CN101210002B

CN101210002B - 一种丹酚酸b化学对照品的分离制备方法

Info

Publication number: CN101210002B
Application number: CN2006101350972A
Authority: CN
Inventors: 肖红斌; 高明哲
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2006-12-27
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2026-12-27
Also published as: CN101210002A

Abstract

本发明涉及一种丹酚酸B化学对照品的分离制备方法。以重量含量10～97％的丹酚酸B提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的甲醇-酸水溶液为洗脱体系，获得纯度大于98％的丹酚酸B化学对照品。工艺步骤有：样品预处理，色谱柱处理，进样，洗脱，在线检测，收集含有丹酚酸B的洗脱液，减压浓缩丹酚酸B洗脱液至无甲醇，冷冻干燥，即得丹酚酸B化学对照品。经高效液相色谱法检测，丹酚酸B的含量可达到98％以上。

Description

一种丹酚酸B化学对照品的分离制备方法

技术领域

本发明涉及一种从丹参提取物中分离获得纯度大于98％的丹酚酸B化学对照品的制备方法。

背景技术

丹参是我国传统药学中常用药物之一，有悠久的临床应用历史。现代药理研究表明，丹酚酸B具有很强的抗氧化作用，可以清除体内的超氧阴离子和羟基自由基；丹酚酸B对多种原因引起的血小板聚集和血栓形成，无论是体内或体外试验，均有明显的抑制作用，且不影响凝血系统功能，无出血危险性；丹酚酸B能保护局限性脑缺血-再灌注所致的线粒体损伤并抑制脑缺血——再灌注导致的神经细胞凋亡。在防治脑缺血和老年痴呆等急慢性神经退行性疾病有良好的前景。是丹参复方制剂治疗冠心病、心脑血管疾病的重要药效成分。我国2005版国家药典中把丹酚酸B作为测量成分，并规定其在丹参药材中的含量应达3％以上。

目前丹酚酸B的提取分离方法主要采用如下步骤：药材提取——除杂——柱层析过程。不同提取分离过程的区别在于除杂所用所用方法及柱层析所用色谱柱不同。黎莲娘等(中国专利CN1384090A，2002年公开)采用乙醇沉淀，使用大孔吸附树脂柱分离，获得含40％丹酚酸B的多酚酸提取物；张国力等(中国专利CN1528756A，2004年公开)采用壳聚糖絮凝沉淀，再用乙酸乙酯萃取，最后用硅胶柱层析获得纯度在50％-96％的丹酚酸B样品；徐亚明等(中国专利CN1247855A，2000年公开)采用大孔吸附树脂，用水洗后，以不同浓度的甲醇洗脱，获得以丹酚酸B镁盐为主成分的丹参多酚酸提取物；魏峰等(中国专利CN1459448A，2003年12月公开)采用聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱，收集获得总酚酸，总酚酸含量大于80％，其中丹酚酸B含量大于50％。张凤侠等报道(中国专利CN1164582C，2004年公开)采用多种填料类型的色谱柱获得纯度在90％以上的丹酚酸B。

以上方法均在不同程度上考虑了丹参提取物中的其他成分对丹酚酸B提取分离过程的影响，使丹酚酸B与其他成分得到良好分离，获得不同纯度的丹酚酸B。但由于缺少高效的柱分离方法及相应检测方法，不能稳定获得纯度在98％以上的丹酚酸B化学对照品。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，优化分离条件，本发明的目的在于提供一种分离时间短、分离效果好、产品纯度高(纯度在98％以上)的丹酚酸B化学对照品的分离制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案：对照品的分离制备方法，以重量含量10～97％的丹酚酸B提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以甲醇-酸水溶液为洗脱体系，具体步骤为：

(1)样品预处理：将重量含量10～97％的丹酚酸B提取物用甲醇、乙醇、水或50％甲醇溶液溶解，配置成重量浓度为8～60mg/ml的丹酚酸B提取物溶液，经0.22～0.45μm微孔滤膜过滤；

(2)色谱柱处理：高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以5—20倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇-酸水溶液，其中甲醇于甲醇-酸水溶液中的体积浓度为50—80％；酸于酸水溶液的体积浓度为0.1～1％；

(3)进样：将过滤后的样品溶液通过六通阀或泵进样，进样体积为1～100ml；

(4)洗脱：采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在10～600ml/min，在线紫外监测，收集含有丹酚酸B的洗脱液；

(5)丹酚酸B化学对照品的获取：减压浓缩所收集到的丹酚酸B洗脱液，至浓缩液中无甲醇，冷冻干燥。

丹酚酸B的结构式如下：

所述制备型高效液相柱可以选用商品化或自己装填的制备型高效液相柱；其填料可为C8或C18键合相填料；自己装填的制备型高效液相柱装填方式为湿法装柱，填料粒径为5～20μm，柱效在2000以上；洗脱体系中的酸可为甲酸或乙酸；在线紫外监测，其监测波长为254nm～290nm；丹酚酸B洗脱液收集后，减压浓缩，浓缩温度控制在55～65℃。

以本方法从丹参提取物中分离丹酚酸B化学对照品具有如下优点和进步：

1.本发明以制备型高效液相为分离手段，使丹酚酸B得到高效分离，可以获得纯度在98％以上的丹酚酸B化学对照品，同时缩短分离时间。

2.本发明所述的甲醇-酸水洗脱体系能有效的保证丹酚酸B与其他成分得到有效分离，从而保证分离的效果。

3.本发明采用紫外检测器在线检测，使丹酚酸B的分离情况可以直接检测，并可以选择性收集，显著提高收集效果。

4.本发明所述方法操作简便，条件温和，能有效的保证丹酚酸B的稳定性。

5.可产业推广。色谱柱规格为50×250mm时，其规模可达到10克/月以上。

附图说明

图1为本发明实施例一制备的丹酚酸B化学对照品的纯度分析色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

本实施例中，以10％的丹酚酸B提取物为原料，以5μmC18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-0.1％甲酸的水(45：55，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

丹酚酸B提取物用水溶解，配置成浓度为60mg/ml的丹酚酸B溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱选择为日本Sheshido公司生产的固定相为C18的制备柱(5μm，20×250mm)，以约5倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为1ml。

4.洗脱

流速控制在10ml/min，在线254nm紫外检测，收集含有丹酚酸B的洗脱液，

5.丹酚酸B化学对照品的获取

减压浓缩丹酚酸B洗脱液至浓缩液中无甲醇，浓缩温度控制在65℃，冷冻干燥。得到纯度为98.19％的丹酚酸B化学对照品；如图1所示，其分析结果如表1所示：

表1

峰	名称	保留时间	A峰面积	面积百分比
					1		3.418	5823	0.05
2		5.691	4357	0.04
					3		7.052	2370	0.02
4		7.343	107430	0.90
					5	丹酚酸B	8.425	11742656	98.19
6		14.946	96478	0.81

实施例2

本实施例中，以50％的丹参酸B提取物为原料，以10μm的C18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-1％乙酸的水(50：50，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

丹酚酸B提取物用50％甲醇溶解，配置成浓度为10mg/ml的丹酚酸B溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为5μm的C18键合相填料，湿法装柱，化学对照品色谱柱规格为50×200mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为8ml。

4.洗脱

流速控制在90ml/min，在线254nm紫外检测，收集含有丹酚酸B的洗脱液，

5.丹酚酸B化学对照品的获取

减压浓缩丹酚酸B洗脱液至浓缩液中无甲醇，浓缩温度控制在55℃，冷冻干燥。得到纯度为98.51％的丹酚酸B化学对照品。

实施例3

本实施例中，以60％的丹酚酸B提取物为原料，以10μm的C18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-0.5％甲酸的水(45：55，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

丹酚酸B提取物用乙醇溶解，配置成浓度为20mg/ml的丹酚酸B溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10μm的C18键合相填料，色谱柱规格为75×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为15ml。

4.洗脱

流速控制在150ml/min，在线254nm紫外检测，收集含有丹酚酸B的洗脱液，

5.丹酚酸B化学对照品的获取

减压浓缩丹酚酸B洗脱液至浓缩液中无甲醇，浓缩温度控制在65℃，冷冻干燥。得到纯度为98.74％的丹酚酸B化学对照品。

实施例4

本实施例中，以60％的丹酚酸B提取物为原料，以20μmC18键合相填料为吸附剂，含有甲醇-1％乙酸的水(45：55，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

丹酚酸B提取物用水溶解，配置成浓度为8mg/ml的丹酚酸B溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为20μm的C18键合相填料，色谱柱规格为100×270mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为20ml。

4.洗脱

流速控制在300ml/min，在线290nm紫外检测，收集含有丹酚酸B的洗脱液，

5.丹酚酸B化学对照品的获取

减压浓缩丹酚酸B洗脱液至浓缩液中无甲醇，浓缩温度控制在65℃，冷冻干燥。得到纯度为98.15％的丹酚酸B化学对照品。

实施例5

本实施例中，以97％的丹参酸B提取物为原料，以20μm的C18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-1％乙酸的水(60：40，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

丹酚酸B提取物用水溶解，配置成浓度为20mg/ml的丹酚酸B溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤。

2.色谱柱处理

制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10μm的C18键合相填料，湿法装柱，色谱柱规格为150×250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为100ml。

4.洗脱

流速控制在600ml/min，在线254nm紫外检测，收集含有丹酚酸B的洗脱液，

5.丹酚酸B化学对照品的获取

减压浓缩丹酚酸B洗脱液至无甲醇，浓缩温度控制在55～65℃，冷冻干燥。得到纯度为98.95％的丹酚酸B化学对照品。

实施例6

本实施例中，以80％的丹参酸B提取物为原料，以20μm的C18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-1％乙酸的水(60：40，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下：

1.样品预处理

2.色谱柱处理

3.上样

将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为100ml。

4.洗脱

5.丹酚酸B化学对照品的获取

Claims

1. 一种丹酚酸B化学对照品的分离制备方法，其特征在于：以重量含量10～97％的丹酚酸B提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以甲醇-酸水溶液为洗脱体系，具体步骤为，

(2)色谱柱处理：高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以5—20倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇-酸水溶液，其中甲醇于甲醇-酸水溶液中的体积浓度为50～80％；酸于酸水溶液的体积浓度为0.1～1％；

(3)进样：将过滤后的样品溶液进样，进样体积为1～100ml；

(5)丹酚酸B化学对照品的获取：减压浓缩所收集到的丹酚酸B洗脱液至无甲醇，冷冻干燥。

2. 根据权利要求1所述丹酚酸B化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述制备型高效液相柱可以选用商品化或自己装填的制备型高效液相柱；其填料可为C8或C18键合相填料。

3. 根据权利要求2所述丹酚酸B化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述自己装填的制备型高效液相柱装填方式为湿法装柱。

4. 根据权利要求3所述丹酚酸B化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述制备型高效液相柱的柱效在2000以上。

5. 根据权利要求2所述丹酚酸B化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述制备型高效液相柱的填料粒径为5～20μm。

6. 根据权利要求1所述丹酚酸B化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述洗脱体系中的酸可为甲酸或乙酸。

7. 根据权利要求1所述丹酚酸B化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述在线紫外监测，其监测波长为254nm～290nm。

8. 根据权利要求1所述丹酚酸B化学对照品的分离制备方法，其特征在于：所述丹酚酸B洗脱液收集后，减压浓缩，浓缩温度控制在55～65℃。