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CN101198353A - 免疫调节组合物和其应用 - Google Patents

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CN101198353A CNA2006800210412A CN200680021041A CN101198353A CN 101198353 A CN101198353 A CN 101198353A CN A2006800210412 A CNA2006800210412 A CN A2006800210412A CN 200680021041 A CN200680021041 A CN 200680021041A CN 101198353 A CN101198353 A CN 101198353A
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University of Queensland UQ
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Abstract

本发明公开了将IL－10功能抑制剂和刺激对靶抗原初次产生免疫应答的免疫刺激物用于刺激和延长宿主对所述靶抗原的免疫应答的方法和组合物。本发明方法和组合物具体可用于治疗或预防各种疾病，包括致病性感染和癌症。

Description

免疫调节组合物和其应用
发明领域
本发明总的涉及调节免疫应答的方法和药物。更具体说，本发明涉及IL-10功能抑制剂和刺激对靶抗原产生初次免疫应答的免疫刺激物在刺激和延长宿主对靶抗原的免疫应答的方法和组合物中的应用。本发明的方法和组合物特别可用于治疗或预防许多疾病，包括致病性感染和癌症。
发明背景
“抗原原罪”是用来指用两种交叉反应抗原依次刺激宿主时，诱导的免疫应答仅指向第一种抗原的术语，首次在流感感染期间的抗体应答中描述了这种现象(Webster，1966，J.Immunol.97：177-183)。虽然与新生病毒发生一定程度的交叉反应可解释精液抗体的持续性，但阻止受感染宿主的免疫系统产生针对新生病毒变种的高亲和力中和抗体的机制尚未明了。
在HIV感染的情况下，抗原原罪表示B细胞克隆显性，其中最初反应的B细胞通过称为“欺骗性印记”或“所有组成成分冻结”的方法被“锁定”(Kohler等，1994，Immunol.Today 15：475-478)。这种克隆显性包括针对HIV产生的抗体组的有限多样性，且这种显性显然会减弱免疫应答对新生变体的适应，并有利于病毒持续性。
也在CTL应答中观察到抗原原罪(Klenerman和Zinkernagel，1998，Nature394(6692)：482-485)，因为用一株LCMV初免的小鼠对CTL表位变异毒株引起的后续感染发生应答，而其CTL应答是针对初始表位、而非新变异表位的应答。
预先存在的T细胞或抗体能与变异抗原或递呈新抗原表位的抗原递呈细胞发生交叉反应，从而能够去除变异抗原，这些T细胞或抗体各自被认为是对变异抗原的新表位产生应答的抑制因素(Da Silva，2001，Virology 290(2)：350-60；McMichael，1998，Nature 394(6692)：421-422)。近年来，Liu等(2003，J.Immunol.171：4765-4772)发现，对乳头瘤病毒(PV)衣壳蛋白的在先免疫能抑制诱导原初CD8+T细胞对连接于衣壳蛋白的MHC I类限制表位产生IFN-γ应答，接着用表达I类限制表位的衣壳免疫。此外，Liu等观察到，此种降低的应答需要产生IL-10，局限于PV衣壳递送位点，并且不依赖该衣壳的抗体。虽然得知这些观察结果符合抗原原罪的描述，但这些研究人员提出，需要通过接种病毒或肿瘤抗原诱导新的免疫应答时，IL-10的局部抑制可能是克服先前对载体抗原的免疫力的关键决定因素。
在本发明的先导工作中发现：PV衣壳蛋白L1 VLP免疫能产生抗原特异性IL-10分泌性CD4+T细胞，它是抑制VLP初免宿主的CD8+T细胞随后分泌抗原特异性IFN-γ所必需的。本发明人还发现，VLP特异性CD4+细胞接触树突细胞后能分泌IL-10，CD4+T细胞-教导的(educated)树突细胞有利于诱导分泌IL-5、而不分泌IFN-γ的CD8+T细胞。此外，已发现，在体外或体内临时中和IL-10能恢复合适免疫之后对VLP产生CD8+IFN-γ应答的能力。
简化上述发现，以用于刺激对各种病原物，特别是可持续存在并导致慢性疾病的病原物产生更有效的免疫应答的新方法和组合物。
发明概述
因此，在一个方面，本发明提供了在未接触过靶抗原或以前对靶抗原产生过免疫应答的对象中刺激对该靶抗原产生免疫应答的组合物。这些组合物通常含有能刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激物和IL-10功能抑制剂。在一些实施方式中，该免疫刺激物选自对应于靶抗原的至少一部分的抗原、能与靶抗原发生免疫反应的抗原结合分子和能刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激细胞。靶抗原一般与感兴趣的疾病或病症有关。在一些实施方式中，靶抗原由病原生物体或癌产生。对应于靶抗原的至少一部分的抗原可以是可溶形式(如肽或多肽或可尤其表达任何一种抗原的构建物)。或者，抗原可以是颗粒或细胞(如病毒、细菌或全细胞)或由抗原递呈细胞(如专性或兼性抗原递呈细胞)递呈。在免疫调节剂是抗原结合分子的实施方式中，这种分子一般结合于靶抗原或与其相互作用，以降低其水平或功能活性(如中和性抗体)。可与IL-10功能抑制剂联用的示范性免疫刺激细胞是免疫效应细胞，包括抗原-特异性T淋巴细胞，例如但不限于溶细胞性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞、T调节细胞和B淋巴细胞。在一些实施方式中，该组合物含有一种以上免疫刺激物，如2、3、4、5或多种免疫刺激物，它们能刺激或增强对该靶抗原或多种靶抗原的免疫应答。
适当地，在对象以前对该靶抗原产生过免疫应答和免疫刺激物含有对应于该靶抗原的至少一部分的抗原的实施方式中，相应抗原的氨基酸序列与所述至少一部分的氨基酸序列相同。在对象以前对靶抗原产生过免疫应答且免疫刺激物含有对应于靶抗原的至少一部分的抗原的其它实施方式中，相应抗原的氨基酸序列与所述至少一部分的氨基酸序列不同，区别在于加入、缺失或取代了至少一个氨基酸残基。在这些实施方式的说明性实施例中，所述相应抗原是对象对其产生过免疫应答的天然产生的抗原。
在一些实施方式中，IL-10功能抑制剂选自可溶性或缺陷型IL-10受体或其片段、表达IL-10受体或其片段的细胞、能与IL-10或IL-10受体发生免疫反应的抗原结合分子、抑制IL-10基因的表达或IL-10表达产物的功能活性的核酸(如对IL-10基因或其转录物特异的反义分子、核酶或RNAi分子)或者IL-10的小分子抑制剂。
在一些实施方式中，该组合物还含有药学上可接受的运载体或稀释剂。在某些实施方式中，该组合物还含有提高免疫刺激的有效性的佐剂。适当地，佐剂能将抗原递送给I类主要组织相容性(MHC)途径。例如，这种佐剂包括但不限于：含皂苷的化合物(如ISCOM)和介导将抗原递送至靶细胞的胞浆的溶细胞素。溶细胞素可连接于或结合于抗原。在一些实施方式中，溶细胞素介导将抗原由膜泡(vacuole)(如吞噬体或内体)转移到抗原递呈细胞的胞浆中，在这种类型的说明性实施例中，溶细胞素是李斯特菌溶细胞素。
本发明的另一方面提供了在未接触过靶抗原或以前对靶抗原产生过免疫应答的对象中刺激免疫应答的方法。这些方法通常包括给予该对象有效量的如上所述的免疫刺激物和IL-10功能抑制剂。该组合物的活性成分可以依次、分别或同时给药。在某些实施方式中，免疫应答是T-细胞介导的免疫应答。有利的是，这些方法可用于治疗或预防与对象中靶抗原的存在或异常表达有关的疾病或病症。在某些实施方式中，所述疾病或病症选自致病性感染、特征是免疫缺陷的疾病或癌症。按照本发明，IL-10功能抑制剂将抑制在没有该抑制剂时能产生的IL-10，从而在随后递送免疫刺激物和任选的IL-10功能抑制剂后维持对象对靶抗原产生CD8+IFN-γ应答的能力。因此，在一些实施方式中，本发明方法还包括给予至少一种其它有效量的免疫刺激物和任选的至少一种其它有效量的IL-10功能抑制剂，从而维持或增强对靶抗原的免疫应答。
在另一方面，本发明考虑将上述IL-10功能抑制剂和免疫刺激剂用于制备刺激或增强对靶抗原的免疫应答的药物。
在另一方面，本发明涉及将上述IL-10功能抑制剂和免疫刺激剂用于制备治疗或预防与靶抗原的存在或异常表达有关的疾病或病症的药物。
附图简要说明
图1是显示病毒衣壳初免的CD4+T细胞能产生IL-10，并且为E7特异性IFN-γ抑制所必需的图示。图(A)中，在第0天和第14天用含有或不含明矾的L1 VLP免疫3-5只C57BL/6J小鼠的小组，或者不进行免疫。在第21天收集淋巴结淋巴细胞，并使其接触10μg/mL L1 VLP 48小时。用ELISA测定上清液中的IL-10。图(B)中，用含有明矾的L1 VLP免疫动物两次，如同(A)那样使淋巴结和脾淋巴细胞接触VLP，并且加入或不加入15μg/mL抗-CD4(GK1.5)、抗-CD8(2.43)或同种型对照抗体。用ELISA分析上清液中的IL-10。结果是单个小鼠脾细胞以及汇集的局部淋巴结细胞的三次实验的平均值±SEM。图(C)中，如同(A)那样用L1 VLP免疫动物两次，并从第21天起连续i.p.给予500μL 1 mg/mL抗-CD4(GK1.5)或正常大鼠血清(NRS)3天。第25天和第43天通过血液FACS分析监测CD4+T细胞的耗尽和恢复。图(D)中，如同(C)那样用L1E7 VLP在第44天和第58天免疫耗尽(αCD4)或模拟耗尽(NRS)CD4+细胞的动物(L1/L1E7)。通过相似方法用L1E7 VLP(L1E7)免疫之前未处理的动物。在第55天用ELISPOT评价在脾和淋巴结中E7特异性IFN-γ分泌性CD8+T细胞的诱导。
图2是显示来自VLP和明矾免疫的小鼠的CD4+T细胞能在体外抑制E7特异性IFN-γ分泌的图示。图(A)中，使来自C57BL/6J小鼠的105个CD11c+树突细胞分别接触40μg/mL BPV1 L1E7 VLP、BPV1 L1VLP或HPV6 L1VLP 18小时。充分洗涤后，加入5×105个E7 TCR转基因T细胞并培养48小时。用ELISA测定上清液中的IFN-γ。加入3H胸苷，通过3H掺入评价T细胞增殖。图(B)中，使CD11c+细胞(105个)接触BPV1 L1E7 VLP 18小时，或在没有抗原的情况下培养。洗涤后，如图所示加入来自BPV1 L1 VLP免疫的小鼠或来自未免疫小鼠的CD4+T细胞(105个)。加入5×105个E7 TCR细胞和终浓度为15μg/mL的GK1.5抗-CD4抗体，如上所述测定T细胞增殖和IFN-γ分泌。图(C)中，使CD11c+细胞(105个)接触BPV1 L1E7 VLP或BPV1 L1 VLP18小时。洗涤后，如图所示加入来自BPV1 L1 VLP和明矾免疫的小鼠或来自OVT(OVA的MHC II限制性肽)和明矾免疫的小鼠，或来自未免疫小鼠的CD4+T细胞(105个)。加入5×105个E7 TCR细胞，如上所述测定T细胞增殖和IFN-γ分泌。结果为三个样品的平均值±SEM。图(D)中，使CD11c+细胞(105个)接触BPV1 L1E7 VLP或BPV1 L1 VLP 18小时。洗涤后，如图所示加入来自BPV1 L1 VLP和明矾免疫的小鼠或来自OVT和明矾免疫的小鼠的CD4+T细胞(105个)。收集上清液，用ELISA测定IL-10分泌。结果为三个样品的平均值±SEM。
图3是显示IL-10的中和能恢复E7特异性IFN-γ分泌的图示。图(A)显示了体外中和。使来自C57BL/6J小鼠的CD11c+细胞(105个)接触40μg/mL E7VLP 18小时。如图所示加入用L1VLP和明矾免疫小鼠的CD4细胞(105个)和抗-IL-10抗体作用18小时。然后加入E7 TCR转基因T细胞(5×105个)处理48小时。收集上清液，以进行细胞因子ELISA，通过3H胸苷掺入评价T细胞增殖。图(B)显示了体内中和。在第0天和第14天用L1 VLP免疫3只C57BL/6J小鼠的小组。如图所示，在第20天和第21天i.p.给予小鼠0.5mg抗IL-10R或正常大鼠血清，并且在第21天用E7 VLP免疫。第34天和第35天，重复IL-10R抗体给药和VLP免疫。第41天，收集脾和局部引流淋巴结，进行E7肽特异性IFN-γELISPOT。
图4是显示接触VLP初免的CD4+T细胞的树突细胞(DC)能指导CD8+T细胞响应于抗原而分泌IL-5的图示。图(A)中，使来自C57BL/6J小鼠的CD11c+细胞(105个)接触40μg/mL L1E7VLP或L1VLP 18小时。然后，如图所示，对它们不进行处理，或接触用OVT和明矾或L1VLP和明矾免疫的小鼠的CD4+细胞(105个)18小时。加入E7 TCR转基因T细胞(5×105个)48小时。收集培养物上清进行IL-5 ELISA。图(B)中，用40μg/mL L1E7 VLP培育CD11c+细胞，接着不处理(a，b)或接触L1VLP(c，d)或L1VLP和明矾(e，f)免疫的C57BL/6J小鼠的CD4+细胞18小时。随后，通过阳性选择耗尽CD4+细胞(FACS特性-AFTER)，加入5×105个E7特异性或不相关T细胞48小时；用ELISA测定T细胞增殖(a，c，e)和IL-5水平(b，d，f)。
图5是显示CpG刺激无法克服IL-10分泌性CD4细胞对E7特异性IFN-γ分泌的抑制的图示。在第0天和第14天用L1 VLP免疫3只C57BL/6J小鼠的小组(L1/L1E7)或不进行免疫(L1E7)。在第21天和第35天，用E7 VLP免疫所有小组；也给予一个小组10μg/mL CpG，如图所示。最后一次免疫6天后，收集脾和引流淋巴结，进行E7特异性IFN-γ ELISPOT实验。结果是各组中3只小鼠的平均值和S.EM。
发明详述
1.定义
除非另有定义，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然与本文所述相似或等同的任何方法和材料均可用于实施或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。出于本发明目的，下面对术语作出定义。
本文所用冠词“一个”和“一种”指一个或一个以上(即至少一个)该冠词的语法目标。例如，“一种元素”指一种元素或一种以上的元素。
本文所用术语“约”指相对于具体条件，变化高达30％，优选高达20％，更优选高达10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的条件(如量、浓度、时间等)。
“抗原”指能够在脊椎动物，尤其是哺乳动物中引发免疫应答的蛋白质、肽或者其它分子或大分子的全部或一部分。这种抗原也能与用该蛋白质、肽或者其它分子或大分子免疫的动物的抗体发生反应。
“抗原结合分子”指与靶抗原有结合亲和力的分子。应理解，此术语延及免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和具有抗原结合活性的非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架。
“自体”指衍生自同一生物体的物质(如细胞、组织等)。
本文所用术语“同种异体”指遗传组成不同的细胞、组织、生物体等。
“生物活性片段”指保持了全长母体多肽的活性的该全长母体多肽的片段。本文所用术语“生物活性片段”包括具有母体多肽活性的缺失突变体和小肽，如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个毗连氨基酸的片段。这种类型的肽可通过应用标准的重组核酸技术获得或用常规的液相或固相合成技术合成。例如，可参考以下文献所述的溶液合成或固相合成，例如，Atherton和Shephard的题为“肽合成(Peptide Synthesis)”的第9章，其包括在由Blackwell Scientific Publications出版Nicholson编辑的题为“合成疫苗(Synthetic Vaccine)”的出版物中。或者，可通过用蛋白酶如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本发明多肽产生肽。可采用(例如)高效液相色谱(HPLC)技术纯化消化的片段。
本文所用术语“细胞组合物”、“细胞疫苗”或“细胞免疫原”指含有至少一种细胞群作为活性成分的组合物。
本文所用术语“顺式作用序列”或“顺式调节区”或类似术语应该指衍生自可表达遗传序列的任何核苷酸序列，其中该遗传序列的表达至少部分受核苷酸序列的调节。本领域技术人员应了解，顺式调节区可能能够激活、沉默、增强、抑制或改变任何结构基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。
除非文中另有说明，整个说明书中的术语“包括”、“包含”应被理解为暗指包括所指出的步骤或元件或者步骤或元件组，但不排除任何其它步骤或元件或者步骤或元件组。
“对应于”指编码与靶抗原的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列的抗原。通常，该抗原与靶抗原的至少一部分的相似性至少约为30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％。
本文所用的“培养”等术语指在已显示能支持细胞体外生长或在体外维持细胞的条件下体外培育细胞群(或单细胞)所用的一组步骤。本领域了解多种形式、培养基、温度范围、气体浓度等培养体系中需要确定的这些参数。这些参数取决于所选形式和实施本文所述方法的个体的特殊需要。然而，培养参数的确定是本领域常规过程。
在调节免疫应答或者治疗或预防疾病或病症的情形下，“有效量”指以单一剂量或作为一系列剂量的一部分将这种量的组合物给予需要的个体，以有效实现调节、治疗或预防。有效量将取决于待治疗个体的健康和身体情况、待治疗个体的分类组别、组合物配方、对医学状况的评价和其它相关因素。预计该量将在可通过常规试验测定的相对宽的范围之内。
“表达载体”指能够指导合成该载体编码的蛋白质的任何自主遗传元件。本领域技术人员知道这种表达载体。
本文所用术语“基因”具有最广泛的含义，包括对应于该基因的基因组DNA区以及对应于外显子的cDNA序列或经工程改造编码一产物的功能形式的重组分子。
“衍生物”指，(例如)与其它化学部分偶联或复合或通过本领域所了解的翻译后修饰技术进行修饰，从而由基本序列得到的多肽。术语“衍生物”的范围也包括对母体序列进行的改变，包括提供功能等效分子的加入或缺失。
正如本领域所熟知的那样，增强免疫应答(“免疫增强”)指提高动物对外来或疾病特异性抗原(如癌抗原)反应的能力，即经初免能攻击这种抗原的细胞的数量、活性或检测和破坏这种抗原的能力提高。用标准检测测定免疫应答的强度，这些检测包括：用本领域已知的方式直接测定外周血淋巴细胞；天然杀伤细胞细胞毒性实验(参见例如，Provinciali M.等(1992，J.Immunol.Meth.155：19-24)、细胞增殖实验(参见例如，Vollenweider，I.和Groseurth，P.J.(1992，J.Immunol.Meth.149：133-135)、免疫细胞和亚组的免疫测定(参见例如，Loeffler，D.A.等(1992，Cytom.13：169-174)；Rivoltini，L.等(1992，Can.Immunol.Immunother.34：241-251)；或者通过皮肤测试细胞介导的免疫(参见例如，Chang，A.E.等(1993，Cancer Res.53：1043-1050)。用上述测试测定的免疫应答强度的统计学显著性提高被认为是本文所述的“免疫应答增强”、“免疫增强”或“免疫增效”。免疫应答增强也表现为：身体表现如发热和炎症，全身性和局部感染的治愈，和疾病症状减轻，即肿瘤减小、疾病或病症的症状缓解，所述疾病或病症包括但不限于：麻风病、结核病、疟疾、naphthous溃疡、疱疹样和乳头瘤样疣、牙龈炎、关节硬化、AIDS并发症如卡波济氏肉瘤、支气管感染等。这种身体表现也限定了本文所用的“免疫应答增强”、“免疫增强”或“免疫增效”。
本文提到“免疫缺陷”时，包括体液和/或细胞介导的免疫的产生过程中有缺陷的任何情况。
本文提到“免疫相互作用”包括分子之间的任何相互作用、反应或其它形式的结合，尤其当分子之一是免疫系统的组成成分，或模拟了免疫系统的组成成分时。
本文所用术语细胞的“失活”指使得细胞不能进行细胞分裂以形成后代。然而，细胞可能能够对刺激发生反应，或能够进行生物合成和/或分泌细胞产物如细胞因子。本领域了解失活的方法。优选的失活方法是用毒素如丝裂霉素C或辐射处理。被固定或通透并且不能分裂的细胞也是失活细胞的例子。
“分离”指基本或大体上不含在天然状态下与其并存的组分的物质。如果一种组合物能满足以下条件之一，则称其有“免疫原性”：a)能在幼稚
Figure S2006800210412D00081
个体中产生针对抗原(如肿瘤抗原)的免疫应答；或b)在个体中重建、促进或维持免疫应答，使其超过没有给予化合物或组合物时发生的免疫应答。以单一剂量或多剂量给药时如果能够达到这些标准之一，则该组合物有免疫原性。
“调节”指直接或间接提高或降低靶分子的水平和/或功能活性。例如，药物可通过与靶分子以外的分子相互作用间接调节所述水平/活性。在这个方面，间接调节编码靶多肽的基因的范围包括调节第一种核酸分子的表达，其中第一种核酸分子的表达产物调节编码靶多肽的核酸分子的表达。在某些实施方式中，“调节”指所需/选择的应答比抗原单独使用日寸更有效(如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或更高)、更快速(如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或更高)、幅度更大(如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或更高)和/或更易于诱导(如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或更高)。
本文所用术语“5′非编码区”具有最广泛的含义，包括衍生白可表达基因的上游区的所有核苷酸序列，而不是编码包含所述基因的多肽产物的氨基酸残基的序列，其中所述5′非编码区能产生或激活或有利于(至少部分)该基因的表达。
“获自”指样品，例如核酸提取物或多肽提取物分离自，或衍生自特定的宿主来源。例如，提取物可获自直接从宿主分离的组织或生物液体。
本文所用术语“寡核苷酸”指由多个核苷酸单位(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关结构变体或合成类似物)通过磷酸二酯键(或其相关结构变体或合成类似物)连接组成的聚合物。因此，虽然术语“寡核苷酸”一般指核苷酸及其之间的连接是天然产生的核苷酸聚合物，但应理解，该术语的范围也包括各种类似物，包括但不限于：肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核酸等。该分子的准确大小可取决于具体应用。寡核苷酸的长度一般相当短，通常约为10-30个核苷酸，但该术语可指任何长度的分子，但术语“多核苷酸”或“核酸”一般用于大的寡核苷酸。
本文所用术语“操作性连接”指将结构基因置于启动子的调控下，然后控制该基因的转录，并任选地控制其翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选使遗传序列或启动子与基因转录起始位点之间的距离约等于该遗传序列或启动子和天然状态下其控制的基因(即产生该遗传序列或启动子的基因)之间的距离。如本领域所知，该距离可以容忍一定程度的变化，而不会损失功能。相似地，调节序列元件相对于准备置于其控制下的异源基因的优选定位由该元件在天然状态，即产生它的基因中的定位确定。
在本文中术语“患者”、“对象”、“宿主”或“个体”或可互换使用，指需要进行治疗或预防的任何对象，尤其是脊椎动物对象，更具体是哺乳动物对象。属于本发明范围的合适的脊椎动物包括脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类动物、啮齿动物(如小鼠、大鼠、豚鼠)、兔类(如家兔、野兔)、牛(如畜牛)、羊(如绵羊)、山羊(如山羊)、猪、马、犬(如狗)、猫(如家猫)、鸟类(如鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟类如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(如海豚、鲸)、爬行动物(蛇、蛙、蜥蜴等)和鱼。优选对象是需要治疗或预防与感兴趣抗原的存在或异常表达有关的病症或疾病的人。然而应理解，上述术语不暗示出现症状。
“药学上可接受的运载体”指可安全地用于局部或全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。
本文所用术语“药学相容性盐”指在毒理学上对人和动物给药安全的盐。此盐可选自盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、磷酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、萘磺酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、对苯二甲酸盐、双羟萘酸盐或果胶酸盐(pectinate)。
本文所用术语“多核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语一般指长度大于30个核苷酸的寡核苷酸。
术语“多核苷酸变体”和“变体”指与参比多核苷酸序列的序列基本相同的多核苷酸或能够在本文所述的严谨条件下与参比序列杂交的多核苷酸。这些术语也包括加入或缺失了一个或多个核苷酸、或用不同核苷酸取代的多核苷酸。在这个方面，本领域熟知，可对参比多核苷酸进行某些改变，包括突变、加入、缺失和取代，从而使改变的多核苷酸保持参比多核苷酸的生物学功能或活性。术语“多核苷酸变体”和“变体”也包括天然产生的等位基因变体。
在本文中，“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基及其变体和合成类似物的聚合物。因此，这些术语可用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然氨基酸，如对应天然氨基酸的化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物。
术语“多肽变体”指通过加入、缺失或取代至少一个氨基酸由参比多肽变化而来的多肽。本领域熟知，一些氨基酸可改变为具有广泛相似特性的其它氨基酸，这种改变不会改变多肽活性的特性。因此，本文所用多肽变体包括与母体多肽的活性相似的多肽，所述母体多肽选自：IFNα、IFNβ、IFNγ、B7-1分子或B7-2分子。优选的变异多肽包括保守性氨基酸取代。可按下表对多肽进行示范性保守取代：
表A
    原始残基     示范性取代
    AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIleLeuLysMetPheSerThrTrpTyrVal     SerLysGln，HisGluSerAsnAspProAsn，GlnLeu，ValIle，ValArg，Gln，GluLeu，Ile，Met，Leu，TyrThrSerTyrTrp，PheIle，Leu
如果选择保守性低于表A所示取代的取代，则会引起功能的显著改变。其它取代是非保守取代，可耐受的这种取代相对较少。通常，可能对多肽特性产生最大改变的取代是以下取代：(a)亲水性残基(如Ser或Asn)被疏水性残基(如Ala、Leu、Ile、Phe或Val)取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸被任何其它残基取代；(c)侧链带正电的残基(如Arg、His或Lys)被电负性残基(如Glu或Asp)取代；或(d)侧链较小的残基(如Ala、Ser)或无侧链残基(如Gly)被具有大侧链的残基(如Phe或Trp)取代。
本文中提到的“启动子”具有最广泛的含义，包括经典基因组基因的转录调节序列，包括准确启动转录所需的TATA框(含有或不含CCAAT框序列)，以及响应于发育和/或环境刺激、或以组织特异性或细胞类型特异性方式而改变基因表达的其它调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。启动子通常，但不一定位于表达受其调节的结构基因的上游或5’。而且，含有启动子的调控元件通常位于该基因转录起始位点的2kb内。本发明优选的启动子可含有一种或多种特异性调控元件的额外拷贝，以进一步提高在细胞中的表达和/或改变与其操作性连接的结构基因的表达时机。
本文所用术语“重组多核苷酸”指通过操作使核酸形成在天然情况下通常不存在的形式，从而在体外形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以是表达载体的形式。通常，这种表达载体包括操作性连接于核苷酸序列转录和翻译调节核酸。
“重组多肽”指用重组技术，即通过表达重组多核苷酸制备的多肽。
本文所用的“刺激”免疫或免疫应答指与不用该组合物时相比，给予该组合物能在更高水平上启动、提高或维持宿主免疫系统与靶抗原如外来分子、同种异体细胞或肿瘤细胞反应的能力的组合物。在本文中，刺激“初次”免疫应答指在没有检测到之前反应(例如由于没有接触过靶抗原、对靶点不反应或免疫抑制)的对象中引发特定免疫反应。刺激“再次”应答指在检测到之前反应(例如由于天然免疫、自发免疫或用一种或几种组合物或方法治疗过)的个体中再次启动、提高或维持反应性。
“治疗”应包括治疗性和预防性治疗。
“载体”指由(例如)质粒、噬菌体或植物病毒产生，可向其中插入或克隆核酸序列的核酸分子，优选DNA分子。载体优选含有一种或多种独特的限制性位点，并能够在确定的宿主细胞(包括靶细胞或组织或者其祖细胞或组织)中自主复制，或能与确定宿主的基因组整合，以便复制克隆的序列。因此，载体可以是自主复制性载体，即以染色体外部分的形式存在的载体，其复制不依赖染色体复制，如线性或闭环质粒、染色体外元件、小染色体或人造染色体。载体可含有保证自身复制的任何元件。或者，载体可以是引入宿主细胞时能整合到基因组中并与所整合的染色体一起复制的载体。载体系统可包含一种载体或质粒、两种或多种载体或质粒，它们一起含有准备引入宿主细胞基因组的总DNA或转座子。载体的选择一般取决于载体与准备引入该载体的宿主细胞的相容性。载体也可包含可用于选择合适的转化子的选择性标记，如抗生素抗性基因。这种抗性基因的例子是本领域技术人员熟知的。
2.组合物
本发明至少部分起源于确定在对靶抗原初次应答期间产生的抗原特异性IL-10分泌性CD4+T细胞可损害对象对靶抗原的再次免疫应答，并能阻止幼稚抗原特异性CD8+细胞获得成熟表型(包括细胞毒功能)和分泌IFN-γ的能力。本发明者也确定，在体外或体内暂时中和IL-10能恢复对象在适当免疫后对靶抗原产生CD8+IFN-γ应答的能力。根据这些观察结果，本发明者提出，可用含有IL-10功能抑制剂和能刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激物的组合物实现更有效的初次或再次免疫应答，其维持对象增强或维持对靶抗原的免疫应答的能力。
2.1IL-10功能抑制剂
IL-10功能抑制剂包括与IL-10或其受体直接或间接地结合或物理连接，并适当地阻断、抑制或对抗其功能或活性(如与白细胞，尤其是淋巴细胞，特别是T淋巴细胞上存在的一种或多种表面分子(如受体)结合或相互作用)中的至少一种的任何分子或化合物。结合或连接可涉及诱导的磁场或顺磁场的形成、共价键形成、离子相互作用如离子晶格中发生的离子相互作用、氢键或者范德华力相互作用如偶极-偶极相互作用、偶极-诱导的偶极相互作用，诱导的偶极-诱导的偶极相互作用或互斥作用，或者上述吸引力的任何组合。在某些实施方式中，IL-10功能抑制剂是能与IL-10的至少一部分发生免疫反应的抗原结合分子。在这些实施方式中，抗原结合分子可与IL-10的活性或失活形式发生免疫反应，不同之处在于活性细胞因子的抗原结合分子更可能识别仅以活性构象存在的表位。说明性抗原结合分子和其生产方法参见美国专利5,837,232；5,837,293和6,239,260。
在其它实施方式中，IL-10功能抑制剂是能够特异性阻止IL-10的细胞受体活化的任何分子。例如，这种抑制剂可以是能与IL-10受体发生免疫反应的抗原结合分子，其代表性例子参见美国专利号5,863,796。或者，此种类型的抑制剂可选自：可溶性或缺陷型IL-10受体或可溶性IL-10受体亚基。此种类型的代表性受体参见例如：美国专利5,843,697和6,423,500，美国专利申请公开号20040204351和20050064464，Tan等(1995，J.Biol.Chem.270：12906)和GenBank登录号U00672或NM_001558。在其它实施方式中，IL-10功能抑制剂是在细胞(如细菌细胞)表面上表达的IL-10受体，如美国专利申请公开号20020019043所述。
在一些实施方式中，IL-10功能抑制剂是抑制IL-10基因表达或其表达产物的功能活性的核酸。在此种类型的说明性例子中，该抑制剂能降低或消除IL-10基因表达，包括但不限于用于抑制刺激IL-10信号传导途径信使RNA的翻译的寡核糖核苷酸序列(包括反义RNA和DNA分子)以及核酶。反义RNA和DNA分子用于通过结合于靶mRNA、阻止蛋白质翻译而直接阻断mRNA的翻译。在反义DNA的情况下，优选衍生自翻译起始位点如-10和+10之间区域的寡脱氧核糖核苷酸。对IL-10基因和其转录物具有特异性的说明性反义寡核苷酸参见美国专利号6,184,372。或者，介导靶基因或基因转录物的RNA干扰(RNAi)的RNA分子可用于减少或消除基因表达。RNAi指通过引入与靶基因转录物同源的单链、一般是双链的RNA(dsRNA)，干扰或破坏靶基因的产物。因此，在一些实施方式中，对应于IL-10基因的至少一部分的dsRNA本身，特别是产生dsRNA的构建物可用于减少或消除其表达。RNAi-介导的基因表达抑制可用本领域报道的任何技术完成，例如将编码茎环或发夹RNA结构的核酸构建物转染入靶细胞的基因组，或表达转染的与趋同启动子之间的靶基因有同源性的核酸构建物，或从单个启动子后头对头或尾对尾复制。可采用任何相似的构建物，只要它能产生具有向后折叠至其本身和产生dsRNA的能力的单链RNA，或者只要它能产生能退火形成与靶基因有同源性的dsRNA的两条单独的RNA转录物。或者，指导切割其对应的特定mRNA的约为21-23个核苷酸的RNA分子(如Tuschl等的美国专利申请号20020086356所述)可用于介导RNAi。此种21-23nt RNA分子可含有3’羟基，可以是单链或双链(为两条21-23nt RNA)，其中该dsRNA分子可以是钝端或含有突出端(如5’、3’)。
在其它实施方式中，IL-10功能抑制剂是IL-10的小分子调节剂，其说明性例子包括β-alethine、β-丙氨酰牛磺酸、苄氧羰基β-丙氨酰牛磺酸以及属于美国专利号6,451,853所述化合物的各种其它氨基硫醇和氨基磷酸酯，以及如美国专利号6,723,736所述的取代的异喹啉、异二氢色原酮和异二氢苯并噻喃酮(isothiochromanone)。
IL-10功能抑制剂最好对宿主无毒，并且副作用很小或可忽略不计。
2.2免疫调节剂
2.2.1抗原
本发明考虑将对应于对感兴趣的靶抗原的至少一部分的任意抗原用于本发明的组合物中，用于刺激针对该靶抗原的免疫应答。这种抗原可以是可溶形式(如肽、多肽或可由其表达肽或多肽的核酸分子)或者是全细胞或减毒病原体制剂的形式(如减毒的病毒或细菌)，或者可用下面进一步详述的抗原递呈细胞递呈这种抗原。
用于本发明的靶抗原一般是蛋白性分子，其代表性例子包括多肽和肽。这种分子也可包括例如：非蛋白性部分，例如但不限于简单的中间代谢物、糖、脂质和激素，以及大分子如复合糖、磷脂和核酸。靶抗原可选自：宿主产生的内源性抗原或宿主以外的外源性抗原。合适的内源性抗原包括但不限于：癌或肿瘤抗原。癌或肿瘤抗原的非限制性例子包括来自癌或肿瘤的抗原，所述癌或肿瘤选自ABL1原癌基因、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、腺囊瘤、肾上腺皮质癌、特发性髓样化生、脱发、软组织腺泡状肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调-毛细管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳腺癌、CNS肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、儿童脑瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤纤维肉瘤隆起、结缔组织增生性小圆细胞瘤、导管癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、肝外胆道癌、眼癌、眼睛：黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠-类癌瘤、泌尿生殖器癌、生殖细胞肿瘤、妊娠期-滋养层-疾病、神经胶质瘤、妇科癌症、血液恶性肿瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金病、人乳头瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、下咽部癌症、眼内黑色素瘤、岛细胞癌、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汗斯细胞组织细胞增多病、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、Li-Fraumeni综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、肾的恶性杆状体肿瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口癌、多发性内分泌瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓发育异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生病、鼻癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病、Nijmegen断裂综合征、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周-神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多、前列腺癌、罕见癌症和相关疾病、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、罗-汤二氏综合征、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞-癌(肾-骨盆-/-输尿管)、滋养层癌、尿道癌、泌尿系统癌、uroplakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、肾母细胞瘤。在某些实施方式中，癌症或肿瘤涉及黑色素瘤。黑色素瘤相关抗原的说明性例子包括黑色素细胞分化抗原(如gp100、MART、Melan-A/MART-1、TRP-1、Tyros、TRP2、MC1R、MUC1F、MUC1R或其组合)和黑色素瘤-特异性抗原(如BAGE、GAGE-1、gp100In4、MAGE-1(如GenBank登录号X541 56和AA494311)、MAGE-3、MAGE4、PRAME、TRP2IN2、NYNSO1a、NYNSO1b、LAGE1、p97黑色素瘤抗原(如GenBank登录号M12154)、p5蛋白、gp75、癌胚(oncofetal)抗原、GM2和GD2神经节苷脂、cdc27、p21ras、gp100Pmell17或其组合。其它肿瘤特异性抗原包括但不限于：etv6、aml1、亲环蛋白b(急性淋巴细胞性白血病)；Ig-独特型(B细胞淋巴瘤)；E-钙粘着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白、γ-联蛋白、p120ctn(神经胶质瘤)；p21ras(膀胱癌)；p21ras(胆管癌)；MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2(乳腺癌)；p53、p21ras(宫颈癌)；p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族、Cripto-1蛋白、Pim-1蛋白(结肠癌)；结直肠相关抗原(CRC)-CO17-1A/GA733、APC(结直肠癌症)；癌胚抗原(CEA)(结直肠癌；绒毛膜癌)；亲环蛋白b(上皮细胞癌症)；HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白(胃癌)；甲胎蛋白(肝细胞癌)；Imp-1、EBNA-1(霍奇金淋巴瘤)；CEA、MAGE-3、NY-ESO-1(肺癌)；亲环蛋白b(淋巴细胞衍生的白血病)；MUC家族、p21ras(骨髓瘤)；HER2/neu、c-erbB-2(非小细胞肺癌)；Imp-1、EBNA-1(鼻咽癌)；MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2、MAGE-A4、NY-ESO-1(卵巢癌)；前列腺特异性抗原(PSA)和其抗原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白(前列腺癌)；HER2/neu、c-erbB-2(肾癌)；病毒产物如人乳头瘤病毒蛋白(宫颈和食道的鳞状细胞癌症)；NY-ESO-1(睾丸癌)；和HTLV-1表位(T细胞白血病)。
外来或外源性抗原适合选自致病性生物体的抗原。示范性致病性生物体包括但不限于：病毒、细菌、真菌、寄生物、藻类以及原生动物和变形虫。说明性病毒包括产生某些疾病的病毒，这些疾病和病毒包括但不限于：麻疹、腮腺炎、风疹、脊髓灰质炎、甲型肝炎、乙型肝炎(如GenBank登录号E02707)、丙型肝炎(如GenBank登录号E06890)、以及其它肝炎病毒、流感、腺病毒(如4和7型)、狂犬病(如GenBank登录号M34678)、黄热病毒、EB病毒和其它疱疹病毒如乳头瘤病毒、艾波拉病毒、流感病毒、日本脑炎(如GenBank登录号E07883)、登革热(如GenBank登录号M24444)、汉他病毒、仙台病毒、呼吸道合胞病毒、othromyxovirus、水泡性口膜炎病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、巨细胞病毒和人体免疫缺陷病毒(HIV)(如GenBank登录号U18552)。衍生自这些病毒的任何合适抗原均可用于实施本发明。例如，衍生自HIV的说明性逆转录病毒抗原包括但不限于：抗原如gag、pol和env基因的基因产物、Nef蛋白、逆转录酶和其它HIV组件。肝炎病毒抗原的说明性例子包括但不限于：抗原如乙型肝炎病毒的S、M和L蛋白，乙型肝炎病毒的前S抗原，以及其它肝炎如甲、乙、丙型肝炎的病毒组件如丙型肝炎病毒RNA。流感病毒抗原的说明性例子包括但不限于：抗原如血凝素和神经氨酸酶和其它流感病毒组件。麻疹病毒抗原的说明性例子包括但不限于：抗原如麻疹病毒融合蛋白和其它麻疹病毒组件。风疹病毒抗原的说明性例子包括但不限于：抗原如蛋白E1和E2以及其它风疹病毒组件；轮状病毒抗原如VP7sc和其它轮状病毒组件。巨细胞病毒抗原的说明性例子包括但不限于：抗原如包膜糖蛋白B和其它巨细胞病毒抗原组件。呼吸道合胞病毒抗原的说明性例子包括抗原如RSV融合蛋白、M2蛋白和其它呼吸道合胞病毒抗原组件。单纯疱疹病毒抗原的说明性例子包括但不限于：抗原如立即早期蛋白、糖蛋白D和其它单纯疱疹病毒抗原组件。水痘带状疱疹病毒抗原的非限制性例子包括抗原如9PI、gpII和其它水痘带状疱疹病毒抗原组件。日本脑炎病毒抗原的非限制性例子包括抗原如蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80％E和其它日本脑炎病毒抗原组件。狂犬病病毒抗原的代表性例子包括但不限于：抗原如狂犬病糖蛋白、狂犬病核蛋白和其它狂犬病病毒抗原组件。乳头瘤病毒抗原的说明性例子包括但不限于：L1和L2衣壳蛋白以及与宫颈癌有关的E6/E7抗原，其它病毒抗原的例子请参见Fundamental Virology(基础病毒学)，第二版，Fields，B.N.和Knipe，D.M.编，1991，Raven Press，纽约。
真菌的说明性例子包括枝顶孢(Acremonium spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、蛙粪霉菌(Basidiobolus spp.)、双极霉(Bipolaris spp.)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、念珠菌(Candida spp.)、卡氏支孢瓶霉(Cladophialophora carrionii)、Coccoidiodesimmitis、耳霉(Conidiobolus spp.)、隐球菌(Cryptococcus spp.)、弯孢菌(Curvularia spp.)、表皮癣菌(Epidermophyton spp.)、甄氏外瓶霉(Exophiala jeanselmei)、突脐蠕孢菌(Exserohilum spp.)、紧密着色真菌(Fonsecaea compacta)、裴氏着色真菌(Fonsecaeapedrosoi)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀茵(Fusarium solani)、白地霉(Geotrichum candidum)、荚膜组织胞浆菌荚膜变种(Histoplasma capsulatum var.capsulatum)、荚膜组织胞浆菌杜氏变种(Histoplasma capsulatum var.duboisii)、Hortaeawerneckii、Lacazia loboi、座腔双胞菌(Lasiodiplodia theobromae)、塞内加尔钓端球体(Leptosphaeria senegalensis)、灰色马杜拉分支菌(Madurella grisea)、足马杜拉分枝菌(Madurella mycetomatis)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、小芽胞菌(Microsporumspp.)、罗萨梯新龟甲形菌(Neotestudina rosatii)、Onychocola canadensis、巴西酿母菌(Paracoccidioides brasiliensis)、疣状瓶霉(Phialophora verrucosa)、何德毛结节菌(Piedraia hortae)、Piedra iahortae、花斑癣(Pityriasis versicolor)、Pseudallesheria boydii、罗梅罗刺壳孢菌(Pyrenochaeta romeroi)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、小帚样霉菌(Scopulariopsis brevicaulis)、双间柱顶孢(Scytalidium dimidiatum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、毛癣菌(Trichophyton spp.)、毛孢子菌(Trichosporon spp.)、接合菌(Zygomcete)、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)和少根根霉(Rhizopus arrhizus)。因此，可用于本发明组合物和方法的代表性真菌抗原包括但不限于：念珠菌真菌抗原组件；组织浆菌属真菌抗原如热激蛋白60(HSP60)和其它组织浆菌属真菌抗原组件；隐球菌真菌抗原如荚膜多糖和其它隐球菌真菌抗原组件；球孢子菌真菌抗原如小球体抗原和其它球孢子菌真菌抗原组件；以及癣类真菌抗原如发癣菌素和其它球孢子菌真菌抗原组件。
细菌的说明性例子包括产生疾病的细菌，所述疾病包括但不限于：白喉(如白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae))、百日咳(如百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)，GenBank登录号M35274)、破伤风(如破伤风梭菌(Clostridium tetani)，GenBank登录号M64353)、结核病(如结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、细菌性肺炎(如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、霍乱(如霍乱弧菌(Vibriocholerae))、炭疽(如炭疽杆菌(Bacillus anthracis))、伤寒、鼠疫、志贺菌病(如痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae))、肉毒中毒(如肉毒梭菌(Clostridium botulinum))、沙门菌病(如GenBank登录号L03833)、消化性溃疡(如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、军团病、莱姆病(如GenBank登录号U59487)。其它病原菌包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)。因此，可用于本发明组合物和方法的细菌抗原包括但不限于：百日咳细菌抗原如百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素(pertactin)、F M2、FIM3、腺苷酸环化酶和其它百日咳细菌抗原组件；白喉细菌抗原如白喉毒素或类毒素和其它白喉细菌抗原组件；破伤风细菌抗原如破伤风毒素或类毒素和其它破伤风细菌抗原组件，链球菌细菌抗原如M蛋白和其它链球菌细菌抗原组件；革兰阴性杆菌细菌抗原如脂多糖和其它革兰阴性细菌抗原组件；结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)细菌抗原如分枝菌酸、热激蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白、抗原85A和其它分枝杆菌抗原组件；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)细菌抗原组件，肺炎球菌细菌抗原如肺炎链球菌溶血素、肺炎球菌荚膜多糖和其它肺炎球菌细菌抗原组件；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenz)细菌抗原如荚膜多糖和其它流感嗜血杆菌细菌抗原组件；炭疽细菌抗原如炭疽保护抗原和其它炭疽细菌抗原组件；立克次体细菌抗原如rompA和其它立克次体细菌抗原组件。本文所述细菌抗原也包括任何其它细菌、分枝杆菌、支原体、立克次体或衣原体抗原。
原生动物的说明性例子包括产生疾病的原生动物，包括但不限于：疟原虫(如GenBank登录号X53832)、钩虫、盘尾丝虫(如GenBank登录号M27807)、血吸虫(如GenBank登录号LOS 198)、弓形体、锥虫、利什曼原虫、贾第鞭毛虫(GenBank登录号M33641)、阿米巴、丝虫(如GenBank登录号J03266)、疏螺旋体(borreliosis)和旋毛虫。因此，可用于本发明组合物和方法的原生动物抗原包括但不限于：恶性疟原虫(plasmodium falciparum)抗原如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环孢子体抗原、配子母细胞/配子表面抗原、血液期抗原pf 155/RESA和其它疟原虫抗原组件；弓形体抗原如SAG-1、p30和其它弓形体抗原组件；血吸虫抗原如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白和其它血吸虫抗原组件；硕大利什曼原虫和其它利什曼原虫抗原如gp63、脂磷酸聚糖及其相关蛋白和其它利什曼原虫抗原组件；以及克氏锥虫(trypanosoma cruzi)抗原如75-77kDa抗原、56kDa抗原和其它锥虫抗原组件。
本发明也考虑将毒素组件用作抗原，其说明性例子包括葡萄球菌肠毒素、中毒性休克综合征毒素；逆转录病毒抗原(如衍生自HIV的抗原)、链球菌抗原、葡萄球菌肠毒素-A(SEA)、葡萄球菌肠毒素-B(SEB)、葡萄球菌肠毒素-3(SE1-3)、葡萄球菌肠毒素-D(SED)、葡萄球菌肠毒素-E(SEE)以及衍生自支原体、分支杆菌和疱疹病毒的毒素。
对应于靶抗原的至少一部分的抗原可从天然来源分离，或可用本领域已知的重组技术制备。例如，可由需要调节免疫应答的细胞群或组织获得的抗原递呈细胞的MHC和其它递呈分子洗脱肽抗原。可采用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化洗脱的肽(Rawson等，2000，Cancer Res 60(16)，4493-4498)。如果需要，可对纯化的肽进行测序，并用如下所述的标准蛋白质合成技术生产合成的肽。或者，可通过分离需要调节免疫应答的细胞群或组织的样品，接着裂解该样品或使该样品处于导致形成凋亡细胞的条件下(如紫外线或γ射线辐射、病毒感染、细胞因子或通过耗尽细胞培养基中的细胞营养、与过氧化氢培育、或者与药物如地塞米松、神经酰胺化疗药和抗-激素药如醋酸亮丙瑞林(Lurpon)或他莫昔芬(Tamoxifen)培育)，来产生粗抗原制剂。接着，裂解物或凋亡细胞可用作的粗抗原的来源，以可溶形式使用或与抗原递呈细胞接触，下面作进一步详述。
当抗原已知时，可用下述标准方法方便地制备重组形式的抗原：Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL)(Cold Spring Harbor Press，1989)，具体是第16和17章；Ausubel等，《新编分子生物学方法》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(JohnWiley&Sons，Inc.1994-1998)，具体是第10和16章；以及Coligan等，《新编蛋白质科学方法》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)(John Wiley&Sons，Inc.1995-1997)，具体是第1、5和6章。一般地，可用包括以下步骤的方法制备抗原：(a)提供可由其表达靶抗原或其类似物或模拟物的表达载体；(b)将载体引入合适的宿主细胞；(c)培养该宿主细胞，以由该载体表达重组多肽；和(d)分离该重组多肽。
通常，该表达载体含有操作性连接于调节性多核苷酸的的编码抗原的多核苷酸。可从编码对应于感兴趣靶抗原的抗原的任何合适母体多核苷酸构建编码抗原的多核苷酸。母体多核苷酸适合为天然基因或其部分。然而，母体多核苷酸可能不是天然产生的，而是用重组技术工程改造的。调节性多核苷酸适合包含转录和/或翻译控制序列，它们通常是适合用于表达编码抗原的多核苷酸的宿主细胞的序列。一般地，该转录和翻译调节控制序列包括但不限于：启动子序列、5’非编码区、顺式调节区如转录调节蛋白或翻译调节蛋白的功能结合位点、上游开放阅读框、转录起始位点、翻译起始位点和/或编码前导序列的核苷酸序列、终止密码子、翻译终止位点和3’非翻译区。本发明也考虑本领域已知的组成型或诱导型启动子。这类启动子可以是天然产生的启动子，或者是组合了一种以上启动子元件的杂合启动子。本发明考虑的启动子序列可能是准备引入的宿主细胞的天然序列，或者可能衍生自另一来源，只要该区域在该宿主细胞中有功能。
表达载体也可包含3’非翻译序列，该序列通常指包含含有聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号的DNA节段的基因部分。聚腺苷酸化信号的特征是能影响聚腺苷酸束加到mRNA前体的3’端。通常通过与规范形式5’AATAAA-3’有同源性来识别聚腺苷酸化信号，但也不是没有变化。3’非翻译调节性DNA序列一般包含约50-1,000个核苷酸碱基对，并且除聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号外，还可含有转录和翻译终止序列。
在某些实施方式中，表达载体还含有选择性标记基因，以便选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域熟知的，随所用宿主细胞而变。
该表达载体也可含有融合伙伴(一般由表达载体提供)，以便该重组多肽与该融合伙伴表达成融合多肽。融合伙伴的主要优点是它们有利于鉴定和/或纯化所述融合多肽。融合伙伴的熟知例子包括但不限于：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六组氨酸(HIS6)，它们尤其可用于用亲和色谱分离融合多肽。出于用亲和色谱纯化融合多肽的目的，亲和色谱的相关基质分别是谷胱甘肽-、直链淀粉-和镍-或钴-偶联树脂。许多这种基质可以“试剂盒”形式获得，如与(HIS6)融合伙伴一起使用的QIAexpressTM系统(Qiagen)和Pharmacia GST纯化系统。优选地，融合伙伴也含有蛋白酶切割位点，如因子Xa或凝血酶的切割位点，它能使相关蛋白酶部分消化本发明的融合多肽，从而由其释放本发明的重组多肽。接着，可用后续的色谱分离法从融合伙伴分离释放的多肽。融合伙伴的范围内也包含“表位标签”，它通常是可获得其特异性抗体的短肽序列。不难获得其特异性单克隆抗体的表位标签的熟知例子包括c-Myc、流感病毒血凝素和FLAG标签。
将表达载体引入宿主细胞的步骤可通过包括转染、转导病毒载体和转化的任何合适方法实现，所述病毒载体包括腺病毒、修饰的慢病毒和其它逆转录病毒载体，所述方法的选择取决于所用的宿主细胞。这些方法是本领域技术人员熟知的。
可以在适合蛋白质表达的条件下培养用表达载体转化了的宿主细胞，从而产生重组多肽，所述条件取决于选择的表达载体和宿主细胞。本领域技术人员通过常规实验易于确定该条件。适合表达的宿主细胞可以是原核或真核细胞。用于表达本发明多肽的一种优选的宿主细胞是细菌。所用细菌可以是大肠杆菌(Escherichia coli)。或者，所述宿主细胞可以是昆虫细胞，如可与杆状病毒表达系统一起使用的SF9细胞。在一些实施方式中，与IL-10功能抑制剂一起给药的抗原是可表达该抗原的构建物或载体的形式。
或者，可按照(例如)Atherton和Sheppard(《固相肽合成：实践方法》(Solid PhasePeptode Synthesis：A Practical Approach)，IRL Press，Oxford University Press，Oxford，英国，1989)或Roberge等(1995，Science 269：202)所述的方法，用溶液合成或固相合成方法来合成抗原。合成抗原的氨基酸可以是非天然产生的或天然产生的氨基酸。肽合成过程中非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于：采用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本发明考虑的非天然氨基酸的列表见表B。
表B
    非常规氨基酸     非常规氨基酸
    α-氨基丁酸α-氨基-α-甲基丁酸氨基环丙烷-羧酸氨基异丁酸氨基降冰片基-羧酸环己基丙氨酸环戊基丙氨酸L-N-甲基异亮氨酸D-丙氨酸D-精氨酸D-天冬氨酸D-半胱氨酸D-谷氨酸盐D-谷氨酸D-组氨酸D-异亮氨酸D-亮氨酸D-赖氨酸D-甲硫氨酸D-鸟氨酸D-苯丙氨酸D-脯氨酸D-丝氨酸D-苏氨酸D-色氨酸D-酪氨酸D-缬氨酸D-α-甲基丙氨酸D-α-甲基精氨酸D-α-甲基天冬酰胺D-α-甲基天冬氨酸D-α-甲基半胱氨酸D-α-甲基谷胺酰胺D-α-甲基组氨酸D-α-甲基异亮氨酸D-α-甲基亮氨酸     L-N-甲基丙氨酸L-N-甲基精氨酸L-N-甲基天冬酰胺L-N-甲基天冬氨酸L-N-甲基半胱氨酸L-N-甲基谷胺酰胺L-N-甲基谷氨酸L-N-甲基组氨酸L-N-甲基亮氨酸L-N-甲基赖氨酸L-N-甲基甲硫氨酸L-N-甲基正亮氨酸L-N-甲基正缬氨酸L-N-甲基鸟氨酸L-N-甲基苯丙氨酸L-N-甲基脯氨酸L-N-甲基丝氨酸(L-N-medlylserine)L-N-甲基苏氨酸L-N-甲基色氨酸L-N-甲基酪氨酸L-N-甲基缬氨酸L-N-甲基乙基甘氨酸L-N-甲基-叔丁基甘氨酸L-正亮氨酸L-正缬氨酸α-甲基-氨基异丁酸α-甲基-γ-氨基丁酸α-甲基环己基丙氨酸α-甲基环戊基丙氨酸α-甲基-α-萘基丙氨酸α-甲基青霉胺N-(4-氨基丁基)甘氨酸N-(2-氨基乙基)甘氨酸N-(3-氨基丙基)甘氨酸N-氨基-α-甲基丁酸α-萘基丙氨酸
    非常规氨基酸     非常规氨基酸
    D-α-甲基赖氨酸D-α-甲基甲硫氨酸D-α-甲基鸟氨酸D-α-甲基苯丙氨酸D-α-甲基脯氨酸D-α-甲基丝氨酸D-α-甲基苏氨酸D-α-甲基色氨酸D-α-甲基酪氨酸L-α-甲基亮氨酸L-α-甲基甲硫氨酸L-α-甲基正缬氨酸(methylnorvatine)L-α-甲基苯丙氨酸L-α-甲基丝氨酸L-α-甲基色氨酸L-α-甲基缬氨酸N-(N-(2，2-二苯基乙基氨基甲酰甲基)甘氨酸1-羧基-1-(2，2-二苯基-乙基氨基)环丙烷     N-苄基甘氨酸N-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸(N-(2-carbamylediyl)glycine)N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸N-(2-羧基乙基)甘氨酸N-(羧甲基)甘氨酸N-环丁基甘氨酸N-环庚基甘氨酸N-环己基甘氨酸N-环癸基甘氨酸L-α-甲基赖氨酸L-α-甲基正亮氨酸L-α-甲基鸟氨酸L-α-甲基脯氨酸L-α-甲基苏氨酸L-α-甲基酪氨酸L-N-甲基高苯丙氨酸N-(N-(3，3-二苯基丙基氨基甲酰甲基)甘氨酸
本发明也考虑了用普通分子生物学技术修饰肽抗原，以便改变其对蛋白水解降解的耐受性或优化其溶解特性或使它们更适合用作免疫原性物质。
肽抗原可以是可用于刺激或抑制对感兴趣靶抗原的免疫应答的任何合适大小。许多因素可影响肽大小的选择。例如，可选择肽大小，以使其包含或对应于T细胞表位和/或B细胞表位的大小，并满足其加工需要。本领域技术人员了解，I类-限制性T细胞表位的长度一般为8-10个氨基酸残基，如果置于非天然侧接残基旁边，此表位通常需要2-3个天然侧接氨基酸残基，以保证它们能被有效地加工和递呈。II类-限制性T细胞表位的长度通常为12-25个氨基酸残基，可能不需要天然侧接残基就能进行有效的蛋白水解加工，虽然认为天然侧接残基可起到一定作用。II类-限制性表位的另一个重要特征是它们的中部通常含有9-10个氨基酸残基的核心，该核心特异性结合于II类MHC分子，此核心任一侧的侧接序列通过以序列非依赖性方式与II类MHC抗原任一侧的保守结构结合而稳定该结合。因此，II类-限制性表位的功能区的长度一般短于约15个氨基酸残基。线性B细胞表位的大小和影响其加工的因素如II类-限制性表位的变化相当大，虽然这种表位的大小常常小于15个氨基酸残基。综上所述，肽大小宜(但不一定)为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30个氨基酸残基。适当地，肽大小不大于约500、200、100、80、60、50、40个氨基酸残基。在某些优选实施方式中，肽大小足以由抗原递呈细胞递呈肽中所含的T细胞和/或B细胞表位。
本领域已知鉴定和选择有效的抗原性肽的标准(如能够引发免疫应答的最小肽序列)。例如，Apostolopoulos等(2000，Curr.Opin.Mol.Ther.2：29-36)讨论了根据对抗原递呈分子的三维结构和它与抗原性肽和T细胞受体的相互作用的了解鉴定最小抗原性肽序列的方案。Shastri(1996，Curr.Opin.Immunol.8：271-277)公开了如何从通常结合于MHC分子的数千种肽中区分用于激活T细胞的罕见肽。
在一些实施方式中，以合成构建物(或含有操作性连接于调节性多核苷酸的编码该抗原的多核苷酸的表达载体)的形式递送抗原。合适地，调节性多核苷酸含有转录和/或翻译控制序列，这些序列与在感兴趣的细胞或组织类型中的表达相容。一般地，转录和翻译调节控制序列包括但不限于：启动子序列、5’非编码区、顺式调节区如转录调节蛋白或翻译调节蛋白的功能性结合位点、上游开放阅读框、核糖体结合序列、转录起始位点、翻译起始位点、和/或编码前导序列的核苷酸序列、终止密码子、翻译终止位点和3’非翻译区。本发明也考虑本领域已知的组成型或诱导型启动子。该启动子可以是天然产生的启动子，或者是组合了一种以上启动子元件的杂合启动子。本发明考虑的启动子序列可能是感兴趣生物体的天然序列，或者可能衍生自另一来源，只要该区域在所选生物体中有功能。启动子的选择取决于所用宿主。例如，可用于在哺乳动物细胞中表达的启动子通常包括金属硫蛋白启动子(可响应于重金属如镉而被诱导)、β-肌动蛋白启动子以及病毒启动子如SV40大T抗原启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子、劳氏肉瘤病毒LTR启动子、腺病毒启动子或HPV启动子，尤其是，也可采用HPV上游调节区(URR)。本领域详细描述了所有这些启动子，它们不难获得。或者，启动子可以是谱系特异性启动子，在这种情况下，特别需要上皮特异性启动子，例如但不限于以下基因的启动子：1型谷氨酰胺转移酶、外皮蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)、SPR基因和聚丝蛋白(filagrin)以及角蛋白基因(如K10、K14、K5、K1)。
合成构建物也可含有3’非翻译序列。3’非翻译序列指包含含有聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号的DNA节段的基因部分。聚腺苷酸化信号的特征是能影响聚腺苷酸束加到mRNA前体的3’端。通常通过与规范形式5’AATAAA-3’有同源性来识别聚腺苷酸化信号，但也不是没有变化。3’非翻译调节性DNA序列一般包含约50-1,000个核苷酸碱基对，并且除聚腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号外，还可含有转录和翻译终止序列。
在一些实施方式中，合成构建物还含有可筛选标记基因，以便鉴定含有该合成构建物的细胞。可筛选基因(如lacZ、gfp等)是本领域熟知的，并且与在特定细胞或组织类型中表达相容。
然而应理解，目前已熟知在异源系统中表达编码蛋白质的多核苷酸，本发明不涉及或依赖于任何特定载体、转录控制序列或其生产技术。相反，可将按照本文所述方法制备的合成多核苷酸以任何合适方式与任何合适的合成构建物或载体一起引入所选细胞或组织，或引入其前体或祖细胞，且可用已知启动子以任何常规方式表达该合成多核苷酸。
可用多种非病毒或病毒基因递送载体中的任一种将该合成构建物引入合适的宿主细胞中以进行表达。例如，逆转录病毒(具体说是慢病毒载体)为基因递送系统提供了方便的平台。可用本领域已知技术将感兴趣编码序列(如用于基因治疗应用的序列)插入基因递送载体中，并包装到逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒，并经体内或离体递送至对象的细胞中。
在一个说明性实施方式中，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便和有效的平台。可用本领域已知技术将编码对应于靶抗原的抗原的所选核苷酸序列插入载体中，并包装到逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒，并递送给对象。已经描述了几种说明性逆转录病毒系统，其例子包括：美国专利号5,219,740；Miller和Rosman，1989，Bio Techniques 7：980-990；Miller，A.D.，1990，Human Gene Therapy1：5-14；Scarpa等，1991，Virology 180：849-852；Burns等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037；和Boris-Lawrie和Temin，1993，Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109)。
此外，也描述了几种说明性的基于腺病毒的系统。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒保持在染色体外，从而最大程度降低了与插入诱变相关的风险(参见例如，Haj-Ahmad和Graham，1986，J.Virol.57：267-274；Bett等，1993，J.Virol.67：5911-5921；Mittereder等，1994，Human Gene Therapy 5：717-729；Seth等，1994，J.Virol.68：933-940，；Barr等，1994，Gene Therapy 1：51-58；Berkner，K.L.，1988，Bio Techniques 6：616-629；和Rich等，1993，Human GeneTherapy 4：461-476)。
已经开发了多种用于递送多核苷酸的腺伴随病毒(AAV)载体系统。不难用本领域熟知技术构建AAV载体。参见例如，美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公开号WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski等，1988，Molec.Cell Biol.8：3988-3996；Vincent等，1990，Vaccine 90，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Carter，B.J.，1992，Current Opinion in Biotechnology 3：533-539；Muzyczka，N.，1992，Current Topics in Microbiol.andImmunol.158：97-129；Kotin，R.M.，1994，Human Gene Therapy 5：793-801；Shelling和Smith，1994，Gene Therapy 1：165-169；和Zhou等，1994，J.Exp.Med.179：1867-1875。
用于通过基因转移递送编码抗原的多核苷酸的其它病毒载体包括衍生自痘病毒家族如牛痘病毒和禽痘病毒的载体。例如，可按照如下方法构建表达编码抗原的多核苷酸的牛痘病毒重组物。首先将编码多肽的DNA插入合适的载体中，使其与牛痘启动子相邻并侧接于牛痘DNA序列，如编码胸苷激酶(TK)的序列。接着，用此载体转染细胞，该细胞同时也被牛痘感染。用同源重组将牛痘启动子和编码感兴趣多肽的基因插入病毒基因组中。通过在5-BrdU存在下培养细胞并挑选出对其产生抗性的病毒斑，选择得到的TK(-)重组体。
或者，也可采用禽痘病毒如鸡痘和金丝雀痘(canarypox)病毒递送感兴趣的编码序列。人和其它哺乳动物中使用禽痘载体是特别有利的，因为禽痘属的成员仅能在易感性禽类物种中生产性复制，因此对哺乳动物细胞无感染性。本领域已知采用遗传重组产生重组禽痘病毒的方法，参见上述牛痘病毒的生产。参见例如，WO91/12882；WO 89/03429；和WO 92/03545。
也可采用许多α病毒载体递送本发明的多核苷酸组合物，如美国专利号5,843,723；6,015,686；6,008,035和6,015,694所述的载体。也可采用某些基于委内瑞拉马脑炎(VEE)的载体，其说明性例子参见美国专利号5,505,947和5,643,576。
而且，本发明也可采用分子偶联物载体如腺病毒嵌合载体(如Michael等，J.Biol.Chem.268：6866-69，1993；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6099-6103，1992所述)进行基因递送。
在其它说明性实施方式中，采用慢病毒载体将编码抗原的多核苷酸递送到所选细胞或组织中。一般地，这些载体含有5’慢病毒LTR、tRNA结合位点、包装信号、操作性连接于感兴趣的一种或多种基因的启动子、第二条链DNA合成的起点和3’慢病毒LTR，其中所述慢病毒载体含有核运输元件。核运输元件可位于感兴趣编码序列(例如，本发明的合成Gag或Env表达盒)的上游(5’)或下游(3’)。本发明可利用各种慢病毒，包括例如，选自下组的慢病毒：HIV、HIV-1、HIV-2、FIV、BIV、EIAV、MVV、CAEV和SIV。慢病毒载体的说明性例子参见PCT公开号WO 00/66759、WO00/00600、WO 99/24465、WO 98/51810、WO 99/51754、WO 99/31251、WO 99/30742和WO 99/15641。宜采用第三代SIN慢病毒。第三代SIN(自身失活性)慢病毒的供应商包括Invitrogen(ViraPower慢病毒表达系统)。慢病毒载体的构建、转染、收获和使用的详细方法参见例如Invitrogen技术手册“ViraPower慢病毒表达系统，版本号B050102 25-0501”，获自http://www.invitrogen.com/Content/Tech-Online/molecular_biology/manuals_p-ps/virapower_lentiviral_system_man.pdf。慢病毒载体已经成为基因转移的有效方法。生物安全特征的提高已使得这些载体适合以生物安全水平2(BL2)使用。将许多安全性特征掺入第三代SIN(自身失活)载体中。缺失病毒3’LTR U3区产生了不能转录全长病毒RNA的前病毒。此外，以反式提供许多必需基因，产生能够感染和整合仅一轮的病毒母液。慢病毒载体具有以下优点，包括：1)用兼向性包膜蛋白假型化该载体使它们基本上能够感染任何细胞类型；2)可将基因递送给静息、有丝分裂后、分化细胞，包括神经元；3)其低细胞毒性在转基因递送系统中独树一帜；4)病毒整合到基因组中允许进行长期转基因表达；5)其包装容量(6-14kb)比其它逆转录病毒或腺伴随病毒载体大得多。最近对此系统的容量的研究显示，用表达GFP的慢病毒载体感染鼠干细胞，产生活后代、种系传递以及报道物的启动子-和组织-特异性表达(Ailles，L.E.和Naldini，L.，HIV-1-产生的慢病毒载体(HIV-1-Derived Lentivirus Vectors)，Trono，D.(编)，慢病毒载体(Lentivirus Vector)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，纽约，2002，第31-52页)。当代载体的例子参见Lois等的综述(Lois，C.，Hong，E.J.，Pease，S.，Brown，E.J.和Baltimore，D.，“慢病毒载体递送的转基因的种系传递和组织特异性表达”(Germline transmission andtissue specific expression of transgenes delivered by lentivirus vectors)，Science，295(2002)868-872)的图2。
在某些实施方式中，多核苷酸可整合到靶细胞的基因组中。这种整合可能通过同源重组在特定位置和取向上发生(基因置换)，或者可能随机整合到非特定的位置上(基因增加)。在其它实施方式中，多核苷酸在细胞中可以作为独立的DNA附加节段稳定地维持。这种多核苷酸节段或“附加体”编码足以独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步维持和复制的序列。表达构建物递送给细胞的方式和多核苷酸在细胞中保留的位置取决于所用表达构建物的类型。
在其它实施方式中，以“裸”DNA的形式给予/递送多核苷酸，如Ulmer等，Science 259：1745-49，1993和Cohen的综述，Science 259：1691-92，1993所述。可通过将DNA包被在能有效运输到细胞中的可生物降解的珠上增加裸DNA的摄取。
在其它实施方式中，本发明组合物可通过粒子轰击方法递送，已经描述了许多这种方法。在一个说明性实施例中，可采用诸如Powderject PharmaceuticalsPLC(Oxford，英国)和Powderject Vaccine Inc.(威斯康星州麦迪逊)生产的装置实现气体驱动的颗粒加速，一些例子参见美国专利号5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；和欧洲专利号0500 799。这种方法提供了一种无针递送方法，其中用手持式装置产生的氦气喷气将微观颗粒如多核苷酸或多肽颗粒的干粉制剂加速至高速，将所述颗粒推进到感兴趣的靶组织中。
在相关实施方式中，可用于以气体驱动的无针注射给予本发明组合物的其它装置和方法包括Bioject，Inc.(Portland，Oreg.)提供的装置和方法，一些例子参见美国专利号4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412。
2.2.2免疫调节细胞实施方式
抗原递呈细胞
本发明也考虑了将能递呈对应于靶抗原至少一部分的抗原的抗原递呈细胞用于本发明组合物。这种抗原递呈细胞包括专性或兼性抗原递呈细胞。专性抗原递呈细胞的生理学功能是以能被特定T细胞受体识别的形式递呈抗原，以便刺激或麻痹T淋巴细胞或B淋巴细胞介导的免疫应答。专性抗原递呈细胞不仅通过主要组织相容性复合物(MHC)加工和递呈抗原，而且还加工完成T细胞激活或诱导致耐受性应答所需的其它免疫调节分子。专性抗原递呈细胞包括但不限于：巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、髓样谱系细胞包括单核细胞-粒细胞-DC前体、边缘区肝巨噬细胞、小神经胶质细胞、T细胞、朗格汗斯细胞和树突细胞包括联锁状树突细胞和滤泡状树突细胞。非专性或兼性抗原递呈细胞一般缺少完成T淋巴细胞激活或麻痹所需的一种或多种免疫调节分子。非专性或兼性抗原递呈细胞的例子包括但不限于：活化的T淋巴细胞、嗜曙红细胞、角质形成细胞、星形胶质细胞、滤泡细胞、小神经胶质细胞、胸腺皮层细胞、内皮细胞、施旺细胞、视网膜色素上皮细胞、成肌细胞、血管平滑肌细胞、软骨细胞、肠细胞、胸腺细胞、肾小管细胞和成纤维细胞。在一些实施方式中，抗原递呈细胞选自单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、髓样谱系细胞、树突细胞或朗格汗斯细胞。在某些优选实施方式中，抗原递呈细胞表达CD11c并包括树突细胞。
可按照本领域技术人员已知的任何合适方法制备用于刺激对一种抗原或一组抗原的免疫应答的抗原递呈细胞。制备用于刺激抗原-特异性免疫应答的抗原递呈细胞的说明性方法参见Albert等(国际公开WO 99/42564)、Takamizawa等(1997，J.Immunol，158(5)：2134-2142)、Thomas和Lipsky(1994，J Immunol，153(9)：4016-4028)、O’Doherty等(1994，Immunology，82(3)：487-93)、Fearnley等(1997，Blood，89(10)：3708-3716)、Weissman等(1995，Proc Natl Acad Sci USA，92(3)：826-830)、Freudenthal和Steinman(1990，Proc Natl Acad Sci USA，87(19)：7698-7702)、Romani等(1996，JImmunol Methods，196(2)：137-151)、Reddy等(1997，Blood，90(9)：3640-3646)、Thurnher等(1997，Exp Hematol，25(3)：232-237)、Caux等(1996，J Exp Med，184(2)：695-706；1996，Blood，87(6)：2376-85)、Luft等(1998，Exp Hematol，26(6)：489-500；1998，JImmunol，161(4)：1947-1953)、Cella等(1999，J Exp Med，189(5)：821-829；1997，Nature，388(644)：782-787；1996，J Exp Med，184(2)：747-572)、Ahonen等(1999，Cell Immunol，197(1)：62-72)和Piemonti等(1999，J Immunol，162(11)：6473-6481)。
在一些实施方式中，从宿主分离抗原递呈细胞，处理，然后再引入或再输注给宿主。可通过手术切除、活检、采血或其它合适技术方便地从宿主获得抗原递呈细胞。这种细胞在本文中称为“自体”细胞。在其它实施方式中，从不同于宿主的来源制备和/或培养抗原递呈细胞或细胞系。这种细胞在本文中称为“同种异体”细胞。同种异体抗原递呈细胞或细胞系宜与潜在接受者共享主要和/或次要组织相容性抗原(本文中也称为‘一般’抗原递呈细胞或细胞系)。在此类型的某些优选实施方式中，一般抗原递呈细胞或细胞系含有易感或易患具体疾病的大部分(即至少10、20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、92、94或98％)群体中相容的主要组织相容性(MHC)I类抗原。适当地，一般抗原递呈细胞或细胞系在天然情况下表达本文所述的免疫刺激分子，尤其是免疫刺激性膜分子，其表达水平足以在所需宿主中引发免疫应答，宜为T淋巴细胞免疫应答(如细胞毒性T淋巴细胞免疫应答)。在某些实施方式中，如国际公开号WO 01/88097所述，抗原递呈细胞或细胞系非常易受至少一种IFN处理的影响(即表明高水平表达I类HLA)。
在一些实施方式中，用包括下述步骤的方法使所述抗原递呈细胞有抗原特异性：以足以允许该抗原被抗原递呈细胞内化的条件和时间用对应于靶抗原的至少一部分的抗原接触或‘脉冲’该抗原递呈细胞；以足以使抗原被加工用于抗原递呈细胞递呈的时间和条件如此接触着培养该抗原递呈细胞。然后，脉冲的细胞可用于在体外或体内刺激自体或同种异体T细胞。本领域技术人员可凭经验确定与抗原递呈细胞接触的抗原量。一般地，抗原递呈细胞与抗原一起于37℃培育约1-6小时。通常，对于纯化的抗原和肽来讲，0.1-10μg/mL适合产生抗原特异性抗原递呈细胞。抗原应接触抗原递呈细胞足够时间，以使这些细胞内化这些抗原。可用脉冲-追踪方案确定使细胞内化并递呈加工的抗原所需的时间和抗原剂量，其中接触抗原后接洗涤，并接触读出系统如抗原反应性T细胞。一旦确定了在细胞表面上表达加工抗原所需的最优时间和剂量后，可采用一种方案制备用于诱导致耐受性应答的细胞和抗原。本领域技术人员应了解，抗原递呈细胞递呈抗原所需的时间可能取决于所用抗原或抗原形式、其剂量和所用的抗原递呈细胞，以及加入抗原的条件。本领域技术人员用常规方法即可测定这些参数。
可通过本领域技术人员已知的方法增强外源性抗原向抗原递呈细胞的递送。例如，已经开发了用于将外源性抗原递送给抗原递呈细胞，特别是树突细胞的内源性加工途径的几种不同方案。这些方法包括将抗原插入pH敏感型脂质体(Zhou和Huang，1994，Immunomethods，4：229-235)、胞饮式摄取可溶性抗原后等渗裂解胞饮泡(Moore等，1988，Cell，54：777-785)、将抗原偶联于有效佐剂(Aichele等，1990，J.Exp.Med.，171：1815-1820；Gao等，1991，J.Immunol.，147：3268-3273；Schulz等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：991-993；Kuzu等，1993，Euro.J.Immunol.，23：1397-1400；和Jondal等，1996，Immunity 5：295-302)和凋亡细胞递送抗原(Albert等1998，Nature 392：86-89；Albert等1998，Nature Med.4：1321-1324；和国际公开WO 99/42564和WO 01/85207)。可将重组细菌(如大肠杆菌)或转染的宿主哺乳动物细胞脉冲到树突细胞上(分别作为颗粒抗原或凋亡小体)进行抗原递送。重组嵌合病毒-样颗粒(VLP)也用作将外源性异源抗原递送给树突细胞系的I类MHC加工途径的载体(Bachmann等，1996，Eur.J.Immunol.，26(11)：2595-2600)。
或者，或此外，抗原可连接于或结合于溶细胞素，以增强抗原向本发明抗原递呈细胞的胞浆中的转移，以递送给I类MHC途径。示范性溶细胞素包括皂苷化合物如含皂苷的免疫刺激复合物(ISCOM)(参见例如，Cox和Coulter，1997，Vaccine 15(3)：248-256和美国专利号6,352,697)、磷酸酯酶(参见例如，Camilli等，199l，J.Exp.Med.173：751-754)、造孔毒素(如α-毒素)、革兰阳性菌的天然溶细胞素如李斯特菌溶细胞素O(LLO，如，Mengaud等，1988，Infect.Immun.56：766-772和Portnoy等，1992，Infect.Immun.60：2710-2717)、链球菌溶血素O(SLO，如Palmer等，1998，Biochemistry 37(8)：2378-2383)和产气荚膜羧菌溶细胞素O(perfringolysin O)(PFO，如Rossjohn等，Cell 89(5)：685-692)。当抗原递呈细胞是吞噬体时，宜采用酸活化的溶细胞素。例如，李斯特菌溶细胞素在弱酸性pH(吞噬体内的pH条件)下造孔能力较高，从而有利于将膜泡(包括吞噬体和内体)内容物递送至胞质(参见例如，Portnoy等，Infect.Immun.1992，60：2710-2717)。
可以一种组合物的形式一起提供溶细胞素和预选抗原，或者以单独组合物的形式提供溶细胞素和预选抗原，以接触抗原递呈细胞。在一个实施方式中，溶细胞素融合或连接于抗原，其中融合或连接允许将该抗原递送至靶细胞的胞浆中。在另一实施方式中，以递送载体的形式提供溶细胞素和抗原，例如但不限于：脂质体或选自病毒、细菌或酵母的微生物递送载体。适当地，当递送载体是微生物递送载体时，该递送载体是无毒力的。在此种类型的优选实施方式中，递送载体是无毒力的细菌，如Portnoy等的美国专利6,287,556所述，其含有编码操作性连接于调节性多核苷酸的非分泌的功能性溶细胞素的第一种多核苷酸和编码一种或多种预选抗原的第二种多核苷酸，所述第一种多核苷酸在细菌中表达溶细胞素。可通过各种机制提供非分泌性溶细胞素，这些机制例如，不存在功能性信号序列、无法分泌的微生物如具有遗传缺陷(如功能性信号序列突变)的微生物，或中毒微生物等。可采用各种无毒力的非致病性细菌；优选的微生物是鉴定得相当好的菌株，特别是大肠杆菌的实验室菌株如MC4100、MC1061、DH5α等。可经工程改造用于本发明的其它细菌包括单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、分枝杆菌、沙门菌(Salmonella)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等的良好鉴定的无毒力、非致病性菌株。在具体实施方式中，将细菌减毒，以使其不复制到、不整合到宿主细胞基因组中，和/或无法在细胞间或细胞内运动。
上述递送载体可用于将一种或多种抗原递送给基本上任何能够胞吞该载体的抗原递呈细胞，包括吞噬细胞和非吞噬细胞性抗原递呈细胞。在递送载体是微生物的实施方式中，该方法通常需要微生物被靶细胞摄取，然后在抗原递呈细胞膜泡(包括吞噬体和内体)内裂解。
在其它实施方式中，通过如上所述地引入合适表达载体在抗原递呈细胞内产生抗原。表达载体的抗原编码部分可含有天然产生的序列或经过重组技术工程改造的它的变体。在一个变体的例子中，用国际公开WO 99/02694和WO 00/42215中详述的方法修饰编码抗原的多核苷酸的密码子组成，以增强抗原在靶细胞或所选组织中的表达。简言之，这些方法基于以下观察结果：不同密码子的翻译效率因不同细胞或组织而变，可利用这些差异以及基因的密码子组成来调节蛋白质在特定细胞或组织类型中的表达。因此，为了构建密码子优化的多核苷酸，用在靶细胞或组织中比现有密码子翻译效率更高的同义密码子取代母体多核苷酸中的至少一个现有密码子。虽然优选用翻译效率更高的同义密码子取代母体核酸分子中的所有现有密码子，但这不必要，因为即使采用部分取代，也可提高表达水平。适当的是，取代步骤影响母体多核苷酸中现有密码子的5、10、15、20、25、30％，更优选35、40、50、60、70％或更多。
用于引入抗原递呈细胞的表达载体应与其相容，以便由该细胞表达编码抗原的多核苷酸。例如，此种类型的表达载体可能获自病毒DNA序列，包括但不限于：腺病毒、腺伴随病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒如B、C和D逆转录病毒，以及泡沫病毒和修饰的慢病毒。适用于转染动物细胞的表达载体参见例如，Wu和Ataai(2000，Curr.Opin.Biotechnol.11(2)：205-208)，Vigna和Naldini(2000，J.GeneMed.2(5)：308-316)，Kay等(2001，Nat.Med.7(1)：33-40)，Athanasopoulos等(2000，Iht.J.Mol.Med.6(4)：363-375)和Walther和Stein(2000，Drugs 60(2)：249-271)。根据具体选择的表达载体和抗原递呈细胞，用任何合适方法将表达载体引入抗原递呈细胞中。这种引入方法是本领域技术人员熟知的。例如，可通过以下方法进行引入：接触(如病毒载体的情况下)、电穿孔、转化、转导、偶联或三亲株杂交、转染、感染膜与阳离子脂质融合、用DNA-包被的微粒高速轰击、与磷酸钙-DNA沉淀一起培育、直接显微注射到单细胞中等。也可采用本领域技术人员知道的其它方法。或者，通过阳离子脂质如脂质体的方式引入载体。这种脂质体可购得(如Lipofectin，LipofectamineTM等，由Life Technologies，Gibco BRL，Gaithersburg，Md.提供)。本领域技术人员应理解，组装和表达本文所述的编码抗原的核酸分子、免疫调节分子和/或细胞因子的技术，如合成寡核苷酸、核酸扩增技术、转化细胞、构建载体、表达系统等以及将核酸分子转导或引入细胞中在本领域中已很好建立，大多数技术人员都熟悉用于具体条件和步骤的标准原材料。
在一些实施方式中，由需要修饰免疫应答的细胞群或组织分离抗原递呈细胞或其前体，从而获得抗原-特异性抗原递呈细胞。一般地，对于需要刺激或抑制针对这些抗原的免疫应答，一些分离的抗原递呈细胞或前体会组成性递呈作为免疫应答的靶点或潜在靶点的抗原或在体内吸收这些抗原。在这种情况下，不一定要递送外源性抗原。或者，可由健康或患病组织的活检样品中获得细胞，进行裂解或使其凋亡，随后脉冲到抗原递呈细胞(如树突细胞)上。在此种类型的某些实施方式中，抗原递呈细胞代表需要对其产生抗原特异性免疫应答的癌细胞或肿瘤细胞。癌细胞或肿瘤细胞的说明性例子包括肉瘤和癌细胞，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤；骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多、淋巴瘤(霍奇金病和非-霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。在某些实施方式中，癌细胞或肿瘤细胞选自黑色素瘤细胞或乳腺癌细胞。
在一些上述实施方式中，癌细胞或肿瘤细胞会构成兼性或非专性抗原递呈细胞，在一些情况下可能需要进一步修饰以增强其抗原递呈功能。在这些情况下，进一步修饰抗原递呈细胞，以表达一种或多种免疫调节分子，包括动物中天然产生的可调节或直接影响免疫应答的任何分子，包括：参与抗原加工和递呈的蛋白质，如TAP1/TAP2转运蛋白、蛋白酶体分子如LMP2和LMP7、热激蛋白如gp96、HSP70和HSP90，以及主要组织相容性复合物(MHC)或人白细胞抗原(HLA)分子；为T细胞激活提供共同刺激信号的因子如B7和CD40；为直接杀伤T细胞或诱导T淋巴细胞或B淋巴细胞麻痹或者刺激T调节细胞(Treg)产生提供共同抑制信号的因子如OX-2、程序性死亡-1配体(PD-1L)；辅助分子如CD83；趋化因子；淋巴因子和细胞因子如IFNα、β和γ，白介素(如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-22等)，刺激细胞生长的因子(如GM-SCF)以及其它因子(如肿瘤坏死因子(TNF)、DC-SIGN、MIP1α、MIP1β和转化生长因子-β(TGF-β)。在某些优选实施方式中，免疫调节分子选自：B7分子(如B7-1、B7-2或B7-3)或ICAM分子(如ICAM-1和ICAM-2)。
代替重组表达免疫调节分子的是，表达所需免疫调节分子的抗原递呈细胞可分离自或选自异源细胞群。本发明考虑了任何分离/选择方法，其例子是本领域技术人员熟知的。例如，可利用细胞的一种或多种具体特征特异性地从异源群体中分离该细胞。这种特征包括但不限于：细胞的解剖学位置、细胞密度、细胞大小、细胞形态、细胞代谢活性、细胞对离子如Ca2+、K+和H+的摄取、细胞对化合物如染料的摄取、细胞表面表达的标记物、蛋白质荧光和膜电位。可用于这个方面的合适方法包括手术切除组织、流式细胞术如荧光激活的细胞分选(FACS)、免疫亲和分离(如磁珠分离如DynabeadTM分离)、密度分离(如甲泛葡酸、PercollTM或FicollTM梯度离心)和细胞类型特异性密度分离。宜采用能与免疫调节分子发生免疫作用的抗原结合分子，通过流式细胞术或免疫亲和分离来分离细胞。
或者，可以可溶形式将免疫调节分子提供给抗原递呈细胞。在此种类型的一些实施方式中，免疫调节分子是缺少功能性跨膜结构域的B7分子(如含有B7胞外结构域)，其非限制性例子参见McHugh等(1998，Clin.Immunol.Immunopathol.87(1)：50-59)，Faas等(2000，J.Immunol.164(12)：6340-6348)和Jeannin等(2000，Immunity 13(3)：303-312)。在此种类型的其它实施方式中，免疫刺激蛋白是B7衍生物，包括但不限于：包含B7分子或其生物活性片段或者其变体或衍生物，和连接在一起的抗原结合分子如免疫球蛋白分子或其生物活性片段的嵌合或融合蛋白。例如，用PCR将编码对应于B7-1分子的胞外结构域的氨基酸序列(含有氨基酸位置约为1-215)的多核苷酸连接于编码对应于人Ig Cγ1的铰链、CH2和CH3区域的氨基酸序列的多核苷酸，以形成表达为B7 1g融合蛋白的构建物。已经按照布达佩斯条约将编码对应于B7Ig融合蛋白的氨基酸序列的DNA保藏到Rockville，Md.的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日期为1991年5月31日，登录号68627。Linsley等(美国专利号5,580,756)公开了制备和组装这种B7衍生物的技术。也参见Sturmhoefel等(1999，Cancer Res.59：4964-4972)，它公开了含有框内融合于IgG2a的Fc部分的B7-1或B7-2的胞外区的融合蛋白。
如果需要，可用任何合适方法延长可溶性免疫调节分子的半衰期。优选地，用聚乙二醇(PEG)，包括单甲氧基-聚乙二醇化学修饰这种分子，如Chapman等(1999，Nature Biotechnology 17：780-783)所述。
或者，或此外，以足以提高所述细胞的抗原递呈功能的时间和条件在至少一种IFN的存在下培养抗原递呈细胞，洗涤该细胞以去除IFN。在此种类型的某些优选实施方式中，培养步骤可包括使该细胞接触至少一种I型IFN和/或II型IFN。至少一种I型IFN适合选自：IFN-α、IFN-β、IFN-α的生物活性片段、IFN-β的生物活性片段、IFN-α的变体、IFN-β的变体、所述生物活性片段的变体、IFN-α的衍生物、IFN-β的衍生物、所述生物活性片段的衍生物、所述变体的衍生物、IFN-α的类似物或IFN-β的类似物。一般地，II型IFN选自IFN-γ、IFN-γ的生物活性片段、IFN-γ的变体、所述生物活性片段的变体、IFN-γ的衍生物、所述生物活性片段的衍生物、所述变体的衍生物或IFN-γ的类似物。用IFN处理提高抗原递呈细胞的抗原递呈功能的示范性方法和条件参见国际公开号WO 01/88097。
在一些实施方式中，适当使抗原递呈细胞(如癌细胞)或细胞系失活，以防止给予对象后进一步增殖。可采用任何物理、化学或生物的失活方式，包括但不限于：辐射(通常用至少约5,000cGy，通常至少约10,000cGy，一般至少约20,000cGy)；或用丝裂霉素-C处理(通常至少10μg/mL；更通常至少约50μg/mL)。
可用多种方式获得或制备含有和/或表达一种或多种抗原的抗原递呈细胞，以使该抗原或其加工形式被所述细胞递呈，以潜在调节其它免疫细胞，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，特别是产生经初免对特定抗原或抗原组发生应答的T淋巴细胞和B淋巴细胞。
免疫效应细胞
在一些实施方式中，上述抗原递呈细胞可用于产生对抗原或抗原组初免的T淋巴细胞。可用任何合适方法测定诱导淋巴细胞(特别是T淋巴细胞)以使其对特定抗原产生免疫应答的效率，这些方法包括但不限于：采用(例如)抗原-特异性抗原递呈细胞作为抗原-特异性溶细胞性T淋巴细胞(CTL)的靶点，测定T淋巴细胞的体外溶细胞活性；测定抗原-特异性T淋巴细胞增殖(参见例如，Vollenweider和Groseurth，1992，J.Immunol.Meth.149：133-135)，采用(例如)ELISPOT实验和ELISA实验测定B细胞对抗原的应答；检测细胞因子概况；或用皮肤对特定抗原的反应试验测定延迟型超敏(DTH)反应(参见例如，Chang等(1993，Cancer Res.53：1043-1050)。本发明也考虑了本领域技术人员已知的可检测接触抗原后抗原递呈细胞表面上是否存在抗原的其它方法。
因此，本发明也提供了抗原-特异性B或T淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞，它以抗原特异性方式应答，以递呈抗原。在一些实施方式中，通过使上述抗原递呈细胞接触T淋巴细胞群体产生抗原特异性T淋巴细胞，所述T淋巴细胞群体可获自任何合适来源如脾或扁桃体/淋巴结，但优选获自外周血。T淋巴细胞可以粗制剂或者部分纯化或基本纯化的制剂来使用，适合用如“Immunochemical Techniques(免疫化学技术)，G部分：Separation and Characterization of Lymphoid Cells(淋巴细胞的分离和鉴定)”(Meth.in Enzymol(酶学方法)，108，Di Sabato等编，1984，Academic Press)所述的标准技术获得。这包括与绵羊红细胞形成花结，通过尼龙羊毛柱或可塑性粘附进行传代，以耗尽粘连的细胞，用合适的单克隆抗体进行免疫磁性或流式细胞术选择是本领域已知的技术。
使T淋巴细胞制剂接触本文所述的抗原-特异性抗原递呈细胞足够时间，以使该T淋巴细胞被这些抗原递呈细胞递呈的抗原初免。此时间通常至少约为1天，至多约5天。
2.2.3抗原结合分子
本发明也考虑了将能与所选靶抗原发生特异性免疫反应的抗原结合分子用作免疫调节剂。在一些实施方式中，在疾病或病症中表达靶抗原，或者需要提高对其免疫应答的特定病原体表达靶抗原。在其它实施方式中，靶抗原表达异常，与正常状态或不存在疾病或病症的状态相比，在疾病或病症中表达水平一般较高。抗原结合分子应当与靶抗原相互作用，如2.2.1中所述。可用于本发明的许多抗原结合分子是本领域已知的。在结肠癌是治疗主题的说明性实施例中，抗原结合分子能与选自下组的抗原发生免疫作用：畸胎癌生长因子-1蛋白、Pim-1蛋白或结肠癌细胞裂解物递呈的抗原，如美国专利申请公开号20040176576所述。
在一些实施方式中，抗原结合分子是完整的多克隆抗体。例如，可通过将对应于靶抗原的至少一部分的抗原注射到生产物种(可包括小鼠或兔)中获得多克隆抗血清，从而制备这种抗体。本领域技术人员熟知产生多克隆抗体的方法。可采用的示范性方法参见例如：Coligan等，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(新编免疫学方法)，(John Wiley&Sons，Inc，1991)和Ausubel等(1994-1998，同上)，具体是第11章的第III部分。
代替在生产物种中获得的多克隆抗血清的是，可采用(例如)Khler和Milstein(1975，Nature 256，495-497)所述的标准方法或其最近的修改方案(如Coligan等(1991，同上)所述)生产单克隆抗体，所述修改方案是使获自接种了一种或多种上述抗原的生产物种的脾或其它抗体生产细胞永生化。
本发明也考虑了抗原结合分子Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2免疫球蛋白片段。或者，抗原结合分子可含有合成的稳定Fv片段。此种类型的示范性片段包括单链Fv片段(sFv，常常称为scFv)，其中用肽接头将VH结构域的N末端或C末端分别与VL结构域的C末端或N末端桥接起来。ScFv缺少完整抗体的所有恒定部分，无法激活补体。ScFv可按照Kreber等(Kreber等1997，J.Immunol.Methods；201(1)：35-55)所述的方法制备。或者，它们可通过美国专利5,091,513、欧洲专利239,400或Winter和Milstein的文献(1991，Nature 349：293)和Plückthun等(1996，Antibody engineering：Apractical approach(抗体工程：实践方法)，203-252)所述的方法制备。在另一实施方式中，合成的稳定Fv片段含有二硫键稳定的Fv(dsFv)，其中半胱氨酸残基被引入VH和VL结构域，以使这两个残基在完全折叠的Fv分子中形成二硫键。产生dsFv的合适方法参见例如(Glockscuther等，Biochem.29：1363-1367；Reiter等1994，J.Biol.Chem.269：18327-18331；Reiter等1994，Biochem.33：5451-5459；Reiter等，1994，Cancer Res.54：2714-2718；Webber等1995，Mol.Immunol.32：249-258)。
2.3辅助组件
在一些实施方式中，该组合物还包含一种或多种细胞因子，它们应选自：flt3、SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、TNF-α、IL-4、TNF-β、LT-β、IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-13、IL-5、IL-1α、IL-1β、IFN-γ、IL-17、IL-16、IL-18、HGF、IL-11、MSP、FasL、TRAIL、TRANCE、LIGHT、TWEAK、CD27L、CD30L、CD40L、APRIL、TALL-1、4-1BBL、OX40L、GITRL、IGF-I、IGF-II、HGF、MSP、FGF-a、FGF-b、FGF-3-19、NGF、BDNF、NTs、Tpo、Epo、Ang1-4、PDGF-AA、PDGF-BB、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、TGF-α、AR、BTC、HRGs、HB-EGF、SMDF、OB、CT-1、CNTF、OSM、SCF、Flt-3L、M-CSF、MK或PTN，或者其功能性、重组或化学等同物或同源物。细胞因子优选选自：IL-12、IL-3、IL-5、TNF、GMCSF或IFN-γ。
3.基于细胞的治疗或预防
按照本发明，可将如2.1中所述的IL-10功能抑制剂与抗原递呈细胞和/或2.2.2中所述的免疫效应细胞一起给予患者，以初次产生或加强免疫应答。因此，这些基于细胞的组合物可用于治疗或预防与靶抗原的存在或异常表达有关的疾病或病症。可用任何方式(如注射)将本发明细胞引入患者，以对抗原或抗原组产生所需免疫应答。细胞可获自该患者(即自体细胞)或获自与该患者MHC匹配或错配的个体(即同种异体)。一般地，将自体细胞注射回由其获得来源细胞的患者体内。注射部位可以是皮下、腹膜内、肌肉内、皮内或静脉内。可将足量的这种细胞给予已经患有疾病或病症的患者或倾向于患有疾病或病症的对象，以治疗或预防或缓解该疾病或病症的症状。注射到需要治疗或预防的患者体内的细胞数可能取决于抗原和个体大小等。此数量可以是(例如)约103-1011，通常约为105-107个细胞(如树突细胞或T淋巴细胞)。可以单次或多次给予该细胞，其中细胞数和方式由治疗医师选择。该细胞应该用药学上可接受的运载体给药，所述运载体对该细胞和个体无毒。这种运载体可以是细胞生长的生长培养基，或者是任何合适的缓冲介质如磷酸盐缓冲盐水。该细胞可以单独给药或者与本领域已知的其它疗法联合治疗，以治疗或预防不想要的免疫应答，例如但不限于：糖皮质激素类、甲氨蝶呤、D-青霉胺、羟基氯喹、金盐、柳氮磺吡啶、TNFo或白介素-1抑制剂、和/或其它特定免疫治疗形式。
4.药物制剂
本发明也考虑了含有如2.1中所述的IL-10功能抑制剂、和免疫刺激剂如2.2.1中所述的抗原、2.2.2中所述的免疫效应细胞或2.2.3中所述的抗原结合分子或其组合(治疗剂/预防剂)作为活性成分，以治疗或预防与靶抗原的存在或异常表达有关的各种疾病或病症的免疫调节制剂，包括疫苗。这些治疗剂/预防剂可以直接或者在与合适的药学上可接受的运载体和/或稀释剂或佐剂混合的制剂中给予患者。
这些制剂的制备采用本领域技术人员已知的常规方法。一般将这种制剂和疫苗制备成液体溶液或悬液形式的注射剂；也可制备成适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。也可乳化该制剂。活性免疫原性成分常常与药学上可接受并且与该活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是(例如)：水、磷酸盐缓冲盐水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等和其组合。此外，如果需要，疫苗可含有少量辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或能提高疫苗有效性的佐剂。可能有效的佐剂的例子包括但不限于：表面活性剂如十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基二-十八烷基溴化铵、N，N-二-十八烷基-N’，N’双(2-羟乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和普朗尼克多元醇；聚胺如吡喃、硫酸右旋糖苷、聚IC卡巴浦尔；无机凝胶如磷酸铝、氢氧化铝或明矾；肽如胞壁酰二肽和衍生物如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷胺酰胺(thur-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷胺酰胺(CGP 11637、称为nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷胺酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 1983A、称为MTP-PE)和RIBI，其含有提取自细菌的三种组分，单磷酰基脂质A、二甲基甘氨酸、吞噬刺激肽；油乳剂；海藻糖二霉菌酸酯和2％鲨烯/吐温80乳剂中的细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)；淋巴因子；QuilA和免疫刺激复合物(ISCOMS)。例如，可通过测定给予疫苗产生的抗体量确定佐剂的有效性，其中所述抗体是疫苗处理细胞递呈的一种或多种抗原的抗体。
应该用药学上可接受的运载体给予活性成分，所述运载体对细胞和待治疗个体无毒。这种运载体可以是细胞生长的生长培养基。相容性赋形剂包括含有或不含生理学相容性缓冲液如磷酸盐或Hepes缓冲液和营养物如右旋糖、生理学相容性离子或氨基酸的等渗盐水，以及适用于细胞群的各种培养基，特别是不含其它免疫原性成分的培养基。也可采用负载试剂如白蛋白和血浆组分以及无活性增稠剂。无活性生物组分(至它们在疫苗中存在的程度)优选衍生自与待治疗个体同源的动物或人，甚至更优选先从该对象获得。注射部位可以是皮下、腹膜内、肌肉内、皮内或静脉内。
如果采用可溶性活性成分，可将可溶性活性成分作为中性或盐形式配制到疫苗中。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)，它们是与无机酸如氢氯酸或磷酸，或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
实际上，如果需要，含有疫苗并且适合持续或间歇性释放的装置或药物组合物可以植入体内或局部施用，以便相对较慢地将这种物质释放到体内。
配制和给药的技术可参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)”，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，最新版。合适的途径可包括(例如)：口服、直肠、跨粘膜或肠道给药；胃肠道外递送，包括肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
给药剂量可能取决于所治疗的对象，包括其年龄、性别、体重和总体健康状况。剂量也得考虑IL-10功能抑制剂与其靶分子的结合亲和力、免疫刺激物的免疫原性、其生物利用度以及其体内和药动学特性。在这个方面，给药的准确量也可能取决于实施者的判断。确定治疗疾病或病症的给药有效量的过程中，医师或兽医可评估疾病或病症随时间的进展。在任何情况下，本领域技术人员无需过多实验，即可容易地确定本发明药物的合适剂量。给予患者的含有细胞的组合物和疫苗的合适量约为每次给予104-1010个，更优选约106-108个处理细胞。给予患者的活性物质的剂量应该足以在患者中随时间产生有益的应答，例如与癌症或肿瘤相关的症状减轻。例如，IL-10功能抑制剂或多肽抗原全身给药的普通患者剂量约为0.1-200g，一般约为1-160g，更一般约为10-70g。以患者体重计，普通剂量约为1.5-3000mg/kg，一般约为15-2500mg/kg，更一般约为150-1000mg/kg，更一般约为20-50mg/kg。可以适当的间隔给予这些剂量，以维持IL-10抑制或者维持或增强对靶抗原的免疫应答。可用本领域技术人员已知的常规方法确定此间隔，此间隔可能取决于所用活性物质的类型和其剂型。例如，该间隔可以是每天、每两天、每周、每两周、每月、每两个月、每季度、每半年或每年。
因此，可提供有效量的IL-10功能抑制剂和免疫刺激物，以刺激或增强对靶抗原的免疫应答。此过程可包括分别、同时或依次给予IL-10功能抑制剂和免疫刺激物。在一些实施方式中，可通过给予含有两种药物的一种组合物或药物制剂，或同时给予两种单独的组合物或制剂(其中一种组合物含有IL-10功能抑制剂，另一种组合物含有免疫刺激物)完成此过程。在其它实施方式中，可以在免疫刺激物处理前或后用IL-10功能抑制剂处理，间隔数分钟至数天。在IL-10功能抑制剂与疫刺激物分别施用的实施方式中，通常保证它在各递送时间之间不过期，以便IL-10功能抑制剂仍能够与免疫刺激物一起对免疫系统产生有利的联合作用，具体说，即维持或提高免疫刺激物后续刺激后对象产生抗原-特异性CD8+IFN-γ的免疫应答的能力。在这种情况下，考虑了将细胞与这两种物质接触互相接触约1-12小时，更适当地，互相接触约2-6小时。然而在一些情况下，各次给药之间间隔数小时(2、3、4、5、6或7)至数天(1、2、3、4、5、6、7或8)时，可能需要显著延长治疗的时间。
如上所述，可以想像，需要给予一次以上的IL-10功能抑制剂或免疫刺激物。可采用各种组合，其中IL-10功能抑制剂是“A”，免疫刺激物是“B”，如下所述：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/AA/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B。
考虑了其它组合。再一次，将联合量的两种药物递送给对象的免疫系统，以有效维持或提高免疫刺激物后续刺激后对象产生抗原-特异性CD8+IFN-γ的免疫应答的能力。
5.调节免疫应答的方法
本发明组合物可用于刺激没有免疫接触过靶抗原或之前对该抗原产生过免疫应答的对象对靶抗原产生免疫应答。因此，本发明也涉及通过给予对象本发明组合物或疫苗增强对象的免疫应答的方法。有利的是，免疫应答是细胞介导的免疫应答(如T细胞介导的应答，所述T细胞应包括产生CD8+IFN-γ的T细胞)。可以依次、同时或分别给予该组合物的活性成分，如上所述。
本发明也包括治疗和/或预防疾病或病症的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者有效量的IL-10功能抑制剂以及有效量的免疫刺激物，如上所述。在某些实施方式中，靶抗原与疾病或病症有关或产生了疾病或病症，所述疾病或病症适合选自癌症、感染性疾病或特征是免疫缺陷的疾病。癌症的例子包括但不限于：ABL1原癌基因、AIDS相关性癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、腺囊瘤、肾上腺皮质癌、特发性髓样化生、脱发、软组织腺泡状肉瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调-毛细管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和CNS肿瘤、乳腺癌、CNS肿瘤、类癌瘤、宫颈癌、儿童脑瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤纤维肉瘤隆起、结缔组织增生性小圆细胞瘤、导管癌、内分泌癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、肝外胆道癌、眼癌、眼睛：黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范科尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠-类癌瘤、泌尿生殖器癌、生殖细胞肿瘤、妊娠期-滋养层-疾病、神经胶质瘤、妇科癌症、血液恶性肿瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增多病、霍奇金病、人乳头瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、下咽部癌症、眼内黑色素瘤、岛细胞癌、卡波济氏肉瘤、肾癌、朗格汗斯细胞组织细胞增多病、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、Li-Fraumeni综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、肾的恶性杆状体肿瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口癌、多发性内分泌瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓发育异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生病、鼻癌、鼻咽癌、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤病、Nijmegen断裂综合征、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌、胰腺癌、鼻旁癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周-神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多、前列腺癌、罕见癌症和相关疾病、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、罗-汤二氏综合征、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞-癌(肾-骨盆-/-输尿管)、滋养层癌、尿道癌、泌尿系统癌、uroplakins、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、肾母细胞瘤。
在其它实施方式中，本发明组合物也可用于产生大量CD8+或CD4+CTL，以过继转移给不能产生正常免疫应答的免疫缺陷型个体。例如，可过继转移抗原-特异性CD8+CTL以治疗感染HIV的个体(Koup等，1991，J.Exp.Med.174：1593-1600；Carmichael等，1993，J.Exp.Med.177：249-256；和Johnson等，1992，J.Exp.Med.175：961-971)，患有疟疾的个体(Hill等，1992，Nature 360：434-439)和患有恶性肿瘤如黑色素瘤的个体(Van der Brogen 等，1991，Science 254：1643-1647；和Young和Steinman 1990，J.Exp.Med.，171：1315-1332)。
在其它实施方式中，该组合物适合治疗或预防病毒、细菌或寄生物感染。本发明考虑的病毒感染包括但不限于：HIV、肝炎、流感、日本脑炎病毒、EB病毒和呼吸道合胞病毒引起的感染。细菌感染包括但不限于：奈瑟球菌(Neisseria)、脑膜炎球菌(Meningococcal)、嗜血杆菌(Haemophilus)、沙门菌(Salmonella)、链球菌(Streptococcal)、军团菌(Legionella)和分枝杆菌(Mycobacterium)引起的感染。本发明涉及的寄生物感染包括但不限于：疟原虫(Plasmodium)、血吸虫(Schistosoma)、利什曼虫(Leishmania)、锥虫(Trypanosoma)、弓形体(Toxoplasma)和贾第鞭毛虫(Giardia)引起的感染。
可采用任何合适技术评价免疫的有效性。例如，可采用刺激的脾细胞或外周血单核细胞(PBMC)对肽包被的或重组病毒感染的细胞进行CTL裂解实验，所用靶细胞是用51Cr或Alamar BlueTM标记的。可采用(例如)灵长动物、小鼠或人细胞进行这种实验(Allen等，2000，J.Immunol.164(9)：4968-4978，Woodberry等，同上)。或者，可用一种或多种技术监测免疫的效力，这些技术包括但不限于：HLA I类四聚体染色-新鲜和刺激的PBMC(参见例如Allen等，同上)、增殖实验(Allen等，同上)、ELISPOT实验和胞内IFN-γ染色(Allen等，同上)、ELISA实验(用于线性B细胞应答)；和表达合成多核苷酸的细胞样品的Western印迹。
在一些实施方式中，该组合物含有可由其表达对应于靶抗原的抗原的核酸构建物。将这种构建物给予哺乳动物(尤其是人)可包括通过直接口服、全身注射递送，或递送至所选组织或细胞。可通过微粒轰击、脂质体介导的转染(如lipofectin或lipofectamine)、电穿孔、磷酸钙或DEAE-右旋糖苷-介导的转染促进将该构建物递送至哺乳动物的细胞或组织。对合适递送方法的讨论可参见Ausubel等的第9章(1994-1998，同上)。
将表达载体引入所选的靶细胞或组织的步骤将取决于所需的应用和物种，可涉及一种或多种非病毒和病毒载体、阳离子脂质体、逆转录病毒和腺病毒，如Mulligan，R.C.(1993 Science 260 926-932)所述。这种方法包括例如：
A.通过注射(Wolff等，1990，Science 247 1465-1468)、手术植入、滴注或任何其它方式局部给予表达载体。此方法也可与通过注射、手术植入、滴注或任何其它方式给予对表达载体编码的蛋白质有反应性的细胞的局部给药联用，以便提高该治疗的有效性。此方法也可与通过注射、手术植入、滴注或任何其它方式给予蛋白质活性所必需的其它因子的局部给药联用。
B.普通全身给药：单独注射DNA(Calabretta等，1993，Cancer Treat.Rev.19169-179)或RNA，或与脂质体(Zhu等，1993，Science 261 209-212)、病毒衣壳或纳米颗粒(Bertling等，1991，Biotech.4ppl.Biochem.13 390-405)或任何其它递送介导物联合注射DNA或RNA。可将多核苷酸/表达载体连接于靶向分子(采用(例如)抗原结合分子的所谓“魔方”方法)或通过注射、手术植入或任何其它方式局部施用使表达载体编码的蛋白有活性所需的其它因子或对该蛋白有反应的细胞，从而改进靶向作用。例如，在含有反义IL-10多核苷酸的脂质体的情况下，可通过将对皮肤癌中表达水平较高的EGF受体特异的免疫反应性物质掺入脂质体包膜中，使该脂质体靶向皮肤癌细胞，如鳞癌细胞。
C.注射或植入或以任何方式递送通过转染(例如，在磷酸钙存在下：Chen等，1987，Mole.Cell Biochem.7 2745-2752，或在阳离子脂质体和聚胺的存在下：Rose等，1991，BioTech.10 520-525)、感染、注射、电穿孔(Shigekawa等，1988，BioTech.6 742-751)或任何其它方式离体修饰，以提高多核苷酸在这些细胞中表达的细胞。所述修饰可由以下物质介导：质粒、噬菌体、粘粒、病毒(如腺病毒或逆转录病毒；Mulligan，1993，Science 260 926-932；Miller，1992，Nature 357 455-460；Salmons等，1993，Hum.Gen.Ther.4 129-141)或其它载体，或者其它修饰剂如脂质体(Zhu等，1993，Science 261 209-212)、病毒衣壳或纳米颗粒(Bertling等，1991，Biotech.Appl.Biochem.13 390-405)，或者任何其它修饰介导物。Barr等，1991，Science 2541507-1512和Dhawan等，1991，Science 254 1509-1512描述了将细胞用作基因或基因产物的递送载体。可以将处理的细胞与任何营养物、生长因子、基质或能促进其在治疗对象中存活的其它物质联合递送。
为了使本发明易于理解并付诸实施，通过以下非限制性实施例的方式描述具体优选的实施方式。
实施例
实施例1
克服抗原原罪以在接触过抗原的宿主中产生新的CD8细胞IFN-γ应答
材料和方法
小鼠
4-8周龄成年雌性C57BL/6(H-2b)小鼠是购自Animal Resource Centre(ARC，澳大利亚佩思)的无特定病原体(SPF)动物，在实验室中生产以C57BL/6J为背景的人乳头瘤病毒16 E7(RAHYNIVTF)MHC I类限制性T细胞受体β链转基因小鼠，如(Matsumoto，2004，J.Natl Cancer Inst 96：1611-1619)所述。在整个实验过程中将小鼠保持在SPF条件下，所有实验都由昆士兰大学动物实验伦理委员会批准，并遵照昆士兰大学动物实验伦理委员会的指南进行。
细胞系和肽和抗体
在含有Sf-9 II补充物(Life Technique)和10％胎牛血清(FBS)(CSL，Melbourne)的Sf-900 II培养基中27℃培养草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf-9)细胞(LifeTechnique)。抗-IL-10R杂交瘤(3B1.3a)由悉尼大学Centenary Institute的WarwickBritton博士友情提供，在含有10％FBS的RPMI-1640(Invitrogen，USA)中培养。
为了产生抗-IL-10R MAb，用含有1％FBS的RPMI培养该杂交瘤细胞72小时，收集上清液，使其通过蛋白G柱(Sigma-Aldrich)，使100mM甘氨酸(Sigma-Aldrich)通过该柱，进行洗脱。洗脱的抗体用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(0.15M NaCl；0.02MPO4；pH 7.4)进行粗略(extensively)透析，如前所述测定抗体浓度(Liu等，2003，JImmunol 171：4765-4772)。
由腹水生产抗-CD4 MAb(GK1.5)和抗-CD8 MAb(2.43)。抗CD4-FITCMAb(RM4-4)、FITC大鼠IgG2a(R35-95)、抗-IL-10 MAb(JES5-16E3)、抗-Gr-1MAb(RB6-85C)、抗-CD45R/B220 MAb(RA3-6B2)和抗-CD16/CD32 MAbFcγII/III(2.4G2)购自BD PharMingen(加州圣地亚哥)
MHC I类(H-2 Db)限制性HPV16 E7肽RAHYNIVTF由Chiron Mimotopes(澳大利亚墨尔本)合成和纯化。氢氧化铝凝胶购自Superfos Biosector(Vedbaek，丹麦)，不完全弗氏佐剂购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。
分离小鼠单核细胞和流式细胞术分析
通过密度梯度离心分离小鼠血液的单核细胞。简要说，将200μL静脉血加到含有0.2％EDTA Na2(Sigma-Aldrich)的PBS中，覆盖到1ml Histopaque(Sigma-Aldrich)上。22℃400g离心15分钟后，用含有0.1％牛血清白蛋白和0.1％NaN3的PBS彻底洗涤夹层，然后在室温下接触FITC-偶联的MAb 15分钟，用Becton DickinsonFACSCaliber流式细胞仪和Cellquest(Becton Dickinson)软件进行分析。
产生重组VLP
已经描述了编码人乳头瘤病毒6bL1、BPV1L1 VLP(L1VLP)和BPV1L1/HPV16E7CTL(L1E7VLP)重组蛋白的杆状病毒的构建(Peng等，1998Virology 240：147-157)。如前所述(Liu等，2003，同上)，通过CsCl梯度离心由感染了L1重组杆状病毒的SF9细胞的核纯化VLP。通过透射电子显微镜对样品进行分析，进行免疫印迹以确认VLP的身份和完整性。在免疫印迹分析中，用SDS-PAGE样品缓冲液稀释蛋白质样品，通过10％SDS-PAGE凝胶电泳，并转移至硝基纤维素膜。用抗-L1单克隆抗体MC15检测该膜(Kulski等，1998，Virology 243：275-282)。用辣根过氧化物酶偶联的绵羊抗-小鼠抗体(Silenus)培育该膜并用增强的化学发光(Amersham)进行肉眼观察，以检测结合的抗体。在电子显微镜观察中，将CsCl梯度纯化和透析的VLP样品加到镀碳栅(carbon-coated grid)，用2％钼酸铵(pH 6.2)染色，用Hitachi H-800电镜检测。
小鼠的免疫
按照计划用含有或不含氢氧化铝凝胶(“明矾”)的30或50μg VLP免疫三只或五只小鼠的小组。在免疫过程中用异氟烷(Abbott)对小鼠进行轻度麻醉。VLP溶于50μLPBS中或与等体积的明矾混合。在体内中和实验中，腹膜内给予0.5-1mg单克隆抗体或正常大鼠血清。
用ELISA检测培养物上清液中的IL-10、IL-5和IFN-γ细胞因子
如前所述，按照生产商推荐的方法(Liu等，2003，同上)进行ELISA，以检测IL-5、IL-10和IFN-γ(R&D system，USA)。
ELISPOT
如(Khammanivong等，2003，Immunol Cell Biol 81：1-7)所述进行ELISPOT。简要说，将单个脾细胞或淋巴结悬液加入用抗-IFNγ(BD PharMingen)包被的膜基96孔板(Millipore)中，加入或不加IL-2(Life Techniques)。加入不同浓度的肽，将细胞与肽于37℃保持18小时。通过使平板依次接触生物素化的抗-IFNγ(BD PharMingen)、抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(Sigma-Aldrich)和DAB(Sigma-Aldrich)检测抗原特异性IFNγ分泌细胞。
小鼠脾CD11c+细胞的正选择
用1mg/ml胶原酶D(Roche)维持C57 BL/6J小鼠脾，将500μl胶原酶D注射到各脾中。然后将脾切成小块，用5ml胶原酶D 37℃维持45-60分钟，然后使其通过钢丝网。对细胞进行计数，用含有2％FBS的RPMI洗涤，每108个细胞再悬浮于含2％FBS的400mL RPMI中。加入100μL MACS CD11c Microbeads(Miltenyi Biotec)，6-12℃维持15分钟。洗涤后，每108个细胞重悬于500μl。按照生产商的方法用LS柱(Miltenyi Biotec)正选择CD11c阳性细胞。经流式细胞术评估，CD11c+细胞的纯度约为80％。
CD4细胞的选择
为了产生富含抗原初免的CD4+T细胞的淋巴细胞群，用L1VLP免疫小鼠两次，第二次免疫7天后摘除引流腹股沟淋巴结。使细胞通过70μm尼龙膜(BD，PharMingen)并重悬于1ml RPMI+2％FBS。在每108个细胞中：加入抗-Gr-1 MAb 8μL、抗-B220MAb 6μL、抗-MHC II(I-Ab)MAb 5μL、抗-FcγII/III MAb 4μL和抗-CD8 MAb 8μL。室温培育15分钟后，洗涤该细胞，并重悬于1ml RPMI+2％FBS。在9℃下，以100μL/108个细胞加入抗-大鼠-MACS珠(Miltenyi Biotec)15分钟，用RPMI培养基洗涤，并按照生产商的方法通过LS柱。在CD4+T细胞的正选择中，细胞与抗-CD4MAb(RM4-4)一起在4℃维持1小时，然后在转动搅拌器上用大鼠抗-CD4 Dynabead珠在4℃维持1小时。接着，按照生产商说明书用磁性颗粒浓缩器(Dynal Biotech)正选择CD4+细胞。
用接触嵌合E7 VLP的APC体外激活E7 TCR转基因CD8 T细胞。
使105个CD11+细胞于37℃接触40μg BPVL1 VLP、BPV1-HPV16E7嵌合VLP或HPV6 VLP 18小时。彻底洗涤后，将细胞放入U形96孔组织培养板(Cellstar)中，加入不同数量的通过37℃接触塑料2小时耗尽了其中贴壁细胞的脾细胞，它们是C57B1/6小鼠的细胞或含有对MHC I类限制性E7肽RAHYNIVTF特异的转基因TCRβ-链的C57B1/6小鼠的细胞，称为E7 T细胞。约50％来自TCRβ-链转基因C57B1/6动物的T细胞能结合E7肽四聚体，并响应于E7肽脉冲靶点分泌IFN-γ(Matsumoto等，J Natl CancerInst.96(21)：1611-1619，2004)。细胞在37℃维持2天，收集上清液进行细胞因子测定。将3H胸苷加入培养平板中再处理16小时，如前所述(Femando等，1998，J Immunol 161：2421-2427)检测T细胞增殖。在一些实验中，将用L1VLP或无关抗原免疫的富含CD4的小鼠淋巴细胞加到接触VLP的CD11c+细胞处理18小时。然后加入E7 T细胞和15μg/ml GK1.5封闭抗体并培养细胞，在48小时后如上所述评估细胞因子的分泌和增殖。
统计学分析
用双尾Student’st检验进行统计学分析。
结果和讨论
载体初免的CD4+细胞能介导对CD8 T细胞体内分泌IFN-γ的抑制。
给予偶联于病毒衣壳载体的MHC I类限制性表位能诱导表位特异性IFN-γ分泌性CD8 T细胞(Peng等，1998，同上；Liu等，2000，Virology 273：374-382)。然而，预先存在的对载体病毒衣壳的免疫力会抑制与病毒衣壳相关的新表位的IFN-γ应答的激活，此观察结果称为抗原原罪(Liu等，2003，同上；Da Silva，2001同上)。本发明者以前证明，这种抑制位于载体抗原初免部位，并需要产生IL-10(Liu等，2003，同上)。在本研究中，他们确定了所观察的抑制作用的机制和克服它的方法。由于具有调节功能的IL-10分泌性T细胞主要是CD4+(Sakaguchi，2004，Annu Rev Immunol22：531-562)，所以决定确定在体内抑制先前已观察到的IFN-γ应答是否一定需要免疫CD4细胞。因此，本发明者耗尽了不能对与病毒衣壳相关的新E7表位产生IFN-γ应答的BPV1 L1病毒衣壳初免动物的CD4+细胞。然后，他们观察到3周后幼稚CD4群体恢复(图1C)，并通过用L1E7 VLP免疫检测了对E7表位产生IFN-γ应答的能力的恢复。不出所料，L1E7 VLP在幼稚动物中诱导E7表位特异性IFNγ应答，但L1E7VLP在L1 VLP初免的非耗尽小鼠中不诱导这种应答。然而，不难在耗尽接触过抗原的CD4细胞并在L1E7 VLP免疫前恢复了天然CD4群体的L1 VLP免疫小鼠中检测到E7特异性IFN-γ分泌性T细胞(图1D)。这些结果证实了本发明者之前的发现，并说明，在体内病毒衣壳特异性CD4+T细胞是抑制表位特异性IFN-γ应答所必需的。
由于L1E7 VLP在L1VLP初免小鼠中抑制诱导E7特异性T细胞IFN-γ应答取决于IL-10和L1VLP初免的CD4+T细胞，所以认为在引流L1VLP注射部位的淋巴结中初免的CD4+细胞会产生IL-10。为了检验这一理论，用L1E7 VLP免疫小鼠两次，检测引流淋巴结的细胞的细胞因子分泌。注射不含佐剂或含有明矾佐剂的L1E7VLP能增加用L1E7VLP体外刺激的引流淋巴结细胞产生的抗原特异性IL-10(图1A)。抗-CD4处理淋巴结细胞，而非抗-CD8处理能显著降低IL-10的产生(图1B)。类似地，L1E7VLP免疫能增加免疫动物的脾细胞响应于L1E7VLP抗原产生的IL-10。因此，用VLP免疫能诱导引流淋巴结中VLP特异性CD4阳性T细胞分泌IL-10，这表明这些VLP特异性CD4细胞能以依赖IL-10的方式，响应于新MHC I类限制性表位免疫而抑制IFN-γ分泌性T细胞的诱导。
病毒衣壳初免的CD4+细胞在体外抑制抗原特异性IFN γ分泌
如果E7肽不共价连接于VLP，则能在用E7蛋白和L1VLP免疫的L1VLP初免宿主中观察到E7肽特异性T细胞应答(Liu等，2003，同上)。这提示出以下假说，如果由同一种DC将L1VLP肽递呈给CD4 T细胞并将E7肽递呈给CD8 T细胞，那么该CD4细胞能通过分泌IL-10局部影响E7特异性CD8细胞的命运。为了研究以下假说，本发明者建立了一种体外系统，其中使分离自小鼠脾的CD11c+细胞(下面称为DC)接触L1 VLP、L1E7 VLP或无关的HPV6L1 VLP 18小时。然后借助IFN-γ分泌和T细胞增殖评价抗原脉冲DC在体外激活幼稚E7特异性(TCR转基因)CD8 T细胞。不出所料，在接触L1E7 VLP，而非L1VLP或HPV6L1 VLP的DC中观察到体外激活了E7特异性CD8+T细胞(图2A)。在与未脉冲DC或接触L1VLP的DC相接触的CD8+或CD4+T细胞中没有观察到显著的IFN-γ分泌(图2B、C)，这表明该体外系统的特异性。
为了检测在此体外系统中用L1VLP免疫的动物的CD4细胞对CD8 T细胞激活的影响，本发明者加入来自L1VLP免疫小鼠的引流淋巴结或未免疫小鼠的CD4+T细胞。CD4+T细胞与先前接触过VLP的DC共同培养18小时，然后加入E7 TCR转基因T细胞。令人惊讶的是，加入L1 VLP免疫小鼠的CD4细胞时，E7特异性CD8+T细胞增殖和IFN-γ分泌均有增加(图2B)，尽管如所预料的，来自幼稚小鼠的CD4 T细胞没有影响CD8 T细胞的E7特异性IFNγ分泌。这些数据表明，在体外接触抗原后，来自L1VLP免疫小鼠的大多数L1 VLP特异性CD4细胞都作为辅助T细胞起作用，局部体内环境和完整的淋巴结结构可能对CD4+诱导的抑制CD8+初免(经由抗原脉冲DC产生)很重要。由于VLP与明矾共同共同给予时用VLP免疫的小鼠的CD4+T细胞能分泌更多IL-10，所以本发明者检测了VLP和明矾初免的CD4+T细胞可否抑制E7特异性T细胞被接触DC的L1E7 VLP激活。与仅用VLP免疫的动物的CD4+细胞相反，用明矾和VLP免疫的动物的CD4细胞能显著抑制E7特异性T细胞IFN-γ分泌的激活(图2C)。为了研究是否如本发明者的体内观察结果所料此种抑制作用由IL-10介导，他们首先测定了不同CD4+细胞和DC培养物的上清液中的IL-10。正如所料，含有VLP免疫动物的CD4+细胞的培养物中IL-10分泌显著高于含有对照免疫动物的CD4+细胞的培养物(图2D)。而且，IL-10体外中和能恢复L1E7VLP初免DC激活E7肽特异性T细胞的IFN-γ分泌(图3A)。因此，病毒衣壳初免的CD4+细胞与递呈L1E7的DC相互作用后会分泌IL-10。CD4+细胞和DC的相互作用防止了随后由DC激活E7特异性CD8限制性T细胞的IFN-γ分泌，IFN-γ分泌的抑制取决于IL-10。
用接触VLP特异性CD4 T细胞的DC初免幼稚CD8 T细胞以分泌IL-5
虽然免疫CD4细胞与递呈L1E7的DC共同培养时E7特异性CD8+T细胞的IFNγ分泌被抑制，但T细胞增殖增加(图2C)，这表明接触了抗原的DC激活E7 TCR转基因T细胞可能根据发生抗原递呈的细胞因子环境产生不同的功能效果。为了研究观察到的IL-10分泌性CD4+T细胞对CD8+T细胞的IFN-γ生产的抑制作用是否代表无法产生效应物表型，或者使效应物表型从Tc1转变为Tc2，本发明者测定了共同培养的细胞产生的IL-5。与加入无关CD4+T细胞相比，加入用L1 VLP和明矾免疫的动物的CD4 T细胞后CD8+T细胞的IL-5分泌水平更高(图4A)。为了阐明E7特异性CD8+T细胞是否是IL-5分泌增加的原因，与接触了抗原的DC共同培养18小时后，去除CD4细胞(图4，FACS结果)，然后将“教导的”DC与E7TCR CD8 T细胞，或与无关CD8+T细胞一起培养。无论DC是否被L1特异性CD4细胞教导或者是否接触过CD4+T细胞，E7特异性T细胞增殖相似(图4B a、c、e)。然而，与抗原初免的CD4+细胞教导的DC一起培养时，特别是如果用明矾诱导初免CD4+细胞以分泌大量IL-10时，E7特异性T细胞产生的1L-5显然更多(图4B b、d、f)。感兴趣的是，在接触用IL-10分泌性CD4+T细胞教导过的DC的无关幼稚T细胞中也观察到高水平的IL-5分泌(图4B，f)，这表明这种DC可非特异性地诱导CD8+T细胞分泌IL-5。因此，可通过用能识别DC递呈的其关联抗原的CD4+T细胞对DC进行在先教导，从而测定在体外接触抗原初免DC的CD8细胞产生的细胞因子。
通过中和IL-10恢复CD8+CTL应答
本发明者测试了可克服之前用载体蛋白初免动物后对连接于载体蛋白的表位的Tc1型CD8应答的抑制的方法。由于癌症或慢性病毒感染的患者通常对病毒或肿瘤特异性抗原的免疫应答无效，特征是抗体和缺少肿瘤或病毒抗原特异性CTL效应物，所以克服这种抑制可能对免疫治疗很重要。将VLP与作为刺激物的CpG DNA一起给予天然免疫系统可提高所诱导CD8+免疫应答的水平(Storni，2002，J Immunol168：2880-2886)，因此本发明者用L1E7和CpG免疫病毒衣壳蛋白初免的小鼠，但没有观察到诱导了E7特异性CD8 IFN-γ应答(图5A，B)。因此，通过更好地激活DC提高抗原在初免宿主中的免疫原性不能克服观察到的先前初免对新CD8+Tc1应答的抑制作用。然后，本发明者在体外和体内检测了中和性IL-10可否恢复L1初免动物经L1E7免疫后产生E7特异性IFN-γ应答的能力。将不同浓度的中和性抗IL-10抗体加入体外DC/CD4/CD8共同培养体系中，用抗IL-10以剂量依赖性方式恢复E7特异性CD8+T细胞IFN-γ分泌，而不改变T细胞增殖(图3A)。这些结果验证了本发明者的以下发现：在IL-10存在下激活的E7TCR能够通过增殖进行应答，但无法产生IFNγ。接着，他们研究了在L1VLP初免小鼠中通过给予抗-IL10受体抗体阻断IL10受体中和IL-10的体内作用可否恢复对L1E7的E7特异性IFN-γ应答。在用L1E7 VLP免疫时给予用L1VLP初免的小鼠IL-10受体的阻断抗体或大鼠血清。在接受抗-IL-10R的小鼠中，而非接受正常大鼠血清的小鼠中观察到IFN-γ分泌性E7特异性CD8 T细胞，表明尽管之前用L1初免过，但临时中和IL-10仍可通过L1E7诱导E7特异性IFN-γ分泌性CD8 T细胞(图3B)。
实施例2
通过中和IL-10产生新的促炎应答
材料和方法
免疫小鼠
用50μg HPV16E7和10μg QuilA免疫小鼠。一些小鼠也经腹膜内接受0.3mg抗-IL-10受体抗体形式的IL-10抑制剂。
皮肤移植物
手术切除供体K14E7小鼠的整个耳朵(HPV16E7仅在上皮细胞中表达)，分离背面和腹面。将转基因移植物接种在C57BL/6小鼠侧面，用抗生素浸透的凡士林纱布固定位置(Bactigrass，Smith和Nephew，London)，覆上微孔带和弹性绷带(CoFlex；Andover，Salisbury，MA)7天，如果在第7天粘附并血管化，则认为在技术上成功。在研究期间每周观察皮肤移植物3次，表1的数据小结了移植后第14天的移植物情况。
结果和讨论
本发明者以前确定过，幼稚同源动物不会排斥由角蛋白14(K14)启动子表达E7的皮肤移植物，没有证据显示发生炎性反应或诱导出可测定的对E7的全身免疫力。免疫携带此移植物的动物能诱导对E7的免疫力(可测定其抗体)、延迟型超敏(DTH)和E7特异性CTL，但对表达E7的移植物无影响(Matsumoto，K.等，2004，JNatl CancerInst 96：1611；Dunn，L.A.，M等，1997，Virology 235：94)。然而，该移植物易被E7特异性CTL排斥，因为可通过106个E7 TCR转基因T细胞被动转移加上E7免疫实现排斥。
本发明者利用此皮肤移植物模型来证明，同时给予E7疫苗和IL-10抑制能否增强对HPV 16的E7蛋白抗原的免疫应答。具体说，他们用E7(HPV16L1 E7 VLP)和任选的抗-IL-10受体抗体免疫携带K14E7移植物的动物，观察到这种免疫诱导的炎性反应。表1所示结果显示，同时给予IL-10抑制剂能显著提高携带E7的移植物中的局部炎性反应。具体说，如此处理的8只小鼠中，有2只的移植物发生部分移植物排斥(2只动物)和严重炎症，而没有给予IL-10抑制剂时，没有观察到移植物排斥反应，并且仅有少数动物发生炎症(10只动物中＜1只)。
表1
  第1组   第2组
接受者数量移植物50μg E7gst10μg QuilA0.3mg抗-IL-10R抗体第14天对移植物的部分排斥   4K14E7是否0   8K14E7是是2
上述结果证明，与仅用E7免疫的对象相比，E7免疫加IL-10中和能产生更强的E7特异性免疫应答。同时，由于此模型的排斥反应取决于E7特异性CTL，这些结果也证明，在给予E7疫苗时中和IL-10能增强E7特异性CTL应答。
将本文引用的所有专利、专利申请和发表物的全部内容纳入本文作参考。
在本文中对任何参考文献的引用不应认为是承认该参考文献是本申请的“现有技术”。
整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方式，而不是将本发明限制于任何一种实施方式或特定特征的集合。因此，本领域技术人员根据本公开应理解，可以在不超出本发明范围的情况下对所述的具体实施方式进行各种修改和改变。所有这些修改和改变应包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (29)

1.一种在对象中刺激对靶抗原产生免疫应答的组合物，所述对象没有接触过所述靶抗原或之前对所述靶抗原产生过免疫应答，所述组合物含有能刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激物和IL-10功能抑制剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述免疫刺激物选自对应于所述靶抗原的至少一部分的抗原、能与所述靶抗原发生免疫反应的抗原结合分子和能刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激细胞。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述靶抗原与感兴趣的疾病或病症有关。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述靶抗原由病原生物体或癌产生。
5.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述对应于所述靶抗原的至少一部分的抗原是可溶形式。
6.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述对应于所述靶抗原的至少一部分的抗原是颗粒或细胞。
7.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述对应于所述靶抗原的至少一部分的抗原由抗原递呈细胞递呈。
8.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述免疫调节剂是抗原结合分子，其结合于所述靶抗原或与其相互作用，以降低其水平或功能活性。
9.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述免疫刺激细胞是免疫效应细胞。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述免疫效应细胞选自抗原特异性T淋巴细胞。
11.如权利要求1所述的组合物，还含有至少一种其它免疫刺激物，所述免疫刺激物能刺激或增强对该靶抗原或多种靶抗原的免疫应答。
12.如权利要求1所述的组合物，其中，所述对象之前对所述靶抗原产生过免疫应答，所述免疫刺激物含有对应于所述靶抗原的抗原，其中，所述对应抗原的氨基酸序列与至少所述部分的氨基酸序列相同。
13.如权利要求1所述的组合物，其中，所述对象之前对所述靶抗原产生过免疫应答，所述免疫刺激物含有对应于所述靶抗原的抗原，其中，所述对应抗原的氨基酸序列与至少所述部分的氨基酸序列不同，不同之处在于加入、缺失或取代了至少一个氨基酸残基。
14.如权利要求12或13所述的组合物，其特征在于，所述对应抗原是所述对象已对其产生过免疫应答的天然产生的抗原。
15.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述IL-10功能抑制剂选自可溶性或缺陷型IL-10受体或其片段、表达IL-10受体或其片段的细胞、能与IL-10或IL-10受体发生免疫反应的抗原结合分子、抑制IL-10基因的表达或IL-10表达产物的功能活性的核酸、或者IL-10的小分子抑制剂。
16.如权利要求1所述的组合物，还含有药学上可接受的运载体或稀释剂。
17.如权利要求1所述的组合物，还含有提高免疫刺激的有效性的佐剂。
18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述佐剂将所述抗原递送给I类主要组织相容性途径。
19.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述佐剂选自含皂苷的化合物或介导将抗原递送给靶细胞胞浆的溶细胞素。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述溶细胞素连接于或结合于所述抗原。
21.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述溶细胞素介导将抗原从液泡转移至抗原递呈细胞的胞浆中。
22.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述溶细胞素是李斯特菌溶细胞素。
23.一种在未接触过靶抗原或以前对靶抗原产生过免疫应答的对象中刺激免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的能刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激物和IL-10功能抑制剂。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述免疫应答是治疗或预防与对象中靶抗原的存在或异常表达有关的疾病或病症所需的。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症选自致病性感染、以免疫缺陷为特征的疾病或癌症。
27.如权利要求23所述的方法，还包括给予有效量的至少一种其它免疫刺激物和任选的有效量的至少一种其它IL-10功能抑制剂，从而维持或增强对靶抗原的免疫应答。
28.IL-10功能抑制剂和刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激剂在制备刺激或增强针对所述靶抗原的免疫应答的药物中的应用。
29.IL-10功能抑制剂和刺激或增强对靶抗原的免疫应答的免疫刺激剂在制备治疗或预防与所述靶抗原的存在或异常表达有关的疾病或病症的药物中的应用。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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