CN100390294C - 一种利用酶反应提高异鼠李素极性的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用酶反应提高异鼠李素极性的方法，该方法是将异鼠李素、转苷酶和糖基底物在浓度为0%-90%的乙醇水溶液中进行反应。所述反应温度为20-90℃，反应时间为1-30小时。本发明可显著提高异鼠李素的水溶性，使其在工业生产中易被水或乙醇等极性溶剂溶解，作为医药产品的异鼠李素苷比异鼠李素更易被机体利用；还可提高天然产物中异鼠李素的提取率，从而降低其提取过程中的乙醇用量；此外，本发明还提高了异鼠李素制品的可加工性，同时可扩大其实际应用范围。

Description

一种利用酶反应提高异鼠李素极性的方法

技术领域

本发明涉及黄酮苷元的极性增加方法，尤其涉及异鼠李素极性增加的一种方法。

背景技术

异鼠李素(Isorhamnetin)分子式为C₁₆H₁₂O₇，化学结构式如式I所示。异鼠李素属脂溶性化合物，极性低而只溶于乙酸乙酯、氯仿、乙醚等非极性溶剂。

              (式I)

异鼠李素主要来源于天然产物。天然产物异鼠李素具有很大开发价值，目前异鼠李素用途多在于临床心血管疾病的治疗。

异鼠李素及其衍生物具有降低血管粘稠度、溶解已经形成的血栓、扩张或疏通血管、防止动脉粥样硬化、降低血粘度、耐缺氧作用等药理作用。因此用于治疗临床中冠心病、心肌梗塞、缺血性脑血管病、高血压等重症。另外，异鼠李素还具有改善脑部神经的作用；改善心肌细胞性质的作用；抗脂质过氧化作用等作用，异鼠李素可显著抑制Cu²⁺诱导的VLDL的氧化修饰，从而起到抗自由基的作用。异鼠李素还可通过抑制HeLa细胞端粒酶活性而抑制人宫颈癌细胞生长。异鼠李素抑制人肺细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7。

异鼠李素及其衍生物能有效清除血管内血栓及血管壁垃圾，疏通堵塞血管，保证血流通畅，也可直接溶解纤维蛋白，降低血液粘稠度及血液的凝固性，有效预防血栓形成防止心源性脑栓塞。对于已形成的血栓异鼠李素可直接激活人体的纤维蛋白酶原转变为纤维蛋白酶而有效溶解血栓。

异鼠李素及其衍生物能有效激活脑神经干细胞，促使新的脑神经细胞生长，替换坏死的脑神经细胞，最大限度恢复脑神经功能。异鼠李素也可有效刺激心肌干细胞，促使新的心肌细胞产生，恢复心肌功能。

异鼠李素及其衍生物对血小板有抑制和解聚作用，从而降低血液粘度，防止血液“粘、稠、浓、聚”。异鼠李素使血液粘度和血清、血浆、纤维蛋白原比粘度降低，红细胞电泳速度加快，扩散血小板的凝聚。降低全血粘度、血浆粘度、全血还原粘度等。实验证实，异鼠李素有极为理想的抗凝血及增强纤维活性作用，促使血小板数量及凝集功能降低，微血栓溶解。

异鼠李素及其衍生物能提高心脑组织耐缺氧能力，有利于代谢和氧效应的调节，可有效防止脑缺血所出现的缺氧性脑细胞损害。异鼠李素能减少缺血心肌脂质过氧化作用，提高缺血心肌的活性。异鼠李素能降低血清LPO含量，从而有效清除有害自由基、保护心肌细胞。异鼠李素及其衍生物能使心脏收缩变得更加稳定，显著降低心电图T波的升高，令心肌和脑细胞梗死面积减少。

异鼠李素及其衍生物在植物界分布广泛，多存在于植物的花、叶、果实中。药用植物蒲黄、蒺藜、沙棘、旱柳都含有异鼠李素，尤其是蒲黄、沙棘中异鼠李素的含量最高。国内外学者对于异鼠李素及其衍生物的提取、纯制、药理和临床进行了大量的研究。在实际应用中，异鼠李素多以苷类形式被使用。从药代动力学的角度来看，异鼠李素苷比异鼠李素在体内更容易被吸收，在药理研究中也显示出同样的生理活性。另外，异鼠李素苷还具有保肝降酶等药理作用。

高价(1g异鼠李素约3万元人民币)、高活性单体异鼠李素在工业上如何进一步提高其提取率并不影响其药理活性是极有研究意义的领域。现有生产异鼠李素的方法中多使用丙酮、丁酮作为溶剂进行提取，并且这些有机溶剂对机体会产生有害作用，存在着工业化安全性低、污染严重、成本高等问题。为了避免使用对机体有害的有机溶剂，在饮料和医药品的提取过程中多用醇水作为溶剂。但由于天然的异鼠李素极性低，在实际应用中需要使用60％以上含醇水溶液，导致乙醇用量大，工业上生产水溶性保健品、食品、饮品等时加工利用难，生产成本也高。

从而得知如果将异鼠李素转变为异鼠李素苷，不仅提高生理活性及应用价值，降低生产成本，也促进工业化生产。

通过转苷酶的加入将一些生理活性不高、或没有生理活性的成分的结构转变为高活性分子结构，不仅提高提取物的生理活性及应用价值，降低生产成本也促进工业化生产。由于苷类相对于苷元更易于吸收，而且苷类极性较高已被醇水容易提取，通过加入转苷酶将异鼠李素转化为异鼠李素苷不仅促进其从植物中提取过程降低生产成本还可提高其药理活性。

发明内容

本发明的目的是为了扩大异鼠李素的应用范围及其在机体中的利用效率，提出一种利用酶反应提高异鼠李素极性的方法。

本发明的技术方案如下：一种提高异鼠李素极性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

1)将异鼠李素和糖基底物按摩尔比为1∶1～20加入到浓度为0％～70％的乙醇水溶液中，在30～80℃温度下进行反应，控制乙醇水溶液的pH值为4～8；

2)在上述反应体系中加入转苷酶，使其终浓度为1600～1900IU/100mL，反应时间为1～30小时。

本发明所述糖基底物为糊精、淀粉、麦芽糖或葡萄糖，优化使用麦芽糖。所述转苷酶可为任意一种转苷酶，优选为penicillium decumbens葡萄糖苷酶，spirizyme plus葡萄糖苷酶。

在上述技术方案的基础上，本发明的技术方案还在于：所述乙醇水溶液的浓度为30％；所述乙醇水溶液的pH值控制为6。

本发明提供了一种应用转苷酶反应使异鼠李素单体转变为异鼠李素苷以提高其极性的方法。在转苷酶的作用下，糖基底物中糖基被转移到异鼠李素的羟基基团上，从而生产出极性增强的苷类物质。本发明可显著提高异鼠李素的水溶性，使其在工业生产中易被水或乙醇等极性溶剂溶解，作为医药产品的异鼠李素苷与异鼠李素相比，更易被机体利用；还可提高天然产物中异鼠李素的提取率，从而降低其提取过程中的乙醇用量；同时可扩大其加工性及实际应用范围。

附图说明

图1为异鼠李素转苷产物用乙酸乙酯萃取液分析结果。图中：1为异鼠李素；2为异鼠李素苷；3为芦丁

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1；向1000mL三角瓶中，加入0.025g异鼠李素、0.12g麦芽糖及50mL的30％乙醇水溶液，用1M NaOH溶液调pH值至4.0，然后加入penicillium decumbens葡萄糖苷酶溶液(6.23IU/mL)0.5ml，最后，在80℃、200rpm下，搅拌反应30小时。反应结束后，用相同体积的乙酸乙酯萃取反应产物(以芦丁为阳性对照)，萃取液以GF254硅胶板(10cm×20cm)、苯∶乙酸乙酯∶丙酮∶乙酸＝10∶8∶2∶2为流动相展开，在365nm紫外灯下观察荧光并用TLC方法进行定性定量分析，结果如图1所示(1.R_{f 异鼠李素}＝0.70，2.R_{f异鼠李素转苷产物}＝0.14，3.R_f芦丁＝0.01)，表明通过转苷反应产生了极性大于异鼠李素的异鼠李素苷，使其在工业生产中易被水或乙醇等极性溶剂所溶解，反应机理可用下述化学方程式表示：

实施例2：向1000mL三角瓶中，加入0.025g异鼠李素、0.03g麦芽糖及50mL的30％乙醇水溶液，用1M NaOH溶液调pH值至8.0，然后加入spirizyme plus葡萄糖苷酶(标准活力475AGU/g)0.5ml，在30℃，200rpm下，搅拌反应30小时。反应结束后，用相同体积乙酸乙酯萃取(以芦丁为阳性对照)，萃取液以GF254硅胶板(10cm×20cm)、苯∶乙酸乙酯∶丙酮∶乙酸＝10∶8∶2∶2为流动相展开，在365nm紫外灯下观察荧光并用TLC方法进行定性定量分析，结果如图1所示(1.R_{f异鼠李素}＝0.70，2.R_{f异 鼠李素转苷产物}＝0.14，3.R_f芦丁＝0.01)，表明通过转苷反应产生了极性大于异鼠李素的异鼠李素苷，使其在工业生产中易被水或乙醇等极性溶剂所溶解，反应机理与实施例1相同。实施例3：向1000mL三角瓶中，加入0.01g异鼠李素、0.05g麦芽糖及50mL的60％乙醇水溶液，用1M NaOH溶液调pH值至6.0，然后加入penicillium decumbens葡萄糖苷酶溶液(6.23IU/mL)0.5ml，在50℃，200rpm下，搅拌反应30小时。反应结束后，用相同体积乙酸乙酯萃取(以芦丁为阳性对照)，萃取液以GF254硅胶板(10cm×20cm)、苯∶乙酸乙酯∶丙酮∶乙酸＝10∶8∶2∶2为流动相展开，在365nm紫外灯下观察荧光并用TLC方法进行定性定量分析，结果如图1所示(1.R_{f异鼠李素}＝0.70，2.R_{f异 鼠李素转苷产物}＝0.14，3.R_f芦丁＝0.01)，表明通过转苷反应产生了极性大于异鼠李素的异鼠李素苷，使其在工业生产中易被水或乙醇等极性溶剂所溶解，反应机理与实施例1相同。实施例4：向1000mL三角瓶中，加入0.02g异鼠李素、0.05g麦芽糖及50mL的10％乙醇水溶液，用1M NaOH溶液调pH值至6.0，然后加入spirizyme plus葡萄糖苷酶(标准活力475AGU/g)0.5ml，在90℃，200rpm下，搅拌反应20小时。反应结束后，用相同体积乙酸乙酯萃取(以芦丁为阳性对照)，萃取液以GF254硅胶板(10cm×20cm)、苯∶乙酸乙酯∶丙酮∶乙酸＝10∶8∶2∶2为流动相展开，在365nm紫外灯下观察荧光并用TLC方法进行定性定量分析，结果如图1所示(1.R_{f异鼠李素}＝0.70，2.R_{f异 鼠李素转苷产物}＝0.14，3.R_f芦丁＝0.01)，表明通过转苷反应产生了极性大于异鼠李素的异鼠李素苷，使其在工业生产中易被水或乙醇等极性溶剂所溶解，反应机理与实施例1相同。实施例5：向1000mL三角瓶中，加入0.025g异鼠李素、0.12g麦芽糖及50mL的70％乙醇水溶液，用1M NaOH溶液调pH值至4.0，然后加入penicillium decumbens葡萄糖苷酶溶液(6.23IU/mL)0.5ml，在50℃，200rpm下，搅拌反应1小时。反应结束后，用相同体积乙酸乙酯萃取(以芦丁为阳性对照)，萃取液以GF254硅胶板(10cm×20cm)、苯∶乙酸乙酯∶丙酮∶乙酸＝10∶8∶2∶2为流动相展开，在365nm紫外灯下观察荧光并用TLC方法进行定性定量分析，结果如图1所示(1.R_{f异鼠李素}＝0.70，2.R_{f异 鼠李素转苷产物}＝0.14，3.R_f芦丁＝0.01)，表明通过转苷反应产生了极性大于异鼠李素的异鼠李素苷，使其在工业生产中易被水或乙醇等极性溶剂所溶解，反应机理与实施例1相同。

Claims (4)

1.一种提高异鼠李素极性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

1)将异鼠李素和糖基底物按摩尔比为1∶1～20加入到浓度为10％～70％的乙醇水溶液中，在30～80℃温度下进行反应，控制乙醇水溶液的pH值为4～8；所述糖基底物为糊精、淀粉、麦芽糖或葡萄糖；

2)在上述反应体系中加入转苷酶，使其终浓度为1600～1900IU/100mL，反应时间为1～30小时。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转苷酶为葡萄糖苷酶。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述糖基底物为麦芽糖。

4.按照权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述乙醇水溶液的浓度为30％；所述乙醇水溶液的pH值为6。

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