CN100387704C

CN100387704C - 可高产糖肽复合物的灵芝真菌及其诱变选育方法和用途

Info

Publication number: CN100387704C
Application number: CNB2005100661147A
Authority: CN
Inventors: 张日俊; 鉏晓艳; 王铮
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2005-04-21
Filing date: 2005-04-21
Publication date: 2008-05-14
Anticipated expiration: 2025-04-21
Also published as: CN1854288A

Abstract

本发明涉及一种可高产糖肽复合物的灵芝真菌，及其诱变选育方法和用途。该灵芝真菌其分类命名为：灵芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1251。其诱变选育步骤包括：以购自《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，菌种保藏号为CGMCC 5.533的灵芝真菌CAU55作为出发菌株，依次于固体培养基、液体培养基上培养，得到出发菌株CAU55菌丝体液；将此菌丝体液酶解、过滤，得到出发菌株CAU55原生质体沉淀；再将此原生质体进行紫外诱变和再生培养，最后得到可高产糖肽复合物的灵芝真菌CAU5501。该可高产糖肽复合物的灵芝真菌可用于液体发酵制备糖肽复合物饲料添加剂，或用于制备益生素、免疫增强剂等微生制剂。

Description

可高产糖肽复合物的灵芝真菌及其诱变选育方法和用途

发明领域

本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种可高产糖肽复合物的灵芝真菌，及其诱变选育方法和用途。

背景技术

由于多年来在动物饲养和饲料中广泛和长期使用抗生素、化学合成药物、激素等促生长保健剂，导致畜禽和水产产品中药物残留严重、畜禽产品品质下降、细菌耐药性增强、耐药菌株增多，因而极大的威胁着人类健康和生态环境。由于抗生素的上述诸多副作用，和近年来消费者对食品安全问题的关注，世界各国都在纷纷禁用或限制抗生素的使用，并加速开发、推广新型安全高效的绿色饲料添加剂，以减少或替代抗生素等药物添加剂。

灵芝和灵芝糖肽复合物因其独特的理化特性和神奇的生物学功能而成为新型绿色饲料添加剂领域的研究热点。灵芝真菌的生长是孢子→菌丝体→子实体的过程。由于灵芝人工栽培生长周期过长(大于2-3个月)，且灵芝子实体糖肽复合物提取工序复杂，因此成本过高，难以满足大规模工业生产的需要，从而限制了其在畜牧业中的应用；另一方面，研究发现，同种(株)灵芝真菌的菌丝体与子实体的糖肽复合物的分子量、组成、结构、比例、化学性质及生物学活性相似，因此采用生物发酵方法直接培养灵芝真菌丝体，再分别提取胞内、胞外糖肽复合物具有许多优点。与前者相比，生物发酵法只将灵芝真菌培养到菌丝体阶段，且其糖肽复合物后提取工序简单，生产周期缩短，生产效率得以提高。

在生物发酵生产的过程中，决定生产水平和生产成本高低的主要因素有三个：生产菌种、发酵工艺和后提取工艺或后加工工艺，其中，最重要的是生产菌种的特性。从自然界分离出的菌种，由于生产能力低，往往不能满足工业上的需要。因为在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，菌体趋向于快速生长和繁殖。但是，发酵工业的期望或需要与此相反，需要微生物的代谢产物，如多糖或其它活性成分等，能够大量积累。为此，采用种种方法来打破菌种的正常代谢，使之失去自我保守性的调节控制，从而大量积累我们所需要的目标代谢产物，如灵芝糖肽复合物。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术制备灵芝糖肽复合物饲料添加剂的成本高而不易于在动物养殖行业推广使用的缺陷，通过原生质体紫外诱变技术选育一株可高产糖肽复合物的灵芝真菌，使其能经发酵生产出在饲料中添加量低、功能明确，具有提高动物体免疫力、抗病力，促进免疫系统生长发育，提高其奶、肉、蛋产量和生产能力，改善奶、肉、蛋的品质和风味，提高水产动物的生长速度和存活率，能广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物，可作为抗生素的替代品等优点的灵芝糖肽复合物饲料添加剂。

本发明的另一目的在于提供一种可高产糖肽复合物的灵芝真菌的诱变选育方法。

本发明的再一目的在于该可高产糖肽复合物的灵芝真菌用于液体发酵制备糖肽复合物饲料添加剂或免疫强化饲料添加剂等的应用。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供的可高产糖肽复合物的灵芝真菌，其分类命名为：灵芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1251。

该灵芝真菌菌丝生长速度快，菌丝体为纯白色，产孢子；需避光培养，其培养需Mg²⁺、K⁺等微量元素及B族维生素；高产糖肽复合物等生物活性物质。

本发明提供的可高产糖肽复合物的灵芝真菌的诱变选育方法，其诱变选育步骤如下：

1)出发菌株CAU55菌丝体的培养

以本实验室于4℃保存，购自《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，菌种保藏号为CGMCC 5.533的灵芝真菌CAU55作为出发菌株；

将出发菌株CAU55接种于灭菌固体培养基上，25～30℃固体培养5～10天；将培养好的菌株接种于灭菌液体培养基中，28～32℃摇瓶培养3～5天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基中，28～32℃摇瓶发酵培养3～5天，得到出发菌株CAU55菌丝体液，备用；

所述的固体培养基为按下述比例配制的：马铃薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH₂PO₄1.5～3g，MgSO₄·7H₂O0.75～2.5g，琼脂15～20g；

所述的液体培养基为按下述比例配制的：葡萄糖20～40g，蛋白胨2～4g，KH₂PO₄0.5～2g，MgSO₄·7H₂O 0.5～2g，蒸馏水1000ml；

2)出发菌株CAU55原生质体的制备

酶解：将步骤1)中培养的出发菌株CAU55菌丝体液于2000～4000r/min离心1～3min；去上清，加灭菌渗透压稳定剂1～3ml，轻微振荡后2000～4000r/min离心1～3min，此步骤重复操作2～3次；去上清后，按酶解液(ml)：菌丝体重(g)1～4∶1的比例，在菌丝体沉淀中加入滤菌后的酶解液，充分振荡，25～30℃培养1～3小时，备用；

过滤：将酶解好的菌丝体液过滤，再用少量渗透压稳定剂冲洗滤膜，1000～3000r/min离心1～5min，得到出发菌株CAU55原生质体沉淀；

所述渗透压稳定剂为按下述比例配制的：80～130g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，灭菌备用；

3)原生质体的紫外诱变和再生培养

将步骤2)所得出发菌株CAU55原生质体沉淀制成悬浮液，并调至原生质体个数为10⁴～10⁶个/ml，液层厚度0.2～0.4cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率为15～18W，照射时间为0.5～5min，照射距离25～30cm；照射后立即稀释涂布在原生质体再生培养基上，27～32℃培养6～10天，进行初筛，挑选10～40个菌丝体生长速度较快的单菌落，进行摇瓶发酵复筛，用苯酚-硫酸法测定其糖肽复合物含量，选择6～10株糖肽复合物高产菌株CAU550N，再分别做传代稳定性实验，选出一株菌丝生长速度最快，糖肽复合物产量最高且稳定性好的菌株CAU5501；

所述原生质体再生培养基为按下述比例配制的：D-纤维二糖10～15g，蛋白胨2～3.5g，酵母浸粉1.5～4g，KH₂PO₄ 2～3g，MgSO₄·7H₂O 1.0～2.5g，VB₁ 20～50μg，渗透压稳定剂1000ml；

所述传代稳定性实验的步骤是：将选出的6～10株糖肽复合物高产菌株CAU550N，分别接种到灭菌固体培养基上，25～30℃固体培养5～8天，培养好后再接种到灭菌固体培养基上，25～30℃固体培养5～8天，重复此步骤5～10次，观察CAU550N的生长速度；将已传种5～10代的CAU550N接种到液体培养基中，28～32℃摇瓶培养3～5天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基中，进行摇瓶发酵，28～32℃培养3～5天，得菌丝体液，分别测定它们的糖肽复合物产量，剔除菌种退化，生长速度下降或生产性能下降的菌株，保留生长速度快，生产性能优良、稳定的菌株，最后得到可高产糖肽复合物的灵芝真菌CAU5501，其分类命名为：灵芝真菌Ganoderma Lucidum，于2004年11月22日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCC No.1251。

本发明提供的可高产糖肽复合物的灵芝真菌的诱变选育方法，还包括将得到的高产菌株CAU5501保存在固体培养基II上，4℃保藏，每3个月转接一次。转接用于该菌株的正常传代，以防止菌株退化。

所述固体培养基II为按下述比例配制的：马铃薯提取液1000ml，葡萄糖20～30g，KH₂PO₄ 1.5～3g，MgSO₄·7H₂O0.75～2.5g，琼脂15～20g。

本发明提供上述可高产糖肽复合物的灵芝真菌的用途，该可高产糖肽复合物的灵芝真菌可用于液体发酵制备糖肽复合物绿色饲料添加剂，或用于制备微生物饲料添加剂、免疫增强剂等微生物制剂。

与现有技术相比，本发明提供的可高产糖肽复合物的灵芝真菌及其制备方法的优点在于：

1.将原生质体技术和紫外诱变方法相结合进行处理，可多角度改变微生物的遗传性能，保证变异菌株的稳定性，并提高诱变效率，易于建立优良再生无性变异株系；

2.诱变方法不复杂，操作方便，效果明显；

3.用其发酵制备灵芝糖肽复合物饲料添加剂可明显缩短生产周期达50％，降低发酵成本，使灵芝糖肽复合物在畜牧业中的应用成为可能；

4.诱变选育的高产菌株可用于制备微生物饲料添加剂；

5.诱变选育的高产菌株可用于制备饲用免疫增强(强化)剂。

具体实施方式

实施例1、诱变选育本发明的可高产糖肽复合物的灵芝真菌

按照本发明提供的诱变选育方法，诱变选育可高产糖肽复合物的灵芝真菌，其步骤如下：

1)出发菌株CAU55菌丝体的培养

将出发菌株CAU55接种于灭菌固体培养基A上，27℃固体培养10天；将培养好的菌株接种于灭菌液体培养基B中，28℃摇瓶培养4天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基C中，32℃摇瓶发酵培养3天，得到出发菌株CAU55菌丝体液，备用；

所述的固体培养基A为按下述比例配制的：马铃薯提取液1000ml，葡萄糖25g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，琼脂15g；

所述的液体培养基B、C为按下述比例配制的：葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH₂PO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，蒸馏水1000ml；

2)出发菌株CAU55原生质体的制备

酶解：将步骤1)中培养的出发菌株CAU55菌丝体液于灭菌离心管中，4000r/min离心2min；去上清，加灭菌渗透压稳定剂3ml，轻微振荡后3000r/min离心2min，此步骤重复操作2次；去上清后，将所得沉淀移至灭菌Eppendorf管中，差数称重法称重，记录菌丝体重量；按酶解液(ml)：菌丝体重(g)1∶1的比例，在菌丝体沉淀中加入滤菌后的酶解液，充分振荡，25℃培养1小时，备用；

过滤：用灭菌滤器将酶解好的菌丝体液过滤至另一灭菌Eppendorf管中，再用少量渗透压稳定剂冲洗滤膜，3000r/min离心3min，得到出发菌株CAU55原生质体沉淀；

所述渗透压稳定剂为按下述比例配制的：100g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，灭菌备用；

3)原生质体的紫外诱变和再生培养

将步骤2)所得出发菌株CAU55原生质体沉淀制成悬浮液，并调至原生质体个数为10⁶个/ml，液层厚度0.4cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率为15W，照射时间为3min，照射距离30cm；照射后立即稀释涂布在原生质体再生培养基D上，27℃培养9天，进行初筛，挑选20个菌丝体生长速度较快的单菌落，进行摇瓶发酵复筛，用苯酚-硫酸法测定其糖肽复合物含量，选择10株糖肽复合物高产菌株CAU550N，再分别做传代稳定性实验，选出一株菌丝生长速度最快，糖肽复合物产量最高且稳定性好的菌株CAU5501；

所述原生质体再生培养基D为按下述比例配制的：D-纤维二糖10g，蛋白胨3g，酵母浸粉2g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，VB₁20μg，渗透压稳定剂1000ml；

所述传代稳定性实验的步骤是：将选出的10株糖肽复合物高产菌株CAU550N，分别接种到灭菌固体培养基A上，25℃固体培养8天，培养好后再接种到灭菌固体培养基A上，25℃固体培养8天，重复此步骤8次，观察CAU550N的生长速度；将已传种8代的CAU550N接种到液体培养基B中，28℃摇瓶培养5天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基B中，进行摇瓶发酵，30℃培养3天，得菌丝体液，分别测定它们的糖肽复合物产量，剔除菌种退化，生长速度下降或生产性能下降的菌株，保留生长速度快，生产性能优良、稳定的菌株，最后得到可高产糖肽复合物的灵芝真菌CAU5501。

将得到的高产菌株CAU5501保存在固体培养基II上，4℃保藏，每3个月转接一次。转接用于该菌株的正常传代，以防止菌株退化。

所述固体培养基II为按下述比例配制的：马铃薯提取液1000ml，葡萄糖30g，KH₂PO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O 2g，琼脂20g。

实施例2、诱变选育本发明的可高产糖肽复合物的灵芝真菌

1)出发菌株CAU55菌丝体的培养

将出发菌株CAU55接种于灭菌固体培养基A上，25℃固体培养10天；将培养好的菌株接种于灭菌液体培养基B中，30℃摇瓶培养3天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基C中，30℃摇瓶发酵培养3天，得到出发菌株CAU55菌丝体液，备用；

所述的固体培养基A为按下述比例配制的：马铃薯提取液1000ml，葡萄糖20g，KH₂PO₄ 1.5g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，琼脂20g；

所述的液体培养基B、C为按下述比例配制的：葡萄糖20g，蛋白胨2.5g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，蒸馏水1000ml；

2)出发菌株CAU55原生质体的制备

酶解：将步骤1)中培养的出发菌株CAU55菌丝体液于灭菌离心管中，2000r/min离心3min；去上清，加灭菌渗透压稳定剂2ml，轻微振荡后2000r/min离心3min，此步骤重复操作2次；去上清后，将所得沉淀移至灭菌Eppendorf管中，差数称重法称重，记录菌丝体重量；按酶解液(ml)：菌丝体重(g)2∶1的比例，在菌丝体沉淀中加入滤菌后的酶解液，充分振荡，30℃培养1小时，备用；

过滤：用灭菌滤器将酶解好的菌丝体液过滤至另一灭菌Eppendorf管中，再用少量渗透压稳定剂冲洗滤膜，3000r/min离心2min，得到出发菌株CAU55原生质体沉淀；

所述渗透压稳定剂为按下述比例配制的：130g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，灭菌备用；

3)原生质体的紫外诱变和再生培养

将步骤2)所得出发菌株CAU55原生质体沉淀制成悬浮液，并调至原生质体个数为10⁵个/ml，液层厚度0.2cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率为15W，照射时间为2.5min，照射距离25cm；照射后立即稀释涂布在原生质体再生培养基D上，30℃培养6天，进行初筛，挑选40个菌丝体生长速度较快的单菌落，进行摇瓶发酵复筛，用苯酚-硫酸法测定其糖肽复合物含量，选择6株糖肽复合物高产菌株CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501，再分别做传代稳定性实验，选出一株菌丝生长速度最快，糖肽复合物产量最高且稳定性好的菌株CAU5501；

所述原生质体再生培养基D为按下述比例配制的：D-纤维二糖12g，蛋白胨2.0g，酵母浸粉2.5g，KH₂PO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O1.5g，VB₁50μg，渗透压稳定剂1000ml；

所述传代稳定性实验的步骤是：将上述步骤选出的6株糖肽复合物高产菌株CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501，分别接种到灭菌固体培养基A上，26℃固体培养6天，培养好后再接种到灭菌固体培养基A上，26℃固体培养6天，重复此步骤10次，观察CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501的生长速度；将已传种10代的CAU55N1、CAU55N2、CAU55N3、CAU55N4、CAU55N5、CAU5501分别接种到液体培养基B中，30℃摇瓶培养4天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基B中，进行摇瓶发酵，30℃培养5天，得菌丝体液，分别测定它们的糖肽复合物产量，剔除菌种退化，生长速度下降或生产性能下降的菌株，保留生长速度快，生产性能优良、稳定的菌株，最后得到可高产糖肽复合物的灵芝真菌CAU5501。

将此得到的高产菌株CAU5501保存在固体培养基II上，4℃保藏，每3个月转接一次。转接用于该菌株的正常传代，以防止菌株退化。

所述固体培养基II为按下述比例配制的：马铃薯提取液1000ml，葡萄糖25g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.75g，琼脂17g。

实施例3、诱变选育本发明的可高产糖肽复合物的灵芝真菌

1)出发菌株CAU55菌丝体的培养

将出发菌株CAU55接种于灭菌固体培养基A上，30℃固体培养10天；将培养好的菌株接种于灭菌液体培养基B中，32℃摇瓶培养4天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基C中，32℃摇瓶发酵培养5天，得到出发菌株CAU55菌丝体液，备用；

所述的固体培养基A为按下述比例配制的：马铃薯提取液1000ml，葡萄糖30g，KH₂PO₄ 3g，MgSO₄·7H₂O 2.5g，琼脂20g；

所述的液体培养基B、C为按下述比例配制的：葡萄糖40g，蛋白胨4g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，蒸馏水1000ml；

2)出发菌株CAU55原生质体的制备

酶解：将步骤1)中培养的出发菌株CAU55菌丝体液于灭菌离心管中，3000r/min离心1min；去上清，加灭菌渗透压稳定剂1ml，轻微振荡后4000r/min离心1min，此步骤重复操作3次；去上清后，将所得沉淀移至灭菌Eppendorf管中，差数称重法称重，记录菌丝体重量；按酶解液(ml)：菌丝体重(g)4∶1的比例，在菌丝体沉淀中加入滤菌后的酶解液，充分振荡，28℃培养3小时，备用；

过滤：用灭菌滤器将酶解好的菌丝体液过滤至另一灭菌Eppendorf管中，再用少量渗透压稳定剂冲洗滤膜，1000r/min离心5min，得到出发菌株CAU55原生质体沉淀；

所述渗透压稳定剂为按下述比例配制的：80g葡萄糖溶于1000ml蒸馏水中，灭菌备用；

3)原生质体的紫外诱变和再生培养

将步骤2)所得出发菌株CAU55原生质体沉淀制成悬浮液，并调至原生质体个数为10⁴个/ml，液层厚度0.3cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率为18W，照射时间为1min，照射距离25cm；照射后立即稀释涂布在原生质体再生培养基D上，32℃培养10天，进行初筛，挑选10个菌丝体生长速度较快的单菌落，进行摇瓶发酵复筛，用苯酚-硫酸法测定其糖肽复合物含量，选择6株糖肽复合物高产菌株CAU550N，再分别做传代稳定性实验，选出一株菌丝生长速度最快，糖肽复合物产量最高且稳定性好的菌株CAU5501；

所述原生质体再生培养基D为按下述比例配制的：D-纤维二糖15g，蛋白胨3.5g，酵母浸粉4g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 1g，VB₁ 40μg，渗透压稳定剂1000ml；

所述传代稳定性实验的步骤是：将选出的6株糖肽复合物高产菌株CAU550N，

分别接种到灭菌固体培养基A上，30℃固体培养5天，培养好后再接种到灭菌固体培养基A上，30℃固体培养5天，重复此步骤5次，观察CAU550N的生长速度；将已传种5代的CAU550N接种到液体培养基B中，32℃摇瓶培养3天，再将培养好的种子液接种于灭菌液体培养基B中，进行摇瓶发酵，32℃培养5天，得菌丝体液，分别测定它们的糖肽复合物产量，剔除菌种退化，生长速度下降或生产性能下降的菌株，保留生长速度快，生产性能优良、稳定的菌株，最后得到可高产糖肽复合物的灵芝真菌CAU5501。

所述固体培养基II为按下述比例配制的：马铃薯提取液1000ml，葡萄糖20g，KH₂PO₄ 1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.75g，琼脂15g。

对上述三个实施例所得可高产糖肽复合物的灵芝真菌CAU5501的菌丝生长速度、产糖肽复合物能力进行测试，实施例2所得可高产糖肽复合物的灵芝真菌菌丝生长速度最快，为7.34cm/7d，其产胞外糖肽复合物能力也最强，为2.45mg/ml。将实施例2所得可高产糖肽复合物的灵芝真菌CAU5501于2004年11月22日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，分类命名为：灵芝Ganoderma Lucidum，其保藏号为CGMCC No.1251。

菌丝生长速度是衡量灵芝真菌株生长性能的有效指标，也是缩短生产周期的关键。菌丝生长速度＝斜面培养基菌丝生长长度/天数(所述天数为7天)。实施例2中各步骤突变株与母株的菌丝生长速度列于表1。

表1、出发菌株与诱变株的菌丝生长速度和胞外糖肽复合物产量的比较

灵芝胞外糖肽复合物产量(mg/ml)，与灵芝糖肽复合物总产量呈正相关，是衡量灵芝真菌生产性能的重要指标，也是衡量灵芝糖肽复合物总产量的关键指标。测定时先利用多糖类化合物不溶于有机溶剂(乙醇)的原理将其沉淀，再利用苯酚-硫酸试剂可与多糖或糖肽中的己糖起显色反应的原理，使其充分反应，由于己糖在490nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系，因此，根据其吸收值可得胞外糖肽复合物的产量。

苯酚-硫酸显色法测定灵芝胞外糖肽复合物产量的方法如下：

标准曲线的绘制：首先配制标准葡萄糖溶液，其浓度为3mg/ml，摇匀备用；然后严格按下表2所列加样量顺序加样。

表2、葡萄糖、5％苯酚、浓硫酸的加样量

按表2在编号试管中加入葡萄糖溶液和蒸馏水，再加5％苯酚溶液1ml，混匀后缓慢滴加浓硫酸4ml，振荡混匀，冷却至室温，放置20分钟，以第一管调零点，在490波长处测定吸收度。以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度值(OD值)为纵坐标，绘制标准曲线。

样品胞外糖肽复合物含量的测定：取用乙醇处理好的样品液3ml，4000r/m下离心20分钟，沉淀用1ml蒸馏水溶解，再加入5％苯酚溶液1ml，混匀后缓慢滴加浓硫酸4ml，振荡混匀，冷却至室温，放置20分钟，490波长处测OD值，根据标准曲线得其胞外糖肽复合物含量。实施例2中各步骤突变株与母株的产胞外糖肽复合物的能力比较列于表1。

实施例4、利用本发明的可高产糖肽复合物的灵芝真菌作为液体发酵制备糖肽复合物饲料添加剂

利用本发明的可高产糖肽复合物的灵芝真菌作为液体发酵制备糖肽复合物饲料添加剂的具体用法如下：

1)制备种子液

将本发明的实施例2制得的可高产糖肽复合物的灵芝真菌(Ganoderma Lucidum)接入灭菌后的液体培养基中，于28～32℃培养3～5天，得到种子液；

所述液体培养基按以下比例配制：葡萄糖20～40g，蛋白胨2～4g，KH₂PO₄ 0.5～2g，MgSO₄·7H₂O 0.5～2g，蒸馏水1000ml。

2)发酵制备糖肽复合物饲料添加剂

将发酵底物粉碎到40～120目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量与发酵底物的重量份配比为100∶3～20，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量份配比为10～80∶1，将发酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃灭菌10～30分钟，冷却到25℃，再加入上述步骤制备的种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3～15∶100，混合均匀后在25～32℃，以0.5～2.5vvm的速度通入无菌空气，以80～200rpm速度搅拌发酵3～7天，得到糖肽复合物发酵液，于140～145℃灭菌2～8秒，得到液态糖肽类饲料添加剂；还可将该糖肽复合物饲料添加剂进行超滤、浓缩、干燥等，得到粉状糖肽类饲料添加剂；另外，通过发酵工业的后提取工艺(浸提、醇沉等)，可将发酵液和菌丝体分别提取胞外、胞内糖肽复合物，得到精制糖肽类饲料添加剂——糖肽复合物饲料添加剂。

所述的发酵底物(即碳源)为选自玉米面、酒糟、麸皮、红糖、食用白糖、玉米糖浆、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜中的一种或几种的混合物；

所述的氮源为选自大豆蛋白、谷蛋白中的一种或几种的混合物；

所述的大豆蛋白包括大豆分离蛋白、豆粕、豆饼、大豆；

所述的谷蛋白包括玉米蛋白、玉米蛋白粉和小麦蛋白。

制备的糖肽类饲料添加剂具有多种用途：

1)该糖肽类饲料添加剂可提高畜禽的抗体水平和细胞免疫功能，增强免疫力和抗病力，减少病死率。

2)该糖肽类饲料添加剂能明显刺激动物免疫器官的生长发育，提高动物的健康水平。

3)该糖肽类饲料添加剂无毒、无残留，具有抑制有害菌和消炎的作用，可作为抗生素替代产品，用于调节家畜、家禽肠道微生物区系平衡。

4)该糖肽类饲料添加剂有调节营养物质代谢，降血脂、胆固醇，降血糖的作用，提高畜产品品质。

5)该糖肽类饲料添加剂能提高动物的生产性能，如提高生长速度、节约饲料、降低生产成本等。

实施例5、实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂对肉仔鸡生产性能的影响。

将1日龄公母混合的健康爱维因肉鸡500只，随机分成5个处理，每个处理100只，每个处理分为5个重复，每个重复20只鸡。5个处理分别为：

A组，空白对照组，仅饲喂肉仔鸡基础日粮；

B组，抗生素组，除饲喂肉仔鸡基础日粮外，每吨饲料添加3.2g安来霉素(常用量)；

C组，灵芝糖肽复合物饲料添加剂组，除饲喂肉仔鸡基础日粮外，每吨饲料添加1kg实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂，其中有效成分2.5g/t饲料；

D组，灵芝糖肽复合物饲料添加剂组，除饲喂肉仔鸡基础日粮外，每吨饲料添加3kg实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂，其中有效成分7.5g/t饲料；

E组，灵芝糖肽复合物饲料添加剂组，除饲喂肉仔鸡基础日粮外，每吨饲料添加5kg实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂，其中有效成分12.5g/t饲料。

糖肽复合物对肉仔鸡生产性能的影响结果列于表3。

表3、糖肽复合物饲料添加剂在肉仔鸡生产性能的影响

注：同行数字右肩标有不同大写字母(A、B、C)者为差异达极显著(P＜0.01)，同行数字右肩标有不同小写字母者(a，b，c)为差异显著(P＜0.05)，有相同字母者或无字母标注者为差异不显著(p＞0.05)。A、B、C、a，b，c为统计学上显著性检验的表示方法。

从表3可以看出，在1～4周和1～7周，D组的日增重效果最好，在1～4周D组的日增重和其它组存在极显著差异(P＜0.01)。在整个饲养周期(1～7周)中，随着糖肽复合物添加量的增加，肉仔鸡日增重先上升后下降，D组的日增重是峰值和其它组差异显著(P＜0.05)；且随着糖肽复合物添加量的增加，肉仔鸡生长的料肉比先下降后上升，D组的料肉比最小，但与其它组相比差异不显著(p＞0.05)。从表中可以看出D组(7.5g/t糖肽复合物添加组)和B组(抗生素组)相比，日增重相似，但料肉比较低，说明D组效果好于B组。总之，本试验表明，在肉仔鸡饲料中添加糖肽复合物饲料添加剂可提高家禽日增重，降低料肉比，提高生产性能，降低生产成本。

实施例6、实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂在养猪生产中应用

为检验本发明的产品的功效和在养猪业上的应用效果，以及代替抗生素的可行性。试验选取体重接近健康的35日龄断奶仔猪(公母各半)180头分为5个处理，每个处理(组)36头猪，每个处理6个重复，每个重复6头猪，均为3公3母，试验期8周(2个月)，试验结果列于表4。5个处理如下所示：

空白对照组：不添加任何添加剂，仅饲喂猪基础日粮；

抗生素对照组：粉剂金霉素100mg/kg，均匀混合于基础日粮中；

灵芝糖肽复合物1组：5mg/kg实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂，均匀混合于基础日粮中；

灵芝糖肽复合物2组：10mg/kg实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂，均匀混合于基础日粮中：

灵芝糖肽复合物3组：15mg/kg实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂，均匀混合于基础日粮中。

表4、在养猪生产中的使用效果

处理/重复	29～50日龄平均日增重(Kg)	29～50日龄料重比
处理/重复	29～50日龄平均日增重(Kg)	29～50日龄料重比	空白对照组	0.2707±0.01	2.23±0.09
抗生素对照组(金霉素100mg/kg)	0.3261±0.02	1.68±0.08	空白对照组	0.2707±0.01	2.23±0.09
抗生素对照组(金霉素100mg/kg)	0.3261±0.02	1.68±0.08	灵芝糖肽复合物1组(5mg/kg)	0.3049±0.01	1.76±0.07
灵芝糖肽复合物2组(10mg/kg)	0.3364±0.02	1.68±0.07	灵芝糖肽复合物1组(5mg/kg)	0.3049±0.01	1.76±0.07
灵芝糖肽复合物2组(10mg/kg)	0.3364±0.02	1.68±0.07	灵芝糖肽复合物3组(15mg/kg)	0.3171±0.01	1.84±0.17

从表5可以看出，添加了实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂的3个组的平均日增重和饲料转化效率均好于空白对照组，可明显提高猪只的生产性能，即日增重和饲料转化效率。其中灵芝糖肽复合物2组(有效成分120mg/kg饲料)的平均日增重和饲料转化效率显著好于空白对照组及抗生素组，完全可以替代抗生素。

实施例7、使用实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂作为免疫强化饲料添加剂对肉鸡肉免疫器官的影响(见表5)。

表5、灵芝糖肽复合物添加剂对肉鸡免疫器官生长发育的影响

注：1)免疫器官指数：指免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊等)重量与动物体重量的比值；上表BW指肉鸡体重。2)同行数字右肩标有不同大写字母(A、B、C)者为差异达极显著(P＜0.01)，同行数字右肩标有不同小写字母者(a，b，c)为差异显著(P＜0.05)，有相同字母者或无字母标注者为差异不显著(p＞0.05)。A、B、C、a，b，c为统计学上显著性检验的表示方法。

从表5可以看出，随着灵芝糖肽复合物添加量的增加，肉鸡免疫器官胸腺、脾脏增重上升，但未形成显著差异(p＞0.05)。随着灵芝糖肽复合物添加量的增加，肉鸡法氏囊增重上升，且差异显著(P＜0.05)；糖肽复合物组与抗生素组间的法氏囊增重差异不显著(p＞0.05)，但各糖肽复合物添加组与空白对照组的差异均极显著(P＜0.01)。总之，本试验表明，在禽饲料中添加实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂，可促使家禽免疫器官增重、提高抗体滴度，增强其免疫力；且可完全替代抗生素，以消除抗生素的药物残留及毒副作用。

实施例8、实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂对鸡的牛血清白蛋白(BSA)抗体效价的影响

为检测本发明实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂对肉鸡对牛血清白蛋白(BSA)特异性抗体效价的影响，将肉仔鸡分为5个组，每个组分成5个重复，每个重复20只鸡，试验期为7周。试验设计见表6，基础日粮配比及营养水平见表7。分别于35日龄、42日龄给肉鸡左右腿肌各注射牛血清白蛋白0.5ml(牛血清白蛋白浓度为2.5mg/kg)。

表6、肉鸡饲养试验设计

组别	处理组	添加量(/吨饲料)	有效成分(g/吨饲料)
组别	处理组	添加量(/吨饲料)	有效成分(g/吨饲料)	A	空白对照	0	0
B	抗生素对照(新霉素+金霉素)	20+100g	20+100	A	空白对照	0	0
B	抗生素对照(新霉素+金霉素)	20+100g	20+100	C	0.1％糖肽复合物添加剂	1kg	40.0
D	0.3％糖肽复合物添加剂	3kg	120.0	C	0.1％糖肽复合物添加剂	1kg	40.0
D	0.3％糖肽复合物添加剂	3kg	120.0	E	0.5％糖肽复合物添加剂	5kg	200.0

表7、肉仔鸡日粮配方及营养水平

注：预混料向每千克全价料提供：Cu 6mg，Fe 75mg，Zn 75mg，Mn 80mg，Se 0.2mg，I 0.4mg，沸石粉1mg，胆碱3mg。维生素A 6000IU，维生素D3 2000IU，维生素E 12IU，维生素K3 2mg，生物素0.05mg，叶酸0.4mg，烟酸32mg，泛酸7mg，维生素B1 1mg，维生素B2 5mg，维生素B6 1mg，维生素B12 10ug。

于28日龄、49日龄每组组取12只鸡心脏采血，然后3000rpm离心10min分离血清，冻存于-20℃冰箱中，用酶联免疫方法(ELISA)检测BSA抗体效价，结果以OD值表示，见表8。

表8、添加糖肽复合物对28日龄肉仔鸡BSA抗体效价的影响

组别	BSA抗体效价(以OD值表示)	死亡率(％)
组别	BSA抗体效价(以OD值表示)	死亡率(％)	A(空白对照组，无药)	0.5537±0.04<sup>cB</sup>	6.8
B(抗生素对照组，新霉素20+金霉素100)	2.0123±0.40<sup>bAB</sup>	3.1	A(空白对照组，无药)	0.5537±0.04<sup>cB</sup>	6.8
B(抗生素对照组，新霉素20+金霉素100)	2.0123±0.40<sup>bAB</sup>	3.1	C(添加糖肽0.1％，含糖肽2.5g/t饲料)	2.5330±0.35<sup>bcBA</sup>	3.4
D(添加肽0.3％，，含糖肽7.5g/t饲料)	2.4183±0.48<sup>bcBA</sup>	2.1	C(添加糖肽0.1％，含糖肽2.5g/t饲料)	2.5330±0.35<sup>bcBA</sup>	3.4
D(添加肽0.3％，，含糖肽7.5g/t饲料)	2.4183±0.48<sup>bcBA</sup>	2.1	E(添加肽0.5％，，含糖肽12.5g/t饲料)	4.1038±0.66<sup>aA</sup>	1.8

从表8可以看出，随着实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂添加量的增加，肉鸡体内牛血清白蛋白抗体效价上升，死亡率下降，E组与其他各组相比差异显著(P＜0.05)。此外，添加糖复合物组的肉仔鸡的抗体效价明显高于空白对照组和抗生素组，特别是E组更为显著。说明实施例4制得的糖肽复合物饲料添加剂可明显提高肉仔鸡的抗体效价(抗体效价是衡量机体抵抗病原能力的重要指标，抗体效价高即表明机体的抗病力强)，并明显降低死亡率。

Claims

1.一种可高产糖肽复合物的灵芝真菌，该灵芝真菌CAU5501的分类命名为：灵芝(Ganoderma Lucidum)，于2004年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1251。

2.一种权利要求1所述的可高产糖肽复合物的灵芝真菌的用途，该可高产糖肽复合物的灵芝真菌用于液体发酵制备糖肽复合物饲料添加剂，该糖肽复合物饲料添加剂作为饲料的免疫强化添加剂。