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CN100494364C - 碱性蛋白酶 - Google Patents

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CN100494364C
CN100494364C CNB031074561A CN03107456A CN100494364C CN 100494364 C CN100494364 C CN 100494364C CN B031074561 A CNB031074561 A CN B031074561A CN 03107456 A CN03107456 A CN 03107456A CN 100494364 C CN100494364 C CN 100494364C
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Abstract

本发明提供了一种碱性蛋白酶，其中，在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的(a)65号位置，(b)101号位置，(c)163号位置，(d)170号位置，(e)171号位置，(f)273号位置，(g)320号位置，(h)359号位置，或(i)387号位置或与之相应的位置上的氨基酸残基是从以下氨基酸残基中选择的：位置(a)：脯氨酸，位置(b)：天冬酰胺，位置(c)：组氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸或缬氨酸，位置(d)：缬氨酸或亮氨酸，位置(e)：丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸或苏氨酸，位置(f)：异亮氨酸，甘氨酸或苏氨酸，位置(g)：苯丙氨酸，丙氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸或甘氨酸，位置(h)：丝氨酸，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或谷氨酰胺，和位置(i)：丙氨酸，赖氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸和组氨酸。本发明能够有效生产并提供一种碱性蛋白酶，这种蛋白酶在即使存在高浓度脂肪酸的条件下也具有活性，并且在去除不仅含有蛋白，而且还含有皮脂等的复杂污渍方面具有出色的去污力，因此，可以作为一种酶掺入洗涤剂中。

Description

碱性蛋白酶
技术领域
本发明涉及可以作为一种酶添加到洗涤剂中的碱性蛋白酶，以及编码这种酶的基因。
背景技术
蛋白酶在工业领域的应用具有很长的历史，并且业已广泛扩展到包括洗涤剂在内的各种领域，如衣物洗涤剂，纤维改性剂，皮革处理剂，化妆组合物，洗浴添加剂，食品改性剂，和药物。其中，用于洗涤剂的蛋白酶是工业化大量生产的。例如，已知的蛋白酶包括Alcalase(商标；Novozymes的产品)，Savinase(商标；Novozymes的产品)，Maxacal(商标；Genencor的产品)，Blap(商标；Henkel的产品)，和KAP(Kao的产品)。
将蛋白酶掺入洗涤剂中，是为了降解主要由附着在衣物上的蛋白组成的污渍。实际上，污渍不仅包括蛋白，而且还包括混在其中的多种成分，包括有机物和无机物，如由皮脂产生的脂类和固体颗粒。因此，有必要开发具有足够高的去污能力的洗涤剂，以便除去这种复杂的污渍。
由于发现若干种碱性蛋白酶即使在存在高浓度脂肪酸的条件下，也能保持酪蛋白酶解活性，并且，在去除包括蛋白和皮脂的复杂污渍方面具有良好的去污能力，并且分子量为大约43000，本发明人业已就此提出了一项专利申请(参见专利文献1)。这种碱性蛋白酶在分子量、一级结构、酶促特性方面有所不同，并且具有来自枯草蛋白酶的很强的抗氧化剂作用，这种蛋白酶是已知的源于芽孢杆菌属的微生物的常规丝氨酸蛋白酶，因此认为应当将其归入新的枯草蛋白酶亚科(参见非专利文献1)。
上述碱性蛋白酶即使在存在高浓度脂肪酸的条件下，也具有酪蛋白酶解活性，并且在去除不仅包括蛋白，而且还包括皮脂等的复杂污渍方面具有出色的去污能力。但其产量不够工业规模生产。在考虑进一步改善去污力，以及工业规模的产量时，就需要具有与上述碱性磷酸酶类似的特性，并且具有更有效的蛋白酶解能力的碱性蛋白酶。
用于增强靶蛋白(酶)分泌的常规的已知方法的例子，包括通过宿主菌株(酶生产菌)改良，以及改良编码所述酶的基因或控制编码所述酶的基因表达的基因。不过，没有发现能够增加枯草蛋白酶分泌数量的改良例子。
另一方面，为了改善蛋白酶解能力，常用的方法是改变蛋白酶基因，以便提高每毫克蛋白的蛋白酶解活性，即比活性。有关为了改善枯草蛋白酶比活性而进行的蛋白质工程改变，有详细的报导(参见非专利文献2，非专利文献3，非专利文献4和非专利文献5等)。迄今为止所报导过的改变，证实了某些合成肽的比活性的提高，但是，没有改善针对天然底物的活性，这种活性被认为对去污力有影响。
为了提高对天然底物的比活性，据报导，通过用亮氨酸取代枯草蛋白酶E的31号位置上的异亮氨酸，可以提高对酪蛋白的蛋白酶解活性(参见非专利文献6)。这种情况不能作为参考，因为在上述碱性蛋白酶中，相应的氨基酸实际上是亮氨酸；并且，上述碱性蛋白酶在酶促特性方面，也与分子量大约为28000的枯草蛋白酶不同。
本发明的目的是提供一种具有更有效的蛋白酶解能力，在除去复杂的污渍方面具有出色的去污力，并且具有高的分泌能力的碱性蛋白酶。
专利文献1：(国际公开号99/18218)
非专利文献1：(Saeki等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，279，2000，313-319)
非专利文献2：(Wells等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1987，1219-1223)
非专利文献3：(Wells等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1987，5167-5171)
非专利文献4：(Taguchi等，Appl.Environ.Microbiol.64，1998，492-495)
非专利文献5：(Takagi等，Protein Eng.，11，1998，1205-1210，Bryan，Biochem.Biophys.Acta，1543，2000，203-222)
非专利文献6：(Takagi等，J.Biol.Chem.，36，1988，19592-19596)
发明内容
本发明人找到了一种新型酶，这种酶在培养期间能够有效分泌，而又没丧失上述碱性蛋白酶的特征。结果，本发明人业已发现，在其氨基酸序列的特定位置上具有特定氨基酸残基的某些碱性蛋白酶，能够满足上述要求。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种碱性蛋白酶，其中，在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的(a)65号位置，(b)101号位置，(c)163号位置，(d)170号位置，(e)171号位置，(f)273号位置，(g)320号位置，(h)359号位置，或(i)387号位置或与之相应的位置上的氨基酸残基是从以下氨基酸残基中选择的：
位置(a)：脯氨酸残基，
位置(b)：天冬酰胺残基，
位置(c)：组氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸或缬氨酸残基，
位置(d)：缬氨酸或亮氨酸残基，
位置(e)：丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸或苏氨酸残基，
位置(f)：异亮氨酸，甘氨酸或苏氨酸残基，
位置(g)：苯丙氨酸，丙氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸或甘氨酸残基，
位置(h)：丝氨酸，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或谷氨酰胺残基，和
位置(i)：丙氨酸，赖氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸或组氨酸残基。
在本发明的另一方面，还提供了含有上述基因的载体，以及含有这种载体的转化体。
在本发明的另一方面，还提供了一种含有所述碱性蛋白酶的洗涤剂组合物。
附图说明
图1表示与SEQ ID NO：1的氨基酸序列有至少80％同源性的碱性蛋白酶的氨基酸序列比对。
具体实施方式
本发明的碱性蛋白酶在SEQ ID NO：1的(a)65号位置，(b)101号位置，(c)163号位置，(d)170号位置，(e)171号位置，(f)273号位置，(g)320号位置，(h)359号位置，或(i)387号位置或与之相应的位置上的氨基酸残基是从以下氨基酸残基中选择的：
位置(a)：脯氨酸残基，位置(b)：天冬酰胺残基，位置(c)：组氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸或缬氨酸残基，位置(d)：缬氨酸或亮氨酸残基，位置(e)：丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸或苏氨酸残基，位置(f)：异亮氨酸，甘氨酸或苏氨酸残基，位置(g)：苯丙氨酸，丙氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸或甘氨酸残基，位置(h)：丝氨酸，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或谷氨酰胺残基，和位置(i)：丙氨酸，赖氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸或组氨酸残基。
换句话说，本发明的碱性蛋白酶具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，其中，位于选自上述(a)-(i)的位置上的或位于相当于另一种碱性蛋白酶的氨基酸序列的相应位置上的氨基酸残基，是一种特定的氨基酸残基。所述碱性蛋白酶可以是野生型的，其变体或人工变体。
当本发明的碱性蛋白酶是一种变体时，被称为“具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白酶”或“另一种碱性蛋白酶”的蛋白酶，表示诱变之前的碱性蛋白酶(可称之为“亲代碱性蛋白酶”)。通过将突变导入这种亲代碱性蛋白酶的理想位点，可以获得本发明的碱性蛋白酶。
“另一种碱性蛋白酶”可以是野生型的或野生型的变体。这种蛋白酶优选具有抗氧化剂作用，并且，在通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的分子量为43000±2000。其例子包括其氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少有80％的同源性的碱性蛋白酶。特别优选的是这样的碱性蛋白酶，它的氨基酸序列与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少80％，优选至少87％，更优选至少90％，更优选至少95％的同源性，在pH8或更高pH的碱性范围内工作，具有抗氧化剂作用，在50℃下，在pH10的条件下处理10分钟之后，能保留至少80％的原始活性，能被二异丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制，并且通过SDS-PAGE测定的分子量为43000±2000。
本文所使用的术语“具有抗氧化剂作用”，表示当在30℃下，在含有50mM过氧化氢和5mM氯化钙的20mM Britton-Robinson缓冲液(pH10)中处理20分钟之后，所述蛋白酶的残余活性至少为原始活性的50％。
“具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的碱性蛋白酶”的例子包括KP43[源于芽孢杆菌菌株KSM-KP43(FERM BP-6532)，WO99/18218]，而“其氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％的同源性的碱性蛋白酶”的例子包括蛋白酶KP9860(Genbank保藏号AB046403)[源于芽孢杆菌菌株KSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218]，蛋白酶KP9865(Genbank保藏号AB084155)[源于芽孢杆菌菌株KSM-KP9865(FERM P-18566)，专利申请号2002-002653]，蛋白酶E-1(Genbank保藏号AB046402)[源于芽孢杆菌菌株No.D-6(FERM P-1592)，日本专利公开号昭49-71191]，蛋白酶Ya(Genbank保藏号AB046404)[源于芽孢杆菌菌株YFERM BP-1029]，日本专利公开号昭61-280268]，蛋白酶SD521[源于芽孢杆菌菌株SD-521(Genbank保藏号AB046405)(FERM P-11162)，日本专利公开号Hei3-191781]，蛋白酶A-1(Genbank保藏号AB046406)[源于NCIB122489，WO88/01293]，和蛋白酶A-2(源于NCIB12513，WO98/56927)；通过用亮氨酸取代SEQ ID NO：1的氨基酸序列46号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用丙氨酸取代57号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用精氨酸取代103号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用赖氨酸取代107号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过分别用赖氨酸和丙氨酸取代124号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用丙氨酸取代136号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用丙氨酸取代193号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过分别用天冬酰胺、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酰胺、天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸取代195号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用缬氨酸取代257号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用丙氨酸取代342号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过分别用天冬氨酸和丝氨酸取代66和264号位置上的氨基酸残基获得的变体(日本专利申请号2000-355166)；通过用精氨酸取代SEQ ID NO：1的84号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过用脯氨酸取代104号位置上的氨基酸残基获得的变体，通过分别用丙氨酸和丝氨酸取代256号位置上的氨基酸残基获得的变体，和通过用天冬酰胺取代369号位置上的氨基酸残基获得的变体(日本专利申请号2001-114048)；和通过分别用天冬酰胺、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和谷氨酰胺取代SEQ ID NO：1氨基酸序列的251号位置上的氨基酸残基获得的变体，以及通过分别用丝氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、缬氨酸和丙氨酸取代256号位置上的氨基酸残基获得的变体(日本专利申请号2001-329472)；与上述任意一种氨基酸序列具有至少80％，优选至少87％，更优选至少90％，更优选至少95％的同源性的碱性蛋白酶。
氨基酸序列的同源性是通过Lipman-Pearson’s方法计算的(Science，227，1435，1985)。
SEQ ID NO：1所示碱性蛋白酶的氨基酸残基优选为位置(a)上的苏氨酸，位置(b)上的甘氨酸，位置(c)上的谷氨酸，位置(d)上的异亮氨酸，位置(e)上的丝氨酸，位置(f)上的缬氨酸，位置(g)上的酪氨酸，位置(h)上的苏氨酸，和位置(i)上的丝氨酸。与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少80％的同源性的其他碱性蛋白酶优选具有苏氨酸作为相当于位置(a)的位置上的氨基酸残基，丝氨酸作为相当于位置(b)的位置上的氨基酸残基，谷氨酸作为相当于位置(c)的位置上的氨基酸残基，异亮氨酸作为相当于位置(d)的位置上的氨基酸残基，丝氨酸作为相当于位置(e)的位置上的氨基酸残基，缬氨酸作为相当于位置(f)的位置上的氨基酸残基，酪氨酸作为相当于位置(g)的位置上的氨基酸残基，苏氨酸作为相当于位置(h)的位置上的氨基酸残基，和酪苏氨酸作为相当于位置(i)的位置上的氨基酸残基。
当本发明的碱性蛋白酶是一种变体时，所述亲代碱性蛋白酶的优选例子除了具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的碱性蛋白酶之外，还包括与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少87％，更优选至少90％，更优选至少95％的同源性，并且具有上述酶促特性和/或在相当于SEQ ID NO：1的位置(a)-(i)的位置上具有上述氨基酸残基的蛋白酶。
“与之相应的位置上的氨基酸残基”可以通过使用诸如Lipman-Pearson’s方法的已知程序比较氨基酸序列，并且得出与存在于每一种碱性蛋白酶的氨基酸序列上的保守氨基酸残基的最大同源性进行鉴定。通过以不考虑氨基酸序列的插入或缺失的方式比较蛋白酶的氨基酸序列，可以确定相应氨基酸残基在每一种蛋白酶序列上的位置。据推测，所述相应位置存在于相同的三维位置上，并且能对有关蛋白酶的特定功能产生类似影响。
根据图1，其中，通过上述方法对氨基酸序列进行比对，
(a)SEQ ID NO：1的65号位置上的氨基酸残基是苏氨酸残基。通过采用上述方法，与之相应的位置上的氨基酸残基可以被确定为诸如蛋白酶KP9860的65号位置上的苏氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中，65号位置上的氨基酸残基优选是脯氨酸残基。
(b)尽管SEQ ID NO：1的101号位置上的氨基酸残基是甘氨酸残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶E-1的与之相应的位置上的氨基酸残基是100号位置上的丝氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中，101号位置上的氨基酸残基优选是天冬酰胺残基。
(c)尽管SEQ ID NO：1的163号位置上的氨基酸残基是谷氨酸残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶E-1的与之相应的位置上的氨基酸残基是162号位置上的谷氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中，163号位置上的氨基酸残基优选是组氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，苏氨酸或缬氨酸残基，特别优选的是苏氨酸或缬氨酸残基。
(d)尽管SEQ ID NO：1的170号位置上的氨基酸残基是异亮氨酸残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶E-1的与之相应的位置上的氨基酸残基是169号位置上的异亮氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中，170号位置上的氨基酸残基优选是缬氨酸或亮氨酸残基。
(e)尽管SEQ ID NO：1的171号位置上的氨基酸残基是丝氨酸残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶E-1的与之相应的位置上的氨基酸残基是170号位置上的丝氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中，171号位置上的氨基酸残基优选是丙氨酸，谷氨酸、甘氨酸或苏氨酸，特别优选的是甘氨酸或苏氨酸残基。
(f)尽管SEQ ID NO：1的273号位置上的氨基酸残基是缬氨酸残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶A-2的与之相应的位置上的氨基酸残基是272号位置上的缬氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中，273号位置上的氨基酸残基优选是异亮氨酸，甘氨酸或苏氨酸残基，特别优选的是异亮氨酸残基。
(g)尽管SEQ ID NO：1的320号位置上的氨基酸残基是酪氨酸残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶SD-521的与之相应的位置上的氨基酸残基是319号位置上的酪氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中，320号位置上的氨基酸残基优选是苯丙氨酸，缬氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸或甘氨酸残基，特别优选的是苯丙氨酸残基。
(h)尽管SEQ ID NO：1的359号位置上的氨基酸残基是苏氨酸残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶Ya的与之相应的位置上的氨基酸残基是358号位置上的苏氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中，359号位置上的氨基酸残基优选是丝氨基，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸或谷氨酸残基，特别优选的是丝氨酸残基。
(i)尽管SEQ ID NO：1的387号位置上的氨基酸残基是丝氨酸残基，通过上述方法可以确定诸如蛋白酶D-521的与之相应的位置上的氨基酸残基是386号位置上的酪氨酸残基。在本发明的碱性蛋白酶中，387号位置上的氨基酸残基优选是丙氨基，赖氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸或组氨酸残基，特别优选的是丙氨酸残基。
与蛋白酶KP43的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的位置(a)65，(b)101，(c)163，(d)170，(e)171，(f)273，(g)320，(h)359和(i)387相应的位置以及这些位置上的氨基酸残基的具体例子优选用“其他碱性蛋白酶”中的碱性蛋白酶表示(表1)。
表1
Figure C03107456D00101
在位置位置(a)65，(b)101，(c)163，(d)170，(e)171，(f)273，(g)320，(h)359或(i)387或与之相应的位置上具有预定氨基酸残基的本发明的碱性蛋白酶具有增强了的分泌能力，特别是当它是转化体时尤其如此(参见例2)，而在位置(c)163，(d)170或(e)171或与之相应的位置上具有预定氨基酸残基的碱性蛋白酶对酪蛋白具有特别强的比活性(参见例3)。
在本发明的碱性蛋白酶中，可以同时取代位置(a)-(i)中的两个或两个以上氨基酸残基，因为这种取代既不会导致酶促活性的改变，也不会导致酶促特性的改变。以下是在两个或两个以上位置上同时进行取代的优选的具体例子。氨基酸用三个字母表示，而“+”表示在紧随一个位置上的取代之后是另一个取代，而“/”表示所标出的任何氨基酸都可以使用。
从提高分泌能力的角度出发，优选的双重取代例子包括Thr65Pro+Gly101Asn，Thr65Pro+Va1273(Ile/Gly/Thr)，Gly101Asn+Thr359(Ser/Leu/Val/Ile/Gln)，和Va1273(Ile/Gly/Thr)+Tyr320(Phe/Val/Thr/Leu/Ile/Gly)，特别优选的是Thr65Pro+Ser387Ala和Thr359Ser+Ser387Ala。从增强比活性的角度出发，优选的例子包括Glu163(Phe/Leu/Gln/Val)+Ser171A1a，Glu163(Ala/Asp/Ile/Leu/Ser/Thr/Val)+Ser171Gly，和Glu163(Ala/His/Ile/Lys/Leu/Gln/Thr/Val)+Ser171Thr，特别优选的是Glu163Thr+Ser171Thr，Glu163Thr+Ser171Gly和Glu163Val+Ser171Gly。
从提高分泌能力角度出发，优选的三重取代的例子包括Thr65Pro+Gly101Asn+Va1273(Ile/Gly/Thr)，Tyr320(Phe/Val/Thr/Ileu/Ile/Gly)+Va1273(Ile/Gly/Thr)+Ser387(Ala/Lys/Gln/Glu/Arg/His)，和Thr65Pro+Tyr320(Phe/Val/Thr/Leu/Ile/Gly)+Thr359(Ser/Leu/Val/Ile/Gln)，优选Thr65Pro+GlyAsn+Ser387Ala，Thr65Pro+Va1673Ile+Tyr320Phe和Thr65Pro+Tyr320Phe+Ser387Ala，特别优选的是Thr65Pro+Va1273Ile+Thr359Ser，Thr65Pro+Va1273Ile+Ser387A1a和Thr65Pro+Tyr320Gly+Ser387Ala。
从提高分泌能力角度出发，四重取代的例子包括Thr65Pro+Gly101Asn+Va1273(Ile/Gly/Thr)+Tyr320(Phe/Va1/Thr/Ieu/Ile/Gly)，Thr65Pro+Tyr320(Phe/Val/Thr/Ieu/Ile/Gly)+Thr359(Ser/Leu/Val/Ile/Gln)+Ser387(Ala/Lys/Gln/Glu/Arg/His)，和Gly101Asn+Va1273(Ile/Gly/Thr)+Tyr320(Phe/Val/Thr/Ieu/Ile/Gly)+Ser387(Ala/Lys/Gln/Glu/Arg/His)，优选Thr65Pro+Va1273Ile+Thr359(Ser/Leu/I1e/Val/Thr)+Ser387(Glu/Ala)，Thr65Pro+Va1273Ile+Tyr320(Val/Leu/Phe/Thr)+Ser387(Ala/His/Gln)；特别优选的是Thr65Pro+Va1273Ile+Thr359Ser+Ser387(Ala/Lys)，Thr65Pro+Va1273Ile+Thr359Gln+Ser387Ala，Thr65Pro+Va1273Ile+Tyr320Phe+Ser387(Gln/Lys)，和Thr65Pro+Va1273Ile+Tyr320I1e+Sen387Gln。
还可以采用五重或六重取代。
例如，本发明的碱性蛋白酶可以通过以下方法获得。具体地讲，可以通过以下步骤获得：将突变导入编码亲代碱性蛋白酶的克隆的基因(SEQ ID NO：2)，用所得到的突变基因转化合适的宿主，培养所得到的重组宿主，以及随后从培养液中收集目标碱性蛋白酶。编码亲代碱性蛋白酶的基因的克隆可以用常用的重组DNA技术进行，例如按照披露于WO99/18218或WO98/56927中的方法进行。
为了诱变编码亲代碱性蛋白酶的基因，可以采用常用的随机诱变或位点专一诱变中的任一种。更具体地讲，可以用诸如“定点诱变系统Mutan-Super ExpressKm试剂盒”(Takara Bio的产品)的试剂盒进行诱变。可以通过重组PCR(聚合酶链式反应)方法(PCR方法，Academic Press，New York，1990)，用另一种基因的与目标序列相应的序列取代一种基因的目标序列。
为了用所得到的突变基因生产本发明的蛋白酶，例如，可以使用将所述突变基因连接在能够稳定扩增它的载体上的方法，从而导致宿主细菌的转化，或者将所述突变基因导入能够稳定维持该突变基因的宿主细菌的染色体DNA上。满足上述条件的宿主细胞包括属于芽孢杆菌属、大肠杆菌、霉菌、酵母和放线菌属的微生物。使用上述菌株，可以将业已导入了所述突变基因的宿主细胞接种到含有碳源、氮源和其他必需养分的可同化的培养基中，然后按常规方法培养。
可以按照常用的酶收获和纯化方法，从由此获得的培养液中收获所述碱性蛋白酶，并进行纯化。例如，可以通过离心分离或过滤除去培养液中的细菌，然后按常规方法纯化所述酶获得目标酶。由此获得的酶溶液可以直接使用，或者按已知方法进一步纯化、结晶、粉碎或颗粒化。
由此获得的具有抗氧化剂能力的蛋白酶，不会因为高浓度的脂肪酸而抑制其酪蛋白酶解活性。通过SDS-PAGE测定其分子量为43000±2000，在碱性范围内具有活性。当它是转化体形式时，具有增强了的分泌能力，和/或与亲代碱性蛋白酶相比，增强了对酪蛋白的比活性。
本文所使用的术语“具有高的分泌能力”，表示在与类似于亲代碱性蛋白酶的条件下测定上清液中的蛋白酶活性和蛋白含量时(例如，在接种到一种培养基中之后，在37℃下摇晃培养3天，该培养基包括8％(w/v)聚蛋白胨S，0.3％酵母提取物，10％麦芽糖，0.04％硫酸镁7水合物，0.2％磷酸二氢钾，1.5％无水碳酸钠，和30ppm四环素)，所述碱性蛋白酶变体至少表现出预定的酶活性或蛋白含量。例如，这意味着可能发现酶活性或蛋白含量提高了至少5％，优选至少10％，更优选至少20％。当不能确定比活性的任何变体时，可以测定酶活性或蛋白含量中的任意一项，因为亲代碱性蛋白酶和碱性蛋白酶变体被认为在酶活性与蛋白含量的比例上是相似的。
与具有抗氧化剂作用的亲代碱性蛋白酶相比，对酪蛋白底物具有增强了的比活性的碱性蛋白酶变体，不会因为高浓度的脂肪酸而抑制其酪蛋白酶解活性，通过SDS-PAGE测定该变体的分子量为43000±2000，并且在碱性范围内具有活性。特别优选的是具有亲代碱性蛋白酶的上述各种特性的蛋白酶变体。
因此，本发明的碱性蛋白酶可以作为一种酶掺入各种洗涤剂组合物中。尽管对添加到洗涤剂组合物中的本发明的碱性蛋白酶的用量没有具体限制，只要它能发挥其活性就行，不过，通常是以每千克洗涤剂组合物0.1-5000Pu的用量添加的。出于经济方面的考虑，优选500Pu或更低。
可以将各种酶与本发明的碱性蛋白酶组合应用于本发明的洗涤剂组合物中。其例子包括水解酶，氧化酶，还原酶，转移酶，裂合酶，异构酶，连接酶和合成酶。其中，除了本发明碱性蛋白酶以外的蛋白酶，优选是纤维素酶，角蛋白酶，酯酶，角化酶，淀粉酶，脂酶，支链淀粉酶，果胶酶，甘露糖酶，葡糖苷酶，葡聚糖酶，胆甾醇氧化酶，过氧化物酶，和漆酶，其中特别优选的蛋白酶是纤维素酶，淀粉酶和脂酶。蛋白酶包括商业化销售的Alcalase(商标；Novozymes的产品)，Esperase(商标；Novozymes的产品)，Savinase(商标；Novozymes的产品)，Everlase(商标；Novozymes的产品)，Kannase(商标；Novozymes的产品)，Properase(商标；Genencor International的产品)，Purafect(商标；Genencor International的产品)和KAP(Kao的产品)。纤维素酶包括Celluzyme(商标；Novozymes的产品)，Carezyme(商标；Novozymes的产品)，KAC(Kao的产品)，披露于日本专利公开号Hei10-313859中的由芽孢杆菌菌株KSM-S237生产的碱性纤维素酶，和披露于日本专利申请号2002-116553中的突变的碱性纤维素(都是Kao的产品)。淀粉酶包括Termamyl(商标；Novozymes的产品)，Duramyl(商标；Novozymes的产品)，Purastar(商标；Genencor International的产品)和KAM(Kao的产品)。脂酶包括Lipolase(商标；Novozymes的产品)，和Lipolase Ultra(商标；Novozymes的产品)。
当除了本发明的碱性蛋白酶以外的蛋白酶也被掺入洗涤剂组合物中时，其用量优选为每千克0.1-500PU。当组合使用所述纤维素酶时，其添加量优选为每千克洗涤剂组合物300-3000000KU，这一用量是根据通过披露于[0020]日本专利公开号Hei10-313859中的酶促活性测定方法测定的单位(KU)确定的。当组合使用淀粉酶时，其用量优选为每千克0.1-500PU。当组合使用所述纤维素酶时，其添加量优选为每千克洗涤剂组合物50-500000IU，这一用量是根据通过披露于[0040]日本专利公开号Hei11-43690中的淀粉酶活性测定方法测定的单位(IU)确定的。当组合使用脂酶时，其添加量优选为每千克洗涤剂组合物10000-100000LU，这一用量是根据通过披露于日文公开(PCT)号Hei8-500013的例1中的脂酶活性测定方法测定的单位(LU)确定的。
可以将已知的洗涤成分掺入本发明的洗涤剂组合物中。所述已知洗涤成分如下。
(1)表面活性剂
将用量为0.5-60wt.％的表面活性剂掺入洗涤剂组合物中。优选分别向粉状洗涤剂组合物和液体洗涤剂组合物中添加10-45wt.％和20-50wt.％的表面活性剂。当本发明的洗涤剂组合物是漂白洗涤剂或自动洗碗洗涤剂时，洗涤剂的添加量通常为1-10wt.％，优选1-5wt.％。
作为用于本发明洗涤剂组合物的表面活性剂，可以单独或组合使用阴离子型表面活性剂，非离子型表面活性剂，两性离子表面活性剂和阳离子型表面活性剂。其中，优选阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。
非离子型表面活性剂的例子包括C10-18醇的硫酸盐，烷氧基化C8-20醇的硫酸盐，烷基苯磺酸盐，石蜡磺酸盐，α-烯属磺酸盐，α-磺基脂肪酸盐，α-磺基脂肪酸的烷基酯盐和脂肪酸盐。在本发明中，特别优选的是具有C10-14，更优选C18-15烷基直链的直链烷基苯磺酸盐。作为平衡离子，优选碱金属盐和铵，其中特别优选的是钠和/或钾，单乙醇胺和二乙醇胺。
非离子型表面活性剂的优选例子包括聚氧化亚烃烷基(C8-20)醚，烷基聚糖苷，聚氧化亚烃烷基(C8-20)苯基醚，聚氧化亚烃山梨聚糖脂肪酸(C8-22)酯，和聚氧化亚烃二醇脂肪酸(C8-22)酯，和聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物。其中，特别优选的非离子型表面活性剂是通过将4-20摩尔的诸如氧化乙烯或氧化丙烯的氧化亚烃添加到C10-18醇中获得的聚氧化亚烃烷基醚[HLB数量(通过Griffin方法计算)为10.5-15.0，优选11.0-14.5]。
(2)二价金属离子清除剂
以0.01-50wt％，优选5-40wt％的用量将二价金属离子清除剂添加到洗涤剂组合物中。可以掺入本发明洗涤剂组合物中的二价金属离子清除剂的例子包括诸如三聚磷酸盐，焦磷酸盐和正磷酸盐的缩聚磷酸盐，诸如沸石的硅铝酸盐，合成的层状结晶硅酸盐，次氮基三乙酸盐，乙二胺四乙酸，柠檬酸盐，异柠檬酸盐和聚缩醛羧酸盐。其中，特别优选的是结晶硅铝酸盐(合成的沸石)。在A型、X型和P型的沸石中，A型沸石是特别优选的。平均一级粒度为0.1-10微米，特别是0.1-5微米的合成沸石是适合使用的。
(3)碱性试剂
以0.01-80wt％，优选1-40wt％的用量将碱性试剂添加到洗涤剂组合物中。添加到粉状洗涤剂中的碱性试剂包括碱金属碳酸盐，如碳酸钠，通常被称为稠苏打或轻苏打，以及JIS No.1，2或3的非晶碱金属硅酸盐。所述无机碱性试剂在干燥洗涤剂时能有效形成每个颗粒的核心，因此，能够制备具有良好流动性的比较坚硬的洗涤剂。除了上述试剂之外，碳酸氢三钠和碳酸氢钠也可用作碱性试剂。诸如三聚磷酸盐的磷酸盐也具有碱性试剂的作用。除了上述碱性试剂之外，可以添加到液体洗涤剂中的碱性试剂的例子还包括氢氧化钠和1-，2-，和3-乙醇胺。可将其用作表面活性剂的平衡离子。
(4)抗再沉积剂
以0.001-10wt％，优选1-5wt％的用量将抗再沉积剂添加到洗涤剂组合物中。添加到本发明洗涤剂组合物中的抗再沉积剂的例子包括聚乙二醇，羧酸聚合物，聚乙烯醇，和聚乙烯吡咯烷酮。其中，羧酸聚合物具有金属离子清除功能，和将来自衣物的固体颗粒状污物分散到洗涤液中的能力，还具有抗再沉积作用。羧酸聚合物包括丙烯酸，异丁烯酸或亚甲基丁二酸等的均聚物或共聚物。作为共聚物，优选通过共聚上述单体和马来酸获得的共聚物。共聚物的分子量优选为数千-100000。同样，作为上述羧酸聚合物，优选诸如聚缩水甘油的聚合物，诸如羧甲基纤维素的纤维素衍生物，或诸如聚天冬氨酸的氨基羧酸聚合物，因为它们同样具备金属离子清除剂和分散剂的能力，并且具有抗再沉积作用。
(5)漂白剂
优选以1-10wt％的用量将诸如过氧化氢或过碳酸盐的漂白剂添加到洗涤剂组合物中。在使用漂白剂时，可以根据洗涤剂组合物的量添加0.01-10wt％的漂白激活剂，如四乙基乙二胺(TAED)或披露于日本专利公开号Hei6-316700中的漂白激活剂。
(6)荧光增白剂
作为荧光增白剂，可以将联苯类(如Tinopal CBS-X)和二苯乙烯类(如DM荧光染料)增白剂添加到本发明的洗涤剂组合物中。优选以占洗涤剂组合物0.001-2％的用量添加。
(7)其他成分
在本发明的洗涤剂组合物中，可以添加衣物洗涤剂领域公知的助洗剂、软化剂、还原剂(如亚硫酸氢盐)、消泡剂(如硅氧烷)、芳香剂和其他添加剂。
可以通过组合使用通过上述方法获得的本发明的碱性蛋白酶和上述已知洗涤剂成分，用常规方法制备本发明的洗涤剂组合物。洗涤剂形式可以根据使用目的进行选择。例如，包括液体、粉末、颗粒、糊剂和固体。
由此获得的本发明的洗涤剂组合物可以用作衣物洗涤剂，漂白剂，硬表面清洁剂，管道清洗剂，人工牙齿清洁剂，用于医疗器械的消毒清洁剂等。
实施例
[蛋白酶活性测定方法——酪蛋白方法]
在30℃下，将1.0毫升含有1％(w/v)酪蛋白的50mM硼酸缓冲液(pH10.5)保持5分钟，然后添加0.1毫升的酶溶液，并且让所得到的混合物反应15分钟。将2.0毫升反应终止溶液(0.11M三氯乙酸-0.22M乙酸钠-0.33M乙酸)添加到该反应混合物中。将该混合物在室温下放置30分钟，然后过滤。通过Lowry等的改进方法测定滤液中的酸溶性蛋白。具体地讲，将2.5毫升碱性铜溶液[1％酒石酸钠.钾：1％5水合硫酸铜：2％碳酸钠：0.1N氢氧化钠＝1:1:100]添加到0.5毫升的滤液中，然后将所得到的混合物在室温下放置10分钟。然后添加0.25毫升的苯酚溶液[用蒸馏水稀释2倍的苯酚试剂(Kanto Kagaku的产品)]。将所得到的混合物在30℃下保持30分钟，然后测定660纳米波长下的吸收值。一个蛋白酶单位(1PU)被定义为在上述反应条件下，在1分钟内释放出相当于1mM酪氨酸的酸溶性蛋白酶解产物所需要的酶的量。
例1
将随机诱变导入碱性蛋白酶结构基因中，该基因源于芽孢杆菌菌株KSM-KP43，它具有大约2.0kb，包括一个终止密码子。为了导入随机诱变，将没有错误整合回收能力的Taq聚合酶Takara Taq(TakaraBao的产品)用作DNA聚合酶，以便在PCR中使用一个碱基的错误整合。首先，使用能够扩增该2.0kb DNA的引物1(SEQ ID NO：3)和引物2(SEQ ID NO：4)进行PCR。引物1通过BamHI接头连接在正义链的5’末端，而引物2通过XbaI接头连接在反义链的5’末端。作为使用的反应系统，在100微升混合物中含有10纳克模板DNA，10皮摩尔每一种引物，20纳摩尔dNTP，10微升Takara Taq-加成反应缓冲液和2.5U Taq聚合酶。在94℃下，在PCR条件下对模板DNA进行变性2分钟，然后进行30轮PCR，每一轮包括以下处理：94℃1分钟，55℃1分钟，和72℃2分钟。通过PCR产物纯化试剂盒(Roche的产品)纯化PCR产物，然后用100微升无菌水洗脱。用1微升的洗脱物作为DNA模板，进行第2轮PCR。纯化由此获得的PCR产物，并用于下文披露的检测。
用BamHI和XbaI(Roche)裂解大约2.0kb的扩增DNA片段的限制酶接头。作为用于整合扩增DNA的表达载体，pHA64(日本专利申请号Hei8-323050；在启动子64下游具有BamHI和XbaI位点)能够在属于芽孢杆菌的细菌中复制。混合用BamHI和XbaI处理过的扩增DNA片段和用BamHI和XbaI作过类似处理的pHA64，然后用“LigationHigh”(Toyobo产品)进行连接酶反应。通过乙醇沉淀从连接酶反应混合物中收集DNA，并将它用作随后转化的DNA。
将芽孢杆菌菌株KSM-KP43(下面将简称为“菌株KP-43”)用作转化的宿主细胞。转化方法采用电穿孔方法，并且用“SSH-10”(Shimadzu的产品)和基因脉冲池(BioRad的产品)进行转化。
在含有脱脂乳的碱性琼脂培养基[含有1％脱脂乳(Difco的产品)，1％细菌培养用胰化蛋白胨(Difco的产品)，0.5％酵母提取物(Difco的产品)，0.5％氯化钠，1.5％琼脂，0.05％无水碳酸钠和15ppm四环素]上培养KP43菌株的转化体，并且观察光晕的形成，以便判断是否导入了所述蛋白酶基因。
选择具有在pHA64上插入了蛋白酶基因的质粒的转化过的菌株KP43，并用于随后的培养。
例2
在分离单菌落并且证实光晕形成之后，将在例1中获得的转化体分别接种到5毫升种子培养基A[6.0％(w/v)聚蛋白胨S(NipponPharmaceutical的产品)，0.1％酵母提取物，1.5％麦芽糖，0.02％硫酸镁7水合物，0.1％磷酸二氢钾，0.3％无水碳酸钠和30ppm四环素]中，并且在30℃下以320rpm的旋转速度预培养过夜。将由此获得的种子培养基(1％(v/v))接种到500毫升Sakaguchi烧瓶中的20毫升主培养基[8％(w/v)聚蛋白胨S，0.3％酵母提取物，10％麦芽糖，0.04％硫酸镁7水合物，0.2％磷酸二氢钾，1.5％无水碳酸钠和30ppm四环素]中，并且在30℃下以121rpm的旋转速度培养3天。将由此获得的培养基进行离心，并测定培养上清液中的蛋白酶活性。采用所述酪蛋白方法测定蛋白酶活性，同时用蛋白测定试剂盒(Wako Pure Chemicals的产品)测定蛋白含量。筛选突变的蛋白酶基因，该基因在蛋白酶活性方面的增强，被认为是与通过在类似条件下培养具有野生型酶基因的转化体获得的培养上清液的蛋白酶活性进行比较的结果。培养上清液中蛋白含量表现出大体上与蛋白酶活性成比例地提高，这表明增强蛋白含量分泌所需要的突变业已被导入由此获得的变体中。
用“高纯度质粒分离试剂盒”(Roche产品)从筛选的转化体中收集所述质粒，并且测定其核苷酸序列。用300纳克质粒DNA作模板，使用一种引物和“Big Dye DNA测序试剂盒”(Applied Biosystems产品)在20微升反应系统中进行PCR。用“DNA测序仪377型”(AppliedBiosystems产品)对PCR产物进行分析。
结果发现，具有增强了的蛋白酶活性的变体在65号位置上的苏氨酸，在101号位置上的甘氨酸，在273号位置上的缬氨酸，在320号位置上的酪氨酸，在359号位置上的苏氨酸，和在387号位置上的丝氨酸分别被脯氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸，丝氨酸和丙氨酸所取代。发现通过这种取代可以将蛋白酶活性提高大约5％(表2)。
研究了由于组合使用上述突变位点所导致的蛋白酶活性的增强。使用下文所披露的引物和“定点诱变系统Mutan-Super Express Km试剂盒”作为位点专一性诱变手段，研究了突变位点的组合。
引物3：65号位置上的苏氨酸(T)被脯氨酸(P)取代(SEQ ID NO：5)
引物4：101号位置上的甘氨酸(G)被天冬酰胺(N)取代(SEQ IDNO：6)
引物5：273号位置上的缬氨酸(V)被异亮氨酸(I)取代(SEQ IDNO：7)
引物6：320号位置上的酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)取代(SEQ IDNO：8)
引物7：359号位置上的苏氨酸(T)被丝氨酸(S)取代(SEQ IDNO：9)
引物8：387号位置上的丝氨酸(S)被丙氨酸(A)取代(SEQ IDNO：10)
通过将上述筛选获得的突变蛋白酶基因导入具有用于卡那霉素筛选的琥珀突变标记的pKF18k的多克隆位点中的BamHI和XbaI位点，构建用于导入突变的模板质粒。
为了进行导入位点专一性突变的PCR，采用“Takara LA Taq”(Takara的产品)。用于导入突变的PCR是使用5’末端磷酸化筛选引物(“Mutan-Super Express Km”的试剂盒成分)和向其中导入了突变的引物3-8各5皮摩尔，并使用10纳克模板质粒。在94℃下，在反应条件下，将模板DNA变性2分钟，然后进行30轮PCR，每一轮包括以下处理：94℃1分钟，55℃1分钟，和72℃4分钟。用所获得的PCR产物转化大肠杆菌菌株MV1184，以便获得突变质粒。按照上述核苷酸序列测定方法，证实所得到的突变质粒的突变位点。
将通过位点专一性诱变导入了突变的蛋白酶基因导入pHA64，用于转化菌株KP-43，然后在上述培养条件下培养。与研究过的野生型酶相比，所述突变位点的组合能够加强蛋白酶活性。
结果，在以下组合中发现蛋白酶活性提高了10-30％(突变位点的组合通过+表示，表2)：T65P+S387A，T359S+S387A，T65P+V273I+Y320F，T65P+V273I+T359S，T65P+V273I+S387A，T65P+Y320F+S387A，T65P+G101N+S387A，和T65P+V273U+T359S+S387A。
采用以下引物，分别用需要的氨基酸残基取代了65、101、273、320、359和387号位置上的氨基酸残基。然后研究所述每一个位点上的氨基酸残基是否能够用除了上述取代氨基酸残基以外的氨基酸残基取代，并且证实所述氨基酸残基的组合是可以取代的。
引物9：65号位置上的苏氨酸(T)被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：11)
引物10：101号位置上的甘氨酸(G)被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：12)
引物11：273号位置上的缬氨酸(V)被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：13)
引物12：320号位置上的苏氨酸(T)被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：15)
引物14：387号位置上的丝氨酸(S)被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：16)
结果发现，与野生型相比，当273号位置上的缬氨酸被异亮氨酸、甘氨酸或苏氨酸所取代，320号位置上的酪氨酸被苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或甘氨酸所取代，359号位置上的苏氨酸被丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺所取代，并且387号位置上的丝氨酸被丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸或组氨酸所取代时，酶的分泌增加，这表明可以在每一个位置上实现所述氨基酸的取代。
下面是某些组合的结果：在以下组合中发现蛋白酶活性提高了10-30％(表2)：T65P+Y320F+S387E，T65P+Y320G+S387A，T65P+V273I+T359S+S387E，T65P+V273I+T359L+S387A，T65P+V273I+T359I+S387A，T65P+V273G+T359S+S387A，T65P+V373I+T359S+S387K，T65P+V273I+T359V+S387A，T65P+V273I+T359Q+S387A，T65P+V273I+Y320F+S387K，T65P+V273I+Y320F+S387E，T65P+V273I+Y320F+S387K，T65P+V273I+Y320F+S387A，T65P+V273I+Y320L+S387H，T65P+V273I+Y320V+S387Q，和T65P+V273I+Y320I+S387Q。
表2
Figure C03107456D00221
业已证实，通过上述突变位点的任意一种组合所获得的碱性蛋白酶在其转化体形式下增强了所述酶的分泌，同时又保持了其亲代碱性蛋白酶的特征，更具体地讲，具有抗氧化剂作用，不会因为高浓度脂肪酸而抑制其酪蛋白酶解活性，通过SDS-PAGE测定其分子量为43000±2000，并且在碱性范围内具有活性。
例3
在分离单菌落并且证实光晕形成之后，将在例1中获得的转化体分别接种到试管中的5毫升种子培养基[6.0％(w/v)聚蛋白胨S(NipponPharmaceutical的产品)，0.1％酵母提取物，0.1％麦芽糖，0.02％硫酸镁7水合物，0.1％磷酸二氢钾，0.3％无水碳酸钠和30ppm四环素]中，并且在30℃下以320rpm的旋转速度预培养过夜。将由此获得的种子培养基(1％(v/v))接种到500毫升Sakaguchi烧瓶中的20毫升主培养基[8％(w/v)聚蛋白胨S，0.3％酵母提取物，10％麦芽糖，0.04％硫酸镁7水合物，0.2％磷酸二氢钾，1.5％无水碳酸钠和30ppm四环素]中，并且在30℃下以121rpm的旋转速度培养3天。将由此获得的培养基进行离心，并测定培养上清液中的蛋白酶活性。蛋白酶活性是通过采用酪蛋白作底物的活性测定方法测定的，同时用“蛋白测定试剂盒”(Wako Pure Chemicals的产品)测定蛋白含量。筛选突变的蛋白酶基因，该基因在蛋白酶活性方面的增强被认为是与通过在类似条件下培养具有野生型酶基因的转化体获得的培养上清液的蛋白酶活性进行比较的结果。与培养上清液中蛋白酶活性的增强相比，蛋白含量的增加不太明显，这表明增强所述酶的比活性所必需的突变被导入了由此获得的突变蛋白酶基因中。
用“高纯度质粒分离试剂盒”(Roche产品)从筛选的转化体中收集所述质粒，并且测定其碱基序列。用300纳克质粒DNA作模板，使用一种引物和“Big Dye DNA测序试剂盒”(Applied Biosystems产品)在20微升反应系统中进行PCR。用“DNA测序仪377型”(AppliedBiosystems产品)对PCR产物进行分析。
结果发现，具有增强了的蛋白酶活性的变体在163号位置上的谷氨酸，170号位置上的异亮氨酸，171号位置上的丝氨酸分别被组氨酸，缬氨酸和丙氨酸所取代。
对一部分培养基进行稀释，然后加样到用含有2mM氯化钙的10mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡的“DEAE-Toyopearl”(Tosoh的产品)上，以便收集非吸收性级份，从而获得基本上均匀的蛋白酶。测定由此纯化的酶的蛋白含量和酪蛋白酶解活性，并且计算其比活性。结果发现，通过导入上述突变会导致蛋白酶比活性提高大约15-20％(表3)。
研究了通过用一种需要的氨基酸取代上述突变位点而增强的蛋白酶活性。使用下文所披露的引物和“定点诱变系统Mutan-SuperExpress Km试剂盒”作为位点专一性诱变手段，研究了突变位点的组合。
引物15：163号位置上的谷氨酸(E)被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：17)
引物16：170号位置上的异亮氨酸(I)被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：18)
引物17：171号位置上的丝氨酸(S)被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：19)
引物18：163号位置上的谷氨酸(E)和171号位置上的丝氨酸(S)分别被需要的氨基酸残基(X)所取代(SEQ ID NO：20)
通过将上述筛选获得的突变蛋白酶基因导入具有用于卡那霉素筛选的琥珀突变标记的pKF18k的多克隆位点中的BamHI和XbaI位点，构建用于导入突变的模板质粒。
为了进行导入位点专一性突变的PCR反应，采用“Takara LA Taq”(Takara的产品)。使用5’末端磷酸化筛选引物(“Mutan-SuperExpress Km”的试剂盒成分)，导入了突变的引物3-8各5皮摩尔和10纳克模板质粒进行导入突变的PCR。在94℃下，在PCR反应条件下将模板DNA变性2分钟，然后进行30轮PCR，每一轮包括以下处理：94℃1分钟，55℃1分钟和72℃4分钟。用所获得的PCR产物转化大肠杆菌菌株MV1184，以便获得突变基因。按照上述碱基序列测定方法证实所得到的突变基因的突变位点。
将通过位点专一性诱变导入了突变的蛋白酶基因导入pHA64，用于转化菌株KP-43，然后在上述条件下培养并纯化。与研究过的野生型酶相比，所述氨基酸取代能够加强蛋白酶比活性。
结果发现，在以下组合中所述比活性提高了10-30％(表3)：E163I，E163L，E163N，E163T，E163V，I170L，S171D，S171G，S171T，E163F+S171A，E163L+S171A，E163Q+S171A，E163V+S171A，E163A+171G，E163D+S171G，E163I+S171G，E163L+S171G，E163S+171G，E163T+S171G，E171V+S171G，E163A+171T，E163H+S171T，E163I+S171T，E163K+S171T，E163L+S171T，E163Q+S171T，E163T+S171T和E163V+S171T。
表3
业已证实通过上述任意一种突变组合获得的碱性蛋白酶具有增强了的针对酪蛋白的比活性，同时保留了其亲代碱性蛋白酶的特征，例如，具有抗氧化剂作用，不会因为高浓度脂肪酸而抑制其酪蛋白酶解活性，通过SDS-PAGE测定其分子量为43000±2000，并且在碱性范围内具有活性。
例4
(1)洗涤剂的制备
向体积为1立方米的装有搅拌叶片的水箱中注入465千克水，当水箱中的水温达到55℃时，添加135千克40％(w/v)聚丙烯酸钠的水溶液。搅拌所得到的混合物15分钟，然后添加120千克碳酸钠，60千克硫酸钠，9千克亚硫酸钠和3千克荧光染料。再搅拌15分钟，然后添加300千克沸石。搅拌该混合物30分钟，以便得到均匀的糊剂(该糊剂的含水量为50％wt)。通过从安装在喷雾干燥塔顶部附近的高压喷头中喷出该糊剂，获得基础颗粒(从喷雾干燥塔的底部输入225℃的高温气体，并且以105℃的温度从其顶部排出气体。
然后将100份重量的所得到的基础颗粒填充到Loedige混合器中(Matsuzaka Giken的产品，容量：20升，装有一个套管)。在主轴搅拌条件下(150rpm)用3分钟时间添加含有20份重量的非离子型表面活性剂，22份重量的直链烷基(C10-13)-苯磺酸钠，4份重量的脂肪酸(C14-18)的钠盐，2份重量的聚乙二醇和4份重量的水组成的混合物，然后搅拌5分钟。向所述搅拌器中添加20份重量的结晶硅酸钠和10份重量的沸石，以便覆盖其表面，从而获得洗涤剂基料。
通过将99％wt的洗涤剂基料与0.5％wt的蛋白酶颗粒和0.5％wt的芳香剂混合，获得颗粒状洗涤A的成品。
(2)所使用的原材料
非离子型表面活性剂：“Emulgen 108KM”(Kao的产品)，向其中添加了平均8.5M的还氧乙烷
聚丙烯酸钠的水溶液：平均分子量为10000(按照在日本专利公开号Hei2-24283的实施例中披露的方法制备)
碳酸钠：稠苏打(Central Glass的产品)
沸石：“沸石A”，平均粒度为3.5微米(Tosoh的产品)
聚乙二醇：“K-PEG6000”(平均分子量为8500，Kao的产品)
结晶硅酸钠：“SKS-6粉”(Hoechst Tokuyama的产品)
本发明的蛋白酶颗粒：按照日本专利公开号昭62-257990的例1中披露的方法获得颗粒(PU/克)，如表2和3所披露的，将本发明的每一种溶化的碱性蛋白酶制剂颗粒化
荧光染料：“Tinopal CBS-X”(Ciba Geizy的产品)
例5
(1)洗涤剂的制备
在250℃的热空气温度下对固体含量为50wt％的糊剂进行喷雾干燥，以便基础颗粒含有7wt％的聚丙烯酸钠(平均分子量为100000)，26wt％的碳酸钠，20wt％的硫酸钠，6wt％的氯化钠，0.5wt％的荧光染料，40wt％的沸石和0.5wt％的水。
然后，将100份重量的所得到的基础颗粒装入Loediege搅拌器(Matsuzaka Giken的产品，容量：20升，装有一个套管)中。在主轴搅拌条件下(150rpm)用3分钟时间添加含有20份重量的非离子型表面活性剂，22份重量的直链烷基(C10-13)-苯磺酸钠，4份重量的脂肪酸(C14-18)的钠盐，2份重量的聚乙二醇和4份重量的水组成的混合物，然后搅拌5分钟。向所述搅拌器中添加20份重量的结晶硅酸钠和10份重量的沸石，以便覆盖其表面，从而获得洗涤剂基料。
通过混合95％wt的洗涤剂基料与2.8％wt的漂白颗粒，1.2％wt的漂白激活剂颗粒，0.5％wt的本发明的蛋白酶颗粒和0.5％wt的芳香剂获得颗粒状洗涤B的成品。
(2)所使用的原材料
非离子型表面活性剂：“Emulgen 108KM”(Kao的产品)，向其中添加了平均8.5M的还氧乙烷
聚丙烯酸钠的水溶液：平均分子量为10000(按照在日本专利公开号Hei2-24283的实施例中披露的方法制备)
碳酸钠：稠苏打(Central Glass的产品)
沸石：“沸石A”，平均粒度为3.5微米(Tosoh的产品)
聚乙二醇：“K-PEG6000”(平均分子量为8500，Kao的产品)
结晶硅酸钠：“SKS-6粉”(Hoechst Tokuyama的产品)
本发明的蛋白酶颗粒：按照日本专利公开号昭62-257990的例1中披露的方法获得颗粒(PU/克)，如表2和3所披露的，将本发明的每一种溶化的碱性蛋白酶制剂颗粒化
荧光染料：“Tinopa1 CBS-X”(Ciba Geizy的产品)
漂白颗粒：碳酸钠.过氧化氢加成物(以用于制备[0019]的日本专利公开号2000-256699中披露的漂白颗粒的类似方法获得)
漂白激活剂颗粒：颗粒状月桂酰羟苯磺酸钠(以用于制备[0018]的日本专利公开号2000-256699中披露的漂白颗粒的类似方法获得)
例6
制备了表4所示的液体洗涤剂组合物(洗涤剂C和洗涤剂D)
表4
 
成分 洗涤剂c(wt.％) 洗涤剂D(wt，％)
非离子型表面活性剂<sup>1)</sup>非离子型表面活性剂<sup>2)</sup>非离子型表面活性剂<sup>3)</sup>非离子型表面活性剂<sup>4)</sup>非离子型表面活性剂<sup>5)</sup>非离子型表面活性剂<sup>6)</sup>阴离子表面活性剂<sup>7)</sup>硅烷<sup>8)</sup>羧酸聚合物<sup>9)</sup>聚合物<sup>10)</sup>柠檬酸氯化钙单乙醇胺三乙二醇苯基醚丙二醇乙醇硫化钠本发明的蛋白酶<sup>11)</sup>芳香剂水 25.05.010.0---1.0-2.0-0.20.054.03.03.02.00.20.50.5平衡 ---9.09.02.5-0.8-0.8----2.0-1.00.5平衡
总计 100 100
使用浓度 20g/30L 40g/30L
洗涤液pH 10.5 7.3
1)聚氧乙烯(平均添加7摩尔)烷基醚，烷基基团源于C12-14仲醇(“Softanol 70”，Nippon Shokubai的产品)。
2)聚氧乙烯(平均添加12摩尔)烷基醚，烷基基团源于C12-14仲醇(“Softanol 120”，Nippon Shokubai的产品)。
3)通过按以下顺序向C10-14直链伯醇中团块添加平均5摩尔的E0、平均2摩尔的P0和平均3摩尔的EO获得的。
4)平均添加了8摩尔的EO的聚氧乙烯月桂基乙醚。
5)平均添加了15.5摩尔的EO的聚氧乙烯月桂基乙醚。
6)小范围聚氧乙烯烷基(仲-C12/C13)醚。
7)C15-14直链烷基苯磺酸钠。
8)酰胺/醚改性的硅氧烷聚合物(“BY16-96”)，Dow CorningToray Silicone的产品)。
9)按照披露于日本专利公开号Hei10-60476的第11页第6-13行披露的方法合成苯氧聚乙二醇-丙烯酸-马来酸共聚物(平均分子量：10000，固体含量：51.2％)
10)戊烯和马来酰(50∶50摩尔比)共聚物的钠盐(平均分子量7000)
11)表2和3中所示出的每一种本发明碱性蛋白酶的纯化制剂(15PU/克)
例7
在下面的表5中所示出的成分中添加聚丙烯酸钠(直链烷基)磺酸钠或非离子型表面活性剂，以及月桂酰羟苯磺酸钠的40％的水溶液，同时搅拌并混合过碳酸钠和碳酸钠(稠苏打)。然后添加按照在日本专利公开号昭62-257990的例1中披露的方法制备的本发明的蛋白酶颗粒。搅拌所得到的混合物，直到所有溶液变均匀，从而制备了一种漂白洗涤剂。
表5
 
成分 漂白洗涤剂E(wt.％) 漂白洗涤剂F(wt.％)
过碳酸钠<sup>1)</sup> 72.0 72.0
碳酸钠(稠苏打) 20.0 20.0
阴离子型表面活性剂<sup>2)</sup> 2.0 -
非离子型表面活性剂<sup>3)</sup> - 2.0
聚丙烯酸钠<sup>4)</sup> 1.0 1.0
月桂酰羟苯磺酸钠 4.0 4.0
本发明的蛋白酶<sup>5)</sup> 1.0 1.0
1)粒度为500-700微米
2)(C12-14)直链烷基苯磺酸钠
3)聚氧乙烯烷基醚(具有C12-14烷基基团，平均添加了12摩尔的EO)
4)平均分子量为8000
5)用表2和3所示本发明的每一种碱性蛋白酶的纯化制剂制备的颗粒(6PU/克)，所述制剂是按照在日本专利公开号昭62-257990的例1中披露的方法制备的。
例8
制备了在下面的表6中示出的自动洗碗洗涤组合物(洗涤剂G和H)
表6
 
成分 洗涤剂G(wt.％) 洗涤剂H(wt.％)
Pluronic L-61<sup>1)</sup> - 4.0
Softanol EP-7085<sup>2)</sup> 4.0 -
柠檬酸三钠 - 30.0
三聚磷酸钠 30.0 -
过碳酸钠 20.0 20.0
碳酸钠 20.0 20.0
非晶硅酸盐<sup>3)</sup> 10.0 10.0
AA-MA4) 4.0 4.0
硫酸钠 10.0 10.0
α-淀粉酶 1.0 1.0
本发明的蛋白酶 1.0 1.0
1)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(平均分子量2000)
2)C12-14仲醇的7摩尔的环氧乙烷和8.5摩尔环氧丙烷的加成物
3)JIS No.2的柠檬酸钠
4)丙烯酸-马来酸共聚物
5)“Duramy160TTM”(Novozymes的产品)
6)用表2和3所示本发明的每一种碱性蛋白酶的纯化制剂制备的颗粒(6PU/克)，所述制剂是按照在日本专利公开号昭62-257990的例1中披露的方法制备的。
例9
使用在表7中示出的成分制备硬表面洗涤组合物(洗涤剂J)。
表7
 
成分 洗涤剂J(wt.％)
阴离子型表面活性剂<sup>1)</sup>非离子型表面活性剂<sup>2)</sup>非离子型表面活性剂<sup>3)</sup>两性表面活性剂<sup>4)</sup>两性表面活性剂<sup>5)</sup>柠檬酸聚丙二醇<sup>6)</sup>乙醇本发明的蛋白酶<sup>7)</sup>芳香剂，水，其它/pH调节剂总计 15.05.05.07.54.01.02.05.01.054.5100.0
1)聚氧乙烯(EOP＝4)烷基(C12)醚硫酸钠
2)聚氧乙烯(EOP＝4)烷基(C12)醚
3)烷基(C12)聚葡糖苷(缩合度)：1.3
4)单(长链)叔烷基(C12)氧化二甲胺
5)烷基(C12)羟基二甲基磺基甜菜碱
6)分子量10000
7)披露于表2和3中的本发明的每一种碱性蛋白酶的纯化制剂(15PU/克)
例10
用上述洗涤剂A(参见例2)获得了在下面的表8中示出的颗粒状洗涤剂
表8
 
成分(wt.％) 洗涤剂K 洗涤剂L 洗涤剂M 洗涤剂N
例2的洗涤剂基料 98.4 98.3 98.5 97.2
芳香剂 0.5 0.5 0.5 0.5
本发明的蛋白酶<sup>1)</sup> 0.5 0.5 0.5 0.5
常规蛋白酶<sup>2)</sup> 0.6 0.6
纤维素酶<sup>3)</sup> 0.7 07
脂酶<sup>4)</sup> 0.5 0.5
1)由表2和3所示本发明的每一种碱性蛋白酶的纯化制剂制备的颗粒(6PU/克)，所述制剂是按照在日本专利公开号昭62-257990的例1中披露的方法制备的。
2)由披露于日本专利公开号昭Hei5-25492中的蛋白酶K-16获得的5PU/克的蛋白酶，该蛋白酶是按照在日本专利公开号昭62-257990的例1中披露的方法制备的。
3)“KAC-500”(Kao的产品)
4)“Lipolase100TTM”(Novogymes的产品)
工业应用
本发明能够有效生产并提供一种碱性蛋白酶，这种蛋白酶在即使存在高浓度脂肪酸的条件下也具有活性，并且在去除不仅含有蛋白，而且还含有皮脂等的复杂污渍方面具有出色的去污力，因此，可以作为一种酶掺入洗涤剂中。
序列表
<110>花王株式会社(KAO CORPORATl0N)
<120>碱性蛋白酶
<130>KS0696
<150>JP 2002-081428
<151>2002-03-22
<150>JP 2002-165987
<151>2002-06-06
<150>JP 2002-304230
<151>2002-10-18
<150>JP 2002-304231
<151>2002-10-18
<160>20
<170>Patentln Ver.3.1
<21O>1
<211>434
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)
<400>1
Figure C03107456D00331
Figure C03107456D00351
<210>2
<211>1305
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)KSM-KP43
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1305)
<400>2
Figure C03107456D00352
Figure C03107456D00361
Figure C03107456D00371
<210>3
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
Figure C03107456D00383
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
Figure C03107456D00384
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
Figure C03107456D00391
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
Figure C03107456D00392
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
Figure C03107456D00393
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
Figure C03107456D00394
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
Figure C03107456D00395
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
Figure C03107456D00401
<210>13
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
Figure C03107456D00403
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
Figure C03107456D00404
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
<210>17
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
Figure C03107456D00406
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
Figure C03107456D00411
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
Figure C03107456D00412
<210>20
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
Figure C03107456D00413

Claims (6)

1.一种碱性蛋白酶，其中，在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的(a)65号位置，(b)101号位置，(f)273号位置，(g)320号位置，(h)359号位置，或(i)387号位置上的氨基酸残基是从以下氨基酸残基中选择的：
位置(a)：脯氨酸，
位置(b)：天冬酰胺，
位置(f)：异亮氨酸，甘氨酸和苏氨酸，
位置(g)：苯丙氨酸，丙氨酸，苏氨酸，亮氨酸，异亮氨酸和甘氨酸，
位置(h)：丝氨酸，亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，和谷氨酰胺，和
位置(i)：丙氨酸，赖氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，精氨酸和组氨酸。
2.编码权利要求1的碱性蛋白酶的基因。
3.含有权利要求2的基因的重组载体。
4.含有权利要求3的载体的转化体。
5.如权利要求4的转化体，其为微生物。
6.含有权利要求1的碱性蛋白酶的洗涤剂组合物。
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