CN101183108A

CN101183108A - 一种间接竞争法检测微量氧化低密度脂蛋白胶体金试纸条

Info

Publication number: CN101183108A
Application number: CNA2007102020847A
Authority: CN
Inventors: 李红玉; 陈瑜
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2007-10-16
Filing date: 2007-10-16
Publication date: 2008-05-21

Abstract

本发明提供一种间接竞争法检测微量氧化低密度脂蛋白胶体金试纸条。该试纸条采用竞争法，在金标抗体垫包被一定量的金标抗体，在检测区包被氧化低密度脂蛋白。通过观察检测区是否显色，从而检测人血清或血浆中存在的氧化低密度脂蛋白是否高于正常水平。本发明能方便，快速，直观的进行氧化低密度脂蛋白的检测，从而对动脉粥样硬化疾病的早期诊断提供了可靠的依据。

Description

一种间接竞争法检测微量氧化低密度脂蛋白胶体金试纸条

一.技术领域：

本发明涉及氧化低密度脂蛋白的检测，具体涉及一种检测氧化低密度脂蛋白的胶体金试纸。

二.背景技术：

据美国心脏学会2001年的最新统计数据，心血管疾病已成为人类的头号杀手。而动脉粥样硬化是大多数心脑血管疾病发生的前期病理基础，故研究动脉硬化的发病机理、诊断和防治方法已经成为医学界研究的热点。

脂蛋白是血浆胆固醇和甘油三酯的主要载体。低密度脂蛋白(LDL)是由磷脂，载脂蛋白(Apo)B多肽链，胆固醇，甘油三酯，碳水化合物等组成。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是经LDL氧化修饰形成的。近年来人们发现oxLDL与动脉粥样硬化有密切的关系。oxLDL促使泡沫细胞的形成，而泡沫细胞的死亡将导致脂类在动脉壁的沉积，这是导致动脉粥样硬化的主要病因之一。最近研究表明，在动脉粥样硬化病灶中发现了oxLDL沉积，而正常动脉壁中没有，此属于动脉粥样硬化病灶的特有成分。因此，患者体内的oxLDL量远高于正常人，其浓度与病变范围呈比例。临床认为健康人体内oxLDL的含量为200-500μg/L，而当临床检测oxLDL含量大于600μg/L时为异常。因此oxLDL的检测对动脉粥样硬化心血管病的预警及早期辅助诊断具有重要意义。

目前检测oxLDL的方法很多，最常用的方法是采用oxLDL单抗或多抗的酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清oxLDL的含量。该法的缺陷为：操作过程相对复杂，需要特殊的仪器如酶标仪来进行操作，需要专业的检验人员进行操作；操作时间较长，整个过程需要超过一个小时；检测费用较高，且不能实现单人分检测等。

胶体金免疫层析技术作为一种快速临床诊断技术，其特点是单分检测，方便快捷，除商品试剂外无需任何仪器设备，几分钟即可肉眼观察结果，且保质期长。

中国专利200510200394.6公开了一种氧化低密度脂蛋白胶体金试纸条，其根据氧化低密度脂蛋白抗体捕获抗原的量建立颜色对浓度的关系。然而，肉眼对颜色深浅的辨别存在一定局限，因此对此种检测法半定量功能的灵敏度形成一种限制，且可能根据个人对颜色深浅的辨别不同，产生个体差异。

本发明的目的在于提供一种不需特殊仪器设备，有效、快速、准确的测定低密度氧化脂蛋白的方法，通过此方法可以简单直接的判定人体内氧化低密度脂蛋白是否高于正常水平。同时有效的降低了检测成本，简化了操作过程，缩短了检测时间。

三.发明内容：

本发明通过竞争法建立一种测定人体中氧化低密度脂蛋白含量的方法。通过对检测区颜色的有、无，判定人体内氧化低密度脂蛋白是否高于正常水平。从而实现了动脉粥样硬化心血管疾病的预警及早期辅助诊断。

本发明包括基本支持片，以及在所述基本支持片上依次排列的样品吸收垫，金标抗体垫，层析显色膜及吸水垫。

基本支持片为一面涂有不干胶的不吸水韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样品吸收垫为无纺布或者玻璃纤维素膜。

金标抗体垫设置有玻璃纤维素膜，该玻璃纤维素膜包被有金标抗体。上述金标抗体为一定量的鼠源抗氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体或者多克隆抗体。

层析显色膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。显色区上依次设立检测带和质控带。检测带包被有作抗原用氧化低密度脂蛋白。质控带包被有第二种动物抗鼠的IgG。

吸水垫为滤纸或玻璃纤维素膜。

本发明的原理是玻璃纤维素膜上包被一定量的金标抗体，检测带上包被的氧化低密度脂蛋白与样品中的氧化低密度脂蛋白成竞争关系。待测样品中氧化低密度脂蛋白与金标抗体结合，形成金标抗原抗体结合物。金标抗原抗体与未结合抗原的金标抗体由于毛细作用沿层析膜层析到检测带。如果检测带不显色，则证明样品中的氧化低密度脂蛋白超过了限定值，即金标抗体全部跟样品中的氧化低密度脂蛋白结合而无法与检测带上的氧化低密度脂蛋白结合。如果检测带显色，则证明样品中的氧化低密度脂蛋白浓度未达到限定值，未结合样品中氧化低密度脂蛋白的金标抗体与检测带上的氧化低密度脂蛋白结合显色。

本发明具有以下优点：

1.检测准确率高，特异性强。

2.检测快速：仅需要5分钟即可观察结果。

3.携带方便，操作简单：检测不需要任何特殊的仪器或设备，操作步骤简单，便于医护人员携带，也可供常年病患者自我检测与监控，从而达到预警作用。

4.氧化低密度脂蛋白检测试纸制作工艺简单，成本低。

5.胶体金试纸可常温下保存，无需特殊仪器及设备。保存期达一年，重复性好。

四.附图说明：

图一为本发明结构的正面示意图和侧面示意图。图一中1为吸水垫，2为质控带，3为检测带，4为层析显色膜，5为金标抗体垫，6为样品吸收垫，7为基本支持片，如PVC板等。

图二为本发明的使用结果说明图。图二中a质控带显色而检测带不显色，为阳性结果，表明样品中氧化低密度脂蛋白含量高于或等于600μg/L，患病；b质控带和检测带均显色，为阴性结果，表明样品中氧化低密度脂蛋白含量低于正常值μg/L，正常；c质控带和检测带均不显色，表明试纸条失效。

五.具体实施方案：

实施例一

氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的制备

用oxLDL(购自北京协和三友科技开发公司)免疫小鼠。取已免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞。挑选阳性高的杂交瘤细胞进行克隆，制备单克隆杂交瘤细胞。持续培养20代，筛选并最终建立可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

采用接种杂交瘤细胞至小鼠腹腔的方法制备腹水，再从腹水中提取抗体的方法制备单克隆抗体。

实施例二

胶体金制备及标记单克隆抗体的方法

采用柠檬酸三钠还原法制取胶体金颗粒。取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶2ml，继续煮沸约5min，出现酒红色。静置冷却，这样制成直径约20nm的胶体金颗粒。

采用凝聚比色法测定胶体金最适结合蛋白量。以0.1Mol/L K₂CO₃调节胶体金pH为9.0，分装于十管，每管1ml。梯度稀释蛋白浓度后，分别加入上述十管中，每管加1ml。5min后，在上述各管中加入1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，测其OD值。根据OD值可观察得出稳定1ml胶体金所需要的抗体量。

使用胶体金颗粒标记抗体。胶体金和一定浓度的抗体溶液分别以0.1Mol/L K₂CO₃调pH至9.0。电磁搅拌抗体溶液，逐滴加入胶体金溶液。继续搅拌10min，加入5％的稳定剂牛血清白蛋白(BSA)以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，再搅拌10min。

用超速离心法纯化胶体金标记的抗体。用1200r/min离心20min，去除大的聚合物(可根据情况省略此步)。用13000g，4℃离心40min，仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PBS液(含0.02％NaN₃)重悬，反复离心3次。将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。如在结合物内加50％甘油可贮存于20℃保存一年以上。

实施例三

检测氧化低密度脂蛋白胶体金试纸条的制备及组装

样品吸收垫：将玻璃纤维裁剪成1.9cm×30cm大小备用。

金垫：将切成0.5mm×30cm的玻璃纤维浸泡于一定浓度的金标抗体溶液中2小时，37℃干燥1小时，密封，4℃保存备用。

层析膜：采用硝酸纤维素膜或者醋酸纤维素膜，裁剪成2.5cm×30cm大小。离膜下端1cm处包被一定浓度的氧化低密度脂蛋白作为检测带，带宽为2mm，向上间隔0.5cm处包被1mg/ml动物抗鼠(多为羊抗鼠)的IgG作为质控带。自然阴干后，用含1％BSA，0.01mol/L，pH7.4的PBS封闭2h，室温阴干，密封备用。

吸水垫：将玻璃纤维拆剪成4cm×30cm大小备用。

将吸水垫，层析膜，金垫和样品吸收垫从上至下依次重叠贴于PVC板上，重叠处约2mm宽。并从层析膜下端2mm处开始，包括金垫和部分吸收垫，用胶带固定相互之间的连接，并贴上MAX线标贴。然后给吸水垫表面贴上色标贴。最后，将切成4mm的试纸条密封，放入干燥剂保存。

实施例四

胶体金试纸条的使用细则

采样：于晨起7至10时空腹抽前臂血，立即加入抗氧化剂，以防低密度脂蛋白在体外继续被氧化。离心后取血浆备检。

检测：检测前将试纸连包装取出，室温放置5min左右，取出试纸。将样品吸收垫浸入样品溶液中，液面不要超过MAX线标贴，或者平放试纸条于洁净的工作台上，滴加样品溶液至样品吸收垫上。10分钟后肉眼观察结果。

观察：如果检测带不显色，质控带显色则证明样品中的氧化低密度脂蛋白超过了限定值，为阳性。如果检测带显色，质控带显色则证明样品中的氧化低密度脂蛋白浓度未达到限定值，为阴性。如果检测带和质控带均不显色，则证明试纸条实效。

Claims

1.一种半定量检测微量氧化低密度脂蛋白胶体金试纸条，该试纸条包括基本支持片，以及在基本支持片依次排列的吸水垫，层析膜，金垫和样品吸收垫。其特征在于固定只能结合约600μg/L浓度的金标抗体于金垫上，采用间接竞争法，使固定于层析膜上的氧化低密度脂蛋白与待测样品中的氧化低密度脂蛋白竞争显色。

2.根据权利要求1所述的一种半定量检测微量氧化低密度脂蛋白胶体金试纸条，其特征在于显色区上依次设立检测带和质控带。检测带包被有作抗原用氧化低密度脂蛋白。质控带包被有第二种动物抗鼠的IgG。金标抗体为一定量的鼠源抗氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体或者多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的一种半定量检测微量氧化低密度脂蛋白胶体金试纸条，其特征在于基本支持片为一面涂有不干胶的不吸水韧性材料，如PVC板。吸水垫为滤纸或玻璃纤维素膜。层析膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。金垫为玻璃纤维素膜，该玻璃纤维素膜包被有金标抗体。样品吸收垫为无纺布或者玻璃纤维素膜。

4.根据权利要求1所述的一种半定量检测微量氧化低密度脂蛋白胶体金试纸条，其特征在于该试纸条可半定量检测人血清或血浆氧化低密度脂蛋白含量，从而应用于动脉粥样硬化性心血管病的早期辅助临床诊断。