CN101003574B

CN101003574B - 长效降血糖肽的重组表达及其在糖尿病治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN101003574B
Application number: CN2006100459094A
Authority: CN
Inventors: 黄庆生; 李元; 张明杰; 李别虎; 薛小平; 王延竹; 韩文君
Original assignee: DIEN BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd DALIAN
Current assignee: DIEN BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd DALIAN
Priority date: 2006-02-21
Filing date: 2006-02-21
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2026-02-21
Also published as: CN101003574A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域中的基因克隆和基因表达，长效降血糖肽把GLP-1中二肽基肽酶作用的关键位点从原来的丙氨酸突变为甘氨酸，解决二肽基肽酶降解的问题，再与人白蛋白基因在基因水平进行拼接，最后在毕赤酵母表达系统中分别表达出四种GLPAG与人白蛋白通过柔性连接子(柔性Linker)连接的融合蛋白，这种融合蛋白既保留了GLP-1的活性又能使其在体内的半衰期大大延长，降血糖作用明显，无低血糖现象发生。

Description

长效降血糖肽的重组表达及其在糖尿病治疗药物中的应用

技术领域：

本发明涉及分子生物学领域中的基因克隆和基因表达，以及药理学领域中应用。

背景技术：

糖尿病已经被列为继心脑血管疾病和肿瘤之后的第三大杀手。随着生活模式、饮食结构的改变，我国居民糖尿病患病率呈急剧上升的趋势。预计到2030年世界糖尿病患病人数将增至3.66亿人，糖尿病将成为发展中国家一个沉重的负担。

II型糖尿病患者中绝大多数人不可避免的要用药物来治疗，口服药物有三大类：第一类为黄脲类。如优降糖，糖适平，达美康，美吡达；黄脲类药能够刺激胰岛分泌胰岛素，但胰岛素分泌多了以后，可以引起低血糖，低血糖对患者而言是一个不可忽视的危险因素，而且部分药物具有较大副作用，如可引起肝功能损伤。第二类药是双胍类药。如降糖灵和二甲双胍；双胍类药并不刺激胰岛素分泌，它刺激机体在细胞水平上提高胰岛素的利用，但对于胰岛素分泌不足的糖尿病患者而言，其发挥的作用就很有限，而且还有乳酸性酸中毒等不良反应。第三类药是a糖苷酶抑制剂。如拜糖平；这类药的作用是减少人体对饮食中糖的吸收，因为吸收减少，血糖升高也比较缓慢。但该药的副作用就是胃肠反应，服用后如发生低血糖反应，还要口服或静脉注射葡萄糖。

目前注射药物主要是胰岛素，注射用的胰岛素在糖尿病的治疗中发挥着重要的作用。但也有其不足，主要为用药后心慌、表情异常、流汗等，重者产生胰岛素休克或低血糖性惊厥；注射胰岛素的患者，经一度停药再用药时，对胰岛素的需用量愈来愈大，甚至一次可耐受200U，其原因可能是机体产生了胰岛素抗体，抗体与胰岛素结合而减弱其作用。基于对胰岛β细胞生理学和胰岛素外周作用机制的深入了解，近年来一批治疗糖尿病的新药相继开发成功。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是其中最具代表性的降血糖肽，它通过与β细胞表面的特异受体结合而刺激胰岛素分泌，只需注射微克级的剂量即可发挥生理效应。肠-胰岛内分泌轴的发现，使GLP-1的作用倍受人们的关注。GLP-1最重要的生理作用是葡萄糖依赖的胰岛素刺激作用，即GLP-1刺激胰岛素分泌作用的强弱依赖于葡萄糖浓度，高浓度葡萄糖下GLP-1才能促进胰岛素分泌，在正常浓度葡萄糖下则无此刺激作用，与其他降血糖类药物比较，其最大的优点就是副作用小且不发生低血糖反应，很多治疗糖尿病的药物都有低血糖、体重增加和水肿等不良反应。此外，GLP-1还可以改善周围组织对胰岛素的敏感性、抑制胰高血糖素的释放、抑制胃排空、可增加β细胞数量等作用。GLP-1以葡萄糖依赖和浓度依赖的方式促进胰岛素基因的表达。GLP-1促进胰岛素基因表达与血糖浓度相关，是目前公认的最为有效的胃肠道促泌素。然而，GLP-1在体内短暂的半衰期(仅2-6min)，极大限制了其临床的应用。GLP-1在体内半衰期短的主要原因是被二肽基肽酶所降解，此外半衰期短的另一个原因就是因GLP-1是一种小分子量短肽，在体内很快就会通过肾脏从尿液中被排出体外。

发明内容：

本发明的目的是解决上述不足问题，提供一种长效降血糖肽的重组表达，既保留了GLP-1的活性又延长体内半衰期，稳定性高，另外其在糖尿病治疗药物中的应用，具降血糖作用明显，无低血糖现象发生，作用持久。

长效降血糖肽(GLPAG--人白蛋白融合蛋白)的重组表达，氨基酸序列如下：

H₂N-HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-Linker-DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYL

QQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQ

HKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAAC

LLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL

LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAK

DVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFE

QLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV

SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE

QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL-COOH

上述的‘H₂N-’代表蛋白质氨基端(N末端)，‘-COOH’代表蛋白质羧基端(C末端)，Linker代表柔性连接子。序列中的氨基酸缩写：A丙氨酸；R精氨酸；N天冬酰胺；D天冬氨酸；C半胱氨酸；Q谷氨酰胺；E谷氨酸；G甘氨酸；H组氨酸；I异亮氨酸；L亮氨酸；K赖氨酸；M甲硫氨酸；F苯丙氨酸；P脯氨酸；S丝氨酸；T苏氨酸；W色氨酸；Y酪氨酸；V颉氨酸；柔性连接子Linker的氨基酸序列为TSGGSGGS或GGSGGS或GGSGGSGGGGS或GGS。

所述在毕赤酵母中表达GLPAG--人白蛋白融合蛋白：

GLPAG基因的获得：

首先合成下列引物：

GLP-F1：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtg 3’；

GLP-R1：5’tccaaataagaacttacatcactggtaaaggtccc 3’；

GLP-R2：5’tccttggcagcttggccttccaaataagaacttac 3’；

GLP-R3：5’accagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc 3’；

GLP-R4：5’tcggcctttcaccagccaagcaatg 3’；

采用融合PCR的方法将它们拼接成完整的GLPAG基因，拼接后序列如下：

5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaa

ggccaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccga 3’；该序列的5’端有xho I限制性内切酶位点以及α因子信号肽末端的6个碱基即tactcgagaaaaga。

载体的构建：

合成下列引物：

alb pf：5’ctggtgaaaggccga-Linker DNA序列-gatgcacacaagagtgaggttg 3’；

alb pr：5’atgcggccgcttaccgcggtaagcctaaggcagcttgac 3’；

上游引物alb pf的5’端引入了GLPAG末端的15个碱基以及柔性连接子(linker DNA)序列，Linker DNA序列为actagtggtggctcaggtggatcc或ggtggctcaggtggatcc或ggtggctcaggtggatccggtggaggcggaagc或ggtggctca。下游引物alb pr 5’端引入Not I限制性内切酶位点；用这一对引物扩增白蛋白基因(白蛋白基因本公司从人体肝细胞中采用RT-PCR方法获得并克隆在T载体中，经测序证实为人白蛋白的cDNA)，获得了5’端带GLPAG末端15个碱基以及连接子的白蛋白基因序列。

将上述白蛋白基因与GLPAG基因混合后用GLP-F1引物和alb pr引物进行融合PCR，扩增产物用Xho I和Not I双酶切后克隆至pPIC9K载体，酶切初步确认的阳性克隆进行序列测定，确认GLPAG--人白蛋白基因是克隆在pPIC9K载体a因子信号肽的下游，确认的阳性克隆提取质粒，Sal I酶切成线性后，转化GS115毕赤酵母菌，再做G418抗性筛选，获得抗4mg/ml G418的酵母工程菌。

发酵表达：

酵母工程菌采用常规方法在甲醇诱导下在发酵罐中进行发酵表达，发酵液经蛋白电泳扫描推算，表达量约为1mg/ml(1000mg/l)。

所述长效降血糖肽在糖尿病治疗药物中的应用，特别是II型糖尿病治疗药物中的应用。

本发明长效降血糖肽(GLPAG--人白蛋白融合蛋白)把GLP-1中二肽基肽酶作用的关键位点突变成其它的氨基酸——将GLP-1的第二位氨基酸从原来的丙氨酸(Ala或A)突变为甘氨酸(Gly或G)，使二肽基肽酶无法发挥作用，可解决二肽基肽酶降解的问题，突变后称之为GLPAG，再与人白蛋白基因在基因水平进行拼接，这种拼接(融合)不是直接将GLPAG基因与人白蛋白基因连接在一起，直接连接在一起会降低GLPAG的活性，而是用一种具有柔性结构的连接子(柔性Linker)将GLPAG和人白蛋白连接在一起，我们分别用了四种不同的连接子(TSGGSGGS或GGSGGS或GGSGGSGGGGS或GGS)。最后在毕赤酵母表达系统中分别表达出四种GLPAG与人白蛋白通过柔性连接子(柔性Linker)连接的融合蛋白，这种融合蛋白既保留了GLP-1的活性又能使其在体内的半衰期大大延长，称之为“长效降血糖肽”，即GLPAG-人白蛋白。对我们重组表达的这一“GLPAG-人白蛋白”，用GK二型糖尿病大鼠模型进行的动物实验表明其活性与GLP-1一致，降血糖作用明显，无低血糖现象发生，此外，其突出优点是比单纯的GLP-1作用持久，持续时间长约1周左右。

附图说明：

附图为发酵液经蛋白电泳扫描图。

具体实施方式：

下面结合实施例对长效降血糖肽的重组表达及其在糖尿病治疗药物中的应用作进一步的说明：

在毕赤酵母中表达GLPAG--人白蛋白融合蛋白：

GLPAG基因的获得：

首先合成下列引物(由大连宝生物生物工程有限公司合成)：

GLP-F1：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtg 3’；

GLP-R1：5’tccaaataagaacttacatcactggtaaaggtccc 3’；

GLP-R2：5’tccttggcagcttggccttccaaataagaacttac 3’；

GLP-R3：5’accagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc 3’；

GLP-R4：5’tcggcctttcaccagccaagcaatg 3’；

采用融合PCR的方法将它们拼接成完整的GLPAG基因，拼接后序列如下：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccga 3’；该序列的5’端有xho I限制性内切酶位点以及α因子信号肽末端的6个碱基即tactcgagaaaaga。

融合PCR的具体过程是：25μM的GLP-F1引物1μl与25μM GLP-R1引物1μl，在体积为50μl的PCR反应液中进行10个循环的变性(94℃20秒)、退火(55℃20秒)、延伸(72℃20秒)，反应液中的其它组分与常规PCR相同。电泳回收GLP-F1引物与GLP-R1引物扩增的片段，以此片段为模板，用GLP-F1引物与GLP-R2引物进行第二次的PCR扩增，反应条件同上，但为20个循环。以电泳回收的第二次PCR产物为模板，用GLP-F1引物与GLP-R3引物进行第三次的PCR扩增，20个循环，反应条件同上。以电泳回收的第三次PCR产物为模板，用GLP-F1引物与GLP-R4引物进行第四次的PCR扩增，25个循环，反应条件同上。第四次PCR扩增的产物即为完整的GLPAG基因。

载体的构建：

合成下列引物(由大连宝生物生物工程有限公司合成)：

alb pf：5’ctggtgaaaggccga-Linker DNA序列-gatgcacacaagagtgaggttg 3’；

alb pr：5’atgcggccgcttaccgcggtaagcctaaggcagcttgac 3’；

将上述白蛋白基因与GLPAG基因混合后用GLP-F1引物和alb pr引物进行融合PCR，反应体积50μl，30个循环，循环条件：变性(94℃50秒)、退火(55℃50秒)、延伸(72℃2分钟)，反应液中的DNA聚合酶用TaKaRa公司的高保真EX Taq酶，其它组分与常规PCR相同。扩增产物用Xho I和Not I双酶切后克隆至pPIC9K载体(已将pPIC9K载体中位于4475处的另一Xho I位点突变)，酶切初步确认的阳性克隆进行序列测定，确认GLPAG--人白蛋白基因是克隆在pPIC9K载体α因子信号肽的下游。确认的阳性克隆提取质粒，Sal I酶切成线性后，转化GS115毕赤酵母菌，再进行G418抗性筛选，获得抗4mg/ml G418的酵母工程菌。四种不同连接子的GLPAG--人白蛋白酵母工程菌各筛选出一株。

发酵表达：

酵母工程菌采用常规方法在甲醇诱导下进行发酵表达。发酵在德国‘贝朗’30-L发酵罐中进行，发酵液经蛋白电泳扫描推算，表达量约为1mg/ml(1000mg/l)，见附图，图中1为标准分子量，从上至下分别是97.4kd，66.2kd，42.7kd，31kd，14.4kd；2为2mg/ml的人白蛋白；3为1mg/ml的人白蛋白；4为发酵液表达的GLPAG-人白蛋白(linker为TSGGSGGS)；5为发酵液表达的GLPAG-人白蛋白(linker为GGSGGS)；6为发酵液表达的GLPAG-人白蛋白(linker为GGSGGSGGGGS)；7为发酵液表达的GLPAG-人白蛋白(linker为GGS)。发酵液经离心、超滤、离子交换层析柱纯化后，作为治疗药物用于随后的糖尿病模型动物的治疗实验。

从附图可以看出发酵液中表过的GLPAG-人白蛋白(4，5，6，7泳道)与1mg/ml人白蛋白(3泳道)量接近，达到每毫升发酵上清液中含1mgGLPAG-人白蛋白的表达量。

GLPAG-人白蛋白作为治疗药物用于GK II型糖尿病大鼠模型的治疗实验：

GK II型糖尿病大鼠60只(每只体重在200g±10g)，分为六组，每组10只；第一组为GLP-1阳性对照组，第二组为生理盐水对照组，第三至第六组分别为不同Linker的GLPAG--人白蛋白实验组；60只GK大鼠实验前都抽取血液，分离血清，冰冻保存待测。GLPAG--人白蛋白实验组每只大鼠腹腔接种0.5ml，含60μg的GLPAG--人白蛋白(在GLPAG--人白蛋白融合蛋白中GLPAG只占整个融合蛋白分子量的约1/20，所以60μg的GLPAG--人白蛋白中也只含约3μg的GLPAG)；GLP-1阳性对照组每只大鼠腹腔接种0.5ml，含3μg的GLP-1；对照组每只大鼠腹腔接种0.5ml的生理盐水；每天注射一次，连续注射10天后，立即抽血，分离血清，冰冻保存待测。停药7天后，再分别采血，分离血清，连同前面两批冰冻保存待测的血清一起，检测血糖的浓度，结果见下表1：

表1

从上表可以看出GLPAG--人白蛋白实验组和GLP-1阳性对照组在连续给药10天后血糖值都降到了正常值的水平(正常大鼠血糖值4.9-6.2)，GLPAG--人白蛋白和GLP-1的活性是相同的。但是停药7天后GLP-1阳性对照组的血糖值又回复到了异常值，而GLPAG--人白蛋白实验组的血糖值仍在正常值，说明GLPAG--人白蛋白的活性能维持更长的时间即在体内的活性比GLP-1约延长7天。

GLPAG--人白蛋白刺激GK大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素和刺激胰岛β细胞增生作用：

体外进行原代细胞培养：取GK II型糖尿病大鼠胰岛β细胞，胰蛋白酶消化成单个细胞后计数。24孔板中每孔加入10⁵个细胞，每组4孔。‘GLPAG--人白蛋白’组(依据4种不同的Linker，分4组，每组4孔)每孔加入相应的‘GLPAG--人白蛋白’的终浓度为20μg/ml，GLP-1组每孔加入GLP-1的终浓度为1μg/ml，阴性对照组每孔加入牛血清白蛋白的终浓度为20μg/ml。细胞置37℃二氧化碳孵箱中培养，培养液为含低糖的DMEM/F2培养液。培养4小时后，每孔取出少量上清后继续培养。

4小时上清中的胰岛素检测结果为：‘GLPAG--人白蛋白’组(Linker为TSGGSGGS)上清中胰岛素含量3.4±0.3μU，‘GLPAG--人白蛋白’组(Linker为GGSGGS)3.3±0.3μU，GLPAG--人白蛋白’组(Linker为GGSGGSGGGGS)3.3±0.4μU，GLPAG--人白蛋白’组(Linker为GGS)3.5±0.3μU，GLP-1阳性对照组3.3±0.4μU，阴性对照组0.8±0.1μU。这一结果可以看出‘GLPAG--人白蛋白’各组和GLP-1阳性对照组上清中胰岛素的量明显要高于阴性对照组，说明‘GLPAG--人白蛋白’和GLP-1一样，具有刺激胰岛β细胞分泌胰岛素的功能。培养7天后将孔中的细胞消化并计数，结果GLPAG--人白蛋白组(Linker为TSGGSGGS)每孔平均9×10⁵个细胞，GLPAG--人白蛋白组(Linker为GGSGGS)每孔平均8.5×10⁵个细胞，GLPAG--人白蛋白组(Linker为GGSGGSGGGGS)每孔平均9×10⁵个细胞，GLPAG--人白蛋白组(Linker为GGS)每孔平均9.5×10⁵个细胞，GLP-1阳性对照组每孔平均8.5×10⁵个细胞，阴性对照组每孔平均1×10⁵个细胞。结果提示GLPAG--人白蛋白和GLP-1具有刺激大鼠胰岛β细胞增生的作用。

GLPAG--人白蛋白葡萄糖依赖的刺激作用：

葡萄糖依赖的刺激作用就是当体内血糖在正常水平时，‘GLPAG-人白蛋白’融合蛋白不刺激胰岛素分泌，所以也不引起低血糖。正常SD大鼠60只(每只体重在200g±10g)，分为六组，每组10只；一组为GLP-1对照组，另一组为生理盐水对照组；其余四组为‘GLPAG--人白蛋白’组；60只SD大鼠实验前都抽取血液，分离血清，测定血糖。‘GLPAG--人白蛋白’四组每只大鼠腹腔接种0.5ml，含600μg的‘GLPAG--人白蛋白’；GLP-1对照组每只大鼠腹腔接种0.5ml，含30μg的GLP-1；阴性对照组每只大鼠腹腔接种0.5ml的生理盐水；于注射后2小时、4小时、6小时、8小时采血，分离血清，测定血糖。血糖测定结果如下表2，从表中可以看出，虽然给大鼠注射了10倍治疗剂量的GLP-1和‘GLPAG--人白蛋白’，均未引起低血糖反应。

表2

Claims

1.长效降血糖肽的重组表达，其特征在于：氨基酸序列如下：

H₂N-HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-Linker-DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYL

QQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQ

HKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAAC

LLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL

LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAK

DVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFE

QLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV

SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKE

QLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL-COOH

上述的‘H₂N-’代表蛋白质氨基端，‘-COOH’代表蛋白质羧基端，Linker代表柔性连接子，序列中的氨基酸缩写：A丙氨酸；R精氨酸；N天冬酰胺；D天冬氨酸；C半胱氨酸；Q谷氨酰胺；E谷氨酸；G甘氨酸；H组氨酸；I异亮氨酸；L亮氨酸；K赖氨酸；M甲硫氨酸；F苯丙氨酸；P脯氨酸；S丝氨酸；T苏氨酸；W色氨酸；Y酪氨酸；V颉氨酸；

柔性连接子Linker的氨基酸序列为TSGGSGGS或GGSGGS或GGSGGSGGGGS或GGS。

2.根据权利要求1所述的长效降血糖肽的重组表达，其特征在于：重组表达的载体是pPIC9K载体，宿主菌是GS115毕赤酵母菌。

3.根据权利要求1所述的长效降血糖肽的重组表达，其特征在于：GLPAG基因的获得：

首先合成下列引物：

GLP-F1：5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtg 3’；

GLP-R1：5’tccaaataagaacttacatcactggtaaaggtccc 3’；

GLP-R2：5’tccttggcagcttggccttccaaataagaacttac 3’；

GLP-R3：5’accagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc 3’；

GLP-R4：5’tcggcctttcaccagccaagcaatg 3’；

5’tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccga 3’；该序列的5’端有xhoI限制性内切酶位点以及α因子信号肽末端的6个碱基即tactcgagaaaaga；

载体的构建：

合成下列引物：

alb pf：5’ctggtgaaaggccga-Linker DNA序列-gatgcacacaagagtgaggttg 3’；

alb pr：5’atgcggccgcttaccgcggtaagcctaaggcagcttgac 3’；

上游引物alb pf的5’端引入了GLPAG末端的15个碱基以及柔性连接子序列，Linker DNA序列为actagtggtggctcaggtggatcc或ggtggctcaggtggatcc或ggtggctcaggtggatccggtggaggcggaagc或ggtggctca；下游引物alb pr 5’端引入Not I限制性内切酶位点；用这一对引物扩增白蛋白基因，获得了5’端带GLPAG末端15个碱基以及连接子的白蛋白基因序列；

将上述白蛋白基因与GLPAG基因混合后用GLP-F1引物和alb pr引物进行融合PCR，扩增产物用Xho I和Not I双酶切后克隆至pPIC9K载体，酶切初步确认的阳性克隆进行序列测定，确认GLPAG--人白蛋白基因是克隆在pPIC9K载体α因子信号肽的下游，确认的阳性克隆提取质粒，Sal I酶切成线性后，转化GS115毕赤酵母菌，再做G418抗性筛选，获得抗4mg/ml G418的酵母工程菌；

发酵表达：

酵母工程菌采用常规方法在甲醇诱导下在发酵罐中进行发酵表达，发酵液经蛋白电泳扫描推算，表达量约为1mg/ml。

4.根据权利要求1所述的长效降血糖肽在糖尿病治疗药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的长效降血糖肽在II型糖尿病治疗药物中的应用。