CN101028322B - 毛裂蜂斗菜提取物用于制备防治肿瘤疾病药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是毛裂蜂斗菜提取物及其制备方法和将毛裂蜂斗菜提取物用于制备治疗肿瘤疾病药物的用途。将毛裂蜂斗菜药材用含水乙醇热提、冷浸或渗漉得提取液，采用大孔吸附树脂分离，精制毛裂蜂斗菜提取物。毛裂蜂斗菜提取物的主要活性成分是蜂斗菜内酯D(bakkenolide-D)、蜂斗菜内酯B(bakkenolide-B)、蜂斗菜内酯-IVa(bakkenolide-IIIa)、蜂斗菜内酯(bakkenolide-IIIa)，四者的总含量高达50％以上，经生物活性筛选试验，能有效防治肿瘤，特别是肝癌、肺癌、宫颈癌、肠癌、肾癌、口腔表皮样癌、乳腺癌，所以毛裂蜂斗菜提取物可用于制备防治肿瘤药物的用途。

Description

毛裂蜂斗菜提取物用于制备防治肿瘤疾病药物的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种毛裂蜂斗菜根茎提取物及其制备方法以及该提取物用于制备治疗和预防肿瘤疾病药物的用途

背景技术

毛裂蜂斗菜Petasites tricholobus Franch.属菊科蜂斗菜属植物，其根茎在民间用于解毒祛瘀，外敷治跌打损伤、骨折蛇伤等。为开发利用该植物本发明人对该植物进行了较系统的化学成分及药理研究，曾报道了毛裂蜂斗菜中的四个蜂斗菜内酯新化合物，以及蜂斗菜内酯类化合物用于治疗可能与组胺和/或白三烯有关疾病的用途(专利公开号：CN1844114)，但到目前为止，尚未见毛裂蜂斗菜及其提取物有抗肿瘤活性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从毛裂蜂斗菜中提取得到的毛裂蜂斗菜提取物及其制备方法，经体外试验，制得的毛裂蜂斗菜提取物，对肝癌、肺癌、宫颈癌、肠癌、肾癌、口腔表皮样癌、乳腺癌肿瘤细胞株有明显的抑制作用，因此，本发明的蜂斗菜提取物可用于治疗肿瘤疾病。这些肿瘤疾病优选包括指肝癌、肺癌、宫颈癌、肠癌、肾癌、口腔表皮样癌、乳腺癌。本发明所制备的毛裂蜂斗菜提取物具有可用于制备抗肿瘤疾病药物的用途。

本发明是通过如下技术方案完成的，具体内容包括：毛裂蜂斗菜提取物的制备以及抗肿瘤药理活性实验。

(1)毛裂蜂斗菜提取物的制备

本发明毛裂蜂斗菜提取物的制备方法依次由以下步骤组成：

(1)提取

毛裂蜂斗菜根茎粉碎后，用20-95％的含水乙醇提取得提取液，提取液减压浓缩后离心或过滤，弃沉淀，上清液或过滤液备用；

含水乙醇提取的方法为热提、冷浸或渗漉；采用上述方法提取时乙醇的体积用量为生药质量的5-15倍；

(2)吸附洗脱

将上述上清液或过滤液进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附、水-50％的含水低级醇淋洗除去杂质后，用上样生药质量的4-12倍量体积的60-95％的含水的C₁～C₅低级醇洗脱；

(3)浓缩、干燥

洗脱液减压浓缩，干燥，即为本发明的毛裂蜂斗菜提取物。

将毛裂蜂斗菜的干燥根茎用20～95％乙醇热提或冷浸，提取液浓缩后离心或过滤，取上清液或过滤液进行大孔树脂吸附，先用水-50％的含水低级醇淋洗除去杂质，再用60-95％的含水低级醇洗脱，洗脱液浓缩到至无醇，干燥即为本发明的毛裂蜂斗菜提取物；或将浓缩液通过聚酰胺色谱，依次用水、50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，浓缩，干燥也可得毛裂蜂斗菜提取物。

获得的毛裂蜂斗菜提取物成分分析：经反复硅胶柱层析，获得4个量大的化合物，这4个化合物的结构通式如下：

即蜂斗菜内酯D，蜂斗菜内酯B，蜂斗菜内酯IVa，和蜂斗菜内酯IIIa。

其中：

化合物名称      R₁                   R₂

蜂斗菜内酯-D    OCOC(CH₃)＝CHCH₃     OCOCH₃

蜂斗菜内酯-B    OCOC(CH₃)＝CHCH₃     OCOCH₃

蜂斗菜内酯IVa   OCOCH＝CHSCH₃        OCOCH＝C(CH₃)₂

蜂斗菜内酯IIIa  OCOCH＝CHSCH₃        OCOC(CH₃)＝CHCH₃

所以，毛裂蜂斗菜提取物主要是蜂斗菜内酯D，蜂斗菜内酯B，蜂斗菜内酯IVa和蜂斗菜内酯IIIa的混合物，经HPLC定量测定，这4个化合物的含量总和占总提取物的50％以上，且蜂斗菜内酯D，蜂斗菜内酯B，蜂斗菜内酯IVa和蜂斗菜内酯IIIa的含量比例为：0.1-5∶0.1-5∶1-9∶1-9。

(2)生物活性试验：受试药物对体外肿瘤细胞生长的抑制作用受试药物：毛裂蜂斗菜提取物(编号为1)，蜂斗菜内酯D(编号为2)，蜂斗菜内酯B(编号为3)，蜂斗菜内酯IVa(编号为4)，蜂斗菜内酯IIIa(编号为5)药物配制：将受试药物溶于二甲基亚砜(DMSO)配成储备液，使用时用含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养基稀释100倍。阳性对照药物选择5-氟脲嘧啶(5-FU)，配制方法同受试药物。

肿瘤细胞株：人肺癌细胞A549，人宫颈癌细胞Hela，人大肠癌细胞HCT116，人肝癌细胞HepG2，人肝癌细胞BEL-7402，人肾癌细胞RXF-631L，人口腔表皮样癌细胞KB，人乳腺腺癌细胞MCF-7。

测定方法：将生长到对数期的各细胞株用胰酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基制成细胞悬液，以每孔10^-4个细胞的浓度接种到96孔细胞培养板上，每孔200μl。24h后，移去培养基，加入含受试药物的培养基，受试药物的终浓度为1×10^-3-10μg/ml，5-FU的终浓度为0.01-10μg/ml。对照组中不加受试药物。继续培养3天后，终止培养，用MTT法检测细胞存活率。终止培养前每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl使MTT终浓度为0.5mg/ml，在37℃，5％CO₂的培养箱继续孵育4h后，终止培养，吸去上清液。每孔加入100μl溶解剂(10％SDS，5％异丙醇，0.01M HCl)，于37℃下充分溶解，显微镜下观察结晶全部溶解后，在酶标仪上于550nm处测定各孔吸光度(OD)值，计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝受试药物OD值/对照组OD值×100％。以细胞存活率对剂量对数作图，计算出受试药物对各肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。结果：见表1

表1受试药物体外抑制肿瘤细胞生长的作用

结果显示受试药物对受试肿瘤细胞都有明显的抑制作用，特别是对于2种肝癌细胞，抑制作用非常明显，作用优于5-FU。结果还显示，毛裂蜂斗菜提取物、蜂斗菜内酯IVa，蜂斗菜内酯IIIa的作用优于蜂斗菜内酯D和蜂斗菜内酯B。

具体实施方式

下面给出实施例进一步说明本发明但并不构成对本发明的限制。

实施例1

毛裂蜂斗菜干燥根茎用20-95％乙醇加热提取，首次溶媒用量约为生药量的5-10倍，或将毛裂蜂斗菜根茎用20-95％乙醇渗漉提取，溶媒用量为生药量的5-15倍，合并渗漉液，并减压浓缩到一定体积得浓缩液，浓缩液的离心上清液或过滤液通过大孔树脂吸附，(大孔树脂为以苯乙烯为架桥材料的聚苯乙烯型多孔性吸附树脂，如：D101、D201、ZTC-1、AB-8、D4020、860021、HP20、SP825型大孔树脂等)，用水-50％的含水乙醇淋洗除去杂质；再用浓度为60-95％的含水低级醇洗脱，低级醇为甲醇、乙醇、或丙醇等C1～C5醇类，其用量为生药量的4-12倍，收集低级醇洗脱液，浓缩至无醇，干燥，即为本发明的毛裂蜂斗菜提取物。

实施例2

毛裂蜂斗菜干燥根茎50公斤，投入渗漉罐，加入250升80％乙醇，浸泡12小时，渗漉，合并渗漉液，并减压浓缩到30升，离心，然后过大孔吸附树脂SP825(北京绿百草公司)，用300升40％乙醇淋洗除去杂质；再用300升70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后干燥，得本发明的毛裂蜂斗菜提取物0.25公斤。

本发明毛裂蜂斗菜提取物的主要活性成分是蜂斗菜内酯D(bakkenolide-D)、蜂斗菜内酯B(bakkenolide-B)、蜂斗菜内酯-IVa(bakkenolide-IIIa)、蜂斗菜内酯(bakkenolide-IIIa)，四者的总含量高达50％以上，经体外试验，能有效防治肿瘤，特别是肝癌、肺癌、宫颈癌、肠癌、肾癌、口腔表皮样癌、乳腺癌，所以毛裂蜂斗菜提取物具有可用于制备防治肿瘤药物的用途。

Claims (1)

1.毛裂蜂斗菜提取物在制备抗肝癌、肺癌、宫颈癌、肠癌、肾癌、口腔表皮样癌、乳腺癌药物中的应用，所说毛裂蜂斗菜提取物的制备方法如下：

(1)提取

毛裂蜂斗菜根茎粉碎后，用20-95％含水乙醇提取得提取液，提取液减压浓缩后离心或过滤，弃沉淀，上清液或过滤液备用；

(2)吸附洗脱

将上述上清液或过滤液进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附、水-50％的含水低级醇淋洗除去杂质后，用上样生药质量的4-12倍量体积的60-95％的含水的C₁～C₅低级醇洗脱；

(3)浓缩、干燥

将洗脱液减压浓缩，干燥，即得毛裂蜂斗菜提取物。