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CN101126075B - 生产化合物ⅱ的棒状细菌 - Google Patents

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CN101126075B
CN101126075B CN2007101371634A CN200710137163A CN101126075B CN 101126075 B CN101126075 B CN 101126075B CN 2007101371634 A CN2007101371634 A CN 2007101371634A CN 200710137163 A CN200710137163 A CN 200710137163A CN 101126075 B CN101126075 B CN 101126075B
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Abstract

本发明涉及棒状细菌及通过发酵这些细菌制备化合物的方法，所述棒状细菌在特定希望的位点(基因座)不是天然存在单拷贝的开放读框(零,gifRF)、基因或等位基因，而是具有优选地串联排列的所述感兴趣的开放读框(零,gifRF)、基因或等位基因的至少两个拷贝，并任选地在另yi,gif个基因位点具有所述开放读框(零,gifRF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝。

Description

生产化合物Ⅱ的棒状细菌
本申请是申请日为2002年7月30日、申请号为02815448.7、发明名称为“生产化合物II的棒状细菌”的发明专利申请的分案申请。
现有技术
化合物，尤其L-氨基酸、维生素、核苷和核苷酸以及D-氨基酸，用于人用药、用于制药业、用于化妆品、用于食品业及用于动物营养。
众多的这些化合物是从棒状细菌尤其谷氨棒杆菌菌株中发酵制备的。由于其及其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施。如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或例如通过离子交换层析对产物形式的加工，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变、选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或有调节重要性的代谢物是营养缺陷的并产生氨基酸的菌株。
一些年以来，重组DNA技术的方法也已经用于棒杆菌菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。
一种通用的方法包括通过附加型复制质粒扩增特定微生物中某些生物合成基因。这种方法的缺点是在发酵期间(在工业过程中发酵通常进行许多代)，所述质粒自发丧失(分离不稳定性)。
另一种方法包括利用在特定微生物中不复制的质粒复制一些生物合成基因。在这种方法中，将包括克隆的生物合成基因的质粒整合入该微生物的染色体生物合成基因中(Reinscheid等，应用和环境微生物学60(1)，126-132(1994)；Jetten等，应用微生物学和生物技术学43(1)：76-82(1995))。这种方法的缺点是质粒的核苷酸序列及选择所必需的抗生素抗性基因的核苷酸序列保留在微生物中，这例如对生物量的处理和利用是一个不利因素。另外，专家预期这种菌株由于在相应于工业发酵中常用的代次中通过“坎贝尔典型交换(Campbell typecross over)”的去整合(disintegration)而不稳定。
发明目的
本发明人提供了改良使用棒状细菌发酵生产化合物的新措施。
发明概述
本发明提供了棒状细菌，特别是棒杆菌属，其产生一或多种所需的化合物，其特征在于：
a)所述细菌在特定希望的位点(基因座)不是天然存在单个拷贝的开放读框(ORF)、基因或等位基因，而是具有优选串联排列的所述感兴趣的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少两个拷贝，在该特定位点没有能/使得(capbleof/enable)在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及
b)所述细菌任选地在另一个基因位点还具有所述感兴趣的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝，在该另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了制备一或多种化合物的方法，其中包括以下步骤：
a)在使所述开放读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下发酵如下的棒状细菌，特别是棒杆菌属：
i)所述细菌在特定希望的位点(基因座)不是天然存在单个拷贝的开放读框(ORF)、基因或等位基因，而是具有优选串联排列的所述开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少两个拷贝，在该特定位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及
ii)所述细菌任选地在另一个基因位点还具有所述开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝，在该另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
b)浓缩发酵肉汤和/或细菌细胞中的化合物，
c)分离所述化合物，任选地
d)伴有>(大于)0—100wt％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
发明详述
应理解所述化合物特别是指氨基酸，维生素，核苷和核苷酸。现有技术已知并可获得这些化合物的生物合成途径。
氨基酸优选是指L-氨基酸，尤其是蛋白原性L-氨基酸，选自L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸，及它们的盐，特别是L-赖氨酸，L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。特别优选L-赖氨酸。
蛋白原性氨基酸应理解为在天然蛋白质中存在的氨基酸，天然蛋白质即微生物、植物、动物和人的蛋白质。
维生素特别是指维生素B1(硫胺素)，维生素B2(核黄素)，维生素B5(泛酸)，维生素B6(吡哆醇)，维生素B12(氰钴胺素)，烟酸/烟酰胺，维生素M(叶酸)和维生素E(生育酚)及它们的盐，优选泛酸。
核苷及核苷酸特别是指S-腺苷甲硫氨酸，肌苷-5′-单磷酸及鸟苷-5′-单磷酸及它们的盐。
棒状细菌特别是棒杆菌属那些细菌。在棒杆菌属中优选谷氨酸棒杆菌，产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)和嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)。这组细菌菌株的分类信息见于Kampfer和Kroppenstedt(加拿大微生物学杂志42，989-1005(1996))及US-A-5,250,434所述。
谷氨酸棒杆菌菌种的合适菌株特别是那些已知的野生型菌株：
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium lilium ATCC15990
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium herculisATCC13868
Arthrobacter sp.ATCC243
Brevibacterium chang-fua ATCC14017
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
Brevibacterium taipei ATCC13744和
Microbacterium ammoniaphilum ATCC21645
及从中产生的生产化合物的突变体或菌株，如本领域已知的那些突变体或菌株。
产氨棒杆菌(C.ammoniagenes)菌种的合适菌株特别是已知的野生型菌株：
Brevibacterium ammoniagenes ATCC6871
Brevibacterium ammoniagenes ATCC15137和
Corynebacterium sp.ATCC21084
及从中产生的生产化合物的突变体或菌株，如本领域已知的那些突变体或菌株。
嗜热产氨棒杆菌(C.thermoaminogenes)菌种的合适菌株特别是已知的野生型菌株：
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1540
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1541和
Corynebacterium thermoaminogenesFERM BP-1542
及从中产生的生产化合物的突变体或菌株，如本领域已知的那些突变体或菌株。
具有ATCC标号的菌株可得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，美国)。具有FERM标号的菌株可得自国立产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central6，1-1-1Higashi，Tsukuba Ibaraki，日本)。提及的嗜热产氨棒杆菌菌株(FERM BP-1539，FERM BP-1540，FERM BP-1541和FERM BP-1542)在US-A5,250,434中描述。
开放读框(ORF)描述了一段编码或可编码一种蛋白质或多肽或核糖核酸的核苷酸序列，现有技术中没有对其功能的描述。
在将一种功能指定给提及的核苷酸序列节段后，其一般称为基因。
等位基因一般是指给定基因的另外的形式。该形式通过核苷酸序列中的不同加以区别。
在本发明中，优选使用内源的即物种特征性开放读框、基因或等位基因。这些应理解为存在于物种群体例如谷氨酸棒杆菌中的开放读框、基因或等位基因或其核苷酸序列。
本发明文中“在特定希望的位点(基因座)天然存在的单拷贝的开放读框(ORF)、基因或等位基因”是指这样的情况，即在相应野生型或相应亲代生物体或起始生物体中一个基因一般以其核苷酸序列形式在其位点或基因位点以一个拷贝天然存在。这个位点优选在染色体中。
因此，例如lysC基因或编码谷氨酸棒杆菌的反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因是以一个拷贝中存在于lysC位点或lysC基因座或lysC基因位点，其一侧是开放读框orfX和leuA基因，另一侧是asd基因。
反馈抗性天冬氨酸激酶是指，与野生形式相比，对赖氨酸和苏氨酸的混合物或者AEC(氨基乙基半胱氨酸)和苏氨酸的混合物或者赖氨酸自身或者AEC自身的抑制具有较低敏感性的天冬氨酸激酶。生产L-赖氨酸的菌株典型含有这种反馈抗性或脱敏的天冬氨酸激酶。
已知谷氨酸棒杆菌染色体的核苷酸序列，并可见于专利申请EP-A-1108790及欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国和Cambridge，英国)的核苷酸序列数据库登录号AX114121。OrfX的核苷酸序列，leuA基因和asd基因的登录号为AX120364(orfX)，AX123517(leuA)和AX123519(asd)。
另外，也可以使用数据库例如国立生物技术信息中心数据库(NCBI，Bethesda，MD，美国)或者瑞士生物信息学研究所数据库(Swissprot，Geneva，Switzerland)或者蛋白质信息资源数据库(PIR，Washington，DC，美国)。
开放读框(ORF)、基因或等位基因的两或多个拷贝的“串联排列”是指这些拷贝以相同方向紧密相邻排列。
“另一个基因位点”是指第二个基因位点，其核苷酸序列不同于至少在天然位点复制的ORF、基因或等位基因的序列。这个另一个基因位点，或者在这个另一个位点存在的核苷酸序列，优选在染色体内，而且一般对生长和产生所需化合物是非必需的。
所述“另一个位点”当然不仅包括所述开放读框或基因的编码区，还包括位于上游的与表达和调节相关的区域或核苷酸序列，例如核糖体结合位点，启动子，调节蛋白的结合位点，调节性核糖核酸的结合位点和弱化子。这些区域一般位于编码区上游的1-800，1-600，1-400，1-200，1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，还包括位于下游的区域，例如转录终止子。这些区域一般位于编码区下游的1-400，1-200，1-100，1-50或1-25个核苷酸范围内。
另外可以使用染色体内的基因间区域，即无编码功能的核苷酸序列。最后，还可以使用染色体中包含的原噬菌体或缺陷噬菌体。
原噬菌体是指一种噬菌体，特别是其基因组，其与宿主的基因组一起复制且不发生感染颗粒的形成。缺陷噬菌体是指一种原噬菌体，特别是其基因组，其由于各种突变的结果而丧失形成所谓感染颗粒的能力。缺陷噬菌体也称为隐性噬菌体。原噬菌体和缺陷噬菌体通常以整合形式存在于其宿主的染色体中。现有技术中关于其的进一步详述例如Edward A.Birge的教材所述(细菌和噬菌体遗传学，3rded.，Springer-Verlag，美国纽约1994)，或者S.Klaus等的教材所述(Bakterienviren，Gustav Fischer Verlag，Jena，德国1992)。
为产生本发明的棒状细菌，分离所需ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，优选包括表达和/或调节信号，至少两个拷贝排列成一排，优选串联排列，然后优选借助于在棒状细菌中不复制或仅有限程度复制的载体，将这些序列转移进所需棒状细菌中，并分离其中在特定希望的天然位点掺入ORF、基因或等位基因的两个拷贝而不是最初存在的单拷贝的那些细菌，在该特定天然位点(基因座)没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，以及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
所述表达和/或调节信号，例如ORF、基因或等位基因编码区上游的核糖体结合位点，启动子，调节蛋白结合位点，调节核糖核酸结合位点及弱化子，一般在编码区上游的1—800，1—600，1—400，1—200，1—100或1—50个核苷酸范围内。所述表达和/或调节信号，例如ORF、基因或等位基因编码区下游的转录终止子，一般在编码区下游的1—400，1—200，1—100，1—50或1—25个核苷酸范围内。
优选地，在根据本发明扩增的ORF、基因或等位基因的两侧没有所用载体的序列或者物种外源DNA的残余，例如限制切割位点。在每种情况中，任选地，两侧最多有这种DNA的24个，优选最多12个，特别优选最多6个核苷酸。
任选地，所述开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝插入在另一个基因位点或者一些另外的基因位点，在该另外的基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
优选地，在所述的另外的基因位点没有所用载体的序列或者物种外源DNA的残余，例如限制切割位点。任选地，在该另外的基因位点保留掺入的ORF、基因或等位基因上游或下游的这种DNA的最多24个，优选最多12个，特别优选最多6个核苷酸。
本发明因此还提供了一种产生棒状细菌的方法，所述细菌产生一或多种化合物，其特征在于：
a)分离希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，优选包括表达和/或调节信号，
b)将所述ORF、基因或等位基因的核苷酸序列的至少两个拷贝排列成一列，优选串联排列，
c)将根据b)获得的核苷酸序列掺入载体中，所述载体在棒状细菌中不复制或者只有限程度复制，
d)将根据b)或c)的核苷酸序列转移进棒状细菌中，
e)分离这样的棒状细菌，所述棒状细菌在该特定希望的天然位点具有希望的ORF、基因或等位基因的至少两个拷贝，而不是最初存在的ORF、基因或等位基因的单拷贝，在该特定的天然位点(基因座)没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
f)任选地，将所述ORF、基因或等位基因的至少第三个拷贝导入另一个基因位点，在所述另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
通过本发明的方法，棒状细菌或者制备化合物的发酵方法的产率在选自以下一组的一或多个方面得以改良至少0.5—1.0％或者至少1.0—1.5％，或者至少1.5—2.0％：浓度(形成的化合物，基于单位体积)，产量(形成的化合物，基于消耗的碳源)，产物形成速率(形成的化合物，基于时间)。
关于常规的遗传工程方法的指导，例如分离染色体DNA，质粒DNA，操作限制酶等，见于Sambrook等(分子克隆实验指导(1989)，冷泉港实验室出版社)。关于在棒状细菌中转化和接合的指导见于Thierbach等(应用微生物学和生物技术29,356—362(1988))，Schafer等(细菌学杂志172，1663—1666(1990)及基因145，69—73(1994))，及Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84—87(1991))。
仅有限程度复制的载体是指质粒载体，其根据宿主或载体培养条件下而复制或不复制。因此，仅在低于31℃才能复制的棒状细菌的温度敏感性质粒已经由Nakamura等描述(US-A-6,303,383)。
本发明还提供了生产L-赖氨酸的棒状细菌，尤其棒杆菌属棒状细菌，其特征在于：
a)所述细菌在特定希望的位点(基因座)不是天然存在单个拷贝的用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因，而是具有优选串联排列的所述的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少两个拷贝，在该特定位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及
b)所述细菌任选地在另一个基因位点还具有所述的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝，在该另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了一种制备L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：
a)在使所述开放读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下发酵如下的棒状细菌，特别是棒杆菌属：
i)所述细菌在特定希望的位点(基因座)不是天然存在用于赖氨酸生产的单个拷贝的开放读框(ORF)、基因或等位基因，而是具有优选串联排列的所述开放读框(ORE)、基因或等位基因的至少两个拷贝，在该特定位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及
ii)所述细菌任选地在另一个基因位点还具有所述用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝，在该另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
b)浓缩发酵肉汤和/或细菌细胞中的L—赖氨酸，
c)从发酵肉汤中分离所述L—赖氨酸，任选地
d)伴有>(大于)0—100wt％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
“用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”是指所有、优选内源的开放读框、基因或等位基因，其增强/过表达可以具有改良赖氨酸生产的作用。增强是指特定的基因产物、蛋白质或酶的胞内浓度或活性提高。
这些特别包括以下开放读框、基因或等位基因：accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap，gap2，gdh，gnd，lysC，lysCFBR，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFSR，P9gk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pycP458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwa1，zwf和zwfA213T。这些在表1中概括及说明。
这些特别包括编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。各种lysCFBR等位基因在表2中概括及说明。
优选以下lysCFBR等位基因：lysC A279T(用苏氨酸置换SEQ IDNO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第279位丙氨酸)，lysC A279V(用缬氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第279位丙氨酸)，lysC S301F(用苯丙氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第301位丝氨酸)，lysC T308I(用异亮氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第308位苏氨酸)，lysCS301Y(用酪氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第301位丝氨酸)，lysC G345D(用天冬氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第345位甘氨酸)，lysC R320G(用甘氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第320位精氨酸)，lysC T311I(用异亮氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第311位苏氨酸)，lysC S381F(用苯丙氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第381位丝氨酸)。
特别优选lysCFBR等位基因lysC T311I(用异亮氨酸置换SEQ IDNO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第311位苏氨酸)，其核苷酸序列示于SEQ ID NO：3；编码的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。
可以使用以下开放读框、基因或核苷酸序列作为“另外的基因位点”，其对生长和赖氨酸生产是非必需的：aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，fda，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，mqo，pck，pgi，poxB和zwa2，特别是基因aecD，gluA，gluB，gluC，gluD和pck。这些在表3中概括并说明。另外可以使用染色体内的基因间区域，即无编码功能的核苷酸序列。最后，还可以使用染色体中包含的原噬菌体或缺陷噬菌体。
表1：用于赖氨酸生产的开放读框、基因和等位基因
 
名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献 登录号
accBC 酰基辅酶A羧化酶EC6.3.4.14(酰基辅酶A羧化酶) Jager et al.Archives ofMicrobiology(1996)166：76-82EP1108790；WO0100805 U35023AX123524AX066441
accDA 酰基辅酶A羧化酶EC6.4.1.2(酰基辅酶A羧化酶) EP1055725EP1108790WO0100805 AX121013AX066443
cstA 碳饥饿蛋白A(碳饥饿蛋白A) EP1108790WO0100804 AX120811AX066109
cysD 硫酸腺苷酰转移酶亚基IIEC2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链) EP1108790 AX123177
cysE 丝氨酸乙酰转移酶EC2.3.1.30(丝氨酸乙酰转移酶) EP1108790WO0100843 AX122902AX063961
cysH 3’-磷酸腺苷硫酸还原酶EC1.8.99.4(3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸还原酶) EP1108790WO0100842 AX123178AX066001
cysK 半胱氨酸合酶EC4.2.99.8(半胱氨酸合酶) EP1108790WO0100843 AX122901AX063963
cysN 硫酸腺苷酰转移酶亚基IEC2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶) EP1108790 AX123176AX127152
cysQ 转运蛋白CysQ(转运蛋白cysQ) EP1108790WO0100805 AX127145AX066423
dapA 二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶EC4.2.1.52(二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶) Bonnassie et a1.NucleicAcids Research18：6421(1990)Pisabarro et al.，Journal ofBacteriology175：2743-2749(1993)EP1108790WO0100805EP0435132EP1067192EP1067193 X53993Z21502AX123560AX063773
dapB 二氢-2，6-吡啶二羧酸还原酶EC1.3.1.26(二氢-2，6-吡啶二羧酸还原酶) EP1108790WO0100843EP1067192 AX127149AX063753AX137723
 
EP1067193Pisabarro et al.，Journal ofBacteriology175：2743-2749(1993)JP1998215883JP1997322774JP1997070291JP1995075578 AX137602X67737Z21502E16749E14520E12773E08900
dapC N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶EC2.6.1.17(N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶) EP1108790WO0100843EP1136559 AX127146AX064219
dapD 四氢-2，6-吡啶二羧酸琥珀酰化酶EC2.3.1.117(四氢-2，6-吡啶二羧酸琥珀酰化酶) EP1108790WO0100843Wehrmann et al.Journal ofBacteriology180：3159-3165(1998) AX127146AX063757AJ004934
dapE N-琥珀酰二氨基酸庚二酸脱琥珀酰化酶EC3.5.1.18(N-琥珀酰二氨基酸庚二酸脱琥珀酰化酶) EP1108790WO0100843Wehrmann et al.Microbiology140：3349-3356(1994) AX127146AX063749X81379
dapF EC5.1.1.7(二氨基酸庚二酸差向异构酶) EP1108790WO0100843EP1085094 AX127149AX063719AX137620
ddh 二氨基酸庚二酸脱氢酶EC1.4.1.16(二氨基酸庚二酸脱氢酶) EP1108790WO0100843Ishino et al.，Nucleic AcidsResearch15：3917-3917(1987)JP1997322774JP1993284970Kim et al.，Journal ofMicrobiology andBiotechnology5：250-256(1995) AX127152AX063759Y00151E14511E05776D87976
dps DNA保护蛋白(饥饿过程中的保护蛋白) EP1108790 AX127153
eno 烯醇化酶EC4.2.1.11(烯醇化酶) EP1108790WO0100844EP1090998Hermann et al.，Electrophoresis19：3217-3221(1998) AX127146AX064945AX136862
gap 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC1.2.1.12 EP1108790WO0100844 AX127148AX064941
 
(甘油醛-3-磷酸脱氢酶) Eikmanns et al.，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) X59403
gap2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2) EP1108790WO0100844 AX127146AX064939
gdh 谷氨酸脱氢酶EC1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶) EP1108790WO0100844Boermann et al.，MolecularMicrobiology6：317-326(1992).Guyonvarch et al.，NCB1 AX127150AX063811X59404X72855
gnd 6-磷酸葡糖酸脱氢酶EC1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶) EP1108790WO0100844 AX127147AX121689AX065125
lysC 天冬氨酸激酶EC2.7.2.4(天冬氨酸激酶) EP1108790WO0100844Kalinowski et al.，MolecularMicrobiology5：1197-204(1991) AX120365AX063743X57226
lysCFBR 天冬氨酸激酶反馈抗性(fbr)EC2.7.2.4(天冬氨酸激酶fbr) 见表2
lysE 赖氨酸输出蛋白(赖氨酸输出蛋白) EP1108790WO0100843Vrljic et al.，MolecularMicrobiology22：815-826(1996) AX123539AX123539X96471
msiK 糖输入蛋白(多种糖输入蛋白) EP1108790 AX120892
opcA 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亚基) WO0104325 AX076272
oxyR 转录调节物(转录调节物) EP1108790 AX122198AX127149
ppcFBR 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性EC4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性) EP0723011WO0100852
ppc 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶EC4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶) EP1108790O′Reagan et al.，Gene77(2)：237-251(1989) AX127148AX123554M25819
pgk 磷酸甘油酸激酶EC2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶) EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology174： AX121838AX127148AX064943X59403
 
6076-6086(1992)
pknA 蛋白激酶A(蛋白激酶A) EP1108790 AX120131AX120085
pknB 蛋白激酶B(蛋白激酶B) EP1108790 AX120130AX120085
pknD 蛋白激酶D(蛋白激酶D) EP1108790 AX127150AX122469AX122468
pknG 蛋白激酶G(蛋白激酶G) EP1108790 AX127152AX123109
ppsA 磷酸烯醇丙酮酸合酶EC2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶) EP1108790 AX127144AX120700AX122469
ptsH 磷酸转移酶系统蛋白HEC2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H) EP1108790WO0100844 AX122210AX127149AX069154
ptsI 磷酸转移酶系统酶IEC2.7.3.9 EP1108790 AX122206AX127149
ptsM 葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶IIEC2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II) Lee et al.，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145(1994) L18874
pyc 丙酮酸羧化酶EC6.4.1.1(丙酮酸羧化酶) WO9918228Peters-Wendisch et al.，Microbiology144：915-927(1998) A97276Y09548
pycP458S 丙酮酸羧化酶EC6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸交换P458S EP1108790
sigC Sigma因子CEC2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子C) EP1108790 AX120368AX120085
sigD RNA聚合酶Sigma因子DEC2.7.7.6(RNA聚合酶sigma因子) EP1108790 AX120753AX127144
sigE Sigma因子EEC2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子E) EP1108790 AX127146AX121325
sigH Sigma因子HEC2.7.7.6(sigma因子SigH) EP1108790 AX127145AX120939
sigM Sigma因子MEC2.7.7.6(sigma因子SigM) EP1108790 AX123500AX127145
tal 转醛酶 WO0104325 AX076272
 
EC2.2.1.2(转醛酶)
thyA 胸苷酸合酶EC2.1.1.45(胸苷酸合酶) EP1108790 AX121026AX127145
tkt 转酮酶EC2.2.1.1(转酮酶) Ikeda et al.，NCBI AB023377
tpi 丙糖磷酸异构酶EC5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶) Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) X59403
zwa1 细胞生长因子1(细胞生长因子1) EP1111062 AX133781
zwf 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶) EP1108790WO0104325 AX127148AX121827AX076272
zwfA213T 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)氨基酸交换A213T EP1108790
表2编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因
 
等位基因名称 氨基酸置换 参考文献 登录号
lysCFBR-E05108 JP 1993184366-A(序列1) E05108
lysCFBR-E06825 lysC A279T JP 1994062866-A(序列1) E06825
lysCFBR-E06826 lysC A279T JP 1994062866-A(序列2) E06826
lysCFBR-E06827 JP 1994062866-A(序列3) E06827
lysCFBR-E08177 JP 1994261766-A(序列1) E08177
lysCFBR-E08178 lys CA279T JP 1994261766-A(序列2) E08178
lysCFBR-E08179 lysC A279V JP 1994261766-A(序列3) E08179
lysCFBR-E08180 lysC S301F JP 1994261766-A(序列4) E08180
lysCFBR-E08181 lysC T308I JP 1994261766-A(序列5) E08181
lysCFBR-E08182 JP 1994261766-A(序列6) E08182
lysCFBR-E12770 JP 1997070291-A(序列13) E12770
lysCFBR-E14514 JP 1997322774-A(序列9) E14514
lysCFBR-E16352 JP 1998165180-A(序列3) E16352
lysCFBR-E16745 JP 1998215883-A(序列3) E16745
lysCFBR-E16746 JP 1998215883-A(序列4) E16746
lysCFBR-I74588 US 5688671-A(序列1) 174588
lysCFBR-I74589 lysC A279T US 5688671-A(序列2) I74589
lysCFBR-I74590 US 5688671-A(序列7) I74590
lysCFBR-I74591 lysC A279T US 5688671-A(序列8) I74591
lysCFBR-I74592 US 5688671-A(序列9) I74592
lysCFBR-I74593 lys CA279T US 5688671-A(序列10) I74593
 
lysCFBR-I74594 US 5688671-A(序列11) I74594
lysCFBR-I74595 lysC A279T US 5688671-A(序列12) I74595
lysCFBR-I74596 US 5688671-A(序列13) I74596
lysCFBR-I74597 IysC A279T US 5688671-A(序列14) I74597
lysCFBR-X57226 lysC S301Y EP0387527Kalinowski et al.，Molecular andGeneral Genetics224：317-324(1990) X57226
lysCFBR-L16848 lysC G345D Follettie and SinskeyNCBI NucleotideDatabase(1990) L16848
lysCFBR-L27125 lysC R320GlysC G345D Jetten et al.，AppliedMicrobiologyB iotechnology43：76-82(1995) L27125
lysCFBR lysC T311I WO0063388(序列17)
lysCFBR lysC S301F US3732144
lysCFBR lysC S381F
lysCFBR JP6261766(序列1)
lysCFBR lysC A279T JP6261766(序列2)
lysCFBR lysC A279V JP6261766(序列3)
lysCFBR lysC S301F JP6261766(序列4)
lysCFBR lysC T308I JP6261766(序列5)
表3用于整合赖氨酸生产的开放读框、基因和等位基因的另外的基因位点
 
基因名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献 登录号
aecD βC-S裂合酶EC2.6.1.1(βC-S裂合酶) Rossol et al.，Journal ofBacteriology174(9)：2968-77(1992) M89931
ccpA1 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A1) WO0100844EP1108790 AX065267AX127147
ccpA2 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2) WO0100844EP1108790 AX065267AX121594
citA 传感蛋白激酶CitA(传感蛋白激酶CitA) EP1108790 AX120161
citB 转录调节物CitB(转录调节物CitB) EP1108790 AX120163
citE 柠檬酸裂合酶EC4.1.3.6(柠檬酸裂合酶) WO0100844EPI108790 AX065421AX127146
fda 果糖二磷酸醛缩酶EC4.1.2.13(果糖-1，6-二磷酸醛缩酶) von der Osten et al.，MolecularMicrobiology3(11)：1625-37(1989) X17313
gluA 谷氨酸转运ATP结合蛋白(谷氨酸转运ATP结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluB 谷氨酸结合蛋白(谷氨酸结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluC 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluD 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
luxR 转录调节物LuxR(转录调节物LuxR) WO0100842EPI108790 AX065953AX123320
luxS 组氨酸激酶LuxS(组氨酸激酶LuxS) EPI108790 AX123323AX127145
lysR1 转录调节物LysR1(转录调节物LysR1) EP1108790 AX064673AX127144
lysR2 转录激活物LysR2(转录调节物LysR2) EP1108790 AX123312
lysR3 转录调节物LysR3(转录调节物LysR3) WO0100842EP1108790 AX065957AX127150
menE O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶EC6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶) WO0100843EP1108790 AX064599AX064193AX127144
 
mqo 苹果酸—醌氧化还原酶(苹果酸—醌氧化还原酶) Molenaar et al.，Eur.Journal ofBiochemistry1；254(2)：395-403(1998) AJ224946
pck 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶) WO0100844 AJ269506AX065053
pgi 葡萄糖-6-磷酸异构酶EC5.3.1.9(葡萄糖-6-磷酸异构酶) EP1087015EP1108790 AX136015AX127146
poxB 丙酮酸氧化酶EC1.2.3.3(丙酮酸氧化酶) WO0100844EP1096013 AX064959AX137665
zwa2 细胞生长因子2(生长因子2) EP1106693EP1108790 AX113822AX127146
本发明还提供了一种生产棒状细菌的方法，所述细菌产生L-赖氨酸，所述方法的特征在于：
a)分离用于赖氨酸生产的所需ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，任选地包括表达和/或调节信号，
b)将用于赖氨酸生产的所述ORF、基因或等位基因的核苷酸序列的至少两个拷贝排列成一列，优选串联排列，
c)将根据b)获得的核苷酸序列掺入一载体中，所述载体在棒状细菌中不复制或者只有限程度复制，
d)将根据b)或c)的核苷酸序列转移进棒状细菌中，
e)分离这样的棒状细菌，所述棒状细菌在该特定希望的天然位点具有希望的ORF、基因或等位基因的至少两个拷贝，而不是最初存在的ORF、基因或等位基因的单拷贝，在该特定的天然位点(基因座)没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
f)任选地，将所述用于赖氨酸生产的ORF、基因或等位基因的至少第三个拷贝导入另一个基因位点，在所述另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了生产L-甲硫氨酸/L-苏氨酸的棒状细菌，尤其棒杆菌属，其特征在于：
a)所述细菌在特定希望的位点(基因座)不是天然存在单个拷贝的用于甲硫氨酸或苏氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因，而是具有优选串联排列的所述的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少两个拷贝，在该特定位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及
b)所述细菌任选地在另一个基因位点还具有所述的用于甲硫氨酸或苏氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝，在该另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了一种制备L-甲硫氨酸/L-苏氨酸的方法，包括以下步骤：
a)在使所述开放读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下发酵如下的棒状细菌，特别是棒杆菌属：
i)所述细菌在特定希望的位点(基因座)不是天然存在用于甲硫氨酸或苏氨酸生产的单个拷贝的开放读框(ORF)、基因或等位基因，而是具有优选串联排列的所述开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少两个拷贝，在该特定位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及
ii)所述细菌任选地在另一个基因位点还具有所述用于甲硫氨酸生产或苏氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝，在该另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
b)浓缩发酵肉汤中的L—甲硫氨酸和/或L-苏氨酸，
c)从发酵肉汤中分离所述L—甲硫氨酸和/或L-苏氨酸，任选地
d)伴有>(大于)0—100wt％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
“用于甲硫氨酸生产的开放读框(ORF)，基因或等位基因的拷贝”是指所有、优选内源的开放读框、基因或等位基因，其增强/过表达可以具有改良甲硫氨酸生产的作用。
这些特别包括以下开放读框、基因或等位基因：accBC，accDA，aecD，cstA，cysD，cysE，cysH，cysR，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，glyA，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，metA，metB，metE，metH，metY，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwa1，zwf和zwfA213T。这些在表4中概括并说明。这些特别包括编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(见表2)，及编码反馈抗性高丝氨酸脱氢酶的homFBR等位基因。
所述用于甲硫氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个、任选地第四个或第五个拷贝可以整合在另一个位点。可以使用以下开放读框、基因或核苷酸序列：brnE，brnF，brnQ，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，metD，metK，pck，pgi，poxB和zwa2。这些在表5中概括并说明。另外可以使用染色体内的基因间区域，即无编码功能的核苷酸序列。最后，还可以使用染色体中包含的原噬菌体或缺陷噬菌体。
表4：用于甲硫氨酸生产的开放读框、基因和等位基因
 
名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献 登录号
accBC 酰基辅酶A羧化酶EC6.3.4.14(酰基辅酶A羧化酶) Jager et al.Archives ofMicrobiology(1996)166：76-82EP1108790；WO0100805 U35023AX123524AX066441
accDA 酰基辅酶A羧化酶EC6.4.1.2(酰基辅酶A羧化酶) EP1055725EP1108790WO0100805 AX121013AX066443
aecD 胱硫醚-β-裂合酶EC4.4.1.8(胱硫醚-β-裂合酶) Rossol et al.，Journal ofBacteriology174：2968-2977(1992) M89931
cstA 碳饥饿蛋白A(碳饥饿蛋白A) EP1108790WO0100804 AX120811AX066109
cysD 硫酸腺苷酰转移酶亚基IIEC2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链) EP1108790 AX123177
cysE 丝氨酸乙酰转移酶EC2.3.1.30(丝氨酸乙酰转移酶) EP1108790WO0100843 AX122902AX063961
cysH 3’-磷酸腺苷硫酸还原酶EC1.8.99.4(3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸还原酶) EP1108790WO0100842 AX123178AX066001
cysK 半胱氨酸合酶EC4.2.99.8(半胱氨酸合酶) EP1108790WO0100843 AX122901AX063963
cysN 硫酸腺苷酰转移酶亚基IEC2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶) EPI108790 AX123176AX127152
cysQ 转运蛋白CysQ(转运蛋白cysQ) EP1108790WO0100805 AX127145AX066423
dps DNA保护蛋白(饥饿过程中的保护蛋白) EP1108790 AX127153
eno 烯醇化酶EC4.2.1.11(烯醇化酶) EP1108790WO0100844EP1090998Hermann et al.，Electrophoresis19：3217-3221(1998) AX127146AX064945AX136862
fda 果糖二磷酸醛缩酶EC4.1.2.13(果糖-1，6-二磷酸醛缩酶) von derOsten etal.，Molecular Microbiology3(11)：1625-37(1989) X17313
gap 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 EP1108790 AX127148
 
EC1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶) WO0100844Eikmanns et al.，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) AX064941X59403
gap2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2) EP1108790WO0100844 AX127146AX064939
gdh 谷氨酸脱氢酶EC1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶) EP1108790WO0100844Boermann et al.，MolecularMicrobiology6：317-326(1992).Guyonvarch et al.，NCBI AX127150AX063811X59404X72855
glyA 甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶EC2.1.2.1(甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶) EP1108790 AX127146AX121194
gnd 6-磷酸葡糖酸脱氢酶EC1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶) EP1108790WO0100844 AX127147AX121689AX065125
hom 高丝氨酸脱氢酶EC1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶) Peoples et al.，MolecularM icrobiology2：63-72(1988) Y00546
homFBR 高丝氨酸脱氢酶反馈抗性EC1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶fbr) Reinscheid et al.，Journal ofBacteriology173：3228-30(1991)
lysC 天冬氨酸激酶EC2.7.2.4(天冬氨酸激酶) EP1108790WO0100844Kalinowski et al.，MolecularMicrobiology5：1197-204(1991) AX120365AX063743X57226
lysCFBR 天冬氨酸激酶反馈抗性(fbr)EC2.7.2.4(天冬氨酸激酶fbr) 见表2
metA 高丝氨酸乙酰转移酶EC2.3.1.31(高丝氨酸乙酰转移酶) Park et al.，Molecular Cells8：286-94(1988) AF052652
metB 胱硫醚-γ-裂合酶EC4.4.1.1(胱硫醚-γ-合酶) Hwang et al.，MolecularCells9：300-308(1999) AF126953
metE 高丝氨酸甲基转移酶EC2.1.1.14(高丝氨酸甲基转移酶) EP1108790 AX127146AX121345
metH 高丝氨酸甲基转移酶(维生素B12依赖性)EC2.1.1.14(高丝氨酸甲基转移酶) EP1108790 AX127148AX121747
 
metY 乙酰高丝氨酸sulfhydrolase(乙酰高丝氨酸sulfhydrolase) EP1108790 AX120810AX127145
msiK 糖输入蛋白(多种糖输入蛋白) EP1108790 AX120892
opcA 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亚基) WO0104325 AX076272
oxyR 转录调节物(转录调节物) EP1108790 AX122198AX127149
ppcFBR 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性EC4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性) EP0723011WO0100852
ppc 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶EC4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶) EP1108790O′Reagan et al.，Gene77(2)：237-251(1989) AX127148AX123554M25819
pgk 磷酸甘油酸激酶EC2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶) EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) AX121838AX127148AX064943X59403
pknA 蛋白激酶A(蛋白激酶A) EP1108790 AX120131AX120085
pknB 蛋白激酶B(蛋白激酶B) EP1108790 AX120130AX120085
pknD 蛋白激酶D(蛋白激酶D) EP1108790 AX127150AX122469AX122468
pknG 蛋白激酶G(蛋白激酶G) EP1108790 AX127152AX123109
ppsA 磷酸烯醇丙酮酸合酶EC2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶) EP1108790 AX127144AX120700AX122469
ptsH 磷酸转移酶系统蛋白HEC2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H) EP1108790WO0100844 AX122210AX127149AX069154
ptsI 磷酸转移酶系统酶IEC2.7.3.9 EP1108790 AX122206AX127149
ptsM 葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶IIEC2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II) Lee et al.，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145(1994) L18874
pyc 丙酮酸羧化酶EC6.4.1.1(丙酮酸羧化酶) WO9918228Peters-Wendisch et al.，Microbiology144：915-927(1998) A97276Y09548
 
pycP458S 丙酮酸羧化酶EC6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸交换P458S EP1108790
sigC Sigma因子CEC2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子C) EP1108790 AX120368AX120085
sigD RNA聚合酶Sigma因子DEC2.7.7.6(RNA聚合酶sigma因子) EP1108790 AX120753AX127144
sigE Sigma因子EEC2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子E) EP1108790 AX127146AX121325
sigH Sigma因子HEC2.7.7.6(sigma因子SigH) EP1108790 AX127145AX120939
sigM Sigma因子MEC2.7.7.6(sigma因子SigM) EP1108790 AX123500AX127145
tal 转醛酶EC2.2.1.2(转醛酶) WO0104325 AX076272
thyA 胸苷酸合酶EC2.1.1.45(胸苷酸合酶) EP1108790 AX121026AX127145
tkt 转酮酶EC2.2.1.1(转酮酶) Ikeda et al..NCBI AB023377
tpi 丙糖磷酸异构酶EC5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶) Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) X59403
zwa1 细胞生长因子1(细胞生长因子1) EP1111062 AX133781
zwf 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶) EP1108790WO0104325 AX127148AX121827AX076272
zwfA213T 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)氨基酸交换A213T EP1108790
表5用于整合甲硫氨酸生产的开放读框、基因和等位基因的另外的基因位点
 
基因名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献 登录号
brnE 支链氨基酸转运蛋白(支链氨基酸转运蛋白) EP1096010 AX137709AX137714
brnF 支链氨基酸转运蛋白(支链氨基酸转运蛋白) EP1096010 AX137709AX137714
brnQ 支链氨基酸载体蛋白(支链氨基酸转运系统载体蛋白) Tauch et al.，Archives ofMicrobiology169(4)：303-12(1998)WO0100805EP1108790 M89931AX066841AX127150
ccpA1 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A1) WO0100844EP1108790 AX065267AX127147
ccpA2 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2) WO0100844EP1108790 AX065267AX121594
citA 传感蛋白激酶CitA(传感蛋白激酶CitA) EP1108790 AX120161
citB 转录调节物CitB(转录调节物CitB) EP1108790 AX120163
citE 柠檬酸裂合酶EC4.1.3.6(柠檬酸裂合酶) WO0100844EP1108790 AX065421AX127146
ddh 二氨基酸庚二酸脱氢酶EC1.4.1.16(二氨基酸庚二酸脱氢酶) Ishino et al.，Nucleic AcidsResearch15：3917-3917(1987)EP1108790 S07384AX127152
gluA 谷氨酸转运ATP结合蛋白(谷氨酸转运ATP结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluB 谷氨酸结合蛋白(谷氨酸结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluC 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluD 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
luxR 转录调节物LuxR(转录调节物LuxR) WO0100842EP1108790 AX065953AX123320
luxS 组氨酸激酶LuxS(组氨酸激酶LuxS) EP1108790 AX123323AX127145
lysR1 转录调节物LysR1(转录调节物LysR1) EP1108790 AX064673AX127144
lysR2 转录激活物LysR2 EP1108790 AX123312
 
(转录调节物LysR2)
lysR3 转录调节物LysR3(转录调节物LysR3) WO0100842EP1108790 AX065957AX127150
menE O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶EC6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶) WO0100843EP1108790 AX064599AX064193AX127144
metD 转录调节物MetD(转录调节物MetD) EP1108790 AX123327AX127153
metK 甲硫氨酸酰苷转移酶EC2.5.1.6(S—腺苷甲硫氨酸合成酶) WO0100843EP1108790 AX063959AX127148
pck 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶) WO0100844 AJ269506AX065053
pgi 葡萄糖-6-磷酸异构酶EC5.3.1.9(葡萄糖-6-磷酸异构酶) EP1087015EP1108790 AX136015AX127146
poxB 丙酮酸氧化酶EC1.2.3.3(丙酮酸氧化酶) WO0100844EP1096013 AX064959AX137665
zwa2 细胞生长因子2(生长因子2) EP1106693EP1108790 AX113822AX127146
“用于苏氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”是指所有、优选内源的开放读框、基因或等位基因，其增强/过表达可以具有改良苏氨酸生产的作用。
这些包括以下开放读框、基因或等位基因：accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysI，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，thrB，thrC，thrE，zwa1，zwf和zwfA213T。这些在表6中概括并说明。这些特别包括编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(见表2)及编码反馈抗性高丝氨酸脱氢酶的homFBR等位基因。
用于苏氨酸生产的开放读框、基因或等位基因的至少第三个、任选地第四个或第五个拷贝可以整合在一个位点。为此可以使用以下开放读框、基因或核苷酸序列：ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，glyA，ilvA，ilvBN，ilvC，ilvD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，mdh，menE，metA，metD，pck，poxB，sigB和zwa2。这些在表7中概括并说明。另外可以使用染色体内的基因间区域，即无编码功能的核苷酸序列。最后，还可以使用染色体中包含的原噬菌体或缺陷噬菌体。
表6用于苏氨酸生产的开放读框、基因和等位基因
 
名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献 登录号
accBC 酰基辅酶A羧化酶EC6.3.4.14(酰基辅酶A羧化酶) Jager et al.Archives ofMicrobiology(1996)166：76-82EP1108790；WO0100805 U35023AX123524AX066441
accDA 酰基辅酶A羧化酶EC6.4.1.2(酰基辅酶A羧化酶) EP1055725EP1108790WO0100805 AX121013AX066443
cstA 碳饥饿蛋白A(碳饥饿蛋白A) EP1108790WO0100804 AX120811AX066109
cysD 硫酸腺苷酰转移酶亚基IIEC2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链) EP1108790 AX123177
cysE 丝氨酸乙酰转移酶EC2.3.1.30(丝氨酸乙酰转移酶) EP1108790WO0100843 AX122902AX063961
cysH 3’-磷酸腺苷硫酸还原酶EC1.8.99.4(3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸还原酶) EP1108790WO0100842 AX123178AX066001
cysK 半胱氨酸合酶EC4.2.99.8(半胱氨酸合酶) EP1108790WO0100843 AX122901AX063963
cysN 硫酸腺苷酰转移酶亚基IEC2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶) EP1108790 AX123176AX127152
cysQ 转运蛋白CysQ(转运蛋白cysQ) EP1108790WO0100805 AX127145AX066423
dps DNA保护蛋白(饥饿过程中的保护蛋白) EP1108790 AX127153
eno 烯醇化酶EC4.2.1.11(烯醇化酶) EP1108790WO0100844EP1090998Hermann et al.，Electrophoresis19：3217-3221(1998) AX127146AX064945AX136862
fda 果糖二磷酸醛缩酶EC4.1.2.13(果糖-1，6-二磷酸醛缩酶) von derOsten et al.，Molecular Microbiology3(11)：1625-37(1989) X17313
gap 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶) EP1108790WO0100844Eikmanns et al.，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) AX127148AX064941X59403
 
gap2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2) EP1108790WO0100844 AX127146AX064939
gdh 谷氨酸脱氢酶EC1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶) EP1108790WO0100844Boermann et al.，MolecularMicrobiology6：317-326(1992).Guyonvarch et al.，NCBI AX127150AX063811X59404X72855
gnd 6-磷酸葡糖酸脱氢酶EC1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶) EP1108790WO0100844 AX127147AX121689AX065125
hom 高丝氨酸脱氢酶EC1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶) Peoples et al.，MolecularMicrobiology2：63-72(1988) Y00546
homFBR 高丝氨酸脱氢酶反馈抗性EC1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶fbr) Reinscheid et al.，Journal ofBacteriology173：3228-30(1991)
lysC 天冬氨酸激酶EC2.7.2.4(天冬氨酸激酶) EP1108790WO0100844Kalinowski et al.，MolecularMicrobiology5：1197-204(1991) AX120365AX063743X57226
lysCFBR 天冬氨酸激酶反馈抗性(fbr)EC2.7.2.4(天冬氨酸激酶fbr) 见表2
msiK 糖输入蛋白(多种糖输入蛋白) EP1108790 AX120892
opcA 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亚基) WO0104325 AX076272
oxyR 转录调节物(转录调节物) EP1108790 AX122198AX127149
ppcFBR 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性EC4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性) EP0723011WO0100852
ppc 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶EC4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶) EP1108790O′Reagan et al.，Gene77(2)：237-251(1989) AX127148AX123554M25819
pgk 磷酸甘油酸激酶EC2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶) EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) AX121838AX127148AX064943X59403
pknA 蛋白激酶A EP1108790 AX120131
 
(蛋白激酶A) AX120085
pknB 蛋白激酶B(蛋白激酶B) EP1108790 AX120130AX120085
pknD 蛋白激酶D(蛋白激酶D) EP1108790 AX127150AX122469AX122468
pknG 蛋白激酶G(蛋白激酶G) EP1108790 AX127152AX123109
ppsA 磷酸烯醇丙酮酸合酶EC2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶) EP1108790 AX127144AX120700AX122469
ptsH 磷酸转移酶系统蛋白HEC2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H) EP1108790WO0100844 AX122210AX127149AX069154
ptsI 磷酸转移酶系统酶IEC2.7.3.9 EP1108790 AX122206AX127149
ptsM 葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶IIEC2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II) Lee et al.，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145(1994) L18874
pyc 丙酮酸羧化酶EC6.4.1.1(丙酮酸羧化酶) WO9918228Peters-Wendisch et al.，Microbiology144：915-927(1998) A97276Y09548
pycP458S 丙酮酸羧化酶EC6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸交换P458S EP1108790
sigC Sigma因子CEC2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子C) EP1108790 AX120368AX120085
sigD RNA聚合酶Sigma因子DEC2.7.7.6(RNA聚合酶sigma因子) EP1108790 AX120753AX127144
sigE Sigma因子EEC2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子E) EP1108790 AX127146AX121325
sigH Sigma因子HEC2.7.7.6(sigma因子SigH) EP1108790 AX127145AX120939
sigM Sigma因子MEC2.7.7.6(sigma因子SigM) EP1108790 AX123500AX127145
tal 转醛酶EC2.2.1.2(转醛酶) WO0104325 AX076272
 
thrB 高丝氨酸激酶EC2.7.1.39(高丝氨酸激酶) Peoples et al.，MolecularMicrobiology2：63-72(1988) Y00546
thrC 苏氨酸合酶EC4.2.99.2(苏氨酸合酶) Han et al.，MolecularMicrobiology4：1693-1702(1990) X56037
thrE 苏氨酸输出蛋白(苏氨酸输出载体) EP1085091 AX137526
thyA 胸苷酸合酶EC2.1.1.45(胸苷酸合酶) EP1108790 AX121026AX127145
tkt 转酮酶EC2.2.1.1(转酮酶) Ikeda et al.，NCBI AB023377
tpi 丙糖磷酸异构酶EC5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶) Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) X59403
zwa1 细胞生长因子1(细胞生长因子1) EP1111062 AX133781
zwf 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶) EP1108790WO0104325 AX127148AX121827AX076272
zwfA213T 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)氨基酸交换A213T EP1108790
表7用于整合苏氨酸生产的开放读框、基因和等位基因的另外的基因位点
 
基因名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献 登录号
ccpA1 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A1) WO0100844EP1108790 AX065267AX127147
ccpA2 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2) WO0100844EP1108790 AX065267AX121594
citA 传感蛋白激酶CitA(传感蛋白激酶CitA) EP1108790 AX120161
citB 转录调节物CitB(转录调节物CitB) EP1108790 AX120163
citE 柠檬酸裂合酶EC4.1.3.6(柠檬酸裂合酶) WO0100844EP1108790 AX065421AX127146
ddh 二氨基酸庚二酸脱氢酶EC1.4.1.16(二氨基酸庚二酸脱氢酶) Ishino et al.，Nucleic AcidsResearch15：3917-3917(1987)EP1108790 S07384AX127152
gluA 谷氨酸转运ATP结合蛋白(谷氨酸转运ATP结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluB 谷氨酸结合蛋白(谷氨酸结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluC 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluD 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
glyA 甘氨酸羟甲基转移酶EC2.1.2.1(甘氨酸羟甲基转移酶) WO0100843 AX063861AF327063
ilvA 苏氨酸脱水酶EC4.2.1.16(苏氨酸脱水酶) Mockel et al.，Journal ofBacteriology174(24)，8065-8072(1992)EP1108790 A47044L01508AX127150
ilvBN 乙酰乳酸合酶EC4.1.3.18(乙酰乳酸合酶) Keilhauer et al.，Journal ofBacteriology175(17)：5595-603(1993)EP1108790 L09232AX127147
ilvC 还原异构酶EC1.1.1.86(乙酮醇酸还原异构酶) Keilhauer et al.，Journal ofBacteriology175(17)：5595-603(1993)EP1108790 C48648AX127147
ilvD 二羟酸脱水酶 EP1006189 AX136925
 
EC4.2.1.9(二羟酸脱水酶)
luxR 转录调节物LuxR(转录调节物LuxR) WO0100842EP1108790 AX065953AX123320
luxS 组氨酸激酶LuxS(组氨酸激酶LuxS) EP1108790 AX123323AX127145
lysR1 转录调节物LysR1(转录调节物LysR1) EP1108790 AX064673AX127144
lysR2 转录激活物LysR2(转录调节物LysR2) EP1108790 AX123312
lysR3 转录调节物LysR3(转录调节物LysR3) WO0100842EP1108790 AX065957AX127150
mdh 苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37(苹果酸脱氢酶) WO0100844 AX064895
menE O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶EC6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶) WO0100843EP1108790 AX064599AX064193AX127144
metA 高丝氨酸-O-乙酰转移酶EC2.3.1.31(高丝氨酸-O-乙酰转移酶) Park et al..Molecular Cells30；8(3)：286-94(1998)WO0100843EP1108790 AX063895AX127145
metD 转录调节物MetD(转录调节物MetD) EP1108790 AX123327AX127153
pck 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶) WO0100844 AJ269506AX065053
poxB 丙酮酸氧化酶EC1.2.3.3(丙酮酸氧化酶) WO0100844EP1096013 AX064959AX137665
sigB RNA聚合酶转录因子(RNA聚合酶转录因子) EP1108790 AX127149
zwa2 细胞生长因子2(生长因子2) EP1106693EP1108790 AX113822AX127146
本发明还提供了生产棒状细菌的方法，所述细菌产生L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸，特征在于：
a)分离用于甲硫氨酸生产或苏氨酸生产的所需ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，任选地包括表达和/或调节信号，
b)将用于甲硫氨酸生产或苏氨酸生产的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列的至少两个拷贝排列成一列，优选串联排列，
c)将根据b)获得的核苷酸序列掺入一载体中，所述载体在棒状细菌中不复制或者仅有限程度复制，
d)将根据b)或c)的核苷酸序列转移进棒状细菌中，
e)分离这样的棒状细菌，所述细菌在特定希望的天然位点具有用于甲硫氨酸生产或苏氨酸生产的所需的ORF、基因或等位基因的至少两个拷贝，而不是最初存在的ORF、基因或等位基因的单拷贝，在该特定的天然位点(基因座)没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
f)任选地将用于甲硫氨酸生产或苏氨酸生产的ORF、基因或等位基因的至少第三个拷贝导入另一个基因位点，在所述另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了生产L-缬氨酸的棒状细菌，特别是棒杆菌属，其特征在于：
a)所述细菌在特定希望的位点(基因座)不是天然存在单个拷贝的用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因，而是具有优选串联排列的所述的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少两个拷贝，在该特定位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，以及
b)所述细菌任选地在另一个基因位点还具有所述的用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝，在该另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了一种生产L-缬氨酸的方法，其包括以下步骤：
a)在使所述开放读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下发酵如下棒状细菌，特别是棒杆菌属：
i)所述细菌在特定希望的位点(基因座)不是存在用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)，基因或等位基因的单拷贝，而是具有优选串联排列的所述开放读框(ORF)，基因或等位基因的至少两个拷贝，在该特定位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
ii)所述细菌任选地在另一个基因位点还具有所述用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个拷贝，在所述另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
b)浓缩发酵肉汤中的L-缬氨酸，
c)从发酵肉汤中分离L-缬氨酸，任选地
d)伴有>(大于)0—100wt％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
“用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”是指所有、优选内源的开放读框、基因或等位基因，其增强/过表达可以具有改良缬氨酸生产的作用。
这些包括以下开放读框、基因或等位基因：bmE，bmF，brnEF，cstA，cysD，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，ilvB，ilvN，ilvBN，ilvC，ilvD，ilvE msiK，pgk，ptsH，ptsI，ptsM，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tpi，zwa1。这些在表8中概括并说明。这些特别包括编码缬氨酸抗性的乙酰乳酸合酶ilvBN等位基因。
所述用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少第三个，任选地第四个或第五个拷贝可以整合入另一个位点。可以使用以下开放读框、基因或核苷酸序列：aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，glyA，ilvA，luxR，lysR1，lysR2，lysR3，panB，panC，poxB和zwa2。这些在表9中概括并说明。另外可以使用染色体内的基因间区域，即无编码功能的核苷酸序列。最后，还可以使用染色体中包含的原噬菌体或缺陷噬菌体。
表8用于缬氨酸生产的开放读框、基因和等位基因
 
名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献 登录号
brnEF 支链氨基酸的输出蛋白(支链氨基酸的输出蛋白) EP1096010Kennerknecht et al.，NCBI AF454053
cstA 碳饥饿蛋白A(碳饥饿蛋白A) EP1108790WO0100804 AX120811AX066109
dps DNA保护蛋白(饥饿过程中的保护蛋白) EP1108790 AX127153
eno 烯醇化酶EC4.2.1.11(烯醇化酶) EP1108790WO0100844EP1090998Hermann et al.，Electrophoresis19：3217-3221(1998) AX127146AX064945AX136862
fda 果糖二磷酸醛缩酶EC4.1.2.13(果糖-1，6-二磷酸醛缩酶) von derOsten et al.，Molecular Microbiology3(11)：1625-37(1989) X17313
gap 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶) EP1108790WO0100844Eikmanns et al.，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) AX127148AX064941X59403
gap2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2) EP1108790WO0100844 AX127146AX064939
gdh 谷氨酸脱氢酶EC1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶) EP1108790WO0100844Boermann et al.，MolecularMicrobiology6：317-326(1992).Guyonvarch et al.，NCBI AX127150AX063811X59404X72855
ilvBN 乙酰乳酸合酶EC4.1.3.18(乙酰乳酸合酶) Keilhauer et al.，Journal ofBacteriology175(17)：5595-603(1993)EP1108790 L09232AX127147
ilvC 还原异构酶EC1.1.1.86(乙酰羟酸还原异构酶) Keilhauer et al.，Journal ofBacteriology175(17)：5595-603(1993)EP1108790 C48648AX127147
ilvD 二羟酸脱水酶EC4.2.1.9(二羟酸脱水酶) EP1006189 AX136925
ilvE 转氨酶BEC2.6.1.42(转氨酶B) EP1108790 AX136925
 
msiK 糖输入蛋白(多种糖输入蛋白) EP1108790 AX120892
pgk 磷酸甘油酸激酶EC2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶) EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) AX121838AX127148AX064943X59403
ptsH 磷酸转移酶系统蛋白HEC2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H) EP1108790WO0100844 AX122210AX127149AX069154
ptsI 磷酸转移酶系统酶IEC2.7.3.9 EP1108790 AX122206AX127149
ptsM 葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶IIEC2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II) Lee et al.，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145(1994) L18874
sigC Sigma因子CEC2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子C) EP1108790 AX120368AX120085
sigD RNA聚合酶Sigma因子DEC2.7.7.6(RNA聚合酶sigma因子) EP1108790 AX120753AX127144
sigE Sigma因子EEC2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子E) EP1108790 AX127146AX121325
sigH Sigma因子HEC2.7.7.6(sigma因子SigH) EP1108790 AX127145AX120939
sigM Sigma因子MEC2.7.7.6(sigma因子SigM) EP1108790 AX123500AX127145
tpi 丙糖磷酸异构酶EC5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶) Eikmanns，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992) X59403
zwa1 细胞生长因子1(细胞生长因子1) EP1111062 AX133781
表9用于整合缬氨酸生产的开放读框、基因和等位基因的另外的基因位点
 
基因名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献 登录号
aecD βC-S裂合酶EC2.6.1.1(βC-S裂合酶) Rossol et al.，Journal ofBacteriology174(9)：2968-77(1992) M89931
ccpA1 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A1) WO0100844EP1108790 AX065267AX127147
ccpA2 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2) WO0100844EP1108790 AX065267AX121594
citA 传感蛋白激酶CitA(传感蛋白激酶CitA) EP1108790 AX120161
citB 转录调节物CitB(转录调节物CitB) EPI108790 AX120163
citE 柠檬酸裂合酶EC4.1.3.6(柠檬酸裂合酶) WO0100844EP1108790 AX065421AX127146
ddh 二氨基酸庚二酸脱氢酶EC1.4.1.16(二氨基酸庚二酸脱氢酶) Ishino et al.，Nucleic AcidsResearch15：3917-3917(1987)EP1108790 S07384AX127152
gluA 谷氨酸转运ATP结合蛋白(谷氨酸转运ATP结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluB 谷氨酸结合蛋白(谷氨酸结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluC 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
gluD 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology177(5)：1152-8(1995) X81191
glyA 甘氨酸羟甲基转移酶EC2.1.2.1(甘氨酸羟甲基转移酶) WO0100843 AX063861AF327063
ilvA 苏氨酸脱水酶EC4.2.1.16(苏氨酸脱水酶) Mockel et al.，Journal ofBacteriology174(24)，8065-8072(1992)EP1108790 A47044L01508AX127150
luxR 转录调节物LuxR(转录调节物LuxR) WO0100842EP1108790 AX065953AX123320
lysR1 转录调节物LysR1(转录调节物LysR1) EP1108790 AX064673AX127144
lysR2 转录激活物LysR2(转录调节物LysR2) EP1108790 AX123312
 
lysR3 转录调节物LysR3(转录调节物LysR3) WO0100842EP1108790 AX065957AX127150
panB 酮泛解酸羟甲基转移酶EC2.1.2.11(酮泛解酸羟甲基转移酶) US6177264 X96580
panC 泛酸合成酶EC6.3.2.1(泛酸合成酶) US6177264 X96580
poxB 丙酮酸氧化酶EC1.2.3.3(丙酮酸氧化酶) WO0100844EP1096013 AX064959AX137665
zwa2 细胞生长因子2(生长因子2) EP1106693EP1108790 AX113822AX127146
本发明相应地还提供了一种生产棒状细菌的方法，所述细菌产生L-缬氨酸，所述方法的特征在于：
a)分离用于缬氨酸生产的所需ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，任选地包括表达和/或调节信号，
b)将用于缬氨酸生产的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列的至少两个拷贝排列成一列，优选串联排列，
c)将根据b)获得的核苷酸序列掺入一载体中，所述载体在棒状细菌中不复制或者只有限程度复制，
d)将根据b)或c)的核苷酸序列转移进棒状细菌中，
e)分离这样的棒状细菌，所述细菌在特定的希望的天然位点具有用于缬氨酸生产的所需的ORF、基因或等位基因的至少两个拷贝，而不是最初存在的ORF、基因或等位基因的单拷贝，在该特定的天然位点(基因座)没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
f)任选地将用于缬氨酸生产的ORF、基因或等位基因的至少第三个拷贝导入另一个基因位点，在所述另一个基因位点没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
在实施本发明期间，可以将串联排列的lysCFBR等位基因的两个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的lysC基因位点，同时使该lysC基因位点中没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。这种菌株例如是菌株DSM13992lysCFBR∷lysCFBR。
可以用于将lysCFBR等位基因的两个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的lysC基因位点的质粒pK18mobsacB2xlysCSma2/1示于图1。
在实施本发明期间，还可以将串联排列的lysE等位基因的两个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的lysE基因位点，同时使该lysE基因位点中没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。这种菌株例如是菌株ATCC21513_17lysE∷lysE。
可以用于将lysE基因的两个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的lysE基因位点的质粒示于图2。所述质粒称为pK18mobsacB2xlysESmal/l。
最后，在实施本发明期间，可以将串联排列的zwa1基因的两个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的zwa1基因位点，同时使该zwa1基因位点中没有能/使得在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。这种菌株例如是菌株ATCC21513_17zwa1∷zwa1。
可以用于将zwa1基因的两个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的zwa1基因位点的质粒示于图3。所述质粒称为pK18mobsacBzwa1zwa1。
为生产化合物，根据本发明产生的棒状细菌可以连续培养或者不连续培养，所述不连续培养是分批培养或补料分批培养或者重复补料分批培养。已知培养方法的概述见Chmiel所著教材(Bioprozesstechnik1.Einfhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas所著教材(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(美国华盛顿D.C.，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃—40℃。持续培养直至所需产物形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
已经发现本发明的棒状细菌，尤其产生L-赖氨酸的棒状细菌，具有令人意想不到的高稳定性。它们在至少10—20，20—30，30—40，40—50个，优选至少50—60，60—70，70—80和80—90个代次或细胞分裂周期过程中保持稳定。
以下微生物已经被保藏：
谷氨酸棒杆菌菌株DSM13992lysCFBR∷lysCFBR以纯培养物形式于2002年6月5日根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号DSM15036。
质粒pK18mobsacB2xlysCSma2/1以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1)的纯培养物形式，根据布达佩斯条约于2001年4月20日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号DSM14244。
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21513_17lysE∷lysE以纯培养物形式，根据布达佩斯条约于2002年6月5日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号DSM15037。
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21513_17zwa1∷zwa1以纯培养物形式，根据布达佩斯条约于2002年6月5日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号DSM15038。
实施例1：在谷氨酸棒杆菌的染色体中产生lysCFBR等位基因lysCT311I的串联重复体
1.1构建串联载体pK18mobsacB2xlysCSma2/1
通过常规方法从谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学140：1817—1828(1994))。
谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中通过多次非定向诱变、选择和突变体选择而产生。该菌株对赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并具有一种反馈抗性天冬氨酸激酶，其对赖氨酸和苏氨酸的混合物(各25mM)的抑制作用不敏感。lysCFBR等位基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：3。在下文也称为lysCT311I。编码的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。这个菌株的纯培养物根据布达佩斯条约于2001年1月16日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)。
借助于聚合酶链反应，扩增携带lysC基因或等位基因的一个DNA节段。基于已知的谷氨酸棒杆菌lysC基因的序列(Kalinowski等，分子微生物学5(5)，1197-1204(1991)；登录号X57226)，选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
lysClbeg(SEQ ID No：15)：
5’TA(G GAT CC)T CCG GTG TCT GAC CAC GGT G3’
lysC2end：(SEQ ID NO：16)：
5’AC(G GAT CC)G CTG GGAAATTGC GCT CTT CC3’
所示引物由MWG Biotech合成，PCR反应通过Innis等所述标准PCR方法进行(PCR方案，方法与应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增长度大约为1.7kb的一个DNA节段，其携带lysC基因或等位基因。另外所述引物含有限制性内切酶BamHI的切割位点的序列，其在以上所示核苷酸序列中用括号标示。
携带菌株DSM13994的lysCFBR等位基因lysC T311I的长度大约为1.7kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳鉴别，从凝胶中分离并通过常规方法纯化(QIA快速凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
然后利用Topo TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，Cat.Number K4600-01)，在载体pCRII-TOPO中进行片段连接。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)中。将转化混合物铺板于含有卡那霉素(50mg/l)、具有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，64mg/l)的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
获得的质粒在分离DNA后通过限制切割而检测，并在琼脂糖凝胶中电泳。所得质粒称为pCRIITOPOlysC。
扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列通过Sanger等所述双脱氧链终止方法测定(美国科学院院报74：5463-5467(1977))，使用PE Applied Biosystems的ABI Prism3777测序设备(Weiterstadt，德国)。所述PCR产物的编码区序列示于SEQ ID No：3。相关天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。
碱基胸腺嘧啶在菌株DSM13994的lysCFBR等位基因编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)的第932位发现。碱基胞嘧啶在野生型基因的相应位置发现(SEQ ID NO：1)。
异亮氨酸在菌株DSM13994的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No：4)的第311位发现。苏氨酸在野生型蛋白的相应位置蛋白发现(SEQ ID No：2)。
在编码区第932位含有胸腺嘧啶并因此编码在氨基酸序列第311位含有异亮氨酸的天冬氨酸激酶蛋白的lysC等位基因，在下文称为lysCFBR等位基因lysC T311I。
携带lysCFBR等位基因lysC T311I的质粒pCRIITOPOlysC，根据布达佩斯条约于2001年4月20日以大肠杆菌菌株TOP10/pCRIITOPOlysC的纯培养物形式保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM14242。
从携带质粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242中分离质粒DNA，用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)，借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，将大约1.7kb的含有lySCFBR的DNA片段从琼脂糖凝胶中分离，用Klenow聚合酶(Boehringer，Mannheim)形成突出端并用于与Schafer等所述可移动克隆载体pK18mobsacB(基因14，69—73(1994))连接。该载体预先用限制酶SmaI切割并用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德国)，将其与大约1.7kb的含有lysCFBR片段混合，将所述混合物用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant et al.，PNAS USA，87(1990)4645-4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过酶HindIII限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacB2xlysCSma2。
在第二步中，将质粒pCRII-TOPOlysC用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)，借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，将大约1.7kb的含有lySCFBR的DNA片段从琼脂糖凝胶中分离，并用于与本实施例所述载体pK18mobsacBlysCSma2连接。将该载体预先用限制酶BamHI切割并用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，BoehringerMannheim，德国)，之后与大约1.7kb的含有lysCFBR的片段混合，将所述混合物用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant等，美国科学院院报87(1990)4645—4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过酶HindIII限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacB2xlysCSma2/1。该质粒图示于图1。
根据布达佩斯条约，质粒pK18mobsacB2xlysCSma2/1于2001年4月20日以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacB2xlysCSma2/1)的纯培养物形式保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM14244。
1.2在谷氨酸棒杆菌菌株DSM13992中产生lysCFBR等位基因lysCT311I的串联重复体
将实施例1.1中所述载体pK18mobsacB2xlysCSma2/1转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM13992中，通过对Schafer等所述方法加以修改后的方法进行(1990，微生物学杂志172：1663—1666)。
谷氨酸棒杆菌菌株DSM13992从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中通过多次非定向诱变、选择和突变体选择而产生。该菌株对链霉素有抗性并对赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有表型抗性。然而该菌株具有一种野生型天冬氨酸激酶(见SEQ ID NO：1和2)，其对赖氨酸和苏氨酸的混合物(各25mM)的抑制作用敏感。这个菌株的纯培养物根据布达佩斯条约于2001年1月16日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)。
载体pK18mobsacB2xlysCSma2/1在DSM13992中不能独立复制，而只有整合入染色体中才保留在细胞中。
将接合混合物铺板于补加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港，纽约，1989)上对具有整合的pK18mobsacB2xlysCSma2/1的克隆进行选择。将生长的克隆铺板于具有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上，在33℃温育16小时。为切除只具有一个拷贝的lysC基因的质粒，在LB液态培养基中温育16小时之后，将所述克隆在具有10％蔗糖的LB琼脂上培养。质粒pK18mobsacB含有一个拷贝的sacB基因，其将蔗糖转变为对谷氨酸棒杆菌有毒性的果聚糖。
因此只有其中已经再次切除整合的pK18mobsacB2xlysCSma2/1的那些克隆能在具有蔗糖的LB平板上生长。对大约40—50个菌落测试“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。在切除期间，lysC基因的两个拷贝或者仅一个拷贝可以与所述质粒一起切除。
为证实lysC的两个拷贝保留在染色体中，借助于Innis等所述标准PCR方法进行的聚合酶链反应(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)研究示出“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的大约20个菌落。从所述菌落的染色体DNA中扩增携带lysC基因和周围区域的DNA片段。选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
lysCK1(SEQ ID NO：5)：
5’TCG GTG TCA TCA GAG CAT TG3’
lysCK2(SEQ ID NO：6)：
5’TCG GTT GCC TGA GTAATG TC3’
所述引物在具有原始lysC基因座的对照克隆中扩增出大约1.9kb的DNA片段。在染色体lysC基因座中具有lysC基因的第二个拷贝的克隆中，扩增出大约3.6kb的DNA片段。
扩增的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而鉴别。基于扩增的片段长度，对具有一个染色体lysC基因拷贝的克隆和具有两个染色体lysC基因拷贝的克隆加以区分。
借助于Roche Diagnostics的LightCycler(Mannheim，德国)，研究在染色体上具有lysC基因两个完整拷贝的10个克隆，以证实这两个拷贝是否是具有突变体lysC T311I的lysCFBR等位基因，或者原始野生型lysC是否存在于lysCFBR等位基因lysC T311I的两侧。所述LightCycler是一种热循环仪和荧光计组合设备。
使用以下寡核苷酸引物通过PCR在第一阶段扩增出含有突变位点的大约500bp的DNA节段(Innis等，PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)，所述引物为：
LC-lysCl-fbr(SEQ ID NO：7)：
5’aaccgttctgggtatttccg3’
LC-lysC2-fbr(SEQ ID NO：8)：
5’tccatgaactctgcggtaac3’
在第二阶段，用不同长度的及用不同荧光染料(光循环仪(LC)—Red640和荧光素)标记的另外两个寡核苷酸，借助于“荧光共振能量转移”方法(FRET)，使用解链曲线分析(Lay等，临床化学43：2262—2267(1997))检测突变的存在，所述寡核苷酸在突变位点区域中杂交，其为：
lysC311-C(SEQ ID NO：9)：
5’LC-Red640—gcaggtgaagatgatgtcggt—(P)3’
lysC311-A(SEQ ID NO：10)：
5’tcaagatctccatcgcgcggcggccgtcggaacga—荧光素3’
所示进行PCR的引物由MWG Biotech合成，所示进行杂交的寡核苷酸由TIB MOLBIOL(德国柏林)合成。
以此方式鉴别一个克隆，其在两个lysC拷贝的编码区的第932位含有碱基胸腺嘧啶，并因此具有两个lysCFBR等位基因lysC T311I。
所述菌株称为谷氨酸棒杆菌DSM13992lysCFBR∷lysCFBR。
所述菌株谷氨酸棒杆菌DSM139921ysCFBR∷lysCFBR根据布达佩斯条约，于2002年6月5日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM15036。
实施例2：在谷氨酸棒杆菌的染色体中产生lysE基因的串联重复体
2.1构建串联载体pK18mobsacB2xlysESmal/l
从大肠杆菌菌株DSM12871(EP-A-1067193)中分离携带质粒pEC7lysE的质粒DNA。
所述质粒含有编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因。这个菌株的纯培养物根据布达佩斯条约，于1999年6月10日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)。
将质粒pEC7lysE用限制酶BamHI(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割，在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从琼脂糖凝胶中分离大约1.1kb的lysE片段，用Klenow聚合酶(Boehringer，Mannheim)形成突出端并用于与Schafer等所述可移动克隆载体pK18mobsacB(基因14，69—73(1994))连接。将该载体预先用限制酶SmaI切割并用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德国)，其与大约1.1kb的lysE片段混合，将所述混合物用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant等，美国科学院院报87(1990)4645—4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过酶BamHI和EcoRI限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBlxlysESmal。
在第二步中，将质粒pEC7lysE用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)，借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，将大约1.1kb的lysE片段从琼脂糖凝胶中分离，并用于与本实施例所述载体pK18mobsacBlxlysESmal连接。将该载体预先用限制酶BamHI切割，用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德国)，之后与大约1.1kb的lysE片段混合，将所述混合物用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant等，美国科学院院报87(1990)4645—4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过酶EcoRI和SalI或者ScaI限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacB2xlysESmal/l。该质粒图示于图2。
2.2在谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21513_17中产生lysE基因的串联重复体
将实施例2.1中所述载体pK18mobsacB2xlysESmal/l转移进谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21513_17中，通过对Schafer等所述方法加以修改后的方法进行(1990，微生物学杂志172：1663—1666)。
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21513_17从谷氨酸棒杆菌ATCC21513中通过多次非定向诱变、选择和突变体选择而产生。该菌株对赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并且是亮氨酸和高丝氨酸原养型。
所述载体在ATCC21513_17不能独立复制，而只有整合入染色体中才保留在细胞中。
将接合混合物铺板于补加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港，纽约，1989)上，对具有整合的pK18mobsacB2xlysESmal/l的克隆进行选择。将生长的克隆铺板于具有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上，在33℃温育16小时。为切除只具有一个拷贝的lysE基因的质粒，在LB液态培养基中温育16小时之后，将所述克隆在具有10％蔗糖的LB琼脂上培养。质粒pK18mobsacB含有一个拷贝的sacB基因，其将蔗糖转变为对谷氨酸棒杆菌有毒性的果聚糖。
因此只有其中已经再次切除整合的pK18mobsacB2xlysESmal/l的那些克隆能在具有蔗糖的LB平板上生长。对大约40—50个菌落测试“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。在切除期间，lysE基因的两个拷贝或者仅一个拷贝可以与所述质粒一起切除。
为证实lysE的两个拷贝保留在染色体中，借助于Innis等所述标准PCR方法进行的聚合酶链反应(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)研究示出“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的大约20个菌落。从所述菌落的染色体DNA中扩增携带lysE基因和周围区域的DNA片段。选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
lysEK—1(SEQ ID NO：11)：
5’TTGC TTG CAC AAG GAC TTC AC3’
lysEK—2(SEQ ID NO：12)：
5’TAT GGT CCG CAA GCT CAA TG3’
所述引物在具有原始lysE基因座的对照克隆中扩增出大约1.2kb的DNA片段。在染色体lysE基因座中具有lysC基因的第二个拷贝的克隆中，扩增出大约2.3kb的DNA片段。
扩增的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而鉴别。基于扩增的片段长度，对具有一个染色体lysE基因拷贝的克隆和具有两个染色体lysE基因拷贝的克隆加以区分。因此可以证实菌株ATCC21513_17在染色体上携带lysE基因的两个完整拷贝。
所述菌株称为谷氨酸棒杆菌ATCC21513_17lysE∷lysE。
所述菌株谷氨酸棒杆菌ATCC21513_17lysE∷lysE根据布达佩斯条约，于2002年6月5日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM15037。
实施例3：在谷氨酸棒杆菌染色体中产生zwa1基因的串联重复体3.1构建串联载体pK18mobsacBzwa1zwa1
从携带质粒pCR2.1zwa1exp的大肠杆菌菌株DSM13115(EP-A-1111062)中分离质粒DNA。
所述质粒含有编码细胞生长因子1的zwa1基因。这个菌株的纯培养物根据布达佩斯条约，于1999年10月19日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)。
将质粒pCR2.1zwa1exp用限制酶EcoRI(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割，在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从琼脂糖凝胶中分离1kb的zwa1片段，并用于与Schafer等所述可移动克隆载体pK18mobsacB(基因14，69—73(1994))连接。将该载体预先用限制酶EcoRI切割并用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德国)，之后与1kb的zwa1片段混合，将所述混合物用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant等，美国科学院院报87(1990)4645—4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过酶NheI限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。对质粒的检测结果示出两个zwa1片段同时以所希望方向的克隆在克隆载体pK18mobsac中。所述质粒称为pK18mobsacBzwa1zwa1。该质粒图示于图3。
3.2在谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21513_17中产生zwa1基因的串联重复体
将实施例3.1中所述载体pK18mobsacBzwa1zwa1转移进谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21513_17中，通过对Schafer等所述方法加以修改后的方法进行(1990，微生物学杂志172：1663—1666)。
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC21513_17从谷氨酸棒杆菌ATCC21513中通过多次非定向诱变、选择和突变体选择而产生。该菌株对赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并且是亮氨酸和高丝氨酸原养型。
所述载体在ATCC21513_17不能独立复制，而只有整合入染色体中才保留在细胞中。
将接合混合物铺板于补加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港，纽约，1989)上，对具有整合的pK18mobsacBzwa1zwa1的克隆进行选择。将生长的克隆铺板于具有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上，在33℃温育16小时。为切除只具有一个拷贝的zwa1基因的质粒，在LB液态培养基中温育16小时之后，将所述克隆在具有10％蔗糖的LB琼脂上培养。质粒pK18mobsacB含有一个拷贝的sacB基因，其将蔗糖转变为对谷氨酸棒杆菌有毒性的果聚糖。
因此只有其中已经再次切除整合的pK18mobsacBzwa1zwa1的那些克隆能在具有蔗糖的LB平板上生长。对大约40—50个菌落测试“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的表型。在切除期间，zwa1基因的两个拷贝或者仅一个拷贝可以与所述质粒一起切除。
为证实有zwa1的两个拷贝保留在染色体中，借助于Innis等所述标准PCR方法进行的聚合酶链反应(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)研究示出“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的大约20个菌落。从所述菌落的染色体DNA中扩增携带zwa1基因和周围区域的DNA片段。选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
zwa1-A2(SEQ ID NO：13)：
5’CAC TTG TCC TCA CCA CTT TC3’
zwa1-E1(SEQ ID NO：14)：
5’TTC TAC TGG GCG TAC TTT CG3’
所述引物在具有原始zwa1基因座的对照克隆中扩增出大约1.3kb的DNA片段。在染色体zwa1基因座中具有zwa1基因的第二个拷贝的克隆中，扩增出大约2.3kb的DNA片段。
扩增的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而鉴别。基于扩增的片段长度，对具有一个染色体zwa1基因拷贝的克隆和具有两个染色体zwa1基因拷贝的克隆加以区分。因此可以证实菌株ATCC21513_17在染色体上携带zwa1基因的两个完整拷贝。
所述菌株称为谷氨酸棒杆菌ATCC21513_17zwa1zwa1。
所述菌株谷氨酸棒杆菌ATCC21513_17zwa1zwa1根据布达佩斯条约，于2002年6月5日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM15038。
实施例4：生产赖氨酸
将在实施例1—3中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM13992lysCFBR∷lysCFBR，ATCC21513_17lysE∷lysE和ATCC21513_17zwa1∷zwa1，在适于赖氨酸生产的营养培养基中培养，测定培养上清中赖氨酸含量。
为此，首先在33℃将菌株在琼脂平板上温育24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是MM培养基。在摇床上以240rpm于33℃温育预培养物24小时。用这一预培养物接种主培养物，由此主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM也用作主培养物。
培养基MM：
CSL                  5g/l
MOPS                 20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l
盐：
(NH4)2SO4             25g/l
KH2PO4                0.1g/l
MgSO4·7H2O           1.0g/l
CaCl2·2H2O           10mg/l
FeSO4·7H2O           10mg/l
MnSO4·H2O            5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)       0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)  0.2mg/l
CaCO3                 25g/l
用氨水将CSL(玉米浆)，MOPS(吗啉代丙磺酸)和所述盐溶液的pH调节为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及在干燥状态下高压灭菌的CaCO3。
在具有挡板的100ml锥形瓶中以10ml体积进行培养。在33℃和80％湿度下进行培养。
48小时后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长下测定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表10。
表10
 
菌株 OD(660nm) 盐酸赖氨酸g/l
DSM13992 12.8 18.9
DSM13992lysCFBR∷lysCFBR 12.0 21.6
ATCC21513_17 10.4 14.0
ATCC21513_17lysE∷lysE 10.0 14.3
ATCC21513_17zwa1∷zwa1 9.9 14.6
附图简述：
示出的碱基对数目是在重复测定中获得的近似值。
图1：质粒pK18mobsacB2xlysCSma2/1图。
所用缩写和名称具有以下含义：
KmR：卡那霉素抗性基因
HindIII：限制酶HindIII的切割位点
BamHI：限制酶BamHI的切割位点
lysC：lysCFBR等位基因lysC T311I
sacB：sacB基因
RP4mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域
oriV：复制起点V
图2：质粒pK18mobsacB2xlysESmal/l图。
所用缩写和名称具有以下含义：
KanR：卡那霉素抗性基因
SalI：限制酶SalI的切割位点
BamHI：限制酶BamHI的切割位点
EcoRI：限制酶EcoRI的切割位点
ScaI：限制酶ScaI的切割位点
lysE：lysE基因
sacB：sacB基因
RP4mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域
oriV：复制起点V
图3：质粒pK18mobsacBzwa1zwa1图。
所用缩写和名称具有以下含义：
KanR：卡那霉素抗性基因
EcoRI：限制酶EcoRI的切割位点
NheI：限制酶NheI的切割位点
zwa1：zwa1基因
sacB：sacB基因
RP4mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域
oriV：复制起点V
序列表
<110>德古萨股份公司
<120>生产化合物II的棒状细菌
<130>DEDEG0504
<160>14
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>1263
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1263)
<223>lysC野生型基因
<400>1
Figure S071D7163420070807D000641
Figure S071D7163420070807D000651
<210>2
<211>421
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>2
Figure S071D7163420070807D000671
<210>3
<211>1263
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1263)
<223>lysC-fbr等位基因lysC T311I
<400>3
Figure S071D7163420070807D000681
Figure S071D7163420070807D000691
<210>4
<211>421
<212>PRT
<213>Corynebacteriumglutamicum
<400>4
Figure S071D7163420070807D000701
Figure S071D7163420070807D000711
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物lysCK1
<400>5
Figure S071D7163420070807D000712
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物lysCK2
<400>6
Figure S071D7163420070807D000721
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>LC-lysCl-fbr
<400>7
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<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>LC-lysC2-fbr
<400>8
Figure S071D7163420070807D000723
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<223>寡核苷酸lysC311-C
<400>9
<210>10
<211>35
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(35)
<223>寡核苷酸lysC311-A
<400>10
Figure S071D7163420070807D000731
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物lysEK-1
<400>11
Figure S071D7163420070807D000732
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物lysEK-2
<400>12
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物zwa1-A2
<400>13
Figure S071D7163420070807D000734
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物zwa1-E1
<400>14
Figure S071D7163420070807D000741

Claims (17)

1.高度稳定地生产选自L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸的L-氨基酸的棒状细菌，其中所述细菌具有至少两个拷贝的用于生产所述L-氨基酸的基因，所述拷贝在所述细菌中串联排列于其天然的位点，且所述基因选自：
a)对于生产L-赖氨酸：
由以下所组成的组的一个或多个基因：accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap，gap2，gdh，gnd，lysC，lysCFBR，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，Pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwal，zwf和zwfA213T；
b)对于生产L-甲硫氨酸：
由以下所组成的组的一个或多个基因：accBC，accDA，aecD，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，glyA，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，metA，metB，metE，metH，metY，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwal，zwf和zwfA213T；
c)对于生产L-苏氨酸：
由以下所组成的组的一个或多个基因：accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysI，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，thrB，thrC，thrE，zwal，zwf和zwfA213T；
d)对于生产L-缬氨酸：
由以下所组成的组的一个或多个基因：brnE，brnF，brnEF，cstA，cysD，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，ilvB，ilvN，ilvBN，ilvC，ilvD，ilvE msiK，pgk，ptsH，ptsI，ptsM，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tpi和zwal；
其中所述细菌通过用在棒状细菌中不复制并携带两个拷贝的串联排列的所述基因的载体进行转化而获得，且在所述基因的两侧残留所用载体序列的0-24个核苷酸残基。
2.权利要求1的棒状细菌，其在另一个基因位点还具有所述基因的至少第三个拷贝，其中在所述第三个拷贝的两侧残留所用载体的0-24个核苷酸残基。
3.权利要求1的棒状细菌，其中所述细菌在所述天然的位点不含提供抗生素抗性的核苷酸序列。
4.权利要求2的棒状杆菌，其中所述细菌在所述天然的位点和所述另一个基因位点不含提供抗生素抗性的核苷酸序列。
5.权利要求1或2的棒状细菌，其生产L-赖氨酸，所述棒状细菌具有至少两个拷贝的选自以下一组的基因：lysCFBR，lysE和zwal。
6.权利要求1或2的棒状细菌，其生产L-赖氨酸，所述棒状细菌具有至少两个拷贝的lysE基因。
7.权利要求1或2的棒状细菌，其生产L-赖氨酸，所述棒状细菌具有至少两个拷贝的zwal基因。
8.权利要求1或2的棒状细菌，其生产L-赖氨酸，其中编码反馈抗性形式的天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因为两个拷贝。
9.权利要求8的棒状细菌，其中编码反馈抗性形式的天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因为两个拷贝，所述反馈抗性形式的天冬氨酸激酶由含有选自以下一组的一个或多个氨基酸置换的SEQ ID NO：2的序列组成：A279V，S301F，T308I，S301Y，G345D，R320G，T311I和S381F。
10.权利要求8的棒状细菌，其中所述反馈抗性形式的天冬氨酸激酶由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成。
11.权利要求8的棒状细菌，其中所述lysCFBR等位基因由SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列组成。
12.权利要求1、10或11的棒状细菌，其包含串联排列的一个拷贝的lysC基因和一个拷贝由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成的lysCFBR等位基因。
13.权利要求1或2的棒状细菌，其中所述棒状细菌属于棒杆菌属。
14.权利要求13的棒杆菌属的棒状细菌，其中所述细菌属于谷氨酸棒杆菌菌种。
15.生产选自L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸的L-氨基酸的方法，该方法包括：
a)发酵权利要求1-14中任一项的棒状细菌。
16.权利要求15的方法，其包括：
a)浓缩发酵肉汤和/或细菌细胞中的所述L-氨基酸，和
b)从所述发酵肉汤分离所述L-氨基酸。
17.权利要求16的方法，其包括：
a)从所述发酵肉汤分离所述L-氨基酸，其伴有大于0wt％至100wt％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
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