CN101107364A - 产率增加的植物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过增加植物中OsMADS18样多肽或其同源物的活性来增加植物产率的方法，一种这样的方法包括向植物中引入OsMADS18样核酸或其变体。本发明也涉及已向其中引入了OsMADS18样核酸或其变体的转基因植物，所述植物相对于相应的野生型植物具有增加的产率。本发明也涉及在本发明方法中有用的构建体。

Description

产率增加的植物及其制备方法

发明领域

本发明总体上涉及分子生物学领域，并且涉及相对于相应的野生型植物而言增加植物产率的方法。更加具体而言，本发明涉及通过增加植物中稻(Oryza sativa)(Os)MADS18样多肽或其同源物的活性来增加植物产率的方法。本发明还涉及OsMADS18样多肽或其同源物活性增加的植物，所述植物相对于相应的野生型植物具有增加的产率。本发明还提供了在本发明方法中有用的构建体

发明背景

不断增加的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地迫使研究朝向提高农业的效率。传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有预期性状的植物。然而，此类选育技术有一些缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常包含异质的遗传组分，当这些异质的遗传组分从亲本植物传递时不一定产生预期的性状。分子生物学的进展已经允许人类修饰动物和植物的种质。植物基因工程需要分离和操作遗传物质(一般以DNA或RNA的形式)以及随后将遗传物质引入植物。这类技术具有传递具多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物的能力。在经济上特别让人感兴趣的性状是产率。产率通常定义为作物可测量经济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产率直接取决于几个因素，例如器官的数量和大小、植物构造(例如，分枝的数量)、种子产量等等。根的发育、营养吸收和胁迫耐受性也是决定产率的重要因素。可以通过优化上述因素之一来增加作物产率。

增加植物产率的能力将在诸如农业，包括观赏植物的生产、树木栽培(aboriculture)、园艺学和林业等领域具有许多应用。现已发现，相对于相应的野生型植物，增加植物中OsMADS18样多肽的活性使植物具有增加的产率。

MADS盒基因(酵母MCM1、植物Agamous和Deficiens以及人SRF(血清反应因子))构成一大类真核细胞转录调控基因家族，参与酵母、植物和动物发育的方方面面。MADS盒基因编码强烈保守的MADS结构域，负责与其靶基因调控区中的特定盒进行DNA结合。此基因家族可划分为两个主要世系，I型和II型。II型基因也称为MIKC型蛋白，源于其所拥有的四个功能结构域(见图1，摘自Jack(2001)Plant Molec Biol 46：515-520)：

-MADS代表DNA结合，位于蛋白N末端的大约60氨基酸(高度保守)；

-I代表居间结构域(intervening domain) (次保守)，参与MADS二聚体的选择性形成；

-K代表负责二聚化的角蛋白结构域(充分保守)；

-C代表参与转录激活或多聚转录因子复合物形成的C末端区域(序列和长度可变)。

已在拟南芥(Arabidopsis)中鉴定到100多个MADS盒基因，并且已按系统发生学归类为12个进化枝，每个进化枝与MADS共有序列具有特殊的偏移(Thiessen等(1996)J Mol Evol 43：484-516)。OsMADS18(以前称为FDRMADS7或OsMADS28)，连同如下拟南芥基因：FUL/Agl8(FRUITFULL)、CAL/Agl10(CAULIFLOWER)、AP1/Agl7(APETALA1)和表征较少的MADS AGL79，均属于SQUA进化枝(代表SQUAMOSA，来自金鱼草(Antirrhinum majus))。SQUA进化枝的基因为参照Coen和Meyerowitz于1991年(Nature 353：31-7)提出的ABC花器官特征说明模型(ABC floral organ identity specification model)的功能器官特征基因。稻拥有四个A类基因：OsMADS14、OsMADS15、OsMADS18和OsMADS20，每一个都是SQUA进化枝的成员。

双子叶植物的SQUA进化枝被再分为两个亚枝，AP1和FUL亚进化枝。这些亚进化枝基本上在位于其相应蛋白C末端的特异性氨基酸基序方面存在差异(Litt和Irish(2003)Genetics 165：821-833)。除了存在特异性AP1氨基酸基序之外，双子叶植物AP1进化枝相关蛋白通常还在其C末端含有法尼基化(farnesylation)基序(此基序为CAAX，其中C为半胱氨酸，A通常为脂肪族氨基酸，而X为甲硫氨酸、谷酰胺(glutamine)、丝氨酸、半胱氨酸或丙氨酸)。在单子叶植物中，SQUA进化枝蛋白也被再分为两大组，这可以基于位于其蛋白最后15个氨基酸中的保守C末端基序予以区分：LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)和LPPWMLSH(SEQ ID NO：19)(图2)。与SQUA进化枝双子叶植物的序列形成对比，SQUA进化枝单子叶植物的序列其C末端没有法尼基化基序。

OsMADS18与玉米ZMM28多肽及大麦m3多肽聚集成簇(Becker和Thiessen(2003)Mol Phylogenet Evol 29(3)：464-89)。所有这三种蛋白在其C末端大约最后15个氨基酸中均含有LPPWMLRT氨基酸基序。来自SQUA进化枝的两个其他稻MADS盒蛋白，OsMADS14和OsMADS15，属于在其C末端大约最后15个氨基酸中具有LPPWMLSH基序的亚进化枝。对于这两类基序，LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)和LPPWMLSH(SEQ ID NO：19)，最保守的氨基酸位于第二位(P代表脯氨酸)和第四位(W代表色氨酸)。

OsMADS18为一种广泛表达的基因，其RNA可在根、叶、花和发育的果仁组织中检测到(Masiero等(2002)J Biol Chem 277(29)：26429-35)。OsMADS18可能参与从营养生长向开花的转变(Fornara等(2004)PlantPhysiol 135(4)：2207-19)。OsMADS18在稻中的组成型过表达作为植物成熟加速的后果导致植物矮化和早期开花。

在酵母双杂交实验中，已证明OsMADS18与OsMADS6、OsMADS24、OsMADS45和OsMADS47形成异源二聚体。OsMADS18还与OsNF-YB1特异性地相互作用，后者与拟南芥Leafy Cotyledon1(LEC1或AtNF-YB9)享有最高的序列同一性。也已经证明了三种蛋白OsMADS18、OsMADS6和OsNF-YB1之间三重复合物的形成(Masiero等(2002)J Biol Chem 277(29)：26429-35)。

Yanofsky等在US 6,229,068 B1中描述了利用AGL8相关基因产物并在植物中异位表达之来增加植物种子(或果实)大小的方法。该文献中提及的用于异位表达AGL8相关基因产物的优选调控元件是组成型的、种子偏好型的或诱导型的元件。

国际专利申请WO 02/33091公开了用于维持开花和植物构造的单子叶植物(来自多年生黑麦草)MADS盒转录因子。国际专利申请WO 03/057877公开了不同大麦品种中具有单核苷酸多态性(SNP)的MADS盒cDNA。

发明内容

根据本发明的一个实施方案，提供了增加植物产率的方法，包括增加植物中OsMADS18样多肽或其同源物的活性，所述OsMADS18样多肽或其同源物为：(i)单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且(iv)与SEQID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。

有利地，实施根据本发明的方法产生产率增加、特别是种子产率增加的植物。

文中所述术语“增加的产率”用来表示任意一种或多种下列参数的增加，每个都相对于相应的野生型植物而言：(i)植物一个或多个部分，特别是地上(可收获)部分增加的生物量(重量)或任何其它可收获部分增加的生物量；(ii)增加的种子产率，这包括种子生物量(种子重量)的增加，并且其可以是每棵植株或单粒种子基础上的种子重量增加或者每公顷或每英亩种子重量的增加；(iii)增加的每个圆锥花序的花(小穗floret)的数量，其表达为饱满种子数占初期(primary)圆锥花序的比率；(iv)增加的(饱满)种子数量；(v)增加的种子充实率(其为饱满种子数除以种子总数并乘以100)；(vi)增加的种子大小，这也可影响种子的组成；(vii)增加的种子体积，这也可影响种子的组成(例如，油、蛋白质和糖类含量的增加以及组成的变化)；(viii)增加的种子面积；(ix)增加的种子长度；(x)增加的种子宽度；(x)增加的种子周长；(xi)增加的收获指数，其表达为可收获部分如种子的产率与总生物量的比率；和(xii)增加的千粒重(TKW)，这通过计数饱满种子数量和它们的总重量外推得到。TKW增加可来自于种子大小和/或种子重量的增加，并且还可以来自胚大小和/或胚乳大小的增加。

以谷物为例，产率增加可以表现为下列一种或多种情况：每公顷或每英亩植物数量的增加、每棵植株谷穗数量的增加、行数、行粒数、粒重量、千粒重、谷穗长度/直径等的增加。以稻为例，产率增加可以表现为下列一个或多个参数的增加：每公顷或每英亩的植物数量、每棵植株的圆锥花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序的花数、种子充实率的增加、千粒重的增加等。产率的增加也可以导致改变的构造，或可以作为改变的构造的结果发生。

根据优选的方面，实施本发明的方法产生具有增加的种子产率的植物。因此，本发明提供了增加植物种子产率的方法，该方法包括增加植物中OsMADS18样多肽或其同源物的活性。

由于本发明的转基因植物具有增加的产率，相对于相应野生型植物在其生命周期相应阶段的生长速率而言，这些植物可能呈现增加的生长速率(至少在其部分生命周期中)。增加的生长速率可以是对植物的一个或多个部分(包括种子)特异性的，或者可以基本上遍及整株植物。具有增加生长速率的植物可以呈现出早期开花。生长速率的增加可以出现在植物生命周期的一个或多个阶段，或者出现在基本上整个植物生命周期的过程中。在植物生命周期的早期阶段，生长速率的增长可以表现为增强的活力。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，使植物能够比其他可能的情况更晚播种和/或更快收获。如果生长速率充分增加，可以允许播种同种植物物种更多的种子(例如完全在一个常规的生长期内，播种和收获稻类植物、接着播种和收获更多的稻类植物)。类似的，如果生长速率充分地增加，可能允许播种不同植物物种更多的种子(例如播种和收获稻类植物，随后，例如，播种和任选的收获大豆、马铃薯或任何其他适合的植物)。在一些作物植物的情况下也可能从同一根茎收获增加的次数。改变植物的收获周期可以导致每英亩年生物量产量的增加(这是由于(比方说在一年中)任何特定植物可以生长和收获次数的增加)。与野生型对应物相比，生长速率的增加还能够在更广阔的地域栽培转基因植物，因为种植农作物的地域限制通常由种植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定。如果缩短收获周期，可以避免这类不利条件。可以通过来自生长曲线的多种参数确定生长速率，这类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小的50％所需时间)和T-90(植物达到其最大大小90％所需时间)等等。

执行本发明的方法赋予植物增加的生长速率。因此，本发明提供了增加植物产率的方法，该方法包括增加植物中OsMADS18样多肽或其同源物的活性。

无论植物处于无胁迫条件下，或植物相对于对照/野生型植物暴露于多种胁迫下，都发生产率和/或生长速率的增加。通常植物通过更加缓慢的生长来应答接触的胁迫。在重度胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在中定义为当植物接触时不导致植物完全停止生长丧失重新开始生长能力的任何胁迫。由于耕作方法(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，栽培的作物植物常常不会遇到重度胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损的生长通常成为农业中不期望的因素。轻度胁迫是植物可能接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物接触的日常生物的和/或非生物的(环境的)胁迫。典型的非生物的或环境的胁迫包括由反常的热或冷/冰冻温度产生的温度胁迫；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量的水)。化学物质也可以引起非生物胁迫。生物的胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。

实施本发明的方法可以在任何植物中有利地实现上述产率的增加。

本文所用术语“植物”包含整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花以及组织和器官，其中上述每一个都包含目的基因/核酸。术语“植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样其中上述每一个都包含目的基因/核酸。

在本发明方法中尤其有用的植物包括所有属于绿色植物(Viridiplantae)总科的植物，尤其是包括选自下列清单的饲料或饲料荚果、观赏植物、食品作物、树木或灌木的单子叶和双子叶植物，其中包括：金合欢属物种(Acacia spp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、七叶树属物种(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathisaustralis)、Albizia amara、三色桫椤(Alsophila tricolor)、须芒草属物种(Andropogon spp.)、落花生属物种(Arachis spp)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、黄芪(Astragalus cicer)、Baikiaea plurijuga、桦木属物种(Betula spp.)、芸苔属物种(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba.farinosa、朱缨花属物种(Calliandra spp)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、决明属物种(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroemapubescens)、木瓜属物种(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、变异小冠花(Coronillia varia)、枸子(Cotoneaster serotina)、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、柏木属物种(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、木梨(Cydonia oblonga)、圆球柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属物种(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、木梨(Cydonia oblonga)、Dalbergiamonetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山马蝗属物种(Desmodiumspp.)、迪卡兰(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆属物种(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、锥穗稗(Echinochloapyramidalis)、Ehrartia spp.、穇子(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺桐属物种(Erythrina spp.)、桉属物种(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、金茅(Eulalia villosa)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、费约罗(Feijoasellowiana)、草雷属物种(Fragaria spp.)、千斤拔属物种(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、银杏(Ginkgo biloba)、Glycinejavanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属物种(Grevilleaspp.)、Guibourtia coleosperma、岩黄芪属物种(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeumvulgare)、Hyparrhenia rufa、小连翅(Hypericum erectum)、Hypertheliadissoluta、白花庭蓝(Indigo incarnata)、鸢尾属物种(Iris spp.)、Leptarrhenapyrolifolia、胡枝子属物种(Lespediza spp.)、莴苣属物种(Lettuca spp.)、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、Lotonus bainesii、百脉根属物种(Lotus spp.)、硬皮豆(Macrotyloma axillare)、苹果属物种(Malus spp.)、Manihot esculenta、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、驴食草属物种(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、非洲双翼豆(Peltophorum africanum)、狼尾草属物种(Pennisetum spp.)、鳄梨(Persea gratissima)、碧冬茄属物种(Petunia spp.)、菜豆属物种(Phaseolusspp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠属物种(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属物种(Pinus spp.)、豌豆(Pisumsativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、欧洲醋粟(Ribesgrossularia)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosa spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、柳属物种(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属物种(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、小麦属物种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsugaheterophylla)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、苋属植物(amaranth)、洋蓟(artichoke)、天门冬属(asparagus)、椰菜(broccoli)、孢子甘蓝(Brussels sprouts)、甘蓝、芸苔(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝(collard greens)、亚麻、无头甘蓝(kale)、兵豆属(lentil)、油菜籽油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜(squash)、茶和藻类等。根据本发明优选的实施方案，植物为诸如大豆、向日葵、芸苔、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草的作物植物。进一步优选地，植物为单子叶植物，例如甘蔗。更加优选地，植物是谷类，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。

可以通过提高多肽的水平来增加OsMADS18样多肽的活性。OsMADS18 mRNA水平也可以提高。备选地，当OsMADS18样多肽水平没有改变，或者甚至当OsMADS18样多肽水平降低的时候，其活性也可以增加。这种情况出现在多肽固有特性发生改变的时候，例如，通过制备比野生型多肽更具活性的突变体形式。

本文定义的术语“OsMADS18样多肽或其同源物”指这样的多肽：(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代且(iv)与SEQ IDNO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。基序中的取代可以是保守取代，但并不限于保守取代。保守氨基酸取代可以替换上述基序中任何一个或多个氨基酸残基，包括第2位和第4位上分别为脯氨酸和色氨酸所占据的残基。在本技术领域可以容易地获得保守取代表。下表给出保守氨基酸取代的实例。

表1：保守氨基酸取代的实例

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln

Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
				Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
				Cys	Ser	Thr	Ser；Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
				Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
				Ile	Leu；Val

可以用本领域内众所周知的常规技术容易地鉴定“OsMADS18样多肽或其同源物”。例如，使用本领域众所周知的技术可以在体外或体内容易地确定DNA结合活性和蛋白质-蛋白质相互作用。DNA结合活性体外测定的实例包括：使用已知MADS盒DNA结合结构域的凝胶阻滞分析(West等(1998)Nucl Acid Res 26(23)：5277-87)，或酵母单杂交测定(yeastone-hybrid assays)。蛋白质-蛋白质相互作用体外测定的实例是酵母双杂交分析(Fields和Song(1989)Nature 340：245-6)。

此外，本领域技术人员也可以简单地通过进行比对并在多肽C末端搜寻该基序，而容易地鉴定上文所定义的基序(SEQ ID NO：18)。类似地，可以通过序列比对容易地确定多肽与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸是否具有至少65％的同一性。序列比对的方法是本领域众所周知的，这类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP应用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48：443-453)来寻找两个完整序列的比对，使匹配数最大化和空位数最小化。BLAST算法(Altschul等(1990)JMol Biol 215：403-10)计算序列同一性的百分比，并对两序列之间的相似性进行统计分析。执行BLAST分析的软件可从生物技术信息国家中心公开地获得。例如，在其蛋白最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ IDNO：18)并与SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列具有至少65％同一性的OsMADS18同源物，可利用如下ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)容易地进行鉴定：http://clustalw.genome.jp/sit-bin/nph-clustalw，使用如下两两比对参数：K-tuple(字长)大小为1，窗口大小为5，空位罚分为4，顶对角线(top diagonal)数为5，并使用百分比的记分方法。

为术语“OsMADS18样多肽或其同源物”所涵盖的植物来源多肽的实例包括(参见表2)：来自稻的OsMADS18 AF091458(SEQ ID NO：2)，来自玉蜀黍的ZMM28(或m28)AJ430695(SEQ ID NO：4)，来自黑麦草(Lolium perenne)的MADS3 AY198328(SEQ ID NO：6)，来自大麦的m3AJ249143(SEQ ID NO：8)。ZMM28样蛋白是由如下数个甘蔗(Saccharumofficinarum)重叠EST的重叠群推断出的：CA285442(SEQ ID NO：9)、CA200888(SEQ ID NO：10)、CA247266(SEQ ID NO：11)、CA282968(SEQ ID NO：12)和CA299090(SEQ ID NO：13)。甘蔗蛋白(SEQ ID NO：15)是由通过比对5个不同的EST所获得的共有序列(SEQ ID NO：14)推断出来的。SEQ ID NO：16为第二个核苷酸共有序列，与SEQ ID NO：14相比，自ATG起578bp的位置上具有一个核苷酸改变(G至T)。多肽SEQ ID NO：17是由SEQ ID NO：16推断出来的，并且除了蛋白质第193位的一个氨基酸改变(V193G)，与SEQ ID NO：15完全相同。

表2：OsMADS18样单子叶植物直系同源物(orthologue)的实例

	基因名	登录号	DNASEQ ID NO	蛋白SEQ ID NO	来源
						1	OsMADS18	AF091458	1	2	稻
2	ZMM28	AJ430695	3	4	玉蜀黍
						3	MADS3	AY198328	5	6	黑麦草
4	m3	AJ249143	7	8	大麦
						5	ZMM28样	CA285442CA200888CA247266CA282968	14，16(推测)	15，17(推测)	甘蔗

CA299090

应该理解的是，归入“OsMADS18样多肽或其同源物”定义的序列不限于由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所代表的序列，而是任何符合以下标准的多肽：(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且(ii)具有DNA和蛋白结合活性且(iii)在其蛋白C末端最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且(iv)与SEQID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性，均适用于本发明的方法，并用于获得相对于相应野生型植物产率增加的植物。

编码OsMADS18样多肽或其同源物的核酸可以是任何天然的或合成的核酸。因此，本文定义的术语“OsMADS18样核酸/基因”是编码如上定义的OsMADS18样多肽或其同源物的任何核酸/基因。OsMADS18样核酸的实例包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中任一所代表的那些序列。OsMADS18样核酸/基因及其变体可适于实施本发明的方法。OsMADS18样核酸/基因的变体包括OsMADS18样核酸/基因的部分和/或能与OsMADS18样核酸/基因杂交的核酸。

本文定义的术语“部分”指包含至少747个核苷酸的(OsMADS18样核酸/基因)DNA片段，该部分编码至少249个氨基酸的多肽，所述多肽包含至少如下特征(i)和(ii)，优选还包含特征(iii)和/或(iV)，其中特征(i)至(iv)为：(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代且(iv)与SEQ IDNO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。可以，例如，通过在OsMADS18样核酸中产生一个或多个缺失来制备部分。部分可以以分离的形式应用，或者它们可以与其它编码(或非编码)序列融合以，例如，产生组合多种活性的蛋白质。当与其它编码序列融合时，翻译产生的多肽产物可以大于预测的OsMADS18样片断。优选地，功能部分是由以下任一所代表核酸的部分：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16。

另一OsMADS18样核酸/基因变体是在降低的严格条件下，优选在严格条件下，能够与上文所定义的OsMADS18样核酸/基因杂交的核酸，该杂交序列编码的多肽包含至少如下特征(i)和(ii)，优选还包含特征(iii)和/或(iv)，其中特征(i)至(iv)为：(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且(iV)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。除了具有上述特征，优选杂交序列能与由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16任一所代表的核酸序列杂交，或与上文所定义的任何上述序列的部分杂交。

本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都在溶液中。杂交过程也可以在如下情况下进行，即互补核酸之一固定于基质上，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也可以如此进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者如用照相平板印刷固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和/或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。

在核酸杂交实验如Southern和Northern杂交的情况中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”依赖于序列，并且在不同的环境参数下不同。熟练的技术人员知晓可以在杂交和洗涤过程中改变的多种参数，从而保持或者改变严格条件。

T_m是在确定的离子强度和pH值下，50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。T_m依赖于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于T_m值16℃到32℃获得最大杂交率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂合体形成；当钠浓度高达0.4M时，这一作用明显。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度降低0.6到0.7℃，加入50％甲酰胺能够使杂交在30到45℃完成，尽管这将降低杂交率。碱基对错配降低杂交率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使T_m值下降约1℃。T_m值可以用依赖于杂合体类型的下列方程式计算：

1、DNA-DNA杂合体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：

Tm＝81.5℃+16.6×log[Na⁺]^a+0.41×％[G/C^b]-500×[L^c]^-1-0.61×％甲酰胺

2、DNA-RNA或RNA-RNA杂合体：

Tm＝79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^b)+11.8(％G/C^b)u-820/L^c

3、寡DNA或寡RNA^d杂合体：

＜20个核苷酸：Tm＝2(l_n)

20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(l_n)

^a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内精确。

^b仅对于在30％到75％范围内的％GC精确。

^cL＝双链体的碱基对长度。

^d寡，寡核苷酸；l_n，引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

注释：对于每1％甲酰胺，T_m值降低约0.6到0.7℃，而6M尿素的存在可使T_m值降低约30℃。

杂交特异性通常是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性条件下进行。一般地，如上设置适用于核酸杂交测定或基因扩增检测操作的严格条件。也可以选择更高或更低的严格性条件。通常，对于在确定的离子强度和pH值下的特定序列，选择比热解链温度(T_m)低50℃的低严格条件。中等严格条件温度比T_m低20℃，高严格条件温度比T_m低10℃。例如，严格条件是至少像如条件A-L一样严格；降低的严格条件是至少像如条件M-R一样严格。可以通过许多已知技术中的任一来控制非特异性结合，所述技术诸如，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，和用RNA酶处理。在以下表3中列出杂交和洗涤条件的实例。

表3：杂交和洗涤条件的实例

严格条件	多核苷酸杂合体±	杂合体长度(bp)	杂交温度和缓冲液	洗涤温度和缓冲液
					A	DNA:DNA	＞或等于50	65℃ 1×SSC；或42℃，1×SSC和50％甲酰胺	65℃；0.3×SSC
B	DNA:DNA	＜50	Tb*；1×SSC	Tb*；1×SSC
					C	DNA:RNA	＞或等于50	67℃1×SSC；或45℃，1×SSC和50％甲酰胺	67℃；0.3×SSC
D	DNA:RNA	＜50	Td*；1×SSC	Td*；1×SSC
					E	RNA:RNA	＞或等于50	70℃ 1×SSC ；或50℃，1×SSC和50％甲酰胺	70℃；0.3×SSC
F	RNA:RNA	＜50	Tf*；1×SSC	Tf*；1×SSC

G	DNA:DNA	＞或等于50	65℃ 4×SSC；或45℃，4×SSC和50％甲酰胺	65℃；1×SSC
					H	DNA:DNA	＜50	Th*；4×SSC	Th*；4×SSC
I	DNA:RNA	＞或等于50	67℃ 4×SSC；或45℃，4×SSC和50％甲酰胺	67℃；1×SSC
					J	DNA:RNA	＜50	Tj*；4×SSC	Tj*；4×SSC
K	RNA:RNA	＞或等于50	70℃ 4×SSC；或40℃，6×SSC和50％甲酰胺	67℃；1×SSC
					L	RNA:RNA	＜50	T1*；2×SSC	T1*；2×SSC
M	DNA:DNA	＞或等于50	50℃ 4×SSC；或40℃，6×SSC和50％甲酰胺	50℃；2×SSC
					N	DNA:DNA	＜50	Tn*；6×SSC	Tn*；6×SSC
O	DNA:RNA	＞或等于50	55℃ 4×SSC；或42℃，6×SSC和50％甲酰胺	55℃；2×SSC
					P	DNA:RNA	＜50	Tp*；6×SSC	Tp*；6×SSC
Q	RNA:RNA	＞或等于50	60℃ 4×SSC；或45℃，6×SSC和50％甲酰胺	60℃.；2×SSC
					R	RNA:RNA	＜50	Tr*；4×SSC	Tr*；4×SSC

^“杂合体长度”是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对序列及鉴别本文所述的保守区域来确定杂合体长度。

^在杂交和洗涤缓冲液中，可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl，10mM NaH₂PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗涤15分钟。杂交和洗涤可以另外地包括5×Denhardt′s试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠和高达50％的甲酰胺。

^*Tb-Tr：对于预期长度小于50个碱基对的杂合体，杂交温度应该比杂合体的解链温度T_m低5-10℃；根据上述方程式确定T_m。

^±本发明还包括以PNA或修饰的核酸代替任一或多个DNA或RNA杂交配偶体。

为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等人(2001)的《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)。

OsMADS18样核酸或其变体可以来自任何天然或人工的来源。核酸/基因或其变体可以分离自微生物来源，如酵母或真菌，或分离自植物、藻类或动物(包括人类)来源。可以通过仔细的人为操作在组成和/或基因组环境上修饰所述核酸的天然形式。优选植物来源的核酸，无论来源于同一植物物种(例如对于其被引入的物种而言)或来源于不同植物物种。可以从单子叶物种，优选从禾本科(Poaceae)，更优选从稻分离所述核酸。更优选地，从稻中分离的OsMADS18样核酸表示为SEQ ID NO：1，而OsMADS18样氨基酸序列表示为SEQ ID NO：2。

可以通过引入遗传修饰(优选在OsMADS18样基因座)提高OsMADS18样多肽或其同源物的活性。本文所定义的基因座意指基因组区，其包括目的基因和编码区上游或下游的10kb。

可以通过任一(或多个)如下方法引入遗传修饰：T-DNA激活、TILLING、定点诱变、定向进化、同源重组或通过在植物中引入和表达编码OsMADS18样多肽或其同源物的核酸。引入遗传修饰之后的步骤是选择活性增加的OsMADS18样多肽，其活性的增加使植物产率增加。

T-DNA激活标记(Hayashi等人Science(1992)1350-1353)包括将通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA插入在目的基因的基因组区或基因编码区上游或下游10kb，从而在构型上使启动子能够指导靶向基因的表达。通常天然启动子对靶基因表达的调控被破坏，基因由新引入的启动子控制。启动子一般包含于T-DNA中。例如，通过农杆菌(Agrobacterium)感染将此T-DNA随机插入植物基因组并导致在插入T-DNA附近的基因过表达。得到的转基因植物由于引入的启动子附近基因过表达而表现出显性表型。引入的启动子可以是任意能够在所希望的生物体内(在本案中是植物)指导基因表达的启动子。例如，组成型的、组织偏好的、细胞类型偏好的和诱导型的启动子都适用于T-DNA激活。

也可以通过TILLING(定向诱导的基因组局部突变)技术将遗传修饰引入OsMADS18基因座。这是一种诱变技术，其用于产生、鉴定和分离诱变的能呈现OsMADS18样活性的OsMADS18样核酸变体。TILLING还允许选择携带此种突变变体的植物。这些突变变体甚至可能比其天然形式基因呈现更高的OsMADS18样活性。TILLING结合了高密度诱变和高通量筛选方法。TILLING一般遵循的步骤有：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C，(1992)In Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编辑Singapore，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994) In Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner和Caspar，(1998) In J Martinez-Zapater，J Salinas编辑，Methods on Molecular Biology，Vol.82.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和退火以形成杂双链体；(e)DHPLC，其中库中存在的杂双链体会在色谱图上检测到额外的峰；(f)突变个体的鉴定；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域内众所周知的(McCallum等(2002)NatBiotechnol 18：455-457，由Stemple综述(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。

定点诱变可用于产生OsMADS18样核酸的变体。可以通过几种方法来完成定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(current protocols inmolecular biology.Wiley编辑http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。

定向进化也可以用于产生OsMADS18样核酸的变体。这包括DNA改组的重复，继之以适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰的生物活性多肽的OsMADS18样核酸或其变体的变体(Castle等(2004)Science304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。

TDNA激活、TILLING、定点诱变和定向进化是能产生新的等位基因和OsMADS18样变体的技术的实例。

同源重组允许向基因组中的指定选择位置引入所选的核酸。同源重组是生物科学中常规使用的标准技术，其用于低等有机体如酵母或小立碗藓(physcomitrella)。在植物中执行同源重组的方法已经不仅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMBO J.9(10)：3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotechnol 15(2)：132-8)。所靶向的核酸(其可能是上文中定义的OsMADS18样核酸或其变体)不需靶向OsMADS18样基因座，但是可以被引入例如高表达的区域。所靶向的核酸可以是改良的等位基因，其用于替换内源基因或额外引入到内源基因中。

根据本发明的优选实施方案，通过在植物中引入和表达编码OsMADS18样多肽或其同源物的核酸，可以提高植物的产率。

引入遗传修饰(在本案中不需引入OsMADS18样基因座中)的优选方法是在植物中引入和表达编码OsMADS18样多肽或其同源物的核酸。上述OsMADS18样多肽或其同源物为(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且(iv)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性欲引入植物的核酸可以是全长的核酸或者是上述定义的部分或杂交序列。

蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有与其衍生自的未修饰形式蛋白质相似的生物学活性和功能活性。为了产生这样的同源物，蛋白质的氨基酸由具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其它氨基酸所替换。保守取代表是本领域内众所周知的(例如见Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company和上述表1)。

术语“同源物”也包括两种具体形式的同源物，其包括直系同源(orthologous)序列和旁系同源(paralogous)序列，其涵盖用于描述基因祖先关系的进化概念。术语“旁系同源”涉及在物种基因组内部的基因复制产生的旁系基因。术语“直系同源”涉及由于物种形成产生的不同有机体中的同源基因。

例如，可以通过所谓的交互(reciprocal)blast搜索容易地找到例如在单子叶植物种中的直系同源物。这可以通过使用查询序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)针对任何序列数据库，如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov找到的公共可获得的NCBI数据库，进行一次blast而实现。当从核苷酸开始时可使用BLASTn或tBLASTX(利用标准缺省值)，而当从蛋白质开始时可使用BLASTP或TBLASTN(利用标准缺省值)。Blast结果可以过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的序列针对查询序列源自的相同生物体的序列进行反向blast(二次blast)(在查询序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所，则二次blast将会针对稻序列)。然后比较第一次和第二次blast的结果。如果二次blast中得分靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，则找到了旁系同源物。得分靠前的命中事件使之E值低的命中事件。E值越低，得分越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻近连接树来辅助相关基因的聚类可视化，以鉴定直系同源物和旁系同源物。

同源物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即在氨基酸序列中至少有一个残基被除去，并在这一位置插入不同的残基。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但是视施加于多肽的功能性限制而定也可能是成簇取代；插入通常在1到10个氨基酸残基的数量级。优选地，氨基酸取代包括保守的氨基酸取代。

同源物也可以是蛋白质的“插入变体”的形式，即在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合，以及单个或多个氨基酸的内部序列插入。一般，氨基酸序列内部的插入将小于氨基或羧基端的融合，数量级在约1到10个残基。氨基或羧基端融合蛋白质或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白质、(组氨酸)6标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。

蛋白质“缺失变体”形式的同源物特征在于从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。

可通过本领域内众所周知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作容易地得到蛋白质的氨基酸变体。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA序列操作方法是本领域内众所周知的。例如，本领域内的技术人员熟知在DNA预定位置产生取代突变的技术，其包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方法。

OsMADS18样多肽或其同源物可以是衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与天然产生形式的蛋白质，例如SEQ ID NO：2所代表的氨基酸序列相比，其可以包括取代、缺失或添加的天然的和非天然产生的氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与天然产生形式多肽的氨基酸序列相比，其可以包括天然产生的改变的、糖基化、酰基化的氨基酸残基或非天然产生的氨基酸残基。衍生物还可以包括相对于其源自的氨基酸序列的一个或多个非氨基酸取代基，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其它配体，例如与之结合有利于衍生物检测的报告分子，以及相对于天然产生蛋白质的氨基酸序列而言非天然产生的氨基酸残基。

OsMADS18样多肽或其同源物可能由OsMADS18样核酸/基因的选择性剪接变体编码。本文所用的术语“选择性剪接变体”包括其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换或添加的核酸序列变体，或者其中内含子已被缩短或增长的核酸序列变体。这样的变体保持了蛋白质的生物活性，这可以通过有选择地保留蛋白质的功能性区段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。产生这类剪接变体的方法是本领域内众所周知的。优选的剪接变体是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16所代表核酸的剪接变体。更优选的剪接变体所编码的多肽包含至少如下特征(i)和(ii)，优选还包含特征(iii)和/或(iv)，其中特征(i)至(iv)为：(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且(iv)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。

同源物还可以由编码OsMADS18样多肽或其同源物的核酸的等位基因变体所编码，优选SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16所代表核酸的等位基因变体。更优选由等位基因变体编码的多肽包含至少如下特征(i)和(ii)，优选还包含特征(iii)和/或(iv)，其中特征(i)至(iv)为：(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且(iii)在其蛋白C末端最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且(iv)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。等位基因变体天然存在，并且这些天然等位基因的用途包含于本发明的方法中。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多数生物体天然存在的多态性品系中形成最大的一组序列变体。

根据本发明的优选方面，OsMADS18样核酸或其变体的表达有所增强或增加。获得增强或增加的基因或基因产物表达的方法在本领域内有充分的记录，其包括，例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调OsMADS18样核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和域取代，体内地改变内源启动子(见Kmiec，美国专利No.5,565,350；Zarling等，PCT/US93/03868)，或者将分离的启动子在本发明基因的适当方向和距离引入植物细胞中，从而控制基因的表达。

如果期望多肽表达，通常要在多肽编码区域的3’末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或备选地源自其它植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

也可以在5’非翻译区或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的数量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入的可剪接内含子均可以在mRNA和蛋白质水平增加高达1000倍的基因表达，Buchman和Berg，Mol.Cell biol.8：4395-4405(1988)；Callis等，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。通常这种内含子被放置在转录单位5’末端附近时，其增强基因表达的作用达到最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。通常见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N.Y.(1994)。

本发明还提供遗传构建体和载体，以促进用于本发明方法中的核酸序列的引入和/或表达，以产生相对于相应野生型植物产率增加的植物。

因此，提供的基因构建体含有：

(i)OsMADS18样核酸或其变体；

(ii)一个或多个能驱动(i)中核酸序列表达的控制序列；和任选的

(iii)转录终止序列。

可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建用于本发明方法的构建体。可以将基因构建体插入可商购的、适合于转化进入植物并在转化的细胞中表达目的基因的载体中。

使用含有目的序列(即OsMADS18样核酸或其变体)的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个控制序列(至少连接于启动子)。术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在本文中都可交换的使用，从广义上是指能够影响其连接序列表达的调控核酸序列。上述术语包括源自典型真核生物基因组基因的转录调控序列(包括具有或没有CCAAT盒序列的TATA盒，其对于精确的转录起始是必需的)，以及另外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，其通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括了经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也包含合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达。本文所用的术语“有效连接”指在启动子序列和目的基因之间的功能性连接，以使启动子序列能起始目的基因的转录。

优选的，OsMADS18样核酸或其变体有效的连接于早期茎尖分生组织(shoot apical meristem)启动子。如本文所定义的“早期茎尖分生组织启动子”是指从球形胚阶段到幼苗阶段在茎尖分生组织中转录性激活的启动子；这些阶段是本领域技术人员所熟知的。优选早期茎尖分生组织启动子是OSH1启动子等(来自稻；SEQ ID NO：22(Matsuoka等，(1993)Plant Cell 5：1039-1048；Sato等，(1996)Proc NatlAcad Sci U S A 93(15)：8117-22)。应当清楚，本发明的应用并不局限于SEQID NO：1所代表的OsMADS18样核酸，而且本发明的应用也并不局限于受OSH1启动子驱动的OsMADS18样核酸的表达。其他早期茎尖分生组织启动子的实例如下表4所示。它们为来自旁系同源或直系同样基因的KNOX家族1类同源盒(homeobox)的成员。应当理解下文列表并不是详尽无遗的。

表4：早期茎尖分生组织启动子的实例

基因来源	基因家族	植物来源	参考文献
				OSH1	KNOX家族1类同源盒	稻	-Matsuoka等，(1993)PlantCell 5：1039-1048-Sato等，(1996)PNAS 93：8117-8122
Knotted1	KNOX家族1类同源盒	玉蜀黍	Hake等，(1989)EMBOJournal 8：15-22
				KNAT1	KNOX家族1类同源盒	拟  南  芥(Arabidopsisthaliana)	Lincoln等，(1994)Plant Cell6：1859-1876
Oskn2	KNOX家族1类同源盒	稻	Postma-Haarsma等，(1999)Plant Mol Biol 39(2)：257-71
				Oskn3	KNOX家族1类同源盒	稻	Postma-Haarsma等，(1999)Plant Mol Biol 39(2)：257-71

任选的，还可以在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止子”包括控制序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，传递信号引发初级转录本的3’加工和多聚腺苷酸化以及转录的终止。另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域技术人员将知道适合用于进行本发明的终止子和增强子的序列。这类序列为本领域技术人员所公知或者可以容易地获得。

本发明的遗传构建体还包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是当需要将遗传构建体作为附加型遗传元件(如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持时。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。

遗传构建体可以任选地包括可选择的标记基因。如本文所用，术语“可选择的标记基因”包括赋予细胞表型的任意基因，该基因在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择经本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。适当的标记可以选自带有抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可视选择。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；或提供草甘膦抗性的aroA或gox)、或者提供代谢性状的基因(例如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA)。视觉标记基因导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、发光(例如荧光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。

本发明还包括由本发明方法可获得的植物。本发明因此提供由本发明方法可获得的植物，该植物中引入了OsMADS18样核酸或其变体。

本发明还提供产生相对于相应野生型植物产率增加的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达OsMADS18样核酸或其变体。

更具体地，本发明提供产生相对于相应野生型植物产率增加的转基因植物的方法，该方法包括：

(i)向植物、植物部分或植物细胞中引入和表达OsMADS18样核酸或其变体；和

(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包括引入组织、器官或植物的任何其它部分)。根据本发明的优选方面，优选通过转化将核酸引入植物。

本文所指术语“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。通过器官发生或者胚胎发生的能够随即克隆增殖的植物组织都可以使用本发明的遗传构建体转化并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可提供和最适于转化的具体物种的克隆增殖系统而改变。示例性的靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、存在的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时的或稳定的引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒保持非整合的状态。备选地，其可以整合进入宿主基因组。得到的转化植物细胞可以接着用于以本领域技术人员熟知的方式再生为转化的植物。

植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利地，可以使用几种转化方法的任一向适当的祖先细胞引入目的基因。转化方法包括用脂质体、电穿孔、增强游离DNA摄取的化学品、直接向植物注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化和显微投影(microprojection)。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，EA.等，(1882)Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，(1987)Plant Mol.Biol.8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的显微注射(Crossway A.等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击(Klein T.M.等，(1987)Nature 327：70)；(非整合的)病毒感染等等。优选使用任何通过农杆菌介导转化产生表达OsMADS18样基因/核酸的转基因稻的熟知方法，例如在任何以下文献中描述的方法：公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等(Plant J.6(2)：271-282，1994)，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。至于谷物转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1)：13-22，2002)中所述，其公开的内容如同其陈述的全部内容那样并入本文作为参考。

通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。

DNA转移和再生之后，可评估推定转化的植物，例如用Southern分析评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组成。备选的或额外的，可用Northern和/或Western分析监测新引入基因的表达水平，这两种技术都是本领域内普通技术人员熟知的。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如用克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交得到纯合的第二代(或T2)转化体，T2植物进一步通过经典育种技术繁殖。

产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如经过转化包含表达盒的所有细胞)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根茎嫁接到非转化的接穗上)。

本发明显然延及由本文所述方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有植物的部分和其无性繁殖体。本发明还涵盖由任意上述方法产生的初级转化或转染的细胞、组织、器官或整个植物的后代，所述后代的唯一要求是与本发明方法产生的亲本呈现同样的基因型和/或表型特性。本发明也包括含有分离的OsMADS18样核酸或其变体的宿主细胞。本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明也延及植物可收获的部分，例如，但不限于种子、叶、果实、花、茎培养物、根茎、块茎和球茎。本发明还涉及由这样的植物的可收获部分衍生的产品，如干丸、干粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。

本发明还包括OsMADS18样核酸或其变体的用途和OsMADS18样多肽或其同源物的用途。

一种这样的用途涉及提高植物相对于野生型植物的产率，特别是提高种子产率。产率的增加已在前文定义。

可以在育种程序中使用OsMADS18样核酸或其变体，或者OsMADS18样多肽或其同源物，其中鉴定可以遗传地连接于OsMADS18样基因或其变体的DNA标记。可以使用OsMADS18样核酸/基因或其变体，或者OsMADS18样多肽或其同源物界定分子标记。接着可以将此DNA或蛋白质标记在育种程序中使用，以选择具有增加的产率的植物。例如，OsMADS18样基因或其变体可以是由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中任一所代表的核酸。

OsMADS18样核酸/基因的等位基因变体也可以用于标记辅助的育种程序。这类育种程序有时需要使用，例如EMS诱变，通过植物诱变处理引入等位基因变体；备选的，此程序可以以收集无意产生的所谓“天然”起源的等位基因变体开始。然后通过例如PCR鉴定等位基因变体。随后是选择步骤，用以选择所讨论序列的较好等位基因变体，所述等位基因变体赋予植物增加的产率。一般通过监测含有所研究序列的不同等位基因变体植物的生长行为来进行选择，所述研究序列的不同等位基因变体是例如SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中任一的不同等位基因变体。可以在温室或田地中监测生长行为。更多任选的步骤包括，将经鉴定含有较好等位基因变体的植物与另一植物杂交。例如，可使用这种方法产生感兴趣表型特征的组合。

OsMADS18样核酸或其变体还可以作为探针，用于对为那些基因连锁性状的一部分并作为其标志物的基因进行遗传和物理的作图。这样的信息可以在植物育种中使用，以得到具有所期望表型的品系。OsMADS18样核酸或其变体的这类应用仅需要长至少15个核苷酸的核酸序列。OsMADS18样核酸或其变体也可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可用OsMADS18样核酸或其变体探测限制酶切消化的植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)MolecularCloning，A Laboratory Manual)。随后使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)对产生的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，可以使用核酸在含有一组个体的限制性内切酶处理的基因组DNA中探测Southern印迹，所述一组个体为代表明确的遗传杂交的亲本和子代的一组个体。记录DNA多态性的分离并用于计算在先前用此群体获得的遗传图谱中OsMADS18样核酸或其变体的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。

在遗传作图中使用的植物基因衍生探针的产生和用途描述于Bematzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中。众多出版物中描述过用上述方法或其变通形式对特定cDNA克隆进行遗传作图。例如，可以使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系和其它个体组作图。这类方法是本领域技术人员众所周知的。

核酸探针也可以用于物理作图(即在物理图谱上安置序列；见Hoheisel等In：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academicpress 1996，第319-346页，及其中引用的参考文献)。

在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。尽管目前FISH作图的方法倾向用于大的克隆(几个到几百个KB；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏性的提高允许在FISH作图中应用较短的探针。

用于遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域内技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。

根据本发明的方法得到如前所述产率提高的植物。产率提高的性状还可以组合其它经济上有利的性状，如进一步提高产率的性状、对多种胁迫的耐受性、改良多种构造特征和/或生化和/或生理学特征的性状。

附图说明

现参考以下附图描述本发明，其中：

图1显示了MIKC MADS盒转录因子的典型结构域特征。MADS结构域位于蛋白质的氨基末端，并编码DNA结合和二聚化功能。保守的K结构域参与蛋白质二聚化。I和C结构域次保守。C结构域能够参与转录激活或参与形成高级MADS多聚体(来自Jack(2001)Plant Molec Biol 46：515-520)。

图2显示了数个SQUAMOSA进化枝MADS结构域转录因子的多重比对，使用的是基于修饰的ClustalW算法(InforMax，Bethesda，MD，http://www.informaxinc.com)的VNTI AlignX多重比对程序，采用缺省设置，空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.05。在比对中，MADS结构域的SQUAMOSA特异性残基加框表示包括MADS共有序列。SQUAMOSA进化枝中的两条双子叶植物亚进化枝显示为双子叶植物AP1进化枝和双子叶植物FUL进化枝。单子叶植物序列根据蛋白质C末端的保守基序被进一步再分为两个亚枝：LPPWMLRT和LPPWMLSH，粗体加框表示。

图3代表无根邻近连接树(unrooted neighbour joining tree)，是利用ClustalW 1.83采用缺省值通过序列比对得到的。两个主要的群，包括单子叶植物和双子叶植物蛋白质，各自可进一步进行分组，对于双子叶植物而言是AP1和FUL亚进化枝，而对于单子叶植物是C末端包含的基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)和LPPWMLSH(SEQ ID NO：19)。所用多肽序列的来源、描述和登录号如下表所示。

来源	描述	NCBI登录号
			三叶木通(Akebia trifoliate)	FRUITFULL样蛋白；Aketr_AktFL-1	AAT46099
金鱼草	DEFH28；Antma_DEFH28	AAK72467
			金鱼草	SQUA；Antma_SQUA	CAA45228
拟南芥	MADS盒蛋白AGL79；Arath_AGL79	AAN52802
			拟南芥	APETALA1/AGL7；Arath_AP1/AGL7	P35631
拟南芥	CAL/AGL10；Arath_CAL/AGL10	Q39081
			拟南芥	FUL/AGL8；Arath_FUL/AGL8	Q38876
垂枝桦(Betula pendula)	MADS5；Betpe_MADS5	CAA67969
			菊花(Chrysanthemumx morifolium)	CDM8；Chrmo_CDM8	AAO22981

大麦	MADS盒蛋白3；Horvu_m3	CAB97351
			大麦	MADS盒蛋白5；Horvu_m5	CAB97352
黑麦草	MADS3；Lolpe_MADS3	AAO45875
			番茄(Lycopersicumesculentum)	RIN；Lyces_RIN	AAM15775
苹果(Malus Xdomestica)	MADS2；Maldo_MADS2	AAC83170
			稻	OsMADS14；Orysa_OsMADS14	AAF19047
稻	OsMADS15；Orysa_OsMADS15	AAF19048
			稻	OsMADS18；Orysa_OsMADS18	AAF04972
稻	OsMADS20；Orysa_OsMADS20	AAO92341
			矮牵牛(Petuniahybrida)	PFG；Pethy_PFG	AAQ72509
甘蔗	ZMM28样蛋白；Sacof_ZMM28样蛋白	SEQ ID NO：15，17
			白芥(Sinapis alba)	MADSB；Sinal_MADSB	Q41274
Solanum commersonii	AGL8同系物；Solco_AGL8	O22328
			马铃薯(Solanum tuberosum)	POTM1-1；Soltu_POTM1-1	Q42429
小麦(Triticum aestivum)	WAP1；Triae_WAP1	BAA33457
			玉蜀黍	MADS3；Zeama_MADS3	AAG43200
玉蜀黍	ZAP1；Zeama_ZAP1	AAB00081
			玉蜀黍	ZMM15；Zeama_ZMM15	CAD23408
玉蜀黍	ZMM28；Zeama_ZMM28	CAD23441
			玉蜀黍	ZMM4；Zeama_ZMM4	CAD23417

图4显示了双元载体p0643，用于在稻中表达处于OSH1启动子(内参PRO0200)控制之下的稻OsMADS18样蛋白(内参CDS2787)。

图5详述了用于执行本发明方法的序列的实例。

实施例

现参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在举例说明。

DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据描述于(Sambrook(2001)《分子克隆：实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)或者Ausubel等(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第一卷和第二卷的标准方法执行。植物分子操作的标准材料和方法由R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications(UK)出版。

实施例1：基因克隆

使用稻幼苗cDNA库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板通过PCR扩增稻OsMADS18样基因(CDS1522)。从幼苗提取的RNA经反转录后，将cDNA克隆进入pCMV Sport 6.0。该库平均插入大小为1.6kb，并且原始克隆数的数量级在1.67×10⁷cfu。在6×10¹⁰cfu/ml的第一次扩增之后，确定原始滴度为3.34×10⁶cfu/ml。提取质粒之后，将200ng模板用于50μlPCR混合物中。PCR扩增所用引物包括Gateway重组的AttB位点，为prm05821(SEQ ID NO：20；正义，起始密码子为粗体，AttB1位点为斜体：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGGGAGAGGGCCG 3’)和prm05822(SEQ ID NO：21；反义，互补的，终止密码子为粗体，AttB2位点为斜体：5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGTGGAGTGACGTTTGAGA3’)。在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。同样用标准方法扩增和纯化849bp(包括attB位点)的PCR片段。接着进行Gateway过程的第一步，BP反应，在此期间将PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生Gateway术语所称的“进入(entry)克隆”，p05838。作为Gateway技术一部分的质粒pDONR201购自Invitrogen。

实施例2：载体构建

接着，将进入克隆p05838与用于稻转化的指定载体p05294一起被用于LR反应。此载体在T-DNA边界内包含以下部分作为功能性元件：植物可选择的标记；可筛选的标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行体内重组LR的Gateway表达盒。用于早期早期茎尖分生组织表达的稻OSH1启动子(PRO0129)(SEQ ID NO：22)在此Gateway盒的上游(Matsuoka等，Plant Cell 5 1993，1039-1048)。

LR重组步骤之后，将产生的表达载体p0643(图4)转化进入农杆菌菌株LBA4044，随后转化进入稻类植物。使转化的稻类植物生长，随后检测实施例3中描述的参数。

实施例3：处于稻OSH1启动子控制之下的OsMADS18的评估及结果

大约产生了15到20个独立的T0稻类转化体。初级转化体由组织培养室转移到温室生长并收获T1种子。5个事件得以保留，其中T1代发生转基因存在/缺乏的3∶1分离。通过监测可视标记的表达，在每一事件中选出大约10个含转基因(杂合子和纯合子)的T1幼苗，和大约10个缺少转基因(无效合子)的T1幼苗。4个T1事件进一步在T2代中进行评价，遵循与T1代相同的评价方法，但每个事件使用更多的个体。

统计分析：F-检验

使用双因子ANOVA(变异分析)作为植物表型特性整体评估的统计模型。在由本发明基因转化的所有事件的所有植物中，对所有测量参数进行F检验。进行F检验来检查所有转化事件中基因的效应，并验证基因的整体效果，亦称为整体基因效应。真实的整体基因效应显著性的阈值设定为F检验的5％概率水平。显著性F检验值证明基因效应，其意味着不仅仅是基因的存在或位置引起表型的差异。

种子相关参数的测量

成熟的原代圆锥花序被收获、包装、标记条形码，然后在37℃烘箱中干燥三天。然后敲打圆锥花序并对所有种子进行收集和计数。用吹风装置将饱满的壳与空壳分离。丢弃空壳，并再次计数剩余的部分。饱满的壳在分析天平上称重。通过计数分离步骤之后剩余的饱满壳数来确定饱满种子数。通过称量从植物收获的全部饱满的壳来测量总的种子产率。通过计数自植物收获的谷壳数来测量每个植株的种子总数。千粒重(TKW)从已计数的饱满种子数及其总重外推得到。利用定制装置来测量个体种子参数(包括宽度、长度、面积、重量)，所述装置由两个主要组件称重装置和成像装置构成，连接于用于图像分析的软件。

下面的结果表(表5和表6)显示了T1和T2代F检验的p值。也显示了转基因和相应无效合子之间的百分比差异。

T1和T2代的TKW的都显著增加(表5和表6)。与此平行，观察到个体种子面积的增加，促成了所观察到的TKW增加。种子面积的增加归因于个体种子长度的显著增加(表5和表6)，因为个体种子宽度未显著改变(数据未显示)。

表6：T1代的结果

	显示增加的品系数	％差异	F检验的P值
				千粒重	5个中的5个	4	0.0123
平均种子面积	5个中的4个	3	0.0007
				平均种子长度	5个中的3个	2	0.0001

表7：T2代的结果

	显示阳性差异的品系数	％差异	P值
				千粒重	4个中的2个	2	0.0109
平均种子面积	4个中的2个	3	＜0.0001
				平均种子长度	4个中的2个	3	＜0.0001

序列表

<110>克罗普迪塞恩股份有限公司

<120>产率增加的植物及其制备方法

<130>CD-122-PCT

<150>EP 04106065.8

<151>2004-11-25

<150>US 60/632,273

<151>2004-12-01

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>750

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<220>

<221>misc_feature

<223>OsMADS18(AF091458)

<400>1

atggggagag ggccggtgca gctgcggcgg atcgagaaca agataaacag gcaggtgacc    60

ttctccaagc ggaggaacgg gctgctgaag aaggcgcacg agatctccgt gctctgtgac    120

gccgacgtcg cgctcatcgt cttctccacc aagggcaagc tctacgagtt ctccagccac    180

tccagtatgg aagggatcct tgaacgctac cagcgttact cgtttgatga aagagccgta    240

ctggagccaa atactgagga ccaggaaaac tggggtgatg aatatggaat tttgaagtcc    300

aaactggatg cacttcagaa gagccaaagg caactcttag gtgaacaatt ggacacacta    360

acaataaaag aactccagca attggaacat caactggaat attctctgaa gcatataaga    420

tcaaaaaaga atcagcttct gtttgaatca atttctgagc ttcagaagaa ggaaaagtca    480

cttaaaaacc agaataatgt tctgcaaaag ctcatggaga cagaaaagga gaaaaacaat    540

gctataataa acactaaccg ggaggagcaa aatggagcaa caccaagcac atcatcacca    600

acaccagtga cggctccaga tcccatcccg acaacaaata acagtcaaag ccaaccaaga    660

ggatcagggg agtcagaagc tcaaccgtct ccggcacaag caggcaacag caagcttccg    720

ccatggatgc tccggacaag tcacacatga                                     750

<210>2

<211>249

<212>PRT

<213>稻

<400>2

Met Gly Arg Gly Pro Val Gln Leu Arg Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1               5                   10                  15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

            20                  25                  30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe

        35                  40                  45

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Phe Ser Ser His Ser Ser Met Glu

    50                  55                  60

Gly Ile Leu Glu Arg Tyr Gln Arg Tyr Ser Phe Asp Glu Arg Ala Val

65                  70                  75                  80

Leu Glu Pro Asn Thr Glu Asp Gln Glu Asn Trp Gly Asp Glu Tyr Gly

                85                  90                  95

Ile Leu Lys Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Lys Ser Gln Arg Gln Leu

            100                 105                 110

Leu Gly Glu Gln Leu Asp Thr Leu Thr Ile Lys Glu Leu Gln Gln Leu

        115                 120                 125

Glu His Gln Leu Glu Tyr Ser Leu Lys His Ile Arg Ser Lys Lys Asn

    130                 135                 140

Gln Leu Leu Phe Glu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Glu Lys Ser

145                 150                 155                 160

Leu Lys Asn Gln Asn Asn Val Leu Gln Lys Leu Met Glu Thr Glu Lys

                165                 170                 175

Glu Lys Asn Asn Ala Ile Ile Asn Thr Asn Arg Glu Glu Gln Asn Gly

            180                 185                 190

Ala Thr Pro Ser Thr Ser Ser Pro Thr Pro Val Thr Ala Pro Asp Pro

        195                 200                 205

Ile Pro Thr Thr Asn Asn Ser Gln Ser Gln Pro Arg Gly Ser Gly Glu

    210                 215                 220

Ser Glu Ala Gln Pro Ser Pro Ala Gln Ala Gly Asn Ser Lys Leu Pro

225                 230                 235                 240

Pro Trp Met Leu Arg Thr Ser His Thr

                245

<210>3

<211>756

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>misc_feature

<223>ZMM28(或m28)(AJ430695)

<400>3

atggggcggg ggccggtgca gctgcgccgg atcgagaaca agatcaaccg ccaggtgacc    60

ttctccaagc gccggaacgg gctgctgaag aaggcccacg agatctccgt gctctgcgac    120

gcagaggtcg cgctcatcgt cttctccact aaggggaagc tctacgagta ctctagccat    180

tccagcatgg aaggcattct tgagcgttac cagcgttact catttgaaga aagggcagta    240

cttaacccaa gtattgaaga ccaggcaaat tggggagatg aatatgtccg gttaaaatcc    300

aaacttgatg cacttcagaa gagtcaaagg cagctgttag gagaacaatt gagttcactg    360

accataaaag aactccagca actggagcaa caactggaca gttctttgaa gcatattagg    420

tcaagaaaga atcagctcat gttcgattca atttccgcgc ttcagaaaaa ggagaaagca    480

cttacagatc aaaacggtgt cctgcaaaag ttcatggagg cagagaagga gaaaaacaag    540

gctttgatga acgcgcagct ccgggagcag caaaatggag catcaacaag ctccccatca    600

ctttcaccac caatagttcc agattccatg ccaactctaa atatagggcc atgtcaacat    660

agaggggcag cagaatctga gtctgaaccg tctcctgctc ctgcacaagc aaacaggggc    720

aacctgccac catggatgct ccgcactgtc aagtaa                              756

<210>4

<211>251

<212>PRT

<213>玉蜀黍

<400>4

Met Gly Arg Gly Pro Val Gln Leu Arg Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1               5                   10                      15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

            20                  25                      30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

        35                  40                      45

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ser Ser His Ser Ser Met Glu

    50                  55                      60

Gly Ile Leu Glu Arg Tyr Gln Arg Tyr Ser Phe Glu Glu Arg Ala Val

65                  70                      75              80

Leu Asn Pro Ser Ile Glu Asp Gln Ala Asn Trp Gly Asp Glu Tyr Val

                85                      90              95

Arg Leu Lys Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Lys Ser Gln Arg Gln Leu

            100                     105             110

Leu Gly Glu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ile Lys Glu Leu Gln Gln Leu

        115                     120             125

Glu Gln Gln Leu Asp Ser Ser Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Lys Asn

    130                     135             140

Gln Leu Met Phe Asp Ser Ile Ser Ala Leu Gln Lys Lys Glu Lys Ala

145                     150             155                 160

Leu Thr Asp Gln Asn Gly Val Leu Gln Lys Phe Met Glu Ala Glu Lys

                    165             170                 175

Glu Lys Asn Lys Ala Leu Met Asn Ala Gln Leu Arg Glu Gln Gln Asn

                180             185                 190

Gly Ala Ser Thr Ser Ser Pro Ser Leu Ser Pro Pro Ile Val Pro Asp

            195             200                 205

Ser Met Pro Thr Leu Asn Ile Gly Pro Cys Gln His Arg Gly Ala Ala

        210             215                 220

Glu Ser Glu Ser Glu Pro Ser Pro Ala Pro Ala Gln Ala Asn Arg Gly

225                 230                 235                  240

Asn Leu Pro Pro Trp Met Leu Arg Thr Val Lys

                245                 250

<210>5

<211>840

<212>DNA

<213>黑麦草(Lolium perenne)

<220>

<221>misc_feature

<223>MADS3(AY198328)

<400>5

atggggcgcg ggccggtgca gctgcggcgg atcgagaaca agataaaccg ccaggtcacc    60

ttctccaagc gccggagcgg gctgctcaag aaggcgcacg agatctccgt gctctgcgac    120

gctgaggtcg cgctcatcgt attctccacc aagggaaagc tctacgagta ctccagccag    180

gacagtaaca tggatgtcat tcttgaacgt taccagcgtt actcattcga agaaagagct    240

atagtggatc aaaatattgg aggccaggca aattggggag atgaatttgg aagtttgaaa    300

attaaactcg atgcactcca gaagagtcaa aggcaactct taggtgaaca attggaccca    360

ctgaccacaa aagaacttca acaattggaa cagcagctag atagttcttt gaagcacata    420

aggtcaagaa agaatcagct tctgtttgag tcaatatctg agcttcagaa gaaggagaag    480

tcacttaaag atcagaatgg cgtcctgcag aagcacctcg tggagacaga aaaggagaaa    540

agtaacgttt tatcgaatat tcatcaccga gagcagacga atggagcagc aaatattcat    600

cgccgggagc agatgaatga aacaacacat attcataacc aggagcagct caatggagca    660

acaacaagct caccgtcacc tacaccagtg gcggtcctag attccgtggc aactctaaat    720

attgggtcat ctcaatctag agaagcagca ggagaggagc cagaatctca gccgtccccg    780

gcacaagcaa acagcggcaa gctaccacca tggatgctcc gcaccatcag taacagatga    840

<210>6

<211>279

<212>PRT

<213>黑麦草

<400>6

Met Gly Arg Gly Pro Val Gln Leu Arg Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1               5                   10                  15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala

            20                  25                  30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

        35                  40                  45

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ser Ser Gln Asp Ser Asn Met

    50                  55                  60

Asp Val Ile Leu Glu Arg Tyr Gln Arg Tyr Ser Phe Glu Glu Arg Ala

 65                 70                  75                  80

Ile Val Asp Gln Asn Ile Gly Gly Gln Ala Asn Trp Gly Asp Glu Phe

                85                  90                  95

Gly Ser Leu Lys Ile Lys Leu Asp Ala Leu Gln Lys Ser Gln Arg Gln

            100                 105                 110

Leu Leu Gly Glu Gln Leu Asp Pro Leu Thr Thr Lys Glu Leu Gln Gln

        115                 120                 125

Leu Glu Gln Gln Leu Asp Ser Ser Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Lys

    130                 135                 140

Asn Gln Leu Leu Phe Glu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Glu Lys

145                 150                 155                 160

Ser Leu Lys Asp Gln Asn Gly Val Leu Gln Lys His Leu Val Glu Thr

                165                 170                 175

Glu Lys Glu Lys Ser Asn Val Leu Ser Asn Ile His His Arg Glu Gln

            180                 185                 190

Thr Asn Gly Ala Ala Asn Ile His Arg Arg Glu Gln Met Asn Glu Thr

        195                 200                 205

Thr His Ile His Asn Gln Glu Gln Leu Asn Gly Ala Thr Thr Ser Ser

    210                 215                 220

Pro Ser Pro Thr Pro Val Ala Val Leu Asp Ser Val Ala Thr Leu Asn

225                 230                 235                 240

Ile Gly Ser Ser Gln Ser Arg Glu Ala Ala Gly Glu Glu Pro Glu Ser

                245                 250                 255

Gln Pro Ser Pro Ala Gln Ala Asn Ser Gly Lys Leu Pro Pro Trp Met

            260                 265                 270

Leu Arg Thr Ile Ser Asn Arg

        275

<210>7

<211>798

<212>DNA

<213>大麦(Hordeum vulgare)

<220>

<221>misc_feature

<223>m3(AJ249143)

<400>7

atggggcgcg ggccggtgca gctgcggcgg atcgagaaca agataaaccg gcaggtgacc    60

ttctccaagc ggcgcagcgg gctgcttaag aaggcgcacg agatctccgt gctctgcgac    120

gccgaggtcg cgctcatcgt cttctccacc aagggcaagc tatacgagta ctccagccag    180

gacagtagca tggatgtgat tcttgaacgt taccaacgtt actcatttga agaaagagct    240

gtactggatc caagtactgg agaccaggca aattggggag acgaatatgg aagtttgaag    300

ataaaactcg atgcactcca gaagagtcaa aggcaactct taggtgaaca attggaccca    360

ctcaccacaa aagaacttca acagttggaa caacagcttg atagttcttt gaagcacata    420

aggtcaagaa agaatcaact tctctttgag tcaatatctg agcttcaaaa gaaggagaaa    480

tcattaaaag atcagaatgg cgtcctgcag aagcacctcg tagagacaga aaaggagaaa    540

aataacgttt tgtcaaatat tcatcaccgg gagcagttga atgaagcaac aaatattcat    600

caccaggagc agctgagtgg agcaacaaca agctcaccgt cacctacacc accgacggcc    660

caagattcca tggcacctcc aaatattggg ccatatcaat ctagaggagg aggggatcca    720

gaacctcagc cgtcaccagc acaagcaaac aacagcaatc tgccaccgtg gatgctccgc    780

accatcggca acagatga                                                  798

<210>8

<211>264

<212>PRT

<213>大麦

<400>8

Met Gly Arg Gly Pro Val Gln Leu Arg Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1               5                   10                  15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala

            20                  25                  30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

        35                  40                  45

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ser Ser Gln Asp Ser Ser Met

    50                  55                  60

Asp Val Ile Leu Glu Arg Tyr Gln Arg Tyr Ser Phe Glu Glu Arg Ala

65                  70                  75                  80

Val Leu Asp Pro Ser Thr Gly Asp Gln Ala Asn Trp Gly Asp Glu Tyr

                85                  90                  95

Gly Ser Leu Lys Ile Lys Leu Asp Ala Leu Gln Lys Ser Gln Arg Gln

            100                 105                 110

Leu Leu Gly Glu Gln Leu Asp Pro Leu Thr Thr Lys Glu Leu Gln Gln

        115                 120                 125

Leu Glu Gln Gln Leu Asp Ser Ser Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Lys

    130                 135                 140

Asn Gln Leu Leu Phe Glu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Glu Lys

145                 150                 155                 160

Ser Leu Lys Asp Gln Asn Gly Val Leu Gln Lys His Leu Val Glu Thr

                165                 170                 175

Glu Lys Glu Lys Asn Asn Val Leu Ser Asn Ile His His Arg Glu Gln

            180                 185                 190

Leu Asn Glu Ala Thr Asn Ile His His Gln Glu Gln Leu Ser Gly Ala

        195                 200                 205

Thr Thr Ser Ser Pro Ser Pro Thr Pro Pro Thr Ala Gln Asp Ser Met

    210                 215                 220

Ala Pro Pro Asn Ile Gly Pro Tyr Gln Ser Arg Gly Gly Gly Asp Pro

225                 230                 235                 240

Glu Pro Gln Pro Ser Pro Ala Gln Ala Asn Asn Ser Asn Leu Pro Pro

                245                 250                 255

Trp Met Leu Arg Thr Ile Gly Asn

            260

<210>9

<211>727

<212>DNA

<213>甘蔗(Saccharum officinarum)

<220>

<221>misc_feature

<223>ZMM28样部分DNA(EST CA285442)

<220>

<221>misc_feature

<222>(620)..(620)

<223>n为a、c、g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(662)..(662)

<223>n为a、c、g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(689)..(689)

<223>n为a、c、g或t

<400>9

cgcaccactc gagtcgagag acgagagcca cctgatccat ccttccccgt cttcctcttc    60

ccacacgtcc ccatcgccat tgctgcgccg agagtgagcg ggagagggta ggtgtcgagg    120

cggcggagat ggggagcggg ccggtgcagc tgcgccggat cgagaacaag atcaaccgcc    180

aggtgacctt ctccaagcgc cggaacgggc tgctgaagaa ggcccacgag atctccgtgc    240

tctgcgatgc agaggtcgcg ctcatcgtct tctccactaa ggggaagctc tacgagtact    300

ctagccattc cagcatggaa ggcattcttg agcgttacca gcggtactca tttgaagaaa    360

gagcagtact tgacccaagt attgaagacc aggcagattg gggagatgaa tatgtccggt    420

taaaatccaa acttgatgca cttcagaaga gtcaaaggca tctgctagga gaacaattgg    480

attcactgac cataaaagaa ctccagcaac tggagcaaca attggacagt tctttgaagc    540

atattaggtc aagaaagaat cagctcatgt tcgattcaat ttctgagctt cagaaaaagg    600

agaaagcact tacagatcan aatggtgtcc tgcaaaagct catggaggca gagaaagaga    660

anaacaatgc tttaatgaac gcacacctnc gggagcagca aaatggagca tcaacaggct    720

ccccata                                                              727

<210>10

<211>680

<212>DNA

<213>甘蔗

<220>

<221>misc_feature

<223>ZMM28样部分DNA(EST CA200888)

<400>10

ttcttgagcg ttaccagcgg tactcatttg aagaaagagc agtacttgac ccaagtattg    60

aagaccaggc agattgggga gatgaatatg tccagttaaa atccaaactt gatgcacttc    120

agaagagtca aagacatctg ttaggagaac aattggattc actgaccata aaagaactcc    180

agcaactgga gcaacaattg gacagttctt tgaagcatat taggtcaaga aagaatcagc    240

tcatgttcga ttcaatttcc gagcttcaga aaaaggagaa agcacttaca gatcaaaatg    300

gtgtcctgca aaagctcatg gaggcagaga aggagaaaaa caatgcttta atgaacgcac    360

acctccggga gcagcaaaat gtagcatcaa caagctcccc atcactgtca ccaccaatgg    420

ttccagattc catgccaact ctaaatattg ggtcatgtca acctagaggg ccaggagaat    480

ctgagcctga accgtctcct gctcctgtac aagcaaacag cggcaacctg ccaccatgga    540

tgctccgcac tgtcagtaac agatgagctc ttcccaatgc agttttgcgg ctgaacacga    600

cagcaacaca cctgccaccg acacgccacg gtgacccagg catcaaccga tgcatgatcc    660

ctctcgatcc tgtgatccaa                                                680

<210>11

<211>483

<212>DNA

<213>甘蔗

<220>

<221>misc_feature

<223>ZMM28样部分DNA(EST CA247266)

<400>11

cttattttgc agcatggaag gcattcttga gcgttaccag cggtactcat ttgaagaaag    60

agcagtactt gacccaagta ttgaagacca ggcagattgg ggagatgaat atgtccagtt    120

aaaatccaaa cttgatgcac ttcagaagag tcaaagacat ctgttaggag aacaattgga    180

ttcactgacc ataaaagaac tccagcaact ggagcaacaa ttggacagtt ctttgaagca    240

tattaggtca agaaagaatc agctcatgtt cgattcaatt tccgagcttc agaaaaagga    300

gaaagcactt acagatcaaa atggtgtcct gcaaaagctc atggaggcag agaaggagaa    360

aaacaatgct ttaatgaacg cacacctccg ggagcagcaa aatgtagcat caacaagctc    420

cccatcactg tcaccaccaa tggttccaga ttccatgcca actctaaata ttgggatgtc    480

aac                                                                  483

<210>12

<211>714

<212>DNA

<213>甘蔗

<220>

<221>misc_feature

<223>ZMM28样部分DNA(EST CA282968)

<400>12

cagtacttga cccaagtatt aaagaccagg cagattgggg agatgaatat gtccggttaa    60

aatccaaact tgatgcactt cagaagagtc aaaggcatct gttaggagaa caattggatt    120

cactgaccat aaaagaactc cagcaactgg agcaacaatt ggacagttct ttgaagcata    180

ttaggtcaag aaagaatcag ctcatgttcg attcaatttc cgagcttcag aaaaaggaga    240

aagcacttac agatcaaaat ggtgtcctgc aaaagctcat ggaggcagag aaggagaaaa    300

acaatgcttt aatgaacgca cacctccggg agcagcaaaa tgtagcatca acaagctccc    360

catcactgtc accaccaatg gttccagatt ccatgccaac tctaaatatt gggtcatgtc    420

aacctagagg gccaggagaa tctgagcctg aaccgtctcc tgctcctgta caagcaaaca    480

gcggcaacct gccaccatgg atgctccgca ctgtcagtaa cagatgagct cttcccaatg    540

cagttttgcg gctgaacacg acagcaacac acctgccacc gacacgccac ggtgaaccag    600

gcatcaaccg atgcatgatc cctctcgatc ctgtgatcca ataccgggcc gtagtactac    660

taattaaagt ccaggccccg ctcaaattgc tttacatggt tgattgaaag ttct          714

<210>13

<211>650

<212>DNA

<213>甘蔗

<220>

<221>misc_feature

<223>ZMM28样部分DNA(EST CA299090)

<220>

<221>misc_feature

<222>(626)..(626)

<223>n为a、c、g或t

<400>13

gaagctctac gagtactcta gccattccag catggaaggc attcttgagc gttaccagcg    60

gtgctcattt gaagaaagag cagtacttga cccaagtatt gaagaccagg cagattgggg    120

agatgaatat gtccggttaa aatccaaact tgatgcactt cagaagagtc aaaggcatct    180

gttaggagaa caattggatt cactgaccat aaaagaactc cagcaactgg agcaacaatt    240

ggacagttct ttgaagcata ttaggtcaag aaagaatcag ctcatgttcg attcaatttc    300

cgagcttcag aaaaaggaga aagcacttac agatcaaaat ggtgtcctgc aaaagctcat    360

ggaggcagag aaggagaaaa acaatgcttt aatgaacgca cacctccggg agcagcaaaa    420

tggagcatca acaagctccc catcactgtc accaccaatg gttccagatt ccatgccaac    480

tctaaatatt gggtcatgtc aacctagagg gccaggagaa tctgagcctg aaccgtctcc    540

tgctcctgta caagcaaaca gcgggaacct gccaccatgg atactccgca ctgtcagtaa    600

cagatgagct ctttccaatg cagttntgcg gctgaactcg acagcaacac               650

<210>14

<211>762

<212>DNA

<213>甘蔗

<220>

<221>misc_feature

<223>ZMM28样重构DNA，版本1

atggggagcg ggccggtgca gctgcgccgg atcgagaaca agatcaaccg ccaggtgacc    60

ttctccaagc gccggaacgg gctgctgaag aaggcccacg agatctccgt gctctgcgat    120

gcagaggtcg cgctcatcgt cttctccact aaggggaagc tctacgagta ctctagccat    180

tccagcatgg aaggcattct tgagcgttac cagcggtact catttgaaga aagagcagta    240

cttgacccaa gtattgaaga ccaggcagat tggggagatg aatatgtccg gttaaaatcc    300

aaacttgatg cacttcagaa gagtcaaagg catctgttag gagaacaatt ggattcactg    360

accataaaag aactccagca actggagcaa caattggaca gttctttgaa gcatattagg    420

tcaagaaaga atcagctcat gttcgattca atttccgagc ttcagaaaaa ggagaaagca    480

cttacagatc aaaatggtgt cctgcaaaag ctcatggagg cagagaagga gaaaaacaat    540

gctttaatga acgcacacct ccgggagcag caaaatggag catcaacaag ctccccatca    600

ctgtcaccac caatggttcc agattccatg ccaactctaa atattgggtc atgtcaacct    660

agagggccag gagaatctga gcctgaaccg tctcctgctc ctgtacaagc aaacagcggc    720

aacctgccac catggatgct ccgcactgtc agtaacagat ga                       762

<210>15

<211>253

<212>PRT

<213>甘蔗

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>ZMM28样重构蛋白，版本1

<400>15

Met Gly Ser Gly Pro Val Gln Leu Arg Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1               5                   10                  15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

            20                  25                  30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

        35                  40                  45

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ser Ser His Ser Ser Met Glu

    50                  55                  60

Gly Ile Leu Glu Arg Tyr Gln Arg Tyr Ser Phe Glu Glu Arg Ala Val

65                  70                  75                  80

Leu Asp Pro Ser Ile Glu Asp Gln Ala Asp Trp Gly Asp Glu Tyr Val

                85                  90                  95

Arg Leu Lys Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Lys Ser Gln Arg His Leu

            100                 105                 110

Leu Gly Glu Gln Leu Asp Ser Leu Thr Ile Lys Glu Leu Gln Gln Leu

        115                 120                 125

Glu Gln Gln Leu Asp Ser Ser Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Lys Asn

    130                 135                 140

Gln Leu Met Phe Asp Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Glu Lys Ala

145                 150                 155                 160

Leu Thr Asp Gln Asn Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Glu Ala Glu Lys

                165                 170                 175

Glu Lys Asn Asn Ala Leu Met Asn Ala His Leu Arg Glu Gln Gln Asn

            180                 185                 190

Gly Ala Ser Thr Ser Ser Pro Ser Leu Ser Pro Pro Met Val Pro Asp

        195                 200                 205

Ser Met Pro Thr Leu Asn Ile Gly Ser Cys Gln Pro Arg Gly Pro Gly

    210                 215                 220

Glu Ser Glu Pro Glu Pro Ser Pro Ala Pro Val Gln Ala Asn Ser Gly

225                 230                 235                 240

Asn Leu Pro Pro Trp Met Leu Arg Thr Val Ser Asn Arg

                245                 250

<210>16

<211>762

<212>DNA

<213>甘蔗

<220>

<221>misc_feature

<223>ZMM28样重构DNA，版本2

<400>16

atggggagcg ggccggtgca gctgcgccgg atcgagaaca agatcaaccg ccaggtgacc    60

ttctccaagc gccggaacgg gctgctgaag aaggcccacg agatctccgt gctctgcgat    120

gcagaggtcg cgctcatcgt cttctccact aaggggaagc tctacgagta ctctagccat    180

tccagcatgg aaggcattct tgagcgttac cagcggtact catttgaaga aagagcagta    240

cttgacccaa gtattgaaga ccaggcagat tggggagatg aatatgtccg gttaaaatcc    300

aaacttgatg cacttcagaa gagtcaaagg catctgttag gagaacaatt ggattcactg    360

accataaaag aactccagca actggagcaa caattggaca gttctttgaa gcatattagg    420

tcaagaaaga atcagctcat gttcgattca atttccgagc ttcagaaaaa ggagaaagca    480

cttacagatc aaaatggtgt cctgcaaaag ctcatggagg cagagaagga gaaaaacaat    540

gctttaatga acgcacacct ccgggagcag caaaatgtag catcaacaag ctccccatca    600

ctgtcaccac caatggttcc agattccatg ccaactctaa atattgggtc atgtcaacct    660

agagggccag gagaatctga gcctgaaccg tctcctgctc ctgtacaagc aaacagcggc    720

aacctgccac catggatgct ccgcactgtc agtaacagat ga                       762

<210>17

<211>253

<212>PRT

<213>甘蔗

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>ZMM28样重构蛋白，版本2

<400>17

Met Gly Ser Gly Pro Val Gln Leu Arg Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1               5                   10                      15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

            20                  25                      30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

        35                  40                      45

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ser Ser His Ser Ser Met Glu

    50                  55                      60

Gly Ile Leu Glu Arg Tyr Gln Arg Tyr Ser Phe Glu Glu Arg Ala Val

65                  70                      75              80

Leu Asp Pro Ser Ile Glu Asp Gln Ala Asp Trp Gly Asp Glu Tyr Val

                85                      90              95

Arg Leu Lys Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Lys Ser Gln Arg His Leu

            100                     105             110

Leu Gly Glu Gln Leu Asp Ser Leu Thr Ile Lys Glu Leu Gln Gln Leu

        115                     120             125

Glu Gln Gln Leu Asp Ser Ser Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Lys Ash

    130                     135             140

Gln Leu Met Phe Asp Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Glu Lys Ala

145                     150             155                 160

Leu Thr Asp Gln Asn Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Glu Ala Glu Lys

                    165             170                 175

Glu Lys Asn Asn Ala Leu Met Asn Ala His Leu Arg Glu Gln Gln Asn

                180             185                 190

Val Ala Ser Thr Ser Ser Pro Ser Leu Ser Pro Pro Met Val Pro Asp

            195             200                 205

Ser Met Pro Thr Leu Asn Ile Gly Ser Cys Gln Pro Arg Gly Pro Gly

        210             215                 220

Glu Ser Glu Pro Glu Pro Ser Pro Ala Pro Val Gln Ala Asn Ser Gly

225                 230                 235                 240

Asn Leu Pro Pro Trp Met Leu Arg Thr Val Ser Asn Arg

                245                 250

<210>18

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>单子叶植物RT C末端基序氨基酸共有序列

<400>18

Leu Pro Pro Trp Met Leu Arg Thr

1               5

<210>19

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>单子叶植物SH C末端基序氨基酸共有序列

<400>19

Leu Pro Pro Trp Met Leu Ser His

1               5

<210>20

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物prm05821

<400>20

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatggg gagagggccg               50

<210>21

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物prm05822

<400>21

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt gagtggagtg acgtttgaga               50

<210>22

<211>1042

<212>DNA

<213>稻

<220>

<221>misc_feature

<223>OSH1启动子

<400>22

ggggagttag gaaccttgac atacaaccaa tgataccatt ttttttcaag cagctagagg    60

tacagaggtt catatttttt agatggctca ttagtgatat tttagtcaaa aatttcagaa    120

gtacggccac gggtgatggc ctgaactaat attttattcg aggtgccgct acatcatcgt    180

ctaaagtaca cgcaagattc aacggaaaaa agaaaccgat cgatcgagat cagttagtta    240

atgaaataac tagatcaact catgtcgtca aaaacaaaag atgctcatct atggacaaca    300

cacgctgatg attcgatcat caaacaaagg tggtagtagt agtaaagcgt atcgtgtttc    360

tcatcagaaa gaagaattaa agaaaaaact aatcccgtct cgcgagccag agaaaattcc    420

ctacaaaagc cactcctttg atttgacatg caaaagcaag gctccactcc tctactaccc    480

tacaactaca caacactgtc tctctatctc caaaggcagt agctgtattg gcttccagct    540

tttcctctct acctctaatg atagcttgga gcaagttcaa tagtatagct aactactagc    600

tctaattcat ctataatcaa tctaatagct tattcataca atagttatat actacattat    660

taatatctgg tcccatctat catacacact gagtctgtgc tatagctgac tacaaatctg    720

tagcccgctg ctcttctctc ttcatttatc ttcttaaaat atatttgcag ctggcttatg    780

gcttatagct tgatattgag agggagagga gtgagagcta gctcagctca gctcaaggta    840

aacaacaagg cacactcttc ctacctcttc tccggttctt cctttttcct ctttctcttc    900

gtccaagaac ttcacctcaa tagctcgagc tacggcctaa cttttgcgtt gcgcaggaga    960

gctcgatcgc tgcaccaata cttcactgga gatcgcctag ctgcagctag ctagcttatc    1020

ctgcgtgtct tgagcttctc tc                                             1042

Claims (27)

1.增加相对于相应野生型植物的产率的方法，包括增加植物中OsMADS18样多肽或其同源物的活性，和任选地选择产率增加的植物，其中所述OsMADS18样多肽：

(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且

(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且

(iii)在其蛋白C末端的最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且

(iv)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。

2.根据权利要求1的方法，其中通过优选地在编码OsMADS18样多肽或其同源物的基因座引入遗传修饰来实现所述增加的活性。

3.根据权利要求2的方法，其中通过定点诱变、同源重组、定向进化、TILLING和T-DNA激活中任一实现所述遗传修饰。

4.增加相对于相应野生型植物的产率的方法，包括在植物中引入和表达核酸或其变体，所述核酸编码OsMADS18样多肽，所述OsMADS18样多肽：

(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且

(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且

(iii)在其蛋白C末端的最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且

(iv)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。

5.根据权利要求4的方法，其中所述变体是OsMADS18样核酸的部分或者能与OsMADS18样核酸杂交的序列，其中所述部分或杂交序列或其互补物编码单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子，所述转录因子具有DNA和蛋白结合活性，并且：

(i)在其蛋白C末端的最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；和/或

(ii)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。

6.根据权利要求4或5的方法，其中所述OsMADS18样核酸或其变体在植物中过表达。

7.根据权利要求4到6中任一项的方法，其中所述OsMADS18样核酸或其变体是植物来源的，优选来自单子叶植物，进一步优选来自禾本科，更加优选核酸来自稻。

8.根据权利要求4到7中任一项的方法，其中所述变体编码SEQID NO：2的OsMADS18蛋白的直系同源物或旁系同源物。

9.根据权利要求4到8中任一项的方法，其中所述OsMADS18样核酸或其变体有效地连接于早期茎尖分生组织启动子。

10.根据权利要求9的方法，其中所述早期茎尖分生组织启动子是OSH1启动子。

11.根据权利要求1到10中任一项的方法，其中所述增加的产率选自以下的任一项或多项：(i)增加的千粒重(TKW)；(ii)增加的种子大小；(iii)增加的种子体积；(iv)增加的种子面积；(v)增加的种子长度和(vi)增加的种子生物量。

12.可根据权利要求1到11中任一项的方法获得的植物。

13.构建体，含有：

(a)编码OsMADS18样多肽或其变体的核酸，所述OsMADS18样多肽：

(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且

(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且

(iii)在其蛋白C末端的最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且

(iv)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性；和

(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选的

(c)转录终止序列。

14.根据权利要求13的构建体，其中所述控制序列是早期茎尖分生组织启动子。

15.根据权利要求14的构建体，其中所述早期茎尖分生组织启动子是OSH1启动子。

16.根据权利要求15的构建体，其中所述OSH1启动子如SEQID NO：22所示。

17.根据权利要求13到16中任一项的构建体，用于根据权利要求4到11中任一项的方法。

18.由根据权利要求13到17中任一项的构建体转化的植物。

19.产生相对于相应野生型植物产率增加的转基因植物的方法，该方法包括：

(a)在植物、植物部分或植物细胞中引入和表达编码如下OsMADS18样多肽或其变体的核酸：

(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且

(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且

(iii)在其蛋白C末端的最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且

(iv)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性；

(b)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。

20.产率增加的转基因植物，其通过将核酸或其变体引入所述植物产生，所述核酸编码如下OsMADS18样多肽：

(i)为单子叶植物SQUAMOSA进化枝II型MADS盒转录因子；且

(ii)具有DNA和蛋白结合活性；且

(iii)在其蛋白C末端的最后15个氨基酸中含有基序LPPWMLRT(SEQ ID NO：18)，除了基序第二位和第四位分别为脯氨酸和色氨酸之外，基序的其他任意位置处允许一个氨基酸取代；且

(iv)与SEQ ID NO：2的OsMADS18蛋白具有至少65％的序列同一性。

21.根据权利要求12、18或20的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物，如甘蔗，或者其中所述植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。

22.根据权利要求12、18、20或21中任一项的植物的可收获部分。

23.根据权利要求22的可收获部分，其中所述可收获部分是种子。

24.从根据权利要求21的植物衍生的产品，和/或从根据权利要求22或23的可收获部分衍生的产品。

25.OsMADS18样核酸/基因或其变体或OsMADS18样多肽或其同源物在提高产率、特别是种子产率中的用途。

26.根据权利要求25的用途，其中所述种子产率包括以下的一项或多项：增加的TKW、增加的种子大小、增加的种子体积、增加的种子面积、增加的种子长度和增加的种子生物量。

27.OsMADS18样核酸/基因或其变体或OsMADS18样多肽或其同源物作为分子标记的用途。

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