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CN100462370C - 纯化β-干扰素的方法 - Google Patents

纯化β-干扰素的方法 Download PDF

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Abstract

提供一种从含有重组人β-干扰素培养物中纯化人β-干扰素的方法，该方法包括进行亲和层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)，其中亲和层析包括：将含有β-干扰素的培养物吸附到平衡的亲和层析柱上，接着用平衡缓冲液洗涤；用洗涤缓冲液A和洗涤缓冲液B洗涤柱子，其中洗涤缓冲液A的pH为6.5-7.5，包含30-60重量%的丙二醇，洗涤缓冲液B的pH为6.5-7.5，包含10-30重量%的丙二醇和1-2M NaCl；用pH为6.5-7.5的包含40-60重量%的丙二醇和1-2M NaCl的缓冲液洗脱包含人β-干扰素的级分。

Description

纯化β-干扰素的方法
技术领域
本发明涉及一种使用亲和层析和反相高效液相色谱从含有重组人β-干扰素培养物中纯化人β-干扰素的方法。
背景技术
广义上干扰素是调节宿主反应性的胞外信使和以相对小分子形式从细胞释放的进化上保守的蛋白家族。干扰素由产生干扰素的细胞在应答病毒、双链RNAs、多种微生物、或者如TNF或IL1的细胞因子刺激时释放，然后，干扰素通过干扰素受体结合到邻近细胞表面。此后，干扰素通过细胞内的连续信号诱导多种蛋白的合成，以便保持宿主的反应性和内环境稳定性。因此，干扰素在体内作为抗病毒、抗增殖和免疫信号蛋白，并且对癌细胞具有直接的抗增殖作用，因此干扰素在作为治疗剂方面备受关注[Postka S.，Langer J.A.和Zoon K.C.(1987)Interferons and their actions，Annu.Rev.Biochem.56：727-777]。
干扰素属于一类螺旋状的生理上活跃的物质。根据其物理化学特征和功能性，干扰素可以分为2类：1型和2型。α-，β-，τ-，和ε-干扰素是1型干扰素的成员[Weissman C.和Weber H.(1986)The Interferon genes，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.33：251-300]，γ-干扰素是2型干扰素的一种。其中，属于1型干扰素的β-干扰素是表现出种属特异性的蛋白。β-干扰素从来源上考虑也叫做成纤维细胞干扰素，从生物特性上考虑也可以叫做pH2-稳定性干扰素。β-干扰素结合到细胞表面的相同受体上，与1型干扰素的α-干扰素一起，然后诱导抗病毒因子的转录来应答连续的细胞信号系统。
β-干扰素是分子量约为20kDa的糖蛋白(约20％为糖基)和由166个氨基酸组成的单链蛋白。已知一个N-糖基化位点作为物理化学作用参与增加物质稳定性或溶解性，而不是参与生物活性或抗原性[Karpusas M.，Whytty A.，Runkel L.，和Hochman P.The structure of human interferon-β：implications for activityCMLS，54：1203-12161998]。
基因重组技术的先进性使得人β-干扰素的氨基酸序列得到确定，并使得人β-干扰素在大肠杆菌(E.coli)中能够被克隆和表达[Taniguchi，Gene10：11-15，1980]。而且，β-干扰素在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达也有报道[USP4,966,843，USP5,376,567，和USP5795779]。
目前，β-干扰素通过基因重组技术生产，并且可以从商业上获得，商标名为
Figure C200480039724D00042
和
Figure C200480039724D00043
已知重组的β-干扰素能够有效地延缓多发性硬化症状患者多发性硬化的发展，并且减轻疾病带来的疼痛。而且，重组的β-干扰素广泛地用作多发性硬化病的治疗剂，同时，也在人类免疫应答的非特异调控、对病毒感染的免疫应答和癌细胞的抗增殖中有效。
目前，对表达在CHO细胞中的重组β-干扰素可用的纯化技术包括3-5个纯化步骤，其包括亲和层析的初级纯化(USP4,278,661，USP4,289,689，USP4,541,952，USP4,808,523，等)，金属鳌和层析(USP4,257,938，USP4,359，389，USP4,541,952，USP5,244,655，等)，CPG(可控孔度玻璃)层析(USP4,359,389，USP5,066,786，USP5,244,655，等)，或伴刀豆球蛋白A层析(USP4,289,689，USP4,658,017，等)，接着进行阳离子交换层析和反相层析。
在上述常规的纯化技术中，金属鳌和层析由于重金属的使用可能引起环境污染。CPG或伴刀豆球蛋白A层析的纯化特异性低。也就是说，伴刀豆球蛋白A层析基于选择性结合包含在CHO细胞培养物中的许多糖链蛋白，其特异性低。CPG柱可以在与蛋白结合后根据分子大小分离。然而，其对β-干扰素分离效率和纯度低于那些亲和层析(例如，蓝色琼脂糖柱层析)。
而且，使用亲和层析的常规纯化技术包括使用单克隆抗体和/或染料树脂的乙二醇洗涤和洗脱。然而，使用单克隆抗体的亲和层析独立地需要去除非糖基化形式的β-干扰素，很难进行大规模生产。尤其是，洗涤和洗脱过程中使用的乙二醇对人体十分有毒，限制了实际的纯化应用。
同时，美国专利No.4,483,849公开了一种使用丙二醇取代有毒的乙二醇，通过亲和层析纯化和稳定β-干扰素的方法。该专利文件中公开的方法包括将包含干扰素的培养物上样到染料-亲和柱例如平衡的蓝色亲和凝胶，柱子用1.0M NaCl/PO4缓冲液和含有40％丙二醇的1.0M NaCl/PO4缓冲液洗涤，用50％的丙二醇洗脱干扰素。尽管该专利文件的方法包含柱洗涤和洗脱，仍共存目的终产物峰和杂质峰，因此降低了纯度。
发明内容
本发明提供一种纯化β-干扰素的方法，包括用无毒的丙二醇通过增强的亲和层析回收高纯度的β-干扰素初级纯化产物，然后再进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)。
因此，本发明提供一种从含有重组人β-干扰素的培养物中纯化人β-干扰素的方法，其包含进行亲和层析和RP-HPLC，其中包括使用特定的缓冲溶液洗涤和洗脱。
根据本发明的一个方面，提供一种通过亲和层析和RP-HPLC从含有重组人β-干扰素的培养物中纯化人β-干扰素的方法，其中的亲和层析包括：将含有β-干扰素的培养物吸附到一种平衡的亲和层析柱上，接着用平衡缓冲液洗涤；用洗涤缓冲液A和洗涤缓冲液B洗涤柱子，其中洗涤缓冲液A的pH为6.5-7.5，包含30-60重量％的丙二醇，洗涤缓冲液B的pH为6.5-7.5，包含10-30重量％的丙二醇和1-2M NaCl；用pH为6.5-7.5的包含40-60重量％的丙二醇和1-2M NaCl的缓冲液洗脱包含人β-干扰素的级分。
在本发明的纯化方法中，用作样品的含有重组人β-干扰素的培养物的非限制性实例包括产生β-干扰素的细胞和菌株。例如，含有重组人β-干扰素的培养物可以是用已知方法获得的培养物，这些已知方法公开于Carter和Horoszewicz，Pharm.Ther.8，359-377，1980；Strander和Cantell，Ann.Med.Exp.Fenn.44，265-273，1966；Wheelock，Science，149，310-311，1965，等等。优选地，含有重组人β-干扰素的培养物是一种无血清培养物，来自于生产重组人β-干扰素的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在本发明的纯化方法中，用于亲和层析的亲和层析柱可以是常规的染料-亲和柱，例如填充蓝色-琼脂糖6(Amersham biosciences，瑞典)的柱子(如XK-50柱，Amersham biosciences，瑞典)或亲和-凝胶蓝色柱(Bio-Rad，美国)。亲和层析柱的平衡缓冲液可以是磷酸钠-EDTA缓冲溶液(pH值约为7.2)。亲和层析柱可以用3倍柱体积(CV)的平衡缓冲液平衡，例如可以使用约15-30cm/hr的线性流速平衡。
在本发明的纯化方法中，亲和层析包括将含有β-干扰素的培养物吸附到平衡的亲和层析柱上，然后通过用平衡缓冲液洗涤除去非特异结合的蛋白。
亲和层析也包括多步洗涤，即，用pH 6.5-7.5的包含30-60重量％的丙二醇的洗涤缓冲液A和pH 6.5-7.5的包含10-30重量％的丙二醇和1-2MNaCl的洗涤缓冲液B洗涤柱子。优选地，亲和层析进一步包括用pH 6.5-7.5的包含1-2M NaCl的洗涤缓冲液C洗涤。优选地，每一步洗涤使用2-4CV的每一种缓冲液进行。
在本发明的纯化方法中，洗涤缓冲液的使用顺序没有限制。也就是说，洗涤可以是先用洗涤缓冲液A然后用洗涤缓冲液B，或者是先用洗涤缓冲液B然后用洗涤缓冲液A进行。而且，洗涤可以是先用洗涤缓冲液A接着用洗涤缓冲液C然后用洗涤缓冲液B，或者是先用洗涤缓冲液B接着用洗涤缓冲液C然后用洗涤缓冲液A进行。用洗涤缓冲液A洗涤有效去除高疏水性杂质，用洗涤缓冲液C洗涤去除亲水性杂质，用洗涤缓冲液B洗涤去除杂蛋白。
β-干扰素的回收可以通过用pH 6.5-7.5的包含40-60重量％的丙二醇优选50重量％，和1-2M NaCl的洗涤缓冲液洗脱包含人β-干扰素的级分来进行。
优选地，用于洗涤或洗脱的每一种缓冲液可以是磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。
在本发明的纯化方法中，与美国专利No.4,483,849公开的用分级的丙二醇浓度梯度进行洗涤和洗脱的方法相比，使用包含约50％丙二醇的缓冲液洗涤能够充分除去杂质峰。
在本发明的纯化方法中，上述亲和层析之后进行RP-HPLC。优选地，在进行RP-HPLC前，使用截留分子量为10,000的超滤膜对亲和层析洗脱下来的溶液进行渗滤处理。通过渗滤可以将相对高盐浓度的β-干扰素调节到适宜的盐浓度。
RP-HPLC按下文所述进行：将渗滤得到的样品上样到柱子上，然后在pH 2-5用浓度梯度的含有HCl的乙醇洗脱含有人β-干扰素的级分。详细地说，柱子先用含有0.1-20％、优选5％或更少的丙二醇的0.1％ HCl平衡，接着将渗滤处理得到的含有0.1-20％、优选5％或更少丙二醇的样品上样到柱子上。然后，用0.1％ HCl洗涤柱子，用从30-50％、优选45％的含0.1％ HCl的乙醇到65-90％、优选70％的含0.1％HCl的线性浓度梯度乙醇洗脱含有β-干扰素的级分。
用于RP-HPLC的柱子可以是Protein C4(珠粒大小10μm，孔径大小
Figure C200480039724D0007131421QIETU
，Vydac)，并且可以用约5CV的含有丙二醇的0.1％ HCl溶液平衡。在RP-HPLC中，渗滤得到的样品允许以适宜的流速流过平衡的柱子，用3CV或更多的0.1％ HCl缓冲液洗涤，然后用线性浓度梯度的约10-20CV含有0.1％ HCl的乙醇洗脱，由此分离目的蛋白与杂蛋白。
用新鲜缓冲液可以将通过RP-HPLC得到的含有β-干扰素的级分进行的置换。新鲜缓冲液置换可以通过凝胶-过滤或者浓缩和渗滤实现。
例如，进行凝胶-过滤时，通过RP-HPLC得到的含有β-干扰素的级分浓缩到如约200-1,000μg/ml，用10-50mM醋酸钠缓冲液(pH 3.5-5.5)透析，然后上样到用10-50mM优选20mM醋酸钠缓冲液(pH 3.5-5.5)平衡的凝胶-过滤层析柱(如聚丙烯酰胺葡聚糖S-200，Amersham biosciences)上。然后将10-50mM醋酸钠缓冲液(pH 3.5-5.5)以适宜的流速流过柱子，这样可以实现目的蛋白的溶液置换并且分离和除去多聚体。
举例说明本发明纯化方法的流程图示于图1。
附图简述
图1.举例说明本发明纯化方法的流程图。
图2.β-干扰素的C4 RP-HPLC(反相高效液相色谱)分析色谱，其中β-干扰素是根据本发明纯化方法亲和层析洗脱下来的。
图3.β-干扰素的C4 RP-HPLC分析色谱，其中β-干扰素是没有经过50％丙二醇洗涤而洗脱下来的。
图4.4A和4B分别是凝胶-过滤缓冲液的C4 RP-HPLC分析色谱和凝胶-过滤后洗脱下来的溶液的C4 RP-HPLC分析色谱。
实施本发明的最佳方式
在下文中将通过实施例对本发明进行更加明确的描述。然而，下述实施例只为举例说明的目的提供，本发明不仅限于这些实施例。
实施例1：亲和层析
350ml蓝色琼脂糖6(Amersham biosciences，瑞典)填充到XK-50柱(Amersham biosciences，瑞典)，制成亲和层析柱。含有1mM EDTA的20mM磷酸钠缓冲液充分流过柱子以平衡柱子。然后，将25L含有β-干扰素的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞无血清培养物流过柱子，流速为5-10ml/min，接着用约3倍柱体积(CV)的平衡缓冲液洗涤柱子。
将大约3CV的含有50％丙二醇的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)流过柱子，流速5ml/min，以除去杂蛋白，接着用约3CV平衡缓冲液洗涤柱子。然后，大约3CV的含有2M NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)流过柱子，流速5ml/min，以除去杂蛋白。最后，大约3CV的含有2M NaCl和20％丙二醇的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)流过柱子，流速5ml/min，以除去杂蛋白。
大约3CV的洗脱缓冲液(含有2M NaCl和50％丙二醇的20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2)流过柱子，流速5ml/min，这样回收到含有β-干扰素的溶液。如此回收到的洗脱溶液的纯度用C4 HPLC分析色谱测定，结果如图2所示。根据图2，β-干扰素的纯度为约85％或更高。
作为对照，根据上述方式进行亲和层析，不同的是，省略了用含有50％丙二醇的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)洗涤的步骤。得到的洗脱溶液的纯度用C4 HPLC分析色谱测定，结果如图3所示。从图3可以看出，不经过含有50％丙二醇的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)洗涤，β-干扰素的纯度显著降低。
实施例2：反相高效液相色谱(RP-HPLC)
使用超滤系统(截留分子量为10,000)，将根据本发明实施例1中得到的含有β-干扰素的溶液进行渗滤处理，然后上样到RP-HPLC柱(ProteinC4，珠粒大小10μm，孔径大小
Figure C200480039724D0007131421QIETU
，Vydac)，流速为2ml/min。接着用约3CV的0.1％ HCl缓冲液(pH 2.1)洗涤柱子。用0.1％ HCl溶液(A)和0.1％ HCl的90％乙醇溶液(B)，以从45％溶液(B)到80％溶液(B)(约20CV)的线性浓度梯度进行β-干扰素的洗脱，由此从目的蛋白中分离杂蛋白。
实施例3：凝胶-过滤层析
将实施例2中得到的含有β-干扰素的溶液浓缩到200μg/ml，并且将浓缩物中含有的乙醇用20mM醋酸钠缓冲液(pH 4.0)置换500次或更多次。将上述方法得到的溶液上样到用20mM醋酸钠缓冲液(pH 4.0)平衡的聚丙烯酰胺葡聚糖S-200柱(1700ml，XK-50/100，Amersham biosciences，瑞典)，以得到含有β-干扰素的溶液。
实施例4：RP-HPLC分析
将在实施例1，2和3得到的每一份溶液上样到C4 RP-HPLC柱(Vydac214TP54，内径4.6mm x 长度25cm，颗粒大小5μm，孔径
Figure C200480039724D0009131518QIETU
)，流速1ml/min。然后，将20CV的含有0.1％三氟乙酸的乙腈以从含有0.1％三氟乙酸的30％乙腈到含有0.1％三氟乙酸的80％乙腈的线性浓度梯度流过柱子，进行色谱分析。
图4A和4B分别为凝胶-过滤层析缓冲液的C4RP-HPLC分析色谱和凝胶-过滤层析后洗脱下来的溶液的C4 RP-HPLC分析色谱。从图4A和4B可以看出本发明能够生产高纯度的β-干扰素。
工业适用性
根据本发明的纯化方法，用无毒的丙二醇和增强的亲和层析可以将β-干扰素纯化到99％或者更高的纯度。

Claims (5)

1.一种从含有重组人β-干扰素培养物中纯化人β-干扰素的方法，其包括进行亲和层析和反相高效液相色谱，
其中所述亲和层析包括：
将含有β-干扰素的培养物吸附到平衡的亲和层析柱上，接着用平衡缓冲液洗涤；
用洗涤缓冲液A和洗涤缓冲液B洗涤柱子，其中所述洗涤缓冲液A的pH为6.5-7.5，其包含30-60重量％的丙二醇，所述洗涤缓冲液B的pH为6.5-7.5，其包含10-30重量％的丙二醇和1-2M NaCl；和
用pH 6.5-7.5的包含40-60重量％的丙二醇和1-2M NaCl的缓冲液洗脱包含人β-干扰素的级分。
2.权利要求1的方法，其中所述洗涤步骤进一步包括用pH6.5-7.5的包含1-2M NaCl的洗涤缓冲液C洗涤柱子。
3.权利要求1或2的方法，其中用于洗涤和洗脱的每一种缓冲液是磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。
4.权利要求1或2的方法，其中对通过亲和层析得到的溶液在反相高效液相色谱前使用截留分子量为10,000的超滤膜进行渗滤处理。
5.权利要求4的方法，其中在反相高效液相色谱过程中，将通过渗滤获得的样品上样到柱子上，然后在pH 2-5通过浓度梯度的含有HCl的乙醇洗脱包含人β-干扰素的级分。
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