经在许多非人类动物中得以鉴定，例如奶牛、马、绵羊、猴子、狒狒、山羊、家兔、狗、刺猬、獾、小鼠、大鼠、猫、豚鼠、仓鼠、鸭、鸡、鲑鱼以及鳗鱼(Brouillette等，2001，Biochim Biophys Acta.1531：4-46；Yu等，1991，Cell Struct Fund.16(4)：347-55；Chen和Albers，1983，BiochimBiophys Acta 753(1)：40-6；Luo等，1989，J Lipid Res0(11)：1735-46；Blaon等，1977，Biochemistry 16：2157-63；Sparrow等，1995，J Lipid Res.36(3)：485-95；Beaubatie等，1986，J Lipid Res.27：140-49；Januzzi等，1992，Genomics14(4)：1081-8；Goulinet和Chapman，1993，J Lipid Res.34(6)：943-59；Collet等，1997，J Lipid Res.38(4)：634-44；以及Frank和Marcel，2000，J Lipid Res.41(6)：853-72)。
源自非人类动物种的载脂蛋白A-I蛋白具有相似大小(Mr~27,000-28,000)并具有相当大的同一性(Smith等，1978，Ann Rev Biochem.47：751-7)。例如，牛ApoA-I蛋白包含241个氨基酸残基并可形成一连串重复的两亲α螺旋区。牛ApoA-I蛋白中具有10个两亲α螺旋区，通常存在于下列残基之间：43-64、65-86、87-97、98-119、120-141、142-163、164-184、185-206、207-217以及218-241(见Sparrow等，1992，BiochimBiophys Acta.1123：145-150，和Swaney，1980，Biochim Biophys Acta617：489-502)。使用BLAST程序进行的人类ApoA-I蛋白(GenBank登录号XM_52106或NM_000039)和牛ApoA-I蛋白(GenBank登录号A56858)之间的氨基酸序列比较揭示这些序列具有77％的同一性(Altschul等，1990，J Mol Bio1.215(3)：403-10)。
猪(猪的)ApoA-I蛋白包含约264个氨基酸残基，具有约30,280的分子量。GenBank登录号S31394提供了具有30,254分子量的264个残基的猪ApoA-I序列，而GenBank登录号JT0672提供了具有30,320分子量的265个残基的猪ApoA-I蛋白(还见Weiler-Guttler等，1990，J Neurochem.54(2)：444-450；Trieu等，1993，Gene 123(2)：173-79；Trieu等，1993，Gene134(2)：267-70)。
鸡ApoA-I前体具有264个氨基酸残基，其序列在GenBank登录号LPCHAl提供。Jackson等已描述了包含234个氨基酸残基的母鸡ApoA-I，它具有约28,000的分子量，并且由于存在异亮氨酸而不同于人类ApoA-I(Jackson等，1976，Biochim Biophys Acta.420(2)：342-9)。Yang等描述了包含240个氨基酸残基的成熟鸡ApoA-I蛋白，它与人类的同一性低于50％(还见Yang等，1987，FEBS Lett.224(2)：261-6，Shackelford和Lebherz；1983，J Biol Chem.258(11)：7175-7180，Banjerjee等，1985，J CellBiol 101(4)：1219-1226，Rajavashisth等，1987，J Biol Chem.262(15)：7058-65，Ferrari等，1987，Gene 60(1)：39-46，Bhattacharyya等，1991，Gene104(2)：163-168；Lamon-Fava等，1992，J Lipid Res.33(6)：831-42)。鸡ApoA-I蛋白的圆二色性研究表明所述蛋白以脂质游离态作为两亲α螺旋束构成(Kiss等，1999，Biochemistry 38(14)：4327-34)。鸡、人类、家兔、狗以及大鼠的二级结构特征比较提示人类ApoA-I的ApoA-I二级结构的良好保守性，尤其在所述蛋白的N端2/3(Yang等，1987，FEBS Lett.224(2)：261-6)。
火鸡的脂蛋白研究已经鉴定了认为与人类ApoA-I和ApoA-II类似的ApoA类脂蛋白。火鸡的ApoA-I是具有约27,000分子量的主要的ApoA多肽(Kelley和Alaupovic，1976，Atherosclerosis 24(1-2)：155-75，Kelley和Alaupovic，1976，Atherosclerosis 24(1-2)：177-87)。鸭ApoA-I可包含约246个氨基酸残基并具有约28,744的分子量(GenBank登录号A61448，Gu等，1993，J Protein Chem.12(5)：585-91)。
适于在乳酸菌中表达的对应于载脂蛋白的肽和肽类似物的非限制性实例以及模拟ApoA-I、ApoA-IM、ApoA-II、ApoA-IV以及ApoE活性的激动剂公开于美国专利No.6,004,925、6,037,323、6,046,166以及5,840,688，美国公布2004/0266671、2004/0254120、2003/0171277、2003/0045460以及2003/0087819，它们的内容通过引用完整并入本申请。
4.3乳酸菌表达载体和调控序列
重组乳酸菌可包括操作性连接编码核苷酸序列的至少一个组成型启动子，或至少一个可调节启动子。如本文所使用，术语“操作性连接”是指功能关联的核苷酸序列元件的连接。例如，“操作性连接”的启动子是指该调控元件在相对于核苷酸编码序列的合适位置和方向以控制RNA聚合酶启动和核酸表达(如它影响编码序列的转录)。启动子区可基于任何原核细胞中存在的启动子，且启动子能够在乳酸菌中起作用(如启动操作性连接的核酸序列的表达)，但在某些实施方案中，它衍生自乳酸菌。例如，在某些实施方案中，启动子区可衍生自乳酸乳球菌的启动子区，乳酸乳球菌包括乳酸乳球菌乳亚种，如命名为MG1363的菌株(在文献中也称为乳酸乳球菌乳脂亚种)(Nauta等，1997，Nat Biotechnol.15：980-983)，和乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰变种(Lactococcus lactis subspecies lactis biovar.Diacetylactis)。其他适用于重组乳酸菌构建的启动子区的实例公开于WO94/16086，包括包含启动子P170的区及其衍生物，其实例公开于WO98/10079和美国申请公布No.2002/0137140，其内容通过引用完整并入本申请。
在某些实施方案中，用于表达重组载脂蛋白的乳酸菌可为其中细胞外管家蛋白酶HtrA被灭活的变体。见例如Miyoshi等，2002，Appl EnvironMicrobiol 68：3141-3146，其内容通过引用完整并入本申请。
在某些实施方案中，用于重组乳酸菌的启动子可为可调节或诱导型的启动子。调节或诱导启动子的因素包括可调节启动子序列活性的任何物理和化学因素，包括但不限于：物理条件，例如温度和光线；化学物质，例如IPTG、色氨酸、乳酸盐或尼生素(nisin)；以及环境或生长条件因素，如pH、培养温度以及氧含量。调节启动子活性的其他条件可尤其包括：引发热休克基因表达的温度变动；生长培养基的组成，例如离子强度/NaCl含量；细胞内或培养基中代谢物的积聚，包括乳酸/乳酸盐；必需细胞成分或其前体的存在/缺无；以及细菌的生长期或生长率。见例如美国公布2002/0137140，其内容通过引用完整并入本申请。
已开发了用于乳酸菌的许多诱导型基因表达系统，见例如Kok，1996，Antonie Van Leeuwenhoek.70：129-145；Kuipers等，1997，Trends Biotechnol15：135-40；Djordjevic和Klaenhammer，1998，Mol Biotechnol 9：127-139；Kleerebezem等，1997，Appl Environ Microbiol.63：4581-4584。有用的乳酸菌表达系统包括NICE系统(de Ruyter等，1996，Appl Environ Microbiol.62：3662-3667)，其基于来自调节乳酸乳球菌中抗微生物肽尼生素的生物合成的二组分系统的遗传元件。其他有用的诱导型表达系统包括使用来自乳酸乳球菌噬菌体f31(O′Sullivan等，1996，Biotechnology(N.Y.)，14：82-87；以及Walker和Klaenhammer，1998，J B acteriol 180：921-931)和rlt(Nauta等，1997，Nat Biotechnol.15：980-983)的遗传元件一通过环境变化如pH(Israelsen等，1995，Appl Environ Microbiol.61：2540-2547)、Zn2+(Llull和Poquet，2004，Appl Environ Microbiol.70：5398-5406)、盐浓度(Sanders等，1998，Mol Gen Genet，257：681-685)以及宿主细胞产生的代谢物或通过宿主细胞生长过程中天然存在的条件诱导的启动子。所述启动子尤其包括pH诱导型的P170启动子及其衍生物，如WO 94/16086、WO 98/10079、美国申请公布No.2002/0137140以及Madsen等，1999，Mol Microbiol.107：75-87所公开的。
在某些实施方案中，可将编码载脂蛋白的启动子和核苷酸序列导入乳酸菌的自动复制的复制子上，例如质粒、转座元件、噬菌体或粘粒。在某些实施方案中，可在下述条件下导入启动子和载脂蛋白核苷酸编码序列：即，其中载脂蛋白核苷酸编码序列整合至乳酸菌细胞染色体，以提供载脂蛋白核苷酸编码序列在细菌中的稳定维持。可通过其中基于同源重组、转座子、接合转移以及噬菌体整合酶的整合系统产生整合(见例如Frazier等，2003，Appl Environ Microbiol.69(2)：1121-8.；Christiansen等，1994，JBacteriol.176(4)：1069-76；Romero等，1992，Appl Environ Microbiol.58(2)：699-702.；Romero等，1991，J Bacteriol.173(23)：7599-606.；Leenhouts等，1991，Appl Environ Microbiol.57(9)：2562-7.；Leenhouts等，1990，ApplEnviron Microbiol.56(9)：2726-2735；Chopin等，1989，Appl EnvironMicrobiol.55(7)：1769-74；以及Scheirlinck等，1989，Appl EnvironMicrobiol.55(9)：2130-7)。
在其他实施方案中，可在其中载脂蛋白核苷酸编码序列操作性连接天然存在于所选宿主生物体染色体中的启动子的位置将其导入乳酸菌细胞染色体(见例如Rauch等，1992，J Bacteriol.174(4)：1280-7；Israelsen等，1993，Appl Environ Microbiol.59(1)：21-26.；以及Maguin等，1996，J Bacteriol.178(3)：931-5)。
在某些实施方案中，载脂蛋白核苷酸编码序列操作性连接编码能够使基因产物自细菌分泌出和分泌至培养基的信号肽(SP)的核苷酸序列。适用于乳酸菌的信号肽(包括Usp 45)公开于美国公布2002/0137140，其内容通过引用完整并入本申请。
在某些实施方案中，其他核苷酸序列，例如改进乳酸菌中异源蛋白产生和分泌的那些可用于本文所述的方法和组合物。例如，在某些实施方案中，编码葡萄球菌核酸酶(Nuc)和合成肽LEISSTCDA的核苷酸序列可连接编码载脂蛋白的核苷酸序列。见例如Nouaille等，2005，Braz J Med Biol Res.38：353-359，其内容通过引用完整并入本申请。
在某些实施方案中，被开发用于乳酸菌的表达载体可用于在乳酸菌中表达重组载脂蛋白，包括但不限于pLF22(见例如Trakanov等，2004，Microbiology 73：170-175)和pTREX(见例如Reuter等，2003，″VaccineProtocols，″Methods in Molecular Medicine中87：101-114)。
在不同实施方案中，可培养包含编码载脂蛋白的核苷酸序列的乳酸菌(例如美国公布2002/0137140中公开的)以产生无内毒素的载脂蛋白。所述方法包括在适于载脂蛋白表达的条件下培养转化的乳酸菌，以及从所转化的乳酸菌收集载脂蛋白。可使用本领域技术人员已知的传统技术收获重组细胞和/或载脂蛋白。见例如美国申请公布No.2002/0137140，其内容通过引用完整并入本申请。
在某些实施方案中，将短链酰基磷脂添加至用于培养包含重组载脂蛋白的乳酸菌(如上所述)的培养基(即发酵培养基)。乳酸菌可利用短链酰基磷脂作为营养来源。另外，短链酰基磷脂可用作溶解所表达的载脂蛋白的助剂。可通过添加剪切酰基链、释放短链脂肪酸和短链lysoPL的磷脂酶容易地去除短链酰基磷脂。由于短链脂肪酸和lysoPL可溶，可沉淀并纯化载脂蛋白。
4.4重组载脂蛋白-脂质络合物
在某些实施方案中，本文所述的重组载脂蛋白可以以载脂蛋白-脂质络合物形式配制和给药。该方法具有几个优点，这是因为所述络合物在循环中具有增加的半衰期，特别当所述络合物具有与HDL尤其是原β-1或原β-2HDL群相似的大小和密度时。可通过下述许多方法中的任何方法来方便地制备载脂蛋白-脂质络合物。还见美国专利No.6,004,925，其内容通过引用完整并入本申请。可通过低压冻干制备具有长储存期的稳定制剂。低压冻干的载脂蛋白-脂质络合物可用于制备药物再配制的大体积制剂(bulk)，或制备可在给药于受治疗者之前通过使用无菌水或合适的缓冲液再水化而重新配制的各等份或剂量单位。
本领域技术人员公知的多种方法可用于制备载脂蛋白-脂质囊泡或络合物。至此，可使用许多制备脂质体或脂蛋白体的有用技术。例如，可将载脂蛋白和合适的脂质一起超声处理(使用浴槽式或探针式超声仪)来形成络合物。可选地，可使载脂蛋白和形成的脂质囊泡结合而导致自发形成载脂蛋白-脂质络合物。在又一些其他实施方案中，可通过去污剂透析方法形成载脂蛋白-脂质络合物，例如将载脂蛋白、脂质和去污剂的混合物进行透析以去除去污剂和重构或形成载脂蛋白-脂质络合物(见例如Jonas等，1986，Methods in Enzymol.128：553-582)。
尽管前述方法可行，但各方法表现其自身在成本、产率、重现性和安全性方面的特有的制备问题。用于制备具有与HDL相似特征的载脂蛋白-磷脂络合物的简单方法描述于美国专利No.6,004,925，其内容通过引用完整并入本申请。
可将低压冻干的产品重溶以获得肽-脂质络合物的溶液或悬浮液。至此，使用水溶液再水化低压冻干粉至合适的体积(常为便于静脉注射的5mg肽/ml)。在某些实施方案中，使用磷酸盐缓冲盐水或生理盐水溶液再水化低压冻干粉。可将该混合物进行搅动或涡旋以利于再水化，在大多数情况下，可在等于或大于所述络合物脂质组分的相变温度的温度下进行重溶步骤。
可对所产生的重溶制品等份进行表征以证实所述制品中的所述络合物具有所需大小分布，例如HDL的大小分布。用于该目的的示例方法为凝胶过滤色谱法。在下文所述的操作实施例中，使用Pharmacia Superose 6FPLC凝胶过滤色谱系统。所使用的缓冲液于50mM磷酸盐缓冲液中含有150mM NaCl，pH为7.4。通常的样品体积为20至200微升含有5mg肽/ml的络合物。柱流速为0.5ml/min。一系列具有已知分子量和Stokes半径的蛋白质以及人类HDL可用作校准柱子的标准。可通过254或280nm的吸光度或光散射波长来检测蛋白和脂蛋白络合物。
重组载脂蛋白可与多种脂质络合，包括饱和、不饱和、天然和合成的脂质和/或磷脂。合适的脂质包括但不限于：小烷基链磷脂、卵磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基卵磷脂、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二月硅酰基磷脂酰甘油磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、鞘脂、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬酯酰基磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈基酰磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑鞘磷脂、二棕榈酰基鞘磷脂、二硬酯酰基鞘磷脂、磷脂酸、半乳糖脑苷脂、神经节糖苷、脑苷脂、二月桂酰基磷脂酰胆碱、(1，3)-D-甘露糖基-(1，3)甘油二酯、氨基苯基糖苷、3-胆固醇基-6′-(糖基巯基)己基醚糖脂，以及胆固醇及其衍生物。
在其他实施方案中，可通过使重组载脂蛋白与下列文献中公开的脂质络合而制备重组载脂蛋白-脂质络合物：2005年3月24日提交的题为“Charged Lipoprotein Complexes and Their Uses”的序列号60/665,180的美国申请，和国际申请No.PCT/IB2006/000635。
4.5药物组合物
本发明内容考虑的药物组合物包含本文所述的重组载脂蛋白，或重组载脂蛋白-脂质络合物作为适于体内给药和递送的药学上可接受的载体中的活性成分。在使用载脂蛋白模拟肽的实施方案中，载脂蛋白模拟肽可以以游离酸或碱形式或以药学上可接受的盐形式包括在组合物中。还可使用修饰的蛋白，例如酰胺化、酰化、乙酰化或聚乙二醇化的蛋白。
可注射的组合物包括于水或油载体中的活性成分的无菌悬浮液、溶液或乳浊液。所述组合物还可包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于注射的组合物可以以单位剂量形式例如于安瓿或多剂量容器中提供，并可包含添加的防腐剂。对于输注，可以于由可与带电荷的脂蛋白络合物相容的材料制成的输注盒中提供组合物，所述材料例如乙烯醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)或本领域已知的任何其他相容的材料。
可选地，可注射的组合物可以以粉末形式来提供，所述粉末形式在使用前使用合适的载体包括但不限于无菌无热原水、缓冲液、葡萄糖液等重溶。至此，可低压冻干重组载脂蛋白或可制备共低压冻干的载脂蛋白-脂质络合物。储存的组合物可以以单位剂量形式提供并在体内使用前重溶。
对于延长的递送，可将活性成分配制成用于植入给药的贮积(depot)组合物，例如皮下、皮内或肌肉注射。因此，例如，重组载脂蛋白-脂质络合物或单独重组载脂蛋白可与合适的聚合物或疏水材料(如作为于可接受的油中的乳浊液)一起或于磷脂泡沫或离子交换树脂中配制。
可选地，可使用制备成缓慢释放活性成分的粘着盘或贴片用于经皮吸收的透皮递送系统。至此，渗透促进剂可用于促进活性成分的透皮渗透。通过将本文所述的带电荷的络合物掺入硝酸甘油片用于患有缺血性心脏病和高胆固醇血症的患者来实现特定益处。
可选地，可使用导管或注样器局部或壁内(血管壁内)进行递送(见例如美国申请公布No.2003/0109442)。
如果需要，可以以包装或分配装置提供所述组合物，所述包装或分配装置可包含含有活性成分的一种或多种单位剂量形式。所述包装可包含例如金属或塑料箔，例如泡罩。包装或分配装置可附带用于给药的说明书。
4.6治疗方法
本文所述的重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物和组合物可用于实际上其中脂蛋白络合物已显示有用的每一种目的。在某些实施方案中，所述络合物和组合物可用于治疗或预防血脂障碍和/或实际上与血脂障碍有关的任何疾病、病症和/或疾患。如本文所使用，术语“血脂障碍”或“脂代谢障碍”是指血浆中脂质水平异常升高或降低，包括但不限于与下列病症有关的脂质水平变化：冠心病、冠状动脉疾病、心血管疾病、高血压、再狭窄、血管或血管周围疾病、脂代谢障碍病症、异常脂蛋白血症、高水平低密度脂蛋白胆固醇、高水平极低密度脂蛋白胆固醇、低水平高密度脂蛋白、高水平脂蛋白Lp(a)胆固醇、高水平载脂蛋白B、动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化的治疗和预防)、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(FH)、家族性复合高脂血症(FCH)、脂蛋白脂肪酶缺陷(例如高甘油三酸酯血症、α低脂蛋白血症以及高胆固醇血症脂蛋白)。
与血脂障碍有关的疾病包括但不限于冠心病、冠状动脉疾病、急性冠状动脉综合征、心血管疾病、高血压、再狭窄、血管或血管周围疾病、脂代谢障碍病症、异常脂蛋白血症、高水平低密度脂蛋白胆固醇、高水平极低密度脂蛋白胆固醇、低水平高密度脂蛋白、高水平脂蛋白Lp(a)胆固醇、高水平载脂蛋白B、动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化的治疗和预防)、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(FH)、家族性复合高脂血症(FCH)、脂蛋白脂肪酶缺陷(例如高甘油三酸酯血症、α低脂蛋白血症以及高胆固醇血症脂蛋白)。
在某些实施方案中，所述方法包括一种治疗或预防与血脂障碍有关的疾病的方法，其包括以下述一种量给药于受治疗者重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物：即给药后有效实现游离或络合的载脂蛋白血清水平在高于给药前的基线(初始)水平约10mg/dL至300mg/dL的范围内至少一天的量。
在其他实施方案中，所述方法包括一种治疗或预防与血脂障碍有关的疾病的方法，其包括以下述一种量给药于受治疗者重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物：即给药后有效实现HDL-胆固醇部分的循环血浆浓度高于给药前的初始HDL-胆固醇部分至少约10％至少一天的量。
在其他实施方案中，所述方法包括一种治疗或预防与血脂障碍有关的疾病的方法，其包括以下述一种量给药于受治疗者本文所述的带电荷的脂蛋白络合物或组合物：即有效实现HDL-胆固醇部分的循环血浆浓度在给药后5分钟和1天之间为30和300mg/dL之间的量。
在其他实施方案中，所述方法包括一种治疗或预防与血脂障碍有关的疾病的方法，其包括以下述一种量给药于受治疗者重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物：即有效实现胆固醇酯的循环血浆浓度在给药后5分钟和1天之间为30和300mg/dL之间的量。
在其他实施方案中，所述方法包括一种治疗或防御与血脂障碍有关的疾病的方法，其包括以下述一种量给药于受治疗者重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物：即给药后有效实现粪便胆固醇的分泌增加高于给药前基线(初始)水平至少约10％至少一天。
本文所述的重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物或组合物可单独使用或与其他药物的联合治疗用于治疗或预防前述病症。所述治疗包括但不限于有关药物的同时或顺序给药。例如，在高胆固醇血症或动脉粥样硬化的治疗中，重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物可与一种或多种目前使用的降低胆固醇的治疗一起给药，例如胆汁酸树脂、尼克酸、他汀类(statins)、胆固醇吸收的抑制剂和/或贝特类(fibrates)。这样的联合方案可产生特别有益的治疗作用，这是由于每一种药物作用于胆固醇合成和运输中的不同靶，即，胆汁酸树脂影响胆固醇再循环、乳糜微粒和LDL群，尼克酸主要影响VLDL和LDL群；他汀类抑制胆固醇合成，减小LDL群(并也许增加LDL受体表达)；而本文所述的带电荷的脂蛋白络合物影响RCT，增加HDL并促进胆固醇外流。
在其他实施方案中，重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物可结合贝特类使用来治疗或预防下述疾病：冠心病、冠状动脉疾病、心血管疾病、高血压、再狭窄、血管或血管周围疾病、脂代谢障碍病症、异常脂蛋白血症、高水平低密度脂蛋白胆固醇、高水平极低密度脂蛋白胆固醇、低水平高密度脂蛋白、高水平脂蛋白Lp(a)胆固醇、高水平载脂蛋白B、动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化的治疗和预防)、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症(FH)、家族性复合高脂血症(FCH)、脂蛋白脂肪酶缺陷(例如高甘油三酸酯血症、α低脂蛋白血症以及高胆固醇血症脂蛋白)。
可通过确保循环中生物利用度的任何合适途径进行重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物的给药。例如，可以以增加小HDL部分的剂量进行重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物给药，小HDL部分例如原β、原γ和原β样HDL部分，αHDL部分、HDL3和/或HDL2部分。在某些实施方案中，所述剂量可有效实现动脉粥样硬化斑块减小，如通过例如磁共振成像(MRI)或血管内超声(IVUS)的成像技术测量的。IVUS跟踪的参数包括但不限于粥样斑体积自基线的变化百分数和总的粥样斑体积的变化。MRI跟踪的参数包括但不限于IVUS的那些和脂质组成以及斑块的钙化。
可使用患者作为其自身对照，时间0相对最后输注结束时的时间t，或在最后输注之后的几周内，或在治疗开始的3个月、6个月或1年之内测量斑块的退化。
可通过胃肠外给药途径最佳实现给药，包括静脉内(IV)、肌肉内(IM)，皮内、皮下(SC)以及腹膜内(IP)注射。在某些实施方案中，通过注样器、渗透器或导管给药。在某些实施方案中，通过注射、皮下可植入泵或通过贮积制剂以实现等于通过胃肠外给药获得的循环血清浓度的量进行带电荷的脂蛋白络合物的给药。所述络合物也可在例如支架或其他装置中被吸收。
可通过多种不同治疗方案实现给药。例如，可在一天期间注射不到每日毒性剂量的累积总体积定时进行几次静脉内注射给药。可选地，可约每3至15天、优选约每5至10天和最优选约每10天进行一次静脉内注射。在又一个可选实施方案中，可进行逐渐扩大的剂量的给药，从每次50-200mg之间的剂量约1-5次给药开始，然后是每次200mg和1g之间的重复给药。根据患者的需要，可通过超过1小时的时间缓慢输注、通过1小时或更少时间的快速输注或通过单次快速浓注进行给药。
在某些实施方案中，可作为一系列注射且然后停止6个月至1年，然后开始另一系列来进行给药。可然后每年或每3至5年进行维持系列的注射。该系列注射可经1天(灌注以维持络合物的特定血浆水平)、几天(如经8天的4次注射)或几周(如经4周的4次注射)进行，且然后在6个月至1年之后再开始。
可使用其他给药途径。例如，可通过口服给药途径(包括但不限于食入、口腔和舌下途径)实现通过胃肠道的吸收，条件是合适的制剂(例如肠衣)可用于避免或最小化活性成分的降解，例如在口腔粘膜、胃和/或小肠中的严格环境中。可选地，经粘膜组织的给药例如阴道和直肠给药方式可用于避免或最小化胃肠道中的降解。在其他实施方案中，本发明的制剂可经皮给药(例如透皮)或通过吸入给药。应理解优选的途径可根据受者的病症、年龄和顺应性而不同。
重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物或组合物的实际剂量可根据给药途径而不同。
不同重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物的毒性和治疗功效可使用细胞培养或实验动物中测定LD50(群体半数致死剂量)和ED50(群体半数治疗有效剂量)的标准药学操作来测定。毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数并可表示为LD50/ED50比值。优选表现大治疗指数的重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物。所跟踪的参数的非限制性实例包括肝功能转氨酶(不超过正常基线水平2X)。这表明太多的胆固醇被带到肝脏且肝脏不能同化这样的量。还可检测对红细胞的作用，这是因为胆固醇自红细胞的动员导致它们变得脆弱或影响它们的形状。
可在医学行动(如预防性治疗)之前几天至几周或在医学行动过程中或之后治疗患者。给药可伴随或同时使用其他侵入性治疗，例如血管成形术、颈动脉切开术、旋切术(rotoblader)或器官移植(例如心脏、肾脏、肝脏等)。
在某些实施方案中，将重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物给药于其胆固醇合成受抑制素(statin)或胆固醇合成抑制剂控制的患者。在其他实施方案中，将重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物给药于使用结合树脂例如半合成树脂如考来烯胺(cholestyramine)或纤维素如植物纤维素捕获胆盐和胆固醇来增加胆汁酸分泌和降低血液胆固醇浓度而进行治疗的患者。
4.7其他用途
本文所述的重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物和组合物可用于体外测定以检测血清HDL，如用于诊断目的。因为ApoA-I、ApoA-II以及Apo肽与血清HDL组分结合，重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物可用作HDL群、原β1和原β2HDL群的“标记”。另外，重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物可用作RCT中有效的HDL群的标记。至此，可将重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物添加至患者血清样品或与其混合，在合适的培养时间之后，可通过检测掺入的重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物测定HDL组分。这可使用标记的重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物(如放射标记、荧光素标记、酶标记、染料等)，或通过使用重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物的特异性抗体(或抗体片段)进行免疫测定来实现。
可选地，标记的重组载脂蛋白和/或重组载脂蛋白-脂质络合物可用于成像程序(如CAT扫描、MRI扫描)以观察循环系统或监测RCT或观察HDL在脂肪纹、粥样硬化病变等上的积聚，其中HDL在胆固醇外流中具有活性。
所有引用的参考文献通过引用完整地且用于所有目的并入本申请，达到下述相同程度：即如同各公布、专利或专利申请特别和各自被指定通过引用完整用于所有目的并入本申请。
任何公布的引用为其内容于提交日期之前，且不应理解为承认由于先前发明而使本发明不享受早于这些公布的权利。
对本领域技术人员显而易见的是，在不背离其精神和范围的情况下可进行本发明的许多修改和变动。所述的具体实施方案仅通过举例方式提供，并且本发明仅受附属权利要求的术语及这些权利要求被授权的等同物的整个范围的限制。

Claims (29)

1.一种能够在乳酸菌中表达的表达载体，其包含编码载脂蛋白的核苷酸编码序列，和与其操作性连接以控制所述核苷酸编码序列表达的一个或多个调控核苷酸序列。
2.根据权利要求1的表达载体，其中所述核苷酸编码序列编码人类载脂蛋白。
3.根据权利要求2的表达载体，其中所述核苷酸编码序列编码选自下列的人类载脂蛋白：前原载脂蛋白、前原ApoAI、原ApoAI、ApoAI、前原ApoAII、原ApoAII、ApoAII、前原ApoA-IV、原ApoAIV、ApoAIV、ApoAV、前原ApoE、原ApoE、ApoE、前原ApoA IMilano、原ApoAIMilano、ApoA IMilano、前原ApoA IParis、原ApoA IParis以及ApoA IParis。
4.根据权利要求1的表达载体，其中所述调控核苷酸序列之一包含与所述核苷酸编码序列操作性连接的组成型启动子。
5.根据权利要求1的表达载体，其中所述调控核苷酸序列之一包含与所述核苷酸编码序列操作性连接的可调节启动子。
6.根据权利要求4或5的表达载体，其中所述启动子衍生自乳酸菌。
7.根据权利要求6的表达载体，其中所述启动子受选自pH、温度和氧气的因素的调节。
8.根据权利要求5的表达载体，其中所述可调节启动子是P170启动子。
9.根据权利要求1-8任一项的表达载体，其中所述载体是自动复制的复制子。
10.根据权利要求9的表达载体，其中所述载体选自质粒、转座元件、噬菌体或粘粒。
11.根据权利要求1-8任一项的表达载体，其中所述载体稳定整合至所述宿主细胞染色体。
12.一种包含根据权利要求1、2或3任一项的核苷酸编码序列的乳酸菌。
13.一种包含根据权利要求1-10任一项的表达载体的乳酸菌。
14.一种表达由根据利要求1-10任一项的核苷酸编码序列编码的蛋白质的乳酸菌。
15.根据权利要求12、13或14任一项的所述乳酸菌，其选自乳球菌亚种、链球菌亚种、乳杆菌亚种、明串珠菌亚种、片球菌亚种、短杆菌亚种以及丙酸杆菌亚种。
16.一种由使用权利要求1-11任一项的表达载体转化的乳酸菌生成的无内毒素的载脂蛋白。
17.一种制备无内毒素的载脂蛋白的方法，其包括：
a)在适于表达载脂蛋白的条件下培养包含编码所述载脂蛋白的核苷酸编码序列的乳酸菌；
b)从所述转化的乳酸菌中收集所述载脂蛋白。
18.根据权利要求17的方法，其中使用权利要求1-11任一项的表达载体转化所述乳酸菌。
19.根据权利要求17的方法，其中所述核苷酸编码序列编码人类载脂蛋白。
20.根据权利要求19的方法，其中所述核苷酸编码序列编码选自下列的人类脂蛋白：前原载脂蛋白、前原ApoAI、原ApoAI、ApoAI、前原ApoAII、原ApoAII、ApoAII、前原ApoA-IV、原ApoAIV、ApoAIV、ApoAV、前原ApoE、原ApoE、ApoE、前原ApoA IMilano、原ApoA IMilano、ApoA IMilano、前原ApoA IParis、原ApoA IParis以及ApoA IParis。
21.根据权利要求17的方法，其中所述调控核苷酸序列之一包含与所述核苷酸编码序列操作性连接的组成型启动子。
22.根据权利要求17的方法，其中所述调控核苷酸序列之一包含与所述核苷酸编码序列操作性连接的可调节启动子。
23.根据权利要求21或22的方法，其中所述启动子衍生自乳酸菌。
24.根据权利要求23的方法，其中所述启动子受选自pH、温度和氧气的因素的调节。
25.根据权利要求22的方法，其中所述可调节启动子包括P170启动子。
26.根据权利要求17-25任一项的方法，其中所述载体包括自动复制的复制子。
27.根据权利要求26的方法，其中所述载体选自质粒、转座元件、噬菌体或粘粒。
28.根据权利要求17-25任一项的方法，其中所述载体稳定整合至所述宿主细胞染色体。
29.根据权利要求17的方法，其中所述乳酸菌选自乳球菌亚种、链球菌亚种、乳杆菌亚种、明串珠菌亚种、片球菌亚种、短杆菌亚种以及丙酸杆菌亚种。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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