CN100540667C - 利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白的方法，属于基因工程技术领域。它涉及到利用谷物种子水稻胚乳细胞作为生物反应器来生产医用的重组人血清白蛋白。利用人类的主要食物之一的水稻胚乳细胞的蛋白体作为重组蛋白的储藏地点，采用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导重组人血清白蛋白进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使重组人血清白蛋白能在水稻种子内大量积累，最终达到较高水平。其表达水平至少达到水稻种子重量的0.3%以上。比其他植物表达体系具有更高的产量和更低的生产成本。

Description

利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，它涉及到利用谷物种子水稻胚乳细胞作为生物反应器来生产医用的重组人血清白蛋白的方法。即以水稻作为宿主，以胚乳细胞作为生物反应器，通过DNA重组技术，将水稻胚乳细胞特异性表达人血清白蛋白的载体导入水稻细胞，在转基因水稻的胚乳细胞中特异性表达和大量积累人血清白蛋白的方法以及由该方法所生产的植物来源的重组人血清白蛋白。

背景技术

在上世纪50年代  主要医药产品的生产是以细菌作为生物反应器。但由于细菌属于原核生物  不具备真核生物的蛋白质合成与加工系统。而一些蛋白质的生物活性是依靠蛋白质的修饰来达到的，所以，它的应用受到了限制。酵母作为第二代生物反应器，在上世纪70年代开始应用于医药产品生产，由于产量低，其体  修饰/加工系统不完善，也限制了它的广泛应用。第三代生物反应器是利用高等植、动物细胞作为生物反应器。目前真核生物反应器可分为动物和植物生物反应器两大类，动物生物反应器有细胞培养与转基因动物两种，目前一些主要的医用抗体使用动物CHO细胞系(或小鼠)细胞培养来生产。转基因动物研究方面主要是在转基因乳牛的乳腺细胞表达重组蛋白质以及在鸡蛋蛋清中表达重组蛋白质。然而，动物细胞培养和转基因动物由于不能克服动物病原菌的污染问题，加上动物细胞培养的成本极高，大规模生产需要巨大的投资，有人估计，全世界目前只有1000公斤的生产单克隆抗体的能力；据计算，每扩大1000公斤的生产能力，需要投资40亿美元，并要花10年的时间来建成投产，这些数据说明目前的重组蛋白质的生产能力大大地小于市场需求。在医药应用方面没有竞争优势，使得在医药上的应用也受到限制。目前的应用是没有选择的选择。因而急需一个高效、安全的表达系统来满足巨大的市场需求。

人血清白蛋白由585个氨基酸组成，它是一个非糖苷化、可溶性相当好的单体分子，其分子量为65kD，是人血液中的主要蛋白成分，占总血清蛋白的60％，在人血液中浓度高达每毫升40毫克。它在肝内合成后，对保持血液的正常渗透压具有重要的作用；它还在血液中作为多种功能分子的载体，调节人体内的多种生理功能。在体外，它作为多种药物的稳定剂被广泛地用于各种疾病的治疗、药物载体、动物细胞培养、血浆替代物等。在国际市场上具有巨大的需求，每年的需求量高达500吨以上。然而，几乎目前所有人血清白蛋白的来源是从人血浆中提取。由于血浆来源的限制，尤其是来自血液传播的疾病如艾滋病、肝炎等的威胁，使得人们对应用血浆中提取的血清白蛋白作为医药用途产生巨大的担忧，从而对重组人血清蛋白的生产与应用产生了极大的兴趣。目前，国际上已有人试图采用原核生物大肠杆菌，真核生物如酵母、动物细胞培养、转基因奶牛来生产重组人血清白蛋白。但这些方法因表达水平较低或生产成本太高，不能用于生产。如德国GTC生物医药公司在转基因牛的人血清白蛋白的表达水平在每升40克左右。美国的鸡基因遗传(AviGenic)有限公司利用转基因鸡蛋来表达重组人血清白蛋白，在鸡蛋清里的表达水平很低，为每毫升1.65微克。英国的德尔塔(Delta)生物技术公司利用酵母来生产重组人血清白蛋白，其产量每升达到了150毫克，虽然已经在市场上开始应用，但用动物细胞作为生物反应器来生产人血清白蛋白，由于不能避免动物病原菌的污染，在应用上受到了限制。而用植物细胞成器官来表达重组人血清白蛋白具有较大的优势，目前在国际上只有两个试验室开展这方面的研究，一个是西班牙的国家农业生物技术研究所利用马铃薯块茎表达重组人血清白蛋白，其表达在每公斤马铃薯块茎为10毫克的水平，它的表达水平还是达不到商业化水平，因而不能用于生产；另一家是美国的佛罗里达州立大学利用叶绿体表达技术在叶绿体表达重组人血清白蛋白，虽然其表达水平每公斤达到250毫克，该系统的一个致命弱点是重组人血清白蛋白在叶绿体内表达形成类似于大肠杆菌表达系统的包涵体，重组人血清白蛋白呈不溶形式，从而使人血清白蛋白的生物活性丧失，而要解决其可溶性问题，将大大地提高其生产成本。

发明内容

本发明人针对现有原核和真核生物为宿主的生物反应器的表达量低、可溶性差、无生物活性和不安全等缺点，利用人类的主要食物之一的水稻胚乳细胞的蛋白体作为重组蛋白的储藏地点，采用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导重组人血清白蛋白进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使重组人血清白蛋白能在水稻种子内大量积累，最终达到较高水平，本发明不仅可以克服其他表达系统的表达量低、可溶性差、无生物活性等问题，还可以完全杜绝动物病原菌的污染问题。

本发明的一个目的是提供了利用水稻储藏醇溶谷蛋白基因Gt13a的启动子和信号肽介导重组人血清白蛋白在胚乳细胞特异性表达并储存在水稻胚乳细胞的蛋白体内的方法，使重组人血清白蛋白不受细胞质内的蛋白酶攻击，从而在水稻胚乳内大量积累，最终获得较高的产量的表达技术。

本发明的第二个目的是将人血清白蛋白基因的遗传密码子转换为水稻偏爱的遗传密码子，从而提高了重组蛋白质的翻译水平，最终提高人血清白蛋白在水稻胚乳细胞的表达与积累。

本发明的第三个目的是提供了一个表达重组人血清白蛋白的新体系，该体系利用水稻或谷物胚乳细胞来生产重组人血清白蛋白。该体系不仅比转基因奶牛和鸡更安全、无病毒污染，而且容易规模化；比其他植物表达体系具有更高的产量和更低的生产成本。

本发明的第四个目的是提供了一个完善的水稻基因转化系统，该系统利用水稻的半胱氨酸蛋白酶B(Cysteine Proteinaseβ)基因的启动子，该启动子特异介导选择性标记基因在水稻愈伤组织表达，从而使选择效果大大地提高。同时避免使用非水稻的启动子而产生的其他不利环境的效应。

下面对本发明的方法进行详细描述：

水稻特异性启动子及信号肽的获得：为了获得较强的水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，根据蛋白组学的研究，发现水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的一个成员Gt13a基因在水稻胚乳细胞的蛋白质表达量为最高，推导这个基因成员具有较强的启动子活性。为了获得Gt13a启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gt13a(基因库登记号AP003256)合成了一对核苷酸引物用于PCR扩增(序列1、2)。为了便于基因克隆，在正向引物的5’端加入了一个HindIII的酶切位点，在反向引物的5’端加了一个NaeI的酶切位点。从任何水稻品种叶片中提取基因组DNA，以此DNA为模版，按照标准的PCR程序，利用上述引物扩增出了一个1284碱基的DNA片段。经DNA序列分析，此DNA片段具有明显的启动子结构。与Gt1启动子比较具有明显的差异，在AT含量明显高于现有的Gt1启动子和较长的核苷酸序列。

水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建：经PCR获得Gt13a启动子和信号肽的序列后，PCR产物经HindIII和NaeI消化后，将这个片段与经HindIII和NaeI消化的pBI221片段(美国克隆技术Clontech有限公司)连接，然后导入大肠杆菌品系DH10B，形成了含有Gt13a启动子、Gt13a信号肽和Nos终止子的水稻胚乳特异性表达的基本载体，并将这个载体质粒命名为pOsPMP1(见序列3)。

水稻遗传密码子优化的人血清白蛋白基因的基因合成与表达载体的构建：为了使重组人血清白蛋白在水稻胚乳获得较高的表达，必须使用水稻优化的遗传密码子，因而，从美国生物技术信息中心(NCBI)基因库里获得了成熟的人血清白蛋白基因(基因库登记号CAA01491)的氨基酸序列，由DNA分析软件马克载体MacVector(英国的阿克尔勒斯Accelrys公司产品)将人血清白蛋白基因的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，然后采用PCR延伸法，人工合成了人血清白蛋白基因(见序列4)。经密码子优化后的人血清白蛋白基因的核苷酸序列比原来的人血清白蛋白基因改变了25.5％，遗传密码改变了71.1％，但其氨基酸的序列不变(见表1)。

表1、密码子优化后的人血清白蛋白基因的比较

遗传密码总数	585
		改变遗传密码子数	416
改变遗传密码子百分比(％)	71.1
		脱氧核苷酸总数	1755
改变脱氧核苷酸数	447
		改变脱氧核苷酸百分比(％)	25.5
氨基酸序列改变(％)	0

在人工合成人血清白蛋白基因时，在基因合成的引物两端分别加上限制性内切酶MylI和XhoI位点，然后克隆到pUC19载体(美国的克隆技术Clontech有限公司)，产生了带有重组人血清白蛋白基因的载体pOsHSA；pOsHSA经限制性内切酶MylI和XhoI消化，在5’端产生了一个平齐末端和在3’末端产生了一个粘性末端，同时用NaeI和XhoI消化载体质粒pOsPMP1，也在5’端产生了一个平齐末端和在3’末端产生了一个粘性末端，经琼脂糖凝胶电泳分离，回收人血清白蛋白基因片段，将此重组人血清白蛋白基因的片断连接到经NaeI和XhoI消化的载体质粒pOsPMP1，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生水稻胚乳特异性表达重组人血清白蛋白基因的载体质粒pOsPMP2(图2和序列5)。

选择性标记基因载体的构建：为了使选择性标记基因在水稻愈伤组织内高效表达而提高选择效果，采用水稻半胱氨酸蛋白酶基因β(cysteineproteinaseβ，CP)的启动子介导选择性标记基因(抗潮霉素基因-潮霉素磷酸转移酶)在愈伤组织中表达。首先，合成了一对PCR引物(见序列6、7)，在PCR引物的两端加了HindIII和SmaI位点；以水稻基因组DNA为模版，采用标准PCR反应，扩增出一个长度为1103碱基含有启动子的片断，PCR产物经HindIII和SmaI消化后，该PCR片段与克隆载体pBI221(美国的克隆技术Clontech有限公司)连接，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生了中间质粒pOsPMP4。CP启动子序列经序列分析，具有明显的启动子特征和元件(序列10)。选择性标记基因采用潮霉素磷酸转移酶基因(Hygromycin β Phosphotransferas，Hpt)，该基因从质粒pCAMBIA1301(澳大利亚的哥仑比亚CAMBIA公司)扩增，在正向引物(见序列8、9)的5’末端加上了一个平末端限制性内切酶为位点SmaI，在反向引物的5’末端加上了一个粘性末端的限制性内切酶位点XhoI，以pCAMBIA1301质粒为模版，采用标准PCR反应，扩增出潮霉素磷酸转移酶基因片断，PCR产物用SmaI和XhoI消化，pOsPMP4 DNA用NaeI和XhoI消化，然后将潮霉素磷酸转移酶基因片断与具有CP启动子的pOsPMP4质粒经NaeI和XhoI消化的DNA片段连接，转化大肠杆菌菌系DH10B，最终产生了水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体，命名为pOsPMP5。

水稻基因遗传转化：水稻种子去壳后，在20％次氯酸钠中消毒20分钟，用灭菌水漂洗3次，然后在愈伤组织诱导培养基上诱导20-25天，诱导的愈伤组织转移到预处理培养基上生长9-10天后，用于遗传转化。将0.5微克的人血清白蛋白表达载体质粒pOsPMP2和具有选择性标记质粒pOsPMP5的DNA，与50微升的金粉、250微升的1M氯化钙和50微升的0.1M亚精胺混合后，反应30分钟，用酒精洗三次，将DNA包裹在金粉上，然后按照美国杜邦公司的基因枪方法，将两个质粒共转化到由中花11号产生的愈伤组织。在含有潮霉素B的选择培养基上经45天的筛选，具有潮霉素B抗性的愈伤组织在再生培养基上在光照下，经20天左右的诱导，愈伤组织分化成绿色的植株，然后将幼小植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成完整的植株，获得转基因植株，这些转基因植株经PCR检测，证明其含有人血清白蛋白基因后，转到试验田生长发育成成熟的种子，此为T1种子。

高表达转基因植株的筛选：转基因水稻经过4个月左右的生长和发育，抽穗开花后，经一个月的时间，形成成熟的转基因水稻种子。其中有50-60％的转基因植株正常结实。当T1种子收获后，利用蛋白质检测技术---酶联免疫(ELISA)药盒(美国的北索实验室Bethyl Laboratory)检测技术，首先，每株转基因取10粒种子，加10毫升的提取缓冲液(50mMTris，pH8.0，50mM NaCl，10mM EDTA)匀浆，在离心机上每分钟14000转，离心10分钟，上清液用人血清白蛋白ELISA定量药盒进行酶联免疫检测。经检测每粒种子的重组人血清白蛋白的表达水平在9.82-282.22微克之间。其中最高的一个转基因单株pPMP2-68的重组人血清白蛋白的表达量平均高达174.18微克。折合成每克水稻种子含有8.29mg重组人血清白蛋白，即占0.83％的种子干重。从T1种子中筛选表达人血清白蛋白高的转基因个体，经T1代的继续选择，形成稳定表达重组人血清白蛋白的转基因品系。供大面积生产植物来源的重组人血清白蛋白之用。

本发明是利用水稻胚乳作为生物反应器来生产可溶的、具有生物活性的重组人血清白蛋白，使其表达水平至少达到水稻种子重量的0.3％以上，即每公斤种子的人血清白蛋白产量达到3克以上，是叶绿体表达体系的最高量的12倍和马铃薯块茎表达体系的最高量的300倍。

本发明描述的利用谷物作物-水稻胚乳细胞作为生物反应器，用水稻种子来生产重组人血清白蛋白的方法与现有技术相比具有以下几个方面的优特点：1)、它具有高效地表达系统，植物细胞具有与人类和动物相同的蛋白质合成体系，具有高效的表达外源蛋白质的潜力。2)、它具有类似动物人类的蛋白质加工修饰系统；3)、它的产品安全可靠。由于植物种子如水稻、小麦和大麦等都是人类的主要食物、由它生产出的蛋白质产品绝对没有任何病源菌的污染、因此安全可靠；4)、生产成本极低，其生产成本分别是细菌和动物系统的1/20和1/200；5)、容易储存和加工。由于重组蛋白质储存在种子里，不需要像其他植物系统需要及时加工，也不需要特殊的储存设备和低温要求；6)、大批量生产极为容易。这项技术在形成稳定的转基因品种后，一旦需要，扩大种植面积即可，不需要增加任何工场设施。相反，细菌或者酵母  需要添置大量的场房和发酵设备；而动物系统的动物繁殖加代与育种极为困难。

将表达载体质粒的代号及其功能与用途对照如下：

pOsPMP1----水稻胚乳特异性表达的基本载体

pOsHSA-----带有重组人血清白蛋白基因的载体

pOsPMP2------水稻胚乳特异性表达重组人血清白蛋白基因的载体质粒

pOsPMP4-----中间质粒

pOsPMP5-----水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体

附图说明

图1、Gt13a启动子与信号肽的PCR扩增产物。箭头指示是PCR扩增的1284个碱基的核苷酸片断。泳道1为分子标记，泳道2为PCR产物，箭头所指是1284碱基的Gt13a的启动子序列。

图2、构建的水稻胚乳特异性表达的人血清白蛋白表达载体的限制性内切酶图谱。

图3、水稻愈伤组织特异性表达的选择性标记基因的限制性内切酶图谱。

图4、显示水稻胚乳中表达的重组人血清白蛋白的聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹法图谱。从转基因水稻胚乳中提取的重组人血清白蛋白，10粒转基因水稻种子用10毫升蛋白质提取缓冲液提取的重组人血清白蛋白。15微升点样在10％聚丙烯酰胺凝胶。然后经考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹法检测。图A为考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶图谱；图B为蛋白质印迹法图谱。箭头所指是人血清白蛋白在转基因胚乳中显而易见，但在对照样品台北309中缺少对应的蛋白质带。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述，但本实施方式不限制本发明的保护范围。

[实施例1]克隆Gt13a启动子和信号肽

为了从水稻基因组序列里克隆醇溶谷蛋白的Gt13a基因的启动子与信号肽，利用序列1的引物，采用标准的多聚酶链(PCR)反应，从台北309品种的基因组DNA中扩增到了1284碱基的DNA片段(图1)，扩增的片段经限制性内切酶NaeI和XhoI消化，克隆到载体质粒pBI221中，产生了水稻胚乳细胞特异性表达的表达载体pOsPMP1，经DNA序列分析，这个DNA片段具有明显的启动子特征和信号肽的序列(序列3)。

[实施例2]合成含有水稻遗传密码子的人血清白蛋白基因。

人血清白蛋白基因序列(基因库登记号为CAA01491)的氨基酸序列，使用DNA分析软件马克载体MacVector将人血清白蛋白基因转换成水稻遗传密码子的核苷酸序列，其修改后的人血清白蛋白基因的脱氧核苷酸序列改变了25.5％，遗传密码改变了71.1％，但其氨基酸序列完全相同。然后，根据密码子优化的脱氧核苷酸序列，采用PCR延伸法，人工合成了重组人血清白蛋白基因。在基因合成过程中，在基因两端加上了MylI和XhoI酶切位点，克隆到pUC19质粒载体，产生了含有水稻密码子优化的人血清白蛋白基因(pOsHSA)。

[实施例3]构建水稻特异性表达人血清白蛋白的载体。

pOsHSA质粒DNA用限制性内切酶MylI和XhoI消化，同时用NaeI和XhoI消化pOsPMP1质粒DNA，将人血清白蛋白基因与载体质粒pOsPMP1连接，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生表达载体质粒为pOsPMP2。其质粒的限制性内切酶图谱见图2。

[实施例4]克隆水稻半胱氨酸蛋白酶B(cysteine proteinase B)启动子。

采用PCR的方法从水稻基因组DNA克隆水稻半胱氨酸蛋白酶β基因的启动子，根据基因库的核苷酸序列设计了两个PCR引物，引物核苷酸序列见序列6、7，利用标准PCR反应，从水稻人工细菌染色体文库中，筛选到一个阳性克隆42M2。BAC克隆经XhoI消化后，一个5kb的片断Southern杂交证实含有半胱氨酸蛋白酶β基因的全DNA序列，以这个BAC克隆DNA为模板，用引物(见序列6、7)采用标准PCR反应，获得了一个1113碱基的DNA片段，将这个片段克隆到pBI221载体中，产生了一个中间载体(pOsPMP4)。

[实施例5]构建选择性标记基因载体。

pOsPMP4的DNA用NaeI和XhoI消化，应用引物(见序列8、9)，以pCAMBIA1301 DNA为模版，用标准PCR方法，扩增出的PCR片段经SmaI和XhoI消化，然后克隆到经NaeI和XhoI消化的pOsPMP4载体上，产生了水稻特异性表达的选择性标记载体pOsPMP5(图3)。

[实施例6]以基因枪介导的基因转化

水稻品种中花11号的种子，脱去谷壳后，经20％的次氯酸钠消毒20分钟，经无菌水漂洗3次，每次10分钟，然后放在愈伤组织诱导培养基上经20-30天的诱导，产生愈伤组织。将0.5微克的质粒pOsPMP2和0.5微克具有选择性标记质粒pOsPMP5的DNA，与50微升的金粉、250微升的1M氯化钙和50微升的0.1M亚精胺混合后，在室温下反应30分钟，用酒精洗三次，然后按照杜邦公司的基因枪方法，将包裹有两个质粒DNA金粉，共转化到从中花11号产生的愈伤组织的细胞中；在含有50微克/毫升的潮霉素B的选择培养基上经45天的筛选，继续生长的愈伤组织为抗潮霉素B的阳性愈伤组织，潮霉素B抗性的愈伤组织转移到再生培养基上，在光照下经20天左右的诱导，愈伤组织分化成绿色的小植株，然后将幼小植株转到生根培养基上，经15-20天的诱导，形成完整的植株，最后转到温室或试验田生长发育成成熟的种子。

[实施例7]筛选表达人血清白蛋白高的转基因植株。

转基因植株在温室或大田经生长与发育，然后开花结种子，形成转基因一代种子，当T1种子收获后，每株转基因植株取10粒种子，在提取缓冲溶液里(50mM Tris，pH 8.0，50mM NaCl，1mM EDTA)抽提蛋白质，经酶联免疫检测(ELISA)技术检测人血清白蛋白的表达量。其在转基因水稻品系的重组人血清白蛋白的表达水平总结(见表3)。

表3、不同转基因植株的表达重组人血清白蛋白的结果

转基因植株号	平均表达水平(微克/粒±标准误)	变化范围(微克/粒)	变异系数％(3-4重复)
				pPMP2-1	9.82±4.5	3.86-15.48	7.79
pPMP2-4	110.65±39.1	55.13-173.84	4.24
				pPMP2-6	9.38±6	2.62-18.56	13.14
pPMP2-18	165.92±62.7	69.03-282.22	3.58
				pPMP2-20	89.91±22.04	70.3-116.92	4.91
pPMP2-21	56.37±10.84	42.15-69.12	2.18
				pPMP2-23	1.36±0.19	10.6-1.57	21.95
pPMP2-26	67.29±19.53	37.72-105.11	4.4
				pPMP2-27	53.23±19.16	28.98-82.02	3.39
pPMP2-29	25.53±20.86	10.01-76.84	6.02
				pPMP2-31	29±11.2	19.52-42.87	5.62

pPMP2-43	56.06±24.6	22.52-83.69	5.7
				pPMP2-55	75.17±26.6	44.9-126.42	4.7
pPMP2-58	13.54±5.6	9.87-18.88	16.26
				pPMP2-62	71.36±25	39.25-123.47	3.74
pPMP2-64	16.92±2.2	15.37-18.47	4.43
				pPMP2-68	174.18±71.7	72.22-286.20	6.11
pPMP2-70	79.61±28.7	34.15-147.72	4.6

从T1种子中筛选表达重组人血清白蛋白最高的转基因个体。为了检验高效表达人血清白蛋白的转基因株系，不同转基因品系的T1代种子的粗提取液经SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳，考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹法检测，人血清白蛋白在聚丙烯凝胶中清晰可见，与阳性对照具有相同的分子量(图4)，在蛋白质印迹法中显示与考马斯亮蓝染色相同的带型，说明在转基因胚乳中的特异蛋白质带是人血清白蛋白。

有关核苷酸的序列

<110>杨代常

<120>利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白

<140>2005100190844

<141>2005-07-13

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

cccaagcttc aacctgctga gaagaacaac tgac                                 34

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

cggtgccggc tagagagcca ttgcacaaga g                                    31

<210>3

<211>1284

<212>DNA

<213>水稻

<400>3

tcacacctta tgtaaagtat ttgttgcaag aaaagtctaa gatgacagca acctgctgag     60

aagaacaact gacgatgtca taaggagagg gagcttttcg ataggtgccg tgcagttcaa    120

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ctcttgtgca atggctctct agcc                                           1284

<210>4

<211>1758

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

gacgcccaca agagcgaggt ggcccaccgc ttcaaggacc tcggcgagga gaacttcaag      60

gccctcgtgc tcatcgcctt cgcccagtac ctccagcagt gcccgttcga ggaccacgtg     120

aagctcgtga acgaggtgac cgagttcgcc aagacctgcg tggccgacga gagcgccgag     180

aactgcgaca agagcctcca caccctcttc ggcgacaagc tctgcaccgt ggccaccctc     240

cgcgagacct acggcgagat ggccgactgc tgcgccaagc aggagccgga gcgcaacgag     300

tgcttcctcc agcacaagga cgacaacccg aacctcccgc gcctcgtgcg cccggaggtg     360

gacgtgatgt gcaccgcctt ccacgacaac gaggagacct tcctcaagaa gtacctctac     420

gagatcgccc gccgccaccc gtacttctac gccccggagc tcctcttctt cgccaagcgc     480

tacaaggccg ccttcaccga gtgctgccag gccgccgaca aggccgcctg cctcctcccg     540

aagctcgacg agctccgcga cgagggcaag gcctccagcg ccaagcagcg cctcaagtgc     600

gccagcctcc agaagttcgg cgagcgcgcc ttcaaggcct gggccgtggc ccgcctcagc     660

cagcgcttcc cgaaggccga gttcgccgag gtgtccaagc tcgtgaccga cctcaccaag     720

gtgcacaccg agtgctgcca cggcgacctc ctggagtgcg ccgacgaccg cgccgacctc     780

gccaagtaca tctgcgagaa ccaggacagc atctccagca agctcaagga gtgctgcgag     840

aagccgctcc tggagaagtc ccactgcatc gccgaggtgg agaacgacga gatgccggcc     900

gacctcccgt ccctcgccgc cgacttcgtg gagagcaagg acgtgtgcaa gaactacgcc     960

gaggccaagg acgtcttcct cggcatgttc ctctacgagt acgcccgccg ccacccggac    1020

tactccgtgg tgctcctcct ccgcctcgcc aagacctacg agaccaccct ggagaagtgc    1080

tgcgccgccg ccgacccgca cgagtgctac gccaaggtgt tcgacgagtt caagccgctc    1140

gtggaggagc cgcagaacct catcaagcag aactgcgagc tcttcgagca gctcggcgag    1200

tacaagttcc agaacgccct cctcgtgcgc tacaccaaga aggtgccgca ggtgtccacc    1260

ccgaccctcg tggaggtgtc ccgcaacctc ggcaaggtgg gcagcaagtg ctgcaagcac    1320

ccggaggcca agcgcatgcc gtgcgccgag gactacctct ccgtggtgct caaccagctc    1380

tgcgtgctcc acgagaagac cccggtgagc gaccgcgtga ccaagtgctg caccgagagc    1440

ctcgtgaacc gccgcccgtg cttctccgcc ctggaggtcg acgagaccta cgtcccgaag    1500

gagttcaacg ccgagacctt caccttccac gccgacatct gcaccctctc cgagaaggag    1560

cgccagatca agaagcagac cgccctcgtc gagctcgtga agcacaagcc gaaggccacc    1620

aaggagcagc tcaaggccgt gatggacgac ttcgccgcct tcgtggagaa gtgctgcaag    1680

gccgacgaca aggagacctg cttcgccgag gagggcaaga agctcgtggc cgccagccag    1740

gccgccctcg gcctctga                                                  1758

<210>5

<211>5957

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

aagctttcac accttatgta aagtatttgt tgcaagaaaa gtctaagatg acagcaacct      60

gctgagaaga acaactgacg atgtcataag gagagggagc ttttcgatag gtgccgtgca     120

gttcaaagag ttagttagca gtaggatgaa gatttttgca catggcaatg agaagttaat     180

tatggtgtag gcaacccaaa tgaaacacca aaatatgcac aagacagttt gttgtattct     240

gtagtacaga ataaactaaa gtaatgaaag aagatggtgt tagaaaatga aacaatatta     300

tgagtaatgt gtgagcatta tgggaccacg aaataaaaaa agaacatttt tatgagcagt     360

gtgttctcaa tgagccttga atgttatcac ccaggataag aaacccttaa gcaatgaaac     420

atgcaagcgt ttaatgtgca aagttggcat tctccacgac ataatgcaaa agaagatata     480

atctatgaca tagcaagtca tgcatcattt catgcctctg tcaacctatt catttctagt     540

catctaggta agtatcttaa gctaaagtgt tagaacttcc catacataag tcataactga     600

tgacaattgg gtgtaacaca tgacaaacca gagagtcaag caagataaag caaaaggatg     660

tgtacataaa actacagagc tatatgtcat gttgcgaaaa gaggagagct tataagacaa     720

gccatgactc aaaaaaaatt cacatgccta ctgtggccca tatatcatgc aacaatccaa     780

aaactcacag gtctcggtgt tgatcgtgtc aacatgtgac caccctaaaa actcttcact     840

aaatattaaa gtattgctag aacagagctt caagatataa gtcatgatca ccaacaacca     900

tgttcaaaaa gaaatagaaa gctatggcac agcaacaaaa agcaaaagca tgcatggata     960

taatctttaa catcatccat gtcatattgc aaaagaaaga aagagagaac aatacaaatg    1020

atgtgtcaat tacacatcca tcattatcca tccaccttcc gtgtaccaca cttcatatat    1080

catgagtcac ttcatgtctg gacattaaca aactctatct taacattcaa atgcatgaga    1140

ctttatctca ctataaatgc acaatgattt agcattgttt ctcacaaaac cattcaagtt    1200

cattagtact acaacaacat ggcatccata aatcgcccca tagttttctt cacagtttgc    1260

ttgttcctct tgtgcaatgg ctctctagcc gacgcccaca agagcgaggt ggcccaccgc    1320

ttcaaggacc tcggcgagga gaacttcaag gccctcgtgc tcatcgcctt cgcccagtac    1380

ctccagcagt gcccgttcga ggaccacgtg aagctcgtga acgaggtgac cgagttcgcc    1440

aagacctgcg tggccgacga gagcgccgag aactgcgaca agagcctcca caccctcttc    1500

ggcgacaagc tctgcaccgt ggccaccctc cgcgagacct acggcgagat ggccgactgc    1560

tgcgccaagc aggagccgga gcgcaacgag tgcttcctcc agcacaagga cgacaacccg    1620

aacctcccgc gcctcgtgcg cccggaggtg gacgtgatgt gcaccgcctt ccacgacaac    1680

gaggagacct tcctcaagaa gtacctctac gagatcgccc gccgccaccc gtacttctac    1740

gccccggagc tcctcttctt cgccaagcgc tacaaggccg ccttcaccga gtgctgccag    1800

gccgccgaca aggccgcctg cctcctcccg aagctcgacg agctccgcga cgagggcaag    1860

gcctccagcg ccaagcagcg cctcaagtgc gccagcctcc agaagttcgg cgagcgcgcc    1920

ttcaaggcct gggccgtggc ccgcctcagc cagcgcttcc cgaaggccga gttcgccgag    1980

gtgtccaagc tcgtgaccga cctcaccaag gtgcacaccg agtgctgcca cggcgacctc    2040

ctggagtgcg ccgacgaccg cgccgacctc gccaagtaca tctgcgagaa ccaggacagc    2100

atctccagca agctcaagga gtgctgcgag aagccgctcc tggagaagtc ccactgcatc    2160

gccgaggtgg agaacgacga gatgccggcc gacctcccgt ccctcgccgc cgacttcgtg    2220

gagagcaagg acgtgtgcaa gaactacgcc gaggccaagg acgtcttcct cggcatgttc    2280

ctctacgagt acgcccgccg ccacccggac tactccgtgg tgctcctcct ccgcctcgcc    2340

aagacctacg agaccaccct ggagaagtgc tgcgccgccg ccgacccgca cgagtgctac    2400

gccaaggtgt tcgacgagtt caagccgctc gtggaggagc cgcagaacct catcaagcag    2460

aactgcgagc tcttcgagca gctcggcgag tacaagttcc agaacgccct cctcgtgcgc    2520

tacaccaaga aggtgccgca ggtgtccacc ccgaccctcg tggaggtgtc ccgcaacctc    2580

ggcaaggtgg gcagcaagtg ctgcaagcac ccggaggcca agcgcatgcc gtgcgccgag    2640

gactacctct ccgtggtgct caaccagctc tgcgtgctcc acgagaagac cccggtgagc    2700

gaccgcgtga ccaagtgctg caccgagagc ctcgtgaacc gccgcccgtg cttctccgcc    2760

ctggaggtcg acgagaccta cgtcccgaag gagttcaacg ccgagacctt caccttccac    2820

gccgacatct gcaccctctc cgagaaggag cgccagatca agaagcagac cgccctcgtc    2880

gagctcgtga agcacaagcc gaaggccacc aaggagcagc tcaaggccgt gatggacgac    2940

ttcgccgcct tcgtggagaa gtgctgcaag gccgacgaca aggagacctg cttcgccgag    3000

gagggcaaga agctcgtggc cgccagccag gccgccctcg gcctctgact cgagctcgaa    3060

tttccccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg    3120

tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat    3180

gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat    3240

ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt    3300

gtcatctatg ttactagatc gggaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg    3360

aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc    3420

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg    3480

aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat    3540

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc    3600

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag    3660

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg    3720

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg    3780

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat    3840

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc    3900

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct    3960

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag    4020

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta    4080

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc    4140

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca    4200

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg    4260

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg    4320

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca    4380

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa    4440

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa    4500

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata    4560

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat    4620

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc    4680

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata    4740

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt    4800

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga    4860

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag    4920

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa    4980

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag    5040

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg    5100

tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat    5160

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta    5220

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg    5280

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc    5340

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa    5400

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc    5460

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt    5520

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct    5580

tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc    5640

gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg    5700

agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt    5760

ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc    5820

gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc    5880

ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct    5940

atgaccatga ttacgcc                                                   5957

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

cgccaagctt gcatgcctgc agcca                                           25

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

ccatgccggc gacgtggaga cgagc                                           25

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

aaagtactat gaaaaagcct gaactcaccg cga                                  33

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat ccggt                                35

<210>10

<211>1135

<212>DNA

<213>水稻

<400>10

aagcttgcat gcctgcagcc aggcttcatc ctaaccatta caggcaagat gttgtatgaa     60

gaagggcgaa catgcagatt gttaaactga cacgtgatgg acaagaatga ccgattggtg    120

accggtctga caatggtcat gtcgtcagca gacagccatc tcccacgtcg cgcctgcttc    180

cggtgaaagt ggaggtaggt atgggccgtc ccgtcagaag gtgattcgga tggcagcgat    240

acaaatctcc gtccattaat gaagagaagt caagttgaaa gaaagggagg gagagatggt    300

gcatgtggga tccccttggg atataaaagg aggaccttgc ccacttagaa aggagaggag    360

aaagcaatcc cagaagaatc gggggctgac tggcactttg tagcttcttc atacgcgaat    420

ccaccaaaac acaggagtag ggtattacgc ttctcagcgg cccgaacctg tatacatcgc    480

ccgtgtcttg tgtgtttccg ctcttgcgaa ccttccacag attgggagct tagaacctca    540

cccagggccc ccggccgaac tggcaaaggg gggcctgcgc ggtctcccgg tgaggagccc    600

cacgctccgt cagttctaaa ttacccgatg agaaagggag gggggggggg gaaatctgcc    660

ttgtttattt acgatccaac ggatttggtc gacaccgatg aggtgtctta ccagttacca    720

cgagctagat tatagtacta attacttgag gattcggttc ctaatttttt acccgatcga    780

cttcgccatg gaaaattttt tattcggggg agaatatcca ccctgtttcg ctcctaatta    840

agataggaat tgttacgatt agcaacctaa ttcagatcag aattgttagt tagcggcgtt    900

ggatccctca cctcatccca tcccaattcc caaacccaaa ctcctcttcc agtcgccgac    960

ccaaacacgc atccgccgcc tataaatccc acccgcatcg agcctatcaa gcccaaaaaa   1020

ccacaaacca aacgaagaag gaaaaaaaaa ggaggaaaag aaaagaggag gaaagcgaag   1080

aggttggaga gagacgctcg tctccacgtc gccggccccg gcggggtggt cagtc        1135

Claims (7)

1、用于介导重组人血清白蛋白在转基因水稻胚乳细胞中表达的水稻储藏蛋白的Gt13a启动子和信号肽的核苷酸，如序列3所示。

2、包括权利要求1所述Gt13a启动子和信号肽的命名为pOsPMP1的水稻胚乳特异性表达载体Gt13a-sp-HSA-Nos的核苷酸，如序列5所示。

3、一种利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白的方法，其步骤如下：

(1)水稻特异性启动子及信号肽的获得：用PCR反应获得含有水稻胚乳特异性表达的Gt13a启动子和信号肽的如序列3所示的长度为1284碱基的DNA片段；

(2)水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建：将以上所述的长度为1284碱基的DNA片段克隆到pBI221载体，形成中间质粒，然后导入大肠杆菌品系DH10B，构建了水稻胚乳细胞特异性表达的基本载体新体系，命名为pOsPMP1；

(3)水稻遗传密码子优化的人血清白蛋白基因合成与表达载体的构建：从基因库里获得人血清白蛋白基因的氨基酸序列，由DNA分析软件将人血清白蛋白基因的氨基酸序列转换成含有优化的水稻遗传密码子的核苷酸序列，然后采用PCR延伸法，人工合成重组人血清白蛋白基因，克隆到pUC19载体，形成pOsHSA；然后将重组人血清白蛋白基因连接到水稻胚乳表达载体pOsPMP1，产生水稻胚乳特异性表达重组人血清白蛋白基因的载体质粒pOsPMP2；

(4)水稻组织特异性表达的选择性标记基因载体的构建：用CP启动子构建水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体，命名为pOsPMP5；首先以水稻基因组DNA为模板，用序列6、7扩增出一个长度为1103碱基的CP启动子的片断，上述PCR片段与克隆载体pBI221连接，产生了中间质粒pOsPMP4；采用标准PCR反应，扩增出选择性标记基因潮霉素磷酸转移酶基因片断，然后将潮霉素磷酸转移酶基因片断与具有CP启动子的中间质粒连接，最终产生了水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体，命名为pOsPMP5；

(5)进行水稻基因遗传转化：将一定数量的表达人血清白蛋白基因的载体质粒pOsPMP2和具有选择性标记的表达质粒pOsPMP5的DNA，以基因枪的方法共转化到由水稻品种产生的愈伤组织，通过选择-培养-筛选-诱导，形成完整的植株。

4、根据权利要求3所述的方法，水稻特异性启动子及信号肽的获得的优选方法是：采用如序列1、2所示的引物，采用标准的多聚酶链反应即PCR，从台北309品种的基因组DNA中扩增到含有水稻胚乳特异性表达的Gt13a启动子和信号肽的如序列3所示的长度为1284碱基的DNA片段。

5、根据权利要求3所述的方法，水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建优选方法是：获得含有Gt13a启动子和信号肽的序列后，将这个片段与经HindIII和NaeI消化的pBI221片段连接，然后导入大肠杆菌品系DH10B，形成含有Gt13a启动子、Gt13a信号肽和Nos终止子的水稻胚乳特异性表达的基本载体pOsPMP1。

6、根据权利要求3所述的方法，获得水稻胚乳特异性表达重组人血清白蛋白基因的载体质粒pOsPMP2的方法是：将带有重组人血清白蛋白基因的载体pOsHSA经限制性内切酶消化，在5’端产生一个平齐末端和在3’末端产生一个粘性末端，同时用NaeI和XhoI消化载体质粒pOsPMP1，也在5’端产生一个平齐末端和在3’末端产生一个粘性末端，经琼脂糖凝胶电泳分离，回收上述带有重组人血清白蛋白基因的片段，将此重组人血清白蛋白基因的片断连接到经NaeI和XhoI消化的载体质粒pOsPMP1，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生水稻胚乳特异性表达重组人血清白蛋白基因的载体质粒pOsPMP2。

7、根据权利要求3所述的方法，用CP启动子构建命名为pOsPMP5的水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体的优选方法是：合成的一对PCR引物如序列6、7所示，在PCR引物的两端加了HindIII和SmaI位点；以水稻品种台北309的基因组DNA为模版，采用标准的PCR反应，扩增出一个长度为1103碱基含有启动子的片断；PCR产物经HindIII和SmaI消化后，该PCR片段与克隆载体pBI221连接，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生了中间质粒pOsPMP4；将潮霉素磷酸转移酶基因片断与具有CP启动子的pOsPMP4质粒经NaeI和XhoI消化的DNA片段连接，转化大肠杆菌菌系DH10B，最终产生了水稻组织特异性表达的选择性标记的表达载体，命名为pOsPMP5。

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