CN101126093B

CN101126093B - 一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因及应用

Info

Publication number: CN101126093B
Application number: CN2007100526888A
Authority: CN
Inventors: 高梅影; 宋玲莉; 戴顺英
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2007-07-11
Filing date: 2007-07-11
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2027-07-11
Also published as: CN101126093A

Abstract

本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因及应用，杀虫晶体蛋白质基因如SEQ ID NO.1所示的DNA序列，其编码的杀虫蛋白质如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该基因编码的杀虫蛋白质对直翅目的东亚飞蝗有特异性的毒杀作用，用该基因制备的杀蝗剂可用于危害禾本科作物如水稻、小麦、玉米、高粱和牧草等蝗虫的防治，效果好，对人和动植物安全，生产和使用成本低，不污染环境，具有巨大的应用价值。

Description

一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因及应用

技术领域

本发明涉及一种抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因，该基因编码的杀虫蛋白质对直翅目的东亚飞蝗等有活性毒性，基于该基因构建的工程菌制备的杀蝗剂可用于直翅目害虫如蝗虫等的防治，该基因在抗虫转基因植物中的用途。

背景技术

蝗虫(Locust)是世界性的重大农业害虫。蝗灾与水灾、旱灾常相间或伴随发生而成为人类历史上三大自然灾害。自80年代起，全球的蝗虫灾害进入频发阶段，除南极外，各大洲均有蝗灾发生，常年发生面积达4680万平方公里，有八分之一的人口常年受到蝗灾的袭扰。我国的蝗灾也随之加重，从1997年起，我国连续几年大面积爆发蝗灾，最高虫口密度可达到3000-10000头/m²。蝗虫中的东亚飞蝗(Locust migratoria manilensis)主要分布在东亚、东南亚地区，如中、日、菲、泰、越等国，在我国分布范围最广、成灾最频繁、最严重。蝗灾的频发，不仅给农业生产造成了重大损失，而且为了治理蝗灾，要花费大量的人力、物力和财力。目前，对于蝗虫的防治，仍然主要是采用飞机大面积喷洒化学农药或人工使用喷雾器喷洒化学农药，但是，这种大面积使用化学农药的防治方式在迅速有效地遏制蝗害的同时，也杀死了大量蝗虫的天敌，破坏了生态平衡，还使蝗虫产生抗药性，导致蝗灾的恶性循环，而且也严重污染了生态环境，给人类健康造成威胁。因此在化学防治的同时，加大生物方法治蝗力度，建立与生态友好、资源可持续利用的蝗虫治理体系和技术规范，已成为我国蝗虫防治工作的当务之急。

近50年来，采用微生物防治蝗虫发展较快。早在20世纪60年代末，美国开始研究和应用微生物----蝗虫微孢子虫防治蝗虫，到20世纪80年代初期，该项生物防治技术被列入美国防治蝗虫的计划，蝗虫微孢子虫是世界上第一个注册的防治蝗虫的生物制剂，也是世界广泛应用的治蝗生物制剂。美国注册了白僵菌用于防治蝗虫的制剂，英国和澳大利亚分别注册绿僵菌制剂，并在很多国家进行田间试验。除此之外，印度、美国成功地开发出了植物源杀虫剂-印楝素。我国是较早开展生物治蝗的国家，在明清时期就有采用养鸡、养鸭防治蝗虫的实例，而且至今仍在一些地方应用。有关蝗虫天敌的记录，可以追溯到东晋时期，距今有1700多年。然而，直到20世纪80年中期，我国才真正开展蝗虫生物防治的研究和应用。中国农业大学首先从美国引入了蝗虫微孢子虫，经过近10年的努力，在深入研究了微孢子虫致病机理、疾病传播途径和流行规律的基础上，成功地研制出了人工大量繁殖蝗虫微孢子虫的技术、防治草原蝗虫和东亚飞蝗的田间应用技术及其配套技术体系，累计示范应用1000多万亩次，取得了良好的经济效益、社会效益和生态效益，该项技术在国际上处于领先水平。中国农业科学院、重庆大学等单位开发研究了绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)制剂，经过多年室内实验后，近年来也较为广泛地开展了田间试验示范。这些微生物制剂，均可以采用喷雾或喷粉的方法施用。同时，国内也有几个厂家在生产印楝素、苦参碱等生物制剂。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)由于具有杀虫效果好，特异性强，生产和使用方便，不污染环境等特点而在害虫生物防治中发挥了重要作用。不同的Bt菌株产生不同的杀虫晶体蛋白质(Insecticidal CrystalProteins，简称ICPs)，使得菌株间的杀虫谱和杀虫活性存在明显差异。现已报道，苏云金芽孢杆菌对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等9个目的昆虫和螨类、植物线虫、原生动物、扁形动物等有特异性杀虫活性。目前，筛选高效特异性Bt菌株，发掘新的ICP基因，对菌株进行遗传改良或构建高效广谱基因工程菌是世界性的课题，也是Bt研究的发展趋势，据报道，全世界已分离出了71个H血清型84个亚种的数万株苏云金芽孢杆菌，从分离的菌株中筛选出了多株对鳞翅目和鞘翅目等害虫有毒效的菌株。在杀虫基因克隆和分类方面，自Schnepf等在1981年将苏云金杆菌库尔斯达克变种HD-1菌株的杀虫晶体蛋白质基因分离、克隆，并在1985年完成其核苷酸序列分析以来，已有380多个杀虫晶体蛋白基因被分离、克隆(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt)。Hofte和Whiteley(1989)将杀虫蛋白质命名为Cry，其编码基因为cry，在活体外具溶昆虫细胞和脊椎动物红血球细胞的蛋白质及其基因分别为Cyt和cyt；并根据杀虫谱将42种晶体蛋白质归为5类14个亚类。I类为特异抗鳞翅目昆虫；II类为特异抗双翅目和鳞翅目昆虫；III类为特异地抗鞘翅目昆虫；IV类为特异抗双翅目昆虫；V类为无毒性的结晶蛋白。随着新的基因不断被克隆和发现，人们发现有些杀虫蛋白质序列相似，但其杀虫活性却不同，而有些基因编码的杀虫蛋白质具有相同的杀虫活性，相似性却又相差很大，所以以序列相似性和生物活性划分类别的分类系统很难高度统一。1995年Crickmore等将已发现的杀虫基因按其δ-内毒素氨基酸序列的相似性确定其不同的分类等级，而与基因的生物活性无关，这个系统用计算机比较晶体蛋白氨基酸序列的相似性，以45％、78％和95％为界，将基因分为4个分类等级，同时还对新基因的命名提出了要求：(1)具有杀虫活性的杀虫晶体蛋白可以来自苏云金芽孢杆菌，也可是与已知的蛋白有明显相似序列的任何蛋白质；(2)表达的毒素蛋白必须在伴胞晶体内；(3)基因的核苷酸序列必须在主要的国际数据库中登记。由于近年来分子生物学及核酸测序技术的迅速发展，至今已经发现Cry1-Cry51及Cyt1-Cyt2共53个大类群杀虫晶体蛋白基因

然而，这些基因所编码的杀虫晶体蛋白质大多数是杀鳞翅目或鞘翅目等害虫，到目前为止，国际上还没有有关杀蝗虫的苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白质基因及其编码的杀虫晶体蛋白质的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因，该基因来源于杀蝗虫的苏云金芽孢杆菌菌株((保藏号：CCTCC M 206061))。

本发明的另一个目的在于提供了一种苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白质，该杀虫蛋白质对直翅目的蝗虫等有特异性的毒杀作用，但对人、畜和环境安全。

本发明的第三个目的在于提供了一种苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白质基因在制备防治或预防蝗虫制剂中的应用，用该基因制备的杀蝗剂可用于危害禾本科农作物如水稻、小麦、玉米、高粱和牧草等的蝗虫的防治，其特点是特异性强，不杀伤昆虫天敌，对人、畜无毒，对环境安全。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

(1)抗蝗虫苏云金芽孢杆菌菌株BTH-13的制备方法及其主要特性：

利用芽孢可耐80℃高温的特性，在80℃高温下通过弹土法分离苏云金芽孢杆菌。以东亚飞蝗为试虫，进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量LC₅₀，筛选到该高毒力菌株Bacillus thuringiensis ssp.BTH-13(菌种保藏号：CCTCCM 206061)。该菌株的细胞形态为杆状，产生椭圆形芽孢和菱形伴孢晶体蛋白质，伴孢晶体蛋白质由128kD的杀虫晶体蛋白质组成。经毒力生物测定，菌株BTH-13对东亚飞蝗等直翅目害虫有较高杀虫活性，其发酵液和晶体蛋白质经过碱和蛋白酶处理后，可明显提高抗蝗虫的活性。

(2)抗蝗虫苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因的克隆与应用：

根据苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质的氨基酸序列的五个保守序列，设计四条简并引物，用聚合酶链式反应(PCR)技术从杀蝗虫的苏云金芽孢杆菌菌株BTH-13的总DNA中扩增一个基因片段并测序。在该基因片段的两端设计两条反方向的特异性引物，用BD GenomeWalker^TM Universal Kit进行PCR扩增，分别获得约900bp和3000bp的PCR产物。PCR产物经胶回收后与载体pGEM-T Easy(购自Promega公司)连接，转化大肠杆菌TG1(本领域的技术人员均知该大肠杆菌TG1的来源)，挑选阳性克隆子提取质粒后进行测序。用NCBI Blast分析获得的DNA序列，确定杀虫晶体蛋白质基因的大小、开放读码框，启动子。再根据所获得的全基因(包括启动子)序列设计特异性引物进行PCR扩增，上游引物引入Sal I酶切位点，下游引物引入BamH I酶切位点，PCR产物经胶回收后与经过Sal I/BamH I处理的载体pHT304[pHT304是苏云金芽孢杆菌基因克隆中常用的一个既可在大肠杆菌中复制、又可在苏云金芽孢杆菌中复制的载体，该载体在90年代即已成功构建，文献“Construction of cloning vectors for Bacillus thuringiensis”(Gene，108：115-119，1991)中，详细描述了苏云金芽孢杆菌常用载体的构建，其中在第116页，第117页和第118页都描写了pHT304的构建方法及其该载体的特点。在文献“苏云金芽孢杆菌菌株YBT-1535转cry1C基因的构建”(生物工程学报，16(5)：587-590，2000)中也有记载。该pHT304载体由法国巴斯德研究所提供，巴斯德研究所是全球最大的菌种鉴定与保藏中心，可以向全世界研究人员提供各种用途的菌种和载体，其中pHT304载体在法国巴斯德研究所有保藏；中国科学院武汉病毒研究所等、华中农业大学生命科学院等许多实验室均保存有该载体)连接，转化大肠杆菌TG1和苏云金芽孢杆菌无质粒突变株BMB171，获得含有全长基因的大肠杆菌克隆子(TG1/7Cal)和苏云金芽孢杆菌工程菌(BMB171/7Cal)。文献“苏云金芽孢杆菌无质粒突变株BMB171的转化和表达性能”，应用与环境生物学报1999，5(4)：395～399，中有关于该突变株的报道。

(3)基因及其编码的杀虫蛋白质的特征：

BTH-13的杀虫晶体蛋白质基因(cry7Cal)全长为3729bp(包括启动子和终止密码子)，开发读码框为3432bp，其序列为SEQID NO.1所示的DNA序列；该基因编码的杀虫蛋白质为Cry7Ca，杀虫蛋白质的氨基酸数为1144，其序列为SEQID NO.2所示的氨基酸序列。毒素区域基因片段为1761bp，编码587氨基酸。

苏云金芽孢杆菌BTH-13具有杀东亚飞蝗等直翅目害虫的特点，国内目前尚无杀东亚飞蝗等直翅目害虫的苏云金芽孢杆菌商品制剂，BTH-13的杀虫晶体蛋白质基因可用于Bt菌株的遗传改良和构建高效抗蝗虫的Bt工程菌，并可用于转基因植物的研究以获得抗蝗虫的牧草和农作物。因而，从优越而独特的杀虫特性、生产和使用成本低、工业化生产技术成熟、对人和动植物安全、不污染环境及市场需求等方面考虑，苏云金芽孢杆菌BTH-13的杀虫基因及其编码的杀虫蛋白质具有巨大潜在的应用价值。

该基因编码的杀虫晶体蛋白质Cry7Ca对东亚飞蝗的毒力如下表1及图1，其中2.0mg/ml的晶体蛋白质经胰蛋白酶处理后产生的毒性肽在72小时内对东亚飞蝗的毒力可达到98.7％。

表1Bt菌株BTH-13杀虫晶体蛋白质基因编码的蛋白质对东亚飞蝗的毒力

附图说明

图1为Bt菌株BTH-13杀虫晶体蛋白质基编码的杀虫蛋白质对东亚飞蝗的毒杀作用

具体实施方式

1.抗蝗虫苏云金芽孢杆菌菌株总DNA的提取：

经活化的BTH-13菌株接种于平板上，30℃培养8h。用20mmol/lTris.cl(pH8.0)的缓冲液洗菌体，5000rpm离心5min，收集菌体。加入1倍体积的TES溶液(含15mg/ml的溶菌酶)，37℃温育2h，加入2倍体积的溶液II，充分混匀，轻微颠倒，加入蛋白酶K至其终浓度为70ug/ml。37℃温育2h，直到溶液变清亮。加入1.5倍体积的溶液III，充分混匀，12000rpm离心15min，收集上情。加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，充分混匀，轻微颠倒，至少5min，以除去蛋白。常温12000rpm离心5min，收集上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，重复上述操作。取上清，加入等体积的异丙醇沉淀DNA，4℃放置30min，12000rpm离心20min，弃上清，加入1ml的70％乙醇洗涤DNA，离心收集沉淀，倒置干燥。加入适量体积的含50ug/ml RNAas A的无菌水，溶解DNA。

2.Bt菌株BTH-13杀虫晶体蛋白质基因的获得：

(1)根据Hofte等(Micro Rev 1998，(53)：242-245)所报道的Bt毒素蛋白的氨基酸序列的五个保守序列，设计四条简并引物：

OL15’TAH CAN YAT AYG CAC ARG CHG CMA AYT T 3’

OL25’AGA GAH RTG AHW DTD AHW DTD AHR GTA TTR GAT 3’

OL45’AGC ATA DCG RAH NCY HRY DYV ATA 3’

OL55’GGA ATA AAT TCR ATT YTR TCT AAT AAA 3’

先以BTH-13的DNA为模板，用引物OL1、OL5进行第一轮PCR扩增；再以第一轮扩增的PCR产物为模板，用引物OL2、OL4进行第二轮扩增。第二轮扩增的PCR产物与载体pGEM-T-Easy Vector(购于promeaga公司)连接，连接产物通过CaCl转化法转入大肠杆菌TG1中，在含有X-gal、IPTG、Amp(100μl/ml)的LB培养基中筛选阳性克隆子[按《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，科学出版社，2002)描述的方法进行]。提取阳性克隆子的质粒DNA进行测序，获得1100kb的BTH-13杀虫晶体蛋白质基因片段序列。

(2)根据所获得的序列设计特异性引物：

H-13(F)：5’AGTGCTACTTGGTATCAGGCGGTCCCTTTA3’，

H-13(R)：5’TCAGAACTGGCAGCTCCATACCAATCAGGA 3’

(3)按BD GenomeWalker^TM Universal Kit User Manual操着，获得约900bp和3000bp的PCR产物。PCR产物经胶回收后与载体pGEM-T Easy连接，转化大肠杆菌TG1，挑选阳性克隆子经酶切、PCR检测验证后提取质粒进行DNAWalking测序。

(4)用NCBI Blast分析所获得的DNA，确定杀虫晶体蛋白质基因的大小、开放读码框，启动子。

(5)根据所获得的全基因(包括启动子)序列设计特异性引物进行PCR扩增，上游引物引入Sal I酶切位点，下游引物引入BamH I酶切位点，PCR产物经胶回收后与经过Sal I/BamH I处理的载体pHT304连接，转化大肠杆菌TG1和苏云金芽孢杆菌无晶体突变株BMB171，获得含有全长基因为SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

3.抗蝗虫基因工程菌杀蝗剂的制备

用上述构建的基因工程菌(BMB171/7Cal)制备杀蝗剂的方法与抗蝗虫Bt菌株BTH-13杀蝗剂的制备方法相同，所采用的培养基配方为：淀粉4.0％、豆饼粉2.4％、棉饼子粉1.5％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.4％、玉米浆2.0％、MgSO₄7H₂O 0.04％、KH₂PO₄ 0.2％、K₂HPO₄ 0.2％、CaCO₃ 0.1％、及α-淀粉酶(淀粉含量的1/400)。其杀蝗剂的制备过程如下：

乳剂生产：

40吨发酵罐，装料25吨，每罐接种两个茄子瓶菌种，接种温度35-37℃和发酵温度28-31℃(在此间中的温度均可实现)，恒速搅拌250r/min，通气量1∶0.5-1∶1.5，发酵至芽孢晶体形成并有40-50％孢晶分离时终止。消泡剂为泡敌BAPE，适量(一般为1％。)加入。发酵液经GF-105碟片式高速离心机循环离心后，仅去除约40％的上清液。在此种低倍浓缩的发酵液中按要求加入防腐剂和乳化剂等制成悬浮剂。

粉剂生产：

低倍浓缩发酵液直接或加10％轻质碳酸钙后，以BLSA规格的高压气流喷雾干燥机进行干燥，喷雾塔进口温度195-200℃，出口温度85-90℃。制得杀蝗剂可湿性粉剂。

发酵罐中的发酵情况及杀蝗剂乳剂的杀虫效果详见表2。

表2发酵罐中的发酵情况及杀蝗剂乳剂的杀虫效果

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院武汉病毒研究所

<120>一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因及应用

<130>一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因及应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3729

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis

<400>1

agcggtatca atgtgtatat gacaaatact cctacaggga caggtacatg attggcattc 60

tttacgctgg cagattgaga tagtatttaa aacatggaaa tcgttgctcc caatatccca 120

tgttattatt aaacgtttaa aatcgtattc taatattcaa tgatattgtc tgataaattg 180

aaaacgtatg aattttggtg acttacaaat attaatcctt aaaaataaca ctgcatttca 240

cagtaatgcg agaaaattta ctttccaaat attcaacagg aggaatgtat aaatatggat 300

aaacaaaatg atagtggaat tataaaagca acattgaacg aagatttttc taatagtatt 360

caaagatatc ctttggtaac tgatcaaact attaattata aagatttttt gaatatgaat 420

gaggagattg caccgtatgc aagttcgaaa gatgtaattt ttagctcaat aagtatcatt 480

cgtaccttca tgggttttgc aggacatggg actgctggag gtattattgg attatttacg 540

gaagtattaa gattactatg gcctaataag caaaatgatc tttgggaatc gtttatgaat 600

gaagtagagg cacttattaa tcaagaaata acagaagcgg tagtaagtaa agctttatca 660

gaattagagg gtttaaggaa cgctttggag ggatatacaa gtgcactgga agcatggcaa 720

aataatcgta gtgataaact taagcagtta ctagtgtatg aaagatttgt ttctacagaa 780

aatttattta aatttgcaat gccttctttt agatcggtag gttttgaagg tccattatta 840

acagtatatg cacaagccgc aaaccttcac ttatttttat taaaaaatgc tgaattattt 900

ggggcagaat ggggaatgca acaatacgaa atagacttgt tttacaatga acaaaaggga 960

tacgtagaag aatatacaga tcattgtgtt aaatggtata aagaagggtt aaataagttg 1020

aagaatgcaa gtggagtaaa aggtaaggta tgggagaact ataatcgttt tcgcagagaa 1080

atgacgatta tggtgttaga tctccttcca ttatttccaa tctatgatgc acgcacatat 1140

cctatggaaa cagtaacaga gttgacaaga caaattttca cagatccaat aggtcttacg 1200

ggaattaatg aaacgaaata tcctgattgg tatggagctg ccagttctga attcgtatta 1260

atagaaaatc gggcgatacc aaaacctggt ctattccaat ggttaactaa aataaacgtt 1320

cgtgctaggg tagttgaacc caatgatagg ttcgcaattt ggaccagaca cagtgtagtt 1380

actcaatgta ctaaatctac tactgagaat acatttaatt atggaacttc ttctggctct 1440

actttaagtc atacttttga tctactttct aaagatatat atcagactta ttcaatagct 1500

gcagcaaata aaagtgctac ttggtatcag gcggtccctt tattgagatt atatggaatt 1560

aattccagta atgtcctatc tgaggatgcg ttctcttttt caaataatat accatctagt 1620

aaatgtaaaa gcacatattc tagtgatcaa ttaccgatag aattgttgga cgaacctatt 1680

tatggagatt tagaggaata tggtcaccgg ttaagttatg tttcagaaat ttttaaagag 1740

actgggagtg gaacaattcc agtcttaggc tggacacatg taagtgtaag gcccgataat 1800

aaattatatc cagataagat tacgcaaatt cctgctgtta aagcgtttga aactaataca 1860

gctggtgtag aaattataga ctccgcatcc actggaggac ctatattaaa aatagtaaat 1920

aataatcttc ctagcaatca agtttttaga atgcgtttat cattttcaga accacaaaag 1980

attaaagtta gggttcgtta tgcagcaact ggagatggag taatgagctt tagtggaatt 2040

gcgcatgacg aatattttac tgcaacgatg aaagaaggag aagcgttaaa atatagctat 2100

ctaactatgg gtaatgatta tgctggaact gcagcagagc tttctatgct ctatataatt 2160

aaggcgaata cttcaaattg tactatctat attgataaaa ttgaattcat tccagtagat 2220

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acagcgggac gaaacgcact acaaaaagat gtgacagatt ttaaagtgga tcaagtgtca 2340

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ttagtcaaat atgcaaaacg tttgagctat tcccgtaatt tacttctaga tccaacattc 2460

gattctatca attcatctga ggagaatggc tggaacggaa gtaatggtat tgcaattggc 2520

agtggggatt ttgtattcaa agggaactat ttaattttct caggtaccaa tgatgaacag 2580

tatccaacct atctctatca aaaaatagat gagtccaaac tcaaagaata tacacgctat 2640

aaactgagag gttttatcga gagtagtcag gatttagaag catatgtgat tcgttatgat 2700

gcaaaacatg aaacattgga tgtatccaat aatctattac cggatattcc tcctgtgaat 2760

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gatacaggtt caattgattt caatgagaac gtaggaattt gggtgttgtt taaaatttcc 2940

acaccagaag gatacgcgaa atttggaaat ctagaagtga ttgaagatgg cccagtcatt 3000

ggagaagcat tagcccgtgt gaaacgccaa gaaacgaagt ggagaaacaa gttgacacaa 3060

ctgcgaacgg aaacacaagc aatttataca cgagcaaaac aagcactgga taatcttttt 3120

acagatgcac aagactctca cttaaaaata ggtgcaacat ttgcggcaat tgtggctgcg 3180

cgaaagattg tccaatcaat acgtgaagcg tatatgtcat ggttatctga cgtcccaggc 3240

ttaaattatc ctatttttac agagttgaat gacagagtac agcgcgcatt tcaattatat 3300

gatgtacaaa atgtcgtgcg taatggccga ttcctcaatg gagtattgga ctggattgtg 3360

acatctgatg taaaggtaca agaaggaaat gggaataacg tactagttct ttccggatgg 3420

gatgcgcaag tattacaatg tctgaatctc tatcaaaacc gcgggtacat cttgcgtgta 3480

acggcacgta aggaaggact gggagaagga tatataacaa ttacggatga agaaggaaat 3540

acagatcaat taacatttgg ttcatgtgaa aatatagatt catccaattc tttcgtatct 3600

acaggatata ttacaaaaga actagagttc ttcccagata cagaccaaat acagattgaa 3660

attggagaaa cagaaggaac attccaggtg gaaagtgtag aattattctt gatggaaaat 3720

ctatgttaa 3729

<210>2

<211>1144

<212>PRT

<213>Bacillus thuringiensis

<400>2

Met Asp Lys Gln Asn Asp Ser Gly Ile Ile Lys Ala Thr Leu Asn Glu

1 5 10 15

Asp Phe Ser Asn Ser Ile Gln Arg Tyr Pro Leu Val Thr Asp Gln Thr

20 25 30

Ile Asn Tyr Lys Asp Phe Leu Asn Met Asn Glu Glu Ile Ala Pro Tyr

35 40 45

Ala Ser Ser Lys Asp Val Ile Phe Ser Ser Ile Ser Ile Ile Arg Thr

50 55 60

Phe Met Gly Phe Ala Gly His Gly Thr Ala Gly Gly Ile Ile Gly Leu

65 70 75 80

Phe Thr Glu Val Leu Arg Leu Leu Trp Pro Asn Lys Gln Asn Asp Leu

85 90 95

Trp Glu Ser Phe Met Asn Glu Val Glu Ala Leu Ile Asn Gln Glu Ile

100 105 110

Thr Glu Ala Val Val Ser Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Gly Leu Arg

115 120 125

Asn Ala Leu Glu Gly Tyr Thr Ser Ala Leu Glu Ala Trp Gln Asn Asn

130 135 140

Arg Ser Asp Lys Leu Lys Gln Leu Leu Val Tyr Glu Arg Phe Val Ser

145 150 155 160

Thr Glu Asn Leu Phe Lys Phe Ala Met Pro Ser Phe Arg Ser Val Gly

165 170 175

Phe Glu Gly Pro Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His

180 185 190

Leu Phe Leu Leu Lys Asn Ala Glu Leu Phe Gly Ala Glu Trp Gly Met

195 200 205

Gln Gln Tyr Glu Ile Asp Leu Phe Tyr Asn Glu Gln Lys Gly Tyr Val

210 215 220

Glu Glu Tyr Thr Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Lys Glu Gly Leu Asn

225 230 235 240

Lys Leu Lys Asn Ala Ser Gly Val Lys Gly Lys Val Trp Glu Asn Tyr

245 250 255

Asn Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Ile Met Val Leu Asp Leu Leu Pro

260 265 270

Leu Phe Pro Ile Tyr Asp Ala Arg Thr Tyr Pro Met Glu Thr Val Thr

275 280 285

Glu Leu Thr Arg Gln Ile Phe Thr Asp Pro Ile Gly Leu Thr Gly Ile

290 295 300

Asn Glu Thr Lys Tyr Pro Asp Trp Tyr Gly Ala Ala Ser Ser Glu Phe

305 310 315 320

Val Leu Ile Glu Asn Arg Ala Ile Pro Lys Pro Gly Leu Phe Gln Trp

325 330 335

Leu Thr Lys Ile Asn Val Arg Ala Arg Val Val Glu Pro Asn Asp Arg

340 345 350

Phe Ala Ile Trp Thr Arg His Ser Val Val Thr Gln Cys Thr Lys Ser

355 360 365

Thr Thr Glu Asn Thr Phe Asn Tyr Gly Thr Ser Ser Gly Ser Thr Leu

370 375 380

Ser His Thr Phe Asp Leu Leu Ser Lys Asp Ile Tyr Gln Thr Tyr Ser

385 390 395 400

Ile Ala Ala Ala Asn Lys Ser Ala Thr Trp Tyr Gln Ala Val Pro Leu

405 410 415

Leu Arg Leu Tyr Gly Ile Asn Ser Ser Asn Val Leu Ser Glu Asp Ala

420 425 430

Phe Ser Phe Ser Asn Asn Ile Pro Ser Ser Lys Cys Lys Ser Thr Tyr

435 440 445

Ser Ser Asp Gln Leu Pro Ile Glu Leu Leu Asp Glu Pro Ile Tyr Gly

450 455 460

Asp Leu Glu Glu Tyr Gly His Arg Leu Ser Tyr Val Ser Glu Ile Phe

465 470 475 480

Lys Glu Thr Gly Ser Gly Thr Ile Pro Val Leu Gly Trp Thr His Val

485 490 495

Ser Val Arg Pro Asp Asn Lys Leu Tyr Pro Asp Lys Ile Thr Gln Ile

500 505 510

Pro Ala Val Lys Ala Phe Glu Thr Asn Thr Ala Gly Val Glu Ile Ile

515 520 525

Asp Ser Ala Ser Thr Gly Gly Pro Ile Leu Lys Ile Val Asn Asn Asn

530 535 540

Leu Pro Ser Asn Gln Val Phe Arg Met Arg Leu Ser Phe Ser Glu Pro

545 550 555 560

Gln Lys Ile Lys Val Arg Val Arg Tyr Ala Ala Thr Gly Asp Gly Val

565 570 575

Met Ser Phe Ser Gly Ile Ala His Asp Glu Tyr Phe Thr Ala Thr Met

580 585 590

Lys Glu Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Tyr Leu Thr Met Gly Asn Asp

595 600 605

Tyr Ala Gly Thr Ala Ala Glu Leu Ser Met Leu Tyr Ile Ile Lys Ala

610 615 620

Asn Thr Ser Asn Cys Thr Ile Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Phe Ile Pro

625 630 635 640

Val Asp Glu Asn Tyr Asn Asn Arg Val Gln Leu Glu Lys Ala Gln Lys

645 650 655

Ala Val Asn Thr Leu Phe Thr Ala Gly Arg Asn Ala Leu Gln Lys Asp

660 665 670

Val Thr Asp Phe Lys Val Asp Gln Val Ser Ile Leu Val Asp Cys Val

675 680 685

Ser Gly Glu Leu Tyr Pro Asn Glu Lys Arg Glu Leu Leu Ser Leu Val

690 695 700

Lys Tyr Ala Lys Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Asn Leu Leu Leu Asp Pro

705 710 715 720

Thr Phe Asp Ser Ile Asn Ser Ser Glu Glu Asn Gly Trp Asn Gly Ser

725 730 735

Asn Gly Ile Ala Ile Gly Ser Gly Asp Phe Val Phe Lys Gly Asn Tyr

740 745 750

Leu Ile Phe Ser Gly Thr Asn Asp Glu Gln Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr

755 760 765

Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Glu Tyr Thr Arg Tyr Lys Leu

770 775 780

Arg Gly Phe Ile Glu Ser Ser Gln Asp Leu Glu Ala Tyr Val Ile Arg

785 790 795 800

Tyr Asp Ala Lys His Glu Thr Leu Asp Val Ser Asn Asn Leu Leu Pro

805 810 815

Asp Ile Pro Pro Val Asn Ala Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Ala

820 825 830

Leu Gln Tyr Leu Asp Glu Asn Pro Lys Leu Glu Cys Ser Ser Ile Gln

835 840 845

Asp Gly Ile Leu Ser Asp Ser His Ser Phe Ser Leu His Ile Asp Thr

850 855 860

Gly Ser Ile Asp Phe Asn Glu Asn Val Gly Ile Trp Val Leu Phe Lys

865 870 875 880

Ile Ser Thr Pro Glu Gly Tyr Ala Lys Phe Gly Asn Leu Glu Val Ile

885 890 895

Glu Asp Gly Pro Val Ile Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Gln

900 905 910

Glu Thr Lys Trp Arg Asn Lys Leu Thr Gln Leu Arg Thr Glu Thr Gln

915 920 925

Ala Ile Tyr Thr Arg Ala Lys Gln Ala Leu Asp Asn Leu Phe Thr Asp

930 935 940

Ala Gln Asp Ser His Leu Lys Ile Gly Ala Thr Phe Ala Ala Ile Val

945 950 955 960

Ala Ala Arg Lys Ile Val Gln Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Met Ser Trp

965 970 975

Leu Ser Asp Val Pro Gly Leu Asn Tyr Pro Ile Phe Thr Glu Leu Asn

980 985 990

Asp Arg Val Gln Arg Ala Phe Gln Leu Tyr Asp Val Gln Asn Val Val

995 1000 1005

Arg Asn Gly Arg Phe Leu Asn Gly Val Leu Asp Trp Ile Val Thr

1010 1015 1020

Ser Asp Val Lys Val Gln Glu Gly Asn Gly Asn Asn Val Leu Val

1025 1030 1035

Leu Ser Gly Trp Asp Ala Gln Val Leu Gln Cys Leu Asn Leu Tyr

1040 1045 1050

Gln Asn Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Arg Lys Glu Gly

1055 1060 1065

Leu Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Ile Thr Asp Glu Glu Gly Asn Thr

1070 1075 1080

Asp Gln Leu Thr Phe Gly Ser Cys Glu Asn Ile Asp Ser Ser Asn

1085 1090 1095

Ser Phe Val Ser Thr Gly Tyr Ile Thr Lys Glu Leu Glu Phe Phe

1100 1105 1110

Pro Asp Thr Asp Gln Ile Gln Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly

1115 1120 1125

Thr Phe Gln Val Glu Ser Val Glu Leu Phe Leu Met Glu Asn Leu

1130 1135 1140

Cys

Claims

1.一种分离的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因，其序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

2.一种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因所编码的杀虫蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因在制备防治或预防蝗虫制剂中的应用。