CN101204573B - 一种治疗糖尿病的药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗糖尿病的药物。该药物是由以下重量的原料制成：苦瓜片30g、苦参9g、黄连30g、知母30g、酸枣仁15g、炮姜6g、红曲3g、陈皮9g、大黄2g、桃仁6g。本发明的清热降浊方治疗2型糖尿病临床实验取得了可重复的肯定疗效，可通过胰岛素抵抗和胰岛细胞功能的改善明显改善2型糖尿病模型大鼠的糖代谢异常，对减轻脂肪肝和维持正常血脂具有重要意义。

Description

一种治疗糖尿病的药物

技术领域

本发明涉及一种中药药物，特别是涉及一种治疗糖尿病的中药药物。

背景技术

糖尿病是体内胰岛素绝对或相对不足引起的以糖代谢紊乱为主的全身性疾病。最近几年，随着对2型糖尿病发病机制研究的深入，特别是一些新的实验技术如细胞电位测量、靶向基因突变、转基因合成、荧光蛋白在研究哺乳动物基因表达中的应用，胰岛细胞自身的胰岛素抵抗(包括β、α和δ细胞胰岛素抵抗)问题逐渐被人们所认识。最新研究已经证实：胰岛细胞上同样存在胰岛素受体及其下游信号转导通路；胰岛细胞不仅是胰岛素等的分泌细胞，同时也是胰岛素作用的靶细胞。同外周组织一样，胰岛细胞的胰岛素信号途径中的任何环节障碍也可以导致胰岛素抵抗，即在胰岛细胞水平上的胰岛素抵抗或叫做胰岛细胞自身的胰岛素抵抗，它直接导致了胰岛细胞功能的障碍。许多学者认为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损在胰岛细胞水平的这种直接关联是2型糖尿病发病机制中的重要环节。

糖尿病治疗的目的是纠正糖代谢紊乱，以消除症状，促进胰岛功能的恢复，改善胰岛素抵抗。西医降糖药物治疗糖尿病疗效肯定，但长期使用需逐渐加量，大多具有不同程度的不良反应，且不能有效地控制并发症。既往关于中医治疗2型糖尿病的方法概括有：益气滋阴，健脾祛湿，疏肝理气，滋补肾阴，活血化瘀，温肾健脾。业界内，普遍认可辨证论治结合应用降糖西药可有效降糖，但没有一个单独的中药或中药复方的单独降糖作用得到大家的普遍认可。

糖尿病的人群发病率为1％-5％，并有日渐增高的趋势，它与癌症、心血管疾病被称为世界性三大疾病。对糖尿病的防治研究，关系到人口与健康，有重大的社会效益和实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗糖尿病的药物。

本发明所提供的治疗糖尿病的药物为清热降浊方，主要由以下重量份的原料制成：

苦瓜片25-35份      苦  参6-12份     黄  连25-35份

知  母25-35份      酸枣仁10-20份    炮  姜4-8份。

所述治疗糖尿病的药物中，所述原料中还可包含重量份为2-4份的红曲和/或重量份为6-12份的陈皮和/或重量份为1-3份的大黄和/或重量份为4-8份的桃仁。

实际应用中一般由以下重量份的原料制成：

苦瓜片25-35份    苦  参6-12份     黄  连25-35份

知  母25-35份    酸枣仁10-20份    炮  姜4-8份

红  曲2-4份      陈  皮6-12份     大  黄1-3份

桃  仁4-8份。

优选为：

苦瓜片30份      苦  参9份     黄  连30份

知  母30份      酸枣仁15份    炮  姜6份

红  曲3份       陈  皮9份     大  黄2份

桃  仁6份。

为了使药物具有较好口感，所述药物中还可含有1-2重量份数比的矫味剂。

本发明所提供的药物可以采用本领域中的常规方法制得，例如水煎、水煎醇沉或磨药粉冲服均可。为了服用方便，本发明所提供的药物可采用汤剂冲剂、散剂或丸剂。为了服用方便，本发明所提供的药物可为软胶囊、颗粒或口服液。

本发明所提供的药物用法用量为：成人140g/次，水500ml煎煮至200ml，分2次口服；儿童酌减。

本发明所提供的药物的主旨是治疗2型糖尿病，具有如下功能和疗效：降低血糖、糖化血红蛋白、血脂，提高胰岛素敏感性，改善胰岛β细胞的分泌功能，减轻脂肪肝。

本发明所提供的药物清热降浊方采取“肥、糖、络整体治疗模式”，在降糖的同时，积极治疗肥胖和尽早干预并发症，能明显降低血糖、糖化血红蛋白，可降血脂。选择此方作为防治2型糖尿病早中期的主方主要是基于以下认识：首先，多数2型糖尿病患者都有营养过剩、体型偏胖的临床特点，且发病早中期多伴有口干口苦、胸胁或脘腹胀满、大便干燥、舌红苔黄、脉弦数或滑实有力等表现，中医辨证为肝胃郁热。其次，过食和少动是导致2型糖尿病最主要的环境因素。过食是热量摄入过多，一者饮食不节，一者过食肥甘。饮食自倍，肠胃乃伤，中焦为之壅滞，脾胃碍于升降，枢机不得斡旋，最终导致运化失职，脾气郁滞；多食肥甘，肥者令人内热，甘者令人中满，所碍的也是中焦气机；少动是活动减少，脾主四肢、肌肉，活动的减少必然影响脾的健运。脾不能为胃行其津液，脾不散精，物不归正化则为痰、为湿、为浊、为脂，进而变证百生。所以中焦的气机障碍是2型糖尿病以及胰岛素抵抗发生的根本。又肝主疏泄，助运化，中焦郁滞日久，肝疏泄不及，进而形成肝脾气滞、肝胃气滞，脾升、胃降、肝疏不能，中焦大气不转，则可进一步壅而为热，滞而为瘀，“食气入胃，散精于肝，淫气于筋，浊气归心，淫精于脉”，先由中焦胃热，继而肝热、心热、血热等，热又耗气灼阴，气阴两虚，虚而不化，又加重痰浊、血瘀，这种病机的演变就形成了2型糖尿病和胰岛素抵抗的发生发展过程。清热降浊方中苦瓜片为君，苦参、黄连、知母、酸枣仁和炮姜为臣，红曲、陈皮为佐，大黄、桃仁为使。

通过对不同糖尿病大鼠模型的实验研究，认为清热降浊方药对糖代谢异常的治疗作用的主要机理在于减轻胰岛素抵抗，并刺激胰岛素分泌。进一步的机理研究提示该方可明显升高OLETF大鼠肝脏、骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合力，降低皮质醇浓度，并对胰高糖素有一定的降低作用，同时可改善高脂胰岛素抵抗大鼠腹腔脂肪的积聚和降低肝脏、肌肉组织中甘油三酯沉积。

本发明的积极效果在于：制剂为纯中草药制成，毒副作用小，治疗工艺简单，疗效显著，具有广阔的应用价值。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为高脂喂养阶段两组大鼠的体重变化图

图2为高脂喂养阶段两组大鼠的摄入热量变化图

图3为灌胃期间各组大鼠体重变化图

图4为为灌胃期间各组大鼠摄食量比较柱状图

图5为静脉葡萄糖耐量试验血糖动态变化图

图6为静脉葡萄糖耐量试验胰岛素动态变化图

图7为大鼠胰岛细胞照片

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法

实施例1、本发明治疗糖尿病的药物的制备

一、药物活性成分及药物活性成分用量

苦瓜片30g      苦  参9g     黄  连30g

知  母30g      酸枣仁15g    炮  姜6g

红  曲3g       陈  皮9g     大  黄2g

桃  仁6g

二、按步骤一的药物活性成分及用量配比制备中药

1、将140g药放药锅内；

2、加水500ml(以没过药为宜)，浸泡30-40分钟；

3、中火水煎30分钟，取汁200ml，制成30ml浸膏。

实施例2、本发明清热降浊方对OLETF大鼠(自发性2型糖尿病大鼠)胰腺及肝脏形态学改变的影响

将40只OLETF大鼠(购自日本大冢制药株式会社德岛研究所)常规饲料饲养至32周，体重＞560g，随机分为4组，糖尿病模型组10只、西药组10只、中药小剂量组10只、中药大剂量组10只。Wistar大鼠(购自中国医学科学院实验动物中心)10只为正常对照。

用实施例1制备的药物进行实验，灌胃前用蒸馏水稀释为4g生药/ml浓度的溶液。大鼠灌胃给药4周，每日一次，剂量为①正常对照组：生理盐水，3ml/只；②模型组：生理盐水，3ml/只；③西药组：罗格列酮(史克必成有限公司，批号：国药试字X20000013)，1.5mg/kg体重；④中药小剂量组：本发明清热降浊方溶液，9ml/kg体重；⑤中药大剂量组：本发明清热降浊方溶液，18ml/kg体重。4周后检测各组的以下指标：1)空腹血糖；2)甘油三酯和总胆固醇；3)病理形态学。实验数据用(

)表示，组间显著性差异采用t检验。

1)空腹血糖的测定

大鼠尾静脉取血，One-touch II血糖仪(美国强生)测定大鼠的空腹血糖。

从表1可见，与正常组比较，模型组空腹血糖明显升高(P＜0.001)；治疗4周后，与模型组比较，各治疗组空腹血糖均无明显变化。

               表1各组空腹血糖比较(x±s mg/dl)

组别	鼠数(只)	剂量(g/kg)	空腹血糖
				正常组模型组西药组中药小剂量中药大剂量	1010101010	--1.5mg/kg36g/kg72g/kg	98.6±6.8139.3±37.9<sup>△△△</sup>126.9±9.3116.8±12.6132.1±21

注：与正常组比^△△△P＜0.001

2)血清甘油三酯、总胆固醇测定

用35mg/kg体重的戊巴比妥钠麻醉各组动物，从颈动脉插管取血6ml，静置1小时后，离心血清(3500rpm，10min)，总胆固醇采用酶联法，甘油三酯用乙酞丙酮显色法，在日立-7150全自动生化仪(HITACHI7150，Automatic Analyzer)测定。

从表2可见，与正常组比较，模型组甘油三酯和总胆固醇均明显升高(P＜0.01和P＜0.001)；与模型组比较，西药组和中药大剂量组血清甘油三酯和总胆固醇的含量降低(P＜0.05和P＜0.01)，中药小剂量组仅总胆固醇的含量降低(P＜0.05)，甘油三酯含量没有明显差异。

小结：OLETF大鼠32周龄时，甘油三酯水平是正常Wistar大鼠的2倍，总胆固醇为其5倍。说明本模型动物有明显的高血脂，胰岛素抵抗常伴有脂代谢异常。本中药和罗格列酮一样能降低甘油三脂和总胆固醇水平，说明其改善胰岛素抵抗(IR)的机理与其能改善2型糖尿病患者的脂质代谢紊乱密切相关。

                  表2各组甘油三酯、总胆固醇的比较(x±s)

组别	鼠数(只)	剂量(g/kg)	甘油三酯(mg/dl)	总胆固醇(mg/dl)
					正常组模型组西药组中药小剂量中药大剂量	1010101010	--1.5mg/kg36g/kg72g/kg	148.1±37.8292.3±64.6<sup>△△</sup>159.1±41.3<sup>**</sup>256.3±66.5176.4±63.7<sup>**</sup>	18.1±9.386.3±18.1<sup>△△△</sup>67.2±15.9<sup>*</sup>58.1±12.4<sup>*</sup>53.1±13.1<sup>**</sup>

注：与正常组比^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001；与模型组比^*P＜0.05，^**P＜0.01

3)病理形态学

动物取血处死后，取胰腺中、尾部，近肝门同一部位肝脏组织约1cm³在10％福尔马林固定液中充分固定24小时，流水漂洗后逐级乙醇脱水，用石蜡包埋，5μm厚切片，HE染色后中性树胶封片，光镜下观察结果如下：

①胰腺

正常组胰腺小叶密集，可见胰岛境界清楚。胰岛细胞排列有序，胞浆丰富，胞核圆形居中，胰岛细胞间可见较多薄壁的毛细血管。

模型组胰腺小叶被较多的脂肪细胞分隔，胰岛明显增大，其间可见炎细胞浸润。胰岛细胞胞浆内可见圆形空泡(脂变)，胰岛中有血管、纤维增生。

西药组胰腺小叶被较多的脂肪细胞分隔，胰岛明显增大，其间可见炎细胞浸润。胰岛细胞胞浆内可见圆形空泡(脂变)，胰岛中有血管、纤维增生，与模型组无显著形态学差异。

中药小剂量组胰腺小叶大部分密集，部分可见脂肪细胞分隔，较模型组显著减轻。胰岛明显增大，其间可见炎细胞浸润、血管和纤维增生，与模型组无显著形态学差异。

中药大剂量组胰腺小叶大部分密集，部分可见脂肪细胞分隔，较模型组显著减轻。胰岛明显增大，其间可见炎细胞浸润、血管和纤维增生，与模型组无显著形态学差异。

②肝脏

正常组肝小叶结构完整，中央静脉居中，肝索向四周呈放射状分布，肝细胞排列整齐，胞核清晰，胞浆丰富。

模型组肝小叶结构基本完整，中央静脉居中，中央静脉周围肝细胞呈小泡性脂变，并可见大泡性脂变，范围广泛。

西药组肝小叶结构基本完整，中央静脉居中，中央静脉周围肝细胞呈小泡性脂变，并可见大泡性脂变，范围和程度同模型组。

中药小剂量组肝小叶结构完整，中央静脉居中，中央静脉周围肝细胞可见散在的小泡性及大泡性脂变，脂变程度与模型组比较显著减轻。

中药大剂量组肝小叶结构完整，中央静脉居中，中央静脉周围肝细胞可见散在的小泡性及大泡性脂变，脂肪变程度与模型组比较显著减轻，与中药小剂量组差异不显著。

小结：OLETF大鼠模型组胰岛组织脂肪浸润严重，提示该模型大鼠由于体重增加，血胆固醇和甘油三酯增高，胰腺组织会发生脂肪沉积，这是最终影响胰岛功能的重要原因。中药可以显著减轻胰腺组织的脂肪浸润，而罗格列酮此作用不明显，提示此中药对胰腺功能的保护作用机理与此密切相关。OLETF大鼠模型组肝组织广泛脂肪浸润，肝细胞呈圆形空泡状脂肪变性，形成印戒细胞。并见肝索扭曲、肝窦受挤压现象。两中药组肝组织脂肪浸润显著减轻，与罗格列酮组相同，提示中药减轻肝组织脂肪浸润的作用与罗格列酮相似，均具有减轻内脏脂肪沉积的作用。2型糖尿病并脂肪肝患者较无脂肪肝者存在明显的脂代谢紊乱、胰岛素抵抗及超重，而且大血管的并发症发生较多。因此清热降浊方减轻脂肪肝及维持正常血脂的作用对预防和减少2型糖尿病胰岛素抵抗及大血管的并发症发生具有重要意义。

实施例3、本发明清热降浊方改善实验性STZ糖尿病大鼠模型的胰岛素抵抗机理的实验研究

1)糖尿病模型的制备及给药

雄性Wistar大鼠(购自中国医学科学院实验动物中心)50只，体重180-220g，6-8周龄。链脲佐菌素(STZ)(Sigma，批号：202-263-7)用0.1mol/L柠檬酸缓冲液在冰浴中配制成1％的溶液，pH值4.4。大鼠禁食12小时后，随机取40只，左下腹腹腔内注射STZ，65mg/kg体重。三天后，测大鼠血糖，在16.7mmol/L以上的确定为糖尿病，选出糖尿病大鼠30只，分为糖尿病模型组(10只)、中药组(10只)和西药组(10只)。取10只大鼠为正常对照组，腹腔内注射等体积柠檬酸缓冲液。0.1mol/L pH4.4柠檬酸缓冲液配制方法如下：

A液：柠檬酸21.01g      蒸馏水1000ml；

B液：柠檬酸钠29.4lg    蒸馏水1000ml；

A液44ml+B液56ml。

用实施例1制备的药物进行实验，灌胃前用蒸馏水稀释为4g生药/ml浓度的溶液。二甲双胍(北京双鹤药业股份有限公司，批号：990825)用生理盐水配成1％的浓度。各组大鼠均灌胃给药4周，每日一次，剂量为①正常对照组：生理盐水3ml/只；②模型组：生理盐水3ml/只；③西药组：1％二甲双胍10ml/kg体重；④中药组：4g/ml的清热降浊方溶液9ml/kg体重。

2)血糖测定

动物非禁食状态下，晨9时尾静脉取血，给药前及给药第二、四周时各测一次。第二、四周检测血糖时间均为给药(水)1小时后。大鼠尾静脉取血，用One-touch II血糖仪(美国强生)测定大鼠的空腹血糖。

实验数据用均数±标准差表示，组间显著性差异采用t检验。

从表3可见，模型组血糖较正常组明显升高(P＜0.001)；治疗2周后，中药和二甲双胍均可使血糖下降(P＜0.05)；第4周时血糖下降更明显(P＜0.01)。

         表3各组非空腹血糖比较(

mmol/L，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	疗前	疗后2周	疗后4周
					正常模型二甲双胍中药	--0.136	4.17±0.2819.93±1.98<sup>△△△</sup>20.41±1.71<sup>△△△</sup>19.64±1.77<sup>△△△</sup>	3.87±0.2120.07±5.18<sup>△△△</sup>15.06±1.58<sup>*</sup>15.52±1.50<sup>*</sup>	4.37±0.6818.83±1.63<sup>△△△</sup>14.68±2.2<sup>**</sup>15.05±1.23<sup>**</sup>

注：与正常组比^△△△P＜0.001，与模型组比^*P＜0.05；^**P＜0.01

3)血清胰岛素、胰高血糖素、皮质醇、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和胃动素(MTL)的测定

给药4周后用35mg/kg体重戊巴比妥钠麻醉动物，颈动脉插管取血，2种方式处理：①血液静置1小时后，离心血清(3500rpm，10min)，用胰岛素放射免疫试剂盒、胰高血糖素放射免疫试剂盒、皮质醇放射免疫试剂盒、胰岛素样生长因子-1放射免疫试剂盒(北京海科锐生物技术中心，批号分别为卫药准字R-11、R-64、R-69、R-70)检测血清胰岛素、胰高血糖素、皮质醇、胰岛素样生长因子-1；②血液放入抗凝管(抑肽酶30μl/支，10％EDTA 40μl/支)中，离心血浆(3500rpm，10min)，用胃动素放射免疫试剂盒(北京海科锐生物技术中心，批号为卫药准字R-67)检测胃动素。实验数据用均数±标准差表示，组间显著性差异采用t检验。

从表4可见，模型组胰高血糖素和皮质醇血清含量均升高，胰岛素含量降低(P＜0.001)；治疗后各组与模型组比，中药能降低皮质醇含量(P＜0.05)，但对胰岛素和胰高血糖素含量无明显影响，二甲双胍对胰岛素、胰高血糖素和皮质醇的含量均无影响。

从表5可见，与正常组相比，模型组胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和胃动素含量均降低(P＜0.001和P＜0.05)；治疗后各组与模型组比，中药能升高胰岛素样生长因子-1和胃动素含量(P＜0.001和P＜0.05)，二甲双胍对胰岛素样生长因子-1和胃动素含量无明显影响。

      表4治疗4周后胰岛素、胰高血糖素和皮质醇变化的比较(

，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	胰岛素(μU/ml)	胰高血糖素(pg/ml)	皮质醇(ng/ml)
					正常模型二甲双胍中药	--0.136	21.52±4.2410.70±2.08<sup>△△△</sup>9.41±3.35<sup>△△△</sup>9.73±2.24<sup>△△△</sup>	175.91±53.61362.88±64.37<sup>△△△</sup>281.84±94.91<sup>△△</sup>269.23±48.06<sup>△△</sup>	16.45±3.4023.56±6.37<sup>△</sup>19.19±6.0816.27±4.17<sup>*</sup>

注：与正常组比^△△△P＜0.001，^△△P＜0.01，^△P＜0.05，与模型组比^*P＜0.05

  表5治疗4周后胰岛素样生长因子-1和胃动素变化的比较(

，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	IGF-1(ng/ml)	MTL(pg/ml)
				正常模型二甲双胍中药	--0.136	1456.85±183.64387.28±90.60<sup>△△△</sup>348.99±102.32582.14±78.93<sup>***</sup>	233.46±25.99202.65±20.60<sup>△</sup>209.01±7.13237.27±25.61<sup>*</sup>

注：与正常组比^△△△P＜0.001，^△P＜0.05；与模型组比^***P＜0.001，^*P＜0.05

4)小肠吸收功能测定

采用右旋木糖吸收实验法进行小肠吸收功能测定。同批动物末次给药1小时后，先尾静脉取血测血糖，然后各组灌服4％D-木糖溶液0.3g/kg，1小时后麻醉取血，制备血清。然后按以下步骤进行实验：①在50ml三角烧瓶内放大鼠血清1份，加蒸馏水8份，再加0.3mol/L硫酸0.5份，再加10％钨酸钠0.5份，均随加随摇，离心沉淀除去蛋白质，即得无蛋白滤液。②取试管4只，第1管为空白管，放蒸馏水2ml；第2管放低浓度(0.05mg/ml)木糖标准液2ml；第3管放高浓度(0.1mg/ml)木糖标准液2ml；第4管放无蛋白滤液2ml。③在以上各管内均各加1％二羟基甲苯试剂2ml，混匀。④置沸水中1小时，冷却后各管加蒸馏水稀释至25ml，混匀。⑤用721分光光度仪630nm测光密度，校正空白管光密度到零点，读取各管光密度值。⑥先算K值：K＝低浓度标准管光密度/0.025+高浓度标准管光密度/0.05。⑦血清内木糖含量(mg/L)＝(测定管光密度/K)×500。实验数据用均数±标准差表示，组间显著性差异采用t检验。

从表6可见，模型组与正常组相比血清右旋木糖含量明显增加(P＜0.001)，即小肠吸收功能增强；治疗后各组与模型组比，二甲双胍能明显降低血清右旋木糖含量(P＜0.001)，即抑制了小肠的吸收功能，但中药对小肠吸收功能无明显的影响作用。

    表6治疗4周后小肠吸收功能的比较(

，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	血清右旋木糖含量(mg/L)
			正常模型二甲双胍中药	--0.136	22.34±9.78164.45±38.75<sup>△△△</sup>68.36±31.09<sup>***</sup>166.80±147.19

注：与正常组比^△△△P＜0.001，与模型组比^***P＜0.001

5)肝脏细胞和肌肉细胞胰岛素受体结合力的观察

采用改良的Kilp方法(柳红芳，仝小林，王庆国等.开郁清胃方对糖尿病大鼠肝脏和骨骼肌细胞胰岛素受体的影响.北京中医药大学学报，2002，25(2)：35-37)进行细胞膜制备。采用考马斯亮蓝染色法测定膜蛋白浓度(参考文献：段军，仝小林，王霞，等.开郁清胃方对高脂饮食诱导早期胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性的影响.中华实用中西医杂志，2006，19(3)：327-330)。采用改良的Nishimura方法(参考文献：赵昱，仝小林，刘素宾.开郁清胃方对2型糖尿病β细胞功能的影响.中华实用中西医杂志，2005，18(16)：712-715)测定胰岛素结合力。实验数据用均数±标准差表示，组间显著性差异采用t检验。

从表7可见，治疗4周后肝脏、骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合率的变化是：模型组较正常组明显升高(P＜0.05)，中药组和二甲双胍组均较模型组降低(P＜0.05)。

    表7治疗4周后肝脏、骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合率(

，n＝10)

组别	专一结合量与总结合量之比(％)
			肝脏	肌肉
	正常模型二甲双胍中药	34.38±12.0655.51±9.53<sup>△</sup>33.70±11.01<sup>*</sup>42.96±11.03<sup>*</sup>			12.37±6.4630.72±11.71<sup>△</sup>15.10±9.28<sup>*</sup>14.69±6.55<sup>*</sup>

注：与正常组比^△P＜0.05，与模型组比^*P＜0.05

6)胰腺组织Fas受体和Fas-L配体的免疫组化观察

各组动物放血处死，取胰腺常规固定，石蜡包埋，5μm厚切片。用免疫组化ABC法显示胰岛Fas和Fas-L的表达情况，免疫组化染色过程如下：石蜡切片脱蜡至水→3％H₂O₂室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性→蒸馏水冲洗，PBS液浸泡5分钟→10％正常山羊血清封闭(PBS稀释)，室温孵育10分钟→倾去血清，分别滴加I抗(兔抗Fas和Fas-L多克隆抗体)(北京中山公司)工作液，置湿盒中4℃冰箱过夜→PBS冲洗，5分钟×3次→滴加II抗(生物素化山羊抗兔IgG)(北京中山公司)，37℃温孵30分钟，PBS冲洗，5分钟×3次，滴加1∶200的III抗(辣根酶标记链酶卵白素)(北京中山公司)，37℃温箱孵育30分钟→PBS冲洗，5分钟×3次→DAB显色→自来水充分冲洗→苏木精复染，自来水冲洗15分钟以上→逐级酒精脱水→二甲苯透明→树胶封片。光镜下观察，结果如下：

①Fas抗原

正常组：胰岛内极少量细胞可见淡棕色颗粒，成微弱表达，绝大多数细胞为阴性。

模型组：胰岛内细胞可见广泛的棕红色阳性反应产物，成片状分布的强阳性表达。

西药组：胰岛内细胞可见广泛的棕色阳性反应产物，成片状分布的中等阳性表达。

中药组：胰岛内呈阳性表达的细胞散在分布，反应产物呈淡棕色。

②Fas配体

正常组：胰岛内Fas配体呈阴性表达。

模型组：胰岛内极少量细胞可见淡棕色颗粒，成微弱表达。

西药组：胰岛内细胞可见广泛的棕色阳性反应产物，成片状分布的中等-强阳性表达。

中药组：胰岛内细胞可见广泛的棕色阳性反应产物，成片状分布的中等-强阳性表达。

综上所述，实验中发现鼠类空腹12小时后，各组血糖与正常组无明显的差别，所以本研究通过非空腹血糖观察本药对血糖的影响。中药在给药2周开始就具有明显的降非空腹血糖作用，各组对胰岛素浓度无提高的作用，说明其降糖作用不通过胰岛素介导，不同于磺脲类，这与OLETF大鼠模型结果一致。中药降低血清中皮质醇的浓度，但对胰高血糖素无明显增加作用，与OLETF模型高胰岛素水平时结果一致，说明无论胰岛素浓度高低，中药均能通过降低血清中皮质醇浓度，改善肝调达情志的功能。该药能提高胃动素水平，但小肠吸收功能与模型组比无明显改变，表明清热降浊方能增加胃动素的分泌，这与OLETF大鼠的实验结果一致，更加肯定了恢复胃的降浊功能，促进胃排空的机理即在于此，中药不能抑制小肠的吸收功能，说明其作用机理与双胍类药物不同。本实验中糖尿病大鼠肝脏、肌肉细胞膜受体结合力增加，可能与血中胰岛素浓度下降引起的胰岛素受体数量增加有关。虽然糖尿病时细胞膜胰岛素受体数量增加，受体结合力增加，但是血糖仍然不降，表明胰岛素效应不全，存在细胞内限速反应，即胰岛素受体后的抵抗，这方面还有待于进一步研究。中药可以使STZ糖尿病模型异常升高的胰岛素受体结合力降低，但使OLETF糖尿病大鼠模型降低的胰岛素受体结合力升高，提示本药的双向调节作用。正常组Fas抗原在绝大多数细胞中为阴性表达，少量细胞呈微弱表达，模型组Fas抗原呈强阳性表达，说明发生糖尿病后Fas抗原的表达增强，表明胰岛细胞凋亡加强。中药和西药均可使Fas抗原的表达减弱，并且中药的减弱程度强于西药，说明口服中药后抑制了胰岛中免疫反应的过程。正常组胰岛内Fas配体呈阴性表达，模型组成微弱表达，西药组和中药组均成中等-强阳性表达。进一步证实本中药可对胰腺组织起到保护作用，从而延缓胰岛细胞的衰竭。

实施例4、本发明清热降浊方对T2DM模型大鼠糖代谢的影响

1)糖尿病模型的制备

Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(购于维通利华实验动物中心)105只，普通饲料适应性喂养2天后，造模组85只给予高脂饲料(中国医学科学院实验动物中心；热量组成为：碳水化合物20％、蛋白质21％、脂肪59％(脂肪主要来自红花油))喂养，对照组20只继续给予普通饲料(北京九江颗粒饲料厂生产；碳水化合物64％、蛋白质23％、脂肪13％)喂养。

定期检测大鼠的体重与摄入热量，记录数据，实验数据用均数±标准差表示，组间显著性差异采用t检验。

脲链佐菌素(STZ)参照实施例3的方法，临用前配制成浓度为1％的溶液，4℃保存。大鼠喂养9周后，隔夜禁食。造模组经腹腔一次注射STZ 15mg/kg体重，1周后尾静脉取血测非空腹血糖，大于16.7mmol/L为造模成功，成模60大鼠，随机分成模型组、中药治疗组和西药治疗组，各20只，未成模的25只大鼠剔出。对照组注射等剂量的柠檬酸缓冲液。

高脂喂养阶段两组大鼠的体重变化如图1所示、摄入热量的变化如图2所示。结果显示，高脂饲料组大鼠与普通饲料组大鼠在喂养的第1、2周结束时体重无明显差异(分别为260±8.4，263±33.4和301±22.2，302±32.2)，自第3周起，两组体重开始出现显著差异(417±25，382±14.6，P＜0.01)，至第9周末，高脂饲料喂养的大鼠体重为632±56.7g，普通饲料喂养的大鼠体重为521±40.5g，统计学有明显差异，高脂组大鼠出现明显的肥胖。高脂饲料组的热量摄入在早期阶段明显高于普通饲料组，但第3周以后随着鼠龄的增长，对照组摄入逐渐增加，第8周时平均摄入热量对照组为521千焦，高脂组为452千焦，可能与饲料投放方法不同有关，前者耗损较多夸大了摄入量，但同时也说明了高脂肪饲料喂养，即使在摄入热量不高的情况下也可引起明显的肥胖。

2)大鼠的给药

用实施例1制备的药物进行实验，灌胃前用蒸馏水稀释为3.7g生药/ml浓度的溶液。文雅迪片(购自美国葛兰素史克中国投资有限公司)，每片含马来酸罗格列酮4mg，灌胃前用蒸馏水配成0.75mg/ml浓度的溶液。

普通饲料喂养大鼠，每日灌胃一次，连续灌胃4周。灌胃剂量如下：①对照组：蒸馏水灌胃，4ml/kg体重；②模型组：给蒸馏水灌胃，4ml/kg体重；③中药组：清热降浊方溶液灌胃，4.2ml/kg体重；④西药组：文迪雅溶液灌胃，4ml/kg体重。观察大鼠的一般状态，活动情况，每周记录大鼠体重及摄食量变化。

各组大鼠灌胃期间体重变化如图3所示，摄食量比较如图4所示。结果显示，成模以后，模型组大鼠并未出现明显的体重下降，摄食和饮水量也没有明显的增加，比较符合人类2型糖尿病的发病特点，灌胃4周后，模型组大鼠体重与灌胃前相比没有增加，对照组的体重符合大鼠的正常生长规律，文迪雅灌胃组大鼠灌胃4周，体重稳步增加约30克，一方面可能是血糖改善的结果，也与西药增加体重的作用有关，中药组体重增加约14克，可能与血糖改善相关。四组动物在灌胃期间每日摄食量无明显差异，均在30-32克之间。

3)口服葡萄糖耐量试验(OGTT)

灌胃前及灌胃4周后，大鼠隔夜禁食12小时，次日晨尾静脉取血备测空腹血糖(FBG)及葡萄糖灌胃后2小时血糖(P2hBG)，葡萄糖灌胃量为2g/kg体重(浓度40％)。在快速葡萄糖分析仪(德国内卡BIOSEN5030)上检测血糖值。用SPSS13.0统计分析软件处理实验数据，所得数据以均数±标准差(

)表示，服从正态分布的两组间均数比较用t检验进行统计，多组间比较采用方差分析。

从表8可见，模型组空腹血糖水平和灌胃葡萄糖2小时后血糖水平要明显高于正常组(P＜0.01)，空白治疗前后无变化；中药组和西药组治疗前与模型组血糖水平相当，无明显差异，治疗后较模型组空腹和餐后2小时血糖水平均明显下降，西药组空腹血糖下降更为明显，而中药组的餐后2小时血糖要优于西药组，但这种差异没有统计学意义。

                  表8各组治疗前后OGTT空腹血糖和2小时血糖水平比较

分组	例数(只)	FBG(mmol/L)		P2hBG(mmol/L)
						治疗前	治疗后	治疗前	治疗后
		正常组模型组中药组西药组	8899	4.46±0.158.99±3.78<sup>##</sup>7.79±3.488.05±3.81	4.42±0.1712.5±6.47<sup>##</sup>6.19±3.51<sup>*</sup>5.69±1.70<sup>**</sup>					6.09±0.3215.08±8.68<sup>##</sup>16.03±4.8615.1±5.67	6.08±0.3218.22±6.11<sup>##</sup>11.01±6.26<sup>*</sup>12.72±4.5<sup>*</sup>

注：与正常组比较^##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

4)血脂、基础胰岛素及糖化血清蛋白的检测

4周灌胃结束后，每组随机选取8-9只大鼠，隔夜禁食12小时，次晨大鼠颈静脉取血2.5ml，离心取血清，-70℃保存。总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)通过酶联法，甘油三酯(TG)用乙酞丙酮显色法，在日立-7150全自动生化仪(HITACHI7150，Automatic Analyzer)测定。通过大鼠胰岛素测定放免试剂盒(Linco)测定基础胰岛素(FINS)。通过微柱层法在日立-7600仪器上检测糖化血清蛋白。用SPSS13.0统计分析软件处理实验数据，所得数据以均数±标准差()表示，服从正态分布的两组间均数比较用t检验进行统计，多组间比较采用方差分析。

从表9可见，模型组的甘油三酯水平和极低密度脂蛋白水平较对照组升高，符合糖尿病的血脂表现，但只有后者有统计学意义，并且中药组有统计学意义的下降。

                                         表9各组血脂情况比较

分组	例数	TC(mmol/L)	TG(mmol/L)	HDL-C(mmol/L)	LDL-C(mmol/L)	VLDL-C(mmol/L)
							正常组模型组中药组西药组	8999	1.86±0.31.92±0.651.77±0.362.13±0.31	1.08±0.331.61±1.051.17±0.571.25±0.42	0.55±0.050.63±0.160.52±0.10.64±0.07	0.26±0.050.31±0.120.35±0.130.36±0.1	0.49±0.150.8±0.47<sup>#</sup>0.48±0.21<sup>*</sup>0.57±0.19

注：与正常组比较^#P＜0.05；与模型组比较^*P＜0.05

从表10可见，模型组糖化血清蛋白水平显著高于对照组，中药治疗4周后糖化血清蛋白水平明显下降(P＜0.01)，接近对照组，文迪雅治疗4周后也使糖化血清蛋白水平明显下降(P＜0.05)，显示两种药物均有可靠的降糖效果；胰岛素结果呈非正态分布，所以取其自然对数后进行统计分析，结果显示，模型组基础胰岛素水平明显低于对照组(P＜0.01)，经中西药物治疗后，基础胰岛素水平都有一定的恢复，与模型组相比，两个治疗组均有显著的统计学差异(中药组P＜0.01，西药组P＜0.05)，说明两种药物对该模型大鼠的胰岛功能均有一定的保护作用。

        表10各组治疗后糖化血清蛋白与基础胰岛素水平比较

分组	例数(只)	糖化血清蛋白(mmol/L)	基础胰岛素(ng/ml)
				正常组模型组中药组西药组	8999	3.29±0.273.8±0.37<sup>##</sup>3.2±0.49<sup>**</sup>3.31±0.28<sup>**</sup>	2.76±1.210.77±0.32<sup>##</sup>1.48±0.63<sup>**</sup>1.22±0.5<sup>*</sup>

注：与正常组比较^##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

5)高胰岛素正葡萄糖钳夹试验

大鼠颈静脉取血后2-3天，每日每组取一只大鼠开始分批隔夜禁食12小时，称体重，尾静脉取血测基础血糖值，然后以2％戊巴比妥钠(2.5ml/kg体重)进行腹腔麻醉。按照周水平的方法，分离大鼠右侧颈总动脉和左侧颈内或颈外静脉，75IU/ml肝素抗凝，进行插管(美国产硬膜外麻醉用硅胶导管，内径0.6mm，外径1mm)，动脉插管以取血测血糖及稳态胰岛素，静脉插管以接微量注射泵以输注胰岛素及葡萄糖。插管完毕后，将大鼠静置30分钟后测定血糖，开始试验，开始时先恒定输注短效猪胰岛素(输注速率为8mu/kg·min-1，临用时胰岛素用0.5％牛血清白蛋白稀释)，每10分钟从左颈动脉取血测血糖1次，当血糖下降至基础血糖+1.0mmol/L时，开始小量输注20％葡萄糖溶液，并根据血糖水平不断调整葡萄糖输注率，使血糖逐渐达到稳态。将所有大鼠血糖都钳夹在基础血糖±0.2mmol/L水平，记录稳态下连续30分钟内的葡萄糖输注率，取均值。试验结束时右颈总动脉放血，测稳态胰岛素。留取胰腺、肝脏的组织标本，取全部的腹腔脂肪称重。用SPSS13.0统计分析软件处理实验数据，所得数据以均数±标准差()表示，服从正态分布的两组间均数比较用t检验进行统计，多组间比较采用方差分析。

从表11可见，在稳态血糖和胰岛素相近的情况下，模型组大鼠稳态葡萄糖输注率较对照组下降了20.4％(P＜0.01)，已具有胰岛素抵抗；中药组和西药组干预治疗后葡萄糖输注率均显著提高(P＜0.01)，与模型组相比，中药组的葡萄糖输注率提高了47％，西药组提高了56％。

             表11各组高胰岛素正葡萄糖钳夹试验结果比较

分组	例数(只)	稳态葡萄糖(mmol/L)	稳态胰岛素(ng/ml)	葡萄糖输注率(mg/kg·min)
					正常组模型组中药组西药组	6666	4.8±0.34.6±0.24.6±0.24.8±0.3	10.75±1.2712.43±0.9312.03±1.0311.87±1.09	8.61±1.026.85±0.76<sup>##</sup>10.07±1.4<sup>**</sup>10.67±1.24<sup>**</sup>

注：与正常组比较^##P＜0.01；与模型组比较^**P＜0.01。

从表12可见，各项实验空腹状态下，模型组大鼠体重略低于对照组，但无统计学差异，解剖结果显示腹腔脂肪含量也减少，也无统计学差异；西药组以及中药组治疗后大鼠的体重及腹腔脂肪含量均显著高于模型组，这种体重和腹脂含量的变化可能与胰岛功能恢复，血糖水平下降有关。

                    表12各组大鼠体重及腹脂含量比较

分组	例数(只)	体重(g)	腹脂(g)	腹脂占体重百分比(％)
					正常组模型组中药组西药组	12101113	552.3±29.9510±95.13<sup>#</sup>564±64.9583±77.03<sup>*</sup>	29.9±5.2320.34±15.934.1±18.12<sup>*</sup>35.9±16.4<sup>*</sup>	4.71±0.813.73±2.54<sup>##</sup>5.83±2.53<sup>*</sup>5.97±2.1<sup>*</sup>

注：与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

6)静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)

各组大鼠给药4周后，处死前作静脉注射葡萄糖-胰岛素释放试验。步骤如下：大鼠自试验前一日20:00起禁食，试验日8:00腹腔内注射3％戊巴比妥钠80mg/kg麻醉动物，颈静脉、颈动脉插管留置约30min后，自静脉予葡萄糖负荷0.5g/kg(浓度50％)，于负荷前(0)，负荷后5、10、30、60、120min分别采血1ml，测血糖、胰岛素。即刻测血糖，余血标本离心，血浆贮存于-20℃冰箱待检。将各采血时点所取血样红细胞加0.9％生理盐水至总体积为1ml，自静脉回输大鼠以保证血容量恒定。试验过程中自静脉定时推入肝素钠(100IU/ml)以抗凝。用SPSS13.0统计分析软件处理实验数据，所得数据以均数±标准差(

)表示，服从正态分布的两组间均数比较用t检验进行统计，多组间比较采用方差分析。

实验血糖变化结果如图5和表13所示，实验胰岛素变化结果如图6和表14所示。IVGTT中各时间点模型组大鼠血糖均显著高于对照组，治疗组各点血糖较模型组均明显下降，同时0-30分钟和0-120分钟血糖曲线下面积中药组和西药组均显著低于模型组。相应的胰岛素的分泌曲线显示，模型组整体分泌非常低下，中药组和西药组胰岛素的分泌量则明显大于模型组，但较对照组早期的分泌峰延后。

                   表13各组血糖曲线下面积比较

分组	例数(只)	0-30min血糖曲线下面积	0-120min血糖曲线下面积
				正常组模型组中药组西药组	5566	41.98±8.0787.47±19.08<sup>##</sup>51.55±15.59<sup>*</sup>57.88±23.72<sup>*</sup>	54.85±12.35125.97±23.36<sup>##</sup>72.34±22.50<sup>**</sup>80.62±36.82<sup>*</sup>

注：与正常组比较^##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

                      表14各组静脉糖耐量胰岛素分泌曲线下面积

分组	例数(只)	0-10min	0-30min	0-60min	0-120min
						正常组模型组中药组西药组	5566	3.07±1.680.48±0.6<sup>##</sup>2.3±1.99<sup>**</sup>2.64±1.57<sup>**</sup>	3.75±2.030.62±0.792.93±2.693.25±1.93	4.27±2.410.68±0.823.69±3.313.9±2.33	5.04±2.930.79±20.03<sup>##</sup>4.6±3.87<sup>**</sup>4.69±2.73<sup>**</sup>

注：与正常组比较^##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

7)胰腺组织石蜡切片胰岛素(Insulin)、胰高血糖素(Glucagon)、胰岛素受体底物1(IRS-1)及胰岛素受体(IRc)免疫组化分析

①胰腺组织石蜡切片Insulin、Glucagon及IRS-1免疫组化染色

a)石蜡切片二甲苯I、II脱蜡各15分钟，梯度酒精即出即入(浓度分别为100％、100％、95％、95％、90％、80％、70％、50％)至水；

b)流水浸洗5分钟；

c)0.3％的H₂O₂溶液氧化15分钟；

d)流水浸洗5分钟，PBS洗5分钟×3次；

e)分别滴加适当稀释的1∶100 Insulin一抗(A056429，美国DAKO)、Glucagon一抗(A056529，美国DAKO)及IRS-1一抗(2382，美国Cell Signaling)，同时设阴性对照以PBS代替I抗，4℃冰箱孵育过夜；

f)PBS洗5分钟×3次；

g)滴加1∶400生物素标记二抗(EnVision^TM系统，DAK公司)，湿盒中留置1.5小时(室温)；

h)PBS洗5钟×3次；

i)DAB溶液显色2分钟；

j)流水浸洗5分钟；

k)梯度酒精脱水(浓度分别为50％、70％、80％、90％、95％、100％)，二甲苯I、II透明各15分钟；

l)DPX封片；

②胰腺组织石蜡切片IRc免疫组化染色

a)、b)两步与前相同

c)0.3％的H₂O₂甲醇溶液氧化15分钟；

d)流水浸洗5分钟后进行抗原修复(置高火预热5分钟的0.1mmol/LPH6.0柠檬酸缓冲液中，中高火加热5分钟→补液→中高火5分钟)；

e)室温自然冷却30-40分钟后，PBS洗5分钟×3次；

f)滴加适当稀释的1∶50IRc的一抗(BA0951，武汉博士德公司)，同时设阴性对照以PBS代替I抗，4℃冰箱孵育过夜；

以下步骤与胰腺组织石蜡切片Insulin、Glucagon及IRS-1免疫组化染色相同。

如要复染，可在DAB显色，流水浸洗后，用Mayer苏木精浸染1分钟，后流水浸洗，脱水、透明、封片。

Mayer苏木精配制方法如下：

苏木精1g、甲矾50g、碘酸钠0.2g、双蒸水1000ml、水合氯醛50g、枸橼酸1g，将苏木精、甲矾及碘酸钠依次加入双蒸水内、略加热搅拌，待全溶后过夜，加水合氯醛及枸橼酸并加热至煮沸5分钟，冷却后过滤备用。

③计算机图像定量分析

免疫组化切片：采用LEICA-Q550IW计算机多功能真彩色病理图像分析系统定量分析，分别测定IRc，IRS-I、Insulin和Glucagon染色切片中各胰岛面积及全胰岛相应的平均光密度值(MOD)。

从表15可见，结果如下：

IRS-1免疫组化表达：对照组染色呈深棕色，强阳性表达，弥漫分布于整个胰岛细胞的胞浆；模型组大鼠主要胰岛中央区域分散或散在的阳性表达，呈棕黄色；中药组大鼠的阳性表达较模型组明显增强和增多，呈深棕黄色，主要胰岛中央区域的细胞胞浆内；西药组与中药组表达情况相似。平均光密度(MOD)值比较，模型组最低，与对照组、中药组和西药组有显著统计学意义的差异。

IRc免疫组化表达：整体染色较淡，对照组染色呈淡棕色阳性表达，弥漫分布于胰岛细胞的中央区域；模型组大鼠主要在胰岛中央区域散在的弱阳性表达，呈淡棕黄色；中药组大鼠的阳性表达较模型组明显增强和增多，呈淡棕色，胰岛中央区域较多；西药组与中药组表达情况相似。平均光密度(MOD)值比较，模型组最低，与对照组、中药组和西药组有显著统计学意义的差异。

IRS免疫组化表达：对照组染色呈深棕黄色，强阳性表达，弥漫分布于胰岛细胞的中央区域；模型组大鼠主要在胰岛中央区域弥散的阳性表达，呈棕色；中药组大鼠的阳性表达较对照组的表达区域局限和不连贯，呈棕黄色阳性表达；西药组呈弥漫分布于胰岛得中央区域，棕黄色阳性表达。平均光密度(MOD)值比较，模型组最低，与对照组、中药组和西药组有显著统计学意义的差异。

Glc免疫组化表达：对照组染色呈棕黄色，分布于胰岛的周边区域，强阳性表达；模型组大鼠的阳性表达区域增多，周边为主，中央区域也有表达，呈深棕黄色；中药组大鼠的阳性表达较对照组的表达区域增高，但中央区的表达较模型组少，呈棕黄色阳性表达；西药组与中药组表达情况相似。平均光密度(MOD)值比较，模型组较对照组高，但无统计学差异，与中药组和西药组相比也没有显著统计学意义的差异，同时对表达区域进行面积的统计也是模型组较多，但无统计学差异。从各组大鼠胰岛标本中选取胰岛素表达情况相近的个体，进行胰高糖素平均光密度值和表达面积的比较，中药组和西药组的胰高糖素表达的面积较模型组还是明显减少的，一定程度上说明胰岛素对胰高糖素表达抑制作用的增强。

                       表15免疫组织化学染色平均光密度(MOD)值比较

分组	例数(只)	IRc	IRS-1	INS	Glc
						正常组模型组中药组西药组	5555	0.231±0.0060.218±0.007<sup>##</sup>0.229±0.009<sup>**</sup>0.226±0.004<sup>**</sup>	0.268±0.0090.244±0.008<sup>##</sup>0.277±0.01<sup>**</sup>0.262±0.04<sup>**</sup>	0.247±0.010.221±0.01<sup>##</sup>0.249±0.03<sup>**</sup>0.264±0.03<sup>**</sup>	0.305±0.020.316±0.02<sup>#</sup>0.312±0.010.323±0.02

注：与正常组比较^##P＜0.01；与模型组比较^**P＜0.01

8)大鼠胰岛分离与功能测定

①实验大鼠隔夜禁食，2％戊巴比妥钠腹腔麻醉，酒精擦洗消毒，固定大鼠。

②用事先消毒好的手术器械，打开腹腔胸腔，剪破心脏，迅速用灭菌纱布吸去血液，把肝脏向上翻起，找到胃与小肠连接处，把小肠向右翻开，即可暴露出胰腺，用止血钳夹住胰腺到十二指肠入口，避免注入到胰腺的胶原酶(Sigma)进入小肠，抽取13ml过滤好的0.5mg/ml的胶原酶，用套管针刺入胆总管，拔除针芯后，用眼科镊固定，推注胶原酶10ml左右，可清晰的看到胰脏膨大，小心的把胰脏完整的剥下。

③将胰脏放入50ml的离心管中，再把剩下的胶原酶加入，37℃水浴20分钟，其间10分钟震荡一次，让它充分裂解，加入4℃的Hanks液，终止消化，使劲吹打，4℃离心2000rpm，5分钟，去上清，Hanks洗，过滤网，再离心，4℃离心2000rpm，10分钟，尽量去干净上清，每管加5ml 25％-4℃-Ficoll(Ficoll 400，50g；Hepes，0.475g；Hanks，150ml)，加后把离心管倾斜，缓慢依次加入23％Ficoll 5ml，21％Ficoll 5ml，11％Ficoll 5ml，4℃离心，400rpm，5分钟，再用2500rpm，20分钟，胰岛会悬浮在11％与21％之间，在21％和23％之间也会有一些。

Hanks液配制方法如下：

无水CaCl₂：0.14g；KCl：0.4g；Na₂HPO₄·7H₂O：0.09g；MgCl₂·6H₂O：0.1g；MgSO₄·7H₂O：0.1g；NaCl：8.0g；NaHCO₃：0.35g；KH₂PO₄：0.6g；无水葡萄糖：1.0g；酚红：0.01g。加ddH2O至1000ml，调pH至7.2~7.4，0.22μm微孔滤膜过滤分装。

④小心把胰岛吸出，加Hanks洗，离心，2000rpm 10分钟，再1600rpm 10分钟，1200rpm 10分钟，弃上清，加约1ml左右1640(完全RPMI-1640培养基)(10％血清)，吹打，吸出1-2滴，放入平皿，在解剖镜下挑选，胰岛细胞会聚集成团，象菠萝形状。加入1640(不完全RPMI-1640培养基)培养。

⑤吸去培养瓶内旧培养液，换用等量的双硫腙染色液后置5％CO2、37℃水蒸气饱和的二氧化碳培养箱内培养染色15-30分钟后在倒置显微镜下观察并拍照，照片见图7。

⑥吸出24孔培养板内的培养液，细胞用Kreb-Ringers液预孵育30分钟后，加入终浓度为5.6mM的葡萄糖孵育1小时，吸出培养上清后用Kreb-Ringers液洗细胞2次后加入含16.7mM葡萄糖的Kreb-Ringers液继续孵育1小时后吸出培养上清，置-20℃待测胰岛素含量。

Kreb-Ringers液配制方法如下：

NaCl，119mmol/L；KCl，4.74mmol/L；CaCl₂，2.54mmol/L；MgSO₄，1.19mmol/L；KH₂PO₄，1.19mmol/L；NaHCO₃，25mmol/L；hepes，10mmol/L；BSA，0.1％；调pH至7.2-7.4，0.22μm微孔滤膜过滤分装。

⑦用SPSS13.0统计分析软件处理实验数据，所得数据以均数±标准差(

)表示，服从正态分布的两组间均数比较用t检验进行统计，多组间比较采用方差分析。

从表16可见，显示5.6mM和16.7mM葡萄糖孵育后胰岛素的分泌情况模型组明显减少，中药组和西药组均有统计学意义的提高。但与对照组仍相差很大，可能与实验期间有一次二氧化碳培养箱断气一晚，影响了胰岛细胞的功能状态有关(正常组没有波及)。

      表16不同浓度葡萄糖孵育对胰岛细胞胰岛素分泌的影响

分组	胰岛数(个)	5.6mM葡萄糖胰岛素ng/ml	16.7mM葡萄糖胰岛ng/ml
				正常组模型组中药组西药组	50505050	21.72±1.031.072±0.381.91±1.2<sup>*</sup>1.34±0.22<sup>*</sup>	21.93±1.871.47±0.912.676±1.13<sup>*</sup>1.70±1.03<sup>*</sup>

综上所述，本实验的研究结果表明，清热降浊方可明显改善2型糖尿病模型大鼠的糖代谢异常，无论从空腹血糖，还是口服葡萄糖负荷后2小时血糖，以及糖化血清蛋白水平都可以肯定其降糖疗效。其降糖机理在于两方面：一是胰岛素抵抗的改善，用胰岛素敏感性评价的金标准进行判定，模型组大鼠存在明显的胰岛素抵抗，中药组和西药组胰岛素抵抗均明显改善，其葡萄糖输注率甚至大于正常对照组，且中药组与西药组相比没有明显差异；二是胰岛细胞功能的改善，结果显示，模型大鼠的基础胰岛素水平明显低于对照组(P＜0.01)，仅为正常大鼠水平的28％，中药组和西药组经治疗后基础胰岛素水平分别提高了92％和58％(P＜0.01)；静脉葡萄糖耐量的结果显示葡萄糖刺激的胰岛素的分泌在模型组几乎消失殆尽有胰岛细胞功能受损严重，中药治疗组和西药治疗组，无论是早相的胰岛素分泌(0-10分钟、0-30分钟胰岛素分泌曲线下面积)，还是整个过程的胰岛素分泌(0-120分钟胰岛素分泌曲线下面积)均有明显的改善，所以0-30分钟和0-120分钟葡萄糖曲线下面积就较模型组明显降低。本实验应用了STZ人为造成胰岛功能的破坏使血糖增高，实验结果显示，中药组大鼠胰岛的胰岛素受体以及受体底物-1的表达较模型组明显增强，与西药组无明显差异，结合我们以往的研究，清热降浊方虽然不能影响STZ导致的的胰岛细胞功能的破坏，但可以改善因为糖毒性、脂毒性引起的对胰岛细胞胰岛素信号转导通路的抑制而起到保护胰岛细胞功能的作用，也就是通过改善胰岛细胞自身的胰岛素抵抗来实现改善胰岛细胞的分泌功能。模型大鼠还是表现出了糖尿病的血脂谱，即甘油三酯升高和极低密度脂蛋白升高，而中药组大鼠的极低密度脂蛋白与模型组比较有统计学意义的下降，提示了中药对血脂异常可能有积极的治疗作用，并且这种作用不能全部用胰岛素分泌改善、胰岛素敏感性增高来解释，因为西药罗格列酮同样改善了胰岛功能和胰岛素抵抗，却未观察到上述的结果，而胆固醇水平还略有升高，这可能也是中药临床应用的优势。免疫组化的实验结果提示中药组和西药组胰岛细胞的胰岛素的表达均较模型组明显增强，但没有显示出对胰岛细胞胰高糖素表达的抑制，可能与模型组大鼠由于胰岛β细胞破坏以及高脂喂养导致的胰岛α细胞的增生较多有关，虽然通过治疗胰岛细胞的功能有所恢复，但增加的胰岛素通过旁分泌的对α细胞的抑制作用并不足够。

Claims (4)

1.一种治疗糖尿病的药物，由以下重量份数的原料制成：

苦瓜片 25-35份  苦参     6-12份     黄连 25-35份

知母   25-35    份酸枣仁 10-20份    炮姜 4-8份

红曲   2-4      份陈皮   6-12份     大黄 1-3份

桃仁   4-8份。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于：所述药物由以下重量份数的原料制成：

苦瓜片 30份    苦参   9份     黄连 30份

知母 30份      酸枣仁 15份    炮姜 6份

红曲 3份       陈皮   9份     大黄 2份

桃仁 6份。

3.根据权利要求1或2所述的药物，其特征在于：所述药物的剂型为汤剂、冲剂、散剂或丸剂。

4.根据权利要求1或2所述的药物，其特征在于：所述药物为软胶囊、颗粒或口服液。

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