CN101173306A - 汽爆秸秆膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用膜反应器进行汽爆秸秆循环酶解并耦合丙酮丁醇连续发酵的方法。该方法利用中空纤维膜装置进行汽爆秸秆原料的循环酶解，所得到的酶解液连续进入发酵罐中，不断补充营养和稀释产物，使微生物保持在高活性的状态，同时有效避免了酶解和发酵的产物抑制。膜循环装置使得纤维素酶能够被重复利用，大大降低了酶制剂的成本。利用该装置酶解和发酵在各自最适的条件下进行，提高了反应效率。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别涉及一种汽爆秸秆膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法。
背景技术
丙酮、丁醇是重要的食品和化工原料，传统的生产工艺多以淀粉，糖蜜等为原料，利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)发酵生产，工艺复杂，原料成本高。随着秸秆等可再生资源的开发，以秸秆为原料进行微生物发酵生产的研究也开始受到重视。秸秆是一类产量巨大，来源丰富的可再生资源，秸秆降解后产生大量的可溶性糖类，包括葡萄糖，木糖等，能够被用作丙酮丁醇梭菌发酵的良好底物。以秸秆为原料进行丙酮丁醇发酵的研究已经有很多，如Ropars等利用汽爆玉米芯酶解液制取丙酮丁醇[Ropars，et al，Bioresource technology1992；42：197-204.]，陈守文等利用稻草酶解液[陈守文等，工业微生物，1998；28(4)：30-34]制取丙酮丁醇。由于秸秆酶解的最适温度为50℃，而丙酮丁醇梭菌发酵的最适温度为35℃，因此，现有的生产方式都要经过原料预酶解，过滤得到酶解液，向酶解液中添加营养组分，灭菌等几个步骤，才能进行发酵生产，生产步骤复杂，难以实现同步酶解和连续发酵。而且，在秸秆原料酶解过程中，需要用到大量的纤维素酶，由于纤维素酶价格昂贵，用量大，因此，酶制剂的成本往往在整个生产成本中占有很大的比例，导致生产成本据高不下。而且，酶解反应还受到其它许多条件的限制，包括产物抑制，反应速率低，缺乏适合的反应器等[Sen Y，Process Biochem 2006；41：721-725]，生产效率难以提高。
此外，发酵产物中的溶剂，尤其是丁醇，会对细胞产生毒性。在丙酮丁醇梭菌发酵过程中，当发酵液中总溶剂的浓度大于1.3％时，就会对细胞产生毒害[Eric F，et al.J Chem Tech Biotech 1996；65：221-228]。有研究采用气提，液液抽提，渗透蒸发以及吸附的方法对发酵液进行在线处理[Thaddeus，BioprocessBiosystem Eng 2005；27：207-214.Qureshi N，Renewable Energy 2001；22：557-564.]，但都存在着设备复杂，成本高的问题。因此，必须改进发酵方式，提高发酵效率。
发明内容
本发明的目的是针对以秸秆为原料的丙酮丁醇发酵过程中存在的处理步骤复杂，酶制剂成本高，难以实现同步糖化发酵，产物抑制效应显著等问题，而提供一种汽爆秸秆膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法。
本发明的另一目的是提供一种膜循环酶解耦合连续发酵装置。
实现本发明目的的技术方案如下：
本发明提供的汽爆秸秆膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法，其步骤如下：
1)将汽爆秸秆料置于酶解罐中，加入用硫酸调节pH4.8的含KH2PO4、MgSO4·7H2O和酵母抽提物的蒸馏水溶液；所述汽爆秸秆原料的重量和蒸馏水溶液的体积的比例为1∶7～1∶10(w/v，下同)；同时加入纤维素酶制剂，加入量为每g汽爆秸秆添加20FPU的纤维素酶制剂；并将酶解罐置入50℃的第一水浴锅内进行酶解；
将所得酶解液透过中空纤维膜组件进入置于35℃的第二水浴锅内的发酵罐中，进行发酵；发酵过程中为了弥补由于酶解液透出而导致的酶解罐中的液体量减少，利用补液罐向酶解罐中不断补充和酶解罐中组分相同的蒸馏水溶液，调节循环泵的流速，使流入酶解罐的液体量和经由中空纤维膜渗透出的酶解液的量相同，以保持酶解罐中的上述固液比；
2)制备丙酮丁醇梭菌种子液：
将丙酮丁醇梭菌接种于种子培养基后，在35℃厌氧环境下培养至对数生长期，制得丙酮丁醇梭菌种子液；
所述种子培养基所含组分及配比为：每升种子培养基含20g葡萄糖，3g酵母抽提物，0.2g KH2PO4，1.6gK2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.1g NaCl，0.01gCaCl2，0.25g Na2S·9H2O，0.01g NaMoO4·2H2O，0.2g NaHCO3 0.2g和3.0g(NH4)2SO4；
3)开启循环泵，使酶解罐中的酶解液透过中空纤维膜组件进入发酵罐中；在进入发酵罐中的酶解液体积达到100～120ml时，关闭循环泵，向发酵罐中接种上述丙酮丁醇梭菌种子液，并迅速通入氮气除氧后，置于35℃静止培养，到对数生长期后，再次开启循环泵，稀释率为0.05～0.075h-1，进行循环酶解和连续发酵，制取丙酮丁醇。
本发明提供的汽爆秸秆膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法，所述步骤3)的循环酶解和连续发酵过程中还包括：每隔20～28h向酶解罐中补充新鲜的汽爆秸秆料，补充量为初始添加的汽爆秸秆原料重量的20～60％，同时补加新鲜的纤维素酶制剂，补加量：每克新补充的汽爆秸秆料补加8～15FPU的纤维素酶制剂。
所述汽爆植物秸秆料为汽爆玉米秸秆料、汽爆高梁秸秆料或汽爆小麦秸秆料。
所述上述步骤1)中还包括管道和发酵罐的灭菌。
所述步骤(2)中，发酵所用菌种丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)购自中国微生物保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其保藏号为CGMCCAS1.132。
所述步骤3)中空纤维膜组件和发酵罐之间通过U形管连通。
本发明的方法所使用的循环酶解耦合发酵装置的结构如下：请参见图1，该装置包括酶解罐4和发酵罐8，其特征在于，还包括补液罐3和中空纤维膜组件6；所述补液罐3顶端与酶解罐4顶端通过安装在其连接管道上的第二循环泵21相连通；所述酶解罐4顶端与中空纤维膜组件6的输入端通过安装在其连接管道上的阀门5相连通，其连接管道上还安装有第二压力表P2；所述酶解罐4底端与中空纤维膜组件6的输入端通过安装在其连接管道上的第一循环泵2相连通，其连接管道上还安装有第一压力表P1；所述中空纤维膜组件6的输出端与发酵罐8顶端通过U形管相连通；所述酶解罐4和发酵罐8分别置于第一水浴锅1和第二水浴锅9中。
本发明提供的汽爆秸秆膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法与现有制备丙酮丁醇的方法相比，具有如下优点：
1、本发明方法中的秸秆原料酶解和微生物发酵分别在各自最适宜的条件下进行，提高了酶解和发酵效率；
2、本发明方法采用中空纤维膜循环组件进行秸秆原料的酶解，水解产生的糖经中空纤维膜组件分离到发酵罐中，纤维素酶分子被膜截留，回到酶解罐中继续降解底物，有效解除了酶解产物对酶的抑制效应，并节约了纤维素酶的用量，降低了生产成本；
3、本发明的方法采用汽爆秸秆进行酶解得到酶解液连续进入发酵罐，在连续补充营养的同时对发酵液不断进行稀释，使溶剂产物的浓度保持在较低水平，避免了溶剂产物浓度过高对菌体产生毒性和抑制作用；
4、本发明的方法中的膜循环组件采用的中空纤维膜为聚砜膜，截留分子量为10,000Da，经由该膜渗透到发酵罐中的发酵液为无菌，省去了发酵过程中的灭菌过程，同时微生物发酵所需无机盐和氮源等直接添加到酶解介质中，与酶解液一起进入发酵罐，简化了操作步骤。
总之，本发明的方法利用中空纤维膜装置进行汽爆秸秆原料的循环酶解，所得到的酶解液连续进入发酵罐中，不断补充营养和稀释产物，使微生物保持在高活性的状态，同时有效避免了酶解和发酵的产物抑制；膜循环装置使得纤维素酶能够被重复利用，大大降低了酶制剂的成本；利用该装置使酶解和发酵在各自最适的条件下进行，提高了反应效率。
附图说明
图1为本发明方法使用的膜循环酶解耦合连续发酵装置的结构示意图：
其中：第一水浴锅1 第一循环泵2 补液罐3
酶解罐4 阀门5 中空纤维膜装置6
发酵罐8 第二水浴锅9 第二循环泵21
U形管11
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步说明。
实施例1.用本发明提供的方法以汽爆玉米秸秆为原料进行丙酮丁醇的制取，具体步骤如下：
1、以玉米秸秆为原料，首先进行汽爆预处理：汽爆介质为水蒸汽，向装有玉米秸秆料的汽爆罐中通入水蒸汽，使罐压力达到1.5MPa，维持6min后，立即打开阀门，使罐压迅速降至常压，得到汽爆玉米秸秆料；
向酶解罐4中加入汽爆玉米秸秆以及用硫酸调节pH4.8的含KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.5g和酵母抽提物2g的蒸馏水溶液；所述汽爆秸秆料的重量和蒸馏水溶液体积的比例为1∶7(w/v)；同时加入纤维素酶制剂，加入量为20FPU/g-汽爆秸秆；补液罐3中装入与酶解罐4组成相同组分的蒸馏水溶液；第一水浴锅1保持在50℃；
2、制备丙酮丁醇梭菌种子液：
按每升种子培养基包括以下组分的比例配制种子培养基：葡萄糖20g，酵母抽提物3g，KH2PO40.2g，K2HPO41.6g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl20.01g，Na2S·9H2O 0.25g，NaMoO4·2H2O 0.01g，NaHCO30.2g and(NH4)2SO43.0g；
将丙酮丁醇梭菌接种于所述种子培养基，在35℃厌氧条件下培养至对数生长期，即可制得丙酮丁醇梭菌种子液；
3、同时开启两个循环泵，使酶解罐中的酶解液透过中空纤维膜组件进入发酵罐中；在进入发酵罐中酶解液体积达到100ml时，关闭循环泵，向发酵罐中接种上述丙酮丁醇梭菌种子液，并迅速通入氮气除氧后，置于35℃静止培养。到对数生长期后，再次同时开启两个循环泵开始循环，稀释率为0.05h-1，酶解液连续进入发酵罐中，。
4、在汽爆秸秆循环酶解耦合发酵的过程中，每隔20h向酶解罐中补充新鲜底物，补充量为初始添加的汽爆秸秆料重量的40％，同时补加新鲜的纤维素酶制剂，补加量为10FPU/g-新鲜底物。
由于酶解罐和发酵罐容量的限制，发酵在144h结束，三种主要产物丙酮、丁醇和乙醇的产量分别为1.84g/l，5.28g/l和0.71g/l。单位底物酶解所需的纤维素酶为14FPU/g底物，与批次发酵相比，纤维素酶酶用量节约30％；发酵过程中溶剂的最高体积含量为1.20％，有效避免了对微生物的毒性。
实施例2.用本发明提供的方法以汽爆小麦秸秆为原料进行丙酮丁醇的制取，具体步骤如下：
1、以小麦秸秆为原料，首先进行汽爆预处理：汽爆介质为水蒸汽，向装有玉米秸秆料的汽爆罐中通入水蒸汽，使罐压力达到1.5MPa，维持5min后，立即打开阀门，使罐压迅速降至常压，得到汽爆小麦秸秆料；
向酶解罐4中加入汽爆小麦秸秆以及用硫酸调节pH4.8的含KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O 0.5g和酵母抽提物2g的蒸馏水溶液；所述汽爆秸秆料的重量和蒸馏水溶液体积的比例为1∶10(w/v)；同时加入纤维素酶制剂，加入量为20FPU/g-汽爆秸秆；补液罐3中装入与酶解罐4组成相同组分的蒸馏水溶液；第一水浴锅1保持在50℃；
步骤2同实施例1；
3、同时开启两个循环泵，使酶解罐中的酶解液透过中空纤维膜组件进入发酵罐中；在进入发酵罐中酶解液体积达到110ml时，停止循环，向发酵罐中接种上述丙酮丁醇梭菌种子液，并迅速通入氮气除氧后，置于35℃静止培养。到对数生长期后，再次同时开启两个循环泵开始循环，稀释率为0.06h-1，酶解液连续进入发酵罐中，。
4、在汽爆秸秆循环酶解耦合发酵的过程中，每隔24h向酶解罐中补充新鲜底物，补充量为初始添加的汽爆秸秆料重量的60％，同时补加新鲜的纤维素酶制剂，补加量为15FPU/g新鲜底物；
发酵在144h结束，丙酮，丁醇和乙醇的产量分别为1.64g/l，4.86g/l和0.63g/l，单位底物所用纤维素酶的添加量为14FPU/g底物。发酵过程中溶剂的最高体积含量为1.13％，有效避免了对微生物的毒性。
实施例3.用本发明提供的方法以汽爆高梁秸秆为原料进行丙酮丁醇的制取，具体步骤如下：
1、以高粱秸秆为原料，首先进行汽爆预处理：汽爆介质为水蒸汽，向装有玉米秸秆料的汽爆罐中通入水蒸汽，使罐压力达到1.5MPa，维持7min后，立即打开阀门，使罐压迅速降至常压，得到汽爆高粱秸秆料；
向酶解罐4中加入汽爆高粱秸秆以及用硫酸调节pH4.8的含KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O 0.5g和酵母抽提物2g的蒸馏水溶液；所述汽爆秸秆料的重量和蒸馏水溶液体积的比例为1∶8(w/v)；同时加入纤维素酶制剂，加入量为20FPU/g-汽爆秸秆；补液罐3中装入与酶解罐4组成相同组分的蒸馏水溶液；第一水浴锅1保持在50℃；
步骤2同实施例1；
3、同时开启两个循环泵使系统开始循环，当进入发酵罐中的酶解液体积达到120ml时，停止循环，向其中接种成熟的丙酮丁醇梭菌种子液，迅速通入氮气除氧后，置于35℃静止培养，到对数生长期后，再次同时开启两个循环泵开始循环，酶解液连续进入发酵罐中，稀释率为0.075h-1。
4、每隔20h向酶解罐中补充新鲜底物，补充量为初始添加的汽爆秸秆料重量的50％，同时补加新鲜的纤维素酶制剂，补加量为8FPU/g新鲜底物。
发酵在168h结束，丙酮，丁醇和乙醇的产量分别为1.82g/l，4.93g/l和0.76g/l，单位底物所用纤维素酶的添加量为14FPU/g底物。发酵过程中溶剂的最高体积含量为1.16％，有效避免了对微生物的毒性。
Claims (5)
1.一种汽爆秸秆膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法，其步骤如下：
1)将汽爆秸秆料置于酶解罐中，加入用硫酸调节pH4.8的含KH2PO4、MgSO4·7H2O和酵母抽提物的蒸馏水溶液；所述汽爆秸秆料的重量和蒸馏水溶液的体积比为1∶7～1∶10；同时，按每克汽爆秸秆料加入20FPU的加入量加入纤维素酶制剂；并将酶解罐置入50℃的第一水浴锅内进行酶解；
将所得酶解液透过中空纤维膜组件进入置于35℃的第二水浴锅内的发酵罐，进行发酵；发酵过程中为了弥补由于酶解液透出而导致的酶解罐中的液体量减少，利用从上部与酶解罐相连通的补液罐向酶解罐中不断补充和酶解罐中组分相同的蒸馏水水溶液，调节安装在所述酶解罐与中空纤维膜装置之间管路上的循环泵的流速，以保持酶解罐中的上述固液比；
2)制备丙酮丁醇梭菌种子液：
将丙酮丁醇梭菌接种于种子培养基后，在35℃厌氧环境下培养至对数生长期，制得丙酮丁醇梭菌种子液；
所述种子培养基所含组分及配比为：每升种子培养基含20g葡萄糖，3g酵母抽提物，0.2g KH2PO4，1.6gK2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.1g NaCl，0.01gCaCl2，0.25g Na2S·9H2O，0.01g NaMoO4·2H2O，0.2g NaHCO30.2g和3.0g(NH4)2SO43.0g；
3)开启循环泵，使酶解罐中的酶解液透过中空纤维膜组件进入发酵罐中；在进入发酵罐中酶解液体积达到100～120ml时，关闭循环泵，向发酵罐中接种上述丙酮丁醇梭菌种子液，并迅速通入氮气除氧后，置于35℃静止培养，到对数生长期后，再次开启循环泵，稀释率为0.05～0.075h-1，进行循环酶解和连续发酵，制得丙酮丁醇。
2.按权利要求1所述的汽爆秸秆膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法，其特征在于，所述上述步骤3)的循环酶解和连续发酵过程中还包括：每隔20～28h向酶解罐中补充新鲜的汽爆秸秆料，补充量为初始添加的汽爆秸秆料重量的20～60％，同时补加新鲜的纤维素酶制剂，补加量：每克新补充的汽爆秸秆料补加8～15FPU的纤维素酶制剂。
3.按权利要求1所述的膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法，其特征在于，所述步骤3)中空纤维膜组件和发酵罐之间通过U形管连通。
4.按权利要求1所述的膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法，其特征在于，所述汽爆植物秸秆料为汽爆玉米秸秆料、汽爆高梁秸秆料或汽爆小麦秸秆料。
5.按权利要求1所述的膜循环酶解耦合连续发酵制备丙酮丁醇的方法，其特征在于，所述上述步骤1)中还包括汽爆秸秆料制取和发酵罐的灭菌。
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