CN101016331A - 分离纯化绿僵菌素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离纯化绿僵菌素的方法，此法包括下列步骤：(1)将真菌发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。此种方法可以快速、环保、节省和高效地分离纯化绿僵菌素，具有良好的社会经济价值。

Description

分离纯化绿僵菌素的方法

技术领域

本发明涉及一种分离纯化的方法，特别涉及一种分离纯化绿僵菌素的方法。

技术背景

绿僵菌素(destruxin)是真菌毒素，是一类环缩羧肽类化合物，主要由绿僵菌(Metarhizium)产生，其它真菌如壳座孢(Aschersonia)、链格孢(Altemaria)、单端孢(Trichothecium)及盘蛇孢(Ophiosphaerella)等也能形成不同种类的绿僵菌素。绿僵菌素有杀虫、抗病毒和抗癌等生物活性，经济价值很高。自从1961年，Kodaira首次分离出绿僵菌素A和B至今，35种绿僵菌素已经被分析鉴定。从Kodaira(1961)、Susuki(1970)到Pail等(1981)都是采用传统经典方法分离绿僵菌素。其方法第一步是萃取，将绿僵菌的发酵液离心或过滤去渣，然后调节其pH值到酸性，按其体积比：溶剂∶发酵液＝1∶1的比例加入乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等溶剂萃取，将该过程重复多次，然后分离有机相和水相分离，保留有机相并通过旋转蒸发器或真空干燥器浓缩干燥，获得绿僵菌素的粗提物。第二步是层析，采用硅胶柱层析或氧化铝柱层析，用苯、丙酮、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷等溶剂，以不同浓度配比梯度洗脱，最后从不同馏份中可分离到不同的绿僵菌素，其中主要是绿僵菌素A、B和E，因为它们的含量较高，约占总绿僵菌素的85％左右。研究发展至今，虽然鉴定出多种绿僵菌素，但大多集中在结构分析和物理化学性质判定上，至于分离制备方法则仍然局限在繁杂的流程之中，整个过程需要使用大量的高毒溶剂，持续很长时间，制备成本非常高。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离纯化绿僵菌素的方法，此法克服了常规方法的上述问题，应用此种方法可以达到快速、环保、节省和高效分离纯化绿僵菌素的目的。

在达到上述目的中，根据本发明提供的一种分离纯化绿僵菌素的方法，此法包括下列步骤：(1)真菌发酵液经过离心或真空抽滤去除固体残渣，所得发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并通过旋转蒸发器浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份通过旋转蒸发器浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。

吸附法预处理发酵液是通过吸附法除去发酵液中的杂质。真菌发酵液的组成非常复杂，从残余的培养基、菌组织，到蛋白质、色素和各种各样的代谢物质等。绿僵菌素的极性较低，且光吸收峰在波长200～220nm之间，当其溶于有机溶剂时呈无色透明液体，因此发酵液中吸收峰大于280nm的物质都可视为杂质，它们实际上是使发酵液颜色加深的物质。我们发现，利用吸附法预处理发酵液，能达到理想的去杂效果。其吸附法预处理发酵液的步骤是在下列条件下进行：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土，或它们其中一种或两种的混合物；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝1～5％；温度：15～35℃；振荡转速：100～200转/分；吸附处理0.5～2小时。而较好的吸附预处理条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；吸附剂为高岭土或硅藻土；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝2％；在24℃下，150转/分振荡吸附处理1小时。然后离心除去吸附剂。

由于超声波是一种纵波，它在液体中的传播会造成液体的压力变化而产生无数的微小真空泡，当这些真空泡受压爆破时，会形成强大的冲击，称为空穴效应，从而使萃取体系中分子增加碰撞机会，达到促进萃取效果的作用。因此，利用超声波促进萃取，能够减少溶剂用量、缩短萃取时间和降低萃取体系的温度以便减少目标物的损失。其超声波促进萃取绿僵菌素的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液∶乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶剂与发酵液的体积比为：萃取溶剂∶发酵液＝30～70∶70～30；超声波频率：30～50kHz；温度：-5～40℃；萃取时间：0.5～2小时；而较好的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶剂与发酵液的体积比为50∶50；超声波频率：40 kHz；温度：-5～10℃；萃取时间：1小时。

经过萃取后浓缩而成的绿僵菌素粗提物是一个混合体系，既含各种绿僵菌素，又含许多杂质。因此，该粗提物直接采用制备色谱分离纯化绿僵菌素时，由于杂质含量高，耗时很长。减压层析可以进一步除去杂质和分离不同的绿僵菌素组分，经减压层析后再用制备色谱，则不光缩短了时间，提高了效率，也减少了溶剂用量，降低了制备成本。减压层析装置由砂芯漏斗、玻璃抽滤瓶和真空泵组合而成。其减压层析条件是：硅胶H填柱；用二氯甲烷洗脱5～10个柱体积，或用以下体积比的混合液：二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脱5～10个柱体积。

经过减压层析所得浓缩物进一步在制备色谱仪上分离纯化。其色谱分离纯化在以下条件下进行：反相色谱柱；用以下体积比：乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比：乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；柱温：0～35℃；检测波长：200～220nm；而较好的检测波长：215nm，柱温：4℃。收集各馏份后，浓缩干燥，再作HPLC分析，与标准对照，确定绿僵菌素种类。

在本说明书中所用的“真菌发酵液”一词是指从主要由绿僵菌(Metarhizium)产生，或其它真菌如壳座孢(Aschersonia)、链格孢(Alternaria)、单端孢(Trichothecium)及盘蛇孢(Ophiosphaerella)等获得的包括不同种类的绿僵菌素的液体。

使用本发明的分离纯化绿僵菌素的方法的有益效果是：由于在萃取过程中采用了超声波促进萃取，从而省去了常规方法萃取过程需重复多次的繁杂，即节省了时间，又减少了溶剂用量，降低了制备成本；在层析过程中采用减压层析，即避免了使用苯等有毒溶剂，又为下一步骤制备色谱分离纯化除去了大量杂质，从而为制备色谱分离纯化省去了大量时间，也减少了溶剂用量，降低成本，达到了快速、环保、节省和高效分离纯化绿僵菌素的目的。

附图说明

图1表示分离纯化绿僵菌素的方法流程图；

图2表示吸附法预处理发酵液流程图；

图3表示超声波促进萃取流程图；

图4表示减压层析流程图；

图5表示减压层析装置示意图；

图6表示减压层析后制备色谱分离纯化绿僵菌素的HPLC图谱；

图7表示超声波促进萃取后制备色谱分离纯化绿僵菌素的HPLC图谱。

1.砂芯漏斗    2.样品层(其上盖滤纸)    3.硅胶H层

4.磨口套接或密封胶塞    5.真空泵接口    6.玻璃抽滤瓶

具体实施方式

用本发明的分离纯化绿僵菌素的方法基本流程是：

如图1所示，(1)吸附法预处理发酵液：真菌发酵液经过离心或真空抽滤去除固体残渣，所得发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)超声波促进萃取：在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并通过旋转蒸发器浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)减压层析：对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份通过旋转蒸发器浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱分离纯化：制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。

下列实施例将进一步说明本发明，但本发明不仅限于实施例。

实施例1

将从金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)产生的液体经发酵后，用5000～8000转/分的离心机离心10～15分钟，去渣；或真空抽滤去渣；用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0，用高岭土或硅藻土作吸附剂，并按吸附剂重量/发酵液体积＝2％加入到发酵液中，在24℃下，150转/分振荡吸附处现1小时；然后用5000～8000转/分的离心机离心10～15分钟，去除吸附剂，保留发酵液，如图2所示；用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0，萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶剂与发酵液的体积比为50∶50；用频率为40kHz的超声波在温度-5～10℃的范围中萃取1小时，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并通过旋转蒸发器浓缩，得到绿僵菌素粗提物，对绿僵菌素A和B的萃取效率达到95％以上，流程如图3所示；然后减压层析：硅胶H填柱；用二氯甲烷洗脱5～10个柱体积，或用以下体积比的混合液：二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脱5～10个柱体积，得馏分1或馏分2，然后用旋转蒸发器浓缩馏分去除溶剂，从馏分1中得到绿僵菌素A和B粗提物，或从馏分2中得到绿僵菌素C、D和E粗提物，对绿僵菌素A和B的回收率达到95％以上，其流程如图4所示，装置如图5所示。将各馏份浓缩干燥，再溶解并过滤后制备色谱分离纯化：反相色谱柱；用以下体积比：乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比：乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；并用215nm波长紫外光在柱温4℃检测绿僵菌素。各馏份浓缩干燥，再作HPLC分析，与标准对照，确定绿僵菌素种类。

实施例2

按所述的相同步骤重复进行实施例1，但是吸附法预处理发酵液、超声波促进萃取、制备色谱分离纯化过程的条件分别改为：

(1)吸附法预处理发酵液的条件：

用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土，或它们其中一种或两种的混合物；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝1～5％；温度：15～35℃；振荡转速：100～200转/分；吸附处理0.5～2小时。

(2)超声波促进萃取的条件：

用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶剂与发酵液的体积比为：萃取溶剂∶发酵液＝30～70∶70～30；超声波频率：30～50kHz；温度：-5～40℃；萃取时间：03～2小时。

(3)制备色谱分离纯化的条件：

反相色谱柱；用以下体积比：乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比：乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；

柱温：0～35℃；检测波长：200～220nm

对比例1

按实施例1所述的相同条件重复进行实施例1，但省去其中间(3)减压层析这一步骤，而直接将超声波促进萃取后得到的绿僵菌素粗提物，用高效液相色谱仪中进一步分离纯化。在HPLC图谱中，实施例1减压层析后制备色谱分离纯化，其测定绿僵菌素A在用时8分钟左右时测定峰面积达到最大值，绿僵菌素B在用时12分钟左右时测定峰面积达到最大值。而本实施例超声波促进萃取后制备色谱分离纯化中，其测定绿僵菌素A在用时50分钟左右时测定峰面积达到最大值，绿僵菌素B在用时60分钟左右时测定峰面积达到最大值，其具体分离纯化绿僵菌素的HPLC图谱情况如图6、图7所示。

Claims (9)

1.一种分离纯化绿僵菌素的方法，该方法包括下列步骤：

(1)将真菌发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；

(2)在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并浓缩得绿僵菌素粗提物；

(3)对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份浓缩干燥，再溶解并过滤；

(4)制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。

2.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(1)中吸附法的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土，或它们其中一种或两种的混合物；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝1～5％；温度：15～35℃；振荡转速：100～200转/分；吸附处理0.5～2小时。

3.按照权利要求2的方法，其中所述步骤(1)中吸附法的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；吸附剂为高岭土或硅藻上；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝2％；在24℃下，150转/分振荡吸附处理1小时。

4.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(2)中用超声波促进萃取的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶剂与发酵液的体积比为：萃取溶剂∶发酵液＝30～70∶70～30；超声波频率：30～50kHz；温度：-5～40℃；萃取时间：0.5～2小时。

5.按照权利要求4的方法，其中所述步骤(2)中用超声波促进萃取的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶剂与发酵液的体积比为50∶50；超声波频率：40kHz；温度：-5～10℃；萃取时间：1小时。

6.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(3)中减压层析的条件是：硅胶H填柱；用二氯甲烷洗脱5～10个柱体积，或用以下体积比的混合液：二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脱5～10个柱体积。

7.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(4)中制备色谱的条件是：反相色谱柱；用以下体积比：乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比：乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；柱温：0～35℃；检测波长：200～220nm。

8.按照权利要求7的方法，其中所述步骤(4)中制备色谱的条件是：柱温：4℃；检测波长：215nm。

9.按照权利要求1的方法，其中所述真菌来自半知菌亚门丝孢纲，其种类包括绿僵菌、壳座孢、链格孢、单端孢及盘蛇孢。

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