CN101247829A - 治疗纤维化症候的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗纤维化症候，诸如肝、肾和肺纤维化，以及身体其它组织纤维化的方法。本发明的方法包括对需要所述治疗的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂。可在本发明方法的实施中使用的示例性B细胞拮抗剂包括针对B细胞表面抗原的抗体(例如抗CD20抗体)，以及BAFF拮抗剂。

Description

治疗纤维化症候的方法

发明背景

发明领域

本发明涉及治疗纤维化或纤维化症候的方法。更具体地，本发明涉及使用B细胞拮抗剂或B细胞消减剂来治疗纤维化症候。

相关技术

组织损伤可由多种慢性和急性刺激造成，包括感染、自身免疫反应和机械损伤。正常情况下，愈合过程包括一个由结缔组织代替实质组织的阶段(Wynn，Nature Reviews 4：583-594(2004))。但是如果该过程持续进行而不受抑制，则可能导致永久性瘢痕组织的形成，而且，在某些情况下，可最终导致器官衰竭和死亡。

纤维化症候是以组织损伤后纤维化物质(例如细胞外基质)的异常和/或过度积累为特征的病理状况。纤维化症候包括与血管疾病(诸如心脏疾病、脑疾病和周围血管疾病)相关的增生性纤维化(fibroproliferative)病症，以及包括皮肤、肾、肺、肠和肝在内的所有主要组织和器官系统中的增生性纤维化病症(Wynn，Nature Reviews 4：583-594(2004))。虽然纤维化症候是一大类形形色色的病理，但人们认为对大多数纤维化症候而言，导致纤维化组织积累的一般机制有很多共同因素。

大多数用于治疗纤维化症候的治疗方法以炎症反应为靶标，炎症反应被认为在纤维化的发病过程中普遍地起作用(Wynn，Nature Reviews4：583-594(2004))。治疗纤维化症候的药物策略的例子包括使用免疫抑制药，诸如皮质类固醇，其它传统免疫抑制剂或细胞毒剂以及抗纤维化剂(antifibrotics)。

但是本领域仍需要新的、特异靶向性更强的纤维化症候治疗方法。

发明概述

本发明至少部分地涉及一个出人意料的发现，即在B细胞缺陷或者药理消减了B细胞的小鼠中，实验诱发的纤维化损伤的程度发生了显著降低，从而暗示在动物中消减B细胞或削弱B细胞活性是治疗纤维化症候的有效方法。

因此，本文包括治疗纤维化症候的方法。本发明的方法包括对需要纤维化症候治疗的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂。

由于人们认为纤维化症候是通过类似的生物分子机制发生的，而与所涉及的具体组织无关，因此本发明可以用来治疗影响患者中任何组织的任何纤维化症候。例如，本发明可以用来治疗、减少或延缓肺(肺的)、肾(肾的)、肝(肝的)、皮肤、血管、肠和角膜组织的纤维化。本发明的方法可以用来治疗由包括感染、自身免疫反应、机械创伤、化学品、糖尿病、高血压等在内的任何种类的组织损伤所导致的纤维化症候。在本文其它地方描述了可以用本发明方法加以治疗的具体示例性纤维化症候。

本发明的方法还可以用来在有风险发生纤维化症候的患者中防止纤维化症候的发生。有风险发生纤维化症候的患者包括，例如，已暴露于一种或多种已知可造成或刺激肺、肾或肝中瘢痕组织积累的环境条件的患者。示例性的环境条件包括，例如，烟雾暴露、粉尘暴露、石棉暴露、过度酒精消耗、辐射暴露、暴露于博来霉素、二氧化硅、细菌、病毒等等。在某些实施方案中，有风险发生纤维化症候的患者还包括例如患有糖尿病、慢性哮喘、狼疮、硬皮病、类风湿性关节炎、血管疾病、青光眼、IgA神经病及家族性出血性肾炎的个体，以及经过肺移植和/或肾移植的个体。

可以用于本发明实施中的示例性B细胞拮抗剂包括能够抑制或削弱B细胞的生长、存活、增殖或功能(包括免疫球蛋白的分泌)，或能够导致B细胞死亡或破坏的任何分子或化合物(多肽、配体、融合蛋白、抗体、小分子等等)。根据本发明的B细胞拮抗剂可以，但不一定起消减B细胞的作用。本发明选择的优选实施方案包括使用这样的B细胞拮抗剂，它通过抗体依赖性细胞细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞细胞毒作用(CDC)或细胞凋亡，造成至少一部分循环中的B细胞或其它B细胞的消减(depletion)。为本说明书的目的，此类拮抗剂可以称为B细胞消减剂(Bcell depleting agents)。

在本发明的某些实施方案中，B细胞拮抗剂或消减剂是针对B细胞表面抗原的抗体。在特别优选的实施方案中，B细胞拮抗剂是针对CD20的抗体。在本发明方法的实施中可使用的抗CD20抗体的例子有rituximab

在本发明的其它实施方案中，B细胞拮抗剂是BAFF的拮抗剂或B细胞上表达的BAFF受体(BR3，BCMA，or TACI)的拮抗剂。本领域技术人员会认识到，当B细胞从骨髓转移到脾时——此过程中自身反应性B细胞特别容易变成致病性——BAFF对它们而言是强有力的存活因子。因此，用BAFF拮抗剂阻断BAFF和BR之间的相互作用，能够下调、干扰或抑制潜在自身反应性B细胞的产生。就此而言，有用的拮抗剂可包括抗BAFF抗体(诸如belimumab)、抗BR抗体、与BAFF或BF相互作用的小分子、或基于配体的多肽拮抗剂。在特别优选的实施方案中，BAFF拮抗剂是可溶性分子，它包含与免疫球蛋白恒定区连接的全部或部分BAFF受体。具体示例性BAFF拮抗剂在下文有更详细的讨论。

本发明还包括包含施用多种B细胞拮抗剂的方法。例如，在某些实施方案中，将针对CD20的抗体(例如rituximab)与BAFF拮抗剂一起施用于患者。

本发明还包括如下所述的方法，它们包括施用一种或多种B细胞拮抗剂和一种或多种额外的药剂，其中所述额外的药剂有用于治疗一种或多种纤维化症候。例如，本发明还涵盖这样的方法，它们包括施用一种或多种B细胞拮抗剂和一种或多种整联蛋白受体拮抗剂。本领域技术人员将会理解，整联蛋白拮抗剂可包括肽、抗体、可溶性配体或抑制功能整联蛋白或整联蛋白拮抗剂的功能的小分子，例如，针对α_vβ₆、α_vβ₅、α_vβ₈、α₅β₁、α₁β₁、α₄β₁(VLA-4)、α₄β₇等等的抗体。在本发明背景下特异性结合α₄β₁整联蛋白受体并可以与B细胞拮抗剂组合用于治疗纤维化症候的一种示例性抗体是natalizumab

本发明还涵盖这样的方法，它们包括施用一种或多种B细胞拮抗剂和一种或多种TGF-β途径抑制剂，例如TGF-β配体拮抗剂或TGF-β受体拮抗剂(例如单克隆抗体、可溶性TGF-βRII-Fc融合蛋白、LAP-Fc融合蛋白、TGF-βRI或RII激酶抑制剂、小分子抑制剂等等)。

技术人员将能够容易地确定其它符合本文教导的抗纤维化剂。

本领域技术人员考虑下文对本发明的优选示例性实施方案的详细描述后，将明了本发明的其它目的、特征和优点。

附图简要说明

图1A显示了成年小鼠脾脏、腹腔(PC)和肝脏中的B细胞群体。分离淋巴细胞并用抗IgD(X轴)和抗IgM(Y轴)染色。淋巴细胞中IgM⁺、IgD⁺细胞的百分比表示在图中。图1B显示CD21、CD23和CD5在分离自脾脏、血液、PC和肝脏的B细胞中的表达水平。图1C显示结合于肝B细胞和脾B细胞的Annexin V的量。图1D显示响应于多种刺激的肝内B细胞和脾B细胞增殖及CFSE和CD86(B7.2)上调的程度。

图2A显示的是在B细胞缺陷小鼠(J_H-/-)和野生型小鼠(BALB/c)中根据给予单个CCl₄剂量24小时后肝细胞特异性酶ALT向血浆中的释放所评估的肝脏损伤程度。图2B显示在B细胞缺陷小鼠(J_H-/-)和野生型小鼠(BALB/c)中，给予第6次每周一次的油(对照)或CCl₄剂量后一周时，用胶原特异性染料天狼星红染色的肝组织的组织学分析结果。图2C和2D显示在三次代表性实验中胶原特异性天狼星红染色(以任意单位计)的定量。实验1和2(图2C)显示在给予第6次每周一次的3.5mg/kg CCl₄剂量后一周时，间质胶原沉积的程度；实验3(图2D)在给予第6次每周一次的1.75mg/kg CCl₄剂量后一周时，间质胶原沉积的程度。一列点代表来自一只动物的一系列切片。平均值以短棒表示。

图3显示的是B细胞缺陷小鼠(J_H-/-)和野生型小鼠(BALB/c)接受单次CCl₄刺激后1、3和5天时的肝切片组织学分析结果。对切片进行凋亡特异性TUNEL染色(最上面两行)、平滑肌肌动蛋白染色(αSMA)(中间两行)、或巨噬细胞特异性F4/80染色(最下面两行)。

图4A显示的是同时缺少B细胞和T细胞二者的小鼠(RAG2-/-)和野生型小鼠接受长期CCl₄处理后肝组织胶原沉积的组织学分析结果。图4B显示RAG2-/-小鼠和野生型小鼠在接受长期CCl₄处理后肝组织间质胶原沉积的定量结果。

图5A显示的是表达EB病毒衍生蛋白LMP2a的小鼠和野生型小鼠用每周一次的1.75mg/kg CCl₄处理6次后，肝组织的间质胶原沉积的定量结果。图5B显示的是表达表面Ig的mIgM tg小鼠以及野生型小鼠用每周一次的1.75mg/kg CCl₄处理6次后，肝组织的间质胶原沉积的定量结果。

图6显示的是野生型小鼠“B6BWT”(C57BL/6J)和B细胞缺陷型小鼠“B6BKO”((B6.129S2-lgh-6^tmlCgn/J)以60mg/kg/7d或100mg/kg/7d施用博来霉素或盐水28天后α-平滑肌肌动蛋白的百分比。

图7显示的是野生型小鼠(C57BL/6J)和B细胞缺陷型小鼠(B6.129S2-lgh-6^tmlCgn/J)以100mg/kg/7d施用博来霉素或盐水28天后肺组织的免疫组化分析结果。

图8显示的是野生型小鼠(C57BL/6J，实心方块)和B细胞缺陷小鼠(B6.129S2-lgh-6^tmlCgn/J，空心方块)以100mg/kg/7d施用博来霉素28天后的存活百分比。

图9A、9B、9C、9D显示的是接受单侧输尿管阻塞(Op)或未手术(Unop)的野生型小鼠″B6Bwt″(C57BL/6J)及B细胞缺陷型小鼠″B6Bko″(B6.129S2-lgh-6^tmlCgn/J)中的α-平滑肌肌动蛋白百分比(图9A)、间质纤维化(图9B)、扩张的肾小管(图9C)和健康肾小管(图9D)。

图10显示从接受单侧输尿管阻塞(Op)或未手术的野生型(C57BL/6J)及B细胞缺陷型(B6.129S2-lgh-6^tmlCgn/J)小鼠获得的肾组织经三色染色后的组织学分析结果。

图11显示接受下列处理的小鼠肺中的B细胞计数：无博来霉素(对照)、博来霉素、及博来霉素加抗CD20单克隆抗体。

图12显示接受下列处理的小鼠脾中的B细胞计数：无博来霉素(对照)、博来霉素、及博来霉素加抗CD20单克隆抗体。

图13显示的是从下述小鼠的肺分离的B细胞的流式细胞术分析结果：未处理小鼠，或滴注博来霉素9天后并用B细胞消减性抗CD20单克隆抗体或PBS处理的小鼠。

图14显示的是小鼠肝组织中平滑肌肌动蛋白免疫染色的定量结果，其中肝组织来自在每周一次的1.75mg/kg CCl₄处理6次后，用B细胞消减性抗CD20抗体、同型对照抗体或PBS处理的小鼠。菱形、方块、三角形和圆圈代表按所述处理的小鼠个体所得的结果。

发明详述

本发明涉及治疗、缓解、降低或防止纤维化或纤维变性症候的方法。本发明的方法包括对需要此类治疗的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂。

本文所用的表述“纤维化症候”意图指响应于组织损伤(例如感染、自身免疫反应、机械损伤、化学损伤、糖尿病、高血压等等)而发生的纤维化组织、瘢痕组织、结缔组织和/或细胞外基质(ECM)物质在体内一种或多种器官上或器官内积累的任何症候。如本文所用的，表述“纤维化症候”和“纤维变性症候”具有相同的含义。

示例性的纤维化症候包括但不限于：

(I)与纤维化相关的肺病，例如特发性肺纤维化，辐射诱发的纤维化，慢性阻塞性肺病(COPD)，硬皮病、博来霉素诱发的肺纤维化、慢性哮喘、硅沉着病、石棉诱发的肺纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫(包括细菌性肺炎诱发的、外伤诱发的、病毒性肺炎诱发的、呼吸机诱发的、非肺性败血症(non-pulmonary sepsis)诱发的、以及吸引诱发的)；

(II)与损伤/纤维化(肾纤维化)相关的慢性肾病，例如狼疮、糖尿病、硬皮病、肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerularsclerosis)、IgA肾病、高血压、同种异体移植、狼疮和家族性出血性肾炎(Alport)；

(III)肠纤维化，例如硬皮病和辐射诱发的肠纤维化；

(IV)肝纤维化，例如肝硬化、酒精诱发的肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，胆管损伤、原发性胆汁性肝硬化、感染或病毒诱发的肝纤维化(例如慢性HCV感染)，和自身免疫性肝炎；

(V)头颈纤维化，例如辐射诱发的；

(VI)角膜瘢痕形成，例如LASIX、角膜移植和小梁切除术；

(VII)肥厚性瘢痕形成和瘢痕疙瘩，例如烧伤诱发的和手术性的，以及

(VIII)其它纤维变性疾病，例如结节病、硬皮病、脊髓损伤/纤维化、骨髓纤维化、血管再狭窄、动脉粥样硬化、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)、混合性结缔组织疾病，和阴茎纤维性海绵体炎(Peyronie′sdisease)。

本文中所用的表述“需要该治疗的患者”意指需要治疗一种或多种纤维化症候，例如任何上面列出的纤维化症候的人或非人动物。“需要该治疗的患者”可以是在体内一种或多种器官上或器官内具有纤维变性组织、瘢痕组织和/或细胞外基质物质(例如胶原、波形蛋白、肌动蛋白等等)积累的人或非人动物。“需要该治疗的患者”可以是，但不必须是，已获得一种或多种纤维化症候的临床诊断的人或非人动物。“需要该治疗的患者”可以是表现纤维化症候的一种或多种症状的人或非人动物(Khalil andO′Connor，Canadian Medical Journal 777：153-160(2004))。例如，“需要该治疗的患者”可以是表现下列症候的一种或多种症状的人或非人动物：肝的纤维化症候(例如肝组织损伤或瘢痕形成，例如由病毒性肝炎、酒精滥用、药品、铁或铜过载所致的代谢病、肝细胞或胆管上皮细胞的自身免疫攻击、或先天性异常所导致的)(Friedman，J.Biol.Chem.275：2247-2250(2000))；肺的纤维化症候(例如由肺对刺激事件的炎症响应(包括例如特发性间质肺炎)所导致的，或与肺对刺激事件的炎症响应有关的肺组织损伤或瘢痕形成)(Garantziotis et al.，J.Clin.Invest.114：319-321(2004))；皮肤或其它器官的硬皮病(Trojanowska，Frontiers Biosci.7：d608-618(2002))；和/或肾的纤维化症候(例如，与肾小球硬化症或肾小管间质纤维化有关的肾组织损伤或瘢痕形成)(Negri，J.Nephrol.17：496-503(2004))。

根据特定的实施方案，“需要该治疗的患者”不患有自身免疫病症和/或没有患上自身免疫病症的风险。例如，“需要该治疗的患者”可以是，但不必须是，没有获得一种或多种自身免疫病症的临床诊断的患者。需要该治疗的患者”可以是，但不必须是，没有表现一种或多种自身免疫病症的一种或多种症状的患者。本文中使用的术语“自身免疫病症”意思是起因于并针对于个体自有(自身)的抗原和/或组织的非恶性疾病或病症。(见，例如，美国专利申请2005/0095243)。因此，在本发明的某些示例性实施方案中，“需要该治疗的患者”是没有获得下列一种或多种自身免疫性病症的临床诊断或者没有表现下列一种或多种自身免疫病症的一种或多种症状的患者：类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、韦格纳氏病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、Reynaud氏综合征、Sjorgen氏综合征或肾小球肾炎。

非人动物包括例如家养或农场动物，还有动物园动物、运动用动物和宠物(例如猫、犬、马、牛等等)。

本文中所述的表述“治疗有效量”是指一定量的B细胞拮抗剂或拮抗剂，其对于预防、缓解、治疗或改善所述纤维化症候的症状是有效的。例如，如本文所用的，B细胞拮抗剂的治疗有效量可以是足以导致纤维化症候的一种或多种标志减少的B细胞拮抗剂量。示例性的纤维化症候标志包括例如胶原沉积、平滑肌肌动蛋白沉积，等等。B细胞拮抗剂的治疗有效量，在本发明的某些实施方案中，是足以导致胶原沉积相对于施用该B细胞拮抗剂之前观察到的胶原沉积水平减少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，90％，95％或100％的B细胞拮抗剂量。在本发明的某些实施方案中，B细胞拮抗剂的治疗有效量，是足以导致平滑肌肌动蛋白沉积相对于施用该B细胞拮抗剂之前观察到的平滑肌肌动蛋白沉积水平减少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，90％，95％或100％的B细胞拮抗剂量。在其它实施方案中，B细胞拮抗剂的治疗有效量，是足以导致器官功能(例如肝功能、肺功能、肾功能)相对于施用该B细胞拮抗剂之前观察到的器百功能改善5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，90％，95％或100％的B细胞拮抗剂量。

B细胞拮抗剂或消减剂

本文中所用的表述“B细胞拮抗剂”意图表示抑制、削弱、阻碍、改善或下调B细胞的生长、存活、增殖或功能(例如通过降低或阻止B细胞引发的体液应答)，或导致B细胞群体的全部或部分死亡或破坏的任何材料或药剂。就后者而言，此类B细胞拮抗剂可以称为B细胞消减剂。B细胞拮抗剂可以是与B细胞表面抗原结合或相互作用，或者与分子内信号分子相互作用，从而抑制B细胞功能的合成或天然序列的肽或小分子。在一些实施方案中，B细胞拮抗剂可以与细胞毒剂融合或偶联。根据本发明的其它实施方案，B细胞拮抗剂是融合蛋白(例如BR-Fc)或抗体，例如针对一种或多种B细胞表面抗原的抗体。

如上文提到的，B细胞拮抗剂可以是对患者施用该B细胞拮抗剂之时或之后消减B细胞的药剂。例如，B细胞拮抗剂在施用该B细胞拮抗剂之后24到100小时内可导致B细胞消减2％到100％。

例如，B细胞拮抗剂在施用该B细胞拮抗剂(例如美国专利6,399,061中所公开的)之后24小时内可以导致外周B细胞消减2％，4％，6％，8％，10％，12％，14％，16％，18％，20％，22％，24％，26％，28％，30％，32％，34％，36％，38％，40％，42％，44％，46％，48％，50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，72％，74％，76％，78％，80％，82％，84％，86％，88％，90％，92％，94％，96％，98％或100％。

或者，B细胞拮抗剂可以在施用该B细胞拮抗剂48小时之内导致外周B细胞消减2％，4％，6％，8％，10％，12％，14％，16％，18％，20％，22％，24％，26％，28％，30％，32％，34％，36％，38％，40％，42％，44％，46％，48％，50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，72％，74％，76％，78％，80％，82％，84％，86％，88％，90％，92％，94％，96％，98％或100％。

在其它实施方案中，B细胞拮抗剂可以在该B细胞拮抗剂施用72小时之内导致外周B细胞消减2％，4％，6％，8％，10％，12％，14％，16％，18％，20％，22％，24％，26％，28％，30％，32％，34％，36％，38％，40％，42％，44％，46％，48％，50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，72％，74％，76％，78％，80％，82％，84％，86％，88％，90％，92％，94％，96％，98％或100％。

B细胞拮抗剂或消减剂治疗纤维化症候的能力可以利用一种或多种体外或体内纤维化模型来测定。示例性的纤维化模型包括，例如，创伤诱发的纤维化模型(例如，手术创伤或器官移植、烧伤、胆管闭合、单侧输尿管阻塞、缺血再灌注、呼吸机诱发的肺损伤、血管气囊损伤、肾切除术、辐照、创伤性主动脉-腔静脉瘘和快速心室起搏)；毒素或药物诱发的纤维化模型(例如博来霉素、石棉、二氧化硅、卵清蛋白、乙醛、四氯化碳、伴刀豆球蛋白A、氯乙烯、三硝基苯磺酸、噁唑酮、环孢菌素A、硫酸镍和蓝肽(cerulein)；自身免疫病或免疫机能障碍介导的纤维化模型(例如抗体或免疫复合物疾病模型，器官抑制排斥、紧皮(tight skin)(Tsk)小鼠模型，缺血-再灌注损伤，移植物抗宿主病诱发的，和类风湿性关节炎)；慢性感染性疾病诱发的纤维化模型(血吸虫属(Schistosoma)物种或慢性病毒性肝炎，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)；以及基因工程化的小鼠模型或病毒感染小鼠(例如转化生长因子-β)(TGF-β)或TGF-β受体转基因和敲除小鼠，信号分子缺陷小鼠(例如mothers-against-decapentaplegic homologue 3(SMAD3)缺陷小鼠)、Col4A3缺陷小鼠(Alport)、影响TGF-β活化的分子(例如α₁-整联蛋白或基质金属蛋白酶9)缺陷的小鼠，和细胞因子基因转基因的、病毒感染的、以及敲除小鼠(例如肿瘤坏死因子、白细胞介素4(IL-4)、IL-13或IL-10))。(Wynn，Nature Reviews 4：583-594)。本发明的B细胞拮抗剂包括，例如，在上述任何纤维化模型中证明可改善纤维化的症状，或者可降低、延缓、削弱和/或改善纤维变性损伤的程度，或者可减少一种或多种纤维变性损伤标志的B细胞拮抗剂。在上述任一纤维化模型中测试包括B细胞拮抗剂在内的药剂改善纤维化症状或降低纤维化损伤程度的能力完全是本领域普通技术人员的技术和知识范围之内的。

抗体

本发明的B细胞拮抗剂或消减剂可以是抗体。

本文中使用的术语“抗体”包括例如天然抗体、完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段(例如结合和/或识别一种或多种抗原的抗体片段)、其它多价抗体构建体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体(Jakobovits et al，Proc.Natl Acad.SciUSA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann et al，Year in Immunol.7：33(1993)；美国专利5,591,669和5,545,807)，从抗体噬菌体文库分离的抗体和抗体片段(McCafferty et al，Nature 348：552-554(1990)；Clackson et al，Nature 352：624-628(1991)；Markset al，J.MoI.Biol.222：581-597(1991)；Marks et al，Bio/Technology 10：119-783(1992)；Waterhouse et al.，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993))。用于制备和使用抗体的方法是本领域公知的(参见例如WO 00/67796和其中引用的文献)。

作为B细胞拮抗剂或消减剂对本发明特别有用的两种抗体是：rituximab，一种鼠/人嵌合抗体；和2H7，一种包含鼠CDR的人源化抗体。Rituximab公开于U.S.P.N 6,399,061，而2H7和它的变体公开于WO04/056312。在此引证这些文献中每一篇的全部内容。

其它符合本文教导的抗CD20抗体包括名为“Y2B8”或“ibritumomabtiuxetan”ZEVALIN

的钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，其可从Biogen-Idec购买(另参见美国专利5,736,137，本文引证之)；鼠IgG2a“B1”，也称作“tositumomab”，它可任选用¹³¹I标记以产生¹³¹I-B1138抗体(BEXXAR^TM)(美国专利5,595,721，本文引证之)；鼠单克隆抗体“1F5″(Press et al.，Blood，69(2)：584-591(1987))及其变体，包括“框架修补”(frame patched)的或人源化1F5(WO 2003/002607)；ATCC保藏物HB-96450；HuMAX^TM-CD20(一种完全人源IgG抗体，美国专利申请公布2004/167319；WO04/035607，Genmab，Denmark)，AME-133(一种最优化的CDR移植抗体，美国专利申请公布2005/025764；WO04/103404，Applied Molecular Evolution)；HumaLym^TM(一种完全人源IgG抗体，Intracel)，和hA20(一种人源化IgG1抗体，美国专利申请公布2003/0219433；WO00/74718，Immunomedics)；和可从International Leukocyte Typing Workshop获得的单克隆抗体L27，G28-2，93-1B3，B-CI或MJ-B2(Valentine et al，In：Leukocyte Typing III(McMichael，Ed.，p.440，Oxford University Press(1987))。

本文使用的术语“抗体片段”是包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区的分子。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv片段、单链Fv(ScFV)片段；删除了域的抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“天然抗体”意指由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的、约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，而轻链的可变域与重链的可变域对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面。

术语“可变的”是指这样的事实，即可变域中的某些部分在抗体间具有很大的序列差异，并且这些部分被用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性在抗体的整个可变域中并不一定是均匀分布的。变异性通常集中于轻链和重链可变域中称作“高变区”的三个区段。可变域中保守程度更高的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取通过三个高变区连接的P-折叠片构型，这些高变区形成环，连接0-折叠片并在有些情况下构成其一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(Kabat等人，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现多种效应物功能，例如该抗体参与抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，它们各自具有一个抗原结合位点；以及一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，各可变域的三个高变区相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

根据其恒定区氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)“轻链”可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定区氨基酸序列，完整抗体可归入不同的类。完整抗体有五种主要的类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与抗体的不同类对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。

本文所用的表述“单链Fv”或“scFv”抗体片段，意指这样的抗体片段，其包含抗体的V_H和V_L域，其中这些域存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽在V_H和V_L域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原的期望结构(Plückthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，(1994))。

本文所用的术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个域之间不能配对，迫使域与另一条链的互补域配对，产生两个抗原结合位点。(EP 404,097；WO93/11161；Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))。

多克隆抗体包括通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原及佐剂而在动物中激发的抗体。可以使用双功能或衍生化试剂使相关抗原与在要免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质偶联，所述蛋白质例如钥孔

血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂；所述双功能或衍生化试剂例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烷基。

为了产生多克隆抗体，用抗原、免疫原性偶联物或衍生物对动物进行免疫，方法是将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用包含初始量的1/5-1/10的肽或偶联物的弗氏完全佐剂对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体效价。对动物进行加强免疫，直到效价达到平台(plateau)。优选的是，用抗原相同但与不同的蛋白质偶联和/或通过不同的交联剂偶联而得到的偶联物对动物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指这样的抗体，它获自一群基本上同质的抗体，例如构成群体的单独抗体是基本上相同的，除了可能有的天然存在突变或不重要的翻译后变化以外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示的是抗体从基本上同质的抗体群获得这个特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohleret al.，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。

单克隆抗体在本文中包括“嵌合”抗体，这些抗体中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；还包括此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利第4,816,567号；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等，诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变域抗原结合序列和人恒定域序列的“灵长类化”抗体(美国专利第5,693,780号)。

如本文中使用的，非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指包含最少的衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。大体上，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中供体高变区中的残基被替换为来自具有期望特异性、亲和力和容量(capacity)的非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区(供体抗体)的残基。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中都不存在的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常是两个基本上整个如下所述的可变域：其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmarm et al，Nature332：323-329(1988)；Verhoeyen et al，Science，239：1534-1536(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol 2：593-596(1992)；WO 00/67796)。

术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责结合抗原的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”(“CDR”)的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.96：901-917(1987))。“框架”或“FR”残基是除了本文定义的高变区残基之外的可变域残基。

B细胞表面抗原

在本发明的特定实施方案中，B细胞拮抗剂是针对B细胞表面抗原的抗体。本文所用的表述“B细胞表面抗原”意指在B淋巴细胞表面上表达的任何抗原。在本发明的一些实施方案中，“B细胞表面抗原”是健康个体中B细胞表面上表达的抗原。在其它实施方案中，“B细胞表面抗原”是处于疾病状态的个体的B细胞表面上表达的抗原。在另外的实施方案中，“B细胞表面抗原”是在健康个体和处于疾病状态的个体中的B细胞表面上均有表达的抗原。根据本发明的一些实施方案，B细胞表面抗原在B细胞上表达的程度高于非B细胞(例如高2倍、高3倍、高4倍、高5倍、高10倍、高100倍或更多)。或者，根据特定的实施方案，B细胞表面抗原在B细胞上表达的程度与非B细胞相比可以相同或较低。特定的B细胞表面抗原可以组成性表达在非B细胞上和/或表达在活化的B细胞上。在本发明的特定实施方案中，B细胞表面抗原仅在B细胞上表达。

示例性的B细胞表面抗原包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD52、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志。其它示例性B细胞表面抗原包括Toll样受体(例如TLR-7和TLR-9)、趋化因子(例如CXCR3)和APRIL(Medema et al，Cell Death Differ.10：1121-1125(2003))。为本公开的目的，BAPF受体(BAFFR/BR3、BCMA和TACI)也可看作B细胞表面受体。

根据本发明的特定实施方案，B细胞表面抗原是CD19。“CD19”抗原是一种由例如HD237-CD19或B4抗原所鉴别的～90kDa的抗原(Kiesel et al，Leukemia Research II 12：1119(1987))。CD19在从干细胞阶段直到即将终末分化为浆细胞之前一点的整个谱系进化过程中的细胞上均有出现。B细胞表面抗原与CD19的结合可能导致CD19抗原的内在化。

B细胞拮抗剂可以是，例如：Lym-1，一种识别B细胞的IgG2a抗体；B2，一种针对CD21抗原的抗体；B3，一种针对CD22抗原的抗体；或J5，一种针对CD10抗原的抗体(US 5,843,398)。在本发明的背景下可用作B细胞拮抗剂的抗CD22抗体在例如美国专利第5,484,892、5,789,557和5,789,554号、WO 98/42378、WO 00/20864和WO 98/41641、以及Campana，D.et at，J.Immunol.134：1524(1985)、Dorken et al，J.Immunol.150：4719(1993)及Engel et al，J.Immunol.150：4519(1993)中有描述。就此方面而言，抗CD22抗体epratuzumab在本发明中特别有用。

在本发明的背景下可用作B细胞拮抗剂的其它示例性CD22抗体在例如美国专利5,484,892，5,789,557及6,846,476，以及WO98/42378、WO00/20864和WO98/41641中有描述。

根据本发明的特定实施方案，B细胞表面抗原是CD23。CD20是IgE的低亲和力受体。已知CD23介导细胞粘附，调节IgE和组胺释放、拯救B细胞免于凋亡，并调节髓样细胞的生长。参见，例如，Conrad，Annu RevImmunol 8：623-645(1990)；Delespesse et al，Adv.Immunol.49：149-191(1991)；Bonnefoy et al，Curr Opin Immunol 5：944-947(1993)。CD23特异性抗体和它们的用途在例如Rector et al，Immunol.55：481-488(1985)；Suemura et al，J.Immunol.137：1214-1220(1986)；Noro et al，J.Immunol.137：1258-1263(1986)；Bonnefoy et al，J.Immunol.138：2970-2978(1987)；Flores-Romo et al，Science261：1038-1046(1993)；Sherr et al，J.Immunol.142：481-489(1989)；Pene et al，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 85：6880-6884(1988)；Bonnefoy et al.(WO87/07302)；Bonnefoy et al(WO96/12741))；Bonnefoy et al，Eur.J.Immunol.20：139-144(1990)；Sarfati et al.J.Immunol.141：2195-2199(1988)及Wakai etal，Hybridoma 12：25-43(1993)中有讨论；另参见美国专利7,008,623、6,893,638和6,011,138。

根据本发明的特定实施方案，B细胞表面抗原是CD80。CD80(又称“B7.1”)已被证明在免疫应答的产生过程中起关键作用(Azuma et al，J.Exp，Med.177：845-850(1993)；Freeman et al，J.Immunol.143：2714-2722(1989)；Hathcock et al，Science 262：905-911(1993)；Hart et al.，Immunol.79：616-620(1993))。CD80特异性抗体已经有描述，包括例如一种对人CD80特异性的灵长类化IgG₁抗体，称为“IDEC-114”(美国专利5,736,137；6,113,898)。

根据本发明的某些优选实施方案，B细胞表面抗原是CD20。“CD20”抗原是一种～35kDa的非糖基化磷蛋白，在超过90％的来自外周血或淋巴器官的B细胞表面上均有发现。CD20在早期前B细胞发育过程中表达，并保持直到浆细胞分化为止。CD20在正常B细胞和恶性B细胞上均存在。文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制性抗原”和“Bp35”。CD20抗原在例如Clark et al.，Proc.Natl.Acad.Sci 82：1766(1985)中有描述。

针对CD20的抗体

本发明的B细胞拮抗剂可以是针对CD20的抗体。本领域已知起B细胞拮抗剂作用的任何抗体均可在本发明的背景下使用(见例如美国专利6,682,734，6,538,124，6,528,624，6,455,043，6,410,391，6,399,061，6,368,596，6,287,537，6,242,195，6,224,866，6,171,586，6,194,551，6,120,767，6,015,542，6,090,365，5,849,898，5,843,439，5,843,398，5,776,456，5,736,137，5,721,108，5,677,180，5,595,721，5,500,362，4,861,579；美国专利申请公布2005/0069545，2005/0053602，2005/0025764，2004/0167319，2004/0093621，2003/0219433，2003/0157108，2003/0147885，2003/01339301，2003/0103971，2003/0095963，2003/0082172，2003/0068664，2003/0026801，2003/0021781，2002/0197256，2002/0197255，2002/0128448，2002/0058029，2002/0041847，2002/0012665，2002/0009444，2002/0006404，2002/0004587；国际专利申请公布WO00/09160，WO00/27428，WO00/27433，WO00/44788，WO01/10462，WO01/10461，WO01/10460，WO02/04021，WO01/74388，WO01/80884，WO01/97858，WO02/34790，WO02/060955，WO2/096948，WO02/079255，WO98/56418，WO98/58964，WO99/22764，WO99/51642，WO00/42072，WO00/67796，WO01/03734，WO01/77342，WO00/20864，WO01/13945，WO00/67795，WO00/74718，WO00/76542，WO01/72333，WO02/102312，WO03/002607，WO049694，WO03/061694，WO95/03770；和欧洲专利申请公布330,191和332,865)。

针对CD20的抗体实例在例如美国专利申请公布2005/0053602中提出，包括：“C2B8”又称“rituximab”

(美国专利5,736,137)；钇-[90]标记的2B8鼠源抗体，称作“Y2B8”或“ibritumomab tiuxetan”

(美国专利5,736,137)；鼠源IgG2a“B1”，也称作“tositumomab”，其任选用¹³¹I标记以产生“¹³¹I-B1”抗体(碘I131 tositumomab，BEXXAR^TM)，(美国专利5,595,721)；鼠源单克隆抗体“1F5″(Press et al.，Blood，69(2)：584-591(1987))，以及“框架修补”的或人源化的1F5(WO 2003/002607)；ATCC保藏物HB-96450；鼠源2H7和嵌合2H7抗体(美国专利5,677,180)；人源化2H7；huMax-CD20(Genmab，丹麦)；AME-133^TM(Applied MolecularEvolution)；及单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得(Valentine等人，《Leukocyte Typing III》，McMichael编，p.440，OxfordUniversity Press，1987)。

术语“rituximab”或

在本文中指针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体，在美国专利5,736,137中称作“C2B8”，包括其保持结合CD20能力的片段。

在某些实施方案中，所述抗CD20抗体结合人和灵长类CD20。在具体的实施方案中，结合CD20的抗体是人源化或嵌合的CD20结合性抗体，包括rituximab

m2H7(鼠源2H7)、hu2H7(人源化2H7)和它的所有功能性变体，包括，但不限于，hu2H7.v16(v代表型式)、v31、v73、v75、v114、v511，以及岩藻糖缺陷的变体。某些hu2H7变体的序列在WO04/056312中提出，本文引证这篇文献的全文，并在下文提供这些序列，其中粗体的N末端氨基酸序列为前导序列，在成熟多肽中被除去：

hu2H7.v16轻链[232aa](SEQ ID NO：1)：

MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSY

MHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF

ATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV

CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS

KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

hu2H7.v16重链[471aa](SEQ ID NO：2)：

MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFT

SYNMHWVRQAPGKGLEWVGArYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNT

LYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSAST

KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF

PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC HKPSNTKVDKKVEPKSC

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE

VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY

KCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

hu2H7.v31重链[471aa](SEQ ID NO：3)：

MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFT

SYNMHWVRQAPGKGLEWVGATYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNT

LYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSAST

KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF

PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD

KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV

KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK

CKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

v31的轻链与上述v16相同，即SEQ ID NO：1。

术语“人源化2H7v.16”如本文所用，是指包括下列可变轻链和重链序列的完整抗体或抗体片段，可变轻链序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP

SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT

KVEIKR(SEQ ID NO：4)；

可变重链序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)

若人源化2H7v.16抗体是完整抗体，其优选包含v16轻链氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAP

SNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT

KVEIKRTVAAPSVFffPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA

LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS

PVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：6)；

和v16重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS

SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK

PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA

KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN

NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK(SEQ ID NO：7)。

除了指出的特定氨基酸替代位点以外包含v16的氨基酸序列的人源化2H7抗体变体的实例总结于下文的表1。除非另有说明，2H7变体将具有与v16相同的轻链。

表1

2H7型式	重链(VH)改变	轻链(VL)改变	Fc改变
				31	---	---	S298A，E333A，K334A
73	N100A	M32L
				75	N100A	M32L	S298A，E333A，K334A
96	D56A，N100A	S92A
				114	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A
115	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，E356D，M358L
				116	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，K334A，K332A，
138	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326A
				477	D56A，N100A	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326A，N434W
375	---	---	K334L

2H7型式	重链(VH)改变	轻链(VL)改变	Fc改变
				588	---		S298A，E333A，K334A，K326A
511	D56A，N100Y，S100aR	M32L，S92A	S298A，E333A，K334A，K326

前述人源化2H7单抗的一个变体是2H7v.31，其具有与上文SEQ IDNO：6相同的轻链序列，重链氨基酸序列如下：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS

SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAK

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPGK(SEQ ID NO：8)。

鼠源抗人CD20抗体具有V_H序列：

QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWI

GAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCA

RVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVS(SEQ ID NO：9)；

和V_L序列：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAP

SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGAG

TKLELK(SEQ ID NO：10)。

另一种优选的人源化2H7抗体包含2H7.v511可变轻链域序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS

NLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTK

VEIKR(SEQ 1D NO：11)

和2H7.v511可变重链域序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：12)。

若2H7.v511抗体是完整抗体，其可包括下列的轻链氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPS

NLASGWSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAENPPTFGQGTK

VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL

QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP

VTKSFNRGEC(SEQ ID NO：20)

和SEQ ID NO：7的重链氨基酸序列或：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVVRQAPGKGLEWV

GAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA

LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS

SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK

PREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAK

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK

SLSLSPG(SEQ ID NO：13)。

除非有说明，本文中公开的人源化2H7v.16及其变体的序列是成熟多肽的序列，即没有前导序列(美国专利申请公布2005/0095243)。

BAFF拮抗剂，BAFF受体拮抗剂和其它B细胞拮抗剂

BAFF(又称BLyS，TALL-1，THANK，TNFSF13B或zTNF4)是TNF1配体超家族成员，是B细胞的存活和成熟所必需的。BAFF过表达在转基因小鼠中的导致B细胞增生和严重自身免疫病的发生(Mackay，et al.(1999)J.Exp.Med.190，1697-1710；Gross，et al.(2000)Nature 404，995-999；Khare，etal.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，3370-33752-4)。BAFF通过结合TNF受体超家族的三个成员：TACI，BCMA和BR3(又称BAFF-R)而作用于B细胞(Gross，et al.，同上；Thompson，J.S.，et al.，(2001)Science 293，2108-2111；Yan，M.，et al.，(2001)Curr.Biol.11，1547-1552；Yan，M.，et al.，(2000)Nat.Immunol.1，37-41；Schiemann，B.，et al.，(2001)Science 293，2111-2114)。在这三种BAFF受体中，只有BR3是BAFF特异性的；其它两种还结合相关的TNF受体成员APRIL。BR3是一种184个残基的III型跨膜蛋白，表达在B细胞表面(美国专利申请公布2005/0095243)。

根据本发明的特定实施方案，B细胞拮抗剂是BAFF拮抗剂或BAFF受体拮抗剂。术语“BAFF拮抗剂”用于本文时包括任何这样的分子：它与天然序列BAFF多肽结合、缔合和/或相互作用，并且部分地或完全地阻断、抑制或中和天然序列BAFF信号传导。在选择的实施方案中，本发明包括与BAFF结合或缔合的抗体或其片段的用途。本领域技术人员将会理解，天然序列BAFF多肽信号传导可促进B细胞生存和B细胞成熟等。例如，生物学活性的BAFF配体在体外或体内增强下列事件中的任一个或它们的组合：(i)B细胞存活率增加；(ii)IgG和/或IgM的水平提高；(iii)浆细胞数目增加；(iv)脾B细胞中NF-κB2/100加工为p52NF-κB(例如Batten et al，J.Exp.Med.192：1453-1465(2000)；Moore，et al，Science 285：260-263(1999)；Kayagaki et al，Immunity 77：515-524(2002))。因此，BAFF信号传导的抑制、阻断或中和导致B细胞数目下降等结果。相应地，本发明某些方面的BAFF拮抗剂将在体内或体外部分地或完全地阻断、抑制或中和BAFF多肽的一种或多种生物学活性，从而降低或抑制B细胞活性。美国专利申请公布2005/0095243中描述了可用于检测BAFF拮抗剂的几种测定法。

可用作BAFF的拮抗剂的肽包括，例如，WO 02/092620中被称为TALL-112-3的肽，它具有下面的氨基酸序列：

MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPGCKW

DLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM

ISRTPEVTCWWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR

WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL

PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO：14)。

这个肽，以及WO 02/092620中公开的其它肽的实例，均结合BAFF并抑制BAFF与其受体BR3、TACI和BCMA的结合。WO 02/092620中提出的BAFF肽拮抗剂在某些实施方案中可与例如Fc或PEG相连接。

其它BAFF肽拮抗剂包括包含选自下组的氨基酸序列的肽或多肽：ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO：15)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO：16)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO：17)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO：18)和ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO：19)，以及包含与SEQ ID NO：15、16、17、18或19中任一序列具有至少40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。

本发明方法的实施中可以使用的其它BAFF多肽拮抗剂包括包含美国专利申请公布2005/0095243中提出的式I、式II或式III的氨基酸序列的多肽。

在本发明的一些实施方案中，BAFF拮抗剂是抗BAFF抗体、免疫粘附素或小分子。免疫粘附素在某些实施方案中是可溶性构建体的形式，包含BAFF受体的BAFF结合区(例如BR3，BCMA或TACI的胞外域)。在一个特别优选的实施方案中，免疫粘附素是BR3-Fc或具有SEQ ID NO：15，16，17，18或19之一的序列的多肽(美国专利申请公布2002/0037852，2003/0059937，2005/0095243和2005/0163775中提出的)。在其它实施方案中，免疫粘附素是TACI或BCMA的可溶性形式(例如TACI-Fc或BCMA-Fc)。

本领域技术人员将进一步理解，与BAFF特异性结合或缔合的抗体或其片段也符合本文的教导，并且在本领域是已知的，例如在美国专利申请公布2003/0059937中。根据本发明这个方面的一个抗体实例是LymphoStat-B^TM(belimumab)(Human Genome Sciences，Inc.)，它是一种特异性识别BAFF并抑制其生物学活性的人源单克隆抗体。

根据本发明某些其它的实施方案，B细胞拮抗剂是BAFF受体拮抗剂。术语“BAFF受体拮抗剂”在用于本文时包括任何这样的分子：它与天然序列BAFF受体(例如BR3，TACI或BCMA)多肽结合、缔合和/或相互作用，并且部分地或完全地阻断、抑制或中和通过该受体的天然序列BAFF信号传导。因此，在本发明选择的实施方案中，B细胞拮抗剂包括与Btk，TACI，BCMA(美国专利申请公布2002/0081296)或BAFF-R(美国专利申请公布2002/0165156)特异性结合或缔合的抗体或其片段、多肽或小分子。其它示例性B细胞拮抗剂包括，例如，抑制Ig-α/Ig-β的ITAM模体与其目标相互作用的抗体、多肽或小分子；抑制经典或旁路NFκB活化途径的抗体、多肽或小分子；以及抑制OCA-B，CD40，LT-β等的抗体、多肽或小分子。

B细胞拮抗剂的偶联物和其它修饰

根据本发明的某些实施方案，B细胞拮抗剂与细胞毒剂偶联。

可用于产生B细胞拮抗剂-细胞毒剂偶联物的化疗剂是本领域公知的。

本文还设想了B细胞拮抗剂与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美国专利5,208,020)、单端孢菌毒素(trichothene)和CC1065的偶联物。在本发明的一个实施方案中，将B细胞拮抗剂与一个或多个美登素分子偶联(例如每个B细胞拮抗剂偶联约1个至约10个美登素分子)。例如，可将美登素转变为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰的B细胞拮抗剂反应(Chari et al.，Cancer Research52：127-131(1992))以生成美登木素生物碱-B细胞拮抗剂偶联物。

或者，将B细胞拮抗剂与一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和Φ₁ ^I(Hinmanet al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998))。

可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。美登素也可与B细胞拮抗剂偶联。

本发明进一步设想了与具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸梅；Dnase)偶联的B细胞拮抗剂。

有多种放射性同位素可用于生成放射偶联的B细胞拮抗剂。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备B细胞拮抗剂和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚胺二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素与B细胞拮抗剂偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992))。

或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含B细胞拮抗剂和细胞毒剂的融合蛋白。

在另一个实施方案中，可以将B细胞拮抗剂与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联以用于“预靶定”——其中对受试者施用B细胞拮抗剂-受体偶联物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。

还可将本发明的B细胞拮抗剂与前体药物活化酶偶联，后者将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO 1981/01145)转变为活性药物。参见例如WO 1988/07378和美国专利4,975,278。此类偶联物的酶组分包括能够以某种方式作用于前体药物将其转化为其活性更高的细胞毒性形式的任何酶。

可用于本发明方法的酶包括，但不限于，可用于将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可用于将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可用于转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可用于将糖基化前体药物转变为游离药物的糖切割酶类，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可用于将P-内酰胺衍生化的药物转变为游离药物的P-内酰胺酶；及可用于将在其氨基氮处分别衍生有苯氧乙酰基或苯乙酰基的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey，Nature 328：457-458(1987))。可如本文所述制备B细胞拮抗剂-抗体酶偶联物，用于将抗体酶投递至细胞群或组织。

可通过本领域众所周知的技术将酶与B细胞拮抗剂共价结合，诸如使用上文讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术，构建包含与酶的至少功能活性部分连接的本发明B细胞拮抗剂的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger et al.，Nature 312：604-608(1984))。

本文还设想了B细胞拮抗剂的其它修饰。例如，可将B细胞拮抗剂与多种非蛋白质性聚合物中的一种连接，所述非蛋白质性聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。

可用于偶联B细胞拮抗剂的聚合物的一个例子是聚乙二醇(PEG)。可以将每个B细胞拮抗剂与PEG部分，例如1、2、3、4或5个PEG聚合物偶联，使得血清半衰期相比于单独的B细胞拮抗剂有所增加。PEG部分是非抗原性并且基本上是生物学惰性的。用于本发明实施的PEG部分可以是分枝的或非分枝的。

与B细胞拮抗剂连接的PEG部分的数目和个体PEG链的分子量可以变化。一般而言，聚合物的分子量越高，多肽上连接的聚合物链就越少。通常，连接于B细胞拮抗剂的总聚合物质量为20kDa到40kDa。因此，如果连接上一条聚合物链，该链的分子量通常是20-40kDa。如果连接上两条链，每条链的分子量通常是10-20kDa。如果连接上3条链，分子量通常是7-14kDa。

可以将聚合物，例如PEG，通过多肽上任何合适的反应性暴露基团与B细胞拮抗剂相连。反应性暴露基团可以是，例如，N末端氨基或内部赖氨酸残基的ε氨基，或二者。活化的聚合物可以与B细胞拮抗剂上任何游离氨基起反应并共价连接。B细胞拮抗剂的游离羧基、合适地活化的羰基、羟基、胍基、咪唑、氧化的糖部分和巯基(如果有的话)也可用作连接聚合物的反应性基团。

在偶联反应中，取决于多肽浓度，每摩尔多肽典型地使用大约1.0到大约10摩尔的活化聚合物。通常，所选择的比例代表了两方面之间的平衡，即：使反应最大化，而使可能有损于B细胞拮抗剂的期望药理学活性的副反应(往往是非特异性的)最小化。优选的是，B细胞拮抗剂保持其至少50％的生物学活性(例如在本文中描述任何测定及本领域已知的任何测定中所表现的生物学活性)，最优选保持近100％的活性。

可以使用常规的化学作用将聚合物与B细胞拮抗剂偶联。例如，可以将聚亚烷基二醇部分与B细胞拮抗剂的赖氨酸ε氨基偶联。可以使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯，诸如PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)，来进行与赖氨酸侧链的连接。合适的聚亚烷基二醇部分包括，例如，羟甲基-NHS和正亮氨酸-NHS，SC。这些试剂是可商购的。可以用其它胺反应性PEG接头来替代琥珀酰亚胺基部分。它们包括，例如，异硫氰酸酯、硝基苯基碳酸酯(nitrophenylcarbonates)(PNP)、环氧化物、苯并三唑碳酸酯、SC-PEG、tresylate、醛、环氧化物、羰基咪唑(carbonylimidazole)和PNP碳酸酯。通常对条件进行优化以最大地增强反应的选择性和程度。此类反应条件最优化是本领域普通技术之内的。

可以通过本领域已知的任何PEG化反应来进行PEG化。参见，例如，Focus on Growth Factors，3：4-10，1992和欧洲专利申请EP 0 154 316和EP 0401 384。可以使用与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。

通过酰化的PEG化通常涉及使聚乙二醇的活性酯衍生物起反应。PEG化中可以使用任何反应性PEG分子。酯化为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PEG是一种常用的活化PEG酯。如本文使用的，“酰化”包括，但不限于，治疗性蛋白质和水溶性聚合物诸如PEG之间的下列类型的联结：酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯等等。参见，例如，Bioconjugate Chem.5：133-140，1994。通常对反应参数进行选择，以避免可能破坏B细胞拮抗剂或使之失活的温度、溶剂和pH条件。

一般而言，连接性联结是酰胺，典型地，至少95％的所得产物是单-、双-或三-PEG化的。但是，可能形成某些具有更高PEG化程度的种类，形成的量取决于所用的具体反应条件。任选地，通过常规纯化手段将纯化的PEG化种类与混合物，尤其是未反应种类分离，其中所述常规纯化方法包括例如透析、盐析、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏水交换色谱和电泳。

通过烷基化的PEG化通常涉及在还原剂存在的条件下使PEG的末端醛衍生物与本发明的B细胞拮抗剂起反应。另外，可以对反应条件加以控制，使之有利于基本上仅在B细胞拮抗剂的N末端氨基基团处发生的PEG化，即单PEG化的蛋白质。无论是单PEG化或是多PEG化，PEG基团典型地通过-CH₂-NH-基团与蛋白质连接。特别就-CH₂-而言，这种类型的联结被认为是一种“烷基”联结。

利用可供衍生化的不同类型的初级氨基基团(赖氨酸和N末端)之间的反应性差异，借助还原性烷基化进行衍生化，生成靶向N末端的单PEG化产物。反应在这样的pH进行，使得人们可以利用所述蛋白质的赖氨酸残基的ε氨基和N末端氨基之间pKa的差异。通过这种选择性衍生化来控制含有反应性基团例如醛的水溶性聚合物与蛋白质的连接：与聚合物的偶联主要在蛋白质的N末端发生，而其它反应性基团，诸如赖氨酸侧链氨基，则没有发生显著的修饰。

酰化和烷基化途径中使用的聚合物分子都选自水溶性聚合物。典型地，所选的聚合物经过修饰而具有单个反应性基团，诸如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，从而可以如本文方法所规定的那样控制聚合反应的程度。反应性PEG醛的实例有水溶性的聚乙二醇丙醛，或者它的单C₁-C₁₀烷氧基或芳氧基衍生物(见例如Harris et al.，美国专利5,252,714)。聚合物可以是分枝的或非分枝的。对酰化反应而言，所选的聚合物典型地具有单个反应性酯基。对还原性烷基化而言，所选的聚合物典型地具有单个反应性醛基。一般而言，水溶性聚合物不会选自天然存在的糖基化残基，因为这些残基通常更方便地由哺乳动物重组表达系统制备。

用于制备PEG化的本发明B细胞拮抗剂的方法通常包括下列步骤：(a)在一定条件下将本发明的B细胞拮抗剂与聚乙二醇(诸如PEG的活性酯或醛衍生物)反应，使得该分子连接上一个或多个PEG分子，及(b)获取反应产物。通常，酰化反应的最优反应条件是根据已知的参数和所需的结果，依照具体情况具体确定的。例如，较高的PEG对蛋白质比率将产生较高百分比的多PEG化产物。

产生基本上均一的单-聚合物/B细胞拮抗剂群体的还原性烷基化通常包括下列步骤：(a)在还原性烷基化条件下，在适于允许选择性修饰NgRN末端氨基的pH，使本发明的B细胞拮抗剂与反应性PEG分子反应；和(b)获取反应产物。

对于基本上均一的单-聚合物/B细胞拮抗剂群体，还原性烷基化反应条件是允许水溶性聚合物部分选择性地连接于本发明B细胞拮抗剂N末端的那些条件。这样的反应条件通常考虑了赖氨酸侧链烷基和N末端氨基之间的pKa差异。为本发明的目的，pH通常在3-9的范围，典型地为3-6。

本发明的B细胞拮抗剂可以包括标签，例如可以随后通过蛋白酶解而释放的部分。因此，赖氨酸部分可以通过下述手段加以选择性修饰：首先与经过低分子量接头例如Traut氏试剂(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)修饰的His标签起反应，其中所述接头将与赖氨酸和N末端二者反应；然后释放所述His标签。然后多肽将会含有游离的SH基团，该基团可以用含有硫醇反应性头部基团的PEG加以选择性修饰；所述硫醇反应性头部基团诸如马来酰亚胺基团、乙烯砜(vinylsulfone)基团、卤代乙酸(haloacetate)基团、或游离或受保护的SH基团。

Traut氏试剂可以用任何能够产生供PEG连接的特定位点的接头来代替。例如，可以用SPDP、SMPT、SATA或SATP(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)来代替Traut氏试剂。类似地，可以使蛋白质与插入马来酰亚胺的胺反应性接头(例如SMCC，AMAS，BMPS，MBS，EMCS，SMPB，SMPH，KMUS或GMBS)，或插入卤代乙酸基团的胺反应性接头(SBAP，SIA，SIAB)，或插入乙烯砜基团的胺反应性接头发生反应，然后使所得产物与含有游离巯基的PEG反应。

在一些实施方案中，将聚亚烷基二醇部分偶联于B细胞拮抗剂的半胱氨酸基团。可以使用例如马来酰亚胺基团、乙烯砜基团、卤代乙酸基团或硫醇基团实现偶联。

任选地，通过不稳定键将B细胞拮抗剂与聚乙二醇部分偶联。该不稳定键可以在例如生化水解、蛋白酶解或巯基裂解中断裂。例如，该键可以在体内(生理)条件下断裂。

反应可以通过用于生物活性物质与惰性聚合物反应的任何合适方法来进行，通常在大约pH 5-8，例如pH 5、6、7或8进行，如果反应性基团在N末端的α氨基上的话。通常，该过程涉及制备活化聚合物，然后使蛋白质与该活化聚合物反应生成适于配制的可溶性蛋白质。

本文公开的B细胞拮抗剂还可配制成脂质体。可通过本领域已知的方法制备包含B细胞拮抗剂的脂质体，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日出版的WO1997/38731中所述。美国专利5,013,556中公开了循环时间增长的脂质体。

可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有所需直径的脂质体。可如Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫键交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon et al.，J.NationalCancer Inst.81(19)：1484(1989)。

设想了本文所述蛋白质或肽B细胞拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进B细胞拮抗剂的结合亲和力和/或其它生物学特性。

通过将适当的核苷酸改变引入B细胞拮抗剂编码核酸或通过肽合成法来制备B细胞拮抗剂的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如B细胞拮抗剂氨基酸序列中的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有所需特性，可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可能改变B细胞拮抗剂的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

可用于鉴定B细胞拮抗剂中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)所述。这里，鉴定了一个或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)加以替代。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，进一步确定那些对替代显示功能敏感性的氨基酸位置。由此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在指定位点处的突变的表现，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机突变，并对所表达的B细胞拮抗剂变体筛选所需活性。

氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合物，其长度范围从一个残基到包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的B细胞拮抗剂或与细胞毒性多肽融合的B细胞拮抗剂。B细胞拮抗剂分子的其它插入变体包括在B细胞拮抗剂的N-或C-末端融合酶或提高B细胞拮抗剂血清半衰期的多肽。

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在B细胞拮抗剂分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。在抗体B细胞拮抗剂中进行替代诱变的最引人注意的位点包括高变区，但FR改变也在设想之内。

保守替代在表2中“优选替代”标题下显示。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可以引入表2中称为“例示替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。

表2

原始残基	例示替代	优选替代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp，Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr

Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Val；Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

对B细胞拮抗剂生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。根据共有的侧链特性，将天然存在的氨基酸分组如下：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代将需要将这些类别之一中的一个成员替换为另一个类别的成员。

任何不涉及B细胞拮抗剂正确构象的保持的半胱氨酸残基也可加以替代，通常替代为丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向B细胞拮抗剂中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当B细胞拮抗剂是抗体片段诸如Fv片段时)。

特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物，以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上。然后如本文所公开的那样，对噬菌体展示的变体筛查其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。

B细胞拮抗剂的另一类氨基酸变体改变了B细胞拮抗剂的原始糖基化样式。此类改变包括删除在B细胞拮抗剂中存在的一个或多个糖部分，和/或添加B细胞拮抗剂中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接指糖部分连接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将糖部分酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中存在这两种三肽序列中的任一种即产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖这些糖类之一连接于羟基氨基酸，羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

向B细胞拮抗剂中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上文描述的三肽序列而便利地实现(用于N-连接的糖基化位点)。还可通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行替代来改变原始B细胞拮抗剂的序列(用于O-连接的糖基化位点)。

若抗体包含Fc区，可改变连接于其上的糖。例如，美国专利申请公布US 2003/0157108中描述了具有成熟糖结构的抗体，所述结构缺乏连接于抗体Fc区的岩藻糖。WO 2003/011878和美国专利6,602,684中提到了在连接于抗体Fc区的糖中具有二分式(bisecting)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087中报告了在连接于抗体Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。还可参见WO 1998/58964和WO 1999/22764，它们涉及Fc区所连接的糖被改变的抗体。

编码B细胞拮抗剂氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)，或者通过对早期制备的变体或非变体形式的B细胞拮抗剂进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可能希望在效应物功能方面对本发明的B细胞拮抗剂加以修饰，从而例如增强B细胞拮抗剂的抗原依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)。这可通过在B细胞拮抗剂Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗原依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗纤维变性活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂制备。或者，可将抗体工程化改造成具有双重Fc区，并因此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。WO 2000/42072描述了在存在人效应细胞时具有改进的ADCC功能的抗体，其中抗体在其Fc区中包含氨基酸替代。

WO 1999/51642和美国专利6,194,551B1、美国专利6,242,195B1、美国专利6,528,624B1和美国专利6,538,124中描述了具有改变的C1q结合和/或补体介导的细胞毒作用(CDC)的抗体。这些抗体在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334中一个或多个位置上包含氨基酸替代。

为了提高B细胞拮抗剂的血清半衰期，可以将补救受体结合表位引入B细胞拮抗剂(尤其是抗体片段)，例如按照美国专利5,739,277中所述。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。WO 2000/42072中也描述了在其Fc区中具有替代且具有提高的血清半衰期的抗体。

还设想了具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的工程化改造抗体(美国专利申请公布US 2002/0004587)。

B细胞拮抗剂的配制和施用

本发明的B细胞拮抗剂优选以治疗用配制剂的形式施用给患者。可通过将具有期望纯度的B细胞拮抗剂与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)混合，以冻干配制剂或水溶液的形式，制备B细胞拮抗剂的治疗用配制剂供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

WO98/56418中描述了示例性的抗CD20抗体配制剂。该出版物描述了一种液体多剂量配制剂，包含40mg/mL rituximab，25mM乙酸盐，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨醇酯20，pH 5.0，最小保存期是2-8℃贮存2年。另一种抗CD20配制剂包含10mg/mL rituximab、90mg/mL氯化钠、7.35mg/mL二水柠檬酸钠、0.7mg/mL聚山梨醇酯80，以及无菌注射用水，pH 6.5。

美国专利6,267,958中记载了适应皮下施用的冻干配制剂。此类冻干配制剂可用合适的稀释剂复原至高蛋白质浓度，且复原的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的患者。

本文中的配制剂按照所治疗的具体适应证的需要还可含有超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的活性化合物。例如，最好还提供细胞毒剂、化疗剂、细胞因子、TGF-β途径的抑制剂(例如单克隆抗体、肽、小分子拮抗剂、TGF-β活化抑制剂)、整联蛋白受体拮抗剂、或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的，诸如环孢菌素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的)。此类其它药剂的有效量依赖于配制剂中存在的B细胞拮抗剂的量，疾病或病症或治疗的类型，及其它因素。

还可将B细胞拮抗剂包埋于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊中，例如分别是羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊；在胶状药物投递系统中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液(macroemulsions)中。此类技术公开于例如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，(1980)。

可制备B细胞拮抗剂的持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有B细胞拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

B细胞拮抗剂可以通过任何合适手段施用，包括非消化道、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内施用。非消化道输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，还可合适的通过脉冲输注来施用B细胞拮抗剂，例如用剂量逐渐减少的B细胞拮抗剂。剂量给药优选通过注射，最优选静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是短期或是持续的。

在本发明的某些示例性实施方案中，以1mg/m²到500mg/m²的剂量对患者施用(例如静脉内)B细胞拮抗剂。例如，可以以下列剂量施用B细胞拮抗剂：1mg/m²，2mg/m²，3mg/m²，4mg/m²，5mg/m²，10mg/m²，15mg/m²，20mg/m²，25mg/m²，30mg/m²，35mg/m²，40mg/m²，45mg/m²，50mg/m²，55mg/m²，60mg/m²，65mg/m²，70mg/m²，75mg/m²，80mg/m²，85mg/m²，90mg/m²，95mg/m²，100mg/m²，105mg/m²，110mg/m²，115mg/m²，120mg/m²，125mg/m²，130mg/m²，135mg/m²，140mg/m²，145mg/m²，150mg/m²，155mg/m²，160mg/m²，165mg/m²，170mg/m²，175mg/m²，180mg/m²，185mg/m²，190mg/m²，195mg/m²，200mg/m²，205mg/m²，210mg/m²，215mg/m²，220mg/m²，225mg/m²，230mg/m²，235mg/m²，240mg/m²，245mg/m²，250mg/m²，255mg/m²，260mg/m²，265mg/m²，270mg/m²，275mg/m²，280mg/m²，285mg/m²，290mg/m²，295mg/m²，300mg/m²，305mg/m²，310mg/m²，315mg/m²，320mg/m²，325mg/m²，330mg/m²，335mg/m²，340mg/m²，345mg/m²，350mg/m²，355mg/m²，360mg/m²，365mg/m²，370mg/m²，375mg/m²，380mg/m²，385mg/m²，390mg/m²，395mg/m²或400mg/m²。

B细胞拮抗剂可以根据多种剂量给药方案加以施用(参见，例如，美国专利申请公布2006/0002930)，例如，可以每天一次施用B细胞拮抗剂，持续预定量的时间(例如4到8周或更长时间)，或根据每周一次的方案(例如每周1天，每周2天，每周3天，每周4天，每周5天，每周6天，或每周7天)，持续预定量的时间(例如4到8周或更长时间)。“每周一次”的剂量给药方案的一个具体实例是：在治疗期间的第1、8、15和22天施用B细胞拮抗剂。在一个作为选择的实施方案中，可以间歇地施用B细胞拮抗剂数月时间。例如，可以每周一次地连续施用B细胞拮抗剂三周，一年进行两次(即，每六个月重复这个每周一次的方案)。应当理解，可以继续进行这样的施用方案较长的时间(以年计)，以便维持最初治疗所提供的有益治疗效果。在其它实施方案中，可以先采用较紧急的给药方案以减轻纤维化症候的直接症状，然后再实施这样的维持疗法。

每次施用的B细胞拮抗剂的量在整个治疗期间可以是相同的，或者，每次施用的B细胞拮抗剂的量在治疗期间可以变化(例如，在某一给定时间的施用量可以多于或少于先前的施用量)。例如，在维持疗法期间给予的剂量可以低于紧急治疗阶段中所施用的剂量。基于具体条件的合适的剂量给药方案对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。

除了对患者施用蛋白质B细胞拮抗剂以外，本发明还设想了通过基因治疗来施用B细胞拮抗剂。此类B细胞拮抗剂编码核酸的施用被涵盖在表述“对需要该治疗的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂”中。参见，例如，WO96/07321，其涉及施用基因治疗来产生细胞内抗体。

有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内和回体(ex vivo)。对于体内投递，将核酸直接注射到患者体内，通常注射在需要B细胞拮抗剂的部位。对于回体治疗，取出患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将这些经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利第4,892,538号和第5,283,187号)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸体外转移至培养细胞还是体内转移至目的宿主的细胞而有所不同。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。一种常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。

示例性的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况下，希望将核酸源与靶向靶细胞的药剂一起提供，这些药剂有诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，可以利用与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白相结合的蛋白质，例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向细胞内定位和增加细胞内半衰期的蛋白质，来进行靶向和/或促进摄入。例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)中记载了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因治疗规程的综述参见Anderson et al.，Science256：808-813(1992)。还可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。

B细胞拮抗剂和其它药剂的组合

在本发明的某些实施方案中，将许多类型的B细胞拮抗剂相互组合后施用于患者，来治疗一种或多种纤维化症候。例如，本发明包括如下所述的纤维化症候的方法，它们包括对患者施用治疗有效量的针对CD20的抗体(例如rituximab)以及如本文中其它地方及美国专利申请公布2005/0095243(本文引证其全部内容)中所描述的BAFF拮抗剂。当给患者施用多种B细胞拮抗剂时，可以将不同的B细胞拮抗剂在单一药物组合物中一起施用，或者，更优选地，可以将它们以分离的剂量按任意顺序先后施用。

本发明还包括如下所述的纤维化症候治疗方法，它们包括对需要治疗的患者施用包含第一药剂和第二药剂的组合，其中第一药剂是B细胞拮抗剂，第二药剂是可用于治疗一种或多种纤维化症候的药剂但不一定是B细胞拮抗剂。例如，根据本发明的某些实施方案，将B细胞拮抗剂与针对一种或多种整联蛋白受体(例如，α₁β₁，α_vβ₆，α_vβ₈，α_vβ₅，α₅β₁，α₄β₁，α₄β₇等等)的拮抗剂一起施用给患者，其中所述针对一种或多种整联蛋白受体的拮抗剂包括针对一种或多种整联蛋白受体(例如，α₁β₁，α_vβ₆，α_vβ₈，α_vβ₅，α₅β₁，α₄β₁，α₄β₇等等)特异性的抗体、多肽拮抗剂和/或小分子拮抗剂(美国专利6,652,856和6,692,741，及美国专利申请公布2004/0248837，2004/0208878，2002/0004482，2005/0255102及2005/0226885)。特异性结合α₄β₁整联蛋白受体，并且可以在本发明的背景下与B细胞拮抗剂组合使用来治疗纤维变性症候的抗体的一个实例，是natalizumab(Tysabri

)，如公布的美国申请2005/0276803中提出的。

在本发明这个方面的某些实施方案中，与B细胞拮抗剂一起施用的第二药剂是，例如，类固醇，细胞毒剂、秋水仙碱、氧、抗氧化剂(例如N-乙酰半胱氨酸)、金属螯合剂(例如四硫代钼酸盐)、IFN-γ、或α-抗胰蛋白酶。在某些实施方案中，第二药剂可以是Btk的抑制剂，包括例如Btk的小分子抑制剂。在某些实施方案中，第二药剂可以是TWEAK的抑制剂，包括例如TWEAK的抗体和小分子抑制剂。在另外的实施方案中，第二药剂可包含LTBR拮抗剂(例如可溶性融合蛋白或抗体)；参见USPN 7,030,080及7,001,921；或TRAIL-R2的拮抗剂。

根据本发明的这个方面的某些实施方案，与B细胞拮抗剂一起施用的第二药剂可以是，例如，TGF-β途径抑制剂。在本发明的背景下可以使用的TGF-β途径抑制剂的实例包括但不限于抑制或拮抗一种或多种TGF-β信号途径组分的抗体、合成的或天然序列的肽及小分子；所述TGF-β信号途径组分包括例如Ang II，IL-1，IL-4，IL-10，IL-13，MIF，PDGF，RAGE，AGE，TNF-α，凝血酶敏感蛋白-1，VLA-1，SMAD-2，SMAD-3(美国专利申请公布2003/0139366)，SMAD-4，ERK，p15，Ink4b，p21Wafl，p27Kip1，p-38，CTGF(美国专利申请公布2004/0248206)，PAI-1，PTHrP，内皮缩血管肽-1，类法尼醇X，HGF，IGF-1，MMP-1，MMP-9，PGE2，脯氨酰羟化酶，前胶原，微纤维蛋白，TIMP5 CXCR4，CXCL 12，CCR2，CCL2，CCL-7及CCL-22。在本发明背景下可以使用的其它示例性TGF-β途径抑制剂包括例如TGF-β配体和受体拮抗剂，包括例如抗体、可溶性TGF-βRII-Fc融合蛋白、LAP-Fc融合蛋白、TGF-βRI或RII激酶抑制剂、和TGF-βRII下游的小分子抑制剂。

在本发明背景下可以与B细胞拮抗剂一起施用的其它药剂包括例如吡非尼酮(pirfenidone)、内皮缩血管肽拮抗剂、TNF-α抑制剂、PDGF抑制剂、CTGF抑制剂、CD40配体拮抗剂(USPN 6,506,383)、BCMA-Ig、P38MAP激酶抑制剂、泼尼松(prednisone)、环磷酰胺(Cytoxan)和硫唑嘌呤(azathioprine)。

在本发明的背景下可以与B细胞拮抗剂组合使用来治疗纤维化症候的临床产品的具体实例包括表3中列出的那些。

表3

产品名                 描述                   开发者

试剂盒

本发明还包含用于治疗纤维化症候的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个容器，其中至少一个容器包含B细胞拮抗剂。本文中其它地方描述的任何B细胞拮抗剂均可包含在本发明的试剂盒内。本发明的试剂盒还可以包含一个或多个这样的容器，所述容器包含一种或多种额外的药剂，这些药剂可以与B细胞拮抗剂组合施用来治疗纤维化症候。这些额外的药剂在本文中其它地方有描述。可选地，试剂盒可包含一套或多套治疗纤维化症候的指导。这些指导除了其它内容之外，可以包括有关下列事项的信息：将要对患者施用的B细胞拮抗剂和/或其它药剂的量，施用的时间选择和频率，建议的施用途径，以及应施用所述B细胞拮抗剂和/或其它药剂的患者所表现的特征和/或症状。

对相关技术领域普通技术人员而言显而易见的是，针对本文所描述的方法和用途所作的其它合适的修改和变通都是显然的，而且可以在不背景本发明或其任何实施方案的范围的前提下加以实现。现在已经对本发明进行了详细的说明，而参考下面的实施例可以更清楚地理解本发明；本文引入这些实施例仅仅是为了举例说明的目的，而不是意图限制本发明。

实施例

实施例1

在缺少B细胞的条件下肝纤维化的减轻

介绍

酒精诱发性肝变性(alcohol-induced liver degeneration)、丙型肝炎感染、非酒精诱发性脂肪性肝炎(non-alcohol induced steatohepatitis)等慢性肝病的标志是慢性炎症、细胞损伤、再生和纤维化。所有这些特征都可以由反复的四氯化碳(CCl₄)诱发性肝损伤所引发(Jungerrnann and Katz，Physiol.Rev.69：708-164(1989)；Friedman，Semin.Liver Dis.72：129-140(1999))。本实施例对野生型和B细胞缺陷的小鼠中的CCl₄诱发性纤维化进行了评估。

在另一种可选模型中，用胆毒素α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱发肝损伤，模拟胆汁性肝硬化和硬化性胆管炎(Tjandra et al，Hepatology 37：280-290(2000))。ANIT与CCl₄相似，可诱发靶向非免疫细胞的肝毒性及随后的炎症性和纤维化应答，但与CCl₄相比所发生的肝脏解剖部位不同。

CCl₄处理6周后，组织化学分析显示，B细胞缺陷小鼠与类似处理的野生型小鼠相比胶原沉积显著减少。另外，通过分析具有正常数目的B细胞但缺少T细胞的小鼠证明，B细胞以不依赖于T细胞的方式对纤维化起贡献。ANIT处理的JH-/-小鼠在胶原沉积方面显示了相似的结果。

材料和方法

小鼠

除非另有说明，将小鼠饲养在Biogen Idee(Cambridge，MA)的无特异性病原的小鼠设施内。所有动物操作程序均得到了Biogen Idec的机构动物看护和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。来自表4所示品系的雄性小鼠必须体重达20g或更重、年龄至少6周方可选用于本项研究。

表4

^*参见Macay et al.，J.Exp.Med.190：1697-1710(1999).

参见Chen et al.，J.Exp.Med.189：1639-1648(1999).

§参见Casola et al.，Nat.Immunol.5：317-327(2004).

CCl₄和ANIT损伤模型

用20号动物喂食针灌胃投药不超过0.2ml体积的CCl₄(Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)和矿物油(Sigma-Aldrich Corp)的混合物。使用3.5mg/kg或1.75mg/kg剂量的CCl₄进行实验。优选后一种剂量，因为它降低了发病率/死亡率，且仍然诱导血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平和胶原沉积发生与前一种较高剂量相似的变化。为长期实验，每周一次对小鼠灌胃，持续6周。短期实验包括1次CCl₄施用。

将ANIT(1-萘异硫氰酸酯，Sigma-Aldrich Corp.)以30mg/ml溶解在矿物油(Sigma-Aldrich Corp.)中。以50mg/kg对小鼠灌胃，每周2次，持续8周。

在施用CCl₄24小时之后测量血清ALT水平。在第6次每周一次的灌胃之后一周或者在单次灌胃后指定的某天，处死小鼠，从每只小鼠取出3片不同的肝叶，在含4％PFA的PBS中温育两天，然后包埋用于进一步的免疫组化分析。

肝淋巴细胞分离

通过CO₂吸入对小鼠实施安乐死。用25G针插入肝门静脉，灌注10ml的冷PBS。去除胆囊后，将肝脏切成切片，并在50ml冰冷的RPMI/5％FBS中通过70μm网孔的细胞滤网(BD Falcon，Bedford，MA)。将每个肝脏的肝浆液在50ml管中300g、4℃离心10min。将沉淀重悬于10ml含0.02％胶原酶IV(Sigma-Aldrich Corp.)的RPMI 1640中，置于37℃45min。向每个管中加入30ml冰冷的RPMI/5％FBS，然后在30g离心3min。弃去沉淀。将上清液于4℃300g离心10min。将细胞沉淀重悬于6ml冰冷的RPMI1640(或45％Percoll(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden))中，然后置于含24％甲泛葡胺(Sigma-Aldrich Corp.)的PBS(或为70％Percoll)上。然后在4℃1000g离心20min。收集界面上的淋巴细胞，用RPMI/5％FBS洗涤，用于进一步分析。

肝内淋巴细胞受血液淋巴细胞污染的程度可能是最小的，因为结果显示肝脏特异性的NK-T细胞增加，并显示V-D连接区和D-J连接区的N核苷酸插入数之比在肝内淋巴细胞(3.5和4.4)和血液B细胞(4.5和3.4，另见“结果”)中有所不同。

从脾脏、血液和腹腔分离淋巴细胞

将脾脏通过尼龙滤网(Cell Strainer；BD Falcon，Bedford，MA)粉碎得到DMEM、5％FCS和2mM L-谷氨酰胺中的单细胞悬液。通过在溶解缓冲液(140mM NH₄Cl，17mM Tris-HCl，pH 7.65)中于冰上保温3分钟溶解红细胞。将血液收集到含EDTA的试管(BD Pharmingen，San Diego，CA)中。为了分离血液淋巴细胞，将200μl的血液置于Ficoll-Paque(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上，室温1000g离心20min。从界面上收集淋巴细胞。用5ml的DMEM、5％FCS、2mM L-谷氨酰胺洗涤腹腔以收集PC白细胞。经过这些步骤后，将淋巴细胞在DMEM、5％FCS、2mM L-谷氨酰胺中通过4℃，300g离心洗涤两次，并重悬于PBS/BSA/叠氮化物中供流式细胞术分析，或者重悬于细胞培养基中供增殖研究。

流式细胞术

如前人所述(Forster and Rajewsky，Eur.J.Immunol.17：521-528(1987))进行荧光染色。使用AnnexinV、7AAD，以及对IgM、IgD、CD19、CD23、CD5、CD69、CD86、B220、MHCII、CD43、Mac-1、CD4、CD8特异性的抗体(BD Pharmingen，San Diego CA)或对CD21特异性的抗体(Ebioscience，San Diego，CA)。将抗体与FITC、PE、APC、PerCP、Cy-Chrome或生物素偶联。用偶联PerCP的链霉抗生物素蛋白检测生物素化抗体。染色细胞固定后，使用FACScalibur(BD Biosciences，San Jose，CA)进行分析。

CFSE标记的B细胞的体外刺激

为生成储备溶液，将CFSE(Molecular Probes，Eugene，OR)溶解在DMSO中至5mM，并保存在-80℃。对脾B细胞进行MACS纯化，方法是根据制造商的指示使用偶联了抗-B220抗体(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)的MACS珠子在LS磁性柱(Miltenyi Biotec)上富集。然后将细胞用RPMI 1640洗涤两次，在37℃以5×10⁷个细胞/ml重悬于含5mM浓度的CSFE的温RPMI 1640中，经过10分钟。然后将细胞在冰冷的RPMI 1640/5％FCS中洗涤3次，以2×10⁵个细胞/100μl重悬于RPMI 1640/5％FCS/βME/L-谷氨酰胺中，并以100μl/孔转移到平底96孔板中。另加入含有2倍于最终浓度的刺激试剂的100μl RPMI。所用的刺激物是纯的山羊抗小鼠IgM的F(ab′)₂片段(2.5μg/ml；Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)、IL-4(25U/ml；R&DSystems，Minneapolis，MN)、抗小鼠CD40抗体(0.25μg/mL Ebioscience)、抗RP 105抗体(10.5μg/ml，Ebioscience)和LPS(20μg/ml，Sigma-Aldrich Corp.)。

免疫组化

使用1∶50稀释度的针对α平滑肌肌动蛋白(克隆1A4，DakoCytomation，Carpinteria，CA)特异性的抗体温育30min。将组织切片在10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0中，在125℃下经过30秒进行热诱导表位修复(epitoperetrieval)预处理，在90℃保持10秒，再经过20min冷却到室温，然后进行免疫染色。使用MM Biotinylation Kit(Biocare Medical，Walnut Creek，CA)，以3，3’-二氨基联苯胺(DAB)为底物，检测第一抗体对组织成分的结合。玻片用Mayer苏木精复染1分钟。

以20μg/ml浓度使用F4/80特异性抗体(克隆CI：A3-1，Serotec Inc.，Raleigh，NC)30分钟。在室温下用蛋白酶K(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)预处理组织切片5分钟。使用Vector Elite ABC kit(VectorLaboratories，Burlingame，CA)，利用DAB底物检测第一抗体的结合。玻片用Mayer苏木精复染1分钟。

使用ApopTag原位凋亡检测试剂盒(Chemicon International，Temecula，CA)根据制造商的指示进行TUNEL染色。使用DAB/氯化镍作为底物检测被标记的凋亡细胞。玻片用甲基绿(Vector Laboratories，Burlingame，CA)复染5分钟。

利用天狼星红(Sirius Red)染色剂检测胶原纤维(Luna，HistopathologicMethoda and Color Atlas of Special Stains and Tissue Artifacts：AmericanHistoLabs，Incorporated.767pp.(1992))；如他处描述(Luna，Manual ofHistologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology.NewYork：McGraw-Hill Book Company(1968))进行H&E染色。

PCR和Ig基因重排分析

根据基因组DNA分离试剂盒(Qiage0n，Valencia，CA)制造商的规程，从被正选择到CD19⁺磁珠(Miltenyi Biotec)上的细胞中提取DNA。使用DNA(2μl，相当于大约10³个B细胞)扩增VDJ连接区。进行两轮扩增，使用对J558L，Q52和7183V_H家族特异性的VHA、VHB和VHE 5′引物，第一轮使用JH4E 3′(16)引物，第二轮使用巢式JH1或JH4A 3′引物。所有引物均在Bioden Idee合成。第一轮进行20个循环(95℃ 1min、60℃ 1min、72℃ 1.5min)；第二轮进行30个循环(95℃ 1min、63℃ 1min、72℃ 1.5min)，并使用2μl的第一轮反应物作为模板。从凝胶中纯化出期待的0.4kb片段，并亚克隆到pCR4-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。制备来自单独克隆的DNA并使用标准的载体特异性引物进行测序。

间质胶原定量

对于每只动物，总共对3个来自肝脏的切片(每个来自不同的叶)进行了染色。在偏振光下以5X放大率拍摄天狼星红染色的黑白照片。照片的拍摄使得肝组织占据照相机摄入的整个区域，以保证每张照片中的总图像面积是相等的(每只动物4-10张照片)。用电子手段去除每幅图像中组成性含有胶原的血管。然后利用MetaMorph图像分析软件(Universal ImagingCorporation，Downingtown，PA)确定白色染色(间质胶原)的量。定量以任意单位(1个关联于1000个像素)显示。白色区域的绝对量在不同的实验之间不能直接比较，因为其随天狼星红染色的强度而变化。

结果

B细胞是肝脏中主要的淋巴细胞群体

胚胎肝脏，也就是发育中胚胎的主要血细胞生成部位中的B细胞已经得到了大量的研究。但是，对成体肝脏中的肝B细胞仍知之甚少。在本实施例中，对肝内(IH)B细胞进行了表型和功能表征。

从PBS灌注的肝脏富集了淋巴细胞群体后，通过B谱系特异性标志CD19的染色对IHB细胞的比例定量，在BALB/c和C57BL/6小鼠中，B细胞均占IH淋巴细胞的大约50％(范围为30-60％不等，图1A，数据未显示)。从一个肝脏分离的B细胞的绝对数目是～2×10⁶个。结果显示CD19⁺IHB细胞与它们脾脏的对应细胞表达相似水平的IgM，IgD，B220，MHCII和CD62L(图1A及B，数据未显示)。IHB细胞不表达CD43和Mac-1这两个B-1或未成熟B细胞的典型标志(数据未显示)。IHB细胞表达CD5的水平比血液B细胞上检测到的水平高，但低于PC B细胞上观察到的水平(图1B)。较高的CD5水平指示常规的B细胞活化(Cong et al，Int.Immunol.3：467-476(1991))。IHB细胞表达CD23，但表达水平低于脾脏或血液B细胞。IHB的CD21表面表达也稍微低于脾B细胞，但高于血液B细胞(图3B)。总而言之，就这些标志的表达而言，肝B细胞与滤泡脾B细胞最为相似。

肝B细胞是功能活性的(functionally competent)

肝脏通常被认为是垂死的淋巴细胞的归宿(Crispe et al.，Immunol.Rev.174：47-62(2000))，因此使用Annexin V来确定IHB细胞是否是倾向凋亡(pro-apoptotic)的。Annexin V结合磷脂酰丝氨酸(PS)：一种当细胞经历凋亡时从细胞膜内层转移到外层的磷脂。Annexin V结合了多到30％的肝B细胞，而相比之下结合了～15％的脾B细胞(图1C，数据未显示)。因此说，大多数肝B细胞并不表现凋亡倾向，且肝中凋亡细胞数目较脾中为多可能与淋巴细胞分离的差异有关。

B淋巴细胞响应于促有丝分裂和B细胞受体交联的增殖能力是一种在B细胞亚群之间差异显著的重要功能特征(Morris and Rothstein，J.Exp.Med.777：857-861(1993)；Philips et al，Immunol.Cell.Biol.76：332-342(1998)；Erickson et al，2001.J.Immunol.166：1531-1539(2001))。对肝和脾B细胞响应于多种刺激物的增殖以及CD86(B7.2)和MHCII等共刺激分子的上调的程度进行了比较。有趣的是，IHB细胞的增殖响应非常类似于脾B淋巴细胞(图1D)：针对Toll样受体4、RP105和CD40刺激的响应相同，而针对IgM交联的响应在没有IL-4时更强，在有IL-4时则不然。仅在IgM交联时更强的增殖响应可能反映IHB细胞在没有外源生存因子如IL-4的条件下培养时存活得更好，这与CD5上调(图1B)所暗示的IHB细胞的活化状态是一致的。所有测试的刺激物对MHCII、CD86和CD5上调的程度在肝和脾B细胞中是非常相似的(图1B、D，数据未显示)。

IHB细胞与脾B2细胞相似，而且不是来源于胚胎肝脏

成体肝脏中的B细胞可能是来自胚胎肝脏的残余的肝B细胞世代。或者，IHB细胞可能和成体生物体中的脾B细胞一样衍生自骨髓(BM)。为了解决肝内B细胞的来源问题，对它们的VDJ重排进行了基因分析。在胚胎肝脏中生成的新生儿B细胞的VDJ连接区中，几乎见不到无模板(non-templated)(N，P)核苷酸的插入，这与B1细胞报道的情况类似(Feeney，J.Exp.Med.172：1377-1390(1990)；Gu et al，EMBO J.2：2133-2140(1990)；Meek，Science 250：820-823.(1990))。相反，成体脾B细胞和血液B细胞具有很多无模板核苷酸添加(Kantor et al，J.Immunol.755：1175-1186(1997)；Kepler et al，J.Immunol.757：4451-4457(1996))。将衍生自成体肝淋巴细胞集合的CDR3序列与衍生自2日龄小鼠脾细胞或成体小鼠血液B细胞的CDR3序列进行了比较。在VDJ连接区序列方面，成体IHB细胞显著不同于新生儿B细胞，而类似于脾B2细胞或再循环中的血液B细胞。新生儿B细胞中N、P核苷酸的平均数在VD连接区是0.5，在DJ连接区是0.1。这明显不同于成体肝脏(或血液)中的B细胞的VD连接区为3.5(或4.5)、DJ连接区为4.4(或3.4)的情况。有趣的是，成体肝B细胞和血液B细胞的VD和DJ连接区长度也表现出差异；该差异处于统计学显著的边缘：p＝0.1，student’s t检验。IHB细胞的VD连接区中的N、P核苷酸比其DJ连接区中的少，而常规成体B2细胞中报道了与此相反的结果(Kantor et al，J.Immunol755：1175-1186(1997))。在IHB和成体血液B细胞中N、P插入长度的差异可能是肝内B细胞选择的结果。另外，这种差异也支持了这样的看法，即肝B细胞是一个未被外周血B细胞显著污染的真正的肝内群体。

B细胞在肝纤维化中的作用

为了评估B细胞在肝脏中可能发挥的生理作用，诱发肝病后，对缺乏B细胞的小鼠和野生型小鼠中的疾病进展进行了比较。使用CCl₄诱发性肝损伤模型，其中随着每次使用CCl₄均发生明显的坏死性炎症肝损伤(necroinflammatory liver injury)，随之发生持续的修复应答。这种模型被认为优于多种广泛使用的肝损伤模型(例如血吸虫、LPS、ConA)，因为毒性损伤诱发普遍的肝毒性，而不是按照事先推理靶向于免疫系统的特定部分。不过，有趣的是，发现肝脏中的B细胞对CCl₄的施用特别敏感。在CCl₄处理1天之后IHB细胞数目下降了大约10倍，而与之相对的是其它肝内淋巴细胞(NK-T、T细胞)在此时间点仍未受影响(数据未显示)。最迟到CCl₄注射后第五天时B细胞数目得以恢复(数据未显示)。

为了检验B细胞是否在肝损伤和修复中起作用，将B细胞缺陷小鼠用于CCl₄诱发的肝毒性研究。选用于分析的B细胞缺陷小鼠品系在免疫球蛋白重链基因J_H区中携带有目标缺失，该缺失排除了组装成编码重链基因的可能，因此可阻止B细胞和抗体的产生(Chen et al，Int.Immunol.5：647-656(1993))。这些B细胞缺陷小鼠在本文中称为J_H-/-小鼠。

借助在CCl₄处理24小之时后肝细胞特异性酶ALT向血清中的释放来评估CCl₄诱发的肝细胞损伤的程度，该损伤程度在J_H-/-和WT BALB/c小鼠中是相似的(图2A)。从组织学分析(图3，见下文)也可明显看到这一点。但有趣的是，积累的胶原纤维的量有很大的差异；在以每周一次1.75或3.5mg/kg CCl₄的剂量施用第6次后一周时，J_H-/-小鼠的间质胶原沉积比WT小鼠少大约6-8倍(图2B和2C)。经过6次CCl₄处理以后，F4/80⁺巨噬细胞和产生平滑肌肌动蛋白的成肌纤维细胞的数量或定位未发现显著变化(数据未显示)。因此，B细胞看来构成一种对肝脏响应CCl₄发生纤维化改变而言必需的、非冗余的(non-redundant)细胞群体。

为了检验B细胞的功能是仅限于CCl₄诱发的损伤这一特例，还是在肝组织的修复中起到更普遍的作用，用1-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱发了肝毒性，因为ANIT可通过与CCl₄诱发截然不同的机制导致肝破坏。ANIT诱发的肝毒性表现为胆管上皮细胞和肝实质细胞的嗜中性粒细胞依赖性坏死(Hill et al，Toxicol.Sd 47：118-125(1999))。ANIT处理8周后，发现JH-/-小鼠的胶原沉积比WT小鼠少大约7倍。因此说，在至少两种模型系统中，在没有B细胞的条件下纤维化得以降低。

为了考察将B细胞数目增加到正常水平以上是否会导致更明显的纤维化，使用了BAFF-tg小鼠，这种小鼠与相应的C57B1/6野生型对照小鼠相比，B细胞数目显示20-30％的增加(Mackay et al，J.Exp.Med.iP0：1697-1710(1999))。经过6次CCl₄处理以后，BAFF-tg和C57B1/6对照中均发生了纤维化。该纤维化的特征在于胶原纤维沉积少于BALB/c小鼠中所见的量(数据未显示；Shi et al，Proc.Natl.Acad.Sd USA 94：10663-10668(1997))。但有趣的是，BAFF转基因小鼠的纤维沉积量是相应的野生型C57B1/6小鼠的大约两倍(图2D)。

B细胞缺陷和野生型小鼠对单次CCl₄诱发的损伤具有不同的响应

为了获知经过6周处理后何种急性反应可触发胶原沉积的变化，在单次CCl₄攻击后1、3和5天时对B细胞缺陷和对照小鼠的肝切片中组织改变的动力学进行了分析。有趣的是，检测凋亡细胞的TUNEL染色显示，虽然在第1天时的初始损伤是相似的，但J_H-/-小鼠到第3天已完全清除了凋亡细胞，而在野生型小鼠中即使在损伤5天后仍检测到了一些垂死的细胞(图3)。当对切片进行组织巨噬细胞特异性标志F4/80的染色时，发现早在第1天时，JH-/-中与野生型小鼠相比就有了巨噬细胞数目的少许增加，这种增加到第3天和第5天就变得非常显著了(图3)。因此看来，在没有B细胞存在时，巨噬细胞清除垂死肝细胞的能力似乎更好。由于胶原纤维的主要细胞来源是一群成肌纤维细胞(Rockey et al.，Clin.Liver.Dis.4：319-355(2000))，对受损肝脏中成肌纤维细胞的标志物——平滑肌肌动蛋白也进行了监测。最初在第3天可检测到成肌纤维细胞，其在B细胞缺陷小鼠和对照小鼠中的水平相似。但是，到第5天为止，野生型小鼠显示了多得多的成肌纤维细胞(图3)。随着损伤反复发生，巨噬细胞无法有效率地去除垂死肝细胞，这可能导致成肌纤维细胞受到过度刺激，最终导致长期损伤时可见胶原沉积增多。一项新近的研究(Duffield et al，J.Clin.Invest.115：56-65(2005))证明了巨噬细胞在肝脏的损伤和修复中起到截然不同且相反的作用。似乎在没有B细胞时，对炎症性瘢痕形成的恢复起贡献的那些巨噬细胞优先得到活化。

CD4⁺、CD8⁺或γδT细胞影响肝纤维化的程度不显著

为了评估T细胞缺陷小鼠是否在纤维形成上也有缺陷，对下述小鼠进行了一系列CCl₄诱发肝损伤的实验：同时缺乏B细胞和T细胞的小鼠(RAG2-/-)、缺乏CD⁺T细胞的小鼠(Aβ-/-)、缺乏CD8⁺T细胞的小鼠(β2m-/-)、或缺乏γδT细胞的小鼠(TCRδ-/-)。对每种小鼠突变体品系均使用具有相同遗传背景的对照品系(见“材料和方法”)。其中，只有RAG2-/-小鼠在长期CCl₄处理后显示与合适的野生型对应小鼠相比不相类似的胶原沉积量(图4，数据未显示)。RAG2-/-小鼠缺乏所有需要DNA重排方能实现其受体组装的淋巴细胞，这种小鼠与野生型小鼠相比，显示间质胶原的积累减少了大约3-4倍(图4B)。该结果与仅缺乏B细胞的小鼠中获得的结果非常类似，并不暗示T细胞在肝纤维化CCl₄模型中具有突出的作用。

B细胞在肝纤维化中的作用是抗体非依赖性的

B细胞可介导局部效应，例如抗原呈递、细胞因子释放和/或共刺激分子调控的细胞-细胞接触，也可以藉由抗体来介导远程效应。由于T细胞缺陷动物(见上文)在胶原沉积方面没有显示出任何差异，B细胞对T细胞的抗原呈递不大可能影响肝纤维化。

为了确定B细胞对肝纤维化的调控是否需要免疫球蛋白，使用了两种具有正常B细胞数目，但其血清中缺乏Ig或者Ig水平严重降低的小鼠品系。表达从一个整合于IgH座位J元件位置处的基因(D_HLMP2a等位基因(Casolaet al，Nat.Immunol.5：317-327(2004))表达EB病毒(Epstein-Barr virus)衍生蛋白LMP2a的小鼠同时缺乏表面免疫球蛋白和循环免疫球蛋白，而表达JH-/-背景的mIgM转基因的小鼠编码表面Ig但不编码分泌的Ig(Chan et al，J.Exp.Med.189：1639-1648(1999))。

如图5A中所示，经过6周每周1次的1.75mg/kg CCl₄处理后，表达EB病毒衍生LMP2a蛋白的小鼠和它们的野生型BALB/cAnNCrlBr对照表现出水平相近的胶原沉积。另外，表达表面Ig而不表达分泌Ig的mIgM tg(JH-/-)小鼠(Chan et al，J.Exp.Med./SP：1639-1648(1999))，与野生型对照BALB/c小鼠显示相同程度的CCl₄诱发性肝纤维化(图5B)。由此可见，B细胞对CCl₄诱发性肝纤维化病理的影响是抗体非依赖性的。值得指出的是，野生型BALB/c小鼠中纤维化的程度在这些实验中较先前的实验为低(图2、4、5)，可能是因为这些动物的不同舍饲条件和/或并发感染所致：LMP2a小鼠群体和mIgM小鼠群体均为肝螺杆菌(H.hepaticus)阳性；因此，将这些小鼠和相应的野生型品系饲养在隔离设施中。

讨论

本实施例证明，肝内B细胞是一个相当大的群体，其表型和功能特征与常规的B2细胞类似。IHB细胞表达CD5的程度稍微高于常规的B2细胞，而且它们在没有体外补充IL-4的条件下响应于IgM交联的增殖更好(图1)，这暗示着IHB细胞的活化状态。虽然已知成体肝脏含有能够产生多谱系(multilineage)白细胞的c-kit⁺多潜能造血干细胞(Watanabe et al，J.Exp.Med.184：681-693(1996)；Taniguchi et al，Nat.Med.2：198-203(1996))，成体肝脏中大多数B细胞似乎是骨髓衍生的，这与自我繁殖性的胚胎肝脏衍生的B1谱系细胞相反(Herzenberg，Immunol.Rev.175：9-22(2000))。IHB细胞有可能是骨髓来源的：肝内B细胞VDJ连接区含有许多N核苷酸插入，总平均长度与常规B2细胞类似。值得注意的是，末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)，即负责N核苷酸插入的酶的表达，还没有在成体肝脏中得到过研究(Benedict et al，Immunol.Rev.175：150-157(2000))，因此，表面上看可能的是(但可能性不大)，成体肝脏B细胞在肝脏中是以TdT依赖性的方式产生的。

这个实施例显示B细胞在肝纤维化的发生中扮演着抗体非依赖性的重要角色，从而又增加了一种可能依赖于局部B细胞功能的疾病模型。在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中也已经证明B细胞对自身免疫性糖尿病起着必不可少的作用。B细胞缺陷的NOD Igμ缺失(null)小鼠和B细胞耗竭(B-celldepleted)的NOD小鼠没有发生胰岛炎或胰岛素依赖性糖尿病，这支持了B细胞对于自身反应性T细胞的引发和/或活化具有关键作用的看法(Serreze etal，J.Exp.Med.184：2049-2053(1996)；Noorchashm et al，Diabetes 46：941-946(1997))。还证明B细胞在多基因fas完整型和fas缺陷型全身性自身免疫微量残留白血病(MRL)模型中是狼疮肾炎所必需的(Chan et al，J.Exp.Med.189：1639-1648(1999)；Chan et al，J.Immunol.160：51-59(1998)；Chan et al，J.Immunol.163：3592-3596(1999))。在两种情况下，均发现抗体非依赖性机制对于B细胞的作用而言是关键的(Chan et al，J.Exp.Med.189：1639-164％(1999)；Wong et al，Diabetes 53：2581-2587(2004))。

在这个实施例中，使用了组成性B细胞缺如的小鼠来研究B细胞在纤维化病理中的作用。虽然B细胞缺陷小鼠在肉眼所见生理(gross physiology)上是正常的，但其缺少滤泡树突状细胞网络(follicular dendritic networks)(Fu et al，J.Exp.Med.187：1009-1018(1998)；Gonzalez et al，J.Exp.Med.187：997-1007(1998)；Endres et al，J.Exp.Med.189：159-168(1999))、肠道集合淋巴结中的连滤泡上皮(Golovkina et al，Science 25(5：1965-1968(1999))和一个非规范NK-T细胞亚群(Treiner et al，Nature 422：164-169(2003))。B细胞减少(B-cell-less)的小鼠在CD4⁺T细胞功能方面亦有缺陷(Baumgarth et al，Proc.Natl.Acad.ScL USA 97：4766-4771(2000))，还可能具有其它某些尚未得到描述的发育/功能缺陷。因此，B细胞缺陷小鼠获得的结果表明，B细胞间接地影响肝纤维化的发病机制。

由于T细胞缺陷小鼠在肝纤维化的发生方面不显示任何不同(数据未显示)，JH-/-小鼠中观察到的肝纤维化的显著减退不可能用CD4⁺T细胞缺陷来解释。但是，一种定居于鼠肝中、表达含不变TCR(invariant TCR)的Vα19的B细胞依赖性NK-T细胞亚群(Shimamura et al，FEBS Lett.516：97-100(2002))可能对B细胞缺陷小鼠中所见的纤维化降低有贡献。NK-T细胞以其可快速响应并可产生TH1和TH2两类细胞因子的能力闻名(Godfrey et al，J.Clin.Invest.J 14：1379-1388(2004))。这样的性质使NK-T细胞能够参予免疫应答的调控(Godfrey et al.，J.Clin.Invest.7/4：1379-1388(2004))。在缺少常规Vα14TCR NK-T细胞的CD1-/-小鼠中未发现肝纤维化发生有明显的不同(数据未显示)。不幸的是，尚没有能够用来研究非规范Vα19不变NK-T细胞在肝纤维化中的作用的小鼠突变体。不过，由于RAG-/-小鼠显示与B细胞缺陷小鼠类似程度的纤维化抑制，暗示那些其发育中需要基因重排的细胞类型(多个谱系的B细胞和T细胞)起着某种作用。因此，这些数据合起来提示：其发育需要B细胞的非CD1限制性NK-T细胞(Treiner et al.，Nature 422：164-169(2003))或者B细胞自主功能，在CCl₄诱发性肝毒性模型所显示的纤维化中起作用。

通过使用两种先前产生的免疫球蛋白生成缺陷性小鼠品系(LMP2a插入和mIgM-Tg小鼠)，证明了CCl₄诱发的肝纤维化的发生不需要抗体。LMP2a小鼠具有正常的B细胞数目，并且既完全缺乏分泌的抗体，也完全缺乏免疫球蛋白表面表达(Casola et al.，Nat.Immunol.5：317-327(2004))。LMP2A不但模仿BCR信号传导，而且触发其它信号传导途径(Ikeda et al.，J.Virol.77：5529-5534(2003))，因此，在表达转基因表面BCR，且抗体效价较正常小鼠减少了300-500倍的mIgM-Tg(JH-/-)小鼠中(Chan et.al J.Exp.Med189：1639-1648(1999))，进行了纤维形成的评估。两个小鼠品系均发生了程度类似于对照的肝纤维化。因此，B细胞在肝纤维化病理中的作用似乎是抗体非依赖性的，这提示它是由局部B细胞的功能(例如细胞因子分泌和/或细胞-细胞接触)，而不是定位于生物体中其它位置的B细胞的潜在远程效应所介导的。B细胞的抗原呈递功能在肝纤维化中不大可能起显著的作用，因为常规T细胞缺陷的小鼠与其野生型的对应小鼠显示类似的纤维形成。另外，LMP2a B细胞没有结合、内在化和呈递抗原的能力，因为它们的表面上缺乏B细胞受体，并且它们也显示与野生型小鼠类似的胶原沉积。这些数据总的来说提示：肝组织的修复受局部B细胞功能的影响，该功能可能在一定程度上由本文所定义的IHB细胞所介导。从表面上看，B细胞可能压倒肝中的清除机制。但是，B细胞的数目相比于肝细胞来说是非常小的。

本实施例中给出的结果与下列报道一致：就响应于CCl₄的肝损伤程度而言，在脾切除大鼠中显著轻于假手术大鼠(Chen et al，Chin.Med.J.(Engl)111：779-783(1998))，在BALB/c背景的SCID小鼠中显著轻于合适的对照(Shi et al，Proc.Natl.Acad.Sd.USA 94：10663-10668(1997))。但是，由寄生虫曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)诱发的肝纤维化在B细胞缺陷小鼠中较对照小鼠有所增加(Ferru et al，Scand.J.Immunol 48：233-240(1998))。这种不一致可以用由反复的肝细胞损伤(如CCl₄和ANIT的情况)或由低水平的蠕虫感染所致的纤维化诱发机制的不同来解释。

B细胞的功能还被人们与小鼠和人的皮肤中的纤维化联系起来。在紧皮(TSK/+)小鼠和全身性硬化患者中，CD19表达增强所致的慢性B细胞活化导致皮肤纤维化和自身免疫(Saito et al，J.Clin.Invest.109：1453-1462(2002))。另外，一个从硬皮病患者肺组织建立的B细胞系表现可能导致纤维化变化的增殖增强和炎症响应(Kondo et al，Cytokine 13：220-226(2001))。

总而言之，本实施例描述了成体肝B细胞群体的分离和表征，并直接证明了B细胞在肝损伤后的组织修复中起作用。该实施例进一步证明B细胞参与了纤维化症候的病理。因此，这里提出的结果提示B细胞拮抗剂可能证明对治疗纤维化症候有效。

实施例2

B细胞缺陷小鼠模型中的肺纤维化

介绍

在动物模型中，可以通过暴露于博来霉素诱发肺纤维化。啮齿动物中气管内施用博来霉素是使用最广泛的肺纤维化模型。博来霉素是一种可导致内皮细胞和上皮细胞损伤的细胞毒剂，这种损伤部分地是通过产生自由基和诱导炎性细胞因子(Sleijfer，Chest 120：617-624(2001))导致的。成纤维细胞被活化，在两周内，肺中出现显著的纤维化和胶原沉积。本实施例显示，B细胞缺陷小鼠在持续的全身性博来霉素暴露后，相比于同样处理的野生型小鼠表现出存活率提高和肺纤维化降低。

材料和方法

小鼠

C57BL/6J：B细胞功能正常的野生型小鼠

B6.129S2-lgh-6^tmlCgn/J：B细胞缺陷小鼠

持续的博来霉素暴露

在第0天，对野生型小鼠或B细胞缺陷小鼠无菌地植入皮下七日Alzet

渗透压微型泵，其中含盐水(n＝7，wt；n＝5，ko)或剂量水平为60(n＝12，wt；n＝10，ko)或100(n＝8，wt；n＝10，ko)mg/kg(总剂量经过7天递送)的博来霉素溶液。

测量

监测体重和临床体征1个月时间。在第28天对小鼠实施安乐死并取出肺，滴注10％中性缓冲福尔马林并固定在其中。对肺进行Masson三色染色以鉴定存在的胶原/纤维化，并进行α-肌动蛋白免疫组化染色以确定将来发生纤维化的潜力的程度。用Metamorph

软件通过组织形态测定手段确定由胶原或肌动蛋白占据的组织面积的比例。

结果

到第28天为止，施用60mg/kg/7d的博来霉素仅产生了不多的α肌动蛋白积累。野生型小鼠和B细胞敲除小鼠显示了类似的α肌动蛋白水平(图6)。

到第28天为止，施用100mg/kg/7d的博来霉素产生了中等到大量的α肌动蛋白积累。野生型小鼠相比于B细胞敲除小鼠显示较低的存活率和统计学上较高的α肌动蛋白水平(图6、7和8)。

这些试验的结果证明，在C57BL6小鼠中，B淋巴细胞的缺失可在持续的博来霉素暴露后降低肺纤维化的程度并提高存活率。因此，这些结果为B细胞拮抗剂用于治疗纤维化症候，特别是肺系统的纤维变性症候提供了进一步的支持。

实施例3

B细胞缺陷小鼠模型中的肾纤维化

介绍

单侧输尿管梗阻(UUO)是产生进行性组织压迫、肾小管变性(tubulardegeneration)、以及间质和肾小球纤维化的梗阻性肾病模型(Miyajima et al，Kidney International 55：2301-2313(2000))。在这个实施例中显示，B细胞缺陷小鼠所表现的响应于UUO的肾纤维化与野生型小鼠相比有所降低。

材料和方法

小鼠

C57BL/6J：B细胞功能正常的野生型小鼠

B6.129S2-lgh-6^tmlCgn/J：B细胞缺陷小鼠

单侧输尿管梗阻

第0天在野生型小鼠(n＝10)或B细胞缺陷小鼠(n＝10)中，在氯胺酮/赛拉嗪麻醉、无菌条件下，分离左输尿管，结扎，并在结扎部之间切开。还包括了未经手术的野生型小鼠(n＝5)或B细胞缺陷小鼠(n＝5)作为正常对照。

测量

在发展到疾病高峰的10天过程中对体重和临床体征进行监测。在第10天对小鼠实施安乐死，取出双肾，在10％中性缓冲福尔马林中固定。用对肾进行Masson三色染色法染色以鉴定存在的胶原/纤维化，并进行α-肌动蛋白免疫组化染色以确定将来发生纤维化的潜力的程度。用Metamorph软件通过组织形态测定手段来确定胶原或肌动蛋白所占据的组织区域的比例。

结果

UUO之后，B细胞缺陷小鼠与对应的野生型小鼠相比显示α-肌动蛋白染色统计学显著地减少了29％(图9A)，积累的间质胶原显示统计学显著地减少了62％(图9B)。应当理解的是，这些病理状态构成纤维化症候的测量和定量的两种经典标志。

UUO之后，B细胞缺陷小鼠还显示肾小管扩张显著降低(图9C)，健康肾小管染色显著增加(图9D)。即使在没有损伤时，在B细胞缺陷小鼠中也观察到了健康肾小管染色增加(图9D，也见图10)。

这些实验的结果显示，B淋巴细胞的缺失降低了UUO诱发性损伤之后肾纤维化的程度。

在多种模型系统中，实验诱发的纤维化损伤程度在B细胞缺陷小鼠中均有显著降低(见实施例1-3)，这一观察结果为使用B细胞拮抗剂治疗与炎症/纤维化病理相关的多种疾病适应证提供了强有力的支持。

实施例4

抗CD20单克隆抗体对抗博来霉素处理所致的肺和脾B细胞增多

介绍

如实施例2中证明的，动物模型中暴露于博来霉素诱发肺纤维化，而博来霉素诱发的肺纤维化的程度在B细胞缺陷小鼠中有所降低。这个实施例显示，用博来霉素处理的小鼠表现肺中B细胞增多，而且重要的是，在接受抗CD20抗体处理的小鼠中，这种博来霉素诱导的B细胞增多被显著地降低。这些结果为使用B细胞拮抗剂治疗纤维化症候提供了进一步支持。

材料和方法

本实施例中使用9周龄的雄性C57B1/6小鼠进行实验。第0天将小鼠通过氯胺酮/赛拉嗪腹膜内注射麻醉，然后使用PennCenntury雾化器对小鼠气管内(IT)给予50μl体积0.025单位的博来霉素。将PennCenntury雾化器通过口腔插入气管。在第-7天(施用博来霉素前7天)及第7天，对小鼠腹膜内施用抗鼠CD-20单克隆抗体(名为“18B12”，由Biogen Idee开发，美国专利申请号60/741,491)或PBS。另一组小鼠仅接受气管内施用PBS而无其它处理。

第9天用CO₂对动物实施安乐死，收集肺和脾。用剪刀将肺和脾剪成片段，匀浆，然后转移到50ml离心管中。将40ml冰冷的RPMI1640/5％FBS加入管中，并于300xg(1200rpm，于使用标准转头的IEC Centra 8R中)、4℃条件下离心10min，以沉降除尽细胞碎片。37℃条件下将离心沉淀重悬于10ml消化培养基中40-60min。

为了分离富集了淋巴细胞的细胞群体，向每个管中加入30ml冰冷的无血清RPMI 1640，使终体积为40ml。将管在4℃、300xg(1200rpm于IECCentra 8R中)条件下离心10min。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于冰冷的含45％Percoll的无血清RPMI 1640中至终体积为6ml，并置于含70％Percoll的PBS上，以获得梯度。

收集界面，加入10倍体积的冰冷无血清RPMI 1640，将管在4℃、400xg(1500rpm于IEC Centra 8R中)离心10min。使用FACS分析表达CD5和CD19的细胞(图11、12和13)。

结果

如图11和13所示，用博来霉素处理的小鼠在肺中显示了B细胞(CD19⁺)的增加，而在除博来霉素之外还接受了抗CD20抗体的小鼠中，这种增加被显著地降低。如图12中所示，抗CD20抗体处理也有效地消减了脾中的B细胞。如上文实施例2中提到的，在动物模型中暴露于博来霉素可诱导肺纤维化。因此这些结果支持了这样的结论，即B细胞拮抗剂诸如抗CD20抗体可有效地治疗纤维化症候。

实施例5

抗CD20单克隆抗体针对CCl₄诱发的肝纤维化具有保护性

介绍

实施例1中已证明，在动物模型中暴露于CCl₄可诱发肝纤维化，并且在B细胞缺陷小鼠中CCl₄诱发的肝纤维化的程度降低。本实施例显示，在用抗CD20抗体处理的小鼠中CCl₄诱发的肝纤维化显著降低。这些结果为B细胞拮抗剂在纤维化症候治疗中的使用提供了进一步的证据。

材料和方法

在通过施用化学剂四氯化碳(CCl₄)诱发的小鼠肝纤维化模型中测试了一种抗鼠CD20B细胞消减性抗体(名为“18B12”，由Biogen Idee开发，美国专利申请号60/741,491)。以1.75ml/Kg的剂量施用调制于矿物油中的CCl₄，每周一次，施用6周；同时用下列物质处理(腹膜内)小鼠：单独的PBS；250μg的所述抗CD20单克隆抗体；或250μg同型对照单克隆抗体。在施用第一剂CCl₄前一周及随后施用每一剂CCl₄前一天对小鼠注射PBS和抗体。施用第6剂CCl₄7天后，处死小鼠，切出肝脏，并针对纤维化的标志物——平滑肌肌动蛋白的表达进行免疫染色。

结果

如图14显示，用抗CD20抗体处理的动物中肝纤维化的程度(如平滑肌肌动蛋白染色所表明的)比接受PBS的对照动物中少大约20％，且比接受对照单克隆抗体的动物中少大约28％。同样，本实施例显示本发明的方法适用于治疗、延缓或防止纤维化症候的发作或进展，尤其是在肝中。

实施例6

治疗纤维化症候的方法

根据本实施例，对诊断为具有纤维化症候的一种或多种症状的患者进行了治疗。这里，要治疗的纤维化症候的例子包括，例如，与损伤/纤维化相关的肺病，与损伤/纤维化相关的慢性肾病(肾纤维化)，肠纤维化，肝纤维化(包括例如肝硬化)；头颈纤维化，角膜瘢痕形成，血管病症，以及与纤维化相关的自身免疫疾病，例如硬皮病、狼疮和移植物抗宿主病。

用rituximab或人源化2H7，或rituximab或人源化2H7的片段(诸如Fab、F(ab′)₂、Fv、scFv或双抗体)处理患者。

优选的是，根据下列任一剂量给药方案对患者静脉内(IV)施用抗体：

(A)第1天50mg/m²；第8、15和22天150mg/m²；

(B)第1天150mg/m²；第8、15和22天375mg/m²；或

(C)第1、8、15和22天375mg/m²。

用CD20抗体处理的患者将显示纤维化症候的症状的改善。

在另一供选择的剂量给药方案中，如刚才方案A中所述用rituximab处理患者，并如U.S.P.N.6,316,601中所述用针对α_vβ₆的抗体处理患者；本文引证上面这篇文献的全部内容。同样，患者将显示纤维化症候的症状的改善。

在又一个供选择的剂量给药方案中，如方案B中所述用rituximab处理患者。对患者的外周B细胞水平及目标组织中的胶原沉积量进行监测。8个月后，当患者重建的B细胞免疫应答和/或胶原沉积量达到预定水平时，根据方案A用rituximab再次处理患者。

至此，为了清楚和理解的目的，已经通过图示和举例相当详细地对本发明进行了充分的说明，但本领域普通技术人员显然可知，通过在多种多样的等同条件、配方和其它参数范围内对本发明加以修改或变化，本发明同样可以实施，而不影响本发明或其任何具体实施方案的范围，而且所附权利要求的范围意图涵盖这样的修改和变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均说明本发明相关领域的技术人员的技术水平，本文引证这些出版物、专利和专利申请，其范围相当于分别单独明文引证这些出版物、专利和专利申请中的每一个。

序列表

<110>生物基因IDEC公司(BIOGEN IDEC INC.)

健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)

<120>治疗纤维化症候的方法

<130>2159.0530002

<150>US 60/682,005

<151>2005-05-18

<150>US 60/741,867

<151>2005-12-05

<160>20

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>232

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1               5                   10                  15

Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

            20                  25                  30

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val

        35                  40                  45

Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro

    50                  55                  60

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

65                  70                  75                  80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

                85                  90                  95

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn

            100                 105                 110

Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val

        115                 120                 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

    130                 135                 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145                 150                 155                 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

                165                 170                 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

            180                 185                 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

        195                 200                 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

    210                 215                 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225                 230

<210>2

<211>471

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1               5                   10                  15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

            20                  25                  30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

    50                  55                  60

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65                  70                  75                  80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn

                85                  90                  95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

        115                 120                 125

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

    130                 135                 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145                 150                 155                 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

                165                 170                 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

            180                 185                 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

    210                 215                 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225                 230                 235                 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

                245                 250                 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

            260                 265                 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

        275                 280                 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

    290                 295                 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305                 310                 315                 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

                325                 330                 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

            340                 345                 350

Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

        355                 360                 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

    370                 375                 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385                 390                 395                 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

                405                 410                 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

            420                 425                 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

        435                 440                 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

    450                 455                 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465                 470

<210>3

<211>471

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>3

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1               5                   10                  15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

            20                  25                  30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

        35                  40                  45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

    50                  55                  60

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn

65                  70                  75                  80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn

                85                  90                  95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

            100                 105                 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe

        115                 120                 125

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

    130                 135                 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145                 150                 155                 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

                165                 170                 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

            180                 185                 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

    210                 215                 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225                 230                 235                 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

                245                 250                 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

            260                 265                 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

        275                 280                 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

    290                 295                 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305                 310                 315                 320

Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

                325                 330                 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

            340                 345                 350

Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

        355                 360                 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

    370                 375                 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385                 390                 395                 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

                405                 410                 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

            420                 425                 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

        435                 440                 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

    450                 455                 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465                 470

<210>4

<211>107

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                  105

<210>5

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1                5                  10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>6

<211>213

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

            100                 105                 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

        115                 120                 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

    130                 135                 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

                165                 170                 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

            180                 185                 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

        195                 200                 205

Asn Arg Gly Glu Cys

    210

<210>7

<211>452

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser LeuArg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

           20                  25                  30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

        115                 120                 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

    130                 135                 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145                 150                 155                 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

                165                 170                 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

            180                 185                 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

        195                 200                 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

    210                 215                 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225                 230                 235                 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

                245                 250                 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

            260                 265                 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

        275                 280                 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

    290                 295                 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305                 310                 315                 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

                325                 330                 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

            340                 345                 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

        355                 360                 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

    370                 375                 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385                 390                 395                 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

                405                 410                 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

            420                 425                 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

        435                 440                 445

Ser Pro Gly Lys

    450

<210>8

<211>452

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

        115                 120                 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

    130                 135                 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145                 150                 155                 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

                165                 170                 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

            180                 185                 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

        195                 200                 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

    210                 215                 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225                 230                 235                 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

                245                 250                 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

            260                 265                 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

        275                 280                 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr

    290                 295                 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305                 310                 315                 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

                325                 330                 335

Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

            340                 345                 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

        355                 360                 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

    370                 375                 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385                 390                 395                 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

                405                 410                 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

            420                 425                 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

        435                 440                 445

Ser Pro Gly Lys

    450

<210>9

<211>121

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

        115                 120

<210>10

<211>106

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

             20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

            100                 105

<210>11

<211>107

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5               10                      15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>12

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>13

<211>451

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

        115                 120                 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

    130                 135                 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145                 150                 155                 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

                165                 170                 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

            180                 185                 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

        195                 200                 205

His Lys  Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

    210                215                 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225                 230                 235                 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

                245                  250                 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

            260                 265                 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

        275                 280                 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr

    290                 295                 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305                 310                 315                 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro

                325                 330                 335

Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

            340                 345                 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

        355                 360                 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

    370                 375                 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385                 390                 395                 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

                405                 410                 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly AsnVal  Phe Ser Cys Ser Val

            420                 425                 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

        435                 440                 445

Ser Pro Gly

    450

<210>14

<211>291

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>14

Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys

1               5                   10                  15

Asp Pro Leu Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp

        35                  40                  45

Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys Asp Pro Leu Gly Gly Gly Gly

    50                  55                  60

Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

65                  70                  75                  80

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

                85                  90                  95

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Trp Trp Asp Val Ser

            100                 105                 110

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

        115                 120                 125

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

    130                 135                 140

Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

145                 150                 155                 160

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

                165                 170                 175

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

            180                 185                 190

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

        195                 200                 205

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

    210                 215                 220

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

225                 230                 235                 240

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

                245                 250                 255

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

            260                 265                 270

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

        275                 280                 285

Pro Gly Lys

    290

<210>15

<211>17

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>15

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Ser Val Leu

1               5                   10                  15

Lys

<210>16

<211>17

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>16

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Trp Val Pro Cys Gly Leu Leu

1               5                   10                  15

Arg

<210>17

<211>17

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>17

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Glu Met Leu

1               5                   10                  15

Gly

<210>18

<211>17

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>18

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys His Met Leu

1               5                   10                  15

Arg

<210>19

<211>17

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>19

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Trp Val Ala Cys Gly Leu Leu

1               5                   10                  15

Arg

<210>20

<211>213

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

        35                  40                  45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

            100                 105                 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

        115                 120                 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

    130                 135                 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145                 150                 155                 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

                165                 170                 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

            180                 185                 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

        195                 200                 205

Asn Arg Gly Glu Cys

    210

Claims (48)

1. 一种治疗纤维化症候的方法，所述方法包括对需要该治疗的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂。

2. 权利要求1的方法，其中所述B细胞拮抗剂是针对B细胞表面抗原的抗体。

3. 权利要求2的方法，其中所述B细胞表面抗原是CD20。

4. 权利要求2的方法，其中所述B细胞表面抗原选自下组：CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD40，CD52，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85，CD86，TLR-7，TLR-9，CXCR3，APRIL，BR3，BCMA和TACI。

5. 权利要求2的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

6. 权利要求2的方法，其中所述抗体是针对CD20的单克隆抗体。

7. 权利要求6的方法，其中所述抗体是针对CD20的嵌合鼠/人单克隆抗体。

8. 权利要求7的方法，其中所述针对CD20的单克隆抗体是rituximab

9. 权利要求2的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

10. 权利要求2的方法，其中所述抗体是完全人抗体。

11. 权利要求1的方法，进一步包括对所述患者施用治疗有效量的BAFF拮抗剂。

12. 权利要求11的方法，其中所述BAFF拮抗剂是包含选自下组的氨基酸序列的多肽：ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQ ID NO：15)，ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQ ID NO：16)，ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO：17)，ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQ ID NO：18)和ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQ ID NO：19)。

13. 权利要求11的方法，其中所述BAFF拮抗剂包含可溶性融合蛋白，该融合蛋白包含BAFF受体的至少一部分和免疫球蛋白恒定区的一部分。

14. 权利要求1的方法，其中所述患者不具有自身免疫性病症。

15. 权利要求1的方法，其中所述患者不具有患自身免疫性病症的风险。

16. 权利要求1的方法，其中所述B细胞拮抗剂在所述B细胞拮抗剂施用于所述患者后24小时内导致所述患者中的外周B细胞消减20％。

17. 权利要求1的方法，其中所述B细胞拮抗剂在所述B细胞拮抗剂施用于所述患者后24小时内导致所述患者中的外周B细胞消减60％。

18. 权利要求1的方法，其中所述B细胞拮抗剂在所述B细胞拮抗剂施用于所述患者后24小时内导致所述患者中的外周B细胞消减80％。

19. 一种治疗肺纤维化的方法，所述方法包括对需要该治疗的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂。

20. 权利要求19的方法，其中所述B细胞拮抗剂是针对CD20的抗体。

21. 权利要求20的方法，其中所述抗体是针对CD20的嵌合鼠/人单克隆抗体。

22. 权利要求21的方法，其中所述针对CD20的抗体是rituximab

23. 权利要求1的方法，其中将所述B细胞拮抗剂施用于所述患者之后，所述患者相比于施用所述B细胞拮抗剂之前表现出一种或多种纤维化标志的减少。

24. 权利要求23的方法，其中所述一种或多种纤维化标志是平滑肌肌动蛋白沉积或胶原沉积。

25. 权利要求24的方法，其中将所述B细胞拮抗剂施用于所述患者之后，在所述患者中一种或多种组织上观察到的平滑肌肌动蛋白染色程度比施用所述B细胞拮抗剂之前在所述患者中一种或多种组织上观察到的平滑肌肌动蛋白染色程度低至少5％。

26. 权利要求24的方法，其中将所述B细胞拮抗剂施用于所述患者之后，在所述患者中一种或多种组织上观察到的平滑肌肌动蛋白染色程度比施用所述B细胞拮抗剂之前在所述患者中一种或多种组织上观察到的平滑肌肌动蛋白染色程度低至少25％。

27. 权利要求24的方法，其中将所述B细胞拮抗剂施用于所述患者之后，在所述患者中一种或多种组织上观察到的平滑肌肌动蛋白染色程度比施用所述B细胞拮抗剂之前在所述患者中一种或多种组织上观察到的平滑肌肌动蛋白染色程度低至少50％。

28. 权利要求24的方法，其中将所述B细胞拮抗剂施用于所述患者之后，在所述患者中一种或多种组织上观察到的胶原染色程度比施用所述B细胞拮抗剂之前在所述患者中一种或多种组织上观察到的胶原染色程度低至少5％。

29. 权利要求24的方法，其中将所述B细胞拮抗剂施用于所述患者之后，在所述患者中一种或多种组织上观察到的胶原染色程度比施用所述B细胞拮抗剂之前在所述患者中一种或多种组织上观察到的胶原染色程度低至少25％。

30. 权利要求24的方法，其中将所述B细胞拮抗剂施用于所述患者之后，在所述患者中一种或多种组织上观察到的胶原染色程度比施用所述B细胞拮抗剂之前在所述患者中一种或多种组织上观察到的胶原染色程度低至少50％。

31. 一种治疗肝纤维化的方法，所述方法包括对需要该治疗的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂。

32. 权利要求31的方法，其中所述B细胞拮抗剂是针对CD20的抗体。

33. 权利要求32的方法，其中所述抗体是针对CD20的嵌合鼠/人单克隆抗体。

34. 权利要求33的方法，其中所述针对CD20的抗体是rituximab

35. 一种治疗肾纤维化的方法，所述方法包括对需要该治疗的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂。

36. 权利要求35的方法，其中所述B细胞拮抗剂是针对CD20的抗体。

37. 权利要求36的方法，其中所述抗体是针对CD20的嵌合鼠/人单克隆抗体。

38. 权利要求37的方法，其中所述针对CD20的单克隆抗体是rituximab

39. 一种治疗纤维化症候的方法，所述方法包括对需要该治疗的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂和治疗有效量的整联蛋白受体拮抗剂。

40. 权利要求39的方法，其中所述整联蛋白受体拮抗剂是整联蛋白受体特异性抗体。

41. 权利要求40的方法，其中所述整联蛋白受体选自下组：αvβ6，αvβ5，α5β1，α1β1，α4β1和α4β7。

42. 权利要求41的方法，其中所述整联蛋白受体是α4β1或α4β7整联蛋白受体。

43. 权利要求42的方法，其中所述整联蛋白受体拮抗剂是natalizumab

44. 权利要求39的方法，其中所述患者不具有自身免疫性病症。

45. 权利要求39的方法，其中所述患者不具有患自身免疫性病症的风险。

46. 一种治疗纤维化症候的方法，所述方法包括对需要该治疗的患者施用治疗有效量的rituximab

和治疗有效量的natalizumab

47. 一种预防纤维化症候的方法，所述方法包括对有风险发生一种或多种纤维化症候的患者施用治疗有效量的B细胞拮抗剂。

48. 权利要求47的方法，其中所述有风险发生一种或多种纤维化症候的患者曾经暴露于一种或多种已知会增加肺、肝或肾纤维化风险的环境条件。

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