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CN101056877B - 咪唑并喹啉化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含咪唑并喹啉化合物的新组合物。也提供给予有效量的该组合物以提高对象的免疫应答的方法。还提供新组合物以及联合给予该组合物与其它药物的方法。

Description

咪唑并喹啉化合物
发明领域
本发明总体上涉及小分子免疫增效剂(SMIP)，例如能刺激或调节对象免疫应答的新型咪唑并喹啉化合物。本发明也涉及可用于疫苗疗法的抗原与免疫增效剂的新型组合。在一些实施方案中，所述化合物可用作增殖性疾病、感染性疾病、自身免疫疾病、过敏和/或哮喘的免疫治疗药物。
发明背景
随着疾病数量和多样性的激增以及相应治疗方法的不足，需要新的治疗方法。这种方法应当更少地关注靶向疾病状态中的特定物质(substrate)，而更多地支持对疾病的免疫应答。自从发现能特异性靶向人类恰好没有的细菌细胞壁的青霉素以来，现代医药的方式致力于消除导致疾病状态的物质而不影响宿主全身系统。不幸的是，只有少数治疗剂可达到该要求，而面对耐药性突变很少药物还能保持有效。应用于癌症时，治疗剂开发的目标是上调激酶。然而，近来唯一成功的治疗药物是格列卫(Gleevec)，并且可能不单只是因其具有激酶抑制活性。Borg等，J.Clin.Invest.，114：379-388，(2004)。
增强免疫应答而不是(或不只)抑制致病物质有许多优点(或者不增强免疫应答有许多害处)。优点之一是疾病因子与宿主共有一些物质，而这些物质在疾病状态中可能上调。例如，靶向激酶的抗癌症药物可能有细胞毒性，除癌细胞外还可破坏宿主的细胞机制。因此，获得疗效所需的最大耐受剂量(MTD)可能导致不良副作用，甚至削弱患者的免疫应答。这种副作用可能需要中止治疗。相反，如利用格列卫所见的，抑制bcr-ab1同时刺激免疫应答的双重作用可能促进其效力与耐受性，特别是因为给予格列卫还能激活NK细胞发挥肿瘤消退作用。癌症消退的此协同方法极其有效。或者，(药物的)细胞毒性抑制免疫系统可能独立地加重疾病状态，因为它们可抑制参与康复的不同途径。
免疫增效作用的另一优点是提供了耐药性突变不易绕过的平台。当治疗靶标，例如病毒复制子的特定物质或癌细胞系中的激酶受到极化和特异性(必须避免靶向宿主细胞)靶向时，疾病过程中(致病因子)发生的单点突变可使其不再受药物影响，导致其后代变得成该疾病更有害的菌株。
需要利用能靶向机体内特异性免疫应答机制的药物的新方法和机制来治疗患有对常规方法耐药或常规方法不足以充分治疗的疾病的患者。
美国专利号4,547,511和4,738,971公开了用于治疗疾病的化合物，所述疾病对能提高细胞介导免疫力的药物起反应。这些专利中所公开的化合物如下式(a)所示：
Figure G200580036853XD00021
然而，此二专利没有考虑将式(a)所示化合物与抗原联用。
WO 98/55495和WO 98/16247描述了免疫刺激寡核苷酸与多核苷酸。公布的美国专利申请号2002/0164341描述了含有未甲基化的CpG二核苷酸(CpG ODN)的佐剂与非核酸佐剂。美国专利申请号2002/0197269描述了含有抗原、抗原性CpG-ODN与聚阳离子聚合物的组合物。这些参考文献的每一篇出于所有目的如同全文列出一样全文纳入本文作为参考。
授权的美国专利号4,689,338；5,389,640；5,268,376；4,929,624；5,266,575；5,352,784；5,494,916；5,482,936；5,346,905；5,395,937；5,238,944；5,525,612；6,083,505和6,110,929；与WO 99/29693公开了具有通式(b)所示结构的咪唑并喹啉化合物用作“免疫应答修饰剂”：
Figure G200580036853XD00022
这些参考文献的每一篇出于所有目的如同全文列出一样全文纳入本文作为参考。
WO 03/097641公开了可用于治疗某些蛋白激酶依赖性疾病和制备治疗该疾病的药物制剂的某些咪唑并喹啉及其盐。
可利用称为疫苗佐剂的免疫增效剂来提高针对某些抗原性弱的抗原的免疫应答。因此，这种佐剂可增强对特异性抗原的免疫应答，因此是医学界极其感兴趣和研究的对象。
研究开发了以前不可能产生的具有抗原性表位的疫苗。例如，目前可用的候选疫苗包括模拟链球菌、淋球菌与疟疾抗原的合成肽。这些纯化的抗原一般是弱抗原需要佐剂来引发保护性免疫力。不幸的是，常规疫苗佐剂具有许多缺点限制了其总体应用和效力。例如，已知矿物油能刺激组织并可能致癌。美国唯一批准的佐剂，明矾也可能诱导接种部位产生肉芽肿，并且不能有效诱导细胞介导免疫力。此外，许多目前可用的佐剂因其含有不能为人体所代谢的组分而应用有限。另外，大多数佐剂难于制备，可能需要耗时的过程，(在一些情况中)可能要利用精密和昂贵的仪器来配制疫苗和佐剂系统。
在“免疫学佐剂的当前状况”(Current Status of Immunological Adjuvants)，Ann.Rev.Immunol.，1986，4，第369-388页与《疫苗佐剂与递送系统的最新进展》(RecentAdvances in Vaccine Adjuvants and Delivery Systems)，Derek T O′Hagan和Nicholas M.Valiante，描述了免疫学佐剂。也可参见美国专利号4,806,352；5,026,543和5,026,546的专利文献中各种疫苗佐剂的内容。这些参考文献的每一篇出于所有目的如同全文列出一样全文纳入本文作为参考。
已试图鉴定可用作疫苗佐剂的新免疫调节剂与能克服常规免疫调节剂缺点和不足的免疫治疗剂。具体地说，非常需要能引发人与家养动物对各种抗原的有效细胞介导和体液免疫应答，但没有常规佐剂和其它免疫调节剂副作用的佐剂制剂。小分子免疫增效剂(SMIP)符合这种需要，因为小分子平台能提供各种化合物来选择性调节免疫应答，这是提高免疫调节剂的治疗指数所需。
需要能够改变人免疫细胞产生细胞因子的水平和/或分布能力的不同新型单一作用药物。当将结构有差异的化合物给予患者时，往往能通过不同的作用机制引发所需应答，或对靶(细胞)，例如树突细胞具有更高特异性，调节效力和降低副作用。
细胞静止药物具有免疫抑制作用使得它们可用于治疗自身免疫疾病，例如多发性硬化症、银屑病和某些风湿疾病。不幸的是，严重的副作用使其用量必须很低从而妨碍了它们的有益作用。此外，可能需要中断治疗。
需要与常规传统细胞静止药物，例如长春花新碱、氨甲蝶呤、顺式铂氨相比，明显增强细胞静止或细胞毒性作用的制剂和/或活性药物联用。这些药物与化疗联用既能增加疗效又能大幅降低副作用和治疗剂量。因此，这种药物和组合疗法可提高已知细胞静止药物的疗效。在一些实施方案中，本发明化合物联用与单独给予的常规细胞静止药物相比能显著增强细胞静止或细胞毒性作用。因此，对常规化疗不敏感的细胞系也可能对联用活性药物的化疗敏感。
本发明提供各种治疗性和预防性药物来治疗特征是存在其它免疫缺陷、异常或感染的疾病状态，包括对能调节细胞因子和/或TNF-α的化合物起反应的自身免疫疾病与病毒和细菌感染，例如多发性硬化症、克罗恩病、HTV、HSV和HCV等。
需要能提高宿主天然抵御病毒和细菌感染，或抵御肿瘤诱导和发展同时降低细胞毒性的治疗药物。本发明提供了这种治疗性药物，还提供了其它相关优点。
发明概述
本发明提供新型免疫增效剂、免疫原性组合物、新型化合物和药物组合物与通过单独给予小分子免疫增效剂或联合给予抗原和/或其它药物来给予疫苗的新方法。本发明还提供新型化合物和药物组合物来治疗癌症、癌前病变、自身免疫疾病、感染性疾病、过敏和哮喘。
用于本发明方法和组合物中的咪唑并喹啉化合物制备廉价且易于给药。与已有的免疫刺激剂相比，这些化合物能具有更好的特异性，从而增强效力和安全性况。
作为佐剂，咪唑并喹啉化合物可与许多抗原和递送系统组合形成最终的疫苗产物。
作为免疫治疗剂，咪唑并喹啉化合物可单独使用或与治疗慢性感染，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)和幽门螺杆菌(H.pylori)所致疾病的其它治疗剂(例如，抗病毒、抗细菌、其它免疫调节剂或治疗性疫苗抗原)，以及能降低肿瘤生长或调节与疾病，例如光化性角化病、非典型或发育异常的痣或恶化前着色斑相关的细胞增殖异常的药物联用。
本发明的咪唑并喹啉化合物也能靶向导致疾病状态的物质，例如特别是激酶，包括EGFr、c-Kit、bFGF、Kdr、CHK1、CDK、cdc-2、Akt、PDGF、PI3K、VEGF、PKA、PKB、src、c-Met、AbI、Ras、RAF和MEK等。
作为免疫治疗剂，咪唑并喹啉化合物也可单独或与其它抗癌症治疗剂(例如，化疗药物、(单克隆抗体)mAb或其它免疫增效剂)联用来治疗癌症。此外，能诱导1型细胞因子(例如，IL-12、TNF-α或IFN)的某些咪唑并喹啉可用于治疗过敏和/或哮喘，因为它们能操控免疫应答向更良性的结局(发展)。例如，该咪唑并喹啉化合物可用于治疗卡介菌(BCG)、霍乱、噬菌体、伤寒、乙肝感染、流感、灭活的脊髓灰质炎、狂犬病、麻疹、腮腺炎、风疹、口服髓灰质炎(oral polio)、黄热病、破伤风、白喉、乙型流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌感染和肺炎球菌感染。可使用抗细胞增殖有效量的咪唑并喹啉化合物来治疗癌症。可使用抗-Th2/2型细胞因子的咪唑并喹啉化合物使过敏/哮喘免疫应答量偏离。
一些实施方案提供了治疗癌症和/或癌前病变的方法。在这种实施方案中，一种或多种已知的抗癌症药物与一种或多种咪唑并喹啉化合物联用来降低对象的肿瘤生长。考虑了许多可用于本发明方法的合适抗癌症药物，这些药物更充分描述于下文详述中。
另一实施方案提供了抑制对象的肿瘤细胞生长的方法。所述方法包括给予对象有效剂量的包含至少一种SMIP和单克隆抗体(mAb)的组合。该组合对抑制肿瘤细胞生长比单独给予mAb本身有效。在组合治疗癌症方法的一些实施方案中，给予对象另一种SMIP化合物和/或mAb。
在本发明方法和组合物的一些实施方案中，咪唑并喹啉化合物选自以下一种或多种化合物：
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；
4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇；
1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；
N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(4-氨基-2-丙基硫烷基(sulfanyl)-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；
1-(4-氨基-2-氮杂环丁烷-1-基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；
1-(4-氨基-2-吡咯烷-1-基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；
1-(4-氨基-2-环丙基硫烷基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；或
1-(4-氨基-2-异丁基硫烷基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇。
在其它实施方案中，U.S.SN.10/814,480；10/762,873；60/582,654；10/405,495和10/748,071公开了考虑用于本发明的方法和组合物，这些文献的每一篇出于所有目的如同全文列出一样全文纳入本文作为参考。
如咪唑并喹啉在制备本发明方法所用药物的方法中的应用一样，本发明提供了制备本文所述化合物和组合物的方法，这些方法属于本发明的范围。
在本发明的各实施方案中，化合物，例如式I所示化合物可用于制备能提高针对抗原的免疫应答的药物。
其它实施方案提供了本发明化合物在制备免疫刺激药物与同时独立给予或连续给予的另一药物，例如抗原中的应用。在另一更具体的实施方案中，所述应用是治疗或预防细菌或病毒感染。在另一实施方案中，所述应用是治疗癌症。在另一实施方案中，所述应用是预防流感感染，所述抗原是血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
其它实施方案提供药物制品或系统，包含(a)本文所述任何方面/实施方案的化合物(例如，式I所示化合物)；和(b)抗原，其中第一和第二药物可以混合或是分开的组合物。在一更具体的实施方案中，所述第二药物是血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。更具体地说，所述药物同时分别给予或依次给予。在另一实施方案中，所述应用是预防感染。在另一实施方案中，所述应用是治疗癌症。
本发明的其它实施方案包括详述中所描述的那些。
附图简述
图1显示了TLR7(图1A)和TLR8(图1B)对本发明SMIP的依赖性。
图2A显示了SMIP对骨髓单核细胞系THP-1效力的多细胞因子试验。
图2B显示了SMIP对人PBMC效力的多细胞因子试验。
图2C显示了SMIP对小鼠脾细胞效力的多细胞因子试验。
图3显示了SMIP对各种细胞系效力的排序。
图4显示了实施例11和实施例19化合物的体内佐剂活性，具体地说，用MF59+/-表示SMIP配制的HIV gp120免疫BALB/c小鼠两次的第二次(免疫)两周后血清的抗-gp120-特异性IgG2a几何平均滴度(图4A)；第二次(免疫)两周后血清的IgG1几何平均滴度(图4B)；从免疫小鼠收集的脾脏的离体抗-gp120-特异性T细胞应答(图4C)。
发明详述
申请人发现刺激细胞的细胞因子活性的方法与提供有效治疗疾病(例如本文所述与本领域技术人员熟知的)的免疫治疗剂和/或疫苗佐剂。
在一个实施方案中，本发明提供式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐、其互变异构体或该互变异构体的药学上可接受的盐：
Figure G200580036853XD00071
其中：
R1是-NR6R7、-C(O)R8、-C(O)OR8、-C(O)NR6R7、-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9、-(CH2)mC≡C(CH2)nR9或-S(O)qR10；
R2是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9、-(CH2)mC≡C(CH2)nR9、-C(O)R8、-C(O)OR8、-C(O)NR6R7或-S(O)qR10；
R3各自独立为H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素、三卤代甲基、-NR6R7、-C(O)R8、-C(O)OR8或-C(O)NR6R7；
R4和R5各自独立为H、C1-6烷基、C6-10芳基-C1-6烷基或保护基团；
R6和R7各自独立为H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C6-10芳基、C6-10芳基-C1-6烷基、C6-10芳氧基-C1-6烷基、-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9或-(CH2)mC≡C(CH2)nR9；或
R6和R7结合在一起形成取代或未取代的杂环基；
R8独立为H、C1-6烷基或取代的C1-6烷基；
R9独立为H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C6-10芳基、-CO2H、-C(O)O-C1-6烷基或卤素；
R10各自独立为C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C6-10芳基、C6-10芳基-C1-6烷基、三卤代甲基或-NR6R7；
m和n各自独立为0、1、2或3；
p是0、1、2或3；与
q各自独立为0、1或2。
在一些实施方案中，如果R1中的q是0并且R1中的R10是甲基(例如，如果R1是-S-Me)，则R2不是异丁基。
在另一实施方案中，R4和R5各自是H。在还有其它实施方案中，R4和R5各自是H，p是0。
在另一实施方案中，R4和R5各自是H，R1是-NR6R7、-S(O)qR10、-C(O)NR6R7、-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9或-(CH2)mC≡C(CH2)nR9。
在另一实施方案中，R4和R5各自是H，R1是-NR6R7，其中R6和R7独立为H、未取代的C1-6烷基或-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9。
在另一实施方案中，R1是-NR6R7。在一些这样的实施方案中，R1中的R6和R7独立选自H、C1-6烷基或-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9。在其它实施方案中，R1-NR6R7的R6和/或R7基团的C1-6烷基独立选自甲基、乙基、丙基、正丁基或正戊基。在一些这种实施方案中，R6和R7分别是丙基和甲基。在其它实施方案中，R6是甲基，R7是-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9，其中m是1，n是0，R9是H。
在另一实施方案中，R1是-S(O)qR10。在一些这样的实施方案中，R1中的q和R10分别是0和C1-6烷基，从而使得R1是-SR10，其中-SR10的R10是C1-6烷基，从而使得R1是-S-C1-6烷基。在另一实施方案中，C1-6烷基是乙基，从而使得R1是-S-乙基。在另一实施方案中，C1-6烷基是-CH2CH2CH3，从而使得R1是-SCH2CH2CH3。在另一实施方案中，C1-6烷基的-CH(CH3)2，从而使得R1是-S-CH(CH3)2。在其它实施方案中，R1中的q和R10分别是0和C6-10芳基-C1-6烷基，从而使得R1是-S-(C6-10芳基-C1-6烷基)。在一些这种实施方案中，R10是苄基，从而使得R1是-S-CH2Ph。
在其它实施方案中，R1是-C(O)NR6R7。
在还有另一实施方案中，R1是-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9。
在还有另一实施方案中，R1是-(CH2)mC≡C(CH2)nR9。
在另一实施方案中，R2是C1-6烷基。在一些这样的实施方案中，R2是异丁基。
在其它实施方案中，m是1，n是0，R9是H。
在还有另一实施方案中，p是0。
在还有其它实施方案中，R2是取代的C1-6烷基。在一些这样的实施方案中，R2是-CH2C(CH3)2(OH)。在另一实施方案中，R2是-CH2C(CH3)2NH-SO2CH3。
在其它实施方案中，R1是-S-环丙基、-S-CH2CH(CH3)2或-S-CH2CH2CH3。
在其它实施方案中，R1是-S-C3-6环烷基。
在其它实施方案中，R6和R7可结合在一起形成取代的或未取代的杂环基。当R6和R7结合在一起形成取代的或未取代的杂环基时，所述杂环基通过氮原子与核心相连。
在其它实施方案中，所述杂环基选自哌啶基、吡咯烷基、氮杂环丁烷基或吖丙啶基。在其它实施方案中，所述杂环基(R6和R7形成的)是吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基或多环杂环基，例如喹宁环。
在其它实施方案中，R6和R7结合在一起形成取代或未取代的杂芳基，例如吡咯、吡唑、三唑或吡啶酮基团。
在其它实施方案中，R1是-N(CH3)CH2CH2CH3。
在还有另一实施方案中，所述化合物选自：
1-(4-氨基-2-丙基硫烷基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；
1-(4-氨基-2-氮杂环丁烷-1-基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；
1-(4-氨基-2-吡咯烷-1-基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2醇；
1-(4-氨基-2-环丙基硫烷基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；或
1-(4-氨基-2-异丁基硫烷基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇。
在还有另一实施方案中，式I所示化合物选自：
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；
4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇；
1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；与
N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。
在一些实施方案中，所述化合物选自以下化合物之一或其药学上可接受的盐、其互变异构体或所述互变异构体的药学上可接受的盐：
Figure G200580036853XD00111
在一些其它的实施方案中，所述化合物选自以下化合物之一或其药学上可接受的盐、其互变异构体或所述互变异构体的药学上可接受的盐：
Figure G200580036853XD00121
在另一实施方案中，本发明提供合成式(II)所示化合物的方法
Figure G200580036853XD00122
其中R11和R14各自是C1-6烷基或取代的C1-6烷基，R12和R13各自是保护基团，所述方法包括以下步骤：
(a)将式(III)所示化合物与式R11NCS所示异硫氰酸酯反应，其中R11如上定义，从而得到式(IV)所示化合物：
Figure G200580036853XD00123
(b)任选纯化式(IV)所示化合物；
(c)将式(IV)所示化合物与偶联剂反应，从而得到式(II)所示化合物；和
(d)任选使式(II)所示化合物脱保护。
在合成式(II)所示化合物的方法的一些实施方案中，所述偶联剂是盐酸1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺。
在合成式(II-XIV)所示任一化合物的方法的其它实施方案中，R12是保护基团，例如叔丁氧基羰基(BOC)，R13是-H。
在另一实施方案中，本发明提供合成式(V)所示化合物的方法
Figure G200580036853XD00131
其中R14是C1-6烷基或取代的C1-6烷基，R15是C6-10芳基-C1-6烷基，所述方法包括：
(a)将其中R12和R13各自是保护基团的式(III)所示化合物与二硫化碳反应得到式(VI)所示化合物：
Figure G200580036853XD00132
(b)任选纯化式(VI)所示化合物；
(c)将式(VI)所示化合物与活化的R15基团反应得到式(VIa)所示化合物；
Figure G200580036853XD00133
(d)式(VIa)所示化合物脱保护得到式(V)所示化合物。
在另一实施方案中，本发明提供合成式(VII)所示化合物的方法
Figure G200580036853XD00134
其中R14是C1-6烷基或取代的C1-6烷基，R16是-C(O)C1-6烷基或-C(O)O-C1-6烷基，所述方法包括：
(a)将式(VIII)所示化合物(其中R12和R13各自是保护基团)与式(IX)所示化合物(其中R17是H或C1-6烷基)反应从而得到式(X)所示化合物：
Figure G200580036853XD00141
(b)任选纯化式(X)所示化合物；
(c)当R17是C1-6烷基时，将式(X)所示化合物与Pearlman催化剂反应，然后在酸性条件下水解得到的化合物从而获得式(VII)所示化合物；或者
(d)当R17是H时，水解然后氧化式(X)所示化合物，再将得到的水解并氧化的化合物与某试剂反应得到式(VIIa)所示化合物：
Figure G200580036853XD00142
其中Bn是苄基，然后将式(VIIa)所示化合物与溴化氢反应得到式(VII)所示化合物。
在另一实施方案中，本发明提供合成式(XI)所示化合物的方法
Figure G200580036853XD00143
其中R12和R13各自是保护基团，R14是C1-6烷基或取代的C1-6烷基，n选自0、1、2或3，R18是H、C1-6烷基或C6-10芳基，所述方法包括：
(a)将式(III)所示化合物
Figure G200580036853XD00144
与式ClC(O)O-C1-6烷基所示氯甲酸酯反应得到式(XII)所示化合物：
Figure G200580036853XD00145
(b)任选纯化式(XII)所示化合物；
(c)在有醇盐碱存在下使式(XII)所示化合物反应，从而得到式(XIII)所示化合物；
Figure G200580036853XD00151
(d)将式(XIII)所示化合物与三氟甲磺酸酐反应得到式(XIV)所示的三氟甲磺酸酯(triflate)：
Figure G200580036853XD00152
(e)将式(XIV)所示化合物与式Li-C≡C(CH2)nR18所示炔化锂(其中n和R18如上定义)反应得到式(XI)所示化合物；和
(f)任选将式(XI)所示化合物脱保护。
在本文所述各合成方法的一些实施方案中，所述保护基团R12或R13，或R12和R13是苄基。
在另一实施方案中，本发明提供合成式(XIV)所示化合物的方法
Figure G200580036853XD00153
其中R12和R13各自为保护基团或H，R14是C1-6烷基或取代的C1-6烷基，所述方法包括：
(a)将式(III)所示化合物
Figure G200580036853XD00154
与式ClC(O)O-C1-6烷基所示氯甲酸酯反应得到式(XII)所示化合物：
Figure G200580036853XD00161
(b)任选纯化式(XII)所示化合物；
(c)在有醇盐碱存在下使式(XII)所示化合物反应，从而得到式(XIII)所示化合物；
Figure G200580036853XD00162
(d)将式(XIII)所示化合物与三氟甲磺酸酐反应得到式(XIV)所示的三氟甲磺酸酯(triflate)：
(e)任选将式(XIV)所示化合物脱保护。
在一些实施方案中，式I所示化合物在喹啉N原子处被氧化，从而使该化合物变为N-氧化物，但具有式I所示化合物的任何其它特征。
还提供了式I所示化合物及其混合物，其中任何不对称碳原子可具有R或S构型。式I所示化合物的双键或环处的取代基可以存在顺式(-Z-)或反式(-E-)构型。因此，这些化合物可作为异构体、非对映异构体和对映异构体的混合物存在或作为纯异构体存在。在一些实施方案中，这些化合物是只存在一种对映异构体的对映异构纯。在其它实施方案中，所述化合物可作为对映异构体的混合物存在，其中所包含的某种对映异构体多于另一种对映异构体。
一般，当细胞与所述化合物接触约18-24小时，优选约24小时后，如果SMIP化合物能(a)在体外细胞试验中使人外周血单核细胞产生TNF-α，和(b)使人外周血单核细胞(PBMC)的浓度达到约500,000/mL，则在一些实施方案中300μM或更低浓度，在一些实施方案中200μM或更低浓度，在一些实施方案中100μM或更低的浓度或者在一些实施方案中20μM或更低浓度的SMIP或含此浓度SMIP的组合物可认为能有效引发免疫应答。
上述刺激局部免疫应答(例如在患者所选的细胞或组织中)的方法包括刺激受感染或癌症部位所选细胞或组织处的局部免疫应答。在一些实施方案中，所选的细胞或组织受真菌或细菌感染。在一些实施方案中，过敏原导致所选的组织发炎，例如哮喘病。在其它实施方案中，所选细胞受病毒或细菌感染。在还有其它实施方案中，感染因子是HCV、HTV、HBV、HSV、幽门螺杆菌、1型或2型HSV或人乳头瘤病毒。
另一实施方案提供诱导对象干扰素生物合成的方法。这种方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导干扰素生物合成。在一些这样的方法中，将足够以用量的式I所示疫苗佐剂给予对象诱导干扰素生物合成。
另一实施方案提供一种式I所示化合物，其中所述化合物与另一药物共同给予需要的患者。在一些这样的实施方案中，所述药物是抗原或疫苗。在式I所示化合物与另一药物共同给予患者或对象的实施方案中，式I所示化合物可在另一药物给予对象之前、期间或之后给予。因此，在一些实施方案中，给予对象另一药物的同时给予该对象式I所示化合物。
另一实施方案提供调节对象的免疫应答的方法。这种方法包括给予对象式I所示化合物。
另一实施方案提供诱导对象产生TNF-α的方法。这种方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导TNF-α产生。在一些这样的实施方案中，所述化合物的在血液平均稳态药物浓度低于20μM。
另一实施方案提供诱导对象的免疫应答的方法。所述实施方案包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导免疫应答。在一些这样的实施方案中，免疫应答包括产生细胞因子或TNF-α产量增加。
另一实施方案提供诱导受微生物感染对象免疫应答的方法。所述方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导免疫应答。
另一实施方案提供诱导受病毒感染或患有病毒所致疾病对象免疫应答的方法。所述方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导免疫应答。在一些这样的实施方案中，所述对象受病毒感染或患有丙型肝炎病毒(HCV)所致疾病。在其它实施方案中，所述对象受病毒感染或患有人免疫缺陷病毒(HIV)所致疾病。在另一实施方案或方法中，将式I所示化合物局部给予对象。
另一实施方案提供诱导对象免疫应答来预防病毒感染或病毒所致疾病的方法。所述方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导免疫应答。在一些这样的实施方案中，预防所述对象免受病毒感染或患病。在其它实施方案中，保护对象免遭微生物或其它病原体感染，例如本文上述的那些。
另一实施方案提供诱导患异常细胞增殖或癌症对象免疫应答的方法。所述方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导免疫应答。在一些这样的实施方案中，将所述化合物给予患异常细胞增殖相关疾病的对象。在一些这样的实施方案中，所述疾病选自：神经纤维瘤、动脉粥样硬化、肺纤维化、关节炎、银屑病、肾小球肾炎、再狭窄、增殖型糖尿病性视网膜病变(PDR)、肥大性瘢痕形成、炎性肠病、移植排异、血管生成或内毒素休克。
其它实施方案提供诱导患过敏性疾病对象免疫应答的方法。所述方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导免疫应答。
另一实施方案提供诱导患哮喘对象免疫应答的方法。所述方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导免疫应答。在一些实施方案中，通过引导免疫应答避开2型细胞因子分泌与效应器机制(例如产生IgE和/或肥大细胞/嗜碱性粒细胞激活)来治疗哮喘。
另一实施方案提供诱导患癌前病变对象免疫应答的方法。所述方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以诱导免疫应答。在一些这样的实施方案中，所述癌前病变是光化性角化病。在其它实施方案中，所述癌前病变选自光化性角化病、非典型或发育异常的痣或恶化前着色斑。在另一实施方案或方法中，将式I所示化合物局部给予对象。
其它实施方案提供抑制对象激酶的方法。这种方法包括给予患者式I所示化合物。
另一实施方案提供调节对象免疫应答的方法。所述方法包括给予对象足够用量的式I所示化合物以抑制对象激酶。在一些实施方案中，所述激酶选自：EGFr、c-Kit、bFGF、Kdr、CHK1、CDK、cdc-2、Akt、PDGF、PI3K、VEGF、PKA、PKB、src、c-Met、AbI、Ras、RAF、MEK或它们的组合。在另一实施方案或方法中，将式I所示化合物局部给予对象。
另一实施方案提供诱导对象免疫应答的方法，包括：给予对象式I所示化合物与抗原，其中所述化合物能诱导或提高该对象对所述抗原的免疫应答。更具体地说，所述抗原是流感抗原或本文所述的任何其它抗原。
另一实施方案提供含有式I所示化合物与另一种药物的组合物。在一些实施方案中，所述另一种药物是免疫原性组合物。在还有的实施方案中，所述药物是抗原。在还有的实施方案中，所述药物是疫苗，所述化合物是疫苗佐剂。在另一实施方案中，所述组合物还包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)。在另一实施方案中，所述组合物还包含MF59或另一种佐剂。
在另一实施方案或方法中，将式I所示化合物局部给予对象。
另一实施方案提供包含式I所示化合物与药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在另一实施方案中，局部给予式I所示化合物。更具体地说，将所述化合物局部给予病毒感染所致病损处。更具体地说，所述病毒感染是单纯疱疹病毒(HSV)，更具体地说是II型单纯疱疹病毒(感染)。或者，将式I所示化合物局部给予光化性角化病所致病损处。
本发明的另一实施方案提供刺激产生TLR-7的方法，所述方法包括给予式I所示化合物。另一实施方案提供刺激产生TLR-8的方法，所述方法包括给予式I所示化合物。另一实施方案提供刺激产生TLR-7和TLR-8的方法，所述方法包括给予式I所示化合物。
本发明化合物可导致免疫增强作用并刺激产生TLR-7和TLR-8。这种化合物可用作产生抗原的多克隆激活物。更具体地说，本发明涉及制备具有所需抗原特异性的单克隆抗体方法，所述方法包括使本发明化合物(例如式I所示)与无限增殖的记忆B细胞接触。
所产生的单克隆抗体或其片段可用于治疗疾病、预防疾病或诊断疾病。诊断方法可包括使抗体或抗体片段与样品接触。诊断方法也可包括检测抗原/抗体复合物。
待转化的记忆B细胞可得自各种来源(例如，全血、外周血单核细胞(PBMC)、血液培养物、骨髓、器官等)，本领域熟知获得人B细胞的合适方法。样品的细胞可包括非记忆性B细胞或其它血细胞。可在转化步骤前采用本领域已知方法选择显示所需抗原特异性的特异性人记忆B淋巴细胞亚群。在一个实施方案中，所述人记忆B淋巴细胞亚群具有病毒特异性，例如所述B细胞取自受病毒(感染)或康复的患者。在另一实施方案中，B细胞取自患阿耳茨海默病的对象，包括对B-型淀粉样蛋白特异性B细胞(例如，Mattson和Chan，(2003)，Science，301：1847-9等)。
另一实施方案提供产生无限增殖B记忆淋巴细胞的方法，所述方法包括在本发明化合物，例如式I所示化合物存在下用EB病毒转化B记忆淋巴细胞的步骤。参见WO 04/76677。
本发明也提供包含上述化合物或式I所示具体化合物的药物组合物。这种组合物可包含其它药学上可接受的成分，例如本领域熟知的一种或多种赋形剂、载体等。
考虑了本发明包括上述实施方案的所有可能的组合。在本文所述各种化合物和方法的一些实施方案中，式(I)所示化合物的R4和R5各自是H。
在治疗性应用，例如治疗癌症或感染性疾病中，咪唑并喹啉化合物可以与抗原联用或不与其联用。在不同的治疗性应用中，咪唑并喹啉化合物也可与其它治疗性药物，例如抗病毒药物与单克隆抗体联用。
诱导患者免疫刺激性作用的方法的一个实施方案涉及给予免疫原性组合物，所述组合物包含能刺激免疫应答，例如细胞介导免疫应答有效量的疫苗与能增强免疫应答，例如对疫苗的细胞介导免疫应答有效量的咪唑并喹啉化合物作为疫苗佐剂。
考虑可与咪唑并喹啉化合物联用来治疗上述疾病的药物包括本领域已知的那些，例如但不限于：麻醉药、催眠性镇静药、抗焦虑药、抗癫痫药、退热药、消炎药、刺激剂、清醒胺(wake amine)、抗帕金森药物、精神神经病药物、中枢神经系统药物、骨骼肌松弛剂、自主神经系统药物、解痉药、细胞毒性药物、单克隆抗体、眼药、鼻与耳药、抗眩晕药、强心剂、抗心率不齐药、利尿剂、降压药、血管收缩剂、冠状血管舒张剂、外周血管舒张药物、高脂血症药、呼吸刺激剂、镇咳药与祛痰药、支气管扩张药、治过敏药、止泻药、肠病药、消化溃疡药(peptic ulcer drug)、胃助消化剂、抗酸剂、利胆药、垂体激素药、唾液腺激素、甲状腺激素药、抗甲状腺药、促合成类固醇、皮质类固醇、雄激素药、雌激素药、黄体激素药物、混合激素、泌尿路/生殖器药、肛门药(anus drug)、手术灭菌剂/消毒剂、伤口保护剂、化脓性疾病外用药(externals for purulent disease)、镇痛剂、止痒药、收敛剂、消炎药、寄生虫皮肤病外用药、皮肤软化药、腐蚀剂、牙齿/口腔药物、维生素、无机制品、补充剂、止血药、抗凝血药、肝病药物、解毒剂、习惯性中毒药物(habitual intoxicationdrug)、治痛风药物、酶制品、糖尿病药、消肿药、抗组胺剂、抗生素(如酮内脂类(ketolides)、氨基糖苷类、磺胺类和/或β内酰胺类)、化疗药物、生物制品、驱虫药、抗原虫药、制备用药(drug for preparation)、X-射线对比介质(contrast media)与诊断药物。
提供了本发明的其它方法，其中本文所述组合物用于治疗癌症与减缓肿瘤生长。在一方面，本发明的咪唑并喹啉化合物与已知的mAb联用来治疗癌症。在一个这样的实施方案中，将抗体与咪唑并喹啉化合物给予需要的对象。在一些这样的实施方案中，抗体单独具有抑制肿瘤细胞生长的作用，而咪唑并喹啉化合物诱导产生细胞因子。
本发明另一实施方案提供了抑制对象肿瘤细胞生长的治疗性组合物。这种组合物包含有效量的至少一种咪唑并喹啉化合物、至少一种mAb与至少一种药学上可接受的载体的组合。在这种实施方案中，所述组合比单独给予的任何药物更有效地抑制某些哺乳动物的肿瘤细胞生长。
另一实施方案提供了治疗癌症的方法，其中将已知的抗癌症药物与咪唑并喹啉化合物联用来减缓对象的肿瘤生长。考虑了许多合适的抗癌症药物可用于这种方法。实际上，本发明考虑了(但不限于)给予许多抗癌症药物，但不限于：芬维A胺(fenretinide)、vatalanib、SU-11248、SU 5416、SU 6668、奥利沙铂、硼替佐米(bortezomib)、R 115777、CEP-701、ZD-6474、MLN-518、拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼(gefitinib)(易瑞沙(iressa))、埃罗替尼(erlotinib)(特罗凯(tarceva))、哌立福新(perifosine)、CYC-202、LY-317615、鲨胺、UCN-01、米哚妥林(midostaurin)、伊洛福芬(irofulven)、星形孢菌素、alvocidib、染料木黄酮、DA-9601、勒
Figure G200580036853XD00211
碱、多烯紫杉醇(docetaxel)、IM 862、SU 101与四硫代钼酸盐以及诱导凋亡的其它药物，例如但不限于：多核苷酸(如，核酶)；多肽(例如，酶)；药物；生物模拟物；25类生物碱；烷化剂；抗肿瘤抗生素；抗代谢物；激素；铂化合物；与抗癌症药物、毒素和/或放射性核素偶联的单克隆抗体；生物反应修饰剂(如，干扰素[如，IFN-α等]与白介素[如，IL-2等]等)；过继性免疫治疗药物；造血生长因子；诱导肿瘤细胞分化的药物(例如，所有的反式视黄酸等)；基因30治疗药物；反义治疗药物与核苷酸；肿瘤疫苗；血管生成抑制剂等。本领域技术人员知道可与本文公开的咪唑并喹啉化合物共同给药的合适化疗化合物和抗癌症治疗剂的其它许多例子。
在一些实施方案中，抗癌症药物包括能诱导或刺激凋亡的药物。诱导凋亡的药物包括但不限于：射线(例如，W)；激酶抑制剂(例如，表皮生长因子受体[EGFR]激酶抑制剂、血管生长因子受体[VGFR]激酶抑制剂、成纤维细胞生长5因子受体[FGFR]激酶抑制剂、血小板衍生的生长因子受体[PGFR]I激酶抑制剂、EGFr和Bcr-Ab1激酶抑制剂，如格列卫、易瑞沙和特罗凯))；反义分子；抗体[例如，Herceptin和利妥昔单抗(Rituxan)]；抗雌激素[例如，雷洛昔芬(raloxifene)和三苯氧胺]；抗雄激素[例如，氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、抑酶类固醇、氨鲁米特(aminoglutethamide)、酮康唑和皮质类固醇]；环加氧酶2(COX-2)抑制剂[例如，塞来考昔(Celecoxib)、美洛昔康(meloxicam)、NS-398和非类固醇]。
抗炎药I(NSAID)]；癌症化疗药物[例如，CPT-11、氟达拉滨(Fludara)、甲氮咪胺(DTIC)、地塞米松、米托蒽醌、Mylotarg、顺铂、5-FU、阿霉素(Doxrubicin)、多烯紫杉醇(Taxotere)或紫杉醇]；细胞信号转导分子；神经酰胺与细胞因子等也可与式I所示咪唑并喹啉联合给予对象。
其它实施方案提供了治疗过敏的方法。这种方法包括单独给予咪唑并喹啉化合物或与另一已知有效的药物组合给予来抵御过敏。在这种实施方案中，所述组合比不加入咪唑并喹啉化合物的已知药物更有效地治疗过敏病症。在一些这样的实施方案中，已知药物是抗组胺剂和/或白三烯抑制剂。在其它实施方案中，所述过敏病症是哮喘。在其它实施方案中，所述过敏病症选自过敏性鼻炎、皮肤病或荨麻疹。在一些这样的实施方案中，所述组合经肠、胃肠外、鼻内、皮下或动脉内给予。
本发明范围内所考虑的疫苗组合物可包括其它佐剂。在一些实施方案中，提高组合物效力的佐剂包括但不限于：(1)铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳剂试剂(含或不含特异性免疫刺激剂，例如胞壁酰肽或细菌细胞壁成分)，例如(a)MF59TM(WO 90/14837)，含有5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选含有MTP-PE)，使用微流化器配制成亚微米颗粒，(b)SAF，含有5％角鲨烯、0.5％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化为亚微米乳剂或旋转振荡产生较大粒径的乳剂，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种由以下成分组成的细菌细胞壁成分：单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂苷佐剂，例如可使用QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或从中产生的颗粒，如ISCOM(免疫刺激复合物)，其中ISCOM可不加入其它洗涤剂(WO00/07621)；(4)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(5)细胞因子，例如白介素，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等(WO 99/44636)；干扰素，如γ干扰素；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基化MPL(3dMPL)，当与肺炎球菌糖(例如WO00/56358)和RC529联用时任选基本上无铝盐存在；(7)3dMPL与，例如QS21和/水包油乳剂的组合，例如EP-A-0835318；(8)含有CpG基序的寡核苷酸，即含有至少一个CpG的二核苷酸，其中任选用5-甲基胞嘧啶取代胞嘧啶；(9)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如WO 99/52549；(10)联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(WO 0121207)或联用至少一种其它非离子表面活性剂(例如辛苯聚醇)的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO 01/21152)；(11)皂苷和免疫刺激寡核苷酸，例如CpG寡核苷酸(WO 00/62800)；(12)免疫刺激剂和金属盐颗粒(例如WO 00/23105)；(13)皂苷和水包油乳剂(WO 99/11241)；(14)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IL-12(任选+类固醇)(例如WO 98/57659)；(14)其它作为免疫刺激剂来提高组合物效力的物质。在一些实施方案中，铝盐(特别是磷酸铝和/或氢氧化铝)与MF59可与糖抗原联用。
本发明也涉及给予疫苗组合物的方法。在一些实施方案中，将能有效刺激免疫应答用量的所述疫苗给予对象。构成有效量的用量取决于所用的具体疫苗本身、所给予的具体佐剂化合物及其用量、待提高的免疫应答(体液或细胞介导的)、免疫系统的状态(例如，抑制的、受损的、刺激的)与所需的治疗结果等。因此，通常设定构成疫苗有效量的用量不实际。然而，本领域技术人员可通过考虑这些因素不难确定合适的用量。
本发明的疫苗组合物可按照本领域技术人员熟知的常规方法(例如，口服、皮下、鼻、局部)给予各种动物对象，包括哺乳动物，例如人和非人对象，包括例如袖珍宠物(pocket pet)、家禽等。
合适的疫苗可包括但不限于：能诱导产生体液和/或细胞介导免疫应答的任何物质。也可采用合适的疫苗，包括活病毒和细菌抗原、灭活的病毒、肿瘤衍生的、原虫、生物体衍生的、真菌和细菌抗原，类毒素、毒素、多糖、蛋白质、糖蛋白、肽等。也可利用常规疫苗，例如与BCG(活细菌)、霍乱、噬菌体和伤寒(杀伤的细菌)、乙肝、流感、灭活的脊髓灰质炎和狂犬病毒(灭活的病毒)、麻疹、腮腺炎、风疹、口服脊髓灰质炎、SARS疫苗和黄热病(活病毒)、破伤风和白喉(类毒素)、乙型流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌和肺炎球菌(细菌多糖)。本领域已知或本文描述的任何抗原可用于本发明。
此外，考虑了目前某些实验性疫苗，特别是诸如不能诱导产生强免疫应答的重组蛋白、糖蛋白和肽等物质发现也可与本发明的咪唑并喹啉化合物联用。示范性的实验性亚基抗原包括但不限于：与病毒性疾病相关的抗原，例如腺病毒、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、水痘、巨细胞病毒、登革热、猫白血病、鸡瘟、甲肝、乙肝、丙肝、HSV-1、HSV-2、猪瘟、甲型流感、乙型流感、日本脑炎、麻疹、副流感、狂犬病、呼吸道合胞体病毒、SARS病毒、轮状病毒、疣与黄热病毒的抗原。
本发明所用的特异性抗原包括但不限于下文所列的。括号内的数字表明该抗原的代表性来源。来源清单在抗原清单之后，各来源出于所有目的如同全文列出一样全文纳入本文作为参考。
特异性抗原包括：脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)血清群B的蛋白抗原(1-7)；脑膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜囊泡(OMV)制品(8、9、10、11)；脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，例如血清群C(13)的寡糖(12)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原(14、15、16)；淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)的抗原(1、2、3)；肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原(17、18、19、20、21、22、23)；砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的抗原(24)；甲型肝炎病毒的抗原，例如灭活的病毒(25、26)；乙型肝炎病毒的抗原，例如表面抗原和/或核心抗原(例如，26、27)；丙型肝炎病毒的抗原(28)；百日咳博得特菌(Bordetellapertussis)的抗原，例如百日咳全毒素(PT)和百日咳博得特菌的丝状血细胞凝集素(FHA)，也任选与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3联用(29、30)；白喉抗原，例如白喉类毒素(31：第3章)，例如CRM197突变体(32)；破伤风抗原，例如破伤风类毒素(31：第4章)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的蛋白抗原，例如CagA(33)、VacA(33)、NAP(34)、HopX(5)、HopY(35)和/或脲酶；乙型流感嗜血杆菌的糖抗原(13)；牙龈卟啉单孢菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原(36)；脊髓灰质炎抗原(37、38)，例如IPV或OPV；狂犬病毒抗原(39)，例如冻干灭活的病毒(40，RabAvertTM)；麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原(31：第9、10和11章)；流感抗原(31：第19章)，例如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白；粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原(41)；无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B群链球菌)的抗原(42、43)；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)的抗原(43、44、45)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原(46)。本发明组合物可含有一种或多种上述抗原。
在一些实施方案中，本发明的小分子免疫增效剂化合物可用于佐剂系统，用于流感疫苗的给药组合物中。在一些这样的实施方案中，一种或多种本发明小分子免疫增效剂化合物可任选与另一佐剂，例如MF59佐剂和一种或多种流感抗原(31：第19章)，例如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白联用。
在利用糖或碳水化合物抗原的实施方案中，可将糖或碳水化合物抗原与载体蛋白偶联以提高抗原性(47-56)。在一些实施方案中，载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉或破伤风类毒素。CRM197白喉类毒素是这种类毒素的实例。其它合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白(57)、合成肽(58、59)、热激蛋白(60)、百日咳蛋白(61、62)、流感嗜血杆菌的D蛋白(63)、艰难梭菌(C.difficile)的A或B毒素(64)等。在混合物含有血清群A和C荚膜多糖的实施方案中，MenA糖∶MenC糖的比值(w/w)可以大于1(例如2∶1、3∶1、4∶4、5∶1、10∶1或更高)。可将脑膜炎奈瑟球菌不同血清群的糖偶联于相同或不同的载体蛋白。
在需要时，可利用任何合适的接头采用任何合适的偶联反应。如果需要，可使毒性蛋白抗原脱毒(例如，通过化学和/或遗传学方法使百日咳毒素脱毒(30))。当组合物中含有白喉抗原时，也优选含有破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当含有破伤风抗原时，也优选含有白喉抗原和百日咳抗原。类似地，当含有百日咳抗原时，也优选含有白喉抗原和破伤风抗原。
佐剂：
可联用其它免疫调节剂给予本发明疫苗。具体地说，这些组合物通常包含佐剂。本发明所用的佐剂包括但不限于：下述一种或多种：
A.含矿物质的组合物
适合用作本发明佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(如羟基氧化物(oxyhydroxides))、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见《疫苗设计》(Vaccine Design)，(1995)，Powell和Newman编，ISBN：030644867X.Plenum的第8和9章]，或不同矿物质化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选磷酸盐过量)，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选(疫苗)吸附到这些盐上。含矿物质的组合物也可配制为金属盐颗粒(WO 00/23105)。
本发明疫苗中可包含铝盐，Al3+的用量介于每剂量0.2-1.0mg之间。
在一个实施方案中，本发明所用的铝佐剂是明矾(硫酸铝钾(AlK(SO4)2))或明矾衍生物，例如将磷酸缓冲液配制的抗原与明矾原位混合，然后用碱，例如氨水或氢氧化钠滴定和沉淀。
本发明疫苗制剂所用的另一铝佐剂是氢氧化铝佐剂(Al(OH)3)或结晶羟基氧化铝(AlOOH)，其是表面积约为500m2/g的优良吸附剂。或者，提供了磷酸铝佐剂(AlPO4)或羟基磷酸铝，其中磷酸基团取代了氢氧化铝佐剂的一些或全部羟基。本文提供的优选磷酸铝佐剂是无定形可溶于酸性、碱性和中性介质。
在另一实施方案中，本发明佐剂包括磷酸铝和氢氧化铝。在其更具体的实施方案中，佐剂中磷酸铝的含量高于氢氧化铝，例如以磷酸铝和氢氧化铝的重量计，比值可以是2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或高于9∶1。还要具体地说，疫苗中存在的铝盐是每疫苗剂量0.4-1.0mg，或者每疫苗剂量0.4-0.8mg，或者每疫苗剂量0.5-0.7mg或者每疫苗剂量约0.6mg。
一般通过优化分子间的静电吸引力使抗原在所需pH下携带与佐剂相反的电荷来选择铝佐剂或多种铝佐剂，例如磷酸铝或氢氧化铝的优选比例。例如，pH 7.4时磷酸铝佐剂(iep＝4)可吸附溶菌酶，但不吸附白蛋白。如果白蛋白是靶蛋白，应选择氢氧化铝佐剂(iep 11.4)。或者，可用磷酸盐预处理氢氧化铝以降低其等电点，使其成为更偏碱性抗原的优选佐剂。
B.油乳剂
适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59(5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘(Span)85，利用微流化仪配制成亚微米颗粒)。参见WO 90/14837。也可参见Podda，“用新型佐剂配制的流感疫苗：利用MF59佐剂配制疫苗的经验”(The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants：experiencewith the MF59-adjuvanted vaccine)，Vaccine，(2001)，19：2673-2680；Frey等，“MF59佐剂配制的流感疫苗与无佐剂的流感疫苗在非老年成人中的安全性、耐受性和免疫原性的比较”(Comparison of the safety，tolerability，and immunogenicity of aMF59-adjuvanted influenza vaccine and a non-adjuvanted influenza vaccine innon-elderly adults)，Vaccine，(2003)，21：4234-4237。MF59用作FLUADTM流感病毒三价亚基疫苗中的佐剂。
组合物中特别优选使用的佐剂是亚微米水包油乳剂。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选含有不同含量的MTP-PE的角鲨烯/水乳剂，例如含有4-5％w/v角鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80TM(单油酸聚氧乙烯山梨聚糖酯)和/或0.25-1.0％司盘85TM(三油酸山梨聚糖酯)和任选含有的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂，例如，称为“MF59”的亚微米水包油乳剂(国际公布号WO90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325；和Ott等.，刊于《疫苗设计：亚单位和佐剂方法》(Vaccirae Design：The Subunit and AdjuvantApproach)中的“MF59-安全而强效人疫苗佐剂的设计与评估”(MF59--Designand Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines)(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)，Plenum Press，纽约，1995，第277-296页)。MF59含有4-5％w/v角鲨烯(例如，4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温80TM和0.5％w/v司盘85TM并且可任选含有各种含量的MTP-PE，使用，例如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE存在的含量可以是约0-500μg/剂量，更优选0-250μg/剂量，最优选0-100μg/剂量。如本文所用，术语“MF59-0”指缺乏MTP-PE的上述亚微米水包油乳剂，而术语MF59-MTP指含有MTP-PE的制剂。例如，“MF59-100”每剂量含有100μg MTP-PE等。本文所用的另一种水包油乳剂MF69含有4.3％w/v角鲨烯、0.25％w/v吐温80TM和0.75％w/v司盘85TM并任选含有MTP-PE。还有另一种亚微米水包油乳剂MF75(也称为SAF)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP指含MTP的MF75制剂，例如每剂量100-400μg MTP-PE。
用于组合物中的亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂(例如胞壁酰肽)详述于国际公布号WO 90/14837和美国专利号6,299,884和6,451,325。
完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可用作本发明佐剂。
C.皂苷制剂
皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的类固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologous group)。从皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中分离的皂苷是经广泛研究的佐剂。皂苷也可通过商业途径获自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)(婚纱花(brides veil))和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根(soap root))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。
已利用高效薄层层析(HP-TLC)和反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术专门纯化的组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。美国专利号5,057,540公开了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有类固醇，例如胆固醇(参见WO96/33739)。
可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有QuilA、QHA和QHC的一种或多种。EP0109942、WO96/11711和WO96/33739描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它去污剂。参见WO00/07621。
皂苷佐剂开发的综述见Barr等，“ISCOM与其它皂苷佐剂”(ISCOMs and othersaponin based adjuvants)，(1998)，Advanced Drug Delivery Reviews，32：247-271。也参见Sjolanderet等，“口服递送的皂苷和ISCOM疫苗的摄取与佐剂活性”(Uptake and adjuvant activity of orally delivered saponin and ISCOM vaccines)，(1998)，Advanced Drug Delivery Reviews，32：321-338。
D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种任选与磷脂联用或用磷脂配制的病毒蛋白。它们通常是非致病性、非复制性，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离此病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的病毒蛋白包括源自以下的蛋白质：流感病毒(例如HA或NA)、乙型肝炎病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白p1)。以下文献进一步讨论了VLP：WO03/024480，WO03/024481和Niikura等，“嵌合型重组戊肝病毒样颗粒作为呈递外来表位的口服疫苗载体”(Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral VaccineVehicle Presenting Foreign Epitopes)，Virology，(2002)，293：273-280；Lenz等，“乳头瘤病毒样颗粒诱导树突状细胞急性激活”(Papillomarivurs-Like Particles InduceAcute Activation of Dendritic Cells)，Journal of Immunology，(2001)，5246-5355；Pinto等，“用重组HPV-16 L1病毒样颗粒免疫的健康志愿者对人乳头瘤病毒(HPV)-16 L1的细胞免疫应答”(Cellular immune reaponse to Human Papillomavirus(HPV)-16 L1 Healthy Volunteers Immunized with Recombinant HPV-16 L1 Virus-LikeParticles)，Journal of Infectious Diseases，(2003)，188：327-338；Gerber等，“当与大肠杆菌不耐热肠毒素突变体R192G或CpG共同给予时，人乳头瘤病毒样颗粒是有效的口服免疫原”(Human Papillomavrisu Virus-Like Particles Are Efficient OralImmunogens when Coadministered with Escherichia coli Heat-Labile EntertoxinMutant R192G or CpG)，Journal of Virology，(2001)，75(10)：4752-4760。例如，Gluck等，“未来疫苗开发的新技术平台”(New Technology Platforms in the Developmentof Vaccines for the Future)，Vaccine，(2002)，20：B10-B16进一步讨论了病毒体。重组的免疫活性流感病毒体(IRIV)在鼻内三价INFLEXALTM产品{Mischler和Metcalfe，(2002)，Vaccine，20增刊5：B17-23}与INFLUVAC PLUSTM产品中用作亚基抗原递送系统。
E.细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如：
(1)肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物
这种衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。EP 0 689 454公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可经0.22μm膜无菌过滤(参见EP 0 689 454)。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。参见Johnson等，(1999)，BioorgMed Chem Lett，9：2273-2278。
(2)脂质A衍生物
脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A的衍生物，例如OM-174。OM-174描述于，例如Meraldi等，“OM-174，一种可能应用于人的新佐剂，与伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)的疟原虫子孢子蛋白的合成C-末端片段242-310一起给予可诱导保护性应答”(OM-174，a New Adjuvant with a Potential forHuman Use，Induces a Protective Response with Administered with the SyntheticC-Terminal Fragment 242-310 from the circumsporozoite protein of Plasmodiumberghei)，Vaccine，(2003)，21：2485-2491；Pajak等，“佐剂OM-174在体内诱导小鼠树突状细胞的迁移与成熟”(The Adjuvant OM-174 induces both the migration andmaturation of murine dendritic cells in vivo)，Vaccine，(2003)，21：836-842。
(3)免疫刺激性寡核苷酸
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的序列)的核苷酸序列。含有回文结构或聚(dG)序列的细菌双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。
CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链的。可用类似物，例如2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参见Kandimalla等，“合成的趋异性核苷酸基序识别模式：具有不同细胞因子诱导概况的有效免疫调节寡脱氧核糖核苷酸药物的设计与开发”(Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern：design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agentswith distinct cytokine induction profiles)，Nucleic Acids Research，(2003)，31(9)：2393-2400；WO02/26757和WO99/62923中可能的类似物取代的例子。Krieg，“CpG基序：细菌提取物中的活性成分？”(CpG motifs：the active ingredient in bacterialextracts？)，Nature Medicine，(2003)，9(7)：831-835；McCluskie等，“用乙肝表面抗原与CpG DNA的小鼠胃肠外与粘膜致敏-加强免疫方案“(Parenteral and mucosalprime-boost immunization strategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpGDNA)，FEMS Immunology and Medical Microbiology，(2002)，32：179-185；WO98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199进一步讨论了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。
CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla，等，″Toll-like receptor 9：modulation of recognition and cytokine induction by novelsynthetic CpG DNAs″，Biochemical Society Transactions(2003)31(part 3)：654-658。CpG序列，例如CpG-A ODN可特异地诱导Th1免疫应答，或者，例如CpG-B ODN可更特异地诱导B细胞应答。Blackwell等，“浆细胞样树突状细胞衍生的IFN-α能调节CpG-A诱导的单核细胞IFN-γ-可诱导蛋白10产生”(CpG-A-Induced MonocyteIFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated by Plasmacytoid DendriticCell Derived IFN-alpha)，J.Immunol.，(2003)，170(8)：4061-4068；Krieg，“CpG上的A到Z”(From A to Z on CpG)，TRENDS in Immunology，(2002)，23(2)：64-65与WO01/95935中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选CpG-A ODN。
优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。两条CpG寡核苷酸序列任选在它们的3’端相连以形成“免疫聚合物”(immunomer)。参见，例如Kandimalla等，“CpG寡核苷酸的二级结构影响免疫刺激活性”(Secondary structures in CpGoligonucleotides affect immunostimulatory activity)，BBRC，(2003)，306：948-953；Kandimalla等，“Toll样受体9：通过新的合成CpG DNA调节识别和细胞因子产生”(Toll-like receptor 9：modulation of recognition and cytokine induction by novelsynthetic GpG DNAs)，Biochemical Society Transactions，(2003)，31(part 3)：664-658；Bhagat等，“CpG五和六脱氧核糖核苷酸作为强效免疫调节药物”(CpG penta-andhexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents)，BBRC，(2003)，300：853-861与WO03/035836。
(4)ADP-核糖基化毒素和它们的脱毒衍生物
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。WO95/17211描述了脱毒的ADP-核糖基化毒素可用作粘膜佐剂，WO98/42375描述了其用作胃肠外佐剂。该佐剂优选脱毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-192G。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见以下参考文献：Beignon等，“大肠杆菌热不稳定肠毒素的LTR72突变体给予裸露皮肤后能提高肽抗原引发CD4+T细胞并分泌γ干扰素的能力”(TheLTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Enahnces the Ability ofPeptide antigen to Elicit CD4+T Cells and Secrete Gamma Interferon afterCoapplication onto Bare Skin)，Infection and Immunity，(2002)，70(6)：3012-3019；Pizza等，“粘膜疫苗：LT和CT的无毒性衍生物”(Mucosal vaccines：non toxicderivatives of LT and CT as mucosal adjuvants)，Vaccine，(2001)，19：2534-2541；Pizza等，“LTK63和LTR72，易应用于临床试验的两种粘膜佐剂”(LTK63 and LTR72，two mucosal adjuvants ready for clinical trials)，Int.J.Med.Microbiol，(2000)，290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等，“利用细菌ADP-核糖基化外毒素、亚基和无关佐剂经皮免疫”(Transcutaneous Immunization with Bacterial ADP-Ribosylating Exotoxins，Subunits and Unrelated Adjuvants)，Infection and Immunity，(2000)，68(9)：5306-5313；Ryan等，“大肠杆菌热不稳定A毒素用作有效粘膜佐剂经鼻递送无细胞百日咳疫苗：无毒AB复合物对Th1和Th2的差异作用与酶活性”(Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an AcellularPertussis Vaccine：Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and EnzvmeActivity on Th1 and Th2 Cells)，Infection and Immunity，(1999)，67(12)：6270-6280；Partidos等，“大肠杆菌的热不稳定肠毒素及其定点突变体LTK63提高了对鼻内共同免疫的合成肽的增殖性和细胞毒性T细胞应答”(Heat-labile enterotoxin ofEscherichia coli and its site-directed mutant LTK63 enhance the proliferative andcytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized synthetic peptides)，Immunol.Lett.，(1999)，67(3)：209-216；Peppoloni等，“大肠杆菌热不稳定的肠毒素作为安全且强效佐剂来鼻内递送疫苗”(Mutants of the Escherichia coli heat-labileenterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines)，Vaccines，(2003)，2(2)：285-293；Pine等，(2002)，“用流感疫苗和大肠杆菌的热不稳定肠毒素的脱毒突变体鼻内免疫”(Intranasal immunization with influenza vaccine and adetoxified mutant of heat labile enterotoxin from Escherichia coli(LTK63))，J.ControlRelease，(2002)，85(1-3)：263-270。氨基酸取代的编号参考优选以Domenighini等，Mol.Microbiol，(1995)，15(6)：1165-1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础。
F.生物粘附剂和粘膜粘附剂
生物粘附剂(bioadhesive)和粘膜粘附剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘附剂包括酯化的透明质酸微球(Singh等，(2001)，J.Cont.ReIe.，70：267-276)，或者粘膜粘附剂，例如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂，例如WO99/27960。
G.微粒
微粒也可用作本发明的佐剂。优选从生物可降解和无毒材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm到150μm，优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm的颗粒)，任选将这些微粒表面处理成带负电(例如，用SDS)或带正电(例如，用阳离子去污剂，如CTAB)。
H.脂质体
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于美国专利号6,090,406；美国专利号5,916,588和EP 0 626 169。
I.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制剂
适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(WO99/52549)。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(WO01/21207)[90]，以及联用至少一种其它非离子表面活性剂(例如辛苯聚醇)的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)。
优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
J.聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂描述于，例如Andrianov等，“通过聚磷腈水溶液凝聚制备水凝胶微球”(Preparation of hydro gel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazenesolutions)，Biomaterials，(1998)，19(1-3)：109-115与Payne等，“从聚磷腈基质释放蛋白质”(Protein Release from Polyphosphazene Matrices)，Adv.Drug.DeliveryReview，(1998)，31(3)：185-196。
K.胞壁酰基肽
适合用作本发明佐剂的胞壁酰基肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
L.2-H与2-烷基咪唑并喹啉化合物
适合用作本发明佐剂的2-H与2-烷基咪唑并喹啉化合物的例子包括描述于以下文献的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物：Stanley，“咪喹莫特与咪唑并喹啉：作用机制与治疗潜力”(Imiquimod and the imidazolquinolines：mechanism of actionand therapeutic potential)，Clin Exp Dermatol，(2002)，27(7)：571-577；Jones，“雷西喹莫特3M”(Resiquimod 3M)，Curr Opin Investig Drugs，(2003)，4(2)：214-218；与美国专利号4,689,338；5,389,640；5,268,376；4,929,624；5,266,575；5,352,784；5,494,916；5,482,936；5,346,905；5,395,937；5,238,944；6,083,505和5,525,612。
M.缩氨基硫脲化合物
缩氨基硫脲化合物以及配制、制备和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法的例子包括WO04/60308所述的。缩氨基硫脲刺激人外周血单核细胞产生细胞因子，例如TNF-α特别有效。
N.色胺酮化合物
色胺酮化合物以及配制、制备和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法的例子包括WO04/64759所述的。色胺酮化合物刺激人外周血单核细胞产生细胞因子，例如TNF-α特别有效。
本发明也包括联用一种或多种上述佐剂的各方面。例如，本发明可用以下佐剂组合物：
(1)皂苷和水包油乳剂(WO99/11241)；
(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153)；
(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；
(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+类固醇)(WO98/57659)；
(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；
(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或振荡搅拌(vortex)产生较大粒度的乳剂；
(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种选自单磷酸酰脂质A(monophosphorylipid A)(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组成的细菌细胞壁组分，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和
(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL)。
(9)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的核苷酸序列)。
O.人免疫调节剂
适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12]等)、干扰素(如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
铝盐与MF59是可注释流感疫苗所用的优选佐剂。细菌毒素和生物黏附剂是粘膜递送疫苗，例如鼻疫苗的优选佐剂。
抗原：
本发明组合物可联合本发明治疗、预防或诊断方法所用的一种或多种抗原给予。优选的抗原包括下文所列的。此外，本发明组合物可用于治疗或预防以下所列任何病原体导致的感染。除了与下述抗原联用以外，本发明组合物也可与本文所述的佐剂联用。
本发明所用的抗原包括但不限于一种或多种以下所列的抗原或一种或多种以下所列病原体衍生的抗原：
A.细菌抗原
适用于本发明的细菌抗原包括可从细菌分离、纯化或衍生的蛋白质、多糖、脂多糖与外膜囊泡。此外，细菌抗原可包括细菌裂解物和灭活的细菌制剂。可采用重组表达制备细菌抗原。细菌抗原优选包含在其生命周期的至少一个阶段暴露于细菌表面的表位。细菌抗原优选在多种血清型之间保守。细菌抗原包括从下列一种或多种细菌衍生的抗原以及以下鉴定的特异性抗原例子。
脑膜炎奈瑟球菌：脑膜炎球菌(Meningitides)抗原可包括从脑膜炎奈瑟球菌血清群，例如A、C、W135、Y和/或B纯化或衍生的蛋白质(例如参考文献1-7中所鉴定的那些)、糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡(参考文献8、9、10、11)。脑膜炎球菌蛋白抗原可选自黏附(素)、自转运蛋白(autotransporter)、毒素、铁获取蛋白(Fe acquisition protein)与膜相关蛋白(优选外膜整合蛋白(integral outermembrane protein))。
肺炎链球菌：肺炎链球菌抗原可包括肺炎链球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白质。糖抗原可选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。蛋白抗原可选自WO98/18931；WO 98/18930；美国专利号6,699,703；美国专利号6,800,744；WO 97/43303和WO 97/37026所鉴定的蛋白质。肺炎链球菌蛋白可选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短体、LytX家族、LytX截短体、CbpX截短体-LytX截短体嵌合蛋白、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125或Sp133。
酿脓链球菌(A群链球菌)：A群链球菌抗原可包括WO 02/34771或WO2005/032582所鉴定的蛋白(包括GAS 40)、GAS M蛋白片段的融合体(包括WO02/094851与Dale，Vaccine，(1999)，17：193-200和Dale，Vaccine，14(10)：944-948所述的)、纤连蛋白结合蛋白(Sfb1)、链球菌血红素相关蛋白(Shp)与链球菌溶血素S(SagA)。
粘膜炎莫拉菌：莫拉菌抗原包括WO 02/18595和WO 99/58562所鉴定的抗原，外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。
百日咳博得特菌：百日咳抗原包括百日咳全毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，也任选与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3抗原联用。
金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌抗原包括任选与无毒的重组绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A偶联的5和8型金黄色葡萄球菌荚膜多糖，例如StaphVAXTM，或衍生自表面蛋白、侵染素(杀白细胞素、激酶、透明质酸酶)、抑制吞噬细胞吞没作用的表面因子(被膜A蛋白)、类胡萝卜素、过氧化氢酶产生、A蛋白、凝固酶、凝血因子和/或能裂解真核细胞膜的膜破坏毒素(任选脱毒的)(溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)的抗原。
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)：表皮葡萄球菌抗原包括黏液相关抗原(SAA)。
破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)：破伤风抗原包括破伤风类毒素(TT)，优选用作与本发明组合物结合/偶联的载体蛋白。
白喉棒杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)(白喉)：白喉抗原包括白喉毒素(优选脱毒的)，例如CRM197。考虑本发明组合物与能调节、抑制ADP核糖基化或与其相关的其它抗原联用结合/共同给予/偶联。白喉类毒素可用作载体蛋白。
乙型流感嗜血杆菌(Hib)：Hib抗原包括Hib糖抗原。
绿脓假单胞菌：假单胞菌抗原包括内毒素A、Wzz蛋白、绿脓假单胞菌LPS，更具体地说分离自PAO1(O5血清型)的LPS和/或外膜蛋白，包括外膜蛋白F(OprF)(Infect Immvn.，2001年5月，69(5)：3510-3515)。
侵肺军团菌(Legionella pneumophila)：细菌抗原可衍生自侵肺军团菌。
无乳链球菌(B群链球菌)：B群链球菌抗原包括WO 02/34771、WO 03/093306、WO 04/041157或WO 2005/002619中鉴定的蛋白质或糖抗原(包括蛋白GBS 80、GBS 104、GBS 276和GBS 322，包括衍生自血清型Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII和VIII的糖抗原)。
淋病奈瑟球菌：淋病奈瑟球菌抗原包括Por(或孔蛋白)蛋白，例如PorB(参见Zhu等，Vaccine，(2004)，22：660-669)、转运结合蛋白，例如TbpA和TbpB(参见Price等，Infection and Immunity，(2004)，71(1)：277-283)、不透明蛋白(例如Opa)、还原修饰的蛋白(Rmp)与外膜囊泡(OMV)制品(参见Plante等，J Infectious Disease，(2000)，182：848-855，也参见例如WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280、WO02/079243)。
砂眼衣原体：砂眼衣原体抗原包括源自血清型A、B、Ba和C(砂眼的病因，致盲的原因)，血清型L1、L2和L3(与性病淋巴肉芽肿相关)和血清型D-K的抗原。砂眼衣原体抗原也可包括WO 00/37494、WO 03/049762、WO 03/068811或WO 05/002619鉴定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH-like(CT242)、L7/L12(CT316)、OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)和MurG(CT761)。
苍白密螺旋体(Treponema pallidum)(梅毒)：梅毒抗原包括TmpA抗原。
杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)(导致软性下疳)：杜氏嗜血菌抗原包括外膜蛋白(DsrA)。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)：抗原包括美国专利号6,756,361所提供的三糖重复或其它肠球菌衍生的抗原。
幽门螺杆菌：幽门螺杆菌抗原包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原。
腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophytics)：抗原包括腐生葡萄球菌抗原的160kDa血凝素。
小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)：抗原包括LPS(Infect Immun.，2002年8月，70(8)：4414)。
大肠杆菌：大肠杆菌抗原可衍生自肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散黏着性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)。
炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)：炭疽杆菌抗原任选是脱毒的，可以选自A组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))，二者含有共同的称为保护性抗原(PA)的B组分。
鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)：鼠疫抗原包括F1荚膜抗原(infectImmun.，2003年1月，71(1)：374-383)、LPS(Infect Immun.，1999年10月，67(10)：5395)、鼠疫耶尔森菌V抗原(Infect Immun.，1997年11月，65(11)：4476-4482)。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)：结核抗原包括任选用阳离子脂质囊泡配制的脂蛋白、LPS、BCG抗原、抗原85B(Ag85B)和/或ESAT-6的融合蛋白(Infent Immun.，2004年10月，72(10)：6148)、结核分枝杆菌(Mtb)异柠檬酸脱氢酶相关抗原(Proc Natl Acad Sci，U S A.，2004年8月24日，101(34)：12652)和/或MPT51抗原(Infect Immun.，2004年7月，72(7)：3829)。
立克次氏体：抗原包括外膜蛋白，包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)(BiochimBiophys Acta.，2004年11月1日，1702(2)：145)、LPS与表面蛋白抗原(SPA)(JAutoimmun.，1989年6月，2增刊：81)。
单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)：细菌抗原可衍生自单核细胞增生利斯特菌。
肺炎衣原体：抗原包括WO 02/02606所鉴定的。
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)：抗原包括蛋白酶抗原、LPS(特别是霍乱弧菌II的脂多糖)、O1 Inaba O-特异性多糖、霍乱弧菌0139、IEM108疫苗的抗原(InfectImmun.，2003年10月，71(10)：5498-504)和/或紧密连接毒素(Zot)。
伤寒沙门菌(Salmonella typhi)(伤寒热)：抗原包括荚膜多糖，优选偶连抗原(Vi，即vax-TyVi)。
布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)：抗原包括脂蛋白(例如OspA、OspB、OspC和OspD)，其它表面蛋白，例如OspE-相关蛋白(Erps)，核心蛋白聚糖结合蛋白(例如DbpA)与抗原性可变VI蛋白，例如P39和P13相关的抗原(膜整合蛋白质，Infect Immun.，2001年5月，69(5)：3323-3334)，VlsE抗原性可变蛋白(J ClinMicrobiol.，1999年12月，37(12)：3997)。
牙龈卟啉单孢菌：抗原包括牙龈卟啉单孢菌外膜蛋白(OMP)。
克雷伯菌(Klebsiella)：抗原包括OMP，包括OMP A或任选与破伤风类毒素偶连的多糖。
本发明的其它细菌抗原可以是任何上述细菌的荚膜抗原、多糖抗原或蛋白质抗原。其它细菌抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制品。此外，可包括活的、减毒的和/或纯化的任何上述细菌。本发明抗原可源自革兰阴性或革兰阳性细菌。本发明抗原可源自需氧或厌氧细菌。
此外，任何上述细菌衍生的糖(多糖、LPS、LOS或寡糖)可与另一种物质或抗原偶连，例如载体蛋白(如CRM197)。如美国专利号5,360,897与Can J Biochem CellBiol.，1984年5月，62(5)：270-5所述，这种偶连可通过糖的羰基部分与蛋白质的氨基(发生)还原性胺化而直接偶连。或者，糖可通过接头，例如琥珀酰胺或《生物偶连技术》Bioconjugate Techniques，1996与CRC，《蛋白质偶连与交联的化学》Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，1993所提供的其它连接键偶连。
B.病毒抗原
适用于本发明的病毒抗原包括灭活(或杀死)的病毒、减毒的病毒、分离的病毒制剂(split virus formulation)、纯化的亚单位制剂、从病毒分离、纯化或衍生的病毒蛋白与病毒样颗粒(VLP)。病毒抗原可以衍生自在细胞培养物或其它物质中繁殖的病毒。或者，可以重组表达病毒抗原。病毒抗原优选包含在其生命周期的至少一个阶段暴露于病毒表面的表位。病毒抗原优选在多种血清型或分离物之间保守。病毒抗原包括从下列一种或多种病毒衍生的抗原以及以下鉴定的特异性抗原例子。
正黏病毒(Orthomyxovirus)：病毒抗原可衍生自正黏病毒，例如甲型、乙型和丙型流感(病毒)。正黏病毒抗原可选自一种或多种病毒蛋白，包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、一种或多种转录酶组分(PB1、PB2和PA)。优选的抗原包括HA和NA。
流感抗原可衍生自流行病两次爆发之间(每年)的流感毒株。或者，流感抗原可源自能导致流行病爆发的毒株(即，与目前流行的毒株的血凝素相比，具有新血凝素的流感毒株，或者可在禽类中致病并可能在人群中水平传播的流感毒株，或者对人致病的流感毒株)。
副黏病毒科病毒(Paramyxoviridae)：病毒抗原可衍生自副黏病毒科病毒，例如肺病毒(RSV)、副黏病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。
肺病毒属(Pneumovirus)：病毒抗原可衍生自肺病毒属，例如呼吸道合胞体病毒(RSV)、牛呼吸道合胞体病毒、小鼠肺炎病毒与火鸡鼻气管炎病毒。肺炎病毒优选RSV。肺病毒抗原可选自一种或多种以下蛋白，包括表面蛋白融合体(F)、糖蛋白(G)和小疏水性蛋白(SH)、基质蛋白M和M2、核衣壳蛋白N、P和L与非结构蛋白NS1和NS2。优选的肺病毒抗原包括F、G和M。参见例如J Gen Virol.，2004年11月，85(11部分)：3229)。肺病毒属抗原也可自嵌合型病毒配制或衍生。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可包含RSV与PIV二者的组分。
副黏病毒属(Paramyxovirus)：病毒抗原可源自副黏病毒，例如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎(病毒)、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副黏病毒优选PIV或腮腺炎病毒。副黏病毒抗原可选自一种或多种以下蛋白：血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基质蛋白(M)。优选的副黏病毒蛋白包括HN、F1和F2。副黏病毒抗原也可自嵌合型病毒配制或衍生。例外，嵌合型RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的组分。可购得的腮腺炎疫苗包括单价形式或与麻疹和风疹疫苗(NMR)组合的活减毒腮腺炎病毒。
麻疹病毒属(Morbillivirus)：病毒抗原可源自麻疹病毒，例如麻疹。麻疹病毒抗原可选自一种或多种以下蛋白：血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质蛋白(M)。可购得的麻疹疫苗包含通常与麻疹和风疹疫苗(NMR)组合的活减毒麻疹病毒。
小RNA病毒(Picornavirus)：病毒抗原可源自小RNA病毒，例如肠病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)、心病毒和口蹄病毒。优选源自肠病毒，例如脊髓灰质炎病毒的抗原。
肠病毒属(Enterovirus)：病毒抗原可源自肠病毒，例如1、2或3型脊髓灰质炎病毒、1-22和24型柯萨奇A病毒、1-6型柯萨奇B病毒、1-9、11-27和29-34型艾柯病毒(ECHO病毒)与68-71(型)肠病毒。肠病毒优选脊髓灰质炎病毒。肠病毒抗原宜选自一种或多种以下衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4。可购得的脊髓灰质炎疫苗包括灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。
嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)：病毒抗原可源自嗜肝RNA病毒，例如甲型肝炎病毒(HAV)。可购得的HAV疫苗包括灭活HAV疫苗。
披膜病毒(Togavirus)：病毒抗原可源自披膜病毒，例如风疹病毒属、甲病毒属或动脉炎病毒属。优选源自风疹病毒属，例如风疹病毒(Rubella virus)的抗原。披膜病毒抗原可选自E1、E2、E3、C、NSP-1、NSPO-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原优选E1、E2或E3。可购得的风疹疫苗包含通常与腮腺炎和麻疹疫苗(NMR)组合的活的冷适应病毒。
黄病毒属(Flavivirus)：病毒抗原可源自黄病毒，例如蜱传脑炎(TBE)(病毒)、登革热(病毒)(1、2、3或4型)、黄热(病毒)、日本脑炎(病毒)、西尼罗脑炎(病毒)、圣路易斯脑炎(病毒)、俄罗斯春夏脑炎(病毒)、Powassan脑炎(病毒)。黄病毒抗原可选自PrM、M、C、E、NS-1、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。黄病毒抗原优选PrM、M和E。可购得的TBE疫苗包括灭活病毒疫苗。
瘟病毒属(Pestivirus)：病毒抗原可源自瘟病毒，例如牛病毒性腹泻(病毒)(BVDV)、典型猪瘟(病毒)(CSFV)或边界病(病毒)(BDV)。
嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus)：病毒抗原可源自嗜肝DNA病毒，例如乙型肝炎病毒。嗜肝DNA病毒抗原可选自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。可购得的HBV疫苗包括含有表面抗原S蛋白的亚单位疫苗。
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)：病毒抗原可源自丙型肝炎病毒(HCV)。HCV抗原可选自E1、E2、E1/E2、NS345多蛋白、NS345-核心多蛋白、核心(蛋白)和/或非结构区域肽的一种或多种(Houghton等，Hepatology，(1991)，14：381)。
弹状病毒(Rhabdovirus)：病毒抗原可源自弹状病毒，例如狂犬病病毒属(狂犬病病毒)和水泡性病毒属(VSV)。弹状病毒抗原可选自糖蛋白(G)、核蛋白(N)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。可购得的狂犬病病毒疫苗包含在人二倍体细胞或恒河猴胎肺细胞中生长的杀死病毒。
杯状病毒科(Caliciviridae)：病毒抗原可源自杯状病毒科，例如诺瓦克病毒与诺瓦克样病毒，例如夏威夷病毒与雪山病毒。
冠状病毒属(Coronavirus)：病毒抗原可源自冠状病毒、SARS、人呼吸道冠状病毒、禽类传染性支气管炎(病毒)(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可选自突起(蛋白)(S)、包膜(蛋白)(E)、基质(蛋白)(M)、核衣壳(蛋白)(N)和血凝素-酯酶糖蛋白(HE)。冠状病毒抗原衍生自SARS病毒。SARS病毒抗原公开于WO 04/92360。
逆转录病毒(Retrovirus)：病毒抗原可源自逆转录病毒，例如肿瘤病毒、慢病毒属(Lentivirus)或泡沫病毒属(Spumavirus)。肿瘤病毒抗原可衍生自HTLV-1、HTLV-2或HTLV-5。慢病毒属抗原可衍生自HIV-1或HIV-2。逆转录病毒抗原可选自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu和vpr。HIV抗原可选自gag(p24gag和p55gag)、env(gp160和gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、微小蛋白(优选p55 gag和gp140v缺失)。HIV抗原可衍生自一种或多种以下毒株：HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1US4。
呼肠孤病毒(Reovirus)：病毒抗原可源自呼肠孤病毒，例如正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)、轮状病毒属(Rotavirus)、环状病毒属(Orbivirus)或科罗拉多蜱传热症病毒属(Coltivirus)。呼肠孤病毒抗原可选自结构蛋白λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、σ1、σ2或σ3，或非结构蛋白σNS、μNS或σls。优选的呼肠孤病毒抗原可衍生自轮状病毒。轮状病毒属抗原可选自VP1、VP2、VP3、VP4(或切割产物VP5和VP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。优选的轮状病毒属抗原包括VP4(或切割产物VP5和VP8)和VP7。
细小病毒属(Parvovirus)：病毒抗原可源自细小病毒，例如细小病毒B19。细小病毒抗原可选自VP-1、VP-2、VP-3、NS-1和NS-2。细小病毒抗原优选衣壳蛋白VP-2。
丁型肝炎病毒(HDV)：病毒抗原可源自HDV，特别是HDV的6-抗原(参见，例如美国专利号5,378,814)。
戊型肝炎病毒(HEV)：病毒抗原可源自HEV。
庚型肝炎病毒(HEV)：病毒抗原可源自HGV。
人疱疹病毒：病毒抗原可源自人疱疹病毒，例如单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。人疱疹病毒抗原可选自立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(γ)。HSV抗原可衍生自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原可选自糖蛋白gB、gC、gD和gH，融合蛋白(gB)或免疫逃避蛋白(gC、gE或gI)。VZV抗原可选自核心、核衣壳、间层或包膜蛋白。减毒活VZV疫苗可购得。EBV抗原可选自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳抗原(VCA)与膜抗原(MA)糖蛋白。CMV抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(例如gB和gH)与间层蛋白。
乳多空病毒(Papovaviruses)：抗原可源自乳多空病毒，例如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原优选衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可选自衣壳蛋白(L1)和(L2)或E1-E7或其融合体。HPV抗原优选配制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可选自VP1、VP2或VP3。
还提供了《疫苗》(Vaccines)，第四版，(Plotkin和Orenstein编，2004)；《医学微生物》(Medical Microbiology)，第四版，(Murray等编，2002)；《病毒学》(Virology)，第三版(W.K.Joklik编，1988)；《基础病毒学》(Fundamental Virology)，第二版，(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)所包括的抗原、组合物、方法与微生物，考虑了这些抗原、组合物、方法和微生物与本发明组合物联用。
C.真菌抗原
本发明所用的真菌抗原可源自一种或多种以下真菌。
真菌抗原可源自皮肤癣菌，包括：絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccusum)、头癣小孢霉(Microsporum audouini)、狗小孢霉(Microsporum canis)、歪斜小孢霉(Microsporum distortum)、马小孢霉(Microsporum equinum)、石膏状小孢霉(Microsporum gypsum)、猪小孢霉(Microsporum nanum)、同心发癣菌(Trichophytonconcentricum)、马发癣菌(Trichophyton equinum)、鸡发癣菌(Trichophyton gallinae)、石膏状发癣菌(Trichophyton gypseum)、表格发癣菌(Trichophyton megnini)、须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、Trichophyton quinckeanum、红色发癣菌(Trichophyton rubrum)、舍莱恩发癣菌(Trichophyton schoenleini)、断发癣菌(Trichophyton tonsurans)、疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)、牛发癣菌(T.verrucosum var.album)、var.discoides、var.ochraceum、堇色发癣菌(Trichophytonviolaceum)和/或Trichophyton faviforme。
真菌病原体源自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、金色土曲霉(Aspergillusterreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲霉(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽生裂殖酵母(Blastoschizomyces capitatus)、白假丝酵母(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克鲁丝假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克柔假丝酵母(Candida kusei)、Candida parakwsei、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporitm carrionii)、厌酷球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、Blastomyces dermatidis、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、凋萎腐霉(Pythiumn insidiosum)、瓶形酵母(Pityrosporumovale)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisae)、布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、Scedosporium apiosperum、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)、鳞斑霉(Malassezia spp.)、着色真菌(Fonsecaea spp.)、王氏皮炎霉菌(Wangiella spp.)、申克孢子丝菌(Sporothrix spp.)、蛙粪霉(Basidiobolus spp.)、耳霉(Conidiobolus spp.)、根霉(Rhizopus spp)、毛霉(Mucorspp)、犁头霉(Absidia spp)、被孢霉(Mortierella spp)、小克银汉霉(Cunninghamellaspp)、瓶霉(Saksenaea spp.)、链格孢(Alternaria spp)、弯孢(Curvularia spp)、长蠕孢(Helminthosporium spp)、镰孢(Fusarium spp)、曲霉(Aspergillus spp)、青霉(Penicilliumspp)、链核盘菌属(Monolinia spp)、丝核菌(Rhizoctonia spp)、拟青霉(Paecilomycesspp)、比梭菌(Pithomyces spp)和枝孢(Cladosporium spp.)。
本领域熟知制备真菌抗原的方法(参见美国专利号6,333,164)。在一优选的方法中，从基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞得到的不可溶组分中提取并分离可溶性组分，所述方法的特征在于包括以下步骤：获得真菌活细胞；获得基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞；裂解基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞；获得不可溶组分；从不可溶组分提取并分离可溶性组分。
D.STD抗原
本发明组合物可包含一种或多种源自性传播疾病(STD)的抗原。这种抗原可提供对STD的预防或治疗作用，例如衣原体、生殖道疱疹、肝炎(如HCV)、生殖道疣、淋病、梅毒和/或软性下疳(参见，WO 00/15255)。抗原可源自一种或多种病毒性或细菌性STD。本发明所用的病毒性STD抗原可源自，例如HIV、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳头瘤病毒(HPV)与肝炎病毒(HCV)。本发明所用的细菌性STD抗原可源自淋病奈瑟球菌、砂眼衣原体、苍白密螺旋体、杜氏嗜血菌、大肠杆菌和无乳链球菌。衍生自这些病原体的特异性抗原的例子如上所述。
E.呼吸道抗原
本发明组合物可包含一种或多种源自导致呼吸道疾病的病原体的抗原。例如，呼吸道抗原可衍生自呼吸道病毒，如正黏病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副黏病毒(PIV)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、VZV和冠状病毒(SARS)。呼吸道抗原可源自导致呼吸道疾病的细菌，例如肺炎链球菌、绿脓假单胞菌、百日咳博得特菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎衣原体、炭疽杆菌和粘膜炎莫拉菌。衍生自这些病原体的具体抗原的例子如上所述。
F.儿科疫苗抗原
本发明组合物可包含适用于儿科对象的一种或多种抗原。儿科对象通常小于约3岁、或小于约2岁或小于约1岁。儿科抗原可在6个月、1年、2年或3年期间多次给予。儿科抗原可源自靶向儿童人群的病毒和/或儿童人群易受感染的病毒。儿科病毒抗原包括源自正黏病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副黏病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘带状疱疹病毒(VZV)与EB病毒(EBV)的一种或多种抗原。儿科细菌抗原包括源自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博得特菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒杆菌(白喉)、B型流感嗜血杆菌B(Hib)、绿脓假单胞菌、无乳链球菌(B群链球菌)和大肠杆菌的一种或多种抗原。源自这些病原体的特异性抗原的例子如上所述。
G.适用于年长或免疫受损个体的抗原
本发明组合物可包含适用于年长或免疫受损个体的一种或多种抗原。这种个体需要更频繁地接种疫苗，采用较高剂量或加入佐剂的制剂来提高它们对靶向抗原的免疫应答。适用于年长或免疫受损个体的可靶向抗原包括源自以下一种或多种病原体的抗原：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博得特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒杆菌(白喉)、B型流感嗜血杆菌B(Hib)、绿脓假单胞菌、侵肺军团菌、无乳链球菌(B群链球菌)、粪肠球菌、幽门螺杆菌、肺炎衣原体、正黏病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副黏病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。源自这些病原体的特异性抗原的例子如上所述。
H.适用于成人疫苗的抗原
本发明组合物可包含适用于成人对象的一种或多种抗原。成人可能需要一起给予的儿科抗原的加强免疫。适用于成人的儿科抗原如上所述。此外，成人可靶向接受源自STD病原体的抗原以确保在性行为开始前(获得)保护性或治疗性免疫力。适用于成人的STD抗原如上所述。
I.肿瘤抗原
本发明的一个实施方案包括与本发明组合物联用的肿瘤抗原或癌症抗原。肿瘤抗原可以是，例如含有肽的肿瘤抗原，如肿瘤多肽抗原或肿瘤糖蛋白抗原。肿瘤抗原也可以是，例如含糖的肿瘤抗原，如肿瘤糖脂抗原或神经节苷脂肿瘤抗原。肿瘤抗原还可以是，例如含有可表达含多肽肿瘤抗原的多核苷酸肿瘤抗原，如RNA载体构建物或DNA载体构建物，如质粒DNA。
适合于实施本发明的肿瘤抗原包括各种分子，例如(a)含多肽肿瘤抗原，包括多肽(如长8-20个氨基酸，虽然超出此长度范围也常见)、脂多肽和糖蛋白，(b)含糖肿瘤抗原，包括多糖、黏蛋白、神经节苷脂、糖脂和糖蛋白，和(c)表达抗原性多肽的多核苷酸。
肿瘤抗原可以是，例如(a)癌细胞相关的全长分子，(b)其同类物与修饰形式，包括缺失、添加和/或取代的分子，与(c)其片段。可以重组形式提供的肿瘤抗原。肿瘤抗原包括，例如CD8+淋巴细胞所识别的I类-限制性抗原(restricted antigen)或CD4+淋巴细胞所识别的II类-限制性抗原。
本领域已知许多肿瘤抗原，包括：(a)睾丸癌抗原，例如NY-ESO-I、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(其可用于例如寻址黑色素瘤、肺、头颈、NSCLC、乳腺、胃肠道与膀胱肿瘤)，(b)突变抗原，例如p53(与各种实体瘤相关，如结肠直肠、肺、头颈癌症)、p21/Ras(与例如黑色素瘤、胰腺癌和结肠直肠癌相关)、CDK4(与例如黑色素瘤相关)、MUM1(与例如黑色素瘤相关)、胱冬酶-8(与例如头颈癌相关)、CIA 0205(与例如膀胱癌相关)、HLA-A2-R1701、β联蛋白(与例如黑色素瘤相关)、TCR(与例如T-细胞性非何杰金淋巴瘤相关)、BCR-ab1(与例如慢性髓细胞性白血病相关)、三磷酸丙糖异构酶、KIA 0205、CDC-27和LDLR-FUT，(c)过度表达的抗原，例如半乳凝集素4(与例如结肠直肠癌相关)、半乳凝集素9(与例如何杰金病相关)、蛋白酶3(与例如慢性髓细胞性白血病相关)、WT1(与例如各种白血病相关)、碳酸酐酶(与例如肾癌相关)、醛缩酶A(与例如肺癌相关)、PRAME(与例如黑色素瘤相关)、HER-2/neu(与例如乳腺、结肠、肺和卵巢癌相关)、甲胎球蛋白(与例如肝癌相关)、KSA(与例如结肠直肠癌相关)、胃泌素(与例如胰腺和胃癌相关)、端粒酶催化蛋白、MUC-1(与例如乳腺和卵巢癌相关)、G-250(与例如肾细胞癌相关)、p53(与例如乳腺、结肠癌相关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌和胃肠道癌症，如结肠直肠癌相关)，(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞分化抗原，如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、促黑素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1与酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(与例如黑色素瘤相关)，(e)前列腺相关抗原，例如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，与例如前列腺癌相关，(f)免疫球蛋白独特型(与例如骨髓瘤和B细胞性淋巴瘤相关)，与(g)其它肿瘤抗原，例如含有多肽和糖的抗原，包括(i)糖蛋白，例如唾液酸化Tn和唾液酸化Lex(与例如乳腺和结肠直肠癌相关)以及各种黏蛋白；糖蛋白可以与载体蛋白偶联(例如，MUC-1可与KLH偶联)；(ii)脂多肽(例如，与脂质部分相连的MUC-1)；(iii)可与载体蛋白(例如，KLH)偶联的多糖(例如，GloboH合成多聚己糖)；(iv)也可与载体蛋白(例如，KLH)偶联的神经节苷脂，例如GM2、GM12、GD2、GD3(与例如脑癌、肺癌、黑色素瘤相关)。本领域已知的其它肿瘤抗原包括p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原(包括E6和E7)、乙肝和丙肝病毒抗原、人T-细胞嗜淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791 Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。美国专利申请20020007173及其引用的参考文献描述了这些以及其它细胞组分。
本发明含多核苷酸的抗原通常含有编码癌症多肽抗原(例如上述)的多核苷酸。优选的含多核苷酸的抗原包括能在体内表达癌症多肽抗原的DNA或RNA载体构建物，例如质粒载体(如pCMV)。
肿瘤抗原可源自，例如突变的或改变的细胞组分。改变后，细胞组分不再行使其调节功能，因此细胞可经历失控生长。改变的细胞组分的代表性例子包括ras、p53、Rb、Wilms肿瘤基因编码的改性蛋白、泛素、黏蛋白、DCC、APC和MCC基因编码的蛋白以及受体或受体样结构，如neu、甲状腺激素受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、胰岛素受体、表皮生长因子(EGF)受体与集落刺激因子(CSF)受体。例如，美国专利号5,693,522及其引用的参考文献描述了这些组分以及其它细胞组分。
此外，细菌和病毒抗原可联用于本发明组合物来治疗癌症。具体地说，载体蛋白，例如CRM197，破伤风类毒素或鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)抗原可与本发明化合物联用/偶联来治疗癌症。与已有的疗法相比，癌症抗原组合疗法显示疗效与生物利用率提高。
癌症或肿瘤抗原的其它信息见，例如Moingeon P，“癌症疫苗”(Cancervaccines)，Vaccine，2001，19：1305-1326；Rosenberg SA，“人肿瘤免疫学和免疫疗法进展”(Progress in human tumor immunology and immunotherapy)，Nature，2001，411：380-384，Dermine，S.等，“癌症疫苗与免疫疗法”(Cancer Vaccines andImmunotherapy)，British Medical Bulletin，2002，62，149-162；Espinoza-Delgado L，“癌症疫苗”(Cancer Vaccines)，The Oncologist，2002，7(增刊3)：20-33；Davis，LD.等，“人癌症疗法的合理方法”(Rational approaches to human cancerimmunotherapy)，Journal of Leukocyte Biology，2003，23：3-29；Van den Eynde B等，“T细胞可识别的新肿瘤抗原”(New tumor antigen recognized by T cells)，Curr.Opin.Immunol.，1995，7：674-81；Rosenberg SA，“基于鉴定到的编码癌症消退抗原的基因的癌症疫苗”(Cancer vaccines based on the identification of genesencoding cancer regression antigen)，Immunol.Today，1997，18：175-82；Offringa R等，“抗癌症的抗原特异性疫苗接种方案的设计和评估”(Design and evaluation ofantigen-specific vaccination strategies against cancer)，Current Opin.Immunol.，2000，2：576-582；Rosenberg SA，“基于编码癌症抗原基因的癌症免疫疗法新时代”(Anew era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigen)，Immunity，1999，10：281-7；Sahin U等，“人肿瘤抗原的血清学鉴定”(Serologicalidentification of human tumor antigen)，Curr.Opin.Immunol.，1997，9：709-16；OldLJ等，“人癌症血清学的新途径”(New paths in human cancer serology)，J.Exp.Med.，1998，187：1163-7；Chaux P等，“鉴定通过HLA-DR分子呈递至CD4(+)T淋巴细胞的MAGE-3表位”(Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DRmolecules to CD4(+)T lymphocytes)，J.Exp.Med.，1999，189：767-78；Gold P等，“人消化系统的特异性癌胚抗原”(Specific carcinoembryonic antigen of the humandigestive system)，J.Exp.Med.，1965，122：467-8；Livingston PO等，“诱导抗癌症抗体的碳水化合物疫苗：基本原理”(Carbohydrate vaccines that induce antibodiesagainst cancer：Rationale)，Cancer Immunol.Immunother.，1997，45：1-6；LivingstonPO等，“诱导抗癌症抗体的碳水化合物疫苗：以前的经验与将来的计划”(Carbohydrate vaccines that induce antibodies against cancer：Previous experience andfuture plans)，Cancer Immunol.Immunother.，1997，45：10-9；Taylor-PapadimitriouJ，“癌相关黏蛋白的生物学、生物化学与免疫学”(Biology，biochemistry andimmunology of carcinoma-associated mucins)，Immunol.Today，1997，18：105-7；Zhao X-J等，“GD2寡糖：细胞毒性T淋巴细胞的靶标”(GD2 oligosaccharide：targetfor cytotoxic T lymphocytes)，J.Exp.Med.，1995，182：67-74；Theobald M等，“靶向通用肿瘤抗原的p53”(Targeting p53 as a general tumor antigen)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92：11993-7；Gauderaack G，“抗突变型ras的T细胞应答：新癌症疫苗的基础”(T cell responses against mutant ras：a basis for novel cancer vaccines)，Immunotechnology，1996，2：3-9；WO 91/02062；美国专利号6,015,567；WO01/08636；WO 96/30514；美国专利号5,846,538与美国专利号5,869,445。
J.抗原制剂
本发明其它方面提供了吸附有抗原的微粒制备方法。所述方法包括：(a)通过分散含有(i)水，(ii)去污剂，(iii)有机溶剂和(iv)选自聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的生物可降解聚合物的混合物来提供乳剂。该混合物中聚合物相对于有机溶剂的浓度通常是约1％-30％，同时该混合物中去污剂与聚合物的重量比通常是约0.00001∶1-约0.1∶1(更常见是约0.0001∶1-约0.1∶1，约0.001∶1-约0.1∶1或约0.005∶1-约0.1∶1)；(b)除去乳剂中的有机溶剂；和(c)将抗原吸附到微粒表面。在某些实施方案中，生物可降解聚合物相对于有机溶剂的浓度是约3％-约10％。
可用可灭菌的、无毒性生物可降解材料制备本文所用的微粒。这种材料包括但不限于：聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。本发明所用的微粒优选衍生自聚(α-羟酸)，特别是聚(丙交酯)(“PLA”)或D，L-丙交酯和乙交酯或乙醇酸(glycolic acid)的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)或D，L-丙交酯和己酸内酯的共聚物。微粒可衍生自分子量不同的各种聚合起始材料，对于共聚物，例如PLG，丙交酯∶乙交酯有各种比值，比值的选择部分取决于共同给予的大分子。下文更全面讨论了这些参数。
其它抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制品。
美国专利系列号09/581,772提供了其它配制方法与抗原(特别是肿瘤抗原)。
K.抗原参考文献
以下参考文献包括和本发明组合物联用的抗原：
下文列出了抗原的参考文献：
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62.欧洲专利申请0471177
63.国际专利申请WO 00/56360
64.国际专利申请WO 00/67161
包含本文所述化合物的药物组合物可含有添加剂，例如赋形剂。合适的药学上可接受的赋形剂包括加工试剂和药物递送修饰剂与增强剂，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、羟丙基-β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点的蜡、离子交换树脂等以及这些物质的任何两种或多种组合。《雷明顿药物科学》(Remington′s PharmaceuticalSciences)，Mack Pub.Co.，新泽西，(1991)描述了其它合适的药学上可接受的赋形剂，该著作出于所有目的如同全文列出一样全文纳入本文作为参考。
包含本文所述化合物的药物组合物可以是适合于所需给药方式的任何剂型，包括例如溶液、悬浮液或乳剂。通常用液体载体制备溶液、悬浮液和乳剂。考虑用于实施本发明的液体载体包括，例如水、盐水、药学上可接受的有机溶剂、药学上可接受的油或脂肪等以及这些物质的两种或多种混合物。所述液体载体可包含其它合适的药学上可接受的添加剂，例如增溶剂、乳化剂、营养素、缓冲剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂、粘度调节剂、稳定剂等。合适的有机溶剂包括，例如一元醇，如乙醇与多元醇，如乙二醇。合适的油包括但不限于：大豆油、椰油、橄榄油、红花油、棉籽油等。对于胃肠外给药，载体可以是油性酯类，例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯等。本发明组合物也可以是微粒、微胶囊等剂型以及这些剂型的任何两种或多种组合。
本发明的化合物与组合物也可以脂质体形式给药。本领域已知脂质体通常衍生自磷脂或其它脂类物质。通过将单层或多层水合液晶分散在水性介质中形成脂质体。可利用能形成脂质体的任何无毒，生理上可接受与可代谢的脂质。除了本发明化合物以外，脂质体形式的本发明组合物可包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质包括天然与合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。本领域已知制备脂质体的方法。参见，例如Prescott编，《细胞生物学方法》(Methods in Cell Biology)，第XIV卷，科学出版社，纽约，N.W.，第33页起，(1976)。
本发明组合物中的其它添加剂可包括本领域已知或本文所列的免疫刺激药物。PCT WO 98/55495和PCT WO 98/16247公开了免疫刺激性寡核苷酸与多核苷酸。美国专利申请号2002/0164341描述了含有未甲基化的CpG二核苷酸(CpG ODN)的佐剂与非核酸佐剂。美国专利申请号2002/0197269描述了含有抗原、抗原性CpG-ODN与聚阳离子聚合物的组合物。也可利用本领域描述的其它免疫刺激性添加剂，例如美国专利号5,026,546；4,806,352和5,026,543所述的。此外，考虑了U.S.S.N.10/814480和60/582654所述的SMIP化合物可用作有效的共同给予药物或可与本发明组合物联用。
也可采用控释递送系统，例如受控扩散的基质系统或可侵蚀系统，例如Lee，“受控扩散的基质系统”(Diffusion-Controlled Matrix Systems)，第155-198页与Ron和Langer，“可侵蚀系统”(Erodible Systems)，第199-224页，刊于《受控药物递送论文》(Treatise on Controlled Drug Delivery)，A.Kydonieus编，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1992所述的。基质可以是，例如可在原位与体内通过，例如水解或酶切割(如利用蛋白酶)而自发降解的生物可降解材料。该递送系统可以是，例如天然产生或合成的聚合物或共聚物，例如水凝胶的形式。具有可切割连接键的示范性聚合物包括聚酯、聚原酸酯、聚酐、多糖、聚(磷酸酯)、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚(亚氨碳酸酯)和聚(磷腈)。
本发明化合物可以单位剂量制剂经肠、口服、胃肠外、舌下、通过喷雾吸入、直肠或局部给予，如果需要，所述制剂可含有无毒的药学上可接受的常规载体、佐剂和运载体。例如，合适的给药方式包括口服、皮下、透皮、经粘膜、离子电渗、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、真皮下、直肠等。局部给药也可包括采用透皮给药，例如透皮贴剂或离子电渗装置。本文所用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输液技术。
可按照本领域已知的(方法)利用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。所述无菌可注射制剂也可以是用无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂配制的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1，3-丙二醇溶液。可利用的可接受载体和溶剂是水、林格溶液与等渗氯化钠溶液。此外，常规采用无菌、不挥发的油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可利用任何温和的不挥发油，包括合成的单甘油酯或甘油二酯。此外，发现脂肪酸，例如油酸可用于制备可注射制剂。
可通过将药物与合适的无刺激赋形剂，例如可可油与聚乙二醇混合来制备直肠给药的栓剂，二者在常温是固态，但在直肠温度是液态，因而能在直肠中融化并释放药物。
口服给药的固态剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末与粒剂。在这种固态剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。如正常实施一样，这种剂型也可包含除惰性稀释剂以外的其它物质，例如润滑剂，如硬脂酸镁。胶囊、片剂和丸剂剂型也可包含缓冲剂。还可制备含肠包衣的片剂和丸剂。
用于口服给药的液体剂型可包括含有本领域常规使用的惰性稀释剂(例如水)的药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。这种组合物也可含有佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、环糊精与甜味剂、调味剂和香料。
本发明化合物的有效量通常包括足以可检测地治疗本文所述疾病的任何用量。
成功治疗本发明所述对象可导致患医学或生物学疾病的对象的症状减轻或缓解。例如，治疗可阻止疾病的进一步发展，或者可防止或减缓疾病的发展。
可与载体物质混合来制备单剂型的活性成分用量取决于所治疗对象与具体给药方式而不同。然而应该知道任何患者的具体剂量水平取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排出率、药物组合与所治疗具体疾病的严重性。普通临床医师根据其技术与判断不难通过常规实验确定给定状况的治疗有效量。
定义
上文与本文别处所用的以下术语和缩写如下文所定义：
AcH：乙酸
ATP：腺苷三磷酸
BCG：卡介分枝杆菌(Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin)
Bn：苄基
BSA：牛血清白蛋白
DCM：二氯甲烷
DIEA：N，N-二异丙基-乙胺
EDC：盐酸1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺
FHA：丝状血凝素
GCMS：气相色谱/质谱
H.Pylori：幽门螺杆菌
HAV：甲型肝炎病毒
HBV：乙型肝炎病毒
HBr：溴化氢
HCV：丙型肝炎病毒
HIV：人免疫缺陷病毒
HPLC：高效液相色谱
HSV：单纯疱疹病毒
IC50值：导致所检测的活性降低50％的抑制剂浓度
IFN：干扰素
IL：白介素
IMS：免疫磁性分离
IPV：灭活的脊髓灰质炎病毒
LCMS：液相色谱/质谱
LPS：脂多糖
Mab或mAb：单克隆抗体
Men A：A群脑膜炎奈瑟球菌
Men C：C群脑膜炎奈瑟球菌
Men B：B群脑膜炎奈瑟球菌
Men W：W群脑膜炎奈瑟球菌
Men Y：Y群脑膜炎奈瑟球菌
MeOH：甲醇
MW：分子量
NANB：非甲非乙肝炎
NMR：核磁共振
OMV：外膜囊泡
PBMC：外周血单核细胞
PT：百日咳全毒素
Rt：室温(25℃)
SMIP：小分子免疫增效剂
tBOK：叔丁醇钠
TEA：三乙胺
OTf：三氟甲磺酸酯
THF：四氢呋喃
TLC：薄层层析和/或小心照料(Tender Loving Care)
TMS：三甲基甲硅烷基
TNF-α：肿瘤坏死因子-α
术语“SMIP”指能刺激或调节患者的促炎应答，分子量通常低于约800g/mol的小分子免疫增效化合物，包括小分子化合物。在一些实施方案中，SMIP化合物能刺激人外周血单核细胞产生细胞因子。更具体地说，优选的SMIP包括咪唑并喹啉与本文所述式I所包括或本文引用的任何参考文献所包括的那些化合物。
术语“SMIS”指能抑制或调节患者的免疫应答，分子量通常低于约800g/mol的小分子免疫抑制化合物。在一些实施方案中，SMIS化合物能抑制人外周血单核细胞产生细胞因子、趋化因子和/或生长因子。在其它实施方案中，SMIS化合物能诱导TGF-β产生，从而抑制免疫应答。
“咪唑并喹啉”(属于本发明的咪唑并喹啉)表明具有本文所述式I通用结构的化合物。在一些实施方案中，咪唑并喹啉选自下列之一：
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-e]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；
4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇；
1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；或
N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。
术语“难治的癌细胞”指对现有治疗方案，包括指定的给药方案抗药的癌症细胞系。
本发明方法可用于治疗“过敏疾病”，所述治疗可以和本文所述其它免疫治疗方法相同的方式实现。
“过敏原”指可诱导易感对象产生过敏或哮喘应答的物质(抗原)。过敏原很多，包括花粉、昆虫毒液、动物皮屑、灰尘、真菌孢子与药物(例如，青霉素)。
“哮喘”指特征在于炎症、气道收缩与气道对所吸入物质的反应性升高的呼吸系统疾病。哮喘往往伴有特应性或过敏症状，虽然不排除其它症状。
术语“白三烯抑制剂”包括能抑制、限制、减缓白三烯的作用或活性，或者能与之相互作用的任何药物或化合物，例如但不限于5-脂肪氧合酶(“5-LO”)抑制剂、5-脂肪氧合酶活化蛋白(“FLAP”)拮抗剂与白三烯D4(“LTD4”)拮抗剂。
“调节”指诱导或抑制。
“免疫刺激”或“免疫增效”指激活免疫系统，包括体液或细胞(免疫)激活，例如激活细胞，如免疫系统的杀伤细胞(T或NK)或树突状细胞，例如提高树突状细胞产生细胞因子从而导致总体提高宿主的防御(免疫应答)。
“调节免疫应答”指本文所定义的免疫增效或免疫抑制。
“免疫原性组合物”指能刺激免疫应答的组合物。在一些实施方案中，“免疫原性组合物”是能刺激对象免疫应答的组合物。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物能调节对象的细胞因子产生，从而实现该对象的免疫增效作用。
“免疫抑制”指免疫系统失活，例如防止或降低树突状细胞产生细胞因子从而导致总体降低宿主防御(免疫应答)。
“免疫刺激有效量”是足以激活免疫系统的用量，例如增加树突状细胞产生细胞因子从而导致总体提升宿主防御(免疫应答)。
通过某化合物“提高针对某抗原的免疫应答”指与不存在该化合物时的免疫应答相比，免疫应答提高。提高免疫应答的引发组合物通常是含有抗原和小分子免疫增效剂化合物的组合物，与含有抗原但不含一种或多种小分子免疫增效剂化合物的组合物相比，所述小分子免疫增效剂能引发更强的免疫应答。在这种实施方案中，所述化合物用作佐剂，例如用于疫苗组合物和方法。
“细胞增殖相关疾病”包括但不限于：神经纤维瘤、动脉粥样硬化、肺纤维化、关节炎、银屑病、肾小球肾炎、再狭窄、增殖型糖尿病性视网膜病变(PDR)、肥大性瘢形成、炎性肠病、移植排异、血管生成或内毒素休克。
术语“有效量”是实现所需生物学作用需要的或足够的用量。例如，治疗传染性疾病的某化合物的有效量可以是与传染性物质接触后导致抗原特应性免疫应答所需的用量。有效量可依，例如所治疗的病症、对象的体重与疾病的严重性而不同。本领域技术人员不难凭经验确定有效量而无需过多实验。
本文所用的术语“治疗有效量”指足以减轻、缓解、稳定、逆转、减慢或延迟病症进展(例如疾病状态)的用量。
与现有治疗方法的给药方案相比，“节拍性给药(metronomic administration)”指以低浓度药物，增加频率的给药方案。节拍性给药与细胞毒性药物的典型给药不同，后者包括以最大耐受剂量(MTD)周期性(低频率)给药。
“对象”或“患者”描述了人或脊椎动物，包括狗、猫、袖珍宠物、狨猴、马、牛、猪、绵羊、山羊、象、长颈鹿、鸡、狮、猴、猫头鹰、大鼠、松鼠、懒猴和小鼠。
“袖珍宠物”指能放入宽敞衣袋的一类脊椎动物，例如仓鼠、绒鼠、雪貂、大鼠、豚鼠、沙鼠、家兔和sugar gliders。其它描述见Mackay，B.，“袖珍宠物”(Pocket Pets)，Animal Issues，32(1)，2001。
本文所用的术语“药学上可接受的酯”指能在体内水解的酯，包括易在体内分解从而释放母体化合物或其盐的那些酯。合适的酯基团包括，例如衍生自药学上可接受的脂族羧酸，特别是链烷酸、链烯酸、环烷酸和链烷双酸，其中各烷基或烯基部分优选不超过6个碳原子。具体酯的代表性例子包括但不限于：甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯与乙基琥珀酸酯。
与衍生自无机或有机酸的“药学上可接受的盐”一样，本发明化合物可以盐形式使用。这些盐包括但不限于以下盐：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、葡糖庚酸盐(glucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐、硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。也可用例如以下试剂季铵化含氮的碱性基团：低级烷基卤，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；长链卤化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤，例如溴苄和苯乙基溴化物等。从而得到水或油可溶或可分散的产物。
本文所用的术语“药学上可接受的药物前体”指本发明化合物的那些药物前体以及本发明化合物的两性离子形式(可能的话)，在合理的医学判断范围内，所述药物前体适用于与人和低等动物组织接触，而没有毒性、刺激性、过敏反应等，与合理的益处/风险比相称并可有效应用。术语“药物前体”指在体内可快速转化从而产生上式所示母体化合物的化合物，例如在血液中水解。彻底的讨论见T.Higuchi和V.Stella，“药物前体作为新型递送系统”(Pro-drugs as Novel Delivery Systems)，A.C.S.论坛系列的第14卷与Edward B.Roche编，《药物设计中的生物可逆载体》(Bioreversible Carriers in Drug Design)，American Pharmaceutical Association andPergamon Press，1987。例如可利用美国专利号6,284,772所述的药物前体。
符号
Figure G200580036853XD00591
表明附加(基团)的连接点。
“卤代”、“卤化物”或“卤素”指F、Cl、Br或I原子，特别是F、Cl和Br。
应用于R基团，例如R15的“激活”或“活化”表明R基团连接有能被亲核试剂取代的亲电部分。优选的活化基团的例子是卤素，例如Cl、Br或I和F；三氟甲磺酸酯；酯；醛；酮；环氧化物等。活化R基团的例子是碘丙烷，其易受亲核试剂，例如巯基的攻击从而形成硫代丙烷官能团。
术语“偶联剂”指用作两个取代基之间的连接部分(interface)，任选在二者之间形成化学桥以促进反应完成的试剂。优选的偶联剂是EDC。
术语“脱保护”指除去保护基团，例如除去与胺结合的苄基。可通过加热和/或加入能除去保护基团的试剂进行脱保护。从氨基上除去苄基的优选方法是加入HBr和乙酸并加热。许多脱保护反应为本领域所熟知，描述于《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)，Greene，T.W.，John Wiley & Sons，纽约，NY，(第一版，1981)。
“任选纯化”表明可任选地除去混合物中不是所需产物的组分。这些组分可以是副产物、残留的起始物质或在工艺的某处引入到混合物中的分子，例如水。因此，“纯化”包括层析、蒸馏、重结晶和过滤，以及萃取和干燥或用诸如硫酸钠或甲苯共沸蒸馏。
“氧化”表明与某原子形成比该原子电负性更强的键。向有机分子中加入氢几乎总视作还原。可利用本领域技术人员熟知的各种氧化剂实现氧化。可利用本领域技术人员熟知的各种还原剂实现还原。
“反应”指改变容器中的条件从而使得不起反应的分子变为反应活性。这包括加入溶剂、催化剂、试剂、偶联剂和/或加热等。
“Pearlman催化剂”指活性炭上的氢氧化钯。
短语“烷基”指取代的和未取代的烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。短语“C1-6烷基”具有与烷基相同的意义，除了其限定到6个碳以下的烷基。短语C1-6烷基也包括直链烷基的支链异构体，包括但不限于以下提供的实例：-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2C(CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)等。短语C1-6烷基还包括环状烷基或C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基与用上述直链和支链烷基取代的这种环。短语烷基也包括多环烷基，例如但不限于金刚烷基、降冰片基和双环[2.2.2]辛基与用上述直链和支链烷基取代的这种环。
短语“芳基”指不含有杂原子的取代的和未取代的芳基。短语“C6-10芳基”具有与芳基相同的意义，除了其限定到6-10个碳原子的芳基。短语芳基包括但不限于以下示例性基团：例如苯基、联苯基和萘基。芳基也包括芳香碳之一与上述烷基、烯基或炔基相连的那些基团。这包括其中芳基的两个碳与烷基、烯基或炔基的两个碳结合从而形成稠合环系统(例如，二氢萘基或四氢萘基)的结合排列情况。因此，短语“芳基”包括但不限于甲苯基和羟苯基等。
短语“烯基”指如以上烷基所述的直链、支链和环状基团，除了两个碳原子之间至少存在一个双键。短语“C2-6烯基”具有与烯基相同的意义，除了其限定到2-6个碳原子的烯基。实例包括但不限于：乙烯基、-CH＝C(H)(CH3)、-CH＝C(CH3)2、-C(CH3)＝C(H)2、-C(CH3)＝C(H)(CH3)、-C(CH2CH3)＝CH2、环己烯基、环戊烯基、环己二烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。
短语“烷氧基”指如式-O-烷基所示的基团，其中连接点是氧基，烷基如上定义。短语“C1-6烷氧基”具有与烷氧基相同的意义，除了其限定到1-6个碳原子的烷氧基。
短语“芳氧基”指如式-O-芳基所示的基团，其中连接点是氧基，芳基如上定义。短语“C6-10芳氧基”具有与芳氧基相同的意义，除了其限定到6-10个碳原子的芳氧基。
短语“C1-6烷氧基-C1-6烷基”指具有多达12个碳原子的醚基团。C1-6烷氧基-C1-6烷基的一个实例是-CH2-O-CH2CH3。
短语“C6-10芳氧基-C1-6烷基”指16个以下碳原子的芳醚基团，特别是在C1-6烷基上连接有10个以下碳原子的芳醚基团。C6-10芳氧基-C1-6烷基的一个实例是丙氧基苯。
短语“C6-10芳基-C1-6烷基”指16个以下碳原子的芳基烷基，特别是在C1-6烷基上连接有10个以下碳原子的芳基烷基。C6-10芳基-C1-6烷基的一个例子是甲苯。
短语“炔基”指如以上烷基所述的直链和支链基团，除了两个碳原子之间至少存在一个三键。短语“C2-6炔基”具有与炔基相同的意义，除了其限定到2-6个碳原子的炔基。实例包括但不限于：-C≡C(H)、-C≡C(CH3)、-C≡C(CH2CH3)、-C(H2)C≡C(H)、-C(H)2C＝C(CH3)、-C(H)2C≡C(CH2CH3)等。
短语“三卤甲基”指甲基的3个氢原子被3个相同或不同的卤素取代的甲基。这种基团的一个实例是其中甲基的所有3个氢原子被F原子取代的-CF3基团。
为清晰起见，-CH2C(CH3)2(OH)指2-甲基丙-2-醇或叔丁醇。
短语“杂环基”指含有3个以上环成员，其中一个或多个成员是诸如(但不限于)N、O和S的杂原子的芳环或非芳环化合物，包括单环、双环与多环化合物，例如但不限于：奎宁环基(quinuclidyl)。杂环基的例子包括但不限于：含有1-4个氮原子的不饱和3-8元环，例如但不限于吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、二氢吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基(如4H-1，2，4-三唑基，1H-1，2，3-三唑基，2H-1，2，3-三唑基等)、四唑基(如1H-四唑基、2H四唑基等)；含有1-4个氮原子的饱和3-8元环，例如但不限于吡咯烷基、咪唑烷基，、哌啶基、哌嗪基；含有1-4个氮原子的稠合的不饱和杂环基，例如但不限于吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、中氮茚基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基；含有1-2个氧原子的不饱和3-8元环，例如但不限于呋喃基；含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的的不饱和3-8元环，例如但不限于噁唑基、异噁唑基、噁二唑基(如1，2，4-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基等)；含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的饱和3-8元环，例如但不限于吗啉基；含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和稠合杂环基团，例如苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁嗪基(如2H-1，4-苯并噁嗪基等)；含有1-3个硫原子和1-3个氮原子的不饱和3-8元环，例如但不限于噻唑基、异噻唑基、噻二唑基(如1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基等)；含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的饱和3-8元环，例如但不限于噻唑烷基(thiazolodinyl)；含有1-2个硫原子的饱和与不饱和的3-8元环，例如但不限于噻吩基、二氢二硫杂环己二烯基(dihydrodithiinyl)、二氢二硫酮基(dihydrodithionyl)、四氢噻吩、四氢噻喃；含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的不饱和的稠合杂环，例如但不限于苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻嗪基(如2H-1，4-苯并噻嗪基等)、二氢苯并噻嗪基(如2H-3，4-二氢苯并噻嗪基等)；含有1-2个氧原子不饱和的稠合杂环，例如苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)(如1，3-苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxoyl)等)；含有氧原子和1-2个硫原子的不饱和3-8元环，例如但不限于二氢氧硫杂环己二烯基(dihydrooxathiinyl)；含有1-2个氧原子和1-2个硫原子的饱和3-8元环，例如1，4-氧硫杂环己烷；含有1-2个硫原子的不饱和的稠合环，例如苯并噻吩基、苯并二硫杂环己二烯基(benzodithiinyl)；与含有氧原子和1-2个氧原子的不饱和的稠合杂环，例如苯并氧硫杂环己二烯基(benzoxathiinyl)。杂环基也包括环中一个或多个S原子与一个或两个O原子双键结合的那些基团(亚砜和砜)。例如，杂环基包括四氢噻吩、四氢噻吩氧化物和四氢噻吩1，1-二氧化物。优选的杂环基含有5或6和环成员。更优选的杂环基包括吗啉、哌嗪、哌啶、吡咯烷、咪唑、吡唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、四唑、硫代吗啉(thiomorpholine)、其中S原子与一个或多个O原子结合的硫代吗啉、吡咯、高哌嗪(homopiperazine)、噁唑烷-2-酮、吡咯烷-2-酮、噁唑、奎宁环、噻唑、异噁唑、呋喃与四氢呋喃。“杂环基”也指如以上取代的烷基和取代的芳基所述，其中环成员之一与非氢原子结合的基团。实例包括但不限于2-甲基苯并咪唑基、5-甲基苯并咪唑基、5-氯代苯并噻唑基、1-甲基哌嗪基和2-氯代吡啶基等。杂环基局限于具有2-15个碳原子和最多6个上述其它杂原子的那些基团。更优选的杂环基具有3-5个碳原子和最多2个杂原子。最优选的杂环基包括哌啶基、吡咯烷基、氮杂环丁烷基和吖丙啶基。
术语“取代的”指用单价或二价基团替代一个或多个氢原子。合适的取代基团包括，例如羟基、硝基、氨基、亚氨基、氰基、卤代、硫代、硫代酰胺基、脒基、imidino、氧代、oxamidino、methoxamidino、imidino、胍基、亚磺酰氨基、羧基、甲酰基、烷基、杂环基、芳基、卤代烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、烷硫基、氨基烷基、烷基氨基、氰基烷基等。例如，优选的“取代的C1-6烷基”是叔丁醇。另一优选的取代的C1-6烷基是-CH2C(CH3)2NH-SO2CH3。
取代基自身可以被取代一次。例如，烷基的烷氧基取代基可以被卤素、氧基团、芳基等取代。取代基上的取代基团可以是羧基、卤代、硝基、氧代、氨基、氰基、羟基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C6-10芳基、氨基羰基、-SR、硫代酰胺基、-SO3H、-SO2R或环烷基，其中R通常是氢、羟基或C1-6烷基。
当被取代的取代基包含直链基团时，取代可以发生在链内(例如，2-羟丙基、2-氨基丁基等)或链末端(例如，2-羟乙基、3-氰基丙基等)。被取代的取代基可以是共价结合的碳原子或杂原子的直链、支链或环状排列。
有关羟基、胺基和巯基的术语“被保护的”或“保护基团”指这些官能团受到本领域技术人员已知的保护基团保护以免发生不良反应的形式，所述保护基团例如《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)，Greene，T.W.，John Wiley & Sons，纽约，NY，(第一版，1981)中所述，这些保护基团可以采用其中所述的方法添加或除去。受保护的羟基的例子包括但不限于：甲硅烷基醚，例如使羟基与例如(但不限于)以下试剂反应得到的：叔丁基二甲基氯硅烷、三甲基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、三乙基氯硅烷；取代的甲基醚和乙基醚，例如但不限于甲氧基甲基醚、甲硫基甲基醚、苄氧基甲基醚、叔丁氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、四氢吡喃基醚、1-乙氧基乙基醚、烯丙基醚、苄基醚；酯，例如但不限于苯甲酰基甲酸酯、甲酸酯、乙酸酯、三氯乙酸酯和三氟乙酸酯。受保护的胺基的例子包括但不限于：苄基或二苄基，酰胺，例如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺和苯甲酰胺；二酰亚胺，例如苯邻二甲酰亚胺和二硫代琥珀酰亚胺；等等。在一些实施方案中，胺基的保护基团是苄基。受保护的巯基的例子包括但不限于：硫醚，例如S-苄基硫醚和S-4-吡啶甲基硫醚；取代的S-甲基衍生物，例如半硫代(hemithio)、二硫代和氨基硫代缩醛；等等。
式I所示咪唑并喹啉化合物可显示互变异构现象，本说明书中的结构式只代表可能的互变异构体之一。应知道本发明包括具有免疫调节活性的任何互变异构体形式，而不仅限于结构式所用的任何一种互变异构体形式。
式I所示的咪唑并喹啉也可以存在溶剂化以及未溶剂化的形式，例如水合形式。本发明包括具有免疫调节活性的溶剂化与未溶剂化的形式。
本发明也包括同位素标记的咪唑并喹啉化合物，这些化合物结构上与上述化合物相同，除了一个或多个原子被与通常天然发现的原子质量或质量数不同的原子取代。可掺入本发明化合物的同位素例子分别包括：氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本发明化合物、其互变异构体、其药物前体与这些化合物和药物前体的药学上可接受的盐属于本发明范围。某些同位素标记的本发明化合物，例如掺入放射性同位素，如3H和14C的那些化合物，可用于药物和/或底物组织分布试验。为易于制备和检测起见，特别优选氚化，即3H和碳-14，即14C同位素。此外，用较重的同位素，例如氘，即2H取代可因较高的代谢稳定性而获得某些治疗益处，例如体内半衰期增加或所需剂量降低，因而在一些情况中是优选的。通常可通过进行已知或引用的方法并用可购得的同位素标记试剂取代未同位素标记的试剂来制备同位素标记的本发明化合物及其药物前体。
参考以下实施例可更好地理解上述内容，给出这些实施例只是为说明而不是限制本发明概念的范围。本领域技术人员采用本文以及本文所列的专利或专利申请所述的方法不难合成示例性化合物及其类似物，所述专利或专利申请出于所有目的如同全文列出一样全文纳入本文作为参考。
实施例
方案1
Figure G200580036853XD00641
反应方案1说明了用于本发明化合物的多用途中间体的制备方法。纳入本文作为参考的美国专利号5,48,293进一步描述了该方案。式1所示未取代的化合物是已知的可购得的化合物，式1所示的其它化合物，包括如本文所述在R3有取代的那些化合物可采用本领域技术人员已知的方法与例如Chem.Ber.，1927，60，1108(Kohler)和J.Heterocyclic Chem.，1988，25，857(Kappe)所述的方法制备。
在步骤(i)中，通过使2，4-二羟基-3-硝基喹啉与磺酰卤或优选磺酸酐反应来合成3-硝基喹啉-2，4-二磺酸酯。合适的磺酰卤包括烷基磺酰卤，例如烷基磺酰氯，如甲磺酰氯和三氟甲磺酰氯与芳基磺酰氯，如苯磺酰氯、对-溴苯磺酰氯和对-甲苯磺酰氯。合适的磺酸酐包括对应于上述磺酰卤的那些化合物。特别优选的磺酸酐是三氟甲磺酸酐。
反应条件优选包括首先优选在合适溶剂，例如二氯甲烷中混合化合物1与碱，优选过量的叔胺碱(例如，三烷基胺碱，如三乙胺)，然后加入磺酰卤或磺酸酐。优选以受控方式(例如，滴加)和在降低的温度下(例如，约0℃)加入。
然后优选在过量叔胺碱存在下，在例如二氯甲烷的溶剂中使二磺酸酯与叔丁胺反应得到化合物2。可向步骤(i)的第一部分得到的反应混合物中加入叔胺碱、冷却至降低的温度(例如，0℃)并以受控方式(例如，滴加)加入叔丁胺进行该反应。也可向在溶剂(例如二氯甲烷)中的二磺酸酯和叔胺碱中加入叔丁胺来进行该反应。反应可以在较低的温度，例如约0℃进行以降低不利的2-胺化和2，4-二胺化的副产物的含量。有时，需要或希望在加入后加热反应混合物以完成反应。
在步骤(ii)中，化合物2与二苄基胺反应。可通过将起始物质与二苄基胺置于惰性溶剂，例如苯、甲苯或二甲苯中，在某温度下加热足够时间以用二苄基胺取代磺酸酯基团来进行反应，本领域技术人员不难选择这种温度和时间。然后在极性溶剂，例如甲醇中在有酸(例如盐酸)存在下加热以除去叔丁基。
然后将硝基还原为氨基。本领域技术人员熟知这些还原方法。优选的方法包括在甲醇中由硼氢化钠和NiCl2原位产生Ni2B以得到还原剂溶液。向还原剂溶液中加入硝基化合物以还原硝基。产物是化合物3。随后以向甲醇鼓泡的形式加入HCl，或溶解于HCl水溶液中再冻干得到以下许多方案所述的有用的HCl中间体。
方案2
Figure G200580036853XD00651
步骤I
总收率：84％
  物质   来源   分子量   质量   摩尔 定量
  1   447.01   2.235g   5mmol   1.0当量
  N，N-二异丙基乙胺(DIEA)   IL   129.24   0.96mL   5.5mmol   1.1当量
  甲醇   LAB-SCAN   40mL
  异硫氰酸丙酯   Acros   101.17   0.52mL   5mmol   1.0当量
  盐酸1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)   Acros   191.7   1.438g   7.5mmol   1.5当量
  THF   LAB-SCAN   50mL
利用2-甲基-1-丙胺取代方案1中步骤(i)的叔丁胺，如方案1所述合成化合物1。将化合物1(2.235g，5mmol，1.0当量)溶解于干燥的甲醇(40mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺(0.96mL，5.5mmol，1.1当量)。溶液搅拌0.5小时，加入异硫氰酸丙酯(0.52mL，5mmol，1.0当量)。回流16小时后，浓缩溶液，残留物溶解于THF(50mL)并加入盐酸1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)(1.438g，7.5mmol，1.5当量)。反应溶液在室温搅拌两天。浓缩混合物，残留物在乙酸乙酯和水之间分配。用饱和的氯化钠溶液洗涤有机层，然后干燥并浓缩。粗制残留物经硅胶柱层析。用10∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到黄色油状产物(2.0g，84％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.87(t，J＝7.2Hz，3H)，1.04(d，J＝6.6Hz，6H)，1.57(m，2H)，2.38(m，1H)，3.32(m，2H)，3.86(t，J＝5.4Hz，1H)，3.96(d，J＝7.5Hz，2H)，5.38(s，4H)，7.17-7.81(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)12.2，20.8，23.6，29.9，46.3，51.1，52.4，115.6，119.1，121.8，126.1，126.6，127.2，128.5，128.9，129.0，133.8，141.0，144.6，150.9，152.2；HRMS(EI)实测值477.2888(M+)，计算值477.2889(M+)(C31H35N5)。
步骤II
Figure G200580036853XD00661
向2(1.887g，3.95mmol，1.0当量)的THF(30mL)溶液中加入60％氢化钠(0.316g，7.9mmol，2.0当量)，然后加入碘乙烷(0.48mL，5.93mmol，1.5当量)。混合物在油浴中回流2小时。然后浓缩混合物，残留物在乙酸乙酯和水中分配。用盐水洗涤有机层，干燥。浓缩得到油状残留物，然后经硅胶柱层析。用10∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到黄色固体状产物(1.83g，92％)。
熔点115.4-116.0℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.798(t，J＝7.2Hz，3H)，0.80(d，J＝6.6Hz，6H)，1.01(t，J＝7.2Hz，3H)，1.45(m，2H)，2.30(m，1H)，3.00(t，J＝7.5Hz，2H)，3.10(q，J＝7.2Hz，2H)，4.16(d，J＝7.2Hz，2H)，5.38(s，4H)，7.17-7.81(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)11.7，12.4，19.7，20.5，28.3，47.5，50.4，52.7，54.5，115.3，119.5，121.0，126.0，126.5，127.6，128.1，128.2，133.7，140.1，144.3，150.5，155.5；HRMS(EI)实测值505.3198(M+)，计算值505.3200(M+)(C33H39N5)。
步骤III
Figure G200580036853XD00671
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  3   制备的   505.3   152mg   0.3mmol   1.0当量
  溴化氢(47％水溶液)   Merck   10mL
  乙酸   Fisher   10mL
使3(152mg，0.3mmol，1.0当量)的溴化氢(10mL，47％水溶液)和乙酸(10mL)溶液回流过夜。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液和饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。粗制产物用5％的甲醇的CH2Cl2溶液层析纯化得到66％的(4)。
熔点139.2-142.8℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.82(d，J＝6.6Hz，6H)，0.92(t，J＝7.2Hz，3H)，1.15(t，J＝7.2Hz，3H)，1.60(m，2H)，2.29(m，1H)，3.14(t，J＝7.5Hz，2H)，3.24(q，J＝7.2Hz，2H)，4.16(d，J＝7.2Hz，2H)，5.67(s，2H)，7.27-7.84(m，4H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)12.4，13.4，20.4，21.4，29.2，48.1，53.5，55.1，116.4，120.6，122.6，126.2，127.0，127.6，133.0，144.7，151.6，158.1；HRMS(EI)实测值325.2262(M+)，计算值325.2261(M+)(C19H27N5)。
方案3
Figure G200580036853XD00672
总收率：68％
Figure G200580036853XD00681
步骤I
Figure G200580036853XD00682
总收率：68％
 物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
 1   447.01   536.4mg   1.2mmol   1.0当量
 N，N-二异丙基乙胺(DIEA)   IL   129.25   0.23mL   13.2mmol   1.1当量
 甲醇   LAB-SCAN   20mL
 异硫氰酸正丁酯   Acros   115.2   0.15mL   1.2mmol   1.0当量
 EDC   Acros   191.7   460mg   2.4mmol   2.0当量
 THF   LAB-SCAN   30mL
将化合物1(536.4mg，1.2mmol，1.0当量)溶解于干燥甲醇(20mL)，加入N，N-二异丙基乙胺(0.23mL，13.2mmol，1.1当量)。溶液搅拌0.5小时，然后加入异硫氰酸正丁酯(0.15mL，1.2mmol，1.0当量)。回流过夜后，浓缩溶液，溶解于THF(30mL)，再加入盐酸1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)(460mg，2.4mmol，2.0当量)。反应溶液回流过夜。浓缩混合物，残留物在乙酸乙酯和水中分配。用饱和的氯化钠溶液洗涤有机层，然后干燥并浓缩。粗制残留物经硅胶柱层析。用10∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到黄色油状产物(0.4g，68％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.86(t，J＝7.2Hz，3H)，1.05(d，J＝6.6Hz，6H)，1.30(m，2H)，1.54(m，2H)，2.28(m，1H)，3.36(m，2H)，3.84(t，J＝5.4Hz，1H)，3.98(d，J＝7.5Hz，2H)，5.39(s，4H)，7.20-7.81(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)14.5，20.8，29.9，32.6，44.3，51.2，52.3，115.5，119.2，121.9，126.2，126.6，127.2，128.2，128.9，129.0，133.8，140.8，150.7，152.3；HRMS(EI)实测值491.3028(M+)，计算值491.3043(M+)(C32H37N5)。
步骤II
Figure G200580036853XD00691
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  5   制备的   491.3   208mg   0.42mmol   1.0当量
  60％氢化钠   Panreac   24.0   50mg   1.26mmol   3.0当量
  碘甲烷   Arcos   141.94   0.039mL   0.63mmol   1.5当量
  THF   LAB-SCAN   30mL
向5(208mg，0.42mmol，1.0当量)的THF(30mL)溶液中加入60％氢化钠(50mg，1.26mmol，3.0当量)，然后加入碘甲烷(0.039mL，0.63mmol，1.5当量)。混合物在N2下回流过夜。然后浓缩混合物，残留物在乙酸乙酯和水中分配。用盐水洗涤有机层，硫酸钠干燥。浓缩得到油状残留物，然后经硅胶柱层析。用10∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到油状产物(165mg，77％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.80(d，J＝6.6Hz，6H)，0.84(t，J＝7.2Hz，3H)，1.25(m，2H)，1.47(m，2H)，2.29(m，1H)，3.01(s，3H)，3.03(t，J＝7.5Hz，2H)，4.17(d，J＝7.5Hz，2H)，5.38(s，4H)，7.20-7.85(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)14.7，20.4，21.1，29.1，30.1，41.7，51.1，53.6，56.1，116.1，120.2，121.9，126.9，127.3，128.4，128.9，129.1，134.6，140.9，145.1，151.3，157.6；HRMS(EI)实测值505.3187(M+)，计算值505.3200(M+)(C33H39N5)。
步骤III
Figure G200580036853XD00692
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  6   制备的   505.3   140mg   0.28mmol   1.0当量
  溴化氢(47％水溶液)   Merck   10mL
  乙酸   Fisher   10mL
使6(140mg，0.28mmol，1.0当量)的溴化氢(10mL，47％水溶液)和乙酸(10mL)溶液回流过夜。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液和饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。粗制产物用CH2Cl2配制的5％甲醇层析纯化得到87％的(7)。
熔点112.7-114.8℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.82(d，J＝6.6Hz，6H)，0.95(t，J＝7.5Hz，3H)，1.39(m，2H)，1.62(m，2H)，2.26(m，1H)，2.89(s，3H)，3.16(t，J＝7.8Hz，2H)，4.18(d，J＝7.5Hz，2H)，5.50(s，2H)，7.26-7.85(m，4H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)14.0，19.6，20.2，28.5，29.5，40.5，52.9，55.4，115.7，119.8，122.0，125.3，126.4，126.9，132.4，143.9，150.7，158.8；HRMS(ET)实测值325.2262(M+)，计算值325.2261(M+)(C19H27N5)。
步骤IV(产生未甲基化的类似物)
Figure G200580036853XD00701
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  5   制备的   491.3   100mg   0.20mmol   1.0当量
  溴化氢(47％水溶液)   Merck   10mL
  乙酸   Fisher   10mL
使5(100mg，0.20mmol，1.0当量)的溴化氢(10mL，47％水溶液)和乙酸(10mL)溶液回流过夜。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液与饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。粗制产物用CH2Cl2配制的10％甲醇层析纯化得到产率为95％的(8)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.99(t，J＝7.3Hz，3H)，1.03(d，J＝6.9Hz，6H)，1.46(m，2H)，1.71(m，2H)，2.27(m，1H)，3.50(m，2H)，3.99(d，J＝7.8Hz，2H)，4.47(t，1H)，6.70(s，2H)，7.25-7.68(m，4H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)13.8，19.8，20.1，29.0，31.6，43.4，51.6，113.6，119.2，122.9，123.1，124.0，126.7，132.3，137.9，148.7，154.2；HRMS(EI)实测值311.2106(M+)，计算值325.2104(M+)(C18H25N5)。
方案4
步骤I
Figure G200580036853XD00712
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  1   制备的   410.6   2.23mg   5.4mmol   1.0当量
  异硫氰酸甲酯   Aldrich   73.0   0.40g   5.4mmol   1.0当量
  甲醇   LAB-SCAN   60mL
将化合物1(2.23g，5.4mmol，1.0当量)溶解于干燥甲醇(60mL)，加入异硫氰酸甲酯(0.4g，5.4mmol，1.0当量)。回流过夜后，浓缩溶液，残留物经硅胶柱层析。用10∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到产物9(1.46g，56％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.88(d，J＝6.6Hz，6H)，1.60(m，1H)，2.97(d，J＝4.5Hz，3H)，3.24(m，2H)，4.73(s，5H)，5.54(q，1H)，6.92(t，1H)，7.17-7.78(m，14H)；HRMS(EI)实测值483.2455(M+)，计算值483.2451(M+)(C29H33N5S1)。
步骤II
Figure G200580036853XD00713
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  9   制备的   483.2   416mg   0.86mmol   1.0当量
  盐酸1-(3-二甲基氨   Acros   191.7   249mg   1.3mmol   1.5当量
  基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)
  THF   LAB-SCAN   30mL
将化合物9(416mg，0.86mmol，1.0当量)溶解于THF(30mL)中，加入盐酸1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)(249mg，1.3mmol，1.5当量)。反应溶液在室温搅拌两天。浓缩混合物，残留物在乙酸乙酯和水之间分配。用饱和的氯化钠溶液洗涤有机层，干燥并浓缩。粗制残留物经硅胶柱层析。用10∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到白色固体状产物(320mg，83％)。
熔点178.5-179.4℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)1.04(d，J＝6.6Hz，6H)，2.39(m，1H)，2.99(d，J＝4.8Hz，3H)，3.83(q，J＝5.1Hz，1H)，3.98(d，J＝7.5Hz，2H)，5.40(s，4H)，7.18-7.82(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)20.7，29.7，31.2，50.9，52.2，115.4，119.0，121.7，126.1，126.5，127.1，128.3，128.8，128.9，133.9，140.8，144.5，150.8，152.8；HRMS(EI)实测值449.2575(M+)，计算值449.2574(M+)(C29H31N5)。
步骤III
Figure G200580036853XD00721
11a甲基，b乙基，c正戊基，
d烯丙基，e甲氧基乙基
在11e的情况中，2-溴乙基甲基醚用作反应物
向10(135mg，0.3mmol，1.0当量)的THF(30mL)溶液中加入60％氢化钠(36mg，0.9mmol，3.0当量)，然后加入烷基碘(0.45mmol，1.5当量)。在室温下搅拌混合物(或在11e的情况中回流8小时)。浓缩混合物，残留物在乙酸乙酯和水中分配。用盐水洗涤有机层，硫酸钠干燥。浓缩得到油状残留物，然后经硅胶柱层析。浓缩合并的各部分得到油状产物。
11a
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.79(d，J＝6.6Hz，6H)，2.28(m，1H)，2.80(s，6H)，4.19(d，J＝7.5Hz，2H)，5.38(s，4H)，7.21-7.85(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)20.1，28.9，43.8，50.9，53.6，115.9，120.0，121.8，126.7，127.1，128.2，128.7，128.9，140.7，145.0；HRMS(EI)实测值463.2726(M+)，计算值463.2730(M+)(C30H33N5)。
11b
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.80(d，J＝6.6Hz，6H)，1.08(t，J＝7.2Hz，3H)，2.28(m，1H)，2.76(s，3H)，3.10(q，J＝7.2Hz，2H)，4.18(d，J＝7.5Hz，2H)，5.38(s，4H)，7.20-7.85(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)13.1，20.2，29.0，41.0，50.5，51.0，53.4，115.9，120.0，121.7，126.7，127.1，128.2，128.8，128.9，134.4，140.7，145.0，151.2，157.1；HRMS(EI)实测值477.2882(M+)，计算值477.2887(M+)(C31H35N5)。
11c
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.80(d，J＝6.6Hz，6H)，0.85(t，J＝7.2Hz，3H)，1.23(m，4H)，1.49(m，2H)，2.28(m，1H)，2.77(s，3H)，3.02(t，J＝7.5Hz，2H)，4.17(d，J＝7.5Hz，2H)，5.38(s，4H)，7.20-7.82(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)14.6，20.2，23.1，27.5，28.9，29.9，41.5，51.0，53.4，56.2，116.0，120.0，121.7，126.7，127.1，128.2，128.7，128.9，134.4，140.7，145.0，151.1，157.5；HRMS(EI)实测值519.3353(M+)，计算值519.3356(M+)(C34H41N5)。
11d
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.80(d，J＝6.6Hz，6H)，2.25(m，1H)，2.76(s，3H)，3.64(d，J＝6.0Hz，2H)，4.18(d，J＝7.2Hz，2H)，5.15(dd，J＝10.2，1.5Hz，1H)，5.25(dd，J＝17.1，1.5Hz，1H)，5.38(s，4H)，5.83(m，1H)，7.21-7.82(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)20.2，29.1，40.7，51.0，53.4，59.0，116.0，118.4，120.0，121.8，126.7，126.8，127.2，128.3，128.8，128.9，134.5，134.7，140.7，145.1，151.2，157.2；HRMS(EI)实测值489.2886(M+)，计算值489.2887(M+)(C32H35N5)。
11e
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.81(d，J＝6.6Hz，6H)，2.27(m，1H)，2.86(s，3H)，3.23(s，3H)，3.28(t，J＝5.4Hz，2H)，3.41(t，J＝5.4Hz，2H)，4.26(d，J＝7.2Hz，2H)，5.40(s，4H)，7.20-7.88(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)20.1，28.9，42.6，51.2，53.3，55.5，59.3，70.6，115.9，120.1，121.9，126.5，126.9，127.2，128.1，128.8，140.6，145.0，151.0，157.0；HRMS(EI)实测值507.3000(M+)，计算值507.2993(M+)(C32H37N5O1)。
步骤IV
Figure G200580036853XD00741
11a甲基，b乙基，c正戊基        12H，a甲基，b乙基，c正戊基
  编号   R   反应时间   产率
  12   H   过夜   66％
  12a   甲基   两天   80％
  12b   乙基   过夜   52％
  12c   正戊基   过夜   59％
将10或11(0.20mmol，1.0当量)的溴化氢(10mL，47％水溶液)和乙酸(10mL)的溶液回流过夜(或者在12a的情况中回流两天)。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液与饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。粗制产物用CH2Cl2配制的5％甲醇层析纯化。
12
188.6℃已分解；1H NMR(300MHz，CDCl3)1.01(d，J＝6.6Hz，6H)，2.28(m，1H)，3.13(d，J＝4.8Hz，3H)，3.97(d，J＝7.5Hz，2H)，4.51(q，J＝3.9Hz，1H)，6.70(s，2H)，7.25-7.86(m，4H)；HRMS(EI)实测值269.1637(M+)，计算值269.1635(M+)(C15H19N5)。
12a
154.6℃已分解；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.82(d，J＝6.6Hz，6H)，2.18(m，1H)，2.93(s，6H)，4.19(d，J＝7.5Hz，2H)，7.28-7.94(m，4H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)20.0，24.5，29.2，43.6，53.9，114.1，120.8，121.7，124.4，124.8，128.8，134.2，137.2，150.7，160.7；HRMS(EI)实测值283.1791(M+)，计算值283.1791(M+)(C16H21N5)。
12b
熔点183.6-186.8℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.83(d，J＝6.6Hz，6H)，1.22(t，J＝7.2Hz，3H)，2.26(m，1H)，2.89(s，3H)，3.22(q，J＝7.2Hz，2H)，4.18(d，J＝7.2Hz，2H)，5.62(s，2H)，7.29-7.85(m，4H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)13.3，20.2，29.2，40.6，50.6，53.6，116.1，120.5，122.9，127.0，127.3，133.2，143.8，151.1，159.1；HRMS(EI)实测值297.1945(M+)，计算值297.1948(M+)(C17H23N5)。
12c
熔点97.6-103.0℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.80(d，J＝6.6Hz，6H)，0.90(t，J＝6.9Hz，3H)，1.32(m，4H)，1.61(m，2H)，2.24(m，1H)，2.87(s，3H)，3.13(t，J＝7.5Hz，2H)，4.16(d，J＝7.2Hz，2H)，5.64(s，2H)，7.25-7.83(m，4H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)14.6，20.2，23.1，27.6，29.1，29.8，41.0，53.5，56.3，116.1，120.5，122.8，125.8，127.0，127.2，133.1，143.9，151.1，159.5；HRMS(EI)实测值339.2417(M+)，计算值339.2417(M+)(C20H29N5)。
步骤V
Figure G200580036853XD00751
将11d(108mg，0.22mmol，1.0当量)的溴化氢(10mL，47％水溶液)溶液回流0.5小时。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液与饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。采用层析(依次用二氯甲烷配制的2.5％、5％和20％甲醇)纯化分别得到产物13(5％)、12d(44％)和12(17％)。
13
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.82(d，J＝6.6Hz，6H)，2.62(m，1H)，2.84(s，3H)，3.71(d，J＝6.0Hz，2H)，4.15(d，J＝7.5Hz，2H)，4.95(d，J＝5.7Hz，2H)，5.25(dd，J＝10.2，1.2Hz，1H)，5.38(dd，J＝17.1，1.5Hz，1H)，5.94(m，1H)，6.99-7.87(m，9H)；HRMS(EI)实测值399.2419(M+)，计算值399.2417(M+)(C25H29N5)。
12d
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.83(d，J＝6.6Hz，6H)，2.24(m，1H)，2.89(s，3H)，3.76(d，J＝6.0Hz，2H)，4.18(d，J＝7.5Hz，2H)，5.28(dd，J＝10.2，1.5Hz，1H)，5.38(dd，J＝17.1，1.5Hz，1H)，5.95(m，1H)，7.30-7.85(m，4H)；HRMS(EI)实测值309.1946(M+)，计算值309.1948(M+)(C18H23N5)。
步骤VI
将11e(508mg，1mmol，1.0当量)的溴化氢(15mL，47％水溶液)和乙酸(15mL)的溶液回流10小时。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液与饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。采用层析(依次用CH2Cl2配制的4％和8％甲醇)纯化粗产物分别得到产物12f(8％)和14(12％)。
12f
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.83(d，J＝6.3Hz，6H)，2.22(m，1H)，3.01(s，3H)，3.47(t，J＝4.8Hz，2H)，3.94(t，J＝4.8Hz，2H)，4.24(d，J＝7.5Hz，2H)，6.54(s，2H)，7.27-7.85(m，4H)；HRMS(EI)实测值313.1893(M+)，计算值313.1897(M+)(C17H23N5O1)。
14
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.83(d，J＝6.6Hz，6H)，2.02(s，3H)，2.29(m，1H)，2.96(s，3H)，3.59(t，J＝5.7Hz，2H)，4.22(d，J＝7.5Hz，2H)，4.33(t，J＝5.7Hz，2H)，5.43(s，2H)，7.31-7.85(m，4H)；HRMS(EI)实测值355.2006(M+)，计算值355.2003(M+)(C19H25N5O2)。
方案5
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  1   制备的   410.6   205mg   0.5mmol   1.0当量
  CS<sub>2</sub>   Merck   76.1   0.03mL   0.5mmol   1.0当量
  CH<sub>3</sub>OH   LAB-SCAN   20mL
  溴化氢(47％水溶液)   Merck   10mL
  乙酸   Fisher   10mL
步骤I
将化合物1(205mg，0.5mmol，1.0当量)溶解于干燥甲醇(20mL)，然后加入二硫化碳(0.03mL，0.5mmol，1.0当量)。回流过夜后，浓缩溶液，用乙酸(10mL)和溴化氢(10mL，47％水溶液)溶解残留物。然后使反应溶液回流过夜。用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液与饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。通过层析依次用二氯甲烷配制的2.5％和5％甲醇纯化粗产物分别得到产物16(37％)和17(43％)。
16
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.93(d，J＝6.6Hz，6H)，2.27(m，1H)，4.12(d，J＝7.5Hz，2H)，4.48(s，2H)，4.97(d，J＝5.7Hz，2H)，6.07(t，J＝5.4Hz，1H)，7.23-7.82(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)20.4，29.8，39.2，45.4，53.8，115.7，120.3，122.4，127.5，127.8，128.3，128.4，128.8，129.0，129.2，129.3，129.6，134.4，137.4，140.4，145.8，149.5，150.5；MS(EI)452(M+)。
17
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.94(d，J＝6.9Hz，6H)，2.30(m，1H)，4.14(d，J＝7.8Hz，2H)，4.54(s，2H)，5.69(s，2H)，7.26-7.85(m，9H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)20.4，29.7，39.0，53.8，115.7，120.4，122.9，127.6，127.7，128.3，128.6，129.3，129.6，135.1，137.3，145.0，150.2，151.2；MS(EI)362(M+)。
步骤II
或者，将化合物1(205mg，0.5mmol，1.0当量)溶解于干燥甲醇(20mL)，然后加入二硫化碳(0.03mL，0.5mmol，1.0当量)。回流过夜后，浓缩溶液，然后用CH2Cl2溶解。用盐水、饱和的NaHCO3洗涤混合物，硫酸钠干燥。向15(16)(226.3mg，0.5mmol，1.0当量)的THF(20mL)溶液中加入60％氢化钠(100mg，2.5mmol，5.0当量)，然后加入碘丙烷(0.098mL，1.0mmol，2.0当量)。在N2中于室温搅拌混合物3小时。浓缩溶液，残留物在乙酸乙酯和水中分配。用盐水洗涤有机层，干燥。浓缩得到油状残留物，然后经硅胶柱层析。用20∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到固体状产物(224mg，88％)。
19
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.89(t，J＝7.2Hz，3H)，1.10(d，J＝6.6Hz，6H)，1.67(m，2H)，2.50(m，1H)，3.13(t，J＝7.2Hz，2H)，4.30(d，J＝7.5Hz，2H)，5.51(s，4H)，7.28-7.97(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)13.9，20.6，23.6，29.8，35.8，51.3，53.9，115.4，120.0，122.0，127.3，127.4，128.5，128.7，128.9，129.3，136.8，140.6，145.3，149.4，150.8；HRMS(EI)实测值494.2501(M+)，计算值(M+)494.2499(C31H34N4S1)。
步骤III
Figure G200580036853XD00781
将19(1.0当量)的溴化氢(10mL，47％水溶液)和乙酸(10mL)的溶液回流8小时。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液与饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。通过层析依次用二氯甲烷配制的5％甲醇纯化粗产物分别得到产物20和21的混合物，1H-NMR显示摩尔比是2.0∶2.8。
20
1H NMR(300MHz，CDCl3)1.00(d，J＝6.6Hz，6H)，1.05(t，J＝7.5Hz，3H)，1.80(m，2H)，2.27(m，1H)，3.32(t，J＝7.5Hz，2H)，4.25(d，J＝7.5Hz，2H)，5.65(s，2H)，7.24-7.84(m，4H)；HRMS(EI)实测值314.1556(M+)，计算值314.1560(M+)(C17H22N4S1)。
21
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.93(d，J＝6.6Hz，6H)，2.28(m，1H)，4.13(d，J＝7.8Hz，2H)，4.53(s，2H)，5.71(s，2H)，7.24-7.84(m，9H)
方案6
Figure G200580036853XD00791
步骤I
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  1   制备的   447.01   134mg   0.3mmol   1.0当量
  氯甲酸乙酯   Merck   108.5   0.14mL   1.5mmol   5.0当量
  THF   LAB-SCAN   20mL
向1(134mg，0.3mmol，1.0当量)的THF(20mL)溶液中加氯甲酸乙酯(0.15mL，1.4mmol，5.0当量)。混合物在N2中回流10小时。浓缩溶液，残留物在二氯甲烷和水中分配。干燥并浓缩有机层。粗制残留物经硅胶柱层析。用8∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到固体状产物18(0.126g，86.9％)。
18
熔点99.7-101.2℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)0.91(d，J＝6.6Hz，6H)，1.15(t，J＝7.2Hz，3H)，1.74(m，1H)，3.24(m，2H)，4.10(q，J＝7.2Hz，2H)，4.41(s，4H)，4.71(s，1H)，6.47(1H)，7.20-7.94(m，14H)；HRMS(EI)实测值482.2679(M+)，计算值482.2676(M+)(C30H34N4O2)。
步骤II
Figure G200580036853XD00801
向18(483mg，1.0mmol，1.0当量)的干燥甲醇(50mL)溶液中加入NaOMe(108mg，2.0mmol，2.0当量)。混合物在N2中回流2天。浓缩溶液，残留物在二氯甲烷和水中分配。干燥并浓缩有机层。将残留物以干法上样于硅胶(1g)，经硅胶柱层析。用5∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到白色固体状产物(396mg，91％)。
19
熔点210.1-211.9℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)1.01(d，J＝6.6Hz，6H)，2.28(m，1H)，4.05(d，J＝7.5Hz，2H)，4.86(s，4H)，7.25-7.86(m，14H)，7.89(s，1H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)19.8，28.8，49.5，51.6，111.3，113.6，119.8，123.0，126.8，127.1，128.0，128.4，130.8，138.2，143.9，146.5，155.3；HRMS(EI)实测值436.2258(M+)，计算值436.2258(M+)(C28H28N4O1)。
步骤III
Figure G200580036853XD00802
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  19   制备的   436.2   87.3mg   0.2mmol   1.0当量
  溴化氢(47％水溶液)   Merck   10mL
  乙酸   Fisher   10mL
将19(87.3mg，0.2mmol，1.0当量)的溴化氢(10mL，47％水溶液)和乙酸(10mL)的溶液回流2小时。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液与饱和的NaHC03溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。通过层析用二氯甲烷配制的10％甲醇纯化粗产物。产率：81％。
20
1H NMR(300MHz，MeOD)1.00(d，J＝6.6Hz，6H)，2.22(m，1H)，4.11(d，J＝7.5Hz，2H)，7.31-7.98(m，4H)；MS(EI)256。
步骤IV
Figure G200580036853XD00811
Figure G200580036853XD00812
向19(1.757g，4.0mmol，1.0当量)的干燥二氯甲烷(50mL)溶液中依次加入三乙胺(0.67mL，4.8mmol，1.2当量)和三氟甲磺酸酐(0.81mL，4.8mmol，1.2当量)。混合物在N2中搅拌2天。溶液在CH2Cl2和水中分配。干燥并浓缩有机层。残留物经硅胶柱层析。用己烷配制的5％乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到白色固体状产物(1.36g，60％)。
21
熔点108.2-109.6℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)1.06(d，J＝6.6Hz，6H)，2.40(m，1H)，4.25(d，J＝7.5Hz，2H)，5.29(s，4H)，7.21-7.84(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)20.4，29.5，51.2，53.3，114.5，119.9，122.7，123.9，127.5，128.6，128.7，128.8，129.0，134.5，139.9，143.4，146.1，150.9；19F NMR(400MHz，CDCl3)-13.42；HRMS(EI)实测值568.1756(M+)，计算值568.1750(M+)(C29H27F3N4O3S1)；C29H27F3N4O3S1的分析计算值为：C，61.26；H，4.79；N，9.85；实测值：C，61.36；H，4.78；N，9.85。
本领域技术人员应该知道化合物21是极其有用的中间体，用许多取代基取代三氟甲磺酸酯不难使其官能化，所述取代基包括取代的胺、巯基(thiol)、羰基、氧代和烷氧基与烯基和炔基部分等。
方案7
步骤I
Figure G200580036853XD00822
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  1   制备的   470.3   470mg   1mmol   1.0当量
  1-氨基-2-甲基-丙醇   制备的<sup>1</sup>   89.1   89mL   1mmo   1.0当量
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  TEA   Aldrich   101.2   0.14mL   1mmol   1.0当量
  CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>   LAB-SCAN   30mL
参见Close，W.J.，Abbott Labs.，North Chicago，J.Amer.Chem.Soc，1951，73，95-8。
向1(470mg，1mmol，1.0当量)的干燥CH2Cl2(30mL)溶液中加入三乙胺(0.14mL，1mmol，1.0当量)，然后加入1-氨基-2-甲基-2-丙醇(89mg，1mmol，1.0当量)。混合物在N2保护(blanket)下回流1小时。反应溶液在二氯甲烷和水中分配。干燥并浓缩有机层得到油状残留物，其经硅胶柱层析。用5∶4(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩黄色部分得到固体状产物(132mg，32％)。
熔点139.6-139.8℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)1.34(s，6H)，3.50(d，J＝5.1Hz，2H)，7.57-8.08(m，4H)，7.89(s，1H)；HRMS(EI)实测值409.0553(M+)，计算值409.0550(M+)(C14H14F3N3O6S1)。
步骤II
Figure G200580036853XD00831
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  2   制备的   409.3   8.066g   0.020mmol   1.0当量
  二苄基胺   Aldrich   197.2   5.8mL   0.03mmol   1.5当量
  甲苯   LAB-SCAN   250mL
向2(8.066g，0.020mol，1.0当量)的干燥甲苯(250mL)溶液中加入二苄基胺(5.8mL，0.03mol，1.5当量)。混合物在N2下回流1小时。浓缩混合物，残留物经硅胶柱层析。用5∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩红色部分得到固体状产物(7.4g，82％)。
3
1H NMR(300MHz，CDCl3)1.24(s，6H)，3.63(d，J＝5.1Hz，2H)，4.53(s，4H)，7.17-7.97(m，15H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)28.0，53.2，60.0，71.2，116.9，122.2，126.7，127.7，128.4，128.8，129.0，129.1，132.6，128.1，149.3，151.2，153.3；HRMS(EI)实测值456.2156(M+)，计算值456.2156(M+)(C27H28N4O3)。
步骤III
Figure G200580036853XD00832
 物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
 NiCl<sub>2</sub>6H<sub>2</sub>O   Merck   237.7   89.2mg   0.375mmol   0.75当量
 NaBH<sub>4</sub>   Aldrich   37.8   28.4mg+75.6mg   0.75mmol+2.0mmol   1.5当量+4.0当量
 3   制备的   456.5   228mg   0.5mmol   1.0当量
 DCM   LAB-SCAN   10mL
 甲醇   LAB-SCAN   20mL
向配有防护管的100mL三颈烧瓶中加入甲醇(10mL)和氯化镍(89.2mg，0.375mmol，0.75当量)。随后分几小批加入NaBH4(28.4mg，0.75mmol，1.5当量)，同时将温度维持在25℃。溶液搅拌30分钟，然后加入DCM(10mL)和甲醇(10mL)配制的3(228mg，0.5mmol，1.0当量)。分几小批加入NaBH4(75.6mg，2.0mmol，4.0当量)，同时将温度维持在35℃。观察到含有黑色沉淀物的无色溶液。经Celite牌助滤剂(filter aid)过滤反应溶液，浓缩滤液，吸附至硅胶柱上并进行层析。用10∶3(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩各部分得到油状产物(146mg，69％)。
4
1H NMR(300MHz，CDCl3)1.23(s，6H)，3.05(s，2H)，4.14(s，2H)，4.41(s，4H)，7.10-7.71(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)28.1，54.0，57.5，71.9，119.7，122.9，124.7，126.0，127.2，127.5，128.9，129.1，135.2，139.6，142.3，153.9；HRMS(EI)实测值426.2421(M+)，计算值426.2414(M+)(C27H30N4O1)。
步骤IV
Figure G200580036853XD00841
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  4   制备的   426.5   146mg   0.34mmol   1.0当量
  异硫氰酸丙酯   Acros   101.17   0.042mL   0.41mmol   1.2当量
  甲醇   LAB-SCAN   15mL
将化合物4(146mg，0.34mmol，1.0当量)溶解于干燥甲醇(15mL)中，加入异硫氰酸丙酯(0.042mL，0.41mmol，1.2当量)。在N2下回流过夜后，浓缩溶液，残留物在CH2Cl2和水之间分配。干燥并浓缩有机层。粗制残留物经硅胶柱层析。用10∶3(v/v)己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到油状产物(131mg，73％)。
5
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.67(t，J＝7.5Hz，3H)，1.13(s，6H)，1.27(m，2H)，2.27(s，1H)，3.31(m，4H)，4.58(s，4H)，5.14(1H)，5.65(1H)，7.07-7.75(m，15H)；HRMS(EI)实测值527.2719(M+)，计算值527.2713(M+)(C31H37N5O1S1)
步骤V
Figure G200580036853XD00851
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  5   制备的   527.7   131mg   0.25mmol   1.0当量
  EDC   Acros   191.7   95mg   0.5mmol   1.2当量
  THF   LAB-SCAN   15mL
向5(131mg，0.25mmol，1.0当量)的干燥THF(15mL)溶液中加入EDC(95mg，0.5mmol，2.0当量)。反应溶液在N2下搅拌两天。然后浓缩混合物，残留物在CH2Cl2和水中分配。用饱和的氯化钠溶液洗涤有机层，干燥并浓缩。粗制残留物经硅胶柱层析。用5∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并非各部分得到油状产物(115mg，84％)。
6
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.79(t，J＝7.5Hz，3H)，1.31(s，6H)，1.51(m，2H)，1.93(1H)，3.16(m，2H)，4.25(s，2H)，5.31(s，4H)，5.83(1H)，7.04-7.74(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)11.5，22.7，27.7，45.1，50.3，54.3，73.8，114.7，117.8，120.7，125.2，126.1，126.4，127.9，128.1，128.2，133.5，140.2，143.8，150.1，153.7；HRMS(EI)实测值493.2832(M+)，计算值493.2836(M+)(C31H35N5O1)
步骤VI
Figure G200580036853XD00852
将6(115mg，0.23mmol，1.0当量)的溴化氢(10mL，47％水溶液)和乙酸(10mL)的溶液回流1小时。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液与饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。TLC显示有4种产物。通过层析分别用CH2Cl2配制的2.5％、10％的甲醇纯化得到产物7和8。
7
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.90(t，J＝7.5Hz，3H)，1.34(s，6H)，1.58(m，2H)，3.28(m，2H)，4.25(s，2H)，4.88(d，J＝5.7Hz，2H)，5.91(1H)，5.99(1H)，7.11-7.82(m，9H)；HRMS(EI)实测值403.2355(M+)，计算值403.2367(M+)(C24H29N5O1)
8
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.94(t，J＝7.5Hz，3H)，1.40(s，6H)，1.65(m，2H)，3.35(m，2H)，4.31(s，2H)，5.42(s，2H)，6.09(t，1H)，7.14-7.78(m，4H)；HRMS(EI)实测值313.1889(M+)，计算值313.1897(M+)(C17H23N5O1)
步骤VII
Figure G200580036853XD00861
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  6   制备的   493.6   2.014g   4.1mmol   1.0当量
  60％氢化钠   Panreac   24.0   163mg   4.1mmol   1.0当量
  碘甲烷   Arcos   141.94   0.25mL   4.1mmol   1.0当量
  THF   LAB-SCAN   40mL
向6(2.014g，4.1mmol，1.0当量)的THF(40mL)溶液中加入60％氢化钠(163mg，4.1mmol，1.0当量)，然后加入碘甲烷(0.25mL，4.1mmol，1.0当量)。在N2中搅拌混合物5小时。浓缩反应溶液，残留物在乙酸乙酯和水中分配。用盐水洗涤有机层，干燥。浓缩得到油状残留物，然后经硅胶柱层析。用15∶1(v/v)的己烷和乙酸乙酯混合液洗脱柱。浓缩合并的各部分得到固体状产物10(41％)和油状产物9(36％)。
9
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.85(t，J＝7.2Hz，3H)，1.20(s，6H)，1.53(m，2H)，2.78(s，3H)，2.98(t，J＝7.8Hz，2H)，4.59(s，1H)，4.66(s，2H)，5.38(s，4H)，7.22-8.04(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)12.2，20.8，28.2，41.5，51.2，56.3，58.6，73.1，115.6，119.7，121.8，126.0，127.2，128.6，128.7，128.8，135.0，140.5，145.6，151.1，156.0；HRMS(EI)实测值507.2988(M+)，计算值507.2993(M+)(C32H37N5O1)
10
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.92(t，J＝7.5Hz，3H)，1.37(s，6H)，1.63(m，2H)，3.26(s，3H)，3.30(m，2H)，4.40(s，2H)，5.41(s，4H)，6.08(t，J＝5.4Hz，1H)，7.18-7.86(m，14H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)11.5，21.3，22.7，44.9，49.1，50.3，55.2，77.9，114.8，117.7，120.7，125.1，126.2，126.4，128.1，128.3，133.5，140.3，143.8，150.1，153.9；HRMS(EI)实测值507.2990(M+)，计算值507.2993(M+)(C32H37N5O1)
步骤VIII
Figure G200580036853XD00871
  物质   来源   分子量   质量   摩尔   定量
  34   制备的   507.7   203mg   0.4mmol   1.0当量
  溴化氢(47％水溶液)   Merck   10mL
  乙酸   Fisher   10mL
将9(203mg，0.4mmol，1.0当量)的溴化氢(10mL，47％水溶液)和乙酸(10mL)的溶液回流2.5小时。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应溶液，用1M NaOH溶液与饱和的NaHCO3溶液调节至pH 7。分离、干燥并浓缩有机层。通过层析用二氯甲烷配制的4％甲醇纯化得到产物(11)。
11
1H NMR(300MHz，CDCl3)0.96(t，J＝7.5Hz，3H)，1.20(s，6H)，1.67(m，2H)，2.87(s，3H)，3.07(t，J＝7.8Hz，2H)，4.09(s，1H)，4.58(s，2H)，5.92(s，2H)，7.25-8.10(m，4H)；HRMS(EI)实测值327.2054(M+)，计算值327.2054(M+)(C18H25N5O1)
步骤VIIa(其它方法)
Figure G200580036853XD00881
将6(1当量)和低聚甲醛(5当量)的混合物溶解于用分子筛干燥过的(onmolecular sieve)MeOH和AcOH(5∶1)的溶液中。在25℃向悬浮液中加入NaCNBH3(4当量)。然后将浆液加热至80℃。10小时后，混合物冷却，过滤并浓缩。将残留物溶解于CH2Cl2，用饱和的NaHCO3洗涤。干燥(Na2SO4)有机溶液，浓缩得到9。然后按照步骤VIII脱苄基化得到终产物(11)。
以下方案描述了优选的2-烯基或2-炔基咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的制备方法。本领域技术人员明白可更换或替换试剂和/或取代基以优化或进一步官能化下述化合物。
方案8
Figure G200580036853XD00882
其中R基团可以是H、烷基或芳基，优选苯基。
方案9
Figure G200580036853XD00883
其中R基团可以是H、烷基或芳基，优选苯基。
方案10
Figure G200580036853XD00884
方案11
Figure G200580036853XD00891
或者，可利用三氟甲酸替代H2SO4。
方案12
Figure G200580036853XD00892
方案13
Figure G200580036853XD00893
也考虑了将反应物中的三氟甲磺酸酯取代基转换为卤化物，例如溴，然后利用CuI、Ph3P和Pd(OAc)2在Et3N中与具有至少3个碳原子的烯基或炔基部分偶联可产生方案8-13所述的许多产物。
当方案8-13中任一反应不能完全进行时，可加热以促进反应完成。
然后在煮沸的MeCN中利用NaI和TMSCL使方案8-13的产物脱苄基化以在4位提供游离的胺基，从而在原位产生TMSI。在THF中利用Bu4N+F-除去得到的TMS官能团。或者，取决于在N-TMS-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物2位的烯基或炔基取代基的稳定性，可利用MeOH配制的K2CO3、柠檬酸、HF或聚苯乙烯磺酸来切去得到的TMS基团。或者，可按照前面所述在HBr和乙酸的存在下进行脱苄基化(如方案11所示)。
方案14
Figure G200580036853XD00894
通过加入缩酮并在THF中加热使1环化形成2的咪唑并喹啉类似物。一旦完成，浓缩反应(混合物)，用水洗涤并用CHCl3萃取。然后用硫酸钠干燥混合物，经硅胶层析纯化。然后如上所述(加热)用溴化氢和乙酸脱苄基化，也使缩酮水解为所需酮。硅胶层析得到产物(3)。
方案15
通过加入缩醛并在THF中加热使1环化形成2的咪唑并喹啉类似物。一旦完成，浓缩反应(混合物)，用水洗涤并用CHCl3萃取。用HCl水溶液水解缩醛，然后进行Swern氧化得到羧酸。最后，在有HCl和醇类，例如乙醇存在下进行酯化。然后如上所述用溴化氢脱苄基化得到终产物(4)。或者，可如以上方案8-13所述脱苄基化。
表1：咪唑并喹啉化合物
Figure G200580036853XD00902
Figure G200580036853XD00911
Figure G200580036853XD00921
Figure G200580036853XD00931
根据以上方案合成表1所列各个实施例化合物1-21。在下文所述试验中筛选许多实施例化合物诱导细胞因子的能力。许多这些化合物显示在低于5μM时具有产生TNF-α的活性。一些这些化合物显示在低于1.5μM时具有产生TNF-α的活性。此外，一些这些化合物显示能产生TLR-7和/或TLR-8的活性。为此原因，表1所列的任一化合物的各R基团是优选的。此外，由于这些化合物的优秀活性，其各自均是优选的，优选作为包括任一或所有其它化合物的成员之一，各化合物在调节免疫应答的方法中与和其相关的生物学病症的治疗方法中是优选的，例如用作疫苗的佐剂。各化合物也优选用于制备免疫增效、减缓肿瘤生长、治疗微生物和病毒感染(特别是HCV和HSV)以及治疗其所介导生物学病症的药物。
采用下文所述试验筛选了几种实施例化合物，发现在20μM或以下浓度时无效，大多数化合物是最终化合物的受保护中间体。在本发明范围内这些化合物也是有用的，因为本发明不限于在20μM或以下的浓度时有用的那些化合物。这些化合物可用作中间体或最终产物，在下文所述试验中以较高浓度，例如100μM、200μM或300μM诱导产生TNF-α。例如300μM的Loxoribine可用于产生TNF-α(参见Pope等，Cellular Immunology，162：333-339，(1995))。
生物学试验
可在体外鉴定候选的小分子免疫增效剂。可在体外筛选这些化合物激活免疫细胞的能力。这种激活的标志之一是产生细胞因子，例如产生TNF-α。可鉴定到凋亡诱导性小分子具有此活性。这些小分子免疫增效剂可能用作佐剂和免疫治疗剂。
在咪唑并喹啉小分子免疫增效剂(SMIP)的试验方法(高通量筛选(HTS)中，将人外周血单核细胞(PBMC)(500,000/mL用含10％FCS的RPMI 1640培养基配制)接种于(100,000/孔)已含有用DMSO配制的5μM化合物的96孔板中。37℃，5％CO2中培育PBMC 18小时。采用改进的夹心ELISA测定它们对小分子化合物反应中产生细胞因子的能力。
简言之，利用与板结合的第一捕获抗体然后用生物素化抗-TNF二抗形成夹心来检测PBMC培养上清液中分泌的TNF。然后用链霉亲和素-铕检测生物素化二抗，通过时间分辨荧光测定所结合铕的含量。与单独在RPMI培养基中培育的细胞相比，咪唑并喹啉化合物在该试验中检测到铕计数增多证实它们的TNF诱导活性。根据它们的TNF诱导活性与最佳剂量的强TNF诱导剂，脂多糖LPS(1μg/mL)相比选择“命中物”。试验稳定和背景(噪声)低使得可以常规选择具有约10％LPS活性的命中物，而该活性通常是背景(只有细胞)的5-10倍。然后证实所选择的命中物在递减浓度诱导多位供体细胞产生细胞因子的能力。在5μM或以下具有一致活性的那些化合物可认为证实了本试验的目的。不难改进该试验来筛选在更高或更低浓度时有效的化合物。
除了上述的方法，可采用本领域熟知检测其它细胞因子(例如，IL1-β、IL-12、IL-6、IFN-γ、IL-10等)的方法发现本发明的活性咪唑并喹啉化合物。
可采用本领域已知的方法定性和定量测定SMIP或含有本发明优选实施方案的SMIP的组合物的免疫应答，例如检测抗原特应性抗体的产生、特异性淋巴细胞(例如CD4+、CD8+T细胞或NK细胞)群的激活和/或细胞因子(例如IFN、IL-2、IL-4或IL-12)的产生。检测特异性抗体应答的方法包括本领域已知的酶联免疫吸附测定(ELISA)。可采用，例如荧光激活的细胞分选(FACS)检测特定类型的淋巴细胞(例如CD4+T细胞)数目。也可采用本领域已知的方法，例如Raz等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：9519-9523所述进行细胞毒性试验。可通过，例如ELISA检测细胞因子的血清浓度。例如，《细胞免疫学的选择方法》(Selected Methods in CellularImmunology)((1980)，Mishell和Shiigi编，W.H.Freeman and Co)描述了这种试验。
其它生物学方法
I.样品制备
人PBMC制备
将一位或多位人供体的人血液采集入含有柠檬酸钠的BD VacutainerTM CPT试管(BD，Franklin Lakes，新泽西)中，1600g离心20分钟。离心后，收集试管中上层的单核细胞，再用PBS缓冲液洗涤三次。然后用含10％FBS加100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素的完全RPMI重建洗涤的细胞至所需细胞浓度。
制备小鼠脾细胞
分离Balbc小鼠脾脏并切碎组织释放脾细胞。用铵盐处理切碎的样品以破坏红细胞后，洗涤其余脾细胞并用完全RPMI培养基重建至所需细胞浓度。
人THP-1细胞系
人骨髓单核(myelomonocytic)转化细胞系对TLR8激动剂起反应，对TLR7激动剂反应弱。细胞系用添加了10％FBS的RPMI培养基培养。
II活性检测
化合物刺激和多种细胞因子检测
用完全RPMI培养基培育混合人PBMC(hPBMC)(一百万个细胞/ml)或小鼠脾细胞(五百万个细胞/ml)或人单核THP-1细胞(一百万个细胞/ml)与滴定过浓度的化合物测试化合物，例如咪唑并喹啉。37℃，5％CO2培育细胞培养物24小时后，收集培养上清液，检测有这些化合物存在时分泌的细胞因子。按照生产商的使用说明书利用人或小鼠Beadlyte多细胞因子Flex试剂盒(Upstate，Lake Placid，新泽西)检测以下细胞因子的含量：TNF-a、IL-6、IL-1β、IL-8和IL-12p40。
图2A-C显示了骨髓单核细胞系、THP-1(图2A)，人PBMC(图2BB)和小鼠脾细胞(图2C)对递减剂量的实施例4、20、19、13、10、12和11化合物反应而产生细胞因子的能力。检测了各细胞群(产生)的多种细胞因子(例如IL-12、IFN-g、IL-1b、IL-10、TNF-a等)，显示了人IL-8(A)、人IL-6(B)和小鼠IL-6(C)的水平。
TLR信号转导
将3×106个HEK293细胞(ATCC，CRL-1573)接种于T75烧瓶中添加有0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素与10％FCS的20ml DMEM中。培养过夜后，利用Fugene 6转染试剂(Roche)和：1)pNFkB-TA-萤光素酶报导子(0.4ug)(BD clontech，Palo Alto，CA)和2)携带TK启动子，对NF-kB刺激不反应和携带Renilla萤光素酶基因用作内部对照(Promega，WI)的pGL4.74(0.01ug)，和3)分别用以下TLR构建物(10ug)：人TLR(hTLR)7、hTLR8、小鼠TLR7(mTLR7)puno构建物(Invivogene，CA)转染细胞。转染24小时后收集转染细胞，接种于96孔平底板(1×104个细胞/孔)，用以下浓度的测试化合物刺激：30、10、3、1、0.3、0.1、0.03uM。化合物刺激过夜后，利用双重萤光素酶报导试验系统(Promega，WI)检测这些细胞的苍蝇(fly)和renilla萤光素酶表达。NF-kb的激活与根据内部对照renilla萤光素酶单位检测的相对苍蝇萤光素酶单位直接成比例。
图1显示了采用20μM剂量的实施例19、4、20和11(化合物)的SMIPS的TLR7-依赖性(图1A)和TLR8-依赖性(图1B)结果。阴性对照是单独培养的TLR7或8转染的HEK293-NFkB-萤光素酶细胞，这些结果类似于利用非转染(TLR7或8)HEK293-NFkB-萤光素酶表达细胞获得的结果。
细胞因子产生的标准化
由于测试化合物的激动剂性质，根据它们在细胞因子诱导的细胞筛选中的效力进行化合物排序。简言之，与参比组合物(即，LPS)相比，计算各化合物对某给定细胞因子的EC50。然后将此数值用作试验中产生的细胞因子最高水平(pg/ml)的除数。图3显示了在各种细胞系中SMIP效力的排序。利用将细胞因子剂量应答曲线与所示细胞系不同SMIP拟合(产生)的五参数曲线计算EC50。用所产生的细胞因子的最高浓度除以测定的所示各化合物的相对EC50来计算SMIP效力的排序。对于人THP-1细胞，利用IL-8诱导来计算；对于人PBMC，利用IL-6诱导来计算；对于小鼠脾细胞，利用IL-6诱导来计算。
体内佐剂研究
在磷酸缓冲盐水(PBS)中混合25微克gp 120dV2EnvSF162抗原(源自HIV-1毒株SF162的序列的重组gp120蛋白-删除了V2结构域；Pharm Res.，2004年12月，21(12)：2148-52)与50微升MF59佐剂，然后加入0、1、5或25微克小分子免疫增效剂(SMIP)，用PBS调节至100微升。然后将50微升该溶液注射入雌性BALB/c小鼠(第0天)左右胫骨前肌，每只小鼠总体积为100微升。四周后(第28天)，再将50微升该溶液注射入该小鼠左右胫骨前肌。第二次接种7天后(第34天)，收集血清样品，一天后(第35天)取出脾脏。用Env-特异性血清IgG2a ELISA和Env-特异性血清IgG1ELISA测定血清样品。测定脾脏样品的Env-特异性，产生细胞因子的脾脏CD4和CD8T细胞。结果见表2。
图4显示了实施例19和实施例11化合物的体内佐剂活性。用MF59+/-所示SMIP(25μg/ml)配制的HIV gp120免疫BALB/c小鼠两次。用CpG 1826(25μg/ml)用作阳性对照。第二次(免疫)两周后，收集免疫小鼠的血清，测定抗-gp120-特异性血清IgG2a(图4A)和IgG1(图4B)抗体的几何平均滴度(GMT)。此外，也收集免疫小鼠的脾脏，通过IL-2和IFN-g的胞内细胞因子染色测定离体抗-gp120-特异性T细胞应答(图4C)。结果表示为表达所示细胞因子的抗原特异性T细胞百分比。
Figure G200580036853XD00981
本申请要求2004年9月14日提交的美国临时申请系列号60/609,586与2004年12月16日提交的美国临时申请系列号60/637,107的优先权，二者的全部内容纳入本文作为参考。
以上引用的各专利、专利申请和期刊出于所有目的如同全文列出一样纳入本文作为参考。

Claims (77)

1.一种式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐、其互变异构体或该互变异构体的药学上可接受的盐：
Figure F200580036853XC00011
其中：
R1是-NR6R7、-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9、-(CH2)mC≡C(CH2)nR9或-S(O)qR10；
R2是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9、-(CH2)mC≡C(CH2)nR9；
R3各自独立为H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素或三卤代甲基；
R4和R5各自独立为H、C1-6烷基、C6-10芳基-C1-6烷基或保护基团；
R6和R7各自独立为H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C6-10芳基、C6-10芳基-C1-6烷基、C6-10芳氧基-C1-6烷基、-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9或-(CH2)mC≡C(CH2)nR9；或
R6和R7结合在一起形成取代或未取代的杂环基；
R9独立为H、C1-6烷基、或C6-10芳基；
R10各自独立为C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C6-10芳基、C6-10芳基-C1-6烷基、三卤代甲基或-NR6R7；
m和n各自独立为0、1、2或3；
p是0、1、2或3；与
q各自独立为0、1或2，
前提是如果R1是-S-Me，则R2不是异丁基。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R4和R5各自为H。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R1是-NR6R7。
4.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R1是-S(O)qR10。
5.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R1是-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9。
6.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R1是-(CH2)mC≡C(CH2)nR9。
7.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是C1-6烷基。
8.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，R1中的R6和R7独立为H、C1-6烷基或-(CH2)mCH＝CH(CH2)nR9。
9.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，R1是-SR10，-SR10的R10是C1-6烷基。
10.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，R2是异丁基。
11.如权利要求8所述的化合物，其特征在于，R10中的C1-6烷基选自甲基、乙基、正-丁基或正-戊基。
12.如权利要求8所述的化合物，其特征在于，m是1，n是0，R9是H。
13.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R1是-N(CH3)CH2CH2CH3。
14.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，p是0。
15.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是取代的C1-6烷基。
16.如权利要求15所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2C(CH3)2(OH)。
17.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R1是-S-环丙基、-S-CH2CH(CH3)2或-S-CH2CH2CH3。
18.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1是-S-C3-6环烷基。
19.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R6和R7结合在一起形成取代或未取代的杂环基。
20.如权利要求19所述的化合物，其特征在于，所述杂环基选自哌啶基、吡咯烷基、氮杂环丁烷基或吖丙啶基。
21.一种以下结构所示的化合物或其药学上可接受的盐、其互变异构体或该互变异构体的药学上可接受的盐：
22.一种以下结构所示的化合物或其药学上可接受的盐、其互变异构体或该互变异构体的药学上可接受的盐：
Figure F200580036853XC00022
23.一种以下结构所示的化合物或其药学上可接受的盐、其互变异构体或该互变异构体的药学上可接受的盐：
Figure F200580036853XC00031
24.一种以下结构所示的化合物或其药学上可接受的盐、其互变异构体或该互变异构体的药学上可接受的盐：
Figure F200580036853XC00032
25.一种以下结构所示的化合物或其药学上可接受的盐、其互变异构体或该互变异构体的药学上可接受的盐：
Figure F200580036853XC00033
26.一种以下结构所示的化合物或其药学上可接受的盐、其互变异构体或该互变异构体的药学上可接受的盐：
27.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：
1-(4-氨基-2-丙基硫烷基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；
1-(4-氨基-2-氮杂环丁烷-1-基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；
1-(4-氨基-2-吡咯烷-1-基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2醇；
1-(4-氨基-2-环丙基硫烷基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇；或
1-(4-氨基-2-异丁基硫烷基-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基-丙-2-醇。
28.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；
4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇；
1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；或
N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。
29.一种合成式(II)所示化合物的方法
Figure F200580036853XC00041
其中R11和R14各自是C1-6烷基或取代的C1-6烷基，R12和R13各自是保护基团，所述方法包括以下步骤：
(a)将式(III)所示化合物与式R11NCS所示异硫氰酸酯反应，其中R11如上定义，从而得到式(IV)所示化合物：
Figure F200580036853XC00051
(b)任选纯化式(IV)所示化合物；
(c)将式(IV)所示化合物与偶联剂反应，从而得到式(II)所示化合物；和
(d)任选使式(II)所示化合物脱保护。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述偶联剂是盐酸1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺。
31.一种合成式(V)所示化合物的方法
Figure F200580036853XC00052
其中R14是C1-6烷基或取代的C1-6烷基，R15是C6-10芳基-C1-6烷基，所述方法包括：
(a)将其中R12和R13各自是保护基团的式(III)所示化合物与二硫化碳反应得到式(VI)所示化合物：
Figure F200580036853XC00053
(b)任选纯化式(VI)所示化合物；
(c)将式(VI)所示化合物与活化的R15基团反应得到式(VIa)所示化合物；
Figure F200580036853XC00054
(d)式(VIa)所示化合物脱保护得到式(V)所示化合物。
32.一种合成式(XI)所示化合物的方法
Figure F200580036853XC00061
其中R12和R13各自是保护基团，R14是C1-6烷基或取代的C1-6烷基，n是0、1、2或3，R18是H、C1-6烷基或C6-10芳基，所述方法包括：
(a)将式(III)所示化合物
Figure F200580036853XC00062
与式ClC(O)O-C1-6烷基所示氯甲酸酯反应得到式(XII)所示化合物：
Figure F200580036853XC00063
(b)任选纯化式(XII)所示化合物；
(c)在有醇盐碱存在下使式(XII)所示化合物反应，从而得到式(XIII)所示化合物；
Figure F200580036853XC00064
(d)将式(XIII)所示化合物与三氟甲磺酸酐反应得到式(XIV)所示的三氟甲磺酸酯：
(e)将式(XIV)所示化合物与式Li-C≡C(CH2)nR18所示炔化锂反应，其中n和R18如上定义，得到式(XI)所示化合物；和
(f)任选将式(XI)所示化合物脱保护。
33.如权利要求29、31或32中任一项所述的方法，其特征在于，所述保护基团是苄基。
34.如权利要求2-28中任一项所述的化合物在制备诱导对象的干扰素生物合成的药物中的应用。
35.如权利要求2-28中任一项所述的化合物在制备调节对象的免疫应答的药物中的应用。
36.如权利要求2-28中任一项所述的化合物在制备诱导对象产生TNF-α的药物中的应用。
37.如权利要求36所述的应用，其特征在于，所述化合物在血液中的平均稳态药物浓度小于20μM。
38.如权利要求2-28中任一项所述的化合物在制备诱导对象的免疫应答的药物中的应用。
39.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述免疫应答包括产生细胞因子。
40.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述免疫应答包括TNF-α的产量增加。
41.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述对象患有微生物感染。
42.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述对象患有病毒感染。
43.如权利要求42所述的应用，其特征在于，所述病毒感染是丙肝病毒(HCV)导致的病毒感染。
44.如权利要求42所述的应用，其特征在于，所述病毒感染是人免疫缺陷病毒(HIV)导致的病毒感染。
45.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述对象患有异常细胞增殖或癌症。
46.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述对象患有变应性疾病。
47.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述对象患有哮喘。
48.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述对象患有癌前病变。
49.如权利要求48所述的应用，其特征在于，所述癌前病变是光化性角化病。
50.如权利要求2-28中任一项所述的化合物在制备抑制对象中的激酶的药物中的应用。
51.如权利要求34、35、36、38-45、48或49中任一项所述的方法，其特征在于，所述化合物局部给予。
52.一种药物组合物，包含：权利要求2-28中任一项所述化合物与药学上可接受的赋形剂。
53.如权利要求2-28中任一项所述的化合物和抗原在制备诱导对象针对所述抗原的免疫应答的药物中的应用。
54.如权利要求2-28中任一项所述的化合物和抗原在制备提高对象针对所述抗原的免疫应答的药物中的应用。
55.一种包含权利要求2-28中任一项所述化合物与其它免疫原性组合物或抗原的组合物。
56.如权利要求55所述的组合物，其特征在于，所述其它免疫原性组合物包含抗原。
57.如权利要求52、55或56中任一项所述的组合物，还包含其它佐剂。
58.如权利要求57所述的组合物，其特征在于，所述佐剂是MF59。
59.如权利要求55-57中任一项所述的组合物，还包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)。
60.如权利要求56所述的组合物，其特征在于，所述抗原是细菌抗原或病毒抗原。
61.如权利要求60所述的组合物，其特征在于，所述抗原是选自以下病毒的病毒抗原：丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、乙肝病毒、人乳头瘤病毒和流感病毒。
62.如权利要求61所述的组合物，其特征在于，所述抗原是流感抗原。
63.如权利要求62所述的组合物，其特征在于，所述流感抗原包含血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
64.如权利要求60-63中任一项所述的组合物，还包含其它佐剂。
65.如权利要求64所述的组合物，其特征在于，所述佐剂是MF59。
66.如权利要求60-65中任一项所述的组合物，还包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)。
67.一种包含权利要求2-28中任一项所述化合物和抗原的组合物。
68.如权利要求67所述的组合物，还包含其它佐剂。
69.如权利要求68所述的组合物，其特征在于，所述佐剂是MF59。
70.如权利要求67-69中任一项所述的组合物，还包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)。
71.如权利要求67所述的组合物，其特征在于，所述抗原是细菌抗原或病毒抗原。
72.如权利要求71所述的组合物，其特征在于，所述抗原是选自以下病毒的病毒抗原：丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、乙肝病毒、人乳头瘤病毒和流感病毒。
73.如权利要求67所述的组合物，其特征在于，所述抗原是流感抗原。
74.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述流感抗原包含血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
75.如权利要求71-74中任一项所述的组合物，还包含其它佐剂。
76.如权利要求75所述的组合物，其特征在于，所述佐剂是MF59。
77.如权利要求71-76中任一项所述的组合物，还包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)。
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