CN100338092C - 水稻籼粳分类控制基因phr1及其应用 - Google Patents
水稻籼粳分类控制基因phr1及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明从水稻籼稻品种93-11中克隆并鉴定了控制水稻籼粳分类的基因并将其命名为PHR1。转基因功能互补实验证明PHR1是区分水稻籼粳分类的基因。在水稻中抑制或过量表达PHR1，得到具不同抗病虫害能力的转基因水稻，表明可以利用基因工程技术调控该基因从而调节植物抗性。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，更具体地，本发明涉及水稻酚染色反应控制基因PHR1编码的蛋白质及其功能类似物，编码其的核苷酸序列，含有该核苷酸的载体和含有该载体的宿主细胞；另外，本发明还涉及控制植物酚染色反应的方法和改良植物抗病虫育种的方法。
背景技术
在栽培稻的漫长进化历史中，产生了大约80000-100000个栽培种。这些栽培种根据相互间杂交后育性的不同被分为两类，一类为籼稻(Indica)，另一类为粳稻(Japonica)[1，2，本文以阿拉伯数字表示所引文献，下同]。然而通过育性进行分类，工作量大而不易被使用。1962年，Oka[3]经过大量的田间观察发现，通过考察栽培种的稃毛长度(A)、耐冷性(B)、对酚溶液的颜色反应(C)和对次氯酸钾抗性(D)，以及利用公式：X＝-D+0.75B-0.22A+0.86C可将栽培稻精确的进行分类。特别是酚反应(将种子浸在2％的苯酚溶液3-5天，籼稻被染成黑褐色，而粳稻则不能被染色)，只通过这一个指标，90％以上的栽培稻可进行正确的籼粳间分类。因此它对于研究水稻的起源和进化具有重要的作用。此外，在水稻杂交育种的实践中发现，籼/粳交比籼/籼或粳/粳交提高30％的产量，因此有效的进行籼粳分类，将对于指导育种实践具有重要的意义。
鉴于酚反应这一性状在研究水稻分类、进化以及水稻育种上的重要意义，其反应特性吸引了众多科研工作者的兴趣，中日学者在这方面做了大量的研究[1，2，3，4，5，6，7，8，9]。Takahashi[10]发现，将叶、茎、叶耳、茎节以及种子浸在2％的酚溶液中时，只有种子能被染色，而其它部位则不能被染色。根据小麦[11]的酚颜色反应，籼稻种子被染色的机理与两个反应有关，第一个反应是酚的芳香环被进一步羟化，而第二个反应酚能被氧化为相应的醌(多酚氧化酶)。而粳稻种子不能被染色则可能与不能羟化酚的芳香环有关，例如缺少羟化酶或电子供体。因此，阐明酚染色反应的生物化学和分子机理，对提示水稻籼粳分类以及研究水稻进化遗传学具有重要的意义。
此外，多酚氧化酶(PPO)对于植物防御病虫的侵害也具有重要作用。Constabel[16]等通过检测伤害及毛虫侵害后杨树中PPO的表达量，发现无论是在伤害后还是虫食后，杨树PPO的表达量与对照相比均显著提高。在番茄[17，18]、马铃薯[19]等植物中也得到了相似的结果。通过过量表达马铃薯PPO，转基因植株与对照相比表现出对细菌病害P.syringae具有较强的抗病性[17]。进一步证实了多酚氧化酶在植物的抗病虫性中具有重要作用。
自从Oka发现酚反应可以做为籼粳分类的指标后，Takahashi[10]和Kinoshita[12，13]等根据经典遗传学的研究，发现酚颜色反应是由一对基因控制，并将酚反应基因(PHR1)定位于第四染色体上，Saito等[14]通过分子标记法将PHR1基因进一步定位于第四染色体的长臂上，随后，Shao-Yang LIN[15]进一步将其定位于两个RFLP标记Kyy3和V17之间。但至今未见克隆该基因的报道。
发明内容
针对上述研究背景，本发明人通过深入研究，选择能被染色的籼稻和不能被染色的粳稻品种，运用图位克隆技术首先克隆了PHR1基因，该基因编码一种多酚氧化酶(SEQ ID NO：2)，经过序列分析，其属于多酚氧化酶(PPO)家族，与小麦PPO(SEQ ID NO：4，AY515506)的同源性为64％，直接参与将底物酚氧化成醌，并进行了该基因的功能验证。
本发明的一个目的是提供一种水稻酚染色反应控制基因PHR1编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有水稻酚染色反应控制功能的功能类似物。所述水稻酚染色反应控制基因PHR1具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。
本发明另一个目的是提供一种核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有水稻酚染色反应控制功能的功能类似物。
本发明还有一个目的是提供一种包含核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有水稻酚染色反应控制功能的功能类似物。在一个优选实施方案中，该载体为pCAMPHR1。
本发明另外的目的是提供一种含有载体的宿主细胞，所述载体含有核苷酸序列，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有水稻酚染色反应控制功能的功能类似物。在优选实施方案中，该宿主细胞是大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
本发明还提供一种控制植物酚染色反应的方法，其包括
i)用上述载体转化植物细胞；和
ii)将转化的植物细胞培育成植株。
在一个优选实施方案中，该植物是水稻。
本发明进一步提供一种改良植物抗病虫育种的方法，其包括用上述载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。在一个优选实施方案中，将上述载体通过农杆菌介导法或基因枪法转化植物细胞。优选植物为水稻。
为了实现上述目的，本发明的一种优选实施方式包含以下步骤：
一、水稻种子酚反应的遗传分析
本发明所采用的水稻品种为能被苯酚染色的籼稻品种(Indica)“明恢63”(中国水稻研究所)和不能染色的粳稻品种(Japonica)“春江06”(中国水稻研究所)，二品种杂交得F1代自交产生F2代，F2代植株所结种子用于苯酚颜色反应试验，明恢63和春江06分别作为正、负对照，如图1所示(A为明恢63，B为春江06)。实验数据证明，水稻酚反应这一性状符合单基因控制遗传规律。
二、图位克隆控制水稻酚反应的PHR1基因
PHR1基因的初步定位
为了分离PHR1基因，本发明首先建立了一个大的多态性高的定位群体，由明恢63(籼稻)与春江06品种(粳稻)杂交而形成的F2群体，再通过图位克隆的方法[21]，并利用已公布的水稻第四染色体SSR(SimpleSequence Repeat)等分子标记对PHR1位点进行初步定位，将其初步定位在第4染色体长臂，并介于Kyy03和V17两个RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism)标记之间，见图2。
PHR1基因的精细定位及物理定位
通过已测序的PHR1位点区域的BAC(Bacterial Artificial Chromosome)序列，建立PAC克隆重叠群。利用了S2970，S6660，P80，S6650和6444等5个STS(Sequence-tagged Sites)标记(序列见表1)和发展了P168，S6669和S2988等3个新的SSR标记(序列见表1)，进行精细定位，最终将PHR1定位于PAC克隆AL606645上SSR标记P80与P168之间，88kb的范围之内(图3)。通过分析此区段的开放阅读框(ORF)推测候选基因。
PHR1基因的鉴定和功能分析
进行功能互补的转基因研究。将PHR1基因构建到常规植物表达载体并转化到不能进行酚反应的粳稻品种Nipponbare(中国水稻研究所)中，结果转基因水稻的种子能够进行酚反应(见图5)；证明了本发明正确克隆了PHR1基因，氨基酸序列分析表明PHR1基因可能编码一种多酚氧化酶。
三、PHR1基因在水稻中的表达
通过转基因技术将PHR1基因以正义(Sense)形式转入水稻中，获得表型与反义(Antisense)形式完全对立的转基因水稻。在正义表达的转化个体中，多酚氧化酶的活性明显升高(图5)。表明该基因编码的蛋白质具有多酚氧化酶的功能。
转基因功能互补实验证明PHR1是区分水稻籼粳分类的基因。在番茄中通过过量表达PHR1的同源基因番茄PPO，能够提高转基因番茄对细菌性病害P.syringae的抗性。在毛虫侵食后的杨树中，PPO的表达量明显提高[17，18，19]。表明可以利用基因工程技术调控该基因从而调节植物抗性。
随着育种技术的不断发展，人们对遗传资源越来越重视。将那些资源合理的分类进而应用到生产中去，成为提高稻米产量和品质的重要一环。PHR1基因的发现与克隆，使我们能够有目的地选择亲本、进行育种实践，以及在分子水平上探讨水稻的起源和进化成为可能。同时也在改良水稻抗病虫性方面发挥重要的作用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应理解为是对本发明进行限定。
图1.水稻F2代植株所结种子的酚反应的表型鉴定。
图2.PHR1在水稻第4染色体上的初步定位图
图3.PHR1基因的精细定位及物理定位
图4.载体pCAMPHR1的图谱
图5.功能互补实验转基因水稻T0代植株所结种子的表型
具体实施方式
下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。
实施例1水稻酚染色反应控制基因PHR1的克隆
1.水稻材料
水稻(Oryza sativa ssp.)能染色的籼稻品种明恢63(Minghui63)和不能染色的粳稻品种春江06(Chunjiang06)。
2.分析和定位群体
纯合的籼稻品种明恢63和粳稻品种春江06进行杂交，F1代自交，共得到8000个F2个体，并从中选出2,506个个体作为定位群体。在苗期每株取2克左右的嫩叶，用来提取DNA。
3.通过SSR，STS，和CAPS标记定位PHR1基因
采用改进的CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)方法[11]从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约100mg水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于100μl超纯水中。每一个SSR、STS或CAPS反应用1μl DNA样品。
根据水稻精典遗传学的研究，酚反应基因被定位于第四染色体的长臂上的105-108cM处。然而，考虑到不同作图群体间的遗传图谱的偏差，我们设计了两对SSR引物RM282和RM487(序列见表1)，分别位于RGP遗传连锁图的100cM和127cM处。我们发现PHR1基因与这两个标记连锁并位于二者之间。在此基础上，我们设计的PCR引物分别以两个亲本的基因组DNA为模板进行PCR扩增(94℃预变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环，72℃延伸10mins)，将PHR1基因初步定位在SSR标记S2970和6444之间。
表1 克隆PHR1基因所用引物序列
| 引物名称 | 正向序列 | 反向序列 |
| S2970 | GAGGTAAGGCATTGATGTGC | CCAAGAGCAGTTTGCATTGC |
| S6660 | CTTTGCTGTGTCCTCTGTGC | GCAATGCTGTCAACCACTCC |
| P80 | CGTCGACATTAACGACGATTCG | ATGCAGATGCAGGTTGCAGCTG |
| P168 | AAGGCTGAGATATGTGAACACC | TGCCGCTACGCGTGACGC |
| S6669 | CAAAGCATGAGCTACTCTGCG | ATTGCATTCACGAGTGCTCG |
| S2988 | AAGTACTCTCCCGTTTCAAA | CCTCCCATAAAAATCTTGTC |
| S6650 | TTCGGACTCTCTCGTCCTGC | TTCATTTGGTCCTCCTCACG |
| 6444 | CTCTCGGCTGAAGCATTTGG | ATACCTTGGCTTCAAGTGGC |
| RM282 | CTGTGTCGAAAGGCTGCAC | CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG |
| RM487 | TTTCTCGAACGCAGGAGAAC | GCTAGGAACATCAACCCGAG |
| PH1 | GTGGTGCTAATGTGCACTAGGTAG | GACGTGAACGTGATGCAGCC |
| PH2 | ACCTGGCCAAGTACGAGAGG | CGTCTCTCCATCTGGGTTCA |
为了将PHR1定位在一个PAC克隆上，我们用已公布的水稻品种Nipponbare的PAC文库(
http://rgp.dna.affrc.go.jp)序列构建了PHR1位点附近的重叠群，设计的PCR引物分别以两个亲本(籼稻品种明恢63和粳稻品种春江06)的基因组DNA为模板进行PCR扩增(94℃预变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环，72℃延伸10mins)。以此发展了STS和SSR标记(序列见表1)，并用于群体精细定位，最终将其定位在一个PAC克隆AL606645上。
4.PHR1基因的精细定位
根据公布的PAC克隆AL606645的序列(
http://rgp.dna.affrc.go.jp)，发展了1个STS标记P80(序列见表1)和1个SSR标记P168(序列见表1)，最后通过连锁分析将PHR1定位在标记P80与P168之间88kb的范围之内。
5.PHR1部分cDNA基因的获得与功能的预测
首先对88kb的全长基因组序列用GENSCAN软件(
http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)预测可能的编码区(ORF)，发现这个区间共有15个ORF。其中一个ORF含有两个Cu2+结合区，具有典型的酪氨酸酶的开放阅读框；扩大序列范围预测，并将基因产物用blastX软件预测(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。用DNAStar软件(Lasergene)MegAlign程序中的ClustalW方法进行蛋白质序列比较和进化树分析。同时又设计一对引物PHRF(5’acctggccaagtacgagagg 3’)和PHRR(5’ccttcctagctcccgaaatca 3’)以籼稻93-11总RNA为模板进行RT-PCR反应(70℃10mins，42℃60mins，99℃5mins，4℃5mins)并用ABI3730DNA测序仪测序，得到了PHR1基因的cDNA序列。在上述研究的基础上推测该基因可能编码一种多酶氧化酶，与菠萝PPO极其相似。
6.不同品种间PHR1基因序列的比较
通过水稻不同品种间，包括亲本春江06、大粒、窄叶青、丽江、日本晴、R4、中花11、台北309、南京6号和中辉1号共10个粳稻品种以及93-11、台中本地1号、协B、浙辐802、广陆矮4号和莲塘藻共6个粳稻品种(由中国水稻研究所提供)的PHR1基因所在位点的DNA序列的比较，并与表型结果相对应，发现了引起表型差异的基因改变位置，表明碱基缺失是造成酚反应颜色改变的遗传基础。
实施例2水稻酚染色反应控制基因PHR1的功能互补及转基因研究
根据籼稻93-11 PHR1基因的序列设计引物，用引物PH1F，PH1R，PH2F和PH2R(序列见附件1)分2段高保真PCR(序列见表1，94℃预变性5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环，72℃延伸10mins并用ABI3730DNA测序仪测序(ABI公司)，挑选序列完全正确的克隆利用共有的BstBI位点将它们连接成一个4.2kb片段，包含起始密码子ATG上游的1,422个碱基和终止密码子TGA后的454个碱基的全长序列，克隆到双元载体pCAMBIA1300(购自CAMIA公司)中，获得了用于转化的质粒pCAMPHR1(图4)。质粒通过电击的方法转入农杆菌(AgroBacteriumtumefaciens)株系EHA105(购自CAMIA公司)中转化水稻。将粳稻日本睛的幼胚脱壳灭菌，接种到诱导愈伤组织的MS培养基[20]中。在28℃的培养室中暗培养3周，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有双元质粒载体的农杆菌EHA105菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，几天后移栽到水田，结实后收种进行表型鉴定。共收获10个株系的T0代种子，其中酚反应表现为阳性的有8个株系，证明PHR1基因已经整合进受体基因组内并能够正确表达(见附图5)。
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序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>水稻籼粳分类控制基因PHR1及其应用
<130>I040376
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2325
<212>DNA
<213>水稻
<400>1
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<211>574
<212>PRT
<213>水稻
<400>2
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Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys Ile Thr Asn Leu Gln Ser Thr
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Leu Arg Tyr Asn Asn Leu Leu Leu His Arg Lys Thr Lys Gly Trp Lys
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Ala Lys Tyr Glu Arg Ala Val Ser Leu Met Lys Lys Leu Pro Ala Asp
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Ala Gly Asp Gln Pro Glu Pro Gly Ala Gly Thr Val Glu Ser Val Pro
305 310 315 320
His Asn Pro Val His Arg Trp Thr Gly Asp Pro Arg Gln Pro Asn Gly
325 330 335
Glu Asp Met Gly Ile Phe Tyr Ser Ala Ala Arg Asp Pro Val Phe Phe
340 345 350
Ala His His Gly Asn Val Asp Arg Met Trp His Ile Arg Arg Gly Leu
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Leu Phe Pro Gly Asp Thr Asp Phe Thr Asp Pro Asp Trp Leu Asp Ala
370 375 380
Ser Phe Phe Phe Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Leu Val Arg Val Arg Val
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Arg Asp Thr Leu Asp Pro Ser Ala Leu Arg Phe Thr Tyr Gln Asp Val
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Gly Leu Pro Trp Leu Asn Ala Lys Pro Ser Thr Gly Ala Ala Ser Thr
420 425 430
Pro Ala Pro Ala Ala Gly Ala Phe Pro Ala Thr Leu Asp Lys Thr Val
435 440 445
Arg Val Ala Val Thr Arg Pro Arg Ala Ser Arg Ser Arg Glu Glu Lys
450 455 460
Glu Glu Glu Glu Glu Val Leu Val Ile Glu Gly Ile Glu Ile Pro Asp
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His Ser Thr Tyr Val Lys Phe Asp Val Phe Val Asn Ala Pro Glu Ser
485 490 495
Gly Asp Gly Ala Ala Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Ser Val Ala
500 505 510
Leu Ala Pro His Gly Ile His Arg Glu Gly Gln Leu Ser Pro Arg Lys
515 520 525
Thr Glu Ala Arg Phe Gly Ile Cys Asp Leu Leu Asp Asp Ile Gly Ala
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Asp Gly Asp Lys Thr Ile Val Val Ser Ile Val Pro Arg Cys Gly Cys
545 550 555 560
Asp Ser Val Thr Val Ala Gly Val Ser Ile Gly Tyr Ala Lys
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<210>3
<211>1734
<212>DNA
<213>菠萝
<400>3
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<210>4
<211>577
<212>PRT
<213>菠萝
<400>4
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1 5 10 15
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Met Ile Ser Cys Lys Ser Glu Lys Ser Arg Gly Ile Asp Arg Arg Asp
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Leu Leu Leu Gly Val Gly Gly Leu Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly
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Lys
Claims (12)
1.一种水稻酚染色反应控制基因PHR1编码的蛋白质，其氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.一种核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.一种载体，其包含权利要求2所述的核苷酸序列。
4.根据权利要求3的载体，其为pCAMPHR1。
5.一种宿主细胞，其含有权利要求3或4所述的载体。
6.根据权利要求5的宿主细胞，其选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞和植物细胞。
7.一种控制植物酚染色反应的方法，包括用权利要求3或4所述的载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。
8.根据权利要求7的方法，其中将权利要求3或4所述的载体通过农杆菌介导法或基因枪法转化植物细胞。
9.根据权利要求7或8的方法，其中所述植物是水稻。
10.一种改良植物抗病虫育种的方法，包括用权利要求3或4所述的载体转化植物细胞；和将转化的植物细胞培育成植株。
11.根据权利要求10的方法，其中将权利要求3或4所述的载体通过农杆菌介导法或基因枪法转化植物细胞。
12.根据权利要求10或11的方法，其中所述植物是水稻。
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2004
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Non-Patent Citations (1)
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