CN111965366B - 一种唾液快速检测外泌体肌钙蛋白的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种唾液快速检测外泌体肌钙蛋白的免疫层析检测试纸，包括样品垫区、抗体区、微流控纸芯片区、金标垫区、硝酸纤维素膜区、吸水垫区，各个区域依次连接。本发明的免疫层析检测试纸可以快速的检测出唾液外泌中的肌钙蛋白，不依赖于仪器和设备，即可通过检测试纸判定是否患有急性心肌梗死。本发明的试纸在诊断同时还能对人群中肌钙蛋白的含量15mg/mL，50mg/mL，100mg/mL做出区分，能够准确判断出高危人群。本发明不仅缩短了检测时间，还提高检测的精准度，实现了移动检测和家庭自助式检测。

Description

一种唾液快速检测外泌体肌钙蛋白的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种唾液快速检测外泌体肌钙蛋白的方法及试剂盒。

背景技术

心血管疾病(CVD)是全球健康的“第一杀手”，心血管疾病每年导致30％(2008年为1730万人)的死亡，预计到2030年将进一步增加，达到2330万人。心血管疾病80％为冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)，而急性心肌梗死是冠心病中的最严重的一种。急性心肌梗死，(acute myocardial infarction,AMI)是冠状动脉出现急性阻塞，心脏持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，使得心脏功能受损的一种危及生命的急性病症，属于急性冠脉综合征范畴。《中国心血管病报告2018》指出，中国心血管病患病率及死亡率仍处于上升趋势、且年轻化，目前，我国心血管病现患人数为2.9亿，死亡率居首位，占居民疾病死亡构成的40％以上，每37秒就有一个人死于急性心肌梗死。中国城市和农村居民冠心病死亡率继续保持2012年以来的上升趋势，农村地区冠心病死亡率上升趋势明显。从2009年起，农村心血管病死亡率持续高于城市水平。2016年，农村心血管病死亡率为309.33/10万，城市心血管病死亡率为265.11/10万，农村和城市心血管病死亡占全部死因的比率分别为45.5％和43.16％。

按照世界卫生组织(WHO)标准：典型的胸痛、心电图改变和心肌肌钙蛋白异常三项指标中有两项符合，即可诊断AMI。AMI在临床表现上有心绞痛与无痛两种表现，在我国AMI病人无症状约占总患病人口的25％，无典型心绞痛表现的病例约占30％，临床上一般采用心电图进行诊断，心电图诊断AMI的准确性大约60％。有确诊意义的病理性Q波常在发病6～8小时以后才出现，而目前心电图对诊断非Q波AMI缺乏特异性，不稳定心绞痛和小范围AMI难以鉴别，不典型的早期AMI不可能依靠心电图作为确诊；AMI发病后1～6小时是溶栓治疗和介入手术治疗的黄金时间，所以快速、准确诊断发病6小时内的早期AMI是决定治疗的关键环节。心肌损伤生化标志物的检测在急性心肌梗塞的诊断、监测、危险评估、预后和引导治疗等方面都起到了重要作用。现有检测肌钙蛋白(cTnI或CTNI)常用方法包括化学发光法和快速检测法(POCT)等，均是采用血液样本、是创伤性检查。因此，目前迫切需要方便采集样本且特异性高、敏感性好的诊断手段对AMI的早期诊断具有重要的临床意义。

国外Miller学者新的研究显示：可以采用唾液检测心脏病，而且唾液测试和心电图检测相结合检测AMI的准确率高达100％，唾液测定AMI准确率也达到95％(C.S.Miller,et al.JDR Clincal Research Supplement,2014,93(7):72-79)。虽然心电图是目前诊断AMI的最好方法之一，但是从心电图判断AMI的正确率只有60％，精准检测和诊断AMI是避免其带来危害的重要方面。Mohd Aizat等研究报道唾液检测AMI的临床价值，当人们患缺血性心脏病时，心肌肌肉组织会缺氧并产生心肌酶包括肌钙蛋白，这种酶通过在人体内循环流动，首先传至唾液腺(Mohd Aizat Abdul Rahim,et al.Int.J.Med.Sci.2015,12(4):329-335)。因此，唾液快速检测肌钙蛋白能够提供给AMI病人节省宝贵的时间，赢得挽救生命的黄金时间。

外泌体(exosome)可以作为心血管疾病的标志物，直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1，是由细胞主动分泌的膜性囊泡，经过"内吞-融合-外排"等一系列调控过程而形成。近年来大量国内外研究报道外泌体体现来源细胞的生理病理状态，可作为早期诊断疾病的生物标记物。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、腹水和母乳。外泌体会携带源细胞独特或关键的功能分子，导致不同来源的外泌体有不同的生物学功能。因此，根据检测外泌体所含的物质，去测定某些细胞内的某些蛋白质与核酸的变化具有可能性。目前，已经有许多疾病，包括心血管疾病、肿瘤等，可以对患者血清或血浆中的外泌体进行检测，通过一定实验和数据分析方法研究样品中的蛋白质含量，对比正常个体的样品数据实现早期诊断，为疗效判断和预后提供重要依据。

目前，差速离心法被认为是外泌体分离的金标准，但也存在一些缺点。费时费力、高度依赖人工，回收率低，由于重复离心操作很有可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量，并且易聚集成块而产生污染，对下游分析不利。目前使用免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒提取和富集外泌体的方法均有局限性，因为每个细胞分泌至少10种不同类型的纳米囊泡，很难或不可能依据相似的大小、密度和表面标记物来区分这些囊泡。因此，当今国内外学者积极探索一种能够快速、高效分离外泌体的实验方法用于急性心肌梗死的早期诊断。

201811060763.X披开的一种基于外泌体的体外即时检测平台及其检测方法，通过空滤膜分离和提取外泌体用于半定量检测肿瘤的特异性标志物。

目前在各级(大、中、小及社区医院)医院应用的化学发光技术、酶联免疫技术、飞行质谱法、胶体金免疫层析法检测肌钙蛋白标志物均采集外周血样本，在我国还没有快速分离提取和检测唾液外泌体肌钙蛋白的AMI特异性标志物的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，本发明基于半乳糖凝聚素-微流控芯片(纸芯片)的试纸快速分离纯化、提取外泌体和定量检测肌钙蛋白，从而提供一种快速检测唾液外泌体肌钙蛋白的免疫层系试纸以及试剂盒，其使用操作简单、检测方便、快速获得结果、特异性强、灵敏度高、且成本低。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现：

一种唾液快速检测外泌体肌钙蛋白的免疫层析检测试纸，包括样品垫区、抗体区、微流控纸芯片区、金标垫区、硝酸纤维素膜区、吸水垫区，其中：

样品垫区：用于滴加唾液或浸泡唾液。优选的，所述的唾液样品经过唾液样品前处理液去除了唾液中的高丰度蛋白和黏蛋白。

抗体区：所述抗体区上包被半乳糖凝聚素3抗体，用于第一步富集和分离唾液外泌体，所述包被半乳糖凝聚素3抗体区与所述样品垫区连接。抗体区上包被的半乳糖凝聚素3抗体与唾液外泌体上的糖蛋白(半乳糖凝聚素3抗原)进行富集与分离唾液外泌体。

芯片区：所述芯片区上设有微流控纸芯片，用于进一步分离纯化并得到尺寸小于200-250nm的唾液外泌体，所述微流控纸芯片区与包被半乳糖凝聚素3抗体区连接。

金标垫区：所述金标垫区上设有被胶体金颗粒标记的肌钙蛋白抗体，被胶体金颗粒标记的肌钙蛋白抗体与唾液中外泌体上的肌钙蛋白抗原结合，所述金标垫区与所述微流控纸芯片区连接。

硝酸纤维素膜区：所述硝酸纤维素膜区上设有检测T线和质控C线，多组T线用于检测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量；C线作为控制线，所述硝酸纤维素膜粘贴区与所述金标垫区连接。

优选地，所述的微流控纸芯片(称纸芯片)使用高分子聚合物材料：包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯、滤纸。

优选地，所述微流控纸芯片上设有亲/疏水微细通道网络，并与层析纸相连接。

优选地，所述微流控纸芯片上设有亲/疏水微细通道网络，并与层析纸相连接。在微流控纸芯片中间设计直径为200-250nm的圆孔，提取和纯化外泌体，分离大于200-250nm的蛋白及杂质。同时，选用硝基纤维滤膜作为纸芯片的基底。

优选地，所述金标垫区被颗粒标记的抗体中的颗粒为胶金体或纳米金或荧光材料中的任一种。

优选地，所述T线的划线抗体为双抗夹心抗体；所述C线的划线抗体为被标记的羊抗兔抗体。

优选地，所述T线有三组T线(71，72，73)检测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量为15～100mg/mL。

优选地，所述T线(71)上测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量为15mg/mL；所述T线(72)上测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量为50mg/mL；所述T线(73)上测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量为100mg/mL。

本发明的有益效果为：本发明的免疫层析检测试纸可以快速的检测出唾液外泌中的肌钙蛋白，不依赖于仪器和设备，即可通过检测试纸判定是否患有急性心肌梗死。本发明的试纸在诊断同时还能对人群中肌钙蛋白的含量15mg/mL，50mg/mL，100mg/mL做出区分，能够准确判断出高危人群。本发明不仅缩短了检测时间，还提高检测的精准度，实现了移动检测和家庭自助式检测。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种检测唾液外泌体肌钙蛋白试纸的主视图。

图2为本发明实施例提供的一种检测唾液外泌体肌钙蛋白试纸的俯视图。其中：1.样品垫区，2.包被半乳糖凝聚素3区，3.微流控纸芯片区，4.金标垫区，5.硝酸纤维素膜区，6.吸水垫区，7.T线区，第一T线：7.1，第二T线：7.2，第三T线：7.3，8.C线区。

图3为本发明实施例提供的一种试纸检测唾液外泌体肌钙蛋白的特异性和敏感性。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1

配制唾液样品前处理液，具体的内容包括：将0.2422g的0.01～0.2mol/L Tris溶于100ml蒸馏水中；然后加入0.149g的0.4％EDTA和0.16g的SDS，再加入交联聚乙烯吡咯烷酮(crospovidone，USNF)10～100mg，1％～5％BSA，HCl调节pH值为7.0～8.0。即为唾液样品前处理液。

由于唾液中水分占99％，富含多种蛋白质如ɑ-淀粉酶、黏蛋白、富组蛋白、免疫球蛋白、胱蛋白、细胞等，所以需要经过使用唾液样品前处理液来处理唾液。通过去除了唾液的高丰度蛋白和黏蛋白，减少相关蛋白的团聚和唾液外泌体的粘附，解决了唾液样品粘稠、含有多种干扰物质等阻碍因素从而大大提高外泌体的提取效率。

收集唾液1～2ml放于2mL密封朔料管中，管内含有唾液样品前处理液，充分摇匀后，用吸管滴加(2滴或3滴)在试纸条上或将试纸条浸泡在朔料管唾液之中，5～10后可观察到试纸条上出现红色的检测结果。

实施例2

本实施例提供一种检测唾液外泌体肌钙蛋白试纸及其制备方法，本实施例试纸由以下部件组成：

1.样品垫(1)为2.5cm×0.4cm的玻璃纤维，包括半乳糖凝聚素3区(2)和微流控纸芯片(3)区；

2.金标垫(4)为0.4cm×0.4cm的含有胶体金标记的肌钙蛋白单抗的聚酯膜；

3.硝酸纤维素膜(5)尺寸为2.5cm×0.4cm，依次包被肌钙蛋白单克隆抗体，羊抗鼠IgG，二者间隔4mm，分别形成检测线T1(7.1)，T2(7.2)，T3(7.3)和质控线C(8)；

4.吸水垫(6)为2.7cm×0.4cm的吸水滤纸；

按照由1-7的顺序依次组织：样品垫(1,2,3)为加样区，金标垫(4)肌钙蛋白单抗区，硝酸纤维素膜为反应区(5,7,8)，即形成了肌钙蛋白检测试纸条，胶体金免疫层析法。

具体制备方法如下：

(1)制作样品垫及包被半乳糖凝聚素3抗体：

样品垫和包被半乳糖凝聚素3抗体区的制备方法：将100μl半乳糖凝聚素3抗体喷涂于1.5cm×0.4cm的玻璃纤维上，37℃，烘干8～24小时，得到样品垫和半乳糖凝聚素3抗体包被区。铝箔袋密封，室温保存备用。

当唾液样品与包被半乳糖凝聚素3抗体结合后，第一步先富集和分离唾液外泌体。

(2)制作微流控纸芯片区

微流控纸芯片结构：为正方形纸芯片5cm×5cm，紧贴样品垫，中间有孔直接为200-250nm，微流控纸芯片使用高分子聚合物材料：包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯、滤纸、高聚物等材料。

由于流道图案区域仍为滤纸，纸的主要组分纤维素使溶液通过毛细作用流动，为亲水区域，不需要外接驱动泵，因此检测的溶液可在滤纸的亲水区域流动；流道图案以外的区域涂胶后通过曝光形成交联网络，固定在滤纸上形成疏水区，溶液无法浸润流动，所以溶液仅沿着设计的流道区域流动。

本发明使用的微流控纸芯片是由香港城市大学捐赠。市场上也有商品化的微流控纸芯片出售。可以从苏州汶灏微流控技术股份有限公司购买或定制微流控纸芯片。

所述微流控纸芯片用于进一步分离纯化并得到尺寸小于200nm的唾液外泌体。纸芯片微流道为200nm～250nm，微流控纸芯片采用硝酸纤维滤膜作为基底代替硅、玻璃、高聚物等材料，通过各种加工技术，纸芯片是在纸上加工出具有一定结构的亲/疏水微细通道，可以分离、提取和纯化外泌体，是微流控分析系统的一种。纸芯片黏贴在玻璃纤维上，制作为微流控纸芯片。与普通的微流控芯片相比，成本低、制备简便、无需复杂外围设备，能够进行一次性、价格低廉、便携式的分析，是目前作为现场实时诊断(POCT)的发展趋势。

(3)制作金标垫

本实施例中，肌钙蛋白单克隆抗体采用鼠抗人的肌钙蛋白单克隆抗体，具体操作制备方法如下：

取10mL制备好的胶体金溶液，用1.0％K₂CO₃调pH值至8.2后，吸取1mg/mL肌钙蛋白单克隆抗体120μL，缓慢加到胶体金溶液中，摇匀后静置30min。加入10μL 1％的PEG20000，摇匀，再加入10μL 10％的BSA，摇匀静置，离心，取沉淀物，用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的10％复溶。把1ml的复溶好的胶体金标记物喷涂于0.4cm×0.4cm金标垫的聚酯膜上，37℃，烘干8～24小时，铝箔袋密封，室温保存备用。

经实验确定肌钙蛋白单克隆抗体胶体标记的其最佳结合pH值为8.2，胶体金和抗体的配比为12μg/ml胶体金。

所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/L Tris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％～3％海藻糖，1％～5％蔗糖，0.1％～2％曲拉通X-100，0.1％～0.5％土温-20，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0，4℃条件下避光保存备用。

(4)制备反应膜

用抗体稀释液将肌钙蛋白单克隆抗体稀释浓度分别为浓度0.3～1.5mg/mL、0.5～3mg/mL、1.0～5.0mg/mL，将羊抗鼠IgG稀释为浓度为0.2～1.2mg/mL，喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测T线71，72，73和质控C线(8)。T线与C线间隔4mm。然后分别加入到划膜喷金仪的T杯和C杯中；调试划膜喷金仪，喷液量设定为1.0μL/cm。调试完成后，划膜包被，形成检测线T：71,72,73分别对应的肌钙蛋白含量为15mg/mL，50mg/mL，100mg/mL和质控线C，37℃，烘干8～24小时；待检验合格后铝箔袋密封，室温存放备用。

(5)制备本发明的免疫层析试纸条

实施例3

本发明采用免疫层析试纸检测唾液外泌体肌钙蛋白的含量，该技术原理应用特异性免疫反应双抗体夹心法。其检测方法为：(1)当测试唾液浸泡或滴入试纸条的样品垫后，通过吸水纤维的毛细作用，包被半乳糖凝聚素3抗体区，测试唾液迅速湿透金标垫，金标垫上的胶体金结合肌钙蛋白抗体被溶解，并随测试液一起沿层析材料向前移动。(2)若测试唾液中存在待测抗原，它将与胶体金结合肌钙蛋白抗体发生特异性免疫反应，形成胶体金结合肌钙蛋白抗体-待测抗原的免疫复合物。微流控纸芯片区，然后随测试唾液一起流经固定在硝酸纤维素膜上T线的捕获试剂。(3)T线的捕获试剂捕获胶体金结合肌钙蛋白抗体-待测抗原免疫复合物，即与该免疫复合物发生特异性免疫反应，形成胶体金肌钙蛋白抗体-待测抗原-捕获试剂的免疫复合物，从而使胶体金肌钙蛋白抗体-待测抗原免疫复合物滞留在T线处。(4)测试唾液继续前移，在流经硝酸纤维素膜上固定有羊抗鼠IgG抗体的质控C线时，未与待测抗原发生反应的胶体金肌钙蛋白抗体与C线上羊抗鼠抗体发生免疫反应，从而使得游离的胶体金肌钙蛋白抗体滞留在C线处。此时T线和C线处均有胶体金肌钙蛋白抗体滞留，即T线和C线处均能观察到红色，则表示检测结果为阳性结果，即测试唾液中有待测抗原；若仅C线处观察到颜色，而T线处未观察到颜色，则表示检测结果为阴性结果，即测试液中无待测抗原；(5)待测唾液中肌钙蛋白含量不同，分别在T线71，或72，或73线出现红色，71，或72，或73线分别相对应的肌钙蛋白含量为15mg/mL，50mg/mL，100mg/mL。(6)当测试唾液浸泡或滴入试纸条的样品垫5～10分钟后，肉眼就能直接观察C、T线的出现情况，即可判断定量检测结果。

本发明检测试纸的灵敏度可达10mIU/ml，定量范围为10～10000mIU/ml。采用本发明的检测试纸检测50份AMI临床样本，以罗氏化学发光定量检测肌钙蛋白为对照，结果表明本发明专利的灵敏度10mIU/ml，特异性100％，与罗氏化学发光定量检测肌钙蛋白结果相比较：在50例AMI病人中，化学发光有8例检测结果显示正常，与临床诊断AMI的符合率为84％；而本专利检测50例AMI病人中唾液外泌体肌钙蛋白均显示异常结果，与临床诊断AMI的符合率为100％(见图3)。

以上结果说明本发明提供的检测试纸条检测，以人体唾液为检测样本，有效监测唾液中外泌体的肌钙蛋白，最低检出量达到10mg/L。本发明的肌钙蛋白检测试纸条在诊断迅速的同时能对人群中肌钙蛋白的含量＜15mg/mL，50mg/mL，100mg/mL做出区分，能够准确判断出高危人群。该试纸条操作简单、具有直观、快速、检测效率高、方法简便、无污染、费用低廉、灵敏度高、特异性强等优点，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，被广泛应用于临床现场检测(POCT)、野外现场及家庭自我检测。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种唾液快速检测外泌体肌钙蛋白的免疫层析检测试纸，其特征在于，包括样品垫区、抗体区、微流控纸芯片区、金标垫区、硝酸纤维素膜区、吸水垫区，其中：

样品垫区：用于滴加唾液或浸泡唾液；唾液样品经过唾液样品前处理液去除了唾液中的高丰度蛋白和黏蛋白；所述唾液样品前处理液的制备方法为将0.2422g的0.01～0.2mol/L Tris溶于100 ml蒸馏水中，加入0.149g的0.4％EDTA和0.16g的SDS，再加入交联聚乙烯吡咯烷酮10～100mg，1％～5％BSA，加入HCl调节pH值为7.0～8.0；

抗体区：所述抗体区上包被半乳糖凝聚素3抗体，用于第一步富集和分离唾液外泌体，所述包被半乳糖凝聚素3抗体区与所述样品垫区连接；

芯片区：所述芯片区上设有微流控纸芯片，用于进一步分离纯化并得到尺寸小于200-250nm的唾液外泌体，所述微流控纸芯片区与包被半乳糖凝聚素3抗体区连接；

金标垫区：所述金标垫区上设有被胶体金颗粒标记的肌钙蛋白抗体，被胶体金颗粒标记的肌钙蛋白抗体与唾液中外泌体上的肌钙蛋白抗原结合，所述金标垫区与所述微流控纸芯片区连接；

硝酸纤维素膜区：所述硝酸纤维素膜区上设有检测T线和质控C线，多组T线用于检测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量，C线作为控制线；所述硝酸纤维素膜粘贴区与所述金标垫区连接；

所述微流控纸芯片上设有亲/疏水微细通道网络，并与层析纸相连接；在微流控纸芯片中间设计直径为200-250nm的圆孔，用于提取和纯化外泌体，分离大于200-250nm的蛋白及杂质，硝基纤维滤膜作为纸芯片的基底；

所述T线有三组T线（71，72，73）检测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量为15~100mg/ml。

2.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸，其特征在于，所述的微流控纸芯片使用高分子聚合物材料：包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、滤纸。

3.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸，其特征在于，所述T线的划线抗体为肌钙蛋白单克隆抗体；所述C线的划线抗体为羊抗鼠IgG。

4.如权利要求1所述的免疫层析检测试纸，其特征在于，所述T线（71）上测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量为15mg/mL；所述T线（72）上测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量为50mg/mL；所述T线（73）上测唾液中外泌体上的肌钙蛋白含量为100mg/mL。

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