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CN100516043C - 多肽和生物合成途径 - Google Patents

多肽和生物合成途径 Download PDF

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CN100516043C CNB038121484A CN03812148A CN100516043C CN 100516043 C CN100516043 C CN 100516043C CN B038121484 A CNB038121484 A CN B038121484A CN 03812148 A CN03812148 A CN 03812148A CN 100516043 C CN100516043 C CN 100516043C
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Abstract

提供的方法和组合物可用于从葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中产生monatin。还公开了用于产生吲哚-3-丙酮酸和2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中间物的方法。提供的组合物包括核酸分子、多肽、化学结构和细胞。方法包括体外和体内方法，体外方法包括化学反应。

Description

多肽和生物合成途径
相关申请的相互参照
此专利申请要求2002年4月23日提交的美国专利申请60/374,831的优先权。
领域
此说明书提供的多肽和生物合成途径用于生成吲哚-3-丙酮酸、2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)和/或莫纳甜(monatin)。
背景
吲哚丙酮酸
吲哚-3-丙酮酸是强抗氧化剂，它被认为在具有高氧浓度的组织中抵消氧化应激(Politi等《色氨酸研究的最新进展》(Recent advances in TryptophanResearch)，G.A.Filippini等主编.Plenum Press，New York，1996，291-8页)。吲哚丙酮酸也是生成吲哚-乙酸(IAA)途径中的中间物，IAA是主要的植物生长激素生长素(可扩散生长促进因子)。在生理过程范围中亚微克量的IAA有活性，包括顶端优势、向性、枝条伸长、诱导形成的层细胞分裂和发根。合成的生长素用于园艺以诱导生根和促进果实的种植和发育。高浓度的合成生长素是抗阔叶植物的有效除草剂。认为发酵产生的天然生长素比化学生成的除草剂对环境更有利。生长调节物在1999年的全球销售额为4亿磅(14亿美元)。
有关吲哚乙酸和其衍生物的一些专利的例子包括：美国专利号5,843,782玫瑰植物的微繁殖、用于培养基的生长素和美国专利号5,952,231玫瑰植物的微繁殖。
除了植物相关的应用之外，吲哚乙酸用于药物应用。例如，美国专利号5,173,497《制备α-氧吡咯并[2，3-B]吲哚乙酸和衍生物的方法》建议这些化合物用于治疗记忆损伤，如与阿尔茨海默氏病和老年性痴呆相关的疾病。美国专利号5,173,497中提出的机制是这些化合物抑制多肽乙酰胆碱酯酶且增加脑中的乙酰胆碱水平。
吲哚-3-甲醇通过过氧化物酶催化的氧化从吲哚-3-乙酸中生成，并易转变成二吲哚甲烷。报导这2种化合物去除毒素且促进生成有益女性健康的激素。
色氨酸衍生物
氯化D-色氨酸鉴定为非营养甜味剂，寻求其它衍生物的兴趣也日益增加。Monatin是天然甜味剂，其组成类似氨基酸色氨酸。它能提取自南非灌木硬壳冬青(Sclerochiton ilicifolius)的根树皮，有希望作为食物和饮料业的高强度甜味剂。有关monatin的一些专利的例子包括：美国专利号5994559合成monatin一种高强度天然甜味剂、美国专利号4975298 3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁基-4-基)-吲哚化合物、美国专利号5128164用于人消耗的含3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁基-4-基)-吲哚化合物的组合物；美国专利号5128482生成3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁基-4-基)-吲哚的方法。
这里所述的monatin的一些前体也能用作合成甜味剂或monatin衍生物合成中的中间物。
概要
说明书提供一些生物合成途径用于从葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸和/或通过monatin前体如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中产生monatin。公开了多肽和核酸序列可用于产生monatin、吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸。
Monatin可通过吲哚-3-丙酮酸、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(monatin前体，MP，monatin的α酮式)、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖(图1)生成。公开了生成或制备monatin或图1-3和11-13所示其中间物的方法，包括将底物转变成第一种产物，随后使第一种产物转变成第2种产物，等等，直到产生所需终产物。
图1-3和11-13以框显示潜在的中间产物和终产物。例如，从一种产物到另一种产物的转变能用这些方法进行，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到MP、MP到monatin或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。这些转变可用化学方法或生物学方法促进。术语“转变”指在将第一种中间物转变成第2种中间物的反应中使用化学方法或多肽。术语“化学转变”指不由多肽活性促进的反应。术语“生物转变”指由多肽活性促进的反应。转变可体内或体外发生。当使用生物转变时，多肽和/或细胞能固定于支持物如化学附着于聚合物支持物。转变可用本领域普通技术人员已知的任何反应器完成，例如在分批或连续反应器中。
提供的方法包括使第一种多肽接触底物并产生第一种产物，随后使生成的第一种产物接触第2种多肽并产生第2种产物，然后使生成的第2种产物接触第3种多肽并产生第3种产物，例如monatin。使用的多肽和生成的产物示于图1-3和11-13。
公开了多肽和其编码序列，它们能用于进行图1-3和11-13所示的转变。在一些例子中，具有1个或多个点突变的多肽用于产生monatin，点突变可修饰底物特异性和/或多肽活性。
公开了生成monatin的分离和重组细胞。这些细胞可以是任何细胞，如植物、动物、细菌、酵母、藻类、古菌或真菌细胞。
在一个特定例子中，揭示的细胞包括一种或多种下列活性，例如2种或3种或多种下列活性：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC号，Hadar等，J.Bacteriol 125：1096-1104，1976和Furuya等，BiosciBiotechnol Biochem 64：1486-93，2000)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(EC 4.1.2.-)、D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》(Proceedings of 8th International Symposium on VitaminB6 and Carbonyl Catalysis)，Osaka，Japan 1990)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)和/或谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)。
在另一个例子中，细胞包括一种或多种下列活性，例如2种或多种或者3种或多种下列活性：吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-色氨酸转氨酶和/或D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。
此外，揭示的细胞可包括一种或多种下列活性，例如2种或多种或者3种或多种下列活性：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC号)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.11 1)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)和/或D-色氨酸转氨酶。
能生成Monatin的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接触第一种多肽，其中第一种多肽将色氨酸和/或吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸可用作转变成吲哚-3-丙酮酸的底物；本领域技术人员理解选择用于此步骤的多肽理想地表现出适当特异性)，所得吲哚-3-丙酮酸接触第2种多肽，其中第2种多肽将吲哚-3-丙酮酸转变成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)，MP接触第3种多肽，其中第3种多肽将MP转变成monatin。能用于这些转变的示范多肽示于图2和3。
发明的另一方面提供组合物如MP、含至少2种多肽或者有时至少3种或至少4种多肽的细胞，多肽在至少一种外源核酸序列中编码。
说明书的这些和其它方面通过下列详细描述和说明性例子是显而易见的。
附图的概述
图1显示用于生成monatin和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径。一种途径经色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一种经吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。随后经2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)生成Monatin。
框中所示化合物是生物合成途径中生成的底物和产物。
与箭头相邻的组合物是辅因子或可在底物转变成产物期间使用的反应物。所用辅因子或反应物取决于生物合成途径的特定步骤使用的多肽。辅因子PLP(吡哆醛5’-磷酸)能催化不取决于多肽的反应，因此仅提供PLP可从底物进行到产物。
图2是使用MP中间物的生物合成途径的更详细图。途径中各步骤的底物以框显示。允许底物间转变的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其普通名称和酶分类(EC)号描述。
图3显示将吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径的更详细图。底物以框显示，允许底物间转变的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其普通名称和酶分类(EC)号描述。
图4显示一种经化学方法产生MP的可能反应。
图5A和5B是色谱图，显示LC/MS鉴定的酶法生成的monatin。
图6是酶法合成monatin的电喷射质谱。
图7A和7B显示LC/MS/MS子离子分析酶混合物中生成的monatin的色谱图。
图8是色谱图，显示酶法生成monatin的高分辨质谱测量。
图9A-9C是色谱图，显示(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸和(C)酶法生成monatin的手性分离。
图10是柱状图，显示IPTG诱导后细菌细胞中生成的相对monatin量。(-)表示缺乏底物加入(不加入色氨酸或丙酮酸盐)。
图11-12是示意图，显示用于增加monatin产量的途径，monatin产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
图13是示意图，显示能用于增加monatin产量的途径，monatin产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
序列列表
所附序列列表中列出的核酸和氨基酸序列用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的3字母密码显示。仅显示各核酸序列的一条链，但通过参考所示链认为包括互补链。
SEQ ID NOS：1和2分别显示来自苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的转氨酶的核酸和氨基酸序列(tatA基因，文献中称为酪氨酸或芳族转氨酶)。
SEQ ID NOS：3和4分别显示来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(2.4.1)的酪氨酸转氨酶的核酸和氨基酸序列(与通过基因组软件预测为“天冬氨酸转氨酶”的tatA(SEQ ID NOS：1和2)同源)。
SEQ ID NOS：5和6分别显示来自类球红细菌(35053)的转氨酶的核酸和氨基酸序列(新的，在2.4.1序列SEQ ID NOS 3和4基础上克隆)。
SEQ ID NOS：7和8分别显示来自硕大利什曼原虫(Leishmania major)的广底物转氨酶(bsat)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS：9和10分别显示来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的芳族转氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS：11和12分别显示来自嗜淀粉乳杆菌(L.amylovorus)的芳族转氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列(经同源性鉴定为芳族转氨酶)。
SEQ ID NOS：13和14分别显示来自类球红细菌(35053)的多底物转氨酶(msa)的核酸和氨基酸序列(通过与登录号AAAE01000093.1，bp 14743-16155和登录号ZP00005082.1的同源性鉴定为多底物转氨酶)。
SEQ ID NOS：15和16显示用于克隆枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat)序列的引物。
SEQ ID NOS：17和18显示用于克隆苜蓿根瘤菌tatA序列的引物。
SEQ ID NOS：19和20显示用于克隆枯草芽孢杆菌araT转氨酶序列的引物。
SEQ ID NOS：21和22显示用于克隆类球红细菌(2.4.1和35053)多底物转氨酶序列的引物。
SEQ ID NOS：23和24显示用于克隆硕大利什曼原虫bsat序列的引物。
SEQ ID NOS：25和26显示用于克隆嗜淀粉乳杆菌araT序列的引物。
SEQ ID NOS：27和28显示用于克隆类球红细菌tatA序列(2.4.1和35053)的引物。
SEQ ID NOS：29和30显示用于克隆大肠杆菌(E.coli)aspC序列(基因序列Genbank登录号：AE000195.1，蛋白序列Genbank登录号：AAC74014.1)的引物。
SEQ ID NOS：31和32分别显示来自大肠杆菌的芳族转氨酶(tyrB)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS：33和34显示用于克隆大肠杆菌tyrB序列的引物。
SEQ ID NOS：35-40显示用于克隆多肽的引物，多肽具有4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(KHG)(EC 4.1.3.16)活性。
SEQ ID NOS：41和42显示的核酸序列分别来自大肠杆菌的色氨酸酶(tna)和来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的酪氨酸酚-裂合酶(tpl)，它们编码蛋白P00913(GI：401195)和P31013(GI：401201)。
SEQ ID NOS：43-46显示用于克隆色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶(酪氨酸酚-裂合酶)多肽的引物。
SEQ ID NOS：47-54显示用于突变色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶多肽的引物。
SEQ ID NOS：55-64显示用于克隆多肽的引物，多肽具有4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)活性。
SEQ ID NOS：65和66分别显示来自睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)的4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(proA)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS：67-68显示引物，用于克隆操纵子中睾丸酮丛毛单胞菌4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(proA)，操纵子具有pET30 Xa/LIC中的大肠杆菌aspC。
SEQ ID NOS：69-72显示用于克隆大肠杆菌aspC和pESC-his中睾丸酮丛毛单胞菌proA的引物。
SEQ ID NOS：73-74显示加入引物的5’末端的序列，用于克隆本文所示基因。
一些实施方案的详细描述
缩写和术语
提供下列术语和方法的解释以更好地描述本说明书并指导本领域普通技术人员实践本发明。如本文所用，“包含”指“包括”且单数形式“a”、“an”或“the”包括复数参考物，除非上下文另有明确规定。例如，提到“包含蛋白”，包括一种或多种这类蛋白，提到“包含细胞”，包括1个或多个细胞和本领域技术人员已知的其等价物等。
除非另有解释，本文所用全部技术和科学术语与此说明书所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。尽管与本文所述类似或相等的方法和材料能用于实践或测试本发明，适当方法和材料描述于下。材料、方法和例子仅用于阐明且不想限制。说明书的其它特征和优点从下列详细描述和权利要求中是显而易见的。
cDNA(互补DNA)：缺乏内部、非编码区段(内含子)和决定转录的调节序列的DNA片段。能通过反转录从提取自细胞的信使RNA在实验室中合成的cDNA。
保守取代：1个或多个氨基酸取代(例如2、5或10个残基)具有类似生化性质的氨基酸残基。通常，保守取代对所得多肽活性的影响小或没有。例如，包括1个或多个保守取代的色氨酸转氨酶多肽理想地保持色氨酸转氨酶活性。可通过操作编码所用多肽的核苷酸序列生成含1个或多个保守取代的多肽，例如标准方法如定点诱变或PCR。
取代变体中去除至少氨基酸序列中的1个残基且此位置中插入1个不同残基。可取代蛋白中原始氨基酸并认为是保守取代的氨基酸例子包括：丝氨酸或苏氨酸取代丙氨酸；谷氨酰胺、组氨酸或赖氨酸取代精氨酸；谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸天冬氨酸、取代天冬酰胺；天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺取代天冬氨酸；丝氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸；天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷氨酰胺；天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或天冬氨酸取代谷氨酸；脯氨酸取代甘氨酸；天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、酪氨酸取代组氨酸；亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代异亮氨酸；异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代亮氨酸；天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸取代赖氨酸；异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代甲硫氨酸；色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸；苏氨酸、丙氨酸取代丝氨酸；丝氨酸或丙氨酸取代苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸取代色氨酸；组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸；甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸取代缬氨酸。
关于保守取代的进一步信息可发现于Ben-Bassat等，(J.Bacteriol.169：751-7，1987)、O’Regan等，(Gene 77：237-51，1989)、Sahin-Toth等，(Protein Sci.3：240-7，1994)、Hochuli等，(Bio/Technology 6：1321-5，1998)、WO 00/67796(Curd等)和遗传学与分子生物学的标准课本。
外源：如本文所用，关于核酸和特定细胞的术语“外源”指不是在自然界中发现那样起源自特定细胞的任何核酸。因此，认为非天然产生的核酸一旦导入细胞，它对细胞是外源的。天然产生的核酸也可对特定细胞外源。例如，一旦染色体导入Y的细胞，分离自人X的细胞的完整染色体对于人Y的细胞是外源性核酸。
功能相等：具有相同功能。在酶方面，功能相等分子包括保持酶功能的不同分子。例如，可通过酶序列中的序列改变提供功能等价物，其中有1个或多个序列改变的肽保持未改变肽的功能，从而它保留其酶活性。在一个特定例子中，色氨酸转氨酶功能等价物保持使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸的能力。
序列改变的例子包括但不限于保守取代、缺失、突变、移码和插入。在一个例子中，特定多肽结合抗体，功能等价物是结合相同抗体的多肽。因此，功能等价物包括具有结合特异性与多肽相同的肽，且能用作取代多肽的试剂。在一个例子中，功能等价物包括多肽，其中结合序列不连续，抗体结合线性抗原表位。因而，如果肽序列是MPELANDLGL(SEQ ID NO：12的氨基酸1-10)，功能等价物包括不连续抗原表位，可表示如下(**＝任何数量的间插氨基酸)：NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH。在此例子中，如果多肽的3维结构能使它结合单克隆抗体，此抗体结合SEQ ID NO：12的氨基酸1-10，则多肽与SEQ ID NO：12的氨基酸1-10功能相等。
杂交：如本文所用，术语“杂交”指测试2种核酸分子的核苷酸序列中互补性的方法，以互补单链DNA和/或RNA形成双链分子的能力为基础。核酸杂交技术能用于在本发明范围内获得分离的核酸。简要地，与SEQ ID NO：11所列序列有一些同源性的任何核酸可用作探针以通过在中等到高度严格的条件下杂交来鉴定类似核酸。一旦鉴定，随后可纯化核酸、测序并分析以确定它是否在本发明的范围内。
杂交能分别通过Southern或Northern分析进行以鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。标记探针可用生物素、洋地黄毒苷、多肽或放射性同位素如32P。待分析的DNA或RNA可在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，转至硝化纤维、尼龙或其它合适的膜，用本领域熟知的标准技术与探针杂交，如Sambrook等，(1989)《分子克隆》(Molecular Cloning)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY的7.39-7.52部分所述。通常，探针至少约20个核苷酸长度。例如，对应于SEQ ID NO：11所列20个连续核苷酸序列的探针能用于鉴定相同或类似核酸。此外，能使用比20个核苷酸长或短的探针。
本发明也提供至少约12个碱基长度(如至少约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基长度)的分离的核酸序列并在杂交条件下与有SEQ ID NO：11所列序列的核酸的有义或反义链杂交。杂交条件可以是中等或高度严格的杂交条件。
为了本发明目的，中等严格的杂交条件指杂交在杂交溶液中约42℃进行，溶液含25mM KPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart溶液、50μg/ml变性、超声处理的鲑精DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(约5×107cpm/μg)，而洗涤在约50℃进行，洗涤液含2 X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠。
高度严格的杂交条件指杂交在杂交溶液中约42℃进行，溶液含25mMKPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart溶液、50μg/ml变性、超声处理的鲑精DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(约5×107cpm/μg)，而洗涤在约65℃进行，洗涤液含0.2 X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠。
分离：如本文所用，关于核酸的术语“分离”指天然产生的核酸，它与生物体的天然产生基因组中直接毗连的序列(一个在5’末端且一个在3’末端)不直接毗连，它来源于此生物体。例如，分离的核酸可无限制地是任意长度的重组DNA分子，只要去除或缺少一种核酸序列，通常在天然产生的基因组中发现这些序列在重组DNA分子侧翼。因此，分离的核酸无限制地包括作为单独分子(如通过PCR或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在且不取决于其它序列的重组DNA以及掺入载体、自主复制质粒、病毒(如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或者掺原核或真核生物基因组DNA的重组DNA。此外，分离的核酸可包括是部分杂合或融合核酸序列的重组DNA分子。
如本文所用，关于核酸的术语“分离”也包括任何非天然产生的核酸，因为非天然产生的核酸序列不在自然界中发现且没有天然产生的基因组中的直接毗连序列。例如，非天然产生的核酸如认为工程核酸是分离的核酸。工程核酸能用普通分子克隆或化学核酸合成技术产生。分离的非天然产生的核酸可不取决于其它序列，或掺入载体、自主复制质粒、病毒(如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或者原核或真核生物的基因组DNA。此外，非天然产生的核酸可包括是部分杂合或融合核酸序列的核酸分子。
本领域技术人员明白在百到百万的其它核酸分子中存在的核酸不认为是分离的核酸，这些核酸分子在例如cDNA或基因组文库或者含基因组DNA限制酶切消化的凝胶切片内。
核酸：如本文所用，术语“核酸”涵盖RNA和DNA，无限制地包括cDNA、基因组DNA和合成(如化学合成)DNA。核酸可以是双链或单链。当单链时，核酸可以是有义链或反义链。上外，核酸可以是环形或线性。
可操作连接：当第一种核酸序列以与第2种核酸序列的功能性关系放置时，第一种核酸序列“可操作连接”第2种核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录，启动子可操作连接编码序列。一般，可操作连接的DNA序列是连续的，在相同读框中有必要连接2个多肽编码区。
多肽修饰：本发明包括酶以及其合成的实施方案。此外，具有所需酶活性的类似物(非肽有机分子)、衍生物(化学功能性肽分子，以所示肽序列起始获得)和变体(同系物)能用于本文所述方法。本文所示肽包括氨基酸序列，氨基酸可以是L-和/或D-氨基酸，天然产生的或其它。
肽能通过多种化学技术修饰以产生衍生物，衍生物有与未修饰肽本质上相同的活性且任选有其它所需性质。例如，蛋白的羧酸基团无论是羧基末端或侧链，可以药学上可接受阳离子的盐形式提供或酯化以形成C1-C16酯，或者转变成公式NR1NR2的酰胺，其中R1和R2各是独立的H或C1-C16烷基，或者结合以形成杂环如5-或6-元环。肽的氨基无论是氨基末端或侧链，可以药学上可接受的酸加成盐形式提供如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸和其它有机盐，或可修饰成C1-C16烷基或二烷基氨基或者进一步转变成酰胺。
肽侧链的羟基可用公认的技术转变成C1-C16烷氧基或转变成C1-C16酯。肽侧链的苯基和酚环可用1个或多个卤原子取代如F、Cl、Br或I，或者用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯或者这种羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基可延伸到同源的C2-C4亚烃基。硫醇可用一些公认保护基团的任何一种保护，如乙酰胺基团。本领域技术人员也认可将环状结构导入本发明肽的方法，用于选择和提供构象约束给结构，导致稳定性提高。例如，C-或N-末端半胱氨酸可加入肽中，这样肽在氧化时包含二硫键，产生环状肽。其它肽环化方法包括形成硫醚及羧基和氨基末端酰胺和酯。
肽模拟物和有机模拟物实施方案也在本发明的范围内，其中这类肽和有机模拟物的化学组分的三维排列模拟肽主链和组成氨基酸侧链的三维排列，产生本发明蛋白的这种肽和有机模拟物，它们有可检测酶活性。对于计算机模型应用，药效团是生物活性的结构要求的、理想的三维定义。能用目前的计算模型软件(使用计算机辅助的药物设计或CADD)设计肽和有机模拟物符合各药效团。参见Walters，“计算机辅助的药物模型”(Computer-Assisted Modeling of Drugs)，Klegerman和Groves(主编)，《制药生物技术》(Pharmaceutical Biotechnology)，1993，InterpharmPress：Buffalo Grove，IL，165-74页和102章，Munson(主编)，《药理学原理》(Principlesof Pharmacology)，1995，Chapman&Hall，描述用于CADD的技术。本发明范围也包括用这些技术制备的模拟物。在一个例子中，模拟物模拟酶或者其变体、片段或融合产生的酶活性。
探针和引物：核酸探针和引物可在本文提供的氨基酸序列和核酸序列基础上容易制备。“探针”包括分离的核酸，核酸含可检测标记或报道分子。示范标记包括但不限于放射性同位素、配基、化学发光剂和多肽。标记方法和选择适于不同目的的标记指南讨论于例如Sambrook等(主编)，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989，Ausubel等(主编)，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(定期更新)，1987。
“引物”通常是有10个或更多核苷酸的核酸分子(如有约10个核苷酸到约100个核苷酸的核酸分子)。引物可通过核酸杂交与互补靶核酸链退火以形成引物与靶核酸链间的杂合体，随后通过例如DNA聚合酶多肽沿着靶核酸链延伸。引物对能用于扩增核酸序列，如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它本领域已知的核酸扩增方法。
制备和使用探针及引物的方法描述于例如参考文献如Sambrook等(主编)，《分子克隆：实验室手册》，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.1989；Ausubel等(主编)，《新编分子生物学实验指南》，Greene Publishingand Wiley-Interscience，New York(定期更新)，1987；Innis等(主编)，《PCR操作：方法和应用指南》(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)，AcademicPress：San Diego，1990。PCR引物对可来源于已知序列，例如使用用于此目的的计算机程序如Primer(版本0.5，
Figure C0381214800151
1991，Whitehead Institute for BiomedicalResearch，Cambridge，Mass.)。本领域技术人员理解特定探针或引物的特异性随着长度增加，但探针或引物大小范围可从全长序列到短至5个连续核苷酸的序列。因此，例如20个连续核苷酸的引物与靶退火的特异性高于仅15个核苷酸的对应引物。因而，为获得较大特异性，可选择探针和引物包含例如10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450或更多连续核苷酸。
启动子：核酸阵列控制指导核酸转录的序列。启动子包括转录起始位置附近的必需核酸序列，如在聚合酶II型启动子的情况中的TATA元件。启动子可包括远端增强子或抑制子元件，它们可位于离转录起始位置多达几千碱基对的地方。
纯化：如本文所用，术语“纯化”不需要绝对纯度；它作为一个相对术语。因此，例如在纯化的多肽或核酸制品中，主题多肽或核酸的浓度分别高于其在生物体内天然环境中的多肽或核酸。例如，如果制品中多肽含量代表至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％的制品总蛋白含量时，认为多肽制品纯化了。
重组：“重组”核酸有(1)其表达生物体中非天然产生的序列或(2)通过人工组合2种不同分离、较短序列产生的序列。此人工组合通常通过化学合成完成，或更常通过人工操作分离的核酸区段，如遗传工程技术。“重组”也用于描述人工操作的核酸分子，但它含与生物体中发现的相同调节序列和编码区，核酸分离自此生物体。
序列同一性：氨基酸序列间的相似性根据序列间的相似性表示，序列间的相似性另外称为序列同一性。序列同一性常以百分比同一性(或相似性或同源性)测量；百分比越高，2种序列越相似。当用标准方法排列时，肽如SEQ ID NO：12的同系物或变体具有相对高程度的序列同一性。
用于比较的序列排列方法在本领域熟知。多种程序和排列算法描述于：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-53，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444-8，1988；Higgins和Sharp，Gene 73：237-44，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-3，1989；Corpet等，NucleicAcids Research 16：10881-90，1988；Altschul等，Nature Genet.6：119-29，1994。
NCBI基本局部排列检索工具(BLASTTM)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-10，1990)可获得自一些来源，包括全国生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和因特网，用于连接序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。
肽的变体的特征通常是在全长排列氨基酸序列时计算具有至少50％序列同一性，使用NCBI Blast 2.0，缺口blastp设定为默认参数。为比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，使用Blast 2.0序列功能，用设定为默认参数的默认BLOSUM62矩阵(间隙存在值为11，每残基间隙值为1)。当排列短肽(少于约30个氨基酸)时，排列用Blast 2序列功能进行，使用设定为默认参数的PAM30矩阵(开放间隙9，延伸间隙1罚分)。当通过此方法评估与参考序列相似性更高的蛋白时，显示百分比同一性增加，如至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或者甚至至少99％序列同一性。当比较不够完整的序列用于序列同一性时，同秒物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口中具有至少80％序列同一性，可具有的序列同一性为至少85％、至少90％、至少95％或98％，这取决于它们与参考序列的相似性。在这种短窗口中确定序列同一性的方法描述于全国生物技术信息中心，Bethesda，Maryland维护的网址。本领域技术人员理解提供这些序列同一性范围仅用于指导；完全有可能在所提供范围外获得很显著的同秒物。
类似方法能用于确定核酸序列的百分比序列同一性。在一个特定例子中，同源序列与天然序列一起排列，匹配数通过计算2种序列中存在的相同核苷酸或氨基酸残基的位置数来确定。确定百分比序列同一性是通过匹配数除以鉴定序列(如SEQ ID NO：11)所示序列的长度或连接长度(如来自鉴定序列中所示序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，接着所得值乘以100。例如，当与SEQ ID NO：11所示序列排列时，有1166个匹配的核酸序列与SEQ ID NO：11所示序列是75％相同(即1166÷1554*100＝75.0)。注意到百分比序列同一性值四舍五入到最接近的十分之王。例如，75.11、75.12、75.13和75.14下舍到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19上舍到75.2。也注意到长度值总是整数。在另一个例子中，含20个核苷酸区的靶序列与来自鉴定序列的20个连续核苷酸如下排列，它包含的区域享有与鉴定序列75％序列同一性(即15÷20*100＝75)。
          1                  20
靶序列：  AGGTCGTGTACTGTCAGTCA
          | || ||| |||| |||| |
鉴定序列：ACGTGGTGAACTGCCAGTGA
特异结合剂：试剂能特异结合本文所述任何多肽。例子包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(包含人源化单克隆抗体)、单克隆抗体片段如Fab、F(ab’)2和Fv片段以及任何其它能特异结合这种多肽的抗原表位的试剂。
本文提供多肽(或其片段、变体或融合)的抗体能用于纯化或鉴定这种多肽。本文提供的氨基酸和核酸序列可生成以抗体为基础的特异结合剂，试剂识别本文所述多肽。
可生成多肽、多肽部分或其变体的单克隆或多克隆抗体。抗多肽抗原上1个或多个抗原表位产生的抗体最佳地特异检测多肽。即抗特定多肽产生的抗体会识别和结合此特定多肽，且不充分识别或结合其它多肽。抗体特异结合特定多肽通过任何一些标准免疫测定方法确定，例如蛋白质印迹(参见例如Sambrook等(主编)，《分子克隆：实验室手册》，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。
为通过蛋白质印迹确定特定抗体制品(如小鼠中抗多肽生成的制品，多肽具有SEQ ID NO：12所列氨基酸序列)特异检测适当多肽(如有SEQ ID NO：12所列氨基酸序列的多肽)，总细胞蛋白可从细胞提取并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
分离的总细胞蛋白随后可转至膜(如硝化纤维)，抗体制品与膜孵育。洗膜以去除非特异结合抗体后，特异结合抗体的存在能用缀合多肽如碱性磷酸酶的适当二抗(如抗小鼠的抗体)检测，因为应用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/硝基蓝四唑通过免疫定位的碱性磷酸酶法生成浓的蓝色化合物。
适合用作免疫原的充分纯化多肽能获得自转染细胞、转化细胞或野生型细胞。可调节终制品中的多肽浓度到几微克每毫升的水平，例如通过Amicon过滤装置上的浓度。此外，能用作免疫原的多肽大小范围从全长多肽到有少至9个氨基酸残基的多肽。这种多肽可在细胞培养中生成，能用标准方法化学合成，或可通过将大多肽切割成能纯化的较小多肽来获得。当主要组织相容性复合体(MHC)分子中呈递给免疫系统时，有少至9个氨基酸残基长度的多肽可以是免疫原性的，MHC分子如MHC I类和II类分子。因此，有本文所示任何氨基酸序列的至少9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或更多连续氨基酸残基的多肽可用作免疫原以生成抗体。
本文所示任何多肽的单克隆抗体可根据Kohler和Milstein(Nature 256：495-7，1975)的经典方法或其衍生方法制备自鼠杂交瘤。
多克隆抗血清含本文所示任何多肽的异源抗原表位的抗体，抗血清可通过多肽(或其片段)免疫合适的动物来制备，多肽可以是未修饰或修饰的以增强免疫原性。用于兔的有效免疫操作可发现于Vaitukaitis等(J.Clin.Endocrinol.Metab.33：988-91，1971)。
抗体片段可用于取代完整抗体且易在原核宿主细胞中表达。免疫有效部分的单克隆抗体也称为“抗体片段”，其产生和使用的方法熟知且包括Better和Horowitz(Methods Enzymol.178：476-96，1989)、Glockshuber等(Biochemistry29：1362-7，1990)、美国专利号5,648,237(《功能性抗体片段的表达》(Expression ofFunctional Antibody Fragments))、美国专利号4,946,778(《单一多肽链结合分子》(Single Polypeptide Chain Binding Molecules))、美国专利号5,455,030(《使用单链多肽结合分子的免疫治疗》(Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide BindingMolecules))和其引用的参考文献中描述的抗体片段。
转化：“转化”细胞是核酸分子导入的细胞，例如通过分子生物学技术。转化涵盖所有将核酸分子导入这种细胞的技术，包括但不限于用病毒载体转染、接合、用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染和粒子枪加速导入裸露DNA。
变体、片段或融合蛋白：所示蛋白包括其变体、片段和融合。DNA序列(例如SEQ ID NO：11)编码蛋白(例如SEQ ID NO：12)、融合蛋白或者蛋白片段或变体，能改造序列以使蛋白在真核细胞、细菌、昆虫和/或植物中表达。为获得表达，可改变DNA序列并可操作连接其它调节序列。含调节序列和蛋白的终产物称为载体。此载体能导入真核生物、细菌、昆虫和/或植物细胞。一旦进入细胞，载体允许蛋白生成。
融合蛋白包括蛋白如色氨酸转氨酶(或其变体、多态性、突变体或片段)，例如SEQ ID NO：12，融合蛋白连接其它不抑制所需蛋白活性的氨基酸序列，例如使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸的能力。在一个例子中，其它氨基酸序列长度不大于约10、12、15、20、25、30或50个氨基酸。
本领域普通技术人员理解DNA序列能以多种方法改变而不影响编码蛋白的生物活性。例如，PCR可用于在编码蛋白的DNA序列中产生变化。这种变体可以是对宿主细胞中密码子优先性最佳化的变体，用于表达蛋白，或者是其它促进表达的序列变化。
载体：核酸分子导入细胞，从而生成转化细胞。载体可包括能使它在细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体也可包括1个或多个可选择标记基因和本领域已知的其它遗传元件。
生物合成途径的概述
如图1-3和11-13所示，许多生物合成途径能用于生成monatin或其中间物如吲哚-3-丙酮酸或MP。为将各底物(葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)转变成各产物(色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和monatin)，可使用一些不同多肽。此外，这些反应可体内、体外完成，或通过体内反应和体外反应的组合，如包括非酶化学反应的体外反应。因此，图1-3和11-13是示范，显示能用于获得所需产物的多种不同途径。
葡萄糖到色氨酸
许多生物体能从葡萄糖合成色氨酸。含从葡萄糖和/或色氨酸生成monatin、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的构建物可克隆入这种生物体中。本文显示色氨酸可转变成monatin。
在其它例子中，生物体用已知多肽改造以生成色氨酸或超量产生色氨酸。例如，美国专利号4,371,614(纳入本文供参考)描述用质粒转化的大肠杆菌菌株，质粒含野生型色氨酸操纵子。
美国专利号4,371,614所示色氨酸的最大效价约为230ppm。类似地，WO8701130(纳入本文供参考)描述遗传改造以生成色氨酸的大肠杆菌菌株并讨论增加发酵生产L-色氨酸。本领域技术人员认识到能从葡萄糖生成色氨酸的生物体也能利用其它可转变成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，结果类似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纤维素或甘油。
色氨酸到吲哚-3-丙酮酸
一些多肽可用于使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括酶种类(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21的成员。这些种类包括名为色氨酸转氨酶的多肽(也命名为L-苯丙氨酸-2-氧戊二酸转氨酶、色氨酸转氨酶、5-羟基色氨酸-酮戊二酸转氨酶、羟基色氨酸转氨酶、L-色氨酸氨基转移酶、L-色氨酸转氨酶、L-色氨酸：2-氧戊二酸转氨酶)，它将L-色氨酸和2-氧戊二酸转变成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸；D-色氨酸转氨酶，它使D-色氨酸和2-含氧酸转变成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脱氢酶(也名为NAD(P)-L-色氨酸脱氢酶、L-色氨酸脱氢酶、L-Trp-脱氢酶、TDH和L-色氨酸：NAD(P)氧化还原酶(脱氨))，它将L-色氨酸和NAD(P)转变成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H；D-氨基酸脱氢酶，它使D-氨基酸和FAD转变成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2；色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(也名为L-色氨酸-α-酮异己酸转氨酶和L-色氨酸：苯基丙酮酸转氨酶)，它将L-色氨酸和苯基丙酮酸转变成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也名为蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨))，它使L-氨基酸和H2O和O2转变成2-含氧酸和NH3和H2O2；D-氨基酸氧化酶(也名为蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸：氧氧化还原酶(脱氨))，它将D-氨基酸和H2O和O2转变成2-含氧酸和NH3和H2O2；色氨酸氧化酶，它使L-色氨酸和H2O和O2转变成吲哚-3-丙酮酸和NH3和H2O2。这些种类也包含酪氨酸(芳族)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)转氨酶和有多种转氨酶活性的广(多底物)转氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸转变成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。
转氨酶种类的11个有这种活性的成员描述于下面的实施例1，包括SEQ IDNOS：11和12所示的新转氨酶。因此，本发明提供分离的核酸和蛋白序列，与SEQID NOS：11和12有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性。本发明也涵盖SEQ ID NOS：11和12的片段和融合，它们保持转氨酶活性或编码有转氨酶活性的蛋白。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000个SEQ ID NO：11的连续核苷酸或至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350个SEQ ID NO：12的连续核苷酸。所示序列(和其变体、片段和融合)可以是部分载体。载体能用于转化宿主细胞，从而生成重组细胞，重组细胞可从色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能进一步生成MP和/或monatin。
已知L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)，序列可分离自一些不同来源，如蝰蛇(Viperalebetine)(sp P81375)、眼睛蛇(Ophiophagus hannah)(sp P81383)、蝮蛇(Agkistrodonrhodostonma)(sp P81382)、响尾蛇(Crotalus atrox)(sp P56742)、洋葱假单孢菌(Burkholderia cepaica)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄杆菌(Caulobactercresentus)、莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假单胞菌(P.Syringae)、和红球菌(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文献且能分离自例如鬼伞(Coprinus)属SF-1、有根肿病的大白菜、拟南芥和哺乳动物的肝。能将色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸的1个L-氨基酸氧化酶类成员讨论于下面的实施例3以及分子克隆的另外来源。许多D-氨基酸氧化酶基因存在于分子克隆的数据库。
已知色氨酸脱氢酶，且可分离自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黄花牧豆树(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆树、小麦、玉米、番茄、烟草、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和乳杆菌(Lactobacilli)。已知许多D-氨基酸脱氢酶序列。
如图11-13所示，如果氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶用于使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸，能加入过氧化氢酶以减少或甚至去除过氧化氢的存在。
吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸
将吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸的反应可通过多种多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽类的成员。1.1.1.110多肽类包括吲哚乳酸脱氢酶(也名为吲哚乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3类包括乳酸脱氢酶(也名为乳酸脱氢酶、乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.1.222类包含(R)-4-羟苯基乳酸脱氢酶(也名为D-芳族乳酸脱氢酶、R-芳族乳酸脱氢酶和R-3-(4-羟苯基)乳酸：NAD(P)+2-氧化还原酶)且1.1.1.237类包含3-(4-羟苯基丙酮酸)还原酶(也名为羟苯基丙酮酸还原酶和4-羟苯基乳酸：NAD+氧化还原酶)。1.1.3.-类包含乳酸氧化酶，1.1.1.111类包含(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(也名为(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸：NAD(P)+氧化还原酶)。可能这些种类的一些多肽能从吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。此转变的例子提供于实施例2。
化学反应也能用于使吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸。这种化学反应包括能用一些方法完成的氧化步骤，例如：空气氧化，使用B2催化剂(China ChemicalReporter，13卷，28期，18页(1)，2002)、d金属催化剂存在时稀释高锰酸盐和高氯酸盐或过氧化氢。
吲哚-3-丙酮酸到2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)
一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸转变成MP。示范多肽种类包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。这些种类包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2种羧酸底物缩合的醛缩酶。肽类EC 4.1.3.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电体，而EC 4.1.2.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作为亲电体。
例如，EP 1045-029中所述多肽(EC 4.1.3.16、4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也名为4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶、2-氧-4-羟基戊二酸醛缩酶或KHG醛缩酶)将乙醛酸和丙酮酸转变成4-羟基-2-酮戊二酸，多肽4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17，也名为4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛缩酶)缩合2种酮酸如2个丙酮酸到4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用这些裂合酶的反应。
图1-2和11-13显示这些反应的示意图，其中3-碳(C3)分子结合吲哚-3-丙酮酸。EC 4.1.2.-和4.1.3.-的许多成员特别是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如丝氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC 4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇缩合需要此途径的3个碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作为C3碳源且可转变成丙酮酸。丙氨酸可通过许多利用PLP的转氨酶来转氨以产生丙酮酸，包括许多上述的转氨酶。可通过β消除反应(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)获得丙酮酸和氨，反应用于L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有足够离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介导的β-裂合酶反应中用作丙酮酸的来源，如色氨酸酶(EC4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC 4.1.99.2，也名为酪氨酸-酚裂合酶)催化的反应。通过在(4.1.99.1-2)多肽上进行定点突变可增加β-裂合酶反应速度，如Mouratou等(J.Biol.Chem 274：1320-5，1999)和实施例8所述。这些修饰使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸盐也能用作丙酮酸的来源，且通过加入乳酸脱氢酶和氧化辅因子或乳酸氧化酶和氧来氧化成丙酮酸。这些反应的例子描述于下。例如，如图2和图11-13所示，当丙酮酸用作C3分子时，ProA醛缩酶能接触吲哚-3-丙酮酸。
MP可用化学反应产生，如实施例5提供的醛醇缩合。
MP到Monatin
MP到monatin的转变可由下列1个或多个催化：色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)或更多转氨酶家族(2.6.1.-)的一般成员如天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)转氨酶(图2)。转氨酶类的11个成员描述于下(实施例1)，包括SEQ ID NOS：11和12所示新的种类成员，实施例7提供证明转氨酶和脱氢酶活性的反应。
此反应也能用化学反应进行。酮酸(MP)胺化通过还原性胺化用氨和氰硼氢化钠进行。
图11-13显示另外的多肽，它们能用于使MP转变成monatin以及增加来自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的monatin产量。例如，如果天冬氨酸用作氨基供体，天冬氨酸转氨酶能用于使天冬氨酸转变成草酰乙酸(图11)。草酰乙酸通过脱羧酶转变成丙酮酸和二氧化碳，如草酰乙酸脱羧酶(图11)。此外，如果赖氨酸用作氨基供体，赖氨酸ε转氨酶可用于使赖氨酸转变成ε-醛基赖氨酸(图12)。ε-醛基赖氨酸自发转变成1-哌啶6-羧酸盐(图12)。如果能催化还原性胺化反应的多肽(如谷氨酸脱氢酶)用于将MP转变成monatin，可使用能再循环NAD(P)H和/或生成挥发性产物的多肽，如甲酸脱氢酶。
设计生物合成途径中的另外考虑
取决于哪种多肽用于产生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或monatin，能提供辅因子、底物和/或另外多肽给生产细胞以提高产物形成。
去除过氧化氢
过氧化氢(H2O2)是产物，如果产生，可对生产细胞有毒且可能损害多肽或产生的中间物。上述L-氨基酸氧化酶产生H2O2作为产物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平减少以降低对细胞或产物的潜在损伤。
过氧化氢酶能用于降低细胞中的H2O2水平(图11-13)。生产细胞可表达编码过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化过氧化氢降解成水和氧气。例如，过氧化氢酶可从转染入生产细胞的载体中表达。能使用的过氧化氢酶例子包括但不限于：tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr|Q9KBE8(耐盐杆菌)、tr|Q9URJ7(白色念珠菌)、tr|P77948(天兰色链霉菌)、tr|Q9RBJ5(野油菜黄单胞菌)(SwissProt登录号。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反应也能包含过氧化氢酶多肽。
PLP(吡哆醛5’-磷酸)有效性的调节
如图1所示，PLP可用于本文所述1个或多个生物合成步骤。能补充PLP浓度，从而PLP不成为对反应总效率的限制。
充分研究大肠杆菌中维生素B6(PLP的前体)的生物合成途径且已结晶一些蛋白(Laber等，FEBS Letters，449：45-8，1999)。其它代谢途径中需要2个基因(epd或gapB和serC)，而3个基因(pdA、pdxB和pdxJ)是吡哆醛磷酸生物合成独有的。大肠杆菌途径中的起始物质之一是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。从共同的2和3碳中心代谢物合成此前体是由多肽1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化。另一个前体是苏氨酸衍生物，它形成自4-碳糖，D-赤藓糖4-磷酸。转变到磷酸-4-羟基-L苏氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后一个反应是DXP与HTP间的复杂分子内缩合和闭环反应，由pdxA和pdxJ的基因产物催化。
如果PLP成为发酵生产monatin期间的限制营养物，1个或多个途经基因在生产宿主细胞中的表达增加可用于提高monatin产量。宿主生物体可包含多个其天然途径基因的拷贝或非天然途径基因的拷贝可掺入生物体基因组中。另外，补救途径基因的多个拷贝能克隆入宿主生物体中。
1个在所有生物体中保守的补救途径使多种维生素B6的衍生物再循环成活性PLP形式。参与此途径的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。过量表达1个或多个这些基因可增加PLP有效性。
提高维生素B6水平可通过去除或阻抑宿主生物体中天然生物合成途径基因的代谢调节。PLP阻抑多肽，此多肽参与黄杆菌属(Flavobacterium)菌株238-7中前体苏氨酸衍生物的生物合成。此细菌菌株无代谢控制，过度生成吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。遗传操作以类似方式ε-醛基赖氨酸生成monatin的宿主生物体可增加PLP生成而不过度表达生物合成途径基因。
铵利用
能推动色氨酸酶反应趋向合成方向(从吲哚生成色氨酸)，这是通过制备更能利用的氨或去除水。还原性胺化反应如由谷氨酸氢化酶催化的反应，也能通过铵过量来推动。
氨可作为碳酸或磷酸缓冲系统中的碳酸铵或磷酸铵盐存在。氨也能作为丙酮酸铵或甲酸铵提供。另外，如果反应偶联产生氨的反应如谷氨酸脱氢酶或色氨酸脱氢酶，可提供氨。加入EC 4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能产生氨，底物会水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通过酶水解其优选底物也能使增加的合成产物的产量超过正常平衡量。
取出产物和副产物
色氨酸经色氨酸转氨酶转变成吲哚-3-丙酮酸可能不利地影响吲哚-3-丙酮酸的产率，因为反应生成谷氨酸并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酸可能引起转氨酶的抑制，反应会消耗大量共底物。此外，高谷氨酸浓度对下游分离过程有害。
多肽谷氨酸脱氢酶(GLDH)使谷氨酸转变成2-氧戊二酸，从而在反应中再循环共底物，反应由色氨酸转氨酶催化。GLDH也产生还原等价物(NADH或NADPH)，能用于在需氧条件下产生细胞所用能量(ATP)。通过GLDH利用谷氨酸也减少副产物形成。另外，反应产生氨，它能用作细胞的氮源或作为图1所示最后步骤中还原性胺化的底物。因此，过度表达GLDH多肽的生产细胞能用于增加产量和降低培养基和/或分离方法的成本。
在色氨酸到monatin的途径中，如果使用来自适当酶类的转氨酶，步骤3的氨基供体(如谷氨酸或天冬氨酸)可反转变成步骤1所需的氨基受体(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途径的2个不同转氨酶能提高此途径的效率，其中1个转氨酶的底物不竞争性地抑制另一个转氨酶的活性。
所述途径中的许多反应是可逆的且因此会到达底物和产物间的平衡。可通过从多肽中连续取出产物来增加此途径的产量。例如，monatin用通透酶或其它转运蛋白分泌入发酵液或者从生物催化反应器流中选择性结晶monatin并伴随底物再循环会提高反应产量。
通过另外的酶反应或氨基供体基团的取代来去除副产物是另一种增加反应产量的方法。一些例子讨论于实施例13且示于图11-13。理想生成的副产物不能在反方向中反应，这是通过相变(蒸发)或自发转变成惰性的终产物如二氧化碳。
底物库的调节
调节吲哚库可通过增加色氨酸前体生成和/或改变包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代谢途径。例如，减少或去除从吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC 4.1.1.74的基因。减少或去除从色氨酸生成吲哚可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC 4.1.99.1的基因。另外，过量吲哚能用作体外或体内过程中的底物，结合增加量的编码EC 4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.，82：604-6，1996)。可进行遗传修饰以增加中间物的水平，如D-赤藓糖4-磷酸和分支酸。
在大部分生物体中调节色氨酸生成。一种机制是通过反馈抑制途径中的某些酶；随着色氨酸水平增加，色氨酸的产率减少。因此，当使用经色氨酸中间物生成monatin的工程宿主细胞时，可使用对色氨酸浓度不敏感的生物体。例如，玫瑰长春花(Catharanthus roseus)品系抗多种色氨酸类似物的生长抑制，它通过反复暴露于高浓度5-甲基色氨酸来选择(Schallenberg和Berlin，Z Naturforsch34：541-5，1979)。可能由于基因突变，所得品系的色氨酸合酶活性受到产物抑制的影响小。类似地，用于monatin生成的宿主细胞可最优化。
最优化色氨酸生成可使用定向进化，以形成对产物抑制不太敏感的多肽。例如，筛选能在培养基中不含色氨酸的平板上进行，但具有高水平的非代谢色氨酸类似物。美国专利号5,756,345；4,742,007和4,371,614描述用于增加发酵生物体中色氨酸产率的方法。色氨酸生物合成的最后步骤是加入丝氨酸到吲哚；因此能增加丝氨酸的有效性以提高色氨酸生成。
可通过增加宿主生物体产生的丙酮酸量来提高发酵生物体产生的monatin量。一些酵母如丝孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)(Wang等，Lett.Appl.Microbiol.35：338-42，2002)和光滑球拟酵母菌(Torulopsis glabrata)(Li等，Appl Microbiol.Biotechnol.57：451-9，2001)超量产生丙酮酸且能用于实践本文所述方法。另外，可对生物体进行遗传修饰以促进丙酮酸生成，如在大肠杆菌菌株W1485lip2(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.82：604-6，1996)中。
控制手性
通过控制分子的立体化学(手性)能改变monatin的味觉分布。例如，不同食物系统需要不同浓度混合的不同monatin异构体。手性可通过pH和多肽的组合控制。
Figure C0381214800261
通过去质子化和再质子化α碳可在monatin的C-4位置(见上面编号的分子)外消旋，这能通过pH变化或与辅因子PLP反应来发生。在微生物中，pH不太可能变化到足以引起外消旋，但PLP丰富。控制多肽手性的方法取决于用于生成monatin的生物合成途径。
当monatin用图2所示途径形成时，可考虑下列各项。在生物催化反应中，碳-2的手性由酶确定，酶使吲哚-3-丙酮酸转变成MP。多种酶(如来自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸转变成MP，因此可选择形成所需异构体的酶。另外，将吲哚-3-丙酮酸转变成MP的酶的对映特异性可用定向进化修饰或能改造催化抗体以催化所需反应。一旦生成MP(通过酶法或化学缩合)，可用转氨酶立体特异性加入氨基，如本文所述的转氨酶。能产生碳-4的R或S构象，这取决于使用D-还是L-芳族酸转氨酶。大部分转氨酶对L-异构体特异，然而，D-色氨酸转氨酶存在于一些植物(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》，Osaka，Japan 1990)。此外，鉴定了D-丙氨酸转氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸转氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.22)。一些转氨酶仅接受在C2碳有特定构象的此反应的底物。因此，即使转变成MP不是立体定向的，可通过适当选择转氨酶控制终产物的立体化学。由于反应是可逆的，未反应MP(不需要的异构体)可再循环回到其组分且可再形成MP的外消旋混合物。
底物的激活
磷酸化底物如磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)可用于本文所示反应。磷酸化底物可在能量上更有利，因此可用于增加反应速度和/或产量。在醛醇缩合中，加入磷酸基团稳定亲核底物的烯醇互变异构体，使它更具反应性。在其它反应中，磷酸化底物通常提供更好的离去基团。类似地，可通过转变成CoA衍生物或焦磷酸盐衍生物激活底物。
实施例1
色氨酸转氨酶的克隆和表达
此例子描述用于克隆色氨酸转氨酶的方法，它可用于使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸。
实验概述
11个编码转氨酶的基因克隆入大肠杆菌中。这些基因是枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat，Genbank登录号Y14082.1 bp 28622-29470和Genbank登录号NP 388848.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)酪氨酸转氨酶(tatA，SEQ ID NOS：1和2分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1酪氨酸转氨酶(tatA通过同源性确定，SEQ ID NOS：3和4分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球细红菌35053酪氨酸转氨酶(通过同源性确定，SEQ IDNOS：5和6，分别硕大利什曼原虫广底物转氨酶(bsat，通过与来自墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)的肽片段的同源性确定，SEQ ID NOS：7和8分别为核酸序列和氨基酸序列)、枯草芽孢杆菌芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NOS：9和10分别为核酸序列和氨基酸序列)、嗜淀粉乳杆菌芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NOS：11和12，分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌35053多底物转氨酶(通过同源性确定，SEQ ID NOS：13和14分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1多底物转氨酶(msa，通过同源性确定，Genbank登录号AAAE01000093.1，bp 14743-16155和Genbank登录号ZP00005082.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(asp C，Genbank登录号AE000195.1bp2755-1565和Genbank登录号AAC74014.1分别为核酸序列和氨基酸序列)和大肠杆菌酪氨酸转氨酶(tyrB，SEQ ID NOS：31和32分别为核酸序列和氨基酸序列)。
克隆、表达了基因并测试它在色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸中的活性，与可商业购买的酶一起。所有11个克隆有活性。
鉴定可能包含有所需活性的多肽的细菌菌株
NCBI(全国生物技术信息中心)数据库中没有基因命名为色氨酸转氨酶。然而，鉴定了有此酶活性的生物体。在细胞提取物或纯化蛋白中测量到L-色氨酸转氨酶(TAT)活性，蛋白来自下列来源：羊茅(Festuca octoflora)的根瘤菌分离物、豌豆线粒体和细胞溶质、向日葵冠瘿细胞、豌豆根瘤菌三叶草生物变种(R.leguminosarumbiovar trifoli)、草生欧文氏菌石头花致病变种(e.herbicola pv.Gypsophilae)、丁香假单胞菌萨氏致病变种(P.Syringae pv.Savastanio)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipferum)、巴西固氮力(A.brasilense)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、团聚肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、麦芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(A.vinelandii)、大鼠脑、大鼠肝、苜蓿根瘤菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CHA0、乳酸乳球菌(L.Lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(L.Helveticus)、小麦苗、大麦、金色菜豆菌(？Phaseolus aureus)(绿豆)、酵母uvarum(carlsbergensis)、利什曼原虫属、玉米、番茄茎、豌豆植物、烟草、猪、生孢梭菌(C.Sporogenes)和灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。
分离基因组DNA用于克隆
苜蓿根瘤菌(ATCC号9930)在TY培养基中25℃，pH7.2生长。细胞生长到600nm(OD600)的光密度为1.85且2％接种物用于基因组DNA制备。Qiagen genomictip 20/G试剂盒(Valencia，CA)用于基因组DNA分离。
枯草芽孢杆菌6051(ATCC)在Bereto营养肉汤(Difco；Detroit，MI)中30℃生长。Qiagen genomic tip 20/G操作用于分离基因组DNA，有下列变化：蛋白酶K和溶菌酶的浓度加倍且接种时间增加2-3倍。
硕大利什曼原虫ATCC 50122基因组DNA由IDI，Inc.(Quebec，Canada)提供，此DNA在pH8.0，17ng/μL的TE缓冲液中。
类球红细菌2.4.1(由Sam Kaplan教授，Univeristy of Texas，Houston提供)、类球红细菌35053(ATCC号)和嗜淀粉乳酸菌基因组DNA通过标准酚抽提制备。细胞在后对数后收集，重悬浮于TEN缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5、1mM EDTA、100mM NaCl)，每mL细胞悬浮液加入0.024mL月桂基肌氨酸钠裂解。用等体积酚抽提至少3次后，DNA溶液用9∶1氯仿∶辛醇抽提1次并用氯仿抽提3次，酚用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5、1mM EDTA)饱和。通过加入0.1体积3M乙酸钠，pH 6.8和2体积乙醇沉淀DNA。通过离心收集沉淀并用70％乙醇洗涤1次。最后，DNA溶于0.10mL蒸馏水。
大肠杆菌基因组DNA从菌株DH10B(Invitrogen)分离且用QiagenGenomic-tipTM(500/G)试剂盒制备。菌株在LB中生长到OD650为1.87，从30mL此菌株中获得0.3mg纯化的DNA。纯化的DNA以0.37μg/μL的浓度溶于Qiagen洗脱缓冲液(EB)。
聚合酶链式反应操作
设计引物的突出端与pET30 Xa/LIC载体(Novagen，Madison，WI)相容。PET载体在Xa/LIC位点的5’侧有12个碱基的单链突出端且在Xa/LIC位点的3’侧有15个碱基的单链突出端。设计质粒用于连接独立的克隆，用N-末端His和S-标记和任选的C-末端His标记。Xa蛋白酶识别位点(IEGR)直接位于感兴趣基因的起始密码子前，从而能去除融合蛋白标记。
当设计引物时，下列序列加到生物体特定序列的5’末端：正向引物，5’GGTATTGAGGGTCGC(SEQ ID NO：73)；反向引物：5’AGAGGAGAGTTAGAGCC(SEQ ID NO：74)。
枯草芽孢杆菌dat引物：N末端：5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3’和C末端：5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3’(SEQ ID NO：15和16)。
苜蓿根瘤菌tatA引物：N末端5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG和C末端：5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC(SEQ ID NO：17和18)。
枯草芽孢杆菌araT引物：N末端：5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC和C末端：5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG(SEQ ID NO：19和20)。
类球红细菌msa(2.4.1和35053)：N末端：5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT和C末端：5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG(SEQ ID NO：21和22)。
硕大利什曼原虫bsat：N末端：5’
GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT和C末端：5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCGATTCACATTGC(SEQ ID NO：23和24)。
嗜淀粉乳杆菌araT：N末端：5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA和C末端：5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTGTAAAA(SEQ ID NO：25和26)。
类球红细菌tatA(2.4.1和35053菌株)：N末端：5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC和C末端：5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG(SEQ ID NO：27和28)。
大肠杆菌aspC：N末端：5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3’和C末端：5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ ID NO：29和30)。
大肠杆菌tyrB：N末端：5’-
GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC和C末端：5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3’(SEQ ID NO：33和34)。
来源于苜蓿根病菌(tatA)的基因用下列PCR操作扩增。在50μL反应中使用0.1-0.5μg模板、1.5μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U扩增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1x expandTM缓冲液。所用热循环仪程序包括96℃ 5分钟的热启动，接着是29个下列步骤的重复：94℃ 30秒，55℃2分钟，72℃ 2.5分钟。29个重复后，样品在72℃保持10分钟，随后4℃贮存。此PCR操作产生1199bp的产物。
来源于类球红细菌(msa和tatA)、嗜淀粉乳杆菌araT和杆菌araT的基因序列用下列PCR操作扩增。在50μL反应中，使用0.1-0.5μg模板、1.5μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U扩增高保真TM聚合酶和有Mg的1X ExpandTM缓冲液。所用热循环仪程序包括96℃ 5分钟的热启动，接着是29个下列步骤的重复：94℃ 30秒，40-60℃ 1分钟、45秒(梯度热循环仪)和72℃ 2分钟、15秒。29个重复后，样品在72℃保持10分钟，随后4℃贮存。
对于各类球红细菌msa基因，42℃和48℃退火温度产生多种产物，但有约1464bp的明显带。对于嗜淀粉乳杆菌araT，42℃、48℃和56℃退火温度产生单一产物，在1173 bp有强带。对于枯草芽孢杆菌araT，40℃、45℃、50℃和55℃退火温度产生单一强产物(1173 bp)，来自基因组DNA和菌落。对于硕大利什曼原虫bsat，55℃退火温度产生最清楚的产物(1239 bp)。对于红细菌tatA基因，50-55℃退火温度产生正确大小的清楚产物(1260bp)。对于大肠杆菌基因和枯草芽孢杆菌dat基因，使用55-60℃的退火温度，退火时间缩短至45秒。获得正确大小的清楚产物(对于大肠杆菌基因约为1.3kb，dat基因为850bp)。
克隆
用Qiagen凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)从0.8或1％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。定量PCR产物，通过与琼脂糖凝胶上的标准比较，随后用T4 DNA聚合酶处理，遵循厂商推荐的连接独立克隆方案(Novagen，Madison，WI)。
简要地，在dGTP存在时，约0.2pmol纯化的PCR产物用1U T4 DNA聚合酶22℃处理30分钟。聚合酶从PCR产物的3’末端去除连续碱基。当聚合酶遇到鸟嘌呤残基时，酶的5’到3’聚合酶活性抵消核酸外切酶活性以有效防止更多切除。这产生与pET30 Xa/LIC载体相容的单链突出端。通过在75℃孵育20分钟使聚合酶失活。
如Novagen的建议退火载体和处理插入物。约0.02pmol处理的插入物和0.01pmol载体在22℃孵育5分钟，加入6.25mM EDTA(终浓度)，重复22℃孵育。退火反应(1μL)加入NovaBlueTM单感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，冰上孵育5分钟。混合后，42℃热激30秒转化细胞。细胞置于冰上2分钟，在250μL室温SOC中37℃恢复30分钟，以225rpm振荡。细胞平板培养于含卡那霉素(25-50μg/mL)的LB平板。
质粒DNA用Qiagen spin miniprep试剂盒纯化，通过XhoI和XbaI限制性消化筛选正确插入物。似乎有正确插入物的质粒序列通过双脱氧链终止DNA测序确认。
SEQ ID NOS：1-14和31-32显示重组转氨酶的核苷酸和对应氨基酸序列，来自Genbank序列的任何变化在蛋白序列中是沉默或产生保守取代。SEQ ID NOS：11和12是新序列。
基因表达和测定
通过序列分析确认的质粒DNA亚克隆入大肠杆菌表达宿主BLR(DE3)或BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)。培养物生长且质粒用Qiagen miniprep试剂盒分离，用限制酶切消化分析以证实同一性。
诱导开始用嗜淀粉乳杆菌araT、枯草芽孢杆菌araT和苜蓿根病菌tatA在BLR(DE3)或BL21(DE3)细胞中进行。时程研究用培养物进行，培养物在含卡那霉素(30mg/L)的LB中生长到OD600为0.5-0.8，用1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导且在诱导后0、1、2和4小时取样。来自2.0mL的细胞重悬浮于0.10mL 120mMTris-HCl，pH6.8，其中含10％十二烷基硫酸钠、10％2-巯基乙醇和20％甘油，95℃加热10分钟，冷却，用0.1mL H2O稀释。这些总细胞蛋白样品的等分部分用4-15％梯度凝胶通过SDS-PAGE分析。2小时和4小时间诱导的表达蛋白量间没有显著差异，BLR(DE3)和BL21(DE3)细胞间也没有。
也从4小时样品中制备细胞提取物，这是通过将来自2mL培养物的细胞沉淀悬浮于0.25mL Novagen BugBusterTM试剂，试剂含0.25μL benzonase核酸酶，室温温和振荡孵育20分钟，16,000xg离心以去除细胞碎片。上清(细胞提取物)上样于4-15％梯度凝胶以分析细胞可溶蛋白。
3个克隆(嗜淀粉乳杆菌araT(SEQ ID NOS：11和12)、枯草芽孢杆菌araT(SEQID NOS：9和10)和苜蓿根病菌tatA(SEQ ID NOS：1和2)显示对应于正确大小(约45kDa)的可溶蛋白。枯草芽孢杆菌araT基因产物以最高水平超量表达和/或经另2种基因产物更溶解。
在随后的表达方法中，来自阳性克隆的质粒DNA亚克隆入BL21(DE3)，因为此宿主的生长特征更佳。用1mM IPTG重复诱导，培养物在含50mg/L卡那霉素的LB中生长，当OD600达到约0.8时诱导。37℃生长4小时后收集细胞，3000rpm离心10分钟(4℃)，用TEGGP缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.0)、0.5mM EDTA、100mg/L谷胱甘肽、5％甘油，具有Roche完整蛋白酶抑制剂混合物)洗涤，在-80℃乙醇中急骤冷冻。
样品重悬浮于5mL/g湿细胞重的BugBusterTM(Novagen)试剂，试剂含5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物#3批(Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CA)和1μL/mL benzonase核酸酶。样品在定轨摇床上室温孵育20分钟。16,000X g 4℃离心20分钟去除不溶的细胞碎片。
细胞提取物通过SDS-PAGE分析，通过追踪吲哚-丙酮酸生成来测定色氨酸转氨酶活性，使用下列操作。1mL反应在50mM四硼酸钠(pH8.5)、0.5mM EDTA、0.5mM砷酸钠、50μM吡哆醛磷酸、5mMα-酮戊二酸和5mM L-色氨酸中完成。加入无细胞提取物或纯化酶来起始反应且30℃孵育30分钟。加入20％TCA(200μL)以终止反应，沉淀的蛋白通过离心取出。测量327nm的吸光度并与测定缓冲液中新颖制备的吲哚-3-丙酮酸的标准曲线比较。也进行对照反应，反应无底物色氨酸或用来自克隆的无细胞提取物，仅用pET30a转化克隆。
由于细胞提取物中来自天然大肠杆菌转氨酶的背景，重组蛋白用His-结合柱体遵循厂商方案(Novagen，Madison，WI)纯化。洗脱部分在PD-10(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)柱上脱盐并在50mM Tris，pH7.0中洗脱。纯化的蛋白通过SDS-PAGE分析并测定转氨酶活性。
来自1mM IPTG 37℃诱导(4小时)的结果证明硕大利什曼原虫bsat、苜蓿根病菌tatA、大肠杆菌aspC和2种类球红细菌tatA克隆有显著水平的色氨酸转氨酶活性。来自枯草芽孢杆菌的araT蛋白超量表达且可溶，但显示小的酶活性。嗜淀粉乳杆菌araT基因产物似乎在细胞提取物中可溶，但用His-结合柱体纯化仅产生少量有正确分子量的蛋白。msa基因产物不溶，进一步的表达实验在24℃进行以将包含体形成减至最低程度。一些10μM和1mM间的IPTG浓度用于使可溶蛋白的量达到最大限度。
表1列出每毫克蛋白每分钟形成的吲哚-3-丙酮酸(I3P)的特异活性，活性以微克测量。在一些情况中，很少量的重组蛋白显示大于测定的有效线性范围的高活性水平。在这些情况中，’＞’在比活数前。
表1：细胞提取物(CE)中的克隆和纯化(P)及商业酶的特异活
  酶   特异活(μgI3P/mg蛋白/分钟)   注释
  硕大利什曼原虫bsat CE   ＞49.3
  硕大利什曼原虫bsat P   ＞4280
  苜蓿根病菌tatA CE   ＞28.6
  苜蓿根病菌tatA P   ＞931
  2.4.1tatA CE   ＞41.2
  2.4.1tatA P   1086
  35053tatA CE   ＞62.3
  35053tatA P   ＞486
  嗜淀粉乳杆菌araT CE   1.26
  嗜淀粉乳杆菌araT P   0   His-结合柱体后的少量蛋白
  枯草芽孢杆菌araT CE   0   不能检测
  枯草芽孢杆菌araT P   1.5-4.5
  2.4.1msa CE   2.05   很少的可溶蛋白
  2.4.1msa P   0   His-结合柱体后无蛋白
  35053msa CE   3.97   很少的可溶蛋白
  35053msa P   0   His-结合柱体后无蛋白
  大肠杆菌aspC(P)   800
  大肠杆菌tyrB(P)   1   不很可溶
  枯草芽孢杆菌D-转氨酶(P)   2.7   使用D-色氨酸作为底物
  广范转氨酶   22   Sigma cat#T 7684
  猪II-A型   1.5   Sigma G7005
  猪I型   1   Sigma G2751
比较所有克隆的重组蛋白的排列阐明araT、tatA、bsat和msa序列间没有许多高度保守的区域。排列活性最高的重组蛋白：红细菌tatA基因产物同系物、硕大利什曼原虫广底物转氨酶和苜蓿根瘤菌酪氨酸转氨酶显示出一些保守区，尽管它们在蛋白水平仅约30-43％相同。D-特异(D-丙氨酸)转氨酶的有效性范围广，可用于生成monatin的其它立体异构体。
实施例2
吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸
如图1和3所示，吲哚-3-乳酸能用于生成吲哚-3-丙酮酸。乳酸和丙酮酸间的转变是可逆反应，正如吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乳酸间的转变也是可逆反应。由于在340nm来自吲哚-3-丙酮酸的高背景量，通常可跟踪吲哚-乳酸的氧化。
0.1mL标准测定混合物包含100mM磷酸钾，pH8.0、0.3mM NAD+、7单位乳酸脱氢酶(LDH)(Sigma-L2395，St.Louis，MO)和2mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次，使用Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读器。混合多肽和缓冲液并移吸到含吲哚-3-乳酸和NAD+的孔中，短暂混合后，各孔在340nm的吸光度以9秒间隔阅读。反应在25℃保持5分钟。从NAD+生成NADH后，340nm的吸光度增加。进行单独的负对照，没有NAD+且没有底物。来自肠膜明串珠菌(L.Mesenteroides)的D-LDH(Sigma目录号L2395)似乎与吲哚衍生物底物的活性大于来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Baccilus stearothermophilus)的L-LDH(Sigma目录号L5275)。
类似方法使用D-乳酸和NAD+或NADH和丙酮酸、D-LDH多肽的天然底物。丙酮酸还原的Vmax比乳酸氧化的Vmax高100-1000倍。吲哚-3-乳酸与D-LDH氧化反应的Vmax约为乳酸的五分之一。也通过跟踪在327的吸光度变化(烯醇-硼酸盐衍生物)测量吲哚-3-丙酮酸的存在，使用含0.5mM EDTA和0.5mM砷酸钠的50mM硼酸钠缓冲液。与用于L和D-LDH多肽的负对照相比，观察到小但可重复的吸光度变化。
此外，可克隆广特异性乳酸脱氢酶(酶活性与EC 1.1.1.27、EC 1.1.1.28和/或EC 1.1.2.3相关)并用于从吲哚-3-乳酸产生吲哚-3-丙酮酸。广特异性脱氢酶的来源包括大肠杆菌、淋病奈瑟氏球菌和植物乳杆菌(L.plantarum)。
另外，生成吲哚-3-丙酮酸可通过吲哚-3-乳酸接触来自生孢梭菌(C.sporogenes)的细胞提取物，提取物包含吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)；或接触克氏锥虫(Trypanosoma cruzi epimastigotes)细胞提取物，提取物包含已知对吲哚-3-丙酮酸有活性的p-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)；或接触嗜酸假单胞菌(P.Acidovorans)或大肠杆菌细胞提取物，提取物包含咪唑-5-基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)；或接触锦紫苏(Coleus blumei)，它包含羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)；或接触麦芽念珠菌，它包含D-芳族乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)。描述这种活性的参考文献包括Nowicki等(FEBS Microbiol Letters，71：119-24，1992)、Jean和DeMoss(Canadian J.Microbiol.14 1968、Coote和Hassall(Biochem.J.111：237-9，1969)、Cortese等(C.R.Seances Soc.Biol.Fil. 162 390-5，1968)、Petersen和Alfermann(Z.Naturforsch.C：Biosci.43 501-4，1988)和Bhatnagar等(J.Gen Microbiol135：353-60，1989)。此外，乳酸氧化酶如来自假单胞菌属(Pseudomonas)的酶(Gu等J.Mo1.CatalysisB：Enzymatic：18：299-305，2002)可用于使吲哚-3-乳酸氧化成吲哚-3-丙酮酸。
实施例3
用L-氨基酸氧化酶使L-色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸
此例子描述的方法用于经氧化酶(EC 1.4.3.2)使L-色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸，作为实施例1所述使用色氨酸转氨酶之外的另一种选择。L-氨基酸氧化酶纯化自响尾蛇(Crotalus durissus)(Sigma，St.Louis，MO，目录号A-2805)。用于分子克隆的L-氨基酸登录号包括：CAD21325.1、AAL14831、NP_490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600和Z48565。
反应在微离心管中进行，总体积1mL，37℃振荡孵育10分钟。反应混合物包含5mM L-色氨酸、100mM磷酸钠缓冲液pH6.6、0.5mM砷酸钠、0.5mM EDTA、25mM四硼酸钠、0.016mg过氧化氢酶(83U，Sigma C-3515)、0.008mg FAD(Sigma)和0.005-0.125单位的L-氨基酸氧化酶。负对照包含所有成分，除了色氨酸，空白包含所有成分，除了氧化酶。过氧化氢酶用于去除在氧化脱氨中形成的过氧化氢。四硼酸钠和砷酸钠用于稳定吲哚-3-丙酮酸的烯醇-硼酸盐形式，它在327nm显示最大吸光度。在反应混合物中制备0.1-1mM浓度的吲哚-3-丙酮酸标准。
购得的L-氨基酸氧化酶具有每分钟每毫克蛋白形成的比活540μg吲哚-3-丙酮酸。这与色氨酸转氨酶的比活是相同的数量级。
实施例4
用醛缩酶使吲哚-3-丙酮酸转变成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸
此例子描述的方法可用于将吲哚-3-丙酮酸转变成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸monatin前体(MP)，使用醛缩酶(裂合酶)(图2)。醛醇缩合是形成碳-碳键的反应，键在一种醛的β-碳与另一种醛或酮的羰基碳间。在一个底物的羰基相邻碳上形成碳负离子，并用作亲核体攻击第2个底物的羰基碳(亲电碳)。最通常地，亲电底物是醛，因此大部分醛缩酶属于EC 4.1.2.-类别。亲核底物通常是丙酮酸。醛缩酶不常催化2个酮酸或2个醛间的缩合。
然而，鉴定了催化2个羧酸缩合的醛缩酶。例如，EP 1045-029描述从乙醛酸和丙酮酸生成L-4-羟基-2-酮戊二酸，使用假单胞菌培养物(EC 4.1.3.16)。此外，4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶，EC4.1.3.17)能催化2个酮酸的缩合。因此，类似的醛缩酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸的缩合。
克隆
4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，EC 4.1.3.17)和4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶，EC 4.1.3.16)催化反应很类似图2的醛缩酶反应。设计引物的突出端与pET30 Xa/LIC载体(Novagen，Madison，WI)相容。这些引物的设计描述于上面的实施例1。
设计下列引物用于pET30 Xa/LIC克隆：
1.稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea)proA基因(Genbank登录号：12964663版本：12964663)和g睾丸酮丛毛单胞菌(睾丸酮丛毛单胞菌)proA基因(SEQ ID NOS：65-66，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3’(SEQ ID NOS：55和56)。
2.苜蓿根瘤菌1021 SMc00502基因(与proA同源，Genbank登录号：15074579和CAC46344，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3’(SEQ ID NOS：61和62)。
3.鞘氨醇单孢菌属LB126 fldZ基因(Genbank登录号：7573247版本：7573247，编码推定的酰基转移酶)正向5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3’(SEQ ID NOS：57和58)。
4.凯氏节杆菌(Arthorbacter keyseri)pcmE基因(Genbank登录号：AF331043版本：AF331043.1，编码草酰柠苹酸醛缩酶)正向5’
GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3’(SEQ ID NOS：59和60)。
5.鼠疫耶尔森氏菌菌株CO92 YPO0082基因(Genbank登录号：15978115版本：15978115，编码可能的转移酶)正向5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3’(SEQ ID NOS：63和64)。
6.枯草芽孢杆菌khg基因(Genbank登录号Z99115.1 GI：2634478，126711-127301和CAB 14127.1，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3’(SEQ IDNOS：35和36)。
7.大肠杆菌khg基因(Genbank登录号AE00279.11331-1972和AAC74920.1，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGG AAACAAG-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3’(SEQ ID NOS：37和38)。
8.苜蓿根病菌khg基因(Genbank登录号AL591792.1GI：15075850，65353-64673和CAC47463.1，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-
GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3’(SEQ ID NOS：39和40)。
来自上面1-2和6-8所述生物体的基因组DNA用Qiagen genomic tip操作纯化。使用类似技术，能从3-5所述生物体纯化基因组DNA。
稻草假单胞菌(ATCC 33636)在营养肉汤和羟基苯甲酸盐培养基中30℃生长。睾丸酮丛毛单胞菌(ATCC 49249)在营养肉汤和羟基苯甲酸盐培养基中26℃生长。鞘氨醇单孢菌属LB126(Flemish Institute for Technological Research，VITO，B-2400Mol，Belgium)根据Wattiau等(Research in Microbiol.152：861-72，2001)所述方法生长。凯氏节杆菌(海湾生态部门，国立日生和环境作用研究实验室，美国环境保护署，海湾Breeze，FL 32561，USA)根据Eaton(J.Bacteriol.183：3689-3703，2001)所述方法生长。苜蓿根瘤菌1021(ATCC 51124)在ATCCTY培养基和羟基苯甲酸盐培养基中26℃生长。鼠疫耶尔森氏菌菌株CO92(ATCC)在ATCC培养基739马血琼脂中26℃生长。枯草芽孢杆菌6051(ATCC)在Bereto营养肉汤(Difco；Detroit，MI)中30℃生长。大肠杆菌基因组DNA从菌株DH10B(Invitrogen)中分离，如实施例1所述。
实施例1所述PCR、克隆和筛选操作用于克隆睾丸酮丛毛单胞菌和苜蓿根病菌proA序列以及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和苜蓿根病菌khg序列。相同方法用于克隆上述其它序列。
阳性克隆用双脱氧链终止测序法(Seqwright，Houston，TX)测序，用S-标记和T7终止引物(Novagen)和来自Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)的内部引物。
表达和活性测定
质粒DNA(通过序列分析验证)亚克隆入表达宿主BLR(DE3)(Novagen)。培养物在含50mg/L卡那霉素的LB中生长，质粒用Qiagen spin plasmid miniprep试剂盒分离，随后通过限制酶切消化分析以确定特性。用BL21(DE3)构建物进行诱导实验，构建物在含50mg/L卡那霉素的LB中37℃生长。OD600达到约0.6后，用0.1mMIPTG诱导蛋白表达。细胞在30℃生长4小时并离心收集。随后用BugBusterTM试剂(Novagen)裂解细胞且His-标记重组蛋白用上述His-结合柱体纯化(实施例1)纯化的蛋白在PD-10一次性柱上脱盐并在50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.3中洗脱，缓冲液有2mM MgCl2。
蛋白在4-15％梯度凝胶上通过SDS-PAGE分析以检测在预测重组融合蛋白分子量的可溶性蛋白水平。
使用吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸钠作为底物测定蛋白活性。1mL测定混合物中包含100mM Tris-HCl(pH7-pH8.9)、0-8mM MgCl2、3mM磷酸钾(pH8)和6mM各底物。通过加入不同量的多肽(例如从10到100μg)来起始反应，25℃-37℃孵育30分钟，过滤，然后-80℃冷冻。
proA基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时，睾丸酮丛毛单胞菌proA和苜蓿根病菌SMc00502基因构建物有高水平表达。重组蛋白是高度可溶的，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品所确定。睾丸酮丛毛单胞菌因产物纯化至＞95％纯度。由于用His-结合柱体亲和纯化后苜蓿根病菌基因产物的产量很低，细胞提取物用于酶测定。
2种重组醛缩酶都催化从吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二价镁和磷酸钾的存在。当缺乏吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸钾时，没有明显产物。缺乏酶时也形成少量产物(与酶存在时通常不到1个量数量级)。
从反相C18柱洗脱的产物峰稍迟于吲哚-3-丙酮酸标准，此峰的质谱显示292.1的碰撞诱导亲本离子([M+H]+)，亲本离子预期产物MP。质谱中存在的主要子片段包括具有m/z＝158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、274(292-H2O)、256(292-2H2O)、238(292-3H2O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。产物也表现出其它含吲哚的化合物的UV光谱特征，如色氨酸，λmax为279-280且有约290nm的小肩部。
随着反应温度从室温增加到37℃、底物量和镁量增加，睾丸酮丛毛单胞菌醛缩酶法生成的MP量提高。酶的合成活性随着pH增加而减少，在pH7观察到最多产物。在色氨酸标准基础上，用20μg纯化的蛋白在标准测定下生成的MP量约为10-40μg酶1mL反应。
由于苜蓿根病菌和睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶编码序列与上述其它基因的高度同源性，预期所有重组基因产物能催化此反应。此外，预期有类似活性的醛缩酶在59位和87位有苏氨酸(T)，在119位有精氨酸(R)，在120位有天冬氨酸(D)，在31位和71位有组氨酸(H)的醛缩酶(以睾丸酮丛毛单胞菌的编号系统为基础)。
khg基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因构建物有高水平表达，而苜蓿根病菌khg的表达水平较低。重组蛋白高度可溶的，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品判断。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因产物纯化到＞95％纯度；用His-结合柱体亲和纯化后，苜蓿根病菌基因产物的产量不高。
没有迹象证明此酶活性需要镁和磷酸盐。然而，文献报导在磷酸钠缓冲液中进行测定，报导的酶是双功能并对磷酸化底物如2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶测定如上所述进行，在一些情况中省略磷酸盐。结果表明重组KHG醛缩酶法产生MP，但活性不如ProA醛缩酶。在一些情况中，KHG产生的MP水平几乎与镁和磷酸盐单独产生的量相同。磷酸盐似乎不增加KHG活性。杆菌酶活性最高，比单独镁和磷酸盐的活性约高20-25％，如SRM所确定(见实施例10)。根瘤菌酶活性量最低，这可能与表达中注意到的折叠和溶解度问题相关。所有3种酶有活性位点谷氨酸(枯草芽孢杆菌编号系统中的43位)以及与丙酮酸形成Shiff碱基所需的赖氨酸(130位)；然而，枯草芽孢杆菌酶在47位包含活性位点残基苏氨酸，而不是精氨酸。枯草芽孢杆菌KHG较小且似乎在簇中不同于苜蓿根病菌和大肠杆菌酶，其它酶有活性位点苏氨酸。活性位点的差异可能是枯草芽孢杆菌酶活性增加的原因。
改进醛缩酶活性
催化抗体可与天然醛缩酶一样有效，接受广范围的底物，并能用于催化图2所示反应。
也能通过定向进化改进醛缩酶，例如上述用于KDPG醛缩酶的例子(与上述KHG高度同源)，KDPG醛缩酶通过DNA改组和易错PCR来发展以去除对磷酸盐的需求和反转对映选择性。KDPG醛缩酶多肽用于生化反应，因为它们高度特异于供体底物(本文是丙酮酸)，但对于受体底物(即吲哚-3-丙酮酸)相对灵活(Koeller和Wong，Nature 409：232-9.2001)。KHG醛缩酶有缩合丙酮酸与一些羧酸的活性。认为KHG醛缩酶的哺乳动物形式的特异性比细菌形式更广，包括对4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸活性较高和接受4-羟基-2-酮戊二酸的2种立体异构体。细菌来源似乎对R异构体有10倍的优先性。基因组数据库中存在将近100个KHG同系物，在假单胞菌、副球菌、普罗威登斯菌、根瘤菌、摩根氏菌、大肠杆菌和哺乳动物组织中证明活性。这些酶能用作修改对映特异性的起始点，monatin生成需要对映特异性。
利用丙酮酸和另一底物的醛缩酶能“进化”以修改多肽特异性、速度和选择性，另一底物是酮酸和/或有大的疏水基团像吲哚。除了本文证明的KHG和ProA醛缩酶之外，这些酶的例子包括但不限于：KDPG醛缩酶和相关多肽(KDPH)；来自类诺卡氏菌属(Nocardioides sp)的转羧基苯丙酮酸水合酶-醛缩酶；4-(2-羧苯基)-2-羟丁基(氧丁)-3-烯醇盐醛缩酶(2’-羧基苯丙酮酸醛缩酶)，它缩合丙酮酸与2-羧基苯甲醛(一种含芳环的底物)；来自恶臭假单胞菌(P.Putida)和嗜芳香物鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)的反式-O-羟基苯亚甲基丙酮酸水合酶-醛缩酶，它也利用丙酮酸和含芳族的醛作为底物；3-羟基天冬氨酸醛缩酶(赤-3-羟基-L-天冬氨酸乙醛酸裂合酶)，它使用2-含氧酸作为底物且认为在生物体脱氮微球菌(Micrococcus denitrificans)中；苯偶姻醛缩酶(苯甲醛裂合酶)，它利用含苄基的底物；二氢新蝶呤醛缩酶；L-苏-3-苯基丝氨酸苯甲醛-裂合酶(苯基丝氨酸醛缩酶)，它缩合甘氨酸与苯甲醛；4-羟基-2-氧戊酸醛缩酶；1，2-二羟基苄基丙酮酸醛缩酶和2-羟基苯丙酮酸醛缩酶。
通过筛选感兴趣的克隆可选择有所需活性的多肽，使用下列方法。色氨酸营养缺陷型用表达盒上携带感兴趣克隆的载体转化且生长于含少量monatin或MP的培养基。由于转氨酶和醛缩酶反应是可逆的，细胞能从monatin的外消旋混合物生成色氨酸。类似地，通过利用MP或monatin作为碳源和能源的能力可筛选生物体(重组和野生型)。靶醛缩酶的一个来源是多种假单胞菌和根瘤菌菌株的表达文库。假单胞菌有许多不寻常的分解代谢途径用于降解芳族分子，它们也包含许多醛缩酶；而根瘤菌包含醛缩酶，已知在植物根际中生长，有许多描述用于构建monatin生物合成途径的基因。
实施例5
化学合成Monatin前体
实施例4描述的方法使用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转变成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸monatin前体(MP)。此例子描述另一种化学合成MP的方法。
MP用典型的醛醇类型缩合形成(图4)。简要地，典型的醛醇类型反应包括用强碱基产生丙酮酸酯的碳负离子，如LDA(二异丙基酰胺锂)、六甲基二硅氮烷锂或丁基锂。产生的碳负离子与吲哚-丙酮酸反应以形成偶联产物。
可用于保护吲哚氮的保护基团包括但不限于：t-丁氧基羰基(Boc)和苄氧基羰基(Cbz)。羧酸的阻断基团包括但不限于烷基酯(例如甲基、乙基、苄基酯)。当使用这些保护基团时，不可能控制所形成产物的立体化学。然而，如果R2和/或R3是手性保护基团(图4)如(S)-2-丁醇、甲醇或手性胺，可使一种MP对映异构体的形成优于另一种。
实施例6
色氨酸或吲哚-3-丙酮酸转变成Monatin
体外方法使用转氨酶和醛缩酶2种酶，从色氨酸和丙酮酸生成monatin。在第1个步骤中，α-酮戊二酸是转氨反应中来自色氨酸氨基的受体，反应产生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸。醛缩酶催化第2个反应，其中丙酮酸在Mg2+和磷酸盐存在时与吲哚-3-丙酮酸反应，产生monatin(MP)2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的α-酮衍生物。转移第1个反应中形成的谷氨酸的氨基生成所需产物monatin。纯化和表征产物确定形成的异构体是S，S-monatin。描述另外的底物、酶和条件以及对此方法进行的改进。
酶
克隆、表达和纯化来自睾丸酮丛毛单胞菌的醛缩酶、4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，proA基因)(EC 4.1.3.17)，如实施例4所述。克隆、表达和纯化来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿根病菌的4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶)(EC 4.1.3.16)，如实施例4所述。
用于结合醛缩酶以生成monatin的转氨酶是大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶、大肠杆菌tyrB基因编码的酪氨酸转氨酶、苜蓿根病菌TatA酶、硕大利什曼原虫bsat基因编码的广底物转氨酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)。实施例1描述非哺乳动物蛋白的克隆、表达和纯化。来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)获得自Sigma(#G7005)。
使用ProA醛缩酶和L-天冬氨酸转氨酶的方法
1升反应混合物中包含50mM醋酸铵，pH8.0、0.4mM MgCl2、3mM磷酸钾、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸铵、50mM色氨酸、10mMα-酮戊二酸、160mg重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶(未纯化细胞提取物，～30％醛缩酶)、233mg重组大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(未纯化细胞提取物，～40％醛缩酶)。除了酶，所有成分混合一起并在30℃孵育直到色氨酸溶解。随后加入酶，反应溶液30℃孵育并温和振荡(100rpm)3.5小时。酶加入后0.5和1小时，固体色氨酸等分样品(各50mmoles)加入反应。所有加入的色氨酸不溶解，但浓度维持于50mM或更高。3.5小时后，滤去固体色氨酸。使用确定的色氨酸量作为标准通过LC/MS分析反应混合物显示溶液中的色氨酸浓度为60.5mM且monatin浓度为5.81mM(1.05g)。
下列方法用于纯化终产物。百分之90的清溶液应用于BioRad AG50W-X8树脂柱(225mL；结合力为1.7meq/mL)。柱用水洗，收集300mL部分，直到280nm的吸光度＜5％首先流过部分的。然后柱用1M醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个300-mL部分。所有4个部分包含monatin并用旋转蒸发器蒸发到105mL，蒸发器装有温水浴。随着体积减小形成沉淀且在蒸发过程中滤去。
通过LC/MS分析柱部分显示99％色氨酸和monatin结合柱。蒸发过程中形成的沉淀包含＞97％的色氨酸和＜2％的monatin。上清中色氨酸与产物的比例约为2∶1。
上清(7ml)应用于100mL快流DEAE琼脂糖(Amersham Biosciences)柱，柱以前通过0.5L 1M NaOH、0.2L水、1.0L 1.0M醋酸铵，pH8.4和0.5L水洗转变成醋酸盐形式。上清以＜2mL/分钟上样，柱用3-4mL/分钟的水洗直到280nm的吸光度～0。Monatin用100mM醋酸铵，pH8.4洗脱，收集4个100-mL部分。
部分的分析显示流过部分的色氨酸与monatin比例为85∶15且洗脱部分的比例为7∶93。假定monatin在280nm的消光系数与色氨酸相同，洗脱部分包含0.146mmole产物。对于68％的回收，推断总共1L的反应会生成～2.4mmoles(～710mg)monatin。
来自DEAE琼脂糖柱的洗脱部分蒸发到＜20mL。通过应用到C8制备性反相柱进一步纯化等分产物，所用色谱条件与实施例10所述用于分析-规模monatin特征的相同。Waters FractionlynxTM软件用于在检测m/z＝293离子基础上触发自动分部收集monatin。C8柱对应于monatin的质子化分子离子，收集来自C8柱的部分，蒸发到干燥，随后溶于小体积水。此部分用于产物的表征。
所得产物用下列方法确定特征。
UV/可见光谱学.UV/可见光谱测量酶法生成的monatin用Cary 100 Bio UV/可见光分光光度计完成。溶于水的纯化产物显示280nm的最大吸收，肩部在288nm，是含吲哚的化合物的典型特征。
LC/MS分析用于monatin的混合物分析如实施例10所述完成，monatin获得自体外生化反应。图5描述体外酶合成混合物中monatin的典型LC/MS分析。图5的下面一组阐明monatin的质子化分子离子在m/z＝293的所选离子色谱。混合物中的此monatin鉴定通过图6所述质谱确证。LC/MS分析纯化产物显示293的分子离子单峰和280nm的吸光度。质谱与图6所示相同。
MS/MS分析.如实施例10所述，也对monatin进行LC/MS/MS子离子实验。图7阐述monatin的子离子质谱。试验性结构分配图7中标记的所有片段离子。这些包括m/z＝275(293-H2O)、257(293-(2xH2O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、144(3-乙基-1H-吲哚-正碳离子)、130(3-亚甲基-1H-吲哚-正碳离子)和118(吲哚正碳离子)的片段离子。预料的那样，如果获得自分子的吲哚部分，许多这些情况与MP获得的(实施例4)相同。由于存在氨基而不是酮，一些比MP所见高1个质量单位。
高分辨MS分析.图8阐明获得的纯化monatin的质谱，使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪。使用色氨酸作为内部质量校准标准，质子化monatin的测量质量是293.1144。在C14H17N2O5元素组成的基础上，质子化monatin的计算质量是293.1137。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm)，提供酶法生成monatin的元素组成的确证。
NMR光谱学.NMR实验在Varian Inova 500MHz仪器上进行。monatin样品(～3mg)溶于0.5ml D2O。溶剂(D2O)起初用作4.78ppm的内部参考。由于水的峰大，运行1H-NMR抑制水峰。随后，由于水峰的广度，monatin的C-2质子用作参考峰，设在7.192ppm的发表值。
对于13C-NMR，几百次扫描的初始运行表明样品太稀释不能在规定时间获得适当13C谱。因此，进行异核多级量子相干(HMQC)实验，它能使其附着的氢和碳相关，也提供碳化学位移的信息。
表2和3显示1H和HMQC数据的概括。通过与发表值比较，NMR数据表明酶法生成的monatin是(S，S)、(R，R)或两者的混合物。
手性LC/MS分析.为确定体外生成的monatin是一种异构体而不是(R，R)和(S，S)对映异构体的混合物，手性LC/MS分析用实施例10所述仪器完成。
手性LC分离用Chirobiotic T(高级分离技术)手性色谱柱在室温进行。在供应商发表的方案基础上，最优化色氨酸的R-(D)和S-(L)异构体的分离和检测。LC流动相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水；B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。洗脱在70％A和30％b为等度。流速为1.0mL/分钟，从200nm到400nm监控PDA吸光度。用于手性LC/MS分析色氨酸和monatin的仪器参数与实施例10所述用于LC/MS分析的相同。收集使用m/z150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于R-和S-色氨酸的[M+H]+＝205且用于monatin的[M+H]+＝293)，可直接鉴定混合物中的这些分析物。
图9显示R-和S-色氨酸和monatin的色谱，它们由手性色谱分离并通过MS监控。monatin色谱中的单峰表明该化合物是一种异构体，保留时间几乎与S-色氨酸相同。
表2：1H-NMR数据
Figure C0381214800451
Figure C0381214800452
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992).
2Takeshi和Shusuke(JP2002060382，2002-02-26).
表3：13C-NMR数据(来自HMQC谱)
  Cargill   Veleggaar等<sup>1</sup>
  原子   δ<sub>c</sub>   δ<sub>c</sub>
  2   126.1   126.03
  3   *   110.31
  4   120.4   120.46
  5   120.2   120.25
  6   122.8   122.74
  7   112.8   112.79
  8   *   137.06
  9   *   129.23
  10a   36.4   36.53
  12   39.5   39.31
  13   54.9   54.89
  14   *   175.30
  15   *   181.18
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1：3095-8，1992).
旋光测定.在Rudolph Autopol III旋光仪上测量旋光性。Monatin制备为14.6mg/mL的水溶液。对于1g/mL水溶液，S，Smonatin(盐形式)的预期比旋光([α]D 20)是-49.6(Veleggaar等)。观察到纯化、酶法生成monatin的[α]D 20为-28.1，表明它是S，S异构体。
改进
最优化包括试剂和酶浓度的反应条件，10mg/mL的产量用下列试剂混合物产生：50mM醋酸铵，pH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸(钠或铵盐)、5mMα-酮戊二酸(钠盐)、0.05mM吡哆醛磷酸、用于在酶加入后达到1mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、50μg/mL重组ProA醛缩酶(细胞提取物；总蛋白浓度为167μg/mL)、1000μg/mL大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶(细胞提取物；总蛋白浓度为2500μg/mL)和使浓度＞60mM的固体色氨酸(饱和；一些在反应中未溶解)。混合物在30℃孵育4小时并温和搅拌或混合。
取代
α-酮戊二酸的浓度能减少到1mM并补充9mM天冬氨酸，monatin的产量相等。另外的氨基酸受体可用于第1个步骤，如草酰乙酸。
当重组硕大利什曼原虫广底物转氨酶用于取代大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶时，获得类似的monatin产量。然而，分子量为292的第2种未鉴定产物也通过LC-MS分析检测。当大肠杆菌tyrB编码的酶、苜蓿根病菌tatA编码的酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)作为转氨酶加入时，产生0.1-0.5mg/mL的monatin浓度。当反应从吲哚-3-丙酮酸开始时，还原性胺化可用于最后步骤，此步有谷氨酸脱氢酶和NADH(如实施例7)。
来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿根病菌的KHG醛缩酶也与大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶一起使用以酶法生成monatin。使用下列反应条件：50mM NH4-OAcpH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸、5mM谷氨酸、0.05mM吡哆醛磷酸、用于在酶加入后达到0.5mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、20μg/mL重组枯草芽孢杆菌KHG醛缩酶(纯化的)、大约400μg/mL来自细胞提取物的未纯化大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(AspC)和12mM吲哚-3-丙酮酸。反应在30℃振荡孵育30分钟。用枯草芽孢杆菌酶法生成的monatin量为80ng/mL，随着醛缩酶量增加而提高。如果饱和量的色氨酸和5mMα-酮戊二酸取代吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸，monatin产量增加到360ng/mL。重复反应，用50mM Tris pH8.3中的3种30μg/mL KHG酶和饱和量的色氨酸，进行1小时以增加检测。如实施例4，杆菌酶活性最高，产生约4000ng/mL monatin。大肠杆菌KHG产生3000ng/mL monatin，苜蓿根病菌酶产生2300ng/mL。
实施例7
MP和Monatin间的互变
MP的胺化以形成monatin可通过转氨酶催化如实施例1和6鉴定的酶，或通过需要还原辅因子如NADH或NADPH的脱氢酶。这些反应是可逆的且能以任何一个方向测量。当使用脱氢酶时，方向性主要通过铵盐的浓度控制。
脱氢酶活性.随着NAD(P)+转变成更发色的NAD(P)H，通过跟踪340nm吸光度增加来监控monatin的氧化脱氨。如实施例6所述酶法生成和纯化monatin。
典型的0.2mL测定混合物中包含50mM Tris-HCl，pH8.0到8.9、0.33mM NAD+或NADP+、2到22单位的谷氨酸脱氢酶(Sigma)和10-15mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次，用Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读器。酶、缓冲液和NAD(P)+的混合物移吸入含底物的孔，短暂混合后，以10秒间隔监控340nm的吸光度增加。反应在25℃孵育10分钟。负对照不加入底物完成，谷氨酸用作正对照。来自牛肝的III型谷氨酸脱氢酶(Sigma#G-7882)催化monatin转变为monatin前体，转变率约为谷氨酸转变为α-酮戊二酸的百分之一。
转氨活性.用来自大肠杆菌的L-天冬氨酸转氨酶(AspC)、来自大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(TyrB)、来自硕大利什曼原虫的广底物转氨酶(BSAT)和2个实施例1所述可商业购买的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行monatin转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。测定混合物包含(0.5mL中)50mM Tris-HCl，pH8.0、0.05mM PLP、5mM氨基受体、5mM monatin和25μg转氨酶。测定在30℃孵育30分钟，通过加入0.5mL异丙醇终止反应。Monatin损失通过LC/MS监控(实施例10)。注意到以草酰乙酸作为氨基受体的硕大利什曼原虫BSAT活性量最高，接着是以α-酮戊二酸作为氨基受体的相同酶。草酰乙酸的相对活性是：BSAT＞AspC＞猪IIa型＞猪I型＝TyrB。α-酮戊二酸的相对活性是：BSAT＞AspC＞猪I型＞猪IIa型＞TyrB。
实施例8
从色氨酸和除了丙酮酸的C3来源生成Monatin
如上面实施例6所述，吲哚-3-丙酮酸或色氨酸能转变成monatin，使用丙酮酸作为C3分子。然而，在一些情况中，丙酮酸可能不是理想的原料。例如，丙酮酸可能比其它C3碳源昂贵，或如果加入培养基对发酵有不利影响。丙氨酸可通过许多PLP-酶转氨以产生丙酮酸。
色氨酸酶类似酶进行β-消除反应的速度快于其它PLP酶如转氨酶。来自此类别(4.1.99.-)的酶能从氨基酸产生氨和丙酮酸，氨基酸如L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有良好离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物例如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。
用EC 4.1.99.-多肽生成monatin的方法可通过突变β-酪氨酸酶(TPL)或色氨酸酶改进，根据Mouratou等(J.Biol.Chem 274：1320-5，1999)的方法。Mouratou等描述将β-酪氨酸酶转变成二羧氨基酸β-裂合酶的能力，此裂合酶没有报导在自然界中产生。通过使缬氨酸(V)283转变成精氨酸(R)和精氨酸(R)100变成苏氨酸(T)来完成特异性变化。这些氨基酸变化使裂合酶接受二羧氨基酸用于水解脱氨反应(如天冬氨酸)。因此，天冬氨酸也能用作丙氨酸来源用于随后的醛醇缩合反应。
另外，能提供乳酸和将乳酸转变成丙酮酸的酶给细胞或酶反应器。能催化此反应的酶的例子包括乳酸脱氢酶和乳酸氧化酶。
分离基因组DNA
以前报导过色氨酸酶多肽，例如Mouratou等(JBC 274：1320-5，1999)。为分离编码色氨酸酶多肽的基因，来自大肠杆菌DH10B的基因组DNA用作PCR模板，如实施例1所述。
用于酪氨酸-酚裂合酶的基因分离自弗氏柠檬酸杆菌(ATCC目录号8090，命名ATCC 13316；NCTC 9750)并在营养琼脂(Difco 0001)和营养肉汤(Difco 0003)中37℃生长到OD为2.0。基因组DNA用Qiagen Genomic-tipTM 100/G试剂盒纯化。
PCR扩增编码序列
设计引物的突出端与pET30 Xa/LIC载体(Novagen，Madison，WI)相容，如上面实施例1所述。
大肠杆菌tna(SEQ ID NO：41)用于pET30 Xa/LIC克隆的N-末端引物：5’-GGTATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3’(SEQ ID NO：43)。用于pET30 Xa/LIC克隆的C-末端引物：5’-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACTTCT TTA AGT TTT G-3’(SEQ ID NO：44)。
弗氏柠檬酸杆菌tpl(SEQ ID NO：42).用于pET30 Xa/LIC克隆的N-末端引物：5’-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3’(SEQ ID NO：45)。用于pET30 Xa/LIC克隆的C-末端引物：5’-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAGATG TAATCAAAGCGTG-3’(SEQ ID NO：46)。
Eppendorf MastercyclerTM梯度5331热循环仪用于所有PCR反应。50μL中加入0.5μg模板(基因组DNA)、1.0μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U扩增高保真聚合酶(Roche)、有Mg的1X ExpandTM缓冲液和5％DMSO(终浓度)。所用热循环仪PCR程序如下：96℃热启动(5分钟)，94℃-30秒，40-60℃-1分钟45秒，72℃-2分钟15秒；30个重复。最后的聚合步骤是7分钟，随后样品4℃贮存。
克隆
上面实施例1详细描述的克隆和阳性克隆鉴定过程用于鉴定适当克隆。
基因表达和活性测定
质粒DNA(通过序列分析确认)亚克隆入表达宿主BLR(DE3)(Novagen)。培养物在含30mg/L卡那霉素的LB中生长，质粒用Qiagen miniprep试剂盒分离，并通过限制酶切消化分析以确定同一性。
用BL21(DE3)表达宿主进行诱导实验，构建物在含50mg/L卡那霉素的LB中37℃生长。培养物的OD600达到约0.6后，蛋白表达用0.1mM IPTG诱导。细胞在30℃生长4小时并离心收集。然后细胞在5mL/g湿细胞重的BugBusterTM(Novagen)试剂中裂解，试剂含5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物#III批(Calbiochem)和1μL/mLbenzonase核酸酶(Novagen)，His-标记的重组蛋白用His-结合柱体纯化，如上面实施例1所述。纯化蛋白在PD-10(G25 Sephadex，Amersham Biosciences)柱上脱盐并在100mM Tris-Cl缓冲液，pH8.0中洗脱。蛋白在4-15％梯度凝胶上通过SDS-PAGE分析以检测在预测的重组融合蛋白分子量的可溶蛋白水平。
诱变
多肽类4.1.99.-(色氨酸酶和β-酪氨酸酶)的一些成员与天冬氨酸或没有任何修饰的类似氨基酸进行β-裂合酶反应。然而，一些类别成员可能需要诱变以使用底物和/或产生产物。此外，在一些情况中，能进行转变的多肽可进一步通过诱变最优化。
定点诱变在PLP-结合多肽的3D结构分析的基础上进行。下面显示改变多肽的底物特异性的2个例子。
诱变色氨酸酶例子1
下面提供的诱变操作在氨基酸序列中导入2个点突变。第1个点突变使103位的精氨酸(R)变为苏氨酸(T)，第2个点突变使299位的缬氨酸(V)变为精氨酸(R)(大肠杆菌成熟蛋白的编号系统)。诱变实验由ATG Laboratories(Eden Prairie，MN)进行。通过PCR基因片段连续引入突变且片段重装配也由PCR完成。将精氨酸(R)103转变为苏氨酸(T)的引物：5’-
CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3’(SEQ ID NO：47)和5’-
TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3’(SEQ ID NO：48)。
将缬氨酸(V)299转变为精氨酸(R)的引物：5’-
TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3’(SEQ ID NO：49)和5’-
CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3’(SEQ ID NO：50)。
突变体通过XbaI/HindIII和SphI限制酶切消化筛选，通过测序确认。
诱变酪氨酸酚裂合酶(β-酪氨酸酶)例子2
对酪氨酸酚裂合酶氨基酸序列进行2次点突变。这些突变使100位的精氨酸(R)转变成苏氨酸(T)且283位的缬氨酸(V)转变成精氨酸(R)(在弗氏柠檬酸杆菌成熟蛋白序列中)。
用于R100T转变的引物是：5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’(SEQ ID NO：51)和5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’(SEQ IDNO：52)。用于V283R的引物是：5’-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3’(SEQ ID NO：53)和5’-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3’(SEQ ID NO：54)。
使用上述方法，通过KpnI/SacI消化筛选克隆。通过双脱氧链终止测序确认序列。如上面野生型酶所述产生重组蛋白。
反应混合物包括50mM Tris-Cl pH8.3、2mM MgCl2、200mM C3碳源、5mMα-酮戊二酸、钠盐、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到0.5mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾pH7.5、25μg如实施例4制备的粗重组睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶、500μg如实施例1制备的粗L-天冬氨酸转氨酶(AspC)、使浓度＞60mM的固体色氨酸(饱和；一些在反应中未溶解)。反应混合物在30℃混合孵育30分钟。提供丝氨酸、丙氨酸和天冬氨酸作为3-碳源。用或不用二级PLP酶(纯化的进行测定)，PLP酶能进行β-消除反应和β-裂合酶反应(色氨酸酶(TNA)，双突变体色氨酸酶，β-酪氨酸酶(TPL))。结果示于表4：
表4：用另外的C3-碳源产生monatin
  C3-碳源   另外的PLP酶   相对活性
  无   无   0％
  丙酮酸   无   100％
  丝氨酸   无   3％
  丝氨酸   11μg野生型TNA(1U)   5.1％
  丝氨酸   80μg双突变体TNA   4.6％
  丙氨酸   无   32％
  丙氨酸   11μg野生型TNA   41.7％
  丙氨酸   80μg突变体TNA   43.9％
  天冬氨酸   110μg野生型TNA(1U)   7.7％
  天冬氨酸   5U野生型TPL(粗)   5.1％
  天冬氨酸   80μg突变体TNA   3.3％
从作为3-碳源的丙氨酸和丝氨酸产生的monatin通过LC/MS/MS子扫描分析确认，与实施例6中产生的monatin特征相同。丙氨酸是测试的最佳选择之一，通过AspC酶转氨。产生的monatin量通过加入色氨酸酶而增加，色氨酸酶能作为二级活性转氨。通过加入色氨酸酶，用丝氨酸作为碳源产生的monatin量几乎加倍，即使与转氨酶相比仅加入五分之一的色氨酸酶量。AspC可有一些单独的β-消除活性的量。天冬氨酸的结果表明色氨酸酶对天冬氨酸的活性不随着定点诱变增加，定点诱变与前面β-酪氨酸酶提示的相同。预期突变体β-酪氨酸酶具有产生monatin的较高活性。
实施例9
化学合成Monatin
丙氨酸加入吲哚-3-丙酮酸生成monatin，此反应能用Grignard或有机锂试剂合成进行。
例如，镁在无水条件下加入3-氯-3-溴-丙氨酸，3-氯-3-溴-丙氨酸在羧基和氨基被适当阻断。随后加入吲哚-3-丙酮酸(适当阻断)以形成偶联产物，接着去除保护基团以形成monatin。特别有用的保护基团包括THP(四氢吡喃基醚)，它易附着和去除。
实施例10
检测Monatin和MP
此例子描述的方法用于检测monatin或其前体2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的存在。
LC/MS分析
用于体外或体内生化反应获得的monatinα-酮酸形式(monatin前体，MP)和monatin的混合物分析用Waters/Micromass液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)仪器进行，包括Waters 2690液相色谱，装有Waters 996光电二极管阵列(PDA)吸光度监控器，串联置于色谱与Micromass Quattro Ultima三重四极质谱仪间。LC分离用Supelco Discovery C18反相色谱柱，2.1mm×150mm或Xterra MS C8反相色谱柱，2.1mm×250mm室温进行。LC流动相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。
梯度洗脱是从5％B到35％B线性，0-9分钟，从35％B到90％B线性，9-16分钟，在90％B等度，16-120分钟，从90％B到5％B线性，20-22分钟，各运行间有10分钟再平衡阶段。流速是0.25mL/分钟，从200nm到4000nm监控PDA吸光度。最优化所有ESI-MS参数且在产生感兴趣分析物的质子化分子离子([M+H]+)、生成特征性片段离子基础上选择。
下列仪器参数用于LC/MS分析monatin：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；Hex 1：20V；孔径：0V；Hex 2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥气体：50L/h；低质量分辨(Q1)：15.0；高质量分辨(Q1)：15.0；离子能量：0.2；进入：50V；碰撞能量：2；出口：50V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。报导的质量/电荷比(m/z)和分子量的不确定性为±0.01％。混合物中monatin α-酮酸形式(MP)和monatin的初始检测用LC/MS监控完成，收集m/z150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于MP的[M+H]+＝292，用于monatin的[M+H]+＝293)可直接鉴定混合物中的这些分析物。
MS/MS分析
如下对monatin进行LC/MS/MS子离子实验。子离子分析包括将感兴趣的母离子(如对于monatin，m/z＝293)从第1个质量分析器(Q1)传送到质谱的碰撞细胞，其中导入氩并使母离子化学解离成片段(子)离子。随后用第2个质量分析器(Q2)检测这些片段离子，它们可用于确证母离子结构分配。
下列仪器参数用于LC/MS/MS分析monatin：毛细管：3.5kV；圆锥：40V；Hex1：20V；孔径：0V；Hex 2：0V；来源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；圆锥体气体：50L/h；低质量分辨(Q1)：13.0；高质量分辨(Q1)：13.0；离子能量：0.2；进入：-5V；碰撞能量：14；出口：1V；低质量分辨(Q2)：15；高质量分辨(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。
高通量测定Monatin
高通量分析(＜5分钟/样品)monatin的混合物用上述仪器完成，monatin来源于体外和体内反应，参数与LC/MS/MS所述相同。用Waters Xterra MS C8(2.1mm×50mm)色谱室温进行LC分离，在15％含水MeOH、0.25％醋酸中等度洗脱，流速为0.3mL/分钟。用选择的反应监控(SRM)-串联质谱检测混合物中的monatin。这包括监控特定碰撞诱导的母离子([M+H]+＝293.1)转变到子离子(如m/z＝168.1的片段离子，暂定为3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)以最大敏感性、选择性和通量用于检测monatin。平行收集PDA吸光度以进一步确定monatin特性。
实施例11
在细菌中产生Monatin
此例子描述的方法用于在大肠杆菌细胞中产生monatin。本领域技术人员理解类似方法可用于在其它细菌细胞中产生monatin。此外，可使用含monatin合成途径中其它基因(图2)的载体。
极限培养基Trp-1+葡萄糖培养基用于增加大肠杆菌细胞中的色氨酸产量(Zeman等Folica Microbiol.35：200-4，1990)，此培养基如下制备。700mL纳米纯水中加入下列试剂：2g(NH4)2SO4、13.6g KH2PO4、0.2g MgSO4*7H2O、0.01gCaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O。pH调至7.0，体积增加到850mL，培养基高压灭菌。单独制备50％葡萄糖溶液并无菌过滤。40mL加入基础培养基(850mL)，终体积1L。
10g/L L-色氨酸溶液在0.1M磷酸钠pH7中制备并无菌过滤。通常加入十分之一体积到下面特定的培养物。也制备10％丙酮酸钠溶液并无菌过滤。每升培养物通常使用10mL等分样品。制备氨苄青霉素(100mg/mL)、卡那霉素(25mg/mL)和IPTG(840mM)贮存液，无菌过滤，使用前-20℃贮存。吐温20(聚氧乙烯20-单月桂酸山梨聚糖)以0.2％(体积/体积)终浓度使用。氨苄青霉素以非致死浓度使用，通常为1-10μg/mL终浓度。
大肠杆菌BL21(DE3)：：睾丸酮丛毛单胞菌proA/pET30 Xa/LIC的新鲜平板(实施例4中描述)在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上制备。从单菌落中接种过夜培养物(5mL)且30℃生长于有卡那霉素的LB培养基。通常，1到50接种物用于trp-1+葡萄糖培养基中的诱导。加入新鲜抗生素到50mg/L的终浓度。诱导前，摇瓶在37℃振荡生长。
每小时细胞取样，直到获得0.35-0.8的OD600。随后用0.1mM IPTG诱导细胞，温度降到34℃。诱导前(零时间点)收集样品(1ml)并5000x g离心。上清在-20℃冷冻用于LC/MS分析。诱导后4小时，收集另外的1mL样品，离心以从细胞沉淀中分离培养液。如上所述加入色氨酸、丙酮酸钠、氨苄青霉素和吐温。
诱导后细胞生长48小时，另取1mL样品且如上制备。在48小时时，加入另一等分的色氨酸和丙酮酸。生长约70小时后(诱导后)，3500rpm 4℃离心整个培养物体积20分钟。轻轻倒出上清，培养液和细胞都在-80℃冷冻。过滤培养液部分并通过LC/MS分析。如实施例10所述监控[M+H]+＝293峰的高度和面积。减去培养基的背景水平。数据也对于细胞生长标准化，这是通过绘出[M+H]+＝293峰的高度图，峰高除以培养物在600nm的光密度。
当丙酮酸、氨苄青霉素和吐温在诱导后4小时而不是诱导时加入时，产生较高水平的monatin。其它添加物如PLP、另外的磷酸盐或MgCl2不增加monatin产量。当使用色氨酸而不是吲哚-3-丙酮酸时且当色氨酸在诱导后而不是接种或诱导时加入时，获得较高效价的monatin。诱导前和诱导后4小时(底物加入时)，发酵液或细胞提取物中通常没有可检测水平的monatin。负对照仅用有pET30a载体的细胞以及培养物进行，培养物中不加入色氨酸和丙酮酸。亲代MS扫描证明且(m+1)/z＝293的化合物不来源于较大分子，子扫描(如实施例10进行)类似于体外产生的monatin。
用0、0.2％(体积/体积)和0.6％终浓度吐温-20研究吐温的效果。摇瓶产生的最高monatin量是0.2％吐温。氨苄青霉素浓度在0和10μg/mL间变化。细胞培养液中的monatin量在0和1μg/mL间迅速增加(2.5×)，当氨苄青霉素浓度从1增加到10μg/mL时，monatin量增加1.3X。
显示典型结果的时程实验示于图10。即使当值对于细胞生长标准化时，分泌到细胞培养液的monatin量增加。通过使用色氨酸的摩尔消光系数，培养液中的monatin量估计小于10μg/mL。重复相同实验，细胞含载体没有proA插入。许多数字为负，表明这些培养物中m/z＝293的峰高度小于单独培养基中的峰高度(图10)。当色氨酸和丙酮酸缺乏时，数字一致地较低，证明monatin生成是醛缩酶催化酶反应的结果。
细菌细胞中的monatin体内生成在800mL摇瓶实验和发酵罐中重复。通过阴离子交换层析和制备性反相液相色谱纯化250mL monatin样品(在无细胞的培养液中)。蒸发此样品，用于高分辨质量分析(如实施例6所述)。高分辨MS表明生成的代谢物是monatin。
体外测定说明转氨酶需要以高于醛缩酶的水平存在(参见实施例6)，因此来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶超量表达，结合醛缩酶基因以增加产生的monatin量。设计引物以将睾丸酮丛毛单胞菌proA导入有aspC/pET30 Xa/LIC的操纵子，引物如下：5’引物：ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQ ID NO：67)和3’引物：CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC(SEQID NO：68)。5’引物包含BamHI位点，3’引物包含SalI位点用于克隆。PCR如实施例4所述进行并凝胶纯化。aspC/pET30 Xa/LIC构建物用BamHI和SalI消化，PCR产物也如此。消化物用Qiagen自旋柱纯化。根据厂商说明用Roche迅速DNA连接试剂盒(Indianapolis，IN)将proA PCR产物连接到载体。用NovabluesSingles(Novagen)进行化学转化，如实施例1所述。菌落在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中生长且质粒DNA用Qiagen spin miniprep试剂盒纯化。通过限制酶切消化筛选克隆并由Seqwright(Houston，TX)确定序列。构建物亚克隆入BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Novagen)。ProA/pET30 Xa/LIC构建物也转化入BL21(DE3)pLysS。
在上述标准条件下初始比较BLR(DE3)摇瓶样品证明加入第2个基因(aspC)使产生的monatin量提高7倍。为加速生长，使用BL21(DE3)-衍生宿主菌株。proA克隆和2个基因操纵子克隆在上面的Trp-1培养基中诱导，pLysS宿主也有加入培养基的氯霉素(34mg/L)。进行摇瓶实验，有和没有加入0.2％吐温-20和1mg/L氨苄青霉素。用体外生成的纯化monatin作为标准计算培养液中的monatin量。SRM分析如实施例10所述进行。在零、4小时、24小时、48小时、72小时和96小时生长时细胞取样。
结果示于表5，显示培养液中生成的最大量。在大多数情况下，2个基因构建物产生的值高于单独proA构建物。细胞膜更易渗漏的pLysS菌株分泌的monatin水平较高，尽管这些菌株通常以较慢的速度生长。加入吐温和氨苄青霉素有益。
表5：大肠杆菌生成的Monatin量
  构建物   宿主   吐温+Amp   μg/mL monatin   时间
  proA   BL21(DE3)   -   0.41   72小时
  proA   BL21(DE3)   +   1.58   48小时
  proA   BL21(DE3)pLysS   -   1.04   48小时
  proA   BL21(DE3)pLysS   +   1.60   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)   -   0.09   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)   +   0.58   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)pLysS   -   1.39   48小时
  aspC：proA   BL21(DE3)pLysS   +   6.68   48小时
实施例12
酵母中生成Monatin
此例子描述用于在真核细胞中生成monatin的方法。本领域技术人员理解类似方法可用于在任何感兴趣细胞中生成monatin。此外，除了此例子所述或作为一个代替的办法，可使用其它基因(例如图2所列)。
pESC酵母抗原表位标记载体系统(Stratagene，La Jolla，CA)用于克隆和表达大肠杆菌aspC和睾丸酮丛毛单胞菌proA基因入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。pESC载体包含相反链上的GAL1和GAL10启动子，有2个不同多克隆位点，可同时表达2个基因。pESC-His载体也包含His3基因用于互补宿主(YPH500)中的组氨酸营养缺陷型。GAL1和GAL10启动子受葡萄糖抑制且由半乳糖诱导；Kozak序列用于在酵母中最佳表达。pESC载体是穿梭载体，能在大肠杆菌中产生初始构建物(bla基因用于选择)；然而，多克隆位点中没有细菌核糖体结合部位。
设计下列引物用于克隆入pESC-His(限制性位点加下划线，Kozak序列粗体)：aspC(BamHI/SalI)，
GAL1：5’CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3’(SEQ ID NO：69)和5’-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ ID NO：70)。proA(EcoRI/NotI)，GAL10：5’-
CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO：71)和5’-
GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3’(SEQ ID NO：72)。
由于导入Kozak序列，2种成熟蛋白的第2个密码子从芳族氨基酸变成缬氨酸。用来自实施例1和实施例4所述克隆的pET30 Xa/LIC miniprep DNA作为模板扩增感兴趣的基因。使用Eppendorf Master循环梯度热循环仪进行PCR，和下列用于50μL反应的操作：1.0μL模板、1.0μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U扩增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1X ExpandTM缓冲液。所用热循环仪程序包括94℃ 5分钟的热启动，接着是29个下列步骤的重复：94℃ 30秒，50℃1分钟45秒，72℃2分钟15秒。29个重复后，样品在72℃维持10分钟，随后4℃贮存。纯化PCR产物是通过在1％TAE-琼脂糖凝胶上分离，接着用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)回收。
pESC-His载体DNA(2.7μg)如上用BamHI/SalI消化并凝胶纯化。aspC PCR产物用BamHI/SalI消化并用QIAquick PCR纯化柱纯化。用Roche迅速DNA连接试剂盒根据厂商的方案进行连接。根据厂商的说明，在0.2cm Biorad一次性小杯中将脱盐的连接物电穿孔入40μl Electromasx DH10B感受态细胞(Invitrogen)，使用附加脉冲控制器的Biorad基因脉冲器II。在1mL SOC培养基中恢复1小时后，转化子平板培养于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。用于克隆的质粒DNA制品用QIAprep Spin Miniprep试剂盒完成。质粒DNA通过限制酶切消化筛选，用设计用于载体的引物测序(Sequwright)以确认。
aspC/pESC-His克隆用EcoRI和NotI消化，proA PCR产物也如此。DNA如上纯化和连接。2个基因构建物转化入DH10B细胞中并通过限制酶切消化和DNA测序筛选。
构建物转入酿酒酵母菌株YPH500，使用S.c.EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen)。转化反应在含2％葡萄糖的SC-His要限培养基(Invitrogen pYES2手册)上平板培养。通过菌落PCR用上面的PCR引物筛选单独酵母菌落中proA和aspC基因的存在。沉淀细胞(2μl)悬浮于20μL含1μl消解酶的Y-裂解缓冲液(ZymoResearch)并37℃加热10分钟。随后4μL此悬浮液用于50μL PCR反应，使用上述PCR反应混合物和程序。
5mL培养物在SC-His+葡萄糖中30℃和225rpm生长过夜。逐步调整细胞在棉子糖上生长以便将半乳糖诱导前的延滞期减至最小。生长约12小时后，测量600nm的吸光度，旋下适当体积的细胞且重悬浮于新鲜SC-His培养基中产生0.4的OD。连续使用下列碳源：1％棉子糖+1％葡萄糖，0.5％葡萄糖+1.5％棉子糖，2％棉子糖和最后的1％棉子糖+2％半乳糖用于诱导。
诱导培养基中生长约16小时后，50mL培养物分成双份25mL培养物，下列仅加入双份之一：(终浓度)1g/L L-色氨酸、5mM磷酸钠pH7.1、1g/L丙酮酸钠、1mM MgCl2。来自非诱导培养基和来自加入monatin途径的底物之前16小时培养液和细胞沉淀的样品保存作为负对照。此外，仅含功能性aspC基因(和截短的proA基因)的构建物用作另一种负对照。细胞可在诱导后总共生长69小时。酵母细胞偶尔在较低OD诱导，仅在加入色氨酸和丙酮酸前生长4小时。然而，这些monatin底物似乎抑制生长且在较高OD加入更有效。
来自培养物的细胞沉淀用5mL YeastBusterTM+50μl THP(Novagen)每克(湿重)细胞遵循厂商的方案裂解，加入前面例子所述的蛋白酶抑制剂和benzonase核酸酶。过滤培养液和细胞提取物并通过SRM分析，如实施例10所述。使用此方法，培养液样品中没有检测到monatin，表明细胞不能在这些条件下分泌monatin。这些条件下的质子动力可能不足或一般的氨基酸转运子可用色氨酸饱和。蛋白表达水平不能用SDS-PAGE检测变化。
当色氨酸和丙酮酸加入培养基时，具有2个功能基因的培养物的细胞提取物中可短暂检测到monatin(约60μg/mL)。任何负对照细胞提取物中不能检测到monatin。用4.4mg/mL总蛋白(约为通常用于大肠杆菌细胞提取物的两倍)进行2次monatin的体外测定，使用实施例6所述最优化测定。进行其它测定，加入32μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶或400μg/mL AspC转氨酶，用于确定哪个酶在细胞提取物中限制。负对照不加入酶或仅加入AspC转氨酶(没有酶时醛醇缩合能发生到一定程度)。正对照用部分纯化的酶(30-40％)进行，使用16μg/mL醛缩酶和400μg/mL转氨酶。
体外结果通过SRM分析。细胞提取物分析显示当色氨酸在诱导后加入培养基时，它被有效转运入细胞中，使色氨酸水平比没有另外色氨酸加入的高2个数量级。体外monatin分析结果示于表6(数字表示ng/mL)。
表6：酵母细胞提取物中的monatin生成
  aspC构建物 +醛缩酶 +AspC   二基因构建物   +醛缩酶 +AspC
 抑制(葡萄糖培养基)   0   888.3   173.5   0   465.2   829
 24小时诱导   0   2832.8   642.4   0   1375.6   9146.6
 69小时诱导   0   4937.3   340.3   71.9   1652.8   23693.5
 69小时+底物   0   556.9   659.1   21.9   755.6   16688.2
 +对照(纯化酶)   21853   21853
 -对照(无酶)   0   254.3   0   254.3
有和没有底物加入生长培养基的全二基因构建物细胞提取物获得阳性结果。这些结果与正对照相比，表明酶表达水平接近酵母中1％的总蛋白。当aspC构建物(截短的proA)的细胞提取物用醛缩酶测定时，产生的monatin量显著大于单独细胞提取物测定，表明重组AspC转氨酶包括约1-2％酵母总蛋白。由于细胞中存在天然转氨酶，用醛缩酶测定时未诱导培养物的细胞提取物有小量活性。当用AspC转氨酶测定时，来自未诱导细胞的提取物活性增加到用AspC的(大约200ng/ml)的负对照生成的monatin量。相反，补充转氨酶时二基因构建物细胞提取物测定中观察到的活性增加大于加入醛缩酶时观察到的活性。由于2个基因都应以相同水平表达，表明当转氨酶水平高于醛缩酶水平时，产生的monatin量最大，与实施例6所示结果一致。
加入丙酮酸和色氨酸不仅抑制细胞生长，而且也明显抑制蛋白表达。加入pESC-Trp质粒可用于纠正YPH500宿主细胞的色氨酸营养缺陷型，是一种提供色氨酸而对生长、表达和分泌效果更少的方法。
实施例13
采用偶联反应改进酶方法
理论上，如果没有副反应或底物降解或产生中间物，从图1所述酶反应中形成的最大产物量直接与各反应的平衡常数、色氨酸和丙酮酸的浓度成比例。色氨酸不是高度可溶的底物，大于200mM的丙酮酸浓度似乎对产量有负作用(参见实施例6)。
理想地，Monatin浓度相对于底物最大化以降低分离成本。可进行物理分离，这样monatin可从反应混合物中取出，防止逆反应发生。原料和催化剂可随后再生。由于monatin的大小、电荷和疏水性与一些试剂和中间物类似，物理分离困难，除非对monatin的亲和性高(如亲和层析技术)。然而，monatin反应可偶联其它反应，这样系统的平衡移向monatin生成。下列是改进monatin产量的方法例子，monatin获得自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
采用草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)的偶联反应
图11是反应的说明。色氨酸氧化酶和过氧化氢酶用于将反应推向吲哚-3-丙酮酸生成的方向。过氧化氢酶过量使用，因而过氧化氢不能在逆方向中起作用或者破坏酶或中间物。氧在过氧化氢酶反应中再生。另外，吲哚-3-丙酮酸可用作底物。
天冬氨酸用作MP胺化的氨基供体，使用天冬氨酸转氨酶。理想地，与MP对monatin反应相比，使用对色氨酸/吲哚-3-丙酮酸反应特异性低的转氨酶，这样天冬氨酸不用于再胺化吲哚-3-丙酮酸。可加入草酰乙酸脱羧酶(来自假单胞菌属)以将草酰乙酸转变成丙酮酸和二氧化碳。由于CO2是挥发性的，它不能用于与酶反应，减少或甚至防止逆反应。此步骤中产生的丙酮酸也能用于醛醇缩合反应。可使用其它脱羧酶，已知同系物存在于伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitans)、风产液菌(Aquifex aeolicus)、闪烁在生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、棕色固氮菌、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、一些博德特氏菌属(Bordetella)、突肠弯曲杆菌(C.jejuni)、微温杆状绿菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexusaurantiacus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、具核梭杆菌(F.nucleatum)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、磁球菌(Magnetocuccus)MC-1、溶血曼海米亚菌(Mannheimia haemolytica)、鞭毛甲基杆菌KT(Methylobacillus flagellatus KT)、多杀巴斯德氏菌(P.Multocida)Pm70、微热石袍菌(Petrotoga miotherma)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、一些假单胞菌属、一些火球菌属(Pyrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)、一些沙门氏菌属(Salmonella)、一些链球菌属(Streptococcus)、微温热着色菌(Thermochromatiumtepidum)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)和一些弧菌属(Vibrio)种。
用来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶(AspC)、来自大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(TyrB)、来自硕大利什曼原虫的广底物转氨酶(BSAT)和2个实施例1所述可商业购买的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行色氨酸转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。比较用monatin的活性(实施例7)相对用色氨酸的活性的比例，用于确定哪一个酶对monatin转氨酶反应的特异性最高。这些结果表明相对色氨酸反应对monatin反应特异性最高的酶是猪II-A型谷氨酸-草酰乙酸转氨酶GOAT(Sigma G7005)。此特异性不取决于使用哪一个氨基受体。因此，此酶用于具有草酰乙酸脱羧酶的偶联反应。
从吲哚-3-丙酮酸起始的典型反应包括(终浓度)50mM Tris-Cl pH7.3、6mM吲哚-3-丙酮酸、6mM丙酮酸钠、6mM天冬氨酸、0.05mM PLP、3mM磷酸钾、3mMMgCl2、25μg/mL转氨酶、50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和3单位/mL脱羧酶(Sigma O4878)。反应可在26℃进行1小时。在一些情况中，省略脱羧酶或用α-酮戊二酸取代天冬氨酸(作为负对照)。也测试上述取代GOAT的转氨酶以证实早期特异性实验。过滤样品并通过LC/MS分析，如实施例10所述。结果证明GOAT酶法生成最高量的monatin每mg蛋白，而产生的副产物色氨酸量最少。此外，加入脱羧酶可增加2-3倍。与其它转氨酶相比，大肠杆菌AspC酶也生成大量monatin。
提高monatin产量是通过：1)定期加入2mM吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸和天冬氨酸(每半小时到1小时)，2)在厌氧环境中进行反应或有脱气缓冲液，3)允许反应过夜进行和4)使用没有多次冻融的新鲜制备的脱羧酶。丙酮酸浓度＞12mM会抑制脱羧酶。吲哚-3-丙酮酸浓度高于4mM时，与吲哚-3-丙酮酸的副反应加速。如果也增加醛缩酶量，用于反应的吲哚-3-丙酮酸量可增大。发现高水平的磷酸盐(50mM)和天冬氨酸(50mM)抑制脱羧酶。在1小时反应中，加入的脱羧酶量能减少到0.5U/mL，而monatin产量没有降低。当温度从26℃提高到30℃和从30℃提高到37℃时，产生的monatin量增加；然而，37℃时吲哚-3-丙酮酸的副反应也加速。生成的monatin量随着pH从7增加到7.3而增大，且从pH 7.3-7.8相对稳定。
从色氨酸起始的典型反应包括(终浓度)50mM Tris-Cl pH7.3、20mM色氨酸、6mM天冬氨酸、6mM丙酮酸钠、0.05mM PLP、3mM磷酸钾、3mM MgCl2、25μg/mL转氨酶、50μg/mL睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶和4单位/mL脱羧酶、5-200mU/mL L-氨基酸氧化酶(Sigma A-2805)、168U/mL过氧化氢酶(SigmaC-3515)和0.008mg FAD。反应可在30℃进30分钟。加入脱羧酶观察到改进。当使用50mU/mL氧化酶时，产生最大量的monatin。改进类似于将吲哚-3-丙酮酸用作底物时所观察到的。此外，当1)色氨酸水平低(即低于转氨酶的Km且因此不能与MP竞争活性位点)和2)氧化酶与醛缩酶和转氨酶的比例维持的水平不能积聚吲哚-3-丙酮酸时，产生的monatin量增加。
无论从吲哚-3-丙酮酸还是色氨酸起始，当使用2-4倍的所有酶量且同时维持相同酶比例时，孵育时间为1-2小时的测定中产生的monatin量增加。使用任一底物，达到约1mg/mL monatin浓度。如果从吲哚-3-丙酮酸起始，产生的色氨酸量通常低于20％的产物量，显示出使用偶联反应的益处。随着中间物浓度和副反应的进一步最优化和控制，产率和产量能大幅提高。
采用赖氨酸ε转氨酶(EC 2.6.1.36)的偶联反应
在一些生物体中发现赖氨酸ε转氨酶(L-赖氨酸6-转氨酶)，包括红球菌、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(Streptomyces)、诺卡氏菌(Nocardia)、黄杆菌、产朊假丝酵母(C.utilis)和链霉菌。生物体利用此酶作为生成一些β-内酰胺抗生素中的和一步骤(Rius和Demain，J.Microbiol.Biotech.，7：95-100，1997)。此酶使赖氨酸转变成L-2-氨基己二酸6-半醛(ε-)，这是通过PLP-调节的赖氨酸的C-6转氨，α-酮戊二酸用作氨基受体。ε-醛赖氨酸不稳定且自发经历分子内脱水以形成环状分子1-哌啶6-羧酸盐。这有效抑制任何逆反应发生。图12描述反应流程。也能使用另外的酶赖氨酸-丙酮酸6-转氨酶(EC 2.6.1.71)。
1mL典型反应包含：50mM Tris-Cl pH7.3、20mM吲哚-3-丙酮酸、0.05mM PLP、6mM磷酸钾pH8、2-50mM丙酮酸钠、1.5mM MgCl2、50mM赖氨酸、100μg转氨酶(赖氨酸ε转氨酶LAT-101，BioCatalytics Pasadena，CA)和200μg睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶。产生的monatin量随着丙酮酸浓度增加而增加。用这些反应条件(50mM丙酮酸)的最大量比用草酰乙酸脱羧酶(约0.1mg/mL)的偶联反应观察到的低10倍。
[M+H]+＝293的峰在monatin预期时间洗脱且质谱包含一些用其它酶方法观察到的相同片段。第2个有正确质量与电荷比(293)洗脱的峰稍早于实施例6中生成的S，S monatin通常观察到的，可能表明存在另一种monatin的异构体。此酶法生成的色氨酸很少。然而，可能对丙酮酸有一些活性(产生丙氨酸作为副产物)。同样，已知酶不稳定。可通过定向进化实验进行改进，用于增加稳定性、减少与丙酮酸的活性并提高与MP的活性。这些反应也能偶联上述L-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶。
其它偶联反应
图13显示另一种能提高来自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸的monatin产量的偶联反应。甲酸脱氢酶(EC 1.2.1.2或1.2.1.43)是普通酶。一些甲酸脱氢酶需要NADH而另一些能利用NADPH。谷氨酸脱氢酶在前面的例子中催化monatin前体和monatin间的互变，使用以铵为基础的缓冲液。甲酸铵和甲酸脱氢酶的存在是辅因子再生的有效系统，二氧化碳生成是降低逆反应速度的有效方法(Bommarius等，Biocatalysis 10：37，1994和Galkin等，Appl.Environ.Microbiol.63：4651-6，1997)。此外，大量甲酸铵能溶于反应缓冲液。加入甲酸脱氢酶和甲酸铵可改进谷氨酸脱氢酶反应(或类似的还原性胺化)生成的monatin产量。
其它方法能用于推动平衡趋向monatin生成。例如，如果氨丙烷在MP转变成monatin中用作氨基酸供体，转变用Ω-氨基酸转氨酶(EC 2.6.1.18)如美国专利5,360,724和5,300,437所述，所得产物之一或许是丙酮，它是比底物氨丙烷更易挥发的产物。可周期性提高短期的温度以急骤蒸发挥丙酮，从而缓解平衡。丙酮的沸点为47℃，如果使用短时间段，此温度不可能降解中间物。大部分对α-酮戊二酸有活性的转氨酶也对monatin前体有活性。类似地，如果乙醛酸/芳族酸转氨酶(EC 2.6.1.60)与作为氨基供体的甘氨酸一起使用，生成的乙醛酸相对不稳定且沸点比甘氨酸低很多。
实施例14
重组表达
具有可公开获得的酶cDNA和氨基酸序列及本文所示酶和序列如SEQ IDNOS：11和12以及其变体、多态性、突变体、片断和融合，可通过标准实验室技术表达和纯化任何蛋白如酶。本领域技术人员理解酶和其片段可在任何感兴趣细胞或生物体中重组生成，使用前纯化，例如在生成SEQ ID NO：12和其衍生物前。
生成重组蛋白的方法在本领域已知。因此，本发明范围包括任何蛋白或其片段如酶的重组表达。例如参见Johnson等的美国专利号5,342,764；Pausch等的美国专利号5,846,819；Fleer等的美国专利号5,876,969和Sambrook等(《分子克隆：实验室手册》，Cold Spring Harbor，New York，1989，第17章)。
简要地，编码蛋白或肽的部分、全长或变体cDNA序列能连接入表达载体，如细菌或真核表达载体。通过将启动子置于cDNA序列的上游能生成蛋白和/或肽。启动子的例子包括但不限于lac、trp、tac、trc、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外被蛋白的控制区、SV40的早期和晚期启动子、来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒和猴病毒的启动子、用于3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶的启动子、酵母α-交配因子的启动子和它们的组合。
适用于产生完整天然蛋白的载体包括pKC30(Shimatake和Rosenberg，1981，Nature 292：128)、pKK177-3(Amann和Brosius，1985，Gene 40：183)和pET-3(Studier和Moffatt，1986，J.Mol.Biol.189：113)。DNA序列可转到其它克隆载体，如其它质粒、噬菌体、粘粒、动物病毒和酵母人工染色体(YACs)(Burke等，1987，Science 236：806-12)。这些载体可导入多种宿主，包括体细胞，简单或复杂生物体如细菌、真菌(Timberlake和Marshall，1989，Science 244：1313-7)、无脊椎动物、植物(Gasser和Fraley，1989，Science 244：1293)和哺乳动物(Pursel等，1989，Science244：1281-8)，它们通过导入异源DNA产生转基因。
为在哺乳动物细胞中表达，cDNA序列可连接异源启动子，如猴病毒SV40、pSV2载体中的启动子(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-6)，并导入细胞如猴COS-1细胞(Gluzman，1981，Cell 23：175-82)以获得瞬时或长期表达。嵌合基因构建物的稳定整合可在哺乳动物细胞中维持，这是通过生化选择如新霉素(Southern和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：327-41)和霉酚酸(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-6)。
将DNA转入真核生物如人或其它哺乳动物细胞是一种常规技术。载体作为纯DNA导入受体细胞(转染)，通过例如磷酸钙沉淀(Graham和vander Eb，1973，Virology 52：466)、磷酸锶沉淀(Brash等，1987，Mol.Cell Biol.7：2013)、电穿孔(Neumann等，1982，EMBO J.1：841)、脂转染(Felgner等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7413)、DEAE葡聚糖(McCuthan等，1968，J.Natl.Cancer Inst.41：351)、显微注射(Mueller等，1978，Cell 15：579)、原生质体融合(Schafner，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：2163-7)或小丸枪(Klein等，1987，Nature 327：70)。另外，能通过病毒载体感染导入cDNA，例如逆转录病毒(Bernstein等，1985，Gen.Engrg.7：235)如腺病毒(Ahmad等，1986，J.Virol.57：267)或疱疹(Spaete等，1982，Cell30：295)。
鉴于本发明的原理可应用于许多可能的实施方案，应认识到所述实施方案仅是本发明的特定例子且不应作为对本本明范围的限制。发明范围与下列权利要求一致。因此我们要求本发明包括在这些权利要求的范围和精神内。
序列表
<110>嘉吉有限公司(Cargill，Incorporated)
<120>多肽和生物合成途径
<130>6682-65741
<150>60/374,831
<151>2002-04-23
<160>74
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1170
<212>DNA
<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)
<400>1
atgttcgacg ccctcgcccg ccaagccgac gatcccttgc ttttcctgat cggcctgttc   60
aggaaggatg agcgccccgg aaaggtcgat ctcggcgtag gagtctatcg cgacgagacc  120
ggacgcacgc cgatcttccg ggccgtcaag gcggcggaaa agcggcttct cgaaacacag  180
gacagcaagg cctatatcgg ccccgaaggg gacctcgtct ttctcgatcg gctctgggaa  240
ctcgtcggcg gcgacacgat cgagcggagc catgttgcgg gcgtccagac gcccggcggc  300
tccggcgcgc tccgtttggc ggcggacctc atcgcccgca tgggcggccg aggcatctgg  360
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gcgctggaag gcgccgcatc cggcgatgcg gtgctgctgc atgcaagctg ccacaacccg  540
accggcggcg tcctgagcga agcacaatgg atggagatcg ccgcgctggt ggccgagcgc  600
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gagattgccg gcaagttcac cagtctctga                                   1170
<210>2
<211>389
<212>PRT
<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)
<400>2
Met Phe Asp Ala Leu Ala Arg Gln Ala Asp Asp Pro Leu Leu Phe Leu
1               5                   10                  15
Ile Gly Leu Phe Arg Lys Asp Glu Arg Pro Gly Lys Val Asp Leu Gly
            20                  25                  30
Val Gly Val Tyr Arg Asp Glu Thr Gly Arg Thr Pro Ile Phe Arg Ala
        35                  40                  45
Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg Leu Leu Glu Thr Gln Asp Ser Lys Ala
    50                  55                  60
Tyr Ile Gly Pro Glu Gly Asp Leu Val Phe Leu Asp Arg Leu Trp Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Gly Gly Asp Thr Ile Glu Arg Ser His Val Ala Gly Val Gln
                85                  90                  95
Thr Pro Gly Gly Ser Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ala Asp Leu Ile Ala
            100                 105                 110
Arg Met Gly Gly Arg Gly Ile Trp Leu Gly Leu Pro Ser Trp Pro Asn
        115                 120                 125
His Ala Pro Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Asp Ile Ala Thr Tyr Asp
    130                 135                 140
Phe Phe Asp Ile Pro Ser Gln Ser Val Ile Phe Asp Asn Leu Val Ser
145                 150                 155                 160
Ala Leu Glu Gly Ala Ala Ser Gly Asp Ala Val Leu Leu His Ala Ser
                165                 170                 175
Cys His Asn Pro Thr Gly Gly Val Leu Ser Glu Ala Gln Trp Met Glu
            180                 185                 190
Ile Ala Ala Leu Val Ala Glu Arg Gly Leu Leu Pro Leu Val Asp Leu
        195                 200                 205
Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Gly Leu Asp Gln Asp Val Ala Gly Leu
    210                 215                 220
Arg His Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Ala Leu Val Ala Val Ser Cys
225                 230                 235                 240
Ser Lys Ser Phe Gly Leu Tyr Arg Glu Arg Ala Gly Ala Ile Phe Ala
                245                 250                 255
Arg Thr Ser Ser Thr Ala Ser Ala Asp Arg Val Arg Ser Asn Leu Ala
            260                 265                 270
Gly Leu Ala Arg Thr Ser Tyr Ser Met Pro Pro Asp His Gly Ala Ala
        275                 280                 285
Val Val Arg Thr Ile Leu Asp Asp Pro Glu Leu Arg Arg Asp Trp Thr
    290                 295                 300
Glu Glu Leu Glu Thr Met Arg Leu Arg Met Thr Gly Leu Arg Arg Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Arg Trp Gln Ser Leu Gly Ala Val Ala
                325                 330                 335
Asp Gln Glu Gly Met Phe Ser Met Leu Pro Leu Ser Glu Ala Glu Val
            340                 345                 350
Met Arg Leu Arg Thr Glu His Gly Ile Tyr Met Pro Ala Ser Gly Arg
        355                 360                 365
Ile Asn Ile Ala Gly Leu Lys Thr Ala Glu Ala Ala Glu Ile Ala Gly
    370                 375                 380
Lys Phe Thr Ser Leu
385
<210>3
<211>1260
<212>DNA
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>3
atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga   60
aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa  120
ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc  180
tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggcggc cgagaagcgg  240
ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccgacgagcc ggcctacaat  300
gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcgggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc  360
gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg  420
cccgaggcca ccgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa  480
tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat  540
gccgagggca tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac  600
ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccatctgc  660
gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc  720
gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg  780
ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgcac gggcatcctg  840
atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac   900
cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag   960
gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg  1020
acactgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc  1080
ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag  1140
cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg  1200
ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga  1260
<210>4
<211>419
<212>PRT
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>4
Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro
            20                  25                  30
Gln Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Met Phe Arg Glu Asp
        35                  40                  45
Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg
65                  70                  75                  80
Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Asp Glu
                85                  90                  95
Pro Ala Tyr Ash Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val
            100                 105                 110
Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala
        115                 120                 125
Val Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr
    130                 135                 140
Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr
                165                 170                 175
Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Met Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys
            180                 185                 190
Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ala Asn Pro Asn Pro Val Gln Trp Leu Ala Ile Cys Glu Ser Leu Ala
    210                 215                 220
Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg
                245                 250                 255
Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile
            260                 265                 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly
        275                 280                 285
Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr
    290                 295                 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu
305                 310                 315                 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg
                325                 330                 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala
            340                 345                 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met
        355                 360                 365
Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr
    370                 375                 380
Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly
385                 390                 395                 400
Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val
                405                 410                 415
Leu Arg Gly
<210>5
<211>1260
<212>DNA
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>5
atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga   60
aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa  120
ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc  180
tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggccgc cgagaagcgg  240
ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccggcgagcc cgcctacaat  300
gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcaggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc  360
gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg  420
cccgaggcca ctgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa  480
tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat  540
gccgagggct tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac   600
ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccgtctgc   660
gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc   720
gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg   780
ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgaac gggcatcctg   840
atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac   900
cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag   960
gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg  1020
acgctgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc  1080
ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag  1140
cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg  1200
ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga  1260
<210>6
<211>419
<212>PRT
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>6
Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro
            20                  25                  30
Gln Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Met Phe Arg Glu Asp
        35                  40                  45
Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro
    50                  55                  60
Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg
65                  70                  75                  80
Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Gly Glu
                85                  90                  95
Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val
            100                 105                 110
Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala
        115                 120                 125
Val Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr
    130                 135                 140
Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr
                165                 170                 175
Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Leu Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys
            180                 185                 190
Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly
        195                 200                 205
Ala Asn Pro Asn Pro Val Gln Trp Leu Ala Val Cys Glu Ser Leu Ala
    210                 215                 220
Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly
225                 230                 235                 240
Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg
                245                 250                 255
Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile
            260                 265                 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly
        275                 280                 285
Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr
    290                 295                 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu
305                 310                 315                 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg
                325                 330                 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala
            340                 345                 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met
        355                 360                 365
Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr
    370                 375                 380
Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly
385                 390                 395                 400
Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val
                405                 410                 415
Leu Arg Gly
<210>7
<211>1239
<212>DNA
<213>硕大利什曼原虫(Leishmania major)
<400>7
atgtccatgc aggcggccat gaccacggcg gagcgctggc agaagattca ggcacaagct   60
cccgatgtca tcttcgatct cgcaaaacgc gccgccgctg ccaagggccc caaggccaac  120
ctcgtcattg gtgcctaccg cgacgagcag ggccgtccct atccgctacg cgtggtccgc  180
aaggctgagc agcttctctt ggacatgaat ctcgactacg agtacctacc catctcgggc   240
taccagccct tcatcgatga ggcggtaaag attatctacg gcaataccgt cgagctggag   300
aacctggttg cggtgcagac gctgagcggg accggtgctg tctctctcgg ggcgaagctg   360
ctgactcgcg tcttcgacgc tgagacgacg cccatctacc tttccgaccc cacgtggccc   420
aaccactacg gcgtcgtgaa ggctgctggc tggaagaaca tctgcacgta cgcctactac   480
gaccccaaga cggtcagcct gaatttcgag ggcatgaaga aagacattct ggcggcgccg   540
gacggctccg tgttcattct gcaccagtgc gcgcacaacc ccaccggcgt ggacccgtcg   600
caggagcagt ggaacgagat cgcgtcactg atgctggcca agcaccatca ggtgttcttc   660
gactccgcct accaaggcta tgcgagcggc agcctcgaca cggacgcgta tgctgcccgc   720
ctgtttgccc gccgcggcat cgaggtactg ctggcgcagt cgttctccaa gaacatgggc   780
ttgtacagcg agcgtgcagg cacgctgtcg ctgctcctca aggacaagac gaagcgcgcg   840
gatgtaaaga gcgtgatgga ttcgctgatc cgtgaggagt acacgtgccc cccagcccac   900
ggtgcccgct tagcccacct aatcctgagc aacaacgaac tgcgaaagga gtgggaggca   960
gagctatcag ccatggcaga gcgcatccgt acgatgcgcc gcaccgtgta cgacgagctg  1020
ctgcgcctgc agacgcccgg gagctgggaa catgtcatta accagattgg catgttttcc  1080
ttcctcgggc tgtcaaaggc gcagtgcgaa tactgccaaa accacaacat cttcatcaca  1140
gtgtcgggcc gcgctaacat ggcaggtctg acgcatgaga cggcgctgat gctagcacag  1200
acgatcaacg atgctgtgcg caatgtgaat cgtgagtga                         1239
<210>8
<211>412
<212>PRT
<213>硕大利什曼原虫(Leishmania major)
<400>8
Met Ser Met Gln Ala Ala Met Thr Thr Ala Glu Arg Trp Gln Lys Ile
1               5                   10                  15
Gln Ala Gln Ala Pro Asp Val Ile Phe Asp Leu Ala Lys Arg Ala Ala
            20                  25                  30
Ala Ala Lys Gly Pro Lys Ala Asn Leu Val Ile Gly Ala Tyr Arg Asp
        35                  40                  45
Glu Gln Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Arg Val Val Arg Lys Ala Glu Gln
    50                  55                  60
Leu Leu Leu Asp Met Asn Leu Asp Tyr Glu Tyr Leu Pro Ile Ser Gly
65                  70                  75                  80
Tyr Gln Pro Phe Ile Asp Glu Ala Val Lys Ile Ile Tyr Gly Asn Thr
                85                  90                  95
Val Glu Leu Glu Asn Leu Val Ala Val Gln Thr Leu Ser Gly Thr Gly
            100                 105                 110
Ala Val Ser Leu Gly Ala Lys Leu Leu Thr Arg Val Phe Asp Ala Glu
        115                 120                 125
Thr Thr Pro Ile Tyr Leu Ser Asp Pro Thr Trp Pro Asn His Tyr Gly
    130                 135                 140
Val Val Lys Ala Ala Gly Trp Lys Asn Ile Cys Thr Tyr Ala Tyr Tyr
145                 150                 155                 160
Asp Pro Lys Thr Val Ser Leu Asn Phe Glu Gly Met Lys Lys Asp Ile
                165                 170                 175
Leu Ala Ala Pro Asp Gly Ser Val Phe Ile Leu His Gln Cys Ala His
            180                 185                 190
Asn Pro Thr Gly Val Asp Pro Ser Gln Glu Gln Trp Asn Glu Ile Ala
        195                 200                 205
Ser Leu Met Leu Ala Lys His His Gln Val Phe Phe Asp Ser Ala Tyr
    210                 215                 220
Gln Gly Tyr Ala Ser Gly Ser Leu Asp Thr Asp Ala Tyr Ala Ala Arg
225                 230                 235                 240
Leu Phe Ala Arg Arg Gly Ile Glu Val Leu Leu Ala Gln Ser Phe Ser
                245                 250                 255
Lys Asn Met Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu
            260                 265                 270
Leu Lys Asp Lys Thr Lys Arg Ala Asp Val Lys Ser Val Met Asp Ser
        275                 280                 285
Leu Ile Arg Glu Glu Tyr Thr Cys Pro Pro Ala His Gly Ala Arg Leu
    290                 295                 300
Ala His Leu Ile Leu Ser Asn Asn Glu Leu Arg Lys Glu Trp Glu Ala
305                 310                 315                 320
Glu Leu Ser Ala Met Ala Glu Arg Ile Arg Thr Met Arg Arg Thr Val
                325                 330                 335
Tyr Asp Glu Leu Leu Arg Leu Gln Thr Pro Gly Ser Trp Glu His Val
            340                 345                 350
Ile Asn Gln Ile Gly Met Phe Ser Phe Leu Gly Leu Ser Lys Ala Gln
        355                 360                 365
Cys Glu Tyr Cys Gln Asn His Asn Ile Phe Ile Thr Val Ser Gly Arg
    370                 375                 380
Ala Asn Met Ala Gly Leu Thr His Glu Thr Ala Leu Met Leu Ala Gln
385                 390                 395                 400
Thr Ile Asn Asp Ala Val Arg Asn Val Asn Arg Glu
                405                 410
<210>9
<211>1182
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>9
atggaacatt tgctgaatcc gaaagcaaga gagatcgaaa tttcaggaat acgcaaattc    60
tcgaatcttg tagcccaaca cgaagacgtc atttcactta caatcggcca gcctgatttt   120
ttcacaccgc atcatgtgaa agctgccgca aaaaaagcca ttgatgaaaa cgtgacgtca   180
tatactccga atgccggcta cctggagctg agacaagctg tgcagcttta tatgaagaaa   240
aaagcggatt tcaactatga tgctgaatct gaaattatca tcacaacagg cgcaagccaa   300
gccattgatg ctgcattccg gacgatttta tctcccggtg atgaagtcat tatgccaggg   360
cctatttatc cgggctatga acctattatc aatttgtgcg gggccaagcc tgtcattgtt   420
gatactacgt cacacggctt taagcttacc gcccggctga ttgaagatgc tctgacaccc   480
aacaccaagt gtgtcgtgct tccttatccg tcaaacccta ccggcgtgac tttatctgaa   540
gaagaactga aaagcatcgc agctctctta aaaggcagaa atgtcttcgt attgtctgat   600
gaaatataca gtgaattaac atatgacaga ccgcattact ccatcgcaac ctatttgcgg   660
gatcaaacga ttgtcattaa cgggttgtca aaatcacaca gcatgaccgg ttggagaatt   720
ggatttttat ttgcaccgaa agacattgca aagcacattt taaaggttca tcaatacaat   780
gtgtcgtgcg cctcatccat ttctcaaaaa gccgcgcttg aagctgtcac aaacggcttt   840
gacgatgcat tgattatgag agaacaatac aaaaaacgtc tggactatgt ttatgaccgt   900
cttgtttcca tgggacttga cgtagttaaa ccgtccggtg cgttttatat cttcccttct   960
attaaatcat ttggaatgac ttcatttgat tttagtatgg ctcttttgga agacgctggc  1020
gtggcactcg tgccgggcag ctcgttctca acatatggtg aaggatatgt aaggctgtct  1080
tttgcatgct caatggacac gctgagagaa ggcctagacc gtttagaatt atttgtatta  1140
aaaaaacgtg aagcaatgca gacgataaac aacggcgttt aa                     1182
<210>10
<211>393
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>10
Met Glu His Leu Leu Asn Pro Lys Ala Arg Glu Ile Glu Ile Ser Gly
1               5                   10                  15
Ile Arg Lys Phe Ser Asn Leu Val Ala Gln His Glu Asp Val Ile Ser
            20                  25                  30
Leu Thr Ile Gly Gln Pro Asp Phe Phe Thr Pro His His Val Lys Ala
        35                  40                  45
Ala Ala Lys Lys Ala Ile Asp Glu Asn Val Thr Ser Tyr Thr Pro Asn
    50                  55                  60
Ala Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Gln Ala Val Gln Leu Tyr Met Lys Lys
65                  70                  75                  80
Lys Ala Asp Phe Asn Tyr Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ile Ile Thr Thr
                85                  90                  95
Gly Ala Ser Gln Ala Ile Asp Ala Ala Phe Arg Thr Ile Leu Ser Pro
            100                 105                 110
Gly Asp Glu Val Ile Met Pro Gly Pro Ile Tyr Pro Gly Tyr Glu Pro
        115                 120                 125
Ile Ile Asn Leu Cys Gly Ala Lys Pro Val Ile Val Asp Thr Thr Ser
    130                 135                 140
His Gly Phe Lys Leu Thr Ala Arg Leu Ile Glu Asp Ala Leu Thr Pro
145                 150                 155                 160
Asn Thr Lys Cys Val Val Leu Pro Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Gly Val
                165                 170                 175
Thr Leu Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ser Ile Ala Ala Leu Leu Lys Gly
            180                 185                 190
Arg Asn Val Phe Val Leu Ser Asp Glu Ile Tyr Ser Glu Leu Thr Tyr
        195                 200                 205
Asp Arg Pro His Tyr Ser Ile Ala Thr Tyr Leu Arg Asp Gln Thr Ile
    210                 215                 220
Val Ile Asn Gly Leu Ser Lys Ser His Ser Met Thr Gly Trp Arg Ile
225                 230                 235                 240
Gly Phe Leu Phe Ala Pro Lys Asp Ile Ala Lys His Ile Leu Lys Val
                245                 250                 255
His Gln Tyr Asn Val Ser Cys Ala Ser Ser Ile Ser Gln Lys Ala Ala
            260                 265                 270
Leu Glu Ala Val Thr Asn Gly Phe Asp Asp Ala Leu Ile Met Arg Glu
        275                 280                 285
Gln Tyr Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Val Ser Met
    290                 295                 300
Gly Leu Asp Val Val Lys Pro Ser Gly Ala Phe Tyr Ile Phe Pro Ser
305                 310                 315                 320
Ile Lys Ser Phe Gly Met Thr Ser Phe Asp Phe Ser Met Ala Leu Leu
                325                 330                 335
Glu Asp Ala Gly Val Ala Leu Val Pro Gly Ser Ser Phe Ser Thr Tyr
            340                 345                 350
Gly Glu Gly Tyr Val Arg Leu Ser Phe Ala Cys Ser Met Asp Thr Leu
        355                 360                 365
Arg Glu Gly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Phe Val Leu Lys Lys Arg Glu
    370                 375                 380
Ala Met Gln Thr Ile Asn Asn Gly Val
385                 390
<210>11
<211>1176
<212>DNA
<213>嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)
<400>11
atgccagaat tagctaatga tttaggatta agcaaaaaga tcactgatgt aaaagcttca    60
ggaattagaa tctttgataa caaagtttca gctattcctg gcattatcaa attgactttg   120
ggtgaaccag atatgaatac tcctgagcat gttaagcaag cggctattaa gaatattgca   180
gataatgatt cacactatgc tccacaaaag ggaaagcttg aattaagaaa agctatcagt   240
aaatatttga aaaagattac tggaattgaa tatgatccag aaacagaaat cgtagtaaca   300
gttggtgcaa ctgaagcaat taacgctacc ttgtttgcta ttactaatcc gggtgacaag   360
gttgcaattc ctacgccagt cttttctcta tattggcccg tggctacact tgctgatgcc   420
gattatgttt tgatgaatac tgcagaagat ggttttaagt taacacctaa gaagttagaa   480
gaaactatca aagaaaatcc aacaattaaa gcagtaattt tgaattatcc aactaaccca   540
actggtgttg aatatagcga agatgaaatt aaagctttgg ctaaggtaat taaagataat   600
catctgtacg taattaccga tgaaatttac agtactttga cttacggtgt aaaacacttt   660
tcaattgcca gcttaattcc agaaagagca atttatatct ctggtttatc taaatcacat   720
gcgatgactg gttatcgttt aggctatgtt gccggacctg caaaaattat ggcagaaatt   780
ggtaaagttc atggccttat ggtgacgact acgacggatt catcacaagc tgccgcaatt   840
gaagcacttg aacacggact tgatgaccct gagaaatata gggaagttta tgaaaagcgt   900
cgtgactatg ttttaaagga attagccgag atagagatgc aagcagttaa gccagaaggt   960
gcattttata tctttgctaa aattccagct aagtatggca aagacgatat gaaatttgcc  1020
ttggatttag cttttaaaga aaaagtgggt atcactccag gtagtgcatt tggtcctggt  1080
ggtgaaggtc atattagatt atcttatgca tcaagtgatg aaaacttgca tgaggcaatg  1140
aagcgaatga agaaagtttt acaagaggac gaataa                            1176
<210>12
<211>391
<212>PRT
<213>嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)
<400>12
Met Pro Glu Leu Ala Ash Asp Leu Gly Leu Ser Lys Lys Ile Thr Asp
1               5                   10                  15
Val Lys Ala Ser Gly Ile Arg Ile Phe Asp Asn Lys Val Ser Ala Ile
            20                  25                  30
Pro Gly Ile Ile Lys Leu Thr Leu Gly Glu Pro Asp Met Asn Thr Pro
        35                  40                  45
Glu His Val Lys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Ile Ala Asp Asn Asp Ser
    50                  55                  60
His Tyr Ala Pro Gln Lys Gly Lys Leu Glu Leu Arg Lys Ala Ile Ser
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Leu Lys Lys Ile Thr Gly Ile Glu Tyr Asp Pro Glu Thr Glu
                85                  90                  95
Ile Val Val Thr Val Gly Ala Thr Glu Ala Ile Asn Ala Thr Leu Phe
            100                 105                 110
Ala Ile Thr Asn Pro Gly Asp Lys Val Ala Ile Pro Thr Pro Val Phe
        115                 120                 125
Ser Leu Tyr Trp Pro Val Ala Thr Leu Ala Asp Ala Asp Tyr Val Leu
    130                 135                 140
Met Asn Thr Ala Glu Asp Gly Phe Lys Leu Thr Pro Lys Lys Leu Glu
145                 150                 155                 160
Glu Thr Ile Lys Glu Asn Pro Thr Ile Lys Ala Val Ile Leu Asn Tyr
                165                 170                 175
Pro Thr Asn Pro Thr Gly Val Glu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala
            180                 185                 190
Leu Ala Lys Val Ile Lys Asp Asn His Leu Tyr Val Ile Thr Asp Glu
        195                 200                 205
Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Val Lys His Phe Ser Ile Ala Ser
    210                 215                 220
Leu Ile Pro Glu Arg Ala Ile Tyr Ile Ser Gly Leu Ser Lys Ser His
225                 230                 235                 240
Ala Met Thr Gly Tyr Arg Leu Gly Tyr Val Ala Gly Pro Ala Lys Ile
                245                 250                 255
Met Ala Glu Ile Gly Lys Val His Gly Leu Met Val Thr Thr Thr Thr
            260                 265                 270
Asp Ser Ser Gln Ala Ala AlaIle Glu Ala Leu Glu His Gly Leu Asp
        275                 280                 285
Asp Pro Glu Lys Tyr Arg Glu Val Tyr Glu Lys Arg Arg Asp Tyr Val
    290                 295                 300
Leu Lys Glu Leu Ala Glu Ile Glu Met Gln Ala Val Lys Pro Glu Gly
305                 310                 315                 320
Ala Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Ile Pro Ala Lys Tyr Gly Lys Asp Asp
                325                 330                 335
Met Lys Phe Ala Leu Asp Leu Ala Phe Lys Glu Lys Val Gly Ile Thr
            340                 345                 350
Pro Gly Ser Ala Phe Gly Pro Gly Gly Glu Gly His Ile Arg Leu Ser
        355                 360                 365
Tyr Ala Ser Ser Asp Glu Asn Leu His Glu Ala Met Lys Arg Met Lys
    370                 375                 380
Lys Val Leu Gln Glu Asp Glu
385                 390
<210>13
<211>1413
<212>DNA
<213>类球红细菌(R.sphaeroides)
<400>13
atgcgcgagc ctcttgccct cgagatcgac ccgggccacg gcggcccgct gttcctcgcc    60
atcgccgagg cgatcaccct cgacatcacc cgcgggcggc tgaggcccgg agcgagactg   120
cccggcacac gcgcgctggc gcgggcgctc ggcgtgcatc gcaacacggt ggatgccgcc   180
tatcaggagt tgctgaccca gggctggctg caggccgagc ccgcgcgggg caccttcgtg   240
gcgcaggatc tgccgcaggg gatgctggtg cacaggcccg cgcccgcgcc ggtcgagccg   300
gtcgcgatgc gcgcggggct cgccttctcc gatggcgcgc cggaccccga gctggtgccc   360
gacaaggcgc tggcgcgggc ctttcgccgg gcgctcctgt cgcccgcctt ccgcgccgga   420
gcggattacg gcgatgcccg cggcacctcc tcgctgcggg aggcgctggc agcctatctc   480
gcctcggacc ggggcgtggt cgcggatcct gcgcggctgc tgatcgcgcg gggcagccag   540
atggcgctgt tcctggtagc ccgggcggcg ctggcgccgg gagaggcgat cgcggtcgag   600
gagccgggct atccgctggc ctgggaggcg ttccgcgcag cgggagcgga ggtgcgcggc   660
gtgccggtgg atggcggcgg cctcaggatc gacgcgctcg aggccgcgct ggcccgggat   720
ccgcgaatcc gggcggtcta tgtcacgccc catcaccagt atccgacgac cgtcaccatg   780
ggcgcggcgc ggcggttgca gcttctggaa ctggcagagc gccaccggct cgcgctgatc   840
gaggacgact acgaccacga ataccgcttc gagggccgtc cggtgctgcc gctggctgcc   900
cgcgcgccgg aaggtctgcc gctgatctat gtgggctcgc tgtcgaaact gctctcgccc   960
ggtatccggc tgggatacgc gctggcgccc gagcggctgc tgacccgcat ggccgcggcg  1020
cgcgccgcca tcgaccggca gggcgacgcg ccgctcgagg cggcgctggc cgagctgatc  1080
cgcgacggcg atctgggccg tcatgcccgc aaggcgcgca gggtctaccg ggcgcggcgg  1140
gatctgctgg cggagcgtct cacggcgcag ctggccgggc gcgccgcctt cgatctgccg  1200
gccgggggcc tcgcgctgtg gctgcgctgc gcgggcgtct cggccgagac ctgggccgaa  1260
gccgcagggc aggcggggct cgccctgctg ccgggcacgc gcttcgcgct ggagagcccg  1320
gcgccgcagg ccttccggct gggctatgcg gcgctggacg aggggcagat cgcccgggcg  1380
gtggagatcc tcgcccggag cttccccggc tga                               1413
<210>14
<211>470
<212>PRT
<213>类球红细菌(R.sphaeroides)
<400>14
Met Arg Glu Pro Leu Ala Leu Glu Ile Asp Pro Gly His Gly Gly Pro
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ala Ile Ala Glu Ala Ile Thr Leu Asp Ile Thr Arg Gly
            20                  25                  30
Arg Leu Arg Pro Gly Ala Arg Leu Pro Gly Thr Arg Ala Leu Ala Arg
        35                  40                  45
Ala Leu Gly Val His Arg Asn Thr Val Asp Ala Ala Tyr Gln Glu Leu
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Gly Trp Leu Gln Ala Glu Pro Ala Arg Gly Thr Phe Val
65                  70                  75                  80
Ala Gln Asp Leu Pro Gln Gly Met Leu Val His Arg Pro Ala Pro Ala
                85                  90                  95
Pro Val Glu Pro Val Ala Met Arg Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly
            100                 105                 110
Ala Pro Asp Pro Glu Leu Val Pro Asp Lys Ala Leu Ala Arg Ala Phe
        115                 120                 125
Arg Arg Ala Leu Leu Ser Pro Ala Phe Arg Ala Gly Ala Asp Tyr Gly
    130                 135                 140
Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Ala Ser Asp Arg Gly Val Val Ala Asp Pro Ala Arg Leu Leu Ile Ala
                165                 170                 175
Arg Gly Ser Gln Met Ala Leu Phe Leu Val Ala Arg Ala Ala Leu Ala
            180                 185                 190
Pro Gly Glu Ala Ile Ala Val Glu Glu Pro Gly Tyr Pro Leu Ala Trp
        195                 200                 205
Glu Ala Phe Arg Ala Ala Gly Ala Glu Val Arg Gly Val Pro Val Asp
    210                 215                 220
Gly Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ala Leu Glu Ala Ala Leu Ala Arg Asp
225                 230                 235                 240
Pro Arg Ile Arg Ala Val Tyr Val Thr Pro His His Gln Tyr Pro Thr
                245                 250                 255
Thr Val Thr Met Gly Ala Ala Arg Arg Leu Gln Leu Leu Glu Leu Ala
            260                 265                 270
Glu Arg His Arg Leu Ala Leu Ile Glu Asp Asp Tyr Asp His Glu Tyr
        275                 280                 285
Arg Phe Glu Gly Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala Ala Arg Ala Pro Glu
    290                 295                 300
Gly Leu Pro Leu Ile Tyr Val Gly Ser Leu Ser Lys Leu Leu Ser Pro
305                 310                 315                 320
Gly Ile Arg Leu Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Thr Arg
                325                 330                 335
Met Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ile Asp Arg Gln Gly Asp Ala Pro Leu
            340                 345                 350
Glu Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ile Arg Asp Gly Asp Leu Gly Arg His
        355                 360                 365
Ala Arg Lys Ala Arg Arg Val Tyr Arg Ala Arg Arg Asp Leu Leu Ala
    370                 375                 380
Glu Arg Leu Thr Ala Gln Leu Ala Gly Arg Ala Ala Phe Asp Leu Pro
385                 390                 395                 400
Ala Gly Gly Leu Ala Leu Trp Leu Arg Cys Ala Gly Val Ser Ala Glu
                405                 410                 415
Thr Trp Ala Glu Ala Ala Gly Gln Ala Gly Leu Ala Leu Leu Pro Gly
            420                 425                 430
Thr Arg Phe Ala Leu Glu Ser Pro Ala Pro Gln Ala Phe Arg Leu Gly
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Tyr Ala Ala Leu Asp Glu Gly Gln Ile Ala Arg Ala Val Glu Ile Leu
    450                 455                 460
Ala Arg Ser Phe Pro Gly
465                 470
<210>15
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
ggtattgagg gtcgcatgaa ggttttagtc aatgg      35
<210>16
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
agaggagagt tagagcctta tgaaatgcta gcagcct    37
<210>17
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
ggtattgagg gtcgcatgtt cgacgccctc gcccg      35
<210>18
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
agaggagagt tagagcctca gagactggtg aacttgc    37
<210>19
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ggtattgagg gtcgcatgga acatttgctg aatcc      35
<210>20
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
agaggagagt tagagcctta aacgccgttg tttatcg    37
<210>21
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
ggtattgagg gtcgcatgcg cgagcctctt gccct      35
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
agaggagagt tagagcctca gccggggaag ctccggg    37
<210>23
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggtattgagg gtcgcatgtc cacgcaggcg gccat      35
<210>24
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
agaggagagt tagagcctca ctcacgattc acattgc    37
<210>25
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
ggtattgagg gtcgcatgcc agaattagct aatga      35
<210>26
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
agaggagagt tagagcctta ttcgtcctct tgtaaaa    37
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
ggtattgagg gtcgcatgcg ctctacgacg gctcc      35
<210>28
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
agaggagagt tagagcctca gccgcgcagc accttgg    37
<210>29
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
ggtattgagg gtcgcatgtt tgagaacatt accgc      35
<210>30
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
agaggagagt tagagcctta cagcactgcc acaatcg    37
<210>31
<211>1194
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>31
gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat ggagcgtttt   60
aaagaagacc ctcgcagcga caaagtgaat ttaagtatcg gtctgtacta caacgaagac  120
ggaattattc cacaactgca agccgtggcg gaggcggaag cgcgcctgaa tgcgcagcct  180
catggcgctt cgctttattt accgatggaa gggcttaact gctatcgcca tgccattgcg  240
ccgctgctgt ttggtgcgga ccatccggta ctgaaacaac agcgcgtagc aaccattcaa  300
acccttggcg gctccggggc attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg  360
gaatcaggcg tctgggtcag cgatcctacc tgggaaaacc gcgtagcaat attcgccggg  420
gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt  480
aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca  540
tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa  600
attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc  660
ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg  720
gtgagcaatt cgttctcgaa aattttctcc ctttacggcg agcgcgtcgg cggactttct  780
gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt  840
cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat  900
gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg  960
gcaatgcgtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat  1020
tatctgctta atcagcgcgg catgttcagt tataccggtt taagtgccgc tcaggttgac  1080
cgactacgtg aagaatttgg tgtctatctc atcgccagcg gtcgcatgtg tgtcgccggg  1140
ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa        1194
<210>32
<211>397
<212>PRT
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>32
Val Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu
1               5                   10                  15
Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser
            20                  25                  30
Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly Ile Ile Pro Gln Leu Gln Ala
        35                  40                  45
Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Leu Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser
    50                  55                  60
Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Arg His Ala Ile Ala
65                  70                  75                  80
Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Lys Gln Gln Arg Val
                85                  90                  95
Ala Thr Ile Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala
            100                 105                 110
Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val Trp Val Ser Asp
        115                 120                 125
Pro Thr Trp Glu Asn Arg Val Ala Ile Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu
    130                 135                 140
Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe
145                 150                 155                 160
Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val
                165                 170                 175
Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn
            180                 185                 190
Asp Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile
        195                 200                 205
Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu
    210                 215                 220
Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu
225                 230                 235                 240
Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val
                245                 250                 255
Gly Gly Leu Ser Val Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val
            260                 265                 270
Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu
    290                 295                 300
Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Glu Met Arg Thr Arg Ile Leu
305                 310                 315                 320
Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Lys Val Leu Ser Thr Glu Met Pro Glu
                325                 330                 335
Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr
            340                 345                 350
Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val
        355                 360                 365
Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Met Cys Val Ala Gly Leu Asn Thr Ala
    370                 375                 380
Asn Val Gln Arg Val Ala Lys Ala Phe Ala Ala Val Met
385                 390                 395
<210>33
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
ggtattgagg gtcgcgtgtt tcaaaaagtt gacgc      35
<210>34
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
agaggagagt tagagcctta catcaccgca gcaaacg    37
<210>35
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
ggtattgagg gtcgcatgga gtccaaagtc gttga      35
<210>36
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
agaggagagt tagagcctta cacttggaaa acagcct    37
<210>37
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
ggtattgagg gtcgcatgaa aaactggaaa acaag      35
<210>38
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
agaggagagt tagagcctta cagcttagcg ccttcta    37
<210>39
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
ggtattgagg gtcgcatgcg aggggcatta ttcaa      35
<210>40
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
agaggagagt tagagcctca gcccttgagc gcgaag    36
<210>41
<211>1416
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>41
atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa    60
cgtaccaccc gcgcttatcg tgaagaggca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg   120
ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg   180
cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagctac   240
tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac   300
cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa   360
aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag   420
ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat   480
acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt   540
gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca   600
ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac   660
gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag   720
cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat   780
gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg   840
tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg   900
caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta   960
ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat  1020
ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca  1080
ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg  1140
ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg  1200
ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta  1260
accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa  1320
catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta  1380
ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa                            1416
<210>42
<211>1371
<212>DNA
<213>弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)
<400>42
atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg   60
cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg  120
aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag  180
tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg  240
gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt  300
ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat  360
atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc  420
gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt  480
aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg  540
gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg  600
cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa  660
aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc  720
gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg  780
gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag  840
ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa  900
gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag  960
caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta  1020
ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag  1080
ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag  1140
cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg  1200
gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg  1260
gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt  1320
tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a           1371
<210>43
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct    35
<210>44
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg    37
<210>45
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc    35
<210>46
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg    37
<210>47
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t          31
<210>48
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt            30
<210>49
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt         32
<210>50
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca       30
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg        29
<210>52
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at    32
<210>53
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat        29
<210>54
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
gtagacgcgg actaactctt tggcagaag             29
<210>55
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>55
ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt      35
<210>56
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>56
agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc    37
<210>57
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>57
ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca      35
<210>58
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>58
agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca    37
<210>59
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>59
ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg      35
<210>60
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>60
agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca    37
<210>61
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>61
ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa      35
<210>62
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>62
agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc    37
<210>63
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>63
ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa      35
<210>64
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>64
agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga    37
<210>65
<211>684
<212>DNA
<213>睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)
<400>65
atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac   60
ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc  120
aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg  180
ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc  240
gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg  300
gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac  360
gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc  420
acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc  480
acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt  540
gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc  600
aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag  660
gccggcctga aatatattga ctaa    684
<210>66
<211>227
<212>PRT
<213>睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)
<400>66
Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gln Arg Ala Asp Arg
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu
            20                  25                  30
Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Gly Lys Gln Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gln Pro
    50                  55                  60
Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gln Ile Gln Pro Gly
65                  70                  75                  80
Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe
                85                  90                  95
Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu
            100                 105                 110
Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Val Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp
        115                 120                 125
Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala
    130                 135                 140
Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val
145                 150                 155                 160
Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val
                165                 170                 175
Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu
            180                 185                 190
Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly
        195                 200                 205
Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys
    210                 215                 220
Tyr Ile Asp
225
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<223>引物
<400>74
agaggagagt tagagcc    17

Claims (13)

1.一种产生莫纳甜的方法，其特征在于，所述方法包括将葡萄糖转变成莫纳甜，包括：
(a)将葡萄糖转变成色氨酸；
(b)将色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸；
(c)将吲哚-3-丙酮酸转变成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)；和
(d)将2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸转变成莫纳甜。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)使所述色氨酸接触第1种多肽，其中所述第1种多肽将所述色氨酸转变成所述吲哚-3-丙酮酸；
(b)所述吲哚-3-丙酮酸接触第2种多肽和C3碳源，其中第2种多肽将所述吲哚-3-丙酮酸和C3碳源转变成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸；和
(c)所述2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸接触第3种多肽，其中所述第3种多肽将所述2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸转变成莫纳甜。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第1种多肽选自色氨酸转氨酶EC 2.6.1.27、色氨酸脱氢酶EC 1.4.1.19、酪氨酸转氨酶EC 2.6.1.5、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶EC 2.6.1.28、多底物转氨酶EC 2.6.1.-、天冬氨酸转氨酶EC 2.6.1.1、色氨酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶EC 1.4.3.2、D-氨基酸脱氢酶EC 1.4.99.1、D-氨基酸氧化酶EC 1.4.3.3、D-色氨酸转氨酶、D-丙氨酸转氨酶EC 2.6.1.21、谷氨酸脱氢酶EC 1.4.1.2-4、苯丙氨酸脱氢酶EC 1.4.1.20和它们的组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括用氨基酸氧化酶EC1.4.3.-和过氧化氢酶EC 1.11.1.6将所述色氨酸转变成所述吲哚-3-丙酮酸。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氨基酸氧化酶是色氨酸氧化酶。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第2种多肽选自EC 4.1.2.-酶、EC 4.1.3.-酶和氨基酸序列为SEQ ID NO：66的多肽。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述EC 4.1.3.-酶是4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶EC 4.1.3.16、4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶EC4.1.3.17或其组合。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述C3碳源选自丙酮酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或它们的组合。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第3种多肽选自酪氨酸转氨酶EC 2.6.1.5、色氨酸脱氢酶EC 1.4.1.19、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶EC 2.6.1.28、色氨酸转氨酶EC 2.6.1.27、天冬氨酸转氨酶EC 2.6.1.1、D-丙氨酸转氨酶EC2.6.1.21、D-色氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶EC 1.4.1.2-4、苯丙氨酸脱氢酶EC1.4.1.20、多底物转氨酶EC 2.6.1.-、D-氨基酸脱氢酶EC 1.4.99.1和它们的组合。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第3种多肽是天冬氨酸转氨酶。
11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第3种多肽是赖氨酸ε转氨酶。
12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第3种多肽选自有还原性胺化活性的酶和能再循环NADH或NADPH的多肽。
13.如权利要求2、3或9中任何一项所述的方法，其特征在于，所述第1种和/或第3种多肽选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
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