CH685674A5

CH685674A5 - Ultramikroemulsionen aus spontan dispergierbaren Konzentraten mit pharmakologisch wirksamen Estern von Apocarotinolen.

Info

Publication number: CH685674A5
Application number: CH3783/93A
Authority: CH
Inventors: Carl Eugster; Conrad Hans Eugster; Walter Haldemann; Giorgio Rivara
Original assignee: Marigen Sa
Priority date: 1993-12-19
Filing date: 1993-12-19
Publication date: 1995-09-15
Also published as: EP0689432A1; WO1995016441A1

Description

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Beschreibung

EINLEITUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Ultramikroemulsionen aus spontan dispergierbaren Konzentraten mit Estern von Apocarotinolen, Ester mit Apocarotinolen, Verfahren zu ihrer Herstellung, sowie die Verwendung der Apocarotinylester-haltigen, spontan dispergierbaren Konzentrate als Mittel zur Erzeugung eines pharmazeutischen Präparates mit Wirksamkeit gegen Tumore, Ekzeme und Psoriasis.

Ausgewählte Ester von Apocarotinolen haben überraschenderweise eine sehr gute Wirkung gegen Tumore, Psoriasis und Ekzeme, insbesondere dann, wenn sie in spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet worden sind, welche mit Wasser verdünnt thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen ergeben mit Mizellen, die einen hydrodynamischen Radius von 1,5 bis 3 nm aufweisen.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die für die vorliegende Erfindung ausgewählten Ester mit Apocarotinolen haben die Formeln (I) bis (IX):

o ch2—o—c r,

(I)

—Ri

(ii)

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O

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ch2—o—c — r

(Ml)

ch2—o— c—rl

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CHj-O C—R,

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ch2—o—-c—r,

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O

II

ch2—o—c—r1

(VIII)

cho

(IX)

wobei in den Formeln (I) bis (IX) Ri eine Cr bis C32-Alkyl-, eine C2- bis C32-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis C32-Alkiny!gruppe oder ein Radikal der Formeln (X), bzw. (XI) darstellt:

?

h,

r2—(-c h==c h-c=c h-)

n

(x)

Ç":

-(-ch=ch-c=ch-)—{-ch=ch-ch-(j—)—ch=ch

ch,

(XI)

worin n die Zahlen 1, 2, 3, 4 oder 5 bezeichnet und R2 für eines der Radikale der Formeln

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steht.

Die Alkyl-, Alkenyl-, bzw. Alkapolyengruppen (d.h. die entsprechenden Alkadiene, Alkatriene, Alkate-traene, Alkapentaene, Alkahexaene oder Alkapentaene), sowie die Alkinylgruppen bei Ri können geradkettig oder verzweigt sein.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) bis (IX), worin Ri eine Ci- bis Cis-Alkyl-, eine C2- bis Ci8-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis Cis-Alkinylgruppe oder ein Radikal der Formeln (XII) und (XIII) bezeichnet:

(XII)

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ch3

(XIII)

Besonders wichtig sind Verbindungen der Formeln (I) bis (IX), worin Ri eine C4- bis C-is-Alkyl-, eine C2- bis Cis-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis Cis-Alkinylgruppe oder ein Radikal der Formel (XII) darstellt.

Die Verbindungen der Formeln (I) bis (IX) können in verschiedenen stereoisomeren oder Drehformen vorliegen. Beispiele von Verbindungen der Formeln (I) bis (IX) sind u.a.:

8'-Apo-ß-carotin-3-ol-10-undecenoat

8'-Apo-ß-carotin-3,8'-diol-di-10-undecenoat

3',4'-Dihydro-2'-apo-ß-carotin-2-ol-10-undecenoat

12'-Apo-ß-carotin-12'-ol-10-undecenoat

10'-Apo-ß-carotin-10'-ol-10-undecenoat

8'-Apo-ß-carotin-8'-ol-10-undecenoat

8'-Apo-ß-carotin-8'-ol-laurat

8-Apo-ß-carotin-8'-ol-palmitat

8-Apo-ß-carotin-8'-ol-10-stearat

6'-Apo-ß-carotin-6'-oi-10-undecenoat

Azafrinyl-10-undecenoat

Azafrinyl-Iaurat

Azafrinyl-palmitat

Azafrinyl-stearat

Die Verbindungen der Formeln (I) bis (IX) lassen sich allgemein nach folgenden, an sich bekannten Verfahren a) oder b) herstellen:

a) Umsetzung einer Verbindung der Formel

R, COOH

worin Ri für eine Cr bis C32-Alkyl-, eine C2- bis C32-Alkenyl-, eine C2- bis C32-Alkapolyen-, eine C2-bis C32-Alkiny!gruppe oder ein Radikal der Formeln (X), oder (XI) steht, mit N,N'-Carbonyldiimidazol bei 0 bis 50°C unter Schutzgaszuleitung und Zusatz einer kataiytischen Menge eines Alkohoiates in einem indifferenten Lösungsmittel und anschliessender Alkoholyse der gebildeten imidazolide mit einer Verbindung der Formeln (XV) bis (XXIII):

(XV)

12'-Apo-ß-carotin-12'-ol

Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv. Chim. Acta 42, 847-864 (1959)

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(XVI)

10-Apo-ß-carotin-10'-ol

Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv. Chim. Acta 42, 847-864 (1959)

(XVII)

8'-Apo-p-caroti n-8'-ol

Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv. Chim. Acta 42, 847-864 (1959)

(XVIII)

6'-Apo-ß-carotin-6'-ol

Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv. Chim. Acta 42, 847-864 (1959)

(XIX)

4'-Apo-ß-carotin-4'-ol

Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv. Chim. Acta 42, 847-864 (1959)

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(XX)

2'-Apo-ß-carotin-2'-ol

Totalsynthese: R. Rüegg et al., Helv. Chim. Acta 42. 847-864 (1959)

(XXI)

Azafrinol; (5R,6R)-5,6-Dihydroxy-5,6-dihydro-10'-apo-ß-carotin-10'-ol

Totalsynthese: W. Eschenmoser und C.H. Eugster, Helv. Chim. Acta gl, 822 (1978). Merck-Index 11.911

(XXIi)

ß-Citraurol; ß-Citraurinol

Synthese: H. Pfander et al., Helv. Chim. Acta 22, 716-727, (1980)

(XXIII)

ß-Citraurin; ß-Citraurinin, Apo-2-Zeaxanthinal, (3R)-3-Hydroxy-8'-apo-ß-carotin-8'-al Synthese: H. Pfander et al., Helv. Chim. Acta SS. 716, 1377 (1980). Merck-Index 11.2326.

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b) Bildung des Chlorides, bzw. Bromides einer Verbindung der Formel r., cooh worin R3 für eine C-i- bis C32-Alkyl-, eine C2- bis C32-Alkenyl-, eine C2- bis C32-Alkapolyen-, eine C2-bis C32-Alkinylgruppe oder für ein Radikal der Formeln (X) oder (XI) steht, mit einem Chlorierungs- oder Bromierungsmittel, wie z.B. Thionylchlorid, Oxalylchlorid, und anschliessende Umsetzung mit einer Verbindung der Formeln (XV) bis (XXIII) bei einer Temperatur von 0 bis 50°C unter Schutzgaszuleitung, in einem indifferenten Lösungsmittel, wie z.B. Toluol oder Tetrahydrofuran, und in Gegenwart eines Katalysatoren, wie z.B. Pyridin, Dimethylformamid oder p-Dimethylaminopyridin.

Die Verfahren c) und d) sind neu.

c) Herstellung von Fettsäureestern von 8'-Apo-ß-carotin-8'-ol im Wege des DIBAH-Verfahrens.

Die Verbindung (XVII), d.h. der C3o-Alkohol:

(XVII)

wurde bislang hergestellt durch Reduktion von 8'-Apo-ß-carotin-8'-al mit LiAIH4 in Ether. [R. Rüegg, M. Montavon, G. Ryser, G. Saucy, G. Schwieter und O. Isler, Helv. Chim. Acta 1959, 42, 854]. Der C30-Alkohol wurde wie folgt charakterisiert: instabile orange Kristalle mit Smp. 148-149°C; /.max (Petrol-ether): 426, 453 nm; O-Acetylverbindung: orange Blättchen, Smp. 130-132°C, Àmax (Petrolether): 426, 452 nm; leicht erfolgende Eliminationsreaktion bei Chromatographieversuchen an AI2O3. Andere, ins-bes. höhere Ester sind bisher nicht beschrieben worden.

Das neue, ergiebige Herstellverfahren für den C3o-Alkohol führt über die Reduktion des 8'-Apo-ß-ca-rotin-8'-säuremethylesters mittels DIBAH (Diisobutylaluminiumhydrid).

Can-Alkohol. 8'-Apo-ß-carotin- 8'-ol

In einem trockenen 1-Liter-Dreihalskolben mit Einleitrohr für Schutzgas, Kühler, Magnetrührer und Septum werden 3.0 g Methyl-8'-Apo-ß-carotin-8'-oat und 300 ml absoluter Diethylether vorgelegt. Hierauf wird unter N2 auf -30°C gekühlt und dann 3,0 ml einer ca. 4,5 molaren Lösung von DIBAH in Hexan mit Hilfe einer Spritze langsam zugetropft. Es tritt keine sichtbare Reaktion ein. Nun lässt man das Gemisch langsam auf RT kommen und kontrolliert die Vollständigkeit der Reduktion mit UV/VIS-Spek-tren und DC. Wenn noch nicht aller Ester reduziert ist, wird erneut auf -30°C gekühlt und die benötigte Menge DIBAH zugefügt; etc. Ein Überschuss an DIBAH verringert die erreichbare Ausbeute an C30-AI-kohol beträchtlich.

Zur Aufarbeitung wird der Ansatz auf 0°C gekühlt, dann mit 5 ml Essigester versetzt und schliesslich vorsichtig solange mit kleinen Eisstückchen versetzt, bis kein Aufschäumen mehr eintritt. Hierauf wird das Kühlbad entfernt, das Gemisch mit Celite versetzt und dann abgenutscht. Der Filterkuchen wird mit Et20/AcOEt/lsopropanol 10:4:1 farbstofffrei gewaschen und das klare, rote Filtrat i.V. zur Trockene eingedampft. Der bereits kristalline, rote Rückstand lässt sich entweder aus heissem Toluol/Hexan oder Essigester/Hexan Umkristallisieren.

Ausbeute an C3o-Alkohol 2,2 bis 2,4 g (80-90%). Orangerote Nadeln, Smp. 148-149°C; UV/VIS (Et20, qualitativ): Xmax: 416, 425, 452 nm; IR (KBr): 2,77 (3603 crrri, OH frei), keine Banden im Car-

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bonylbereich; CI-MS (NH3): 419 [M+1,(16)} 401 [M+1-H20, (100)], 402 [M+2-H20, (30)], 309 [M+1-To-Ilio I, (5%)]

Herstellung und Charakterisierung von Undec-10-ensäure -r8-Aoo-B-carotin-8'-vl-ester1

Eine Lösung von 400 mg C3o-A!kohol in 20 ml abs. EkO und 1,5 ml abs. Pyridin wird in einem Dreihalskolben mit Magnetrührer, N2-Einleitrohr, Rückflusskühler und Septum unter N2 auf minus 30°C gekühlt und hierauf unter Rühren mit 200 ml Undec-10-enoylchlorid tröpfchenweise versetzt. Nach beendeter Zugabe iässt man die Temperatur langsam auf 20°C steigen und kontrolliert die Vollständigkeit der Veresterung durch DC auf Kieselgelplatten mit dem Fliessmittel Benzol/Petrolether 1:1. Der Ester weist einen bedeutend höheren Rf.-Wert als der Alkohol auf. Nun wird das Gemisch i.V. eingedampft, der Rückstand in Benzol aufgenommen und das Gelöste rasch durch eine kurze Säule von CaC03 (Merck Art. 2066) filtriert. Das Filtrat wird eingedampft und der Rückstand an 40 g Kieselgel (Merck, 15-40 (im) mit Benzol chromatographiert. Die Substanz aus der roten Zone wird aufgefangen, i.V. eingedampft und der erhaltene Ester aus t-Butyl-methylether/Pentan bei -20°C kristallisiert. Man erhält 450 mg hellrote Kristalle, nach Trocknen bei 40°C/0,01 Torr; Ausbeute 80%. Smp. 76-77°C, nach Sintern ab 75°C.

In analoger Weise wurden die Ester mit Laurinsäure-, Palmitinsäure- und Stearinsäurechlorid hergestellt. Analytische Daten nachstehend.

d) Herstellung von Azafrinol und von Azafrinylestern

Azafrinol

Die Verbindung

Azafrinol; (5R,6R)-5,6-Dihydro-10'-apo-8-ß-carotin-5,6,10'-triol) wurde erstmals von W. Eschenmoser und C. H. Eugster durch Reduktion von Azafrinmethyiester hergestellt und als labiles Öl beschrieben; s. Helv. Chim. Acta 1975, §£, 1722.

Durch eine modifizierte Reduktion und Aufarbeitung kann Azafrinol als wohlkristallisierte Verbindung isoliert und anschliessend auch eingehend charakterisiert werden. Azafrinol wird so durch Kristallisation aus Benzol/Hexan in leuchtend hellorangegelben Nadeln erhalten. Die Verbindung ist besonders gegen Säuren sehr empfindlich und verliert dabei unter Ringaufspaltung Wasser. Diese Reaktion tritt bereits bei einer Chromatographie an Kieselgel ein.

Herstellung und Charakterisierung

In einem sorgfältig getrockneten Dreihalskolben, versehen mit Rückflusskühler, Gaseinleitrohr, Sep-

h2oh

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tum und Magnetrührer werden 3 g Azafrinmethylester mit 300 ml absolutem Ether Übergossen und hierauf unter Schutzgas und gutem Rühren auf -30°C gekühlt. Dann werden durch das Septum 3,5 ml einer ca. 4,5 molaren Lösung von DIBAH (Diisobutylalumiumhydrid) in Hexan mittels einer Spritze tropfenweise zugegeben; es tritt keine sichtbare Reaktion ein. Während einer langsamen Temperaturerhöhung bis auf 0°C wird der Verlauf der Reaktion mit Hilfe von UVA/IS-Spektren und DC überprüft.

Zeigt sich, dass die Reduktion noch unvollständig ist, wird erneut auf -30°C gekühlt und eine entsprechende Menge von DIBAH-Lösung zugegeben. Ein geringer Überschuss an DIBAH wirkt sich auf die Ausbeute nicht wesentlich aus, doch muss ein grösserer Überschuss unbedingt vermieden werden.

Nach Beendigung der Reaktion wird die Lösung sehr vorsichtig solange mit kleinen Eisstückchen versetzt, bis kein Aufschäumen mehr eintritt und das Ausfallen von Alumiumhydroxid beendet ist. Nach Zugabe von genügend Celite und von 0,2 ml Ethyldiisopropylamin wird abgenutscht und der Filterkuchen mit einem Gemisch von Ether/Isopropylalkohol 5:1 farbstoffrei gewaschen. Das gelborange gefärbte Filtrat wird hierauf i.V. eingedampft und der kristalline Rückstand in Toluol/Isopropylalkohol 99:1 heiss gelöst und im Falle einer Trübung die Lösung rasch durch eine kleine, breite Säule von CaC03 filtriert. Es folgt ein erneutes Eindampfen des Filtrâtes und die Umkristallisation des Rückstandes aus heissem Be-zol/Hexan oder Essigester/Hexan. Nach Trocknen bei 40°C/0,01 Torr erhält man 2,2 g leuchtend hell- /

orange Nadeln. Smp. 133-134°C (Vakuumröhrchen). Vgl. die nachstehend mitgeteilten analytischen Daten.

Herstellung von Undec-10-ensäure[azafrinyl]ester

In einer geeigneten, gut getrockneten Schliffapparatur mit Magnetrührer, Schutzgaseinleitrohr, Kühler und Septum werden 180 mg frisch umkristallisiertes Azafrinol unter N2 in 15 ml EtïO und 0,5 ml abs.

Pyridin gelöst und hierauf auf minus 30°C gekühlt. Dann werden mit einer Spritze 100 ml 10-Unden-oylchlorid tröpfchenweise zugegeben. Nach einer h Rühren bei einer Temperatur von minus 30°C lässt man auf RT kommen. Anschliessend wird das Gemisch i.V. eingedampft, der Rückstand in Hexan/Ether 3:1 aufgenommen und das Lösliche durch eine kurze und breite Säule aus CaCC>3 (Merck, Art. 2066)

filtriert. Das zitronengelbe Eluat wird erneut eingedampft und mit Et20/Hexan/Isopropanol 50:49:1 + einer Spur Ethyldiisopropylamin an einer Säule aus Sephadex LH-20 (im selben Lösungsmittel gequollen) chromatographiert. Aus der orangen Hauptzone wurden 161 mg vakuum-trockenes, zähes Öl erhalten, das allmählich durchkristallisierte. Es konnte kein signifikanter Smp. erhalten werden. UVA/IS (Et2Ö,

qual.): scharfes Dreibandenspektrum mit Xmax 375, 394,5, 419 nm; (Benzol qual.): 377, 402, 428 nm.

in analoger Weise wurden die Ester n = 9 ;n = 13;n = 15, bzw.

Azafrinyl-Laurat, Azafrinyl-Palmitat ünd Azafrinyl-Stearat hergestellt. Analytische Daten sind nachstehend zusammengestellt.

Die Apocarotinester der Formeln (I) bis (IX) haben überraschenderweise eine ausgezeichnete antitumorale Wirkung, insbesondere dann, wenn sie in spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet worden sind, welche mit Wasser verdünnt thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen mit einem hydrodynamischen Radius von 1,5 bis 3 nm ergeben. (Messungen, gegen Wasser, mit dynamischer, quasielastischer Lichtstreuung ÖLS). Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb wesentlich auch spontan dispergierbare Konzentrate mit den Apocarotinylestern der Formeln (I) bis (IX).

Die Apocarotinester der Formeln (I) bis (IX) sind nahezu wasserunlösliche und polymer agglomerierte Verbindungen. Damit die Moleküle dieser Verbindungen aber durch die Membranbarriere der Tumorzellen diffundieren und im Innern der Zelle wirksam werden können, müssen derartige Verbindungen vorerst in geeigneter Weise im wässrigen Medium solubilisiert werden. Im Wege der Bildung von thermodynamisch stabilen Öl-in-Wasser Ultramikroemulsionen mit Hilfe von besonders ausgewählten Cotensi-den oder Lösungsvermittlern einerseits und geeigneten Tensiden anderseits gelingt es, einen optimalen Solubilisierungsgrad der Apocarotinyl-Ester zu erzielen.

Alle experimentellen Beobachtungen an dergestalt ausgebildeten Ultramikroemulsionen lassen sich einheitlich durch die Annahme deuten, dass die ausgewählten Tenside und Cotenside als ausgewogenes System genommen in der wässrigen Phase organisierte Aggregate, sog. Mizellen bilden. Sie besitzen mehr oder weniger kugelförmige Gestalt, mit einem hydrodynamischen Radius von 1,5 bis 3 nm.

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n^CH3

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Die Tenside und Hydrotrope (Cotenside) lassen zwischen der äusseren, wässrigen Phase und der inneren, öligen Phase der Mikroemulsion [enthaltend die pharmazeutischen Wirksubstanzen gelöst im bio-tensiden Lösungsvermittler] eine Grenzschicht entstehen, wodurch die Mischung dieser beiden Phasen unterbleibt. In der öligen, inneren Phase liegen die Wirksubstanz-Moleküle in monomerer oder in oligo-mer agglomerierter Form vor.

Die Mizellen der erfindungsgemässen Ultramikroemulsionen mit der Wirksubstanz-haltigen inneren Phase sind an ihrer Grenzschicht mit einem Tensidmantel versehen, was sie instand setzt, leicht durch die Zellmembran ins Innere der Zelle zu diffundieren. Die Diffusion durch die Plasmamembran der Zellen erfolgt ausschliesslich aufgrund thermischer Molekularbewegungen.

Die Richtung, die ein konkreter Diffusionsvorgang einschlägt, wird vom Konzentrationsunterschied bestimmt, welcher an der Plasmamembran zwischen ausserhalb und innerhalb der einzelen Zelle besteht. Die Diffusion verläuft solange entlang dem Konzentrationsgefälle, bis es abgebaut ist. Zwischen der extrazellulären Zone und dem Inneren der einzelnen Zelle wird die Konzentration an Wirksubstanz, bzw. am Wirkstoffsystem («multiple drug system») ausgeglichen, wobei auch verzögerte Abgabeeffekte («slow release effects») auftreten können. Derartige Diffusionsvorgänge verlaufen unabhängig von jeglicher Energiezufuhr. Sie haben keinen Bezug auf die zelluläre Stoffwechselenergie.

Die Diffusiongeschwindigkeit gehorcht dem Fick'schen Gesetz für Diffusionsvorgänge in Richtung eines Konzentrationsgefälles:

— - = -D — GLEICHUNG (A)

dt q dx wobei dm die Menge in Mol der eine Zellmembranoberfläche q (in cm2) durchdringenden Wirkstoffmoleküle pro Zeit dt (in Sekunden) ist. D ist der Diffusionskoeffizient und de der Konzentrationsunterschied über die Distanz dx.

Nach Nernst ist der Diffusionskoeffizient abhängig von der absoluten Temperatur und dem Reibungswiderstand f

R T kT

D = — — = GLEICHUNG (B)

N f f

Der Reibungswiderstand hängt gemäss dem Stoke'schen Gesetz f = 6 re -n r GLEICHUNG (C)

von der Viskosität der diffundierenden Lösung und vom Radius der diffundierenden Partikel ab. Durch Substitution von f mit 6 rj r in der Nernst-Gleichung erhält man die Sutherland-Einstein-Gleichung für den Diffusionskoeffizienten

RT 1 kT

D = = GLEICHUNG (D)

N 6 it i] r 6 je ri r worin k die Boltzmann-Konstante darstellt.

Wird bei einem Diffusionsvorgang ein gleichmässiger Konzentrationsabfall in der Membran der Tu-

dc Ac morzelle angenommen, so kann der Ausdruck im Diffusionsgesetz durch ersetzt wer-

dx x den. (Konzentrationsunterschied ac über der Zellmembran der Dicke x). x ist für eine bestimmte Zellmembran eine konstante Grösse, weshalb man sie zusammen mit dem Diffusionskoeffizienten zu einer neuen Konstanten, dem Permeabilitätskoeffizienten P, vereinigen kann

D

P = — GLEICHUNG (E)

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dm 1

Der Ausdruck — in der Diffusionsgleichung wird der Flux J genannt und hat die Dimensi-

dt q on Mol pro Sekunde pro cm2. Das negative Vorzeichen auf der rechten Seite der Diffusionsgleichung deutet an, dass der Transport der Wirkstoffmoleküle oder des Wirkstoffsystems in Richtung von der abnehmenden Konzentration weg abläuft.

Es ist somit

■ RT 1 A kT 1

J = -Päc = — ~— Ac = — Ac

Nx6 jc ri r x 6 n ti r gleichung (f)

Aus dieser Gleichung folgt, dass die Geschwindigkeit des Diffusionsvorganges, bzw. die Stärke des Wirkstofftransportes durch die Membran der Tumorzelle bestimmt wird:

1. vom Konzentrationsunterschied Ac in den beiden Kompartimenten

2. vom Teilchenradius des diffundierenden Wirkstoffmoleküls oder Wirkstoffsystems

3. von der Viskosität der diffundierenden wässrigen Lösung (Emulsion)

4. von der Temperatur.

Die erfindungsgemäss spontan dispergierbaren Konzentrate enthalten:

0,001 bis 30 Gew.-% einzelner Ester von Apocarotinolen der Formeln (I) bis (IX), bzw. Kombinationen solcher Ester, sowie

0 bis 40 Gew.-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienenden, pharmaverträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches 0,001 bis 90 Gew.-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Ten-sidgemisches

0 bis 10 Gew.-% eines Vitamins oder Provitamins

0 bis 10 Gew.-% eines Penetrationsverbesserers («flux enhancer»), eines Stabilisators oder Radikalfängers und übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel.

Die erfindungsgemäss einzusetzenden Tenside oder Tensidgemische können anionaktiv, kationaktiv, amphoter oder nicht-ionogen sein. Bevorzugt sind sie amphoter oder nicht-ionogen und haben ein HLB-Verhältnis (d.h. eine «hydrophilic-lipophilic-balance») zwischen 2 und 18; vorzugsweise liegt er zwischen 2 und 6 einerseits und 10 und 15 anderseits. HLB-Werte geben Auskunft über die hydrophilen und lipo-philen Eigenschaften eines Emulgators. Vgl. dazu «Hydrophile-Lipophile Balance: History and recent Developments» von Paul Becher im Journal of Dispersion Science and Technology 5 (1), 81-96 (1984).

Geeignete anionische Tenside können sowohl sog. wasserlösliche Seifen als auch wasserlösliche synthetische Verbindungen sein.

Als Seifen eignen sich die Alkali-, Erdalkali- oder gegebenenfalls substituierten Ammoniumsalze von höheren Fettsäuren (C-io bis C22), wie z.B. die natürlichen Na- oder K-Salze der Öl- oder Stearinsäure, oder von natürlichen Fettsäuregemischen, welche sich u.a. aus Kokosnuss- oder Talgöl gewinnen lassen. Ferner sind als Tenside auch die Fettsäure-Methyltaurinsalze, sowie modifizierte und nicht-modifi-zierte Phospholipide zu erwähnen.

Häufiger werden jedoch sogenannte synthetische Tenside verwendet, insbesondere Fettsulfonate, Fettsulfate, sulfonierte Benzimidazol-Derivate oder Alkylarylsulfonate.

Die Fettsulfonate und -sulfate liegen in der Regel als Alkali-, Erdalkali- oder gegebenenfalls substituierte Ammoniumsalze vor und weisen im allgemeinen einen Alkylrest mit 8 bis 22 C-Atomen auf, wobei Alkyl auch den Alkylteil von Acylresten einschliesst. Beispiele hiefür sind das Na- oder Ca-Salz der Li-gninsulfosäure, des Dodecylschwefelsäureesters und Sulfonsäuren von Fettalkohol-Äthylenoxyd-Adduk-ten. Die sulfonierten Benzimidazol-Derivate enthalten vorzugsweise zwei Sulfonsäuregruppen und einen Fettsäurerest mit etwa 8 bis 22 C-Atomen. Alkylaryl-Sulfonate sind z.B. die Na-, Ca- oder Triäthanol-aminsalze der Dodecylbenzolsulfonsäure, der Dibutylnaphthalinsulfonsäure oder eines Naphthalinsulfon-säure-Formaldehyd-Kondensationsproduktes.

Ais nichtionische Tenside stehen in erster Linie zur Wahl die Polyglykolätherderivate von aliphatischen oder cycloaliphatischen Alkoholen, gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren und Alkylphenolen, welche 3 bis 30 Glykoläthergruppen und 8 bis 20 C-Atome im (aliphatischen) Kohlenwasserstoffrest und 6 bis 18 C-Atome im Alkylrest enthalten können. Weiterhin kommen als nichtionische Tenside in Frage die wasserlöslichen, 20 bis 250 Äthylenglykoläthergruppen und 10 bis 100 Propylenäthergruppen ent13

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haltenden Polyäthylenoxydaddukte an Polypropylenglykol und Alkylpolypropylenglykol mit 1 bis 10 C-Atomen in der Alkylkette. Die genannten Verbindungen enthalten üblicherweise pro Propylenglykolein-heit 1 bis 5 Äthylenglykoleinheiten.

Als Beispiele nicht-ionischer Tenside seien erwähnt:

Nonylphenolpolyäthoxyäthanole, Ricinusölpoiyglykoläther, Polypropylenpolyäthylenoxyd-Addukte, Tri-butylphenoxypolyäthoxyäthanol, Polyäthylenglykol und Octylphenoxypolyäthoxyäthanol. Überdies kommen auch Fettsäureester von Polyoxyäthylensorbitan, wie das Polyoxyäthylensorbitan-Trioleat, in Betracht.

Bei den kationischen Tensiden handelt es sich vor allem um quaternäre Ammoniumsalze, welche als N-Substituenten mindestens einen Alkylrest mit 8 bis 22 C-Atomen enthalten und als weitere Substitu-enten niedrige, gegebenenfalls halogenierte Alkyl-, Benzyl- oder niedrige Hydroxy-alkylreste aufweisen. Die Salze liegen vorab als Halogenide, Methylsulfate oder Äthylsulfate vor, z.B. das Stearyitrimethylam-moniumchlorid oder das Benzyl- di(2-chloräthyl)äthylammoniumbromid.

In hohem Masse bevorzugt zur Herstellung von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentraten sind einerseits Phosphorsäureestertenside, wie z.B.

TristyryIphenolpolyoxyäthylen-1 8-mono/dimethylphosphorsäureester o

II

Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), bzw. das identische Sermul® EA 188 (SERVO), ein Mischemulgator, bestehend aus je 50% der beiden Verbindungen mit den Formeln:

o c9 h19-^}—0 (-ch2-ch2-o VP—°ch3

oh O

C9 H19-^3 (-CH2*CH2'°W-P-OCH3

och3

Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY)

(Tensid 508, CIBA-GEIGY);

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O

(—c h2 —-ch2—o )2-p och3

och3

(Tensid 508, CIBA-GEIGY);

Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), ein Hydroxybiphenyl-10-Äthoxy-Phosphorsäureester Butyl-mono-4-Äthoxy-Phosphorsäureester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), bzw.

O

I

ch3-( ch2 )j-çh-ch2-0 (-ch2—ch2—o )6-p och3

och3

(Zerostat ® AN , CIBA-GEIGY)

und anderseits Betainverbindungen, d.h. amphotere, salz- und wasserfreie Imidazolderivate, wie z.B.:

worin Me[+] für Wasserstoff, Alkali- und Erdalkaliatome und Rx für Cr bis C32-Alkyl oder C2- bis C32-Alkenylgruppen stehen.

Verwendung finden auch sog. «muiti-functional Glucose Derivatives», wie z.B. Glucate® SS (Methyl-Glucose-Sesquistearat) und Glucamate® SSE-20 (PEG-20 Methyl-Glucose-Sesquistearat) von Amer-chol, Edison, N. J.

Invadin® JFC 800% (CIBA-GEIGY) ist ein wasserfreies, tert. Octylphenyipolyoxyäthylenäther Tensid mit 9 bis 10 Oxyäthylen Gruppen.

Als Hydrotrop, bzw. als Co-Emulgator dienende, pharmaverträgliche Lösungsmittel lassen sich einsetzen, z.B.:

Ester eines aliphatischen Alkohols (C3 bis Cis) mit einer aliphatischen Carbonsäure (C10 bis C22), wie etwa Isopropyllaurat, Hexyllaurat, Decyllaurat, Isopropylmyristat (IPM), Isopropylpalmitat und Laurylmyri-stat; Kohlenwasserstoffe mit einer geraden Kohlenstoffkette (C|2 bis C32), welche mit 6 bis 16 Methylgruppen substituiert ist und 1 bis 6 Doppelbindungen aufweisen kann, wofür Terpene wie Polymethylbu-tane und Polymethylbutene als Beispiele dienen mögen.

Mono-Ester aus Äthylenglykol oder Propylenglykol mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6 bis C22), wie etwa Propylenglykolmonolaurat und Propylenglykolmonomyristat.

Ester aus einem aliphatischen Alkohol (C12 bis C22) mit Milchsäure, wie z.B. Myristyl- oder vorzugsweise Lauryl-Lactat; Mono-, Di- oder Triester des Glycerins mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6 bis C22), wie z.B. Glyceryl-Caprylat, oder Miglyol® 812 Neutralöl (Oleum neutrale).

Ester aus einem Poly(2-7)äthylenglykolglyzerinäther mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6 bis C22), wie z.B. aliphatische Alkohole (C12 bis C22), somit u.a.

ch2 ch2 oh

Rx—C

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Dodecanol, Tetradecanol, Oleylalkohol, 2-Hexyldecanol und 2-OctyIdecanol. Ester mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe, aus Poly-(2-10)glykol mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6 bis C22), Mono-äther aus einem Polyäthylenglykol mit einem aliphatischen Alkohol (C12 bis Cis), wie z.B. Polyoxyäthy-ien (Cio)-octyläther.

Heterocyclische Verbindungen, wie z.B. 1-Methyl-2-PyrroIidon. Biotenside Ester der allgemeinen Formel:

R4 eoo—Rfi

(XXIV)

worin R4 Citronellyl, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyi und R5 eine Cr bis C32-Alkyl, bzw. eine C2- bis C32-Alkenyl- oder Alkapoiyengruppe bedeuten.

Alle technischen Tenside wurden vor dem Eintrag in die spontan dispergierbaren Konzentrate mittels Filtration, bzw. Chromatographie über neutralem Aluminiumoxyd mit einem inerten Lösungsmittel wie z.B. Tetrahydrofuran, Äthylalkohol oder Methylenchlorid gereinigt.

Als Zusätze in die erfindungsgemässen spontan dispergierbaren Konzentrate eignen sich Vitamine und Provitamine (wie z.B. Vitamin A, Retinol, Tocopherole), sowie auch ausgewählte Penetrationsverbesserer («Flux enhancers») und Radikaifänger.

Die zur pharmazeutischen Anwendung erforderliche Tagesdosis beträgt 0,001 bis 25 mg/kg Körpergewicht, wenn möglich verteilt auf 2 bis 3 Einzeldosen. Hiefür lassen sich die neuen Ester mit Apocarotinolen oder die spontan dispergierbaren Konzentrate mit diesen Verbindungen in die gängigen pharmazeutischen Zubereitungen und Darreichungsformen wie Dragées, Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Pellets, Lösungen, Ampullen, Emulsionen, Crèmes oder Zäpfchen zusammen mit den üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungs- und Stabilisierungsmitteln einarbeiten.

Die Gegenstand der Erfindung bildenden Wirkstoffe oder Wirkstoffmischungen, sowie die spontan dispergierbaren Konzentrate, welche diese Wirkstoffe oder Wirkstoffmischungen enthalten, können dem Menschen oral, durch Injektion (intravenös, subkutan oder intramuskulär) oder in anderer Weise verabreicht werden. Wenn sie als feste Darreichungsformen für die orale Venwendung aufbereitet werden, kann dies in Form von Tabletten, Granulaten, Pellets, Pulvern oder Kapseln, usw. geschehen. Die Aufbereitungen können Zusatzstoffe enthalten, z.B. einen Arzneimittelträger wie eine Saccharid- oder Cellu-lose-Grundlage, ein Bindemittel wie Stärkepaste oder Methylcellulose, ein Füllmittel oder ein Desinte-griermittel, usw. - wobei Zusatzstoffe eingesetzt werden, wie sie üblicherweise bei der Herstellung medizinischer oder paramedizinischer Formulierungen verwendet werden. Wenn die erfindungsgetreuen Wirkstoffe oder Wirkstoffmischungen als flüssige Darreichungsformen zu oraler Verabreichung gelangen, so können sie irgendeine aus wässrigen Zubereitungen für innere Verwendung, aus Suspensionen, Emulsionen und Sirups usw. ausgewählte Form haben, und sie können ausserdem in der Form Vacuum-getrockneter Präparate vorliegen, welche vor ihrer Verwendung in Lösung oder Emulsion gebracht werden.

Wenn die erfindungsgemässen Wirkstoffe oder Wirkstoffmischungen in der Form wässriger Lösungen, Suspensionen oder öliger, bzw. wässriger Emulsionen, vorzugsweise als Mikroemulsionen aus den erfindungskonformen, spontan dispergierbaren Konzentraten aufbereitet sind, können sie auch injiziert werden. Die Injektionslösungen werden jedoch üblicherweise kurz vor der Anwendung hergestellt, indem man die Extrakte oder Konzentrate in wässrigen, flüssigen Medien wie sterilem Wasser, Glucose-lösung oder physiologischer Kochsalzlösung auflöst oder suspendiert.

Falls erforderlich, können zu einem Injektionspräparat üblicherweise verwendete Lösungsmittel, Stabilisierungsmittel, Konservierungsmittel und Zusätze für die Herstellung isotonischer Lösungen hinzugegeben werden. Die auf diese Weise erhaltenen Injektions-Präparate werden intravenös, intramuskulär, subkutan oder in einer anderen geeigneten Weise verabreicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Präparate, welche die Wirkstoffe, bzw. Wirkstoffgemische, und/oder die beschriebenen, spontan dispergierbaren Konzentrate zur Bekämpfung des Wachstums von Tumorzellen enthalten. Bei den der Erfindung entsprechenden pharmazeutischen Präparaten handelt es sich um solche zur enteralen (wie oralen oder rektalen), sowie zur parenteralen oder topischen Verabreichung an Warmblüter, welche das spontan dispergierbare Konzentrat allein oder zusammen mit einem pharmazeutisch anwendbaren Trägermateriai enthalten.

Die Dosierung der erfindungsgemässen Konzentrate hängt von der Warmblüterspezies, dem Alter und dem individuellen Zustand, sowie von der Verabreichungsart ab. So werden z.B. zur Erzielung eines Abtötungseffektes von Tumorzellen an Warmblütern mit geringem Körpergewicht, wie z.B. Mäusen, Ratten und Hamstern, bei sukutaner Verabreichung Dosen im Bereich von ca. 0,1 bis 50 mg/kg Körpergewicht, und bei intraperitonealer Verabreichung Dosen im Bereich von 0,05 bis 5 mg/kg Körpergewicht angewandt.

Die oralen und rektalen Formen der neuen pharmazeutischen Präparate enthalten zwischen 1-95%, vorzugsweise zwischen 10-95%, insbesondere zwischen 20-95% des erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentrates. Sie können z.B. in Dosis-Einheitsform vorliegen, also als Dragées, Micropellets, Tabletten, Suppositorien oder Ampullen und vor allem als Kapseln.

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Geeignete pharmazeutisch anwendbare Trägerstoffe für die oralen Formen sind hauptsächlich Füllstoffe, wie Zucker (z.B. Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit), Cellulosepräparate und/oder Calcium-phosphate (z.B. Tricalcium- oder Calciumhydrogenphosphat), ferner Bindemittel wie Stärkekleister unter Verwendung von u.a. Mais-, Weizen-, Reis- oder Kartoffelstärke, Gelatine, Traganth, Methylcellulose, Hydroxylmethylcellulose, Hydroxypropyl-Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Po-lyvinylpyrrolidon und/oder Sprengmittel (wenn erwünscht), wie die obgenannten Stärken, ferner Car-boxymethylstärke, quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie z.B. Natriumalginat.

Als Fliessreguliermittel sind z.B. die Polyäthylenglykole Nr. 200 bis 600 und höher geeignet.

Die beim Menschen als Darreichungsform bevorzugten Gelatinekapseln werden mit geeigneten Überzügen versehen, wobei man u.a. konzentrierte Zuckerlösungen - welche gegebenenfalls arabischen Gummi, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Polyäthylenglykol und/oder Titandioxid enthalten - Lacklösungen (wässrige oder solche, die unter Verwendung organischer Lösungsmittel aufbereitet worden sind), oder magensaftresistente Überzüge aus Lösungen von geeigneten Cellulosepräparaten, wie mikrokristalliner Cellulose (Avicel®), Acetylcellulosephthalat, Hydroxylmethylcellulosephthalat (Metolose®), Hydroxyl-propylmethylcellulose-Acetatsuccinat (AQOAT®) oder einem Copolymerisat wie Eudragit® L30D verwendet.

Als besonders geeignete, oral anwendbare pharmazeutische Darreichungsform können Steckkapseln aus Gelatine und einem Weichmacher, wie Glyzerin oder Sorbitol, verwendet werden. Die Weich- bzw. Hartgelatine-Kapseln, sowie solche aus AQOAT® (Hydroxypropyl-Methylcellulose-Acetat-Succinat) können das der Erfindung entsprechende, spontan dispergierbare Konzentrat im Gemisch mit Füllstoffen, wie Laktose, Bindemitteln wie Stärke und/oder Gleitmitteln wie Talk oder Magnesium-Stearat und gegebenenfalls mit Stabilisatoren und Antioxydantien wie z.B. a-, ß- oder 7-Tocopherol enthalten. Der Einsatz von geeigneten Flüssigkeiten wie flüssigen Polyäthylen-glykolen No. 200 bis 600 als Verdünnungsmittel kann sich empfehlen, wobei sich ebenfalls Stabilisatoren und Antioxydantien zufügen lassen.

Zur parenteralen Verabreichung werden die erfindungsgemässen Konzentrate mit destilliertem Wasser versetzt. Der entstehenden wässrigen Injektions-Mikroemulsion können Viskositätserhöhende Stoffe, wie z.B. Na-Carboxymethylcellulose, Sorbit, Mannit und/oder Dextran, und gegebenenfalls auch Stabilisatoren und Antioxydantien zugefügt werden.

Die pharmazeutischen Präparate für die parenterale Anwendung enthalten vorzugsweise zwischen 0,1 bis 60%, und hauptsächlich zwischen 1 bis 40% des erfindungskonformen, spontan dispergierbaren Konzentrates.

Als topisch anwendbare Präparate, welche sich vornehmlich zur Prophylaxe und Therapie von Hautkrebsarten eignen, kommen z.B. Cremen, Salben, Pasten, Pomaden, Schäume, Tinkturen und Lösungen in Betracht, welche zwischen 0,01 bis 70% des erfindungsgemässen Konzentrates enthalten.

Für Crèmen und ÖI-in-Wasser-Emulsionen, welche mehr als 50% Wasser aufweisen, verwendet man als ölige Grundlage in erster Linie Fettalkohole, z.B. Lauryl-, Cetyl- oder Stearylalkohol, flüssige bis feste Wachse, z.B. Isopropylmyristat, Woll- oder Bienenwachs und/oder Kohlenwasserstoffe wie z.B. Vaseline (Petrolatum) oder Paraffinöl. Zur Emulgierung dieser öligen Grundlagen eignen sich in erster Linie oberflächenaktive, pharmaverträgliche Substanzen mit vorwiegend hydrophilen Eigenschaften, wie z.B. nicht-ionogene Emulatoren, vorab Fettsäureester von Polyalkoholen oder Äthylenoxydaddukten (etwa Polyglycerinfettsäureester oder Polyäthylensorbitan-Fettsäureester) mit einem HLB-Wert von unter 8. Zusätze zur Wasserphase sind u.a. Mittel, welche die Austrocknung der Cremen vermindern, z.B. Polyalkohole wie Glyzerin, Sorbit, Propylenglykol und/oder Polyäthylenglykole No. 200 bis 600, ferner Konservierungsmittel, Riechstoffe etc.

Salben sind Wasser-in-ÖI-Emulsionen, die bis zu 70%, vorzugsweise jedoch zwischen 20 und 50% Wasser oder wässrige Phasen enthalten. Als Fettphase kommen in erster Linie Kohlenwasserstoffe, z.B. Vaselin, Paraffinöl und/oder Hartparaffine in Frage, welche zur Verbesserung des Wasserbindungsvermögens geeignete Hydroxydverbindungen, wie z.B. Fettalkohole oder Ester, davon etwa Cetylalkohol oder Wollwachsalkohole, enthalten.

Fallweise werden noch Emulgatoren mit einem HLB-Wert von 8 bis 16, wie z.B. Sorbitan-Fettsäure-ester (etwa Sorbitanisostearol) zugesetzt. Zusätze zur Wasserphase sind u.a. Feuchthaltungsmittel, wie Polyalkohole (Glycerin, Propylenglykol, Sorbit und/oder Polyäthylenglykole No. 200, 400, 600); ferner Konservierungsmittel, Riechstoffe etc.

Fettsalben sind wasserfrei und enthalten als Grundlage vornehmlich Kohlenwasserstoffe, z.B. Paraffin, Vaselin und/oder flüssige Paraffine; überdies natürliche oder partial synthetische Fette wie z.B. Ko-kosfettsäuretriglycerid, ferner: Fettsäurepartialester des Glycerins, wie z.B. die im Zusammenhang mit den Salben erwähnten, die Wasser-Aufnahmefähigkeit steigernden Fettalkohole, Emulgatoren und/oder Zusätze.

Pasten sind Crèmen und Salben mit sekretabsorbierenden Puderbestandteilen, wie beispielsweise Metalloxide (etwa Titanoxid oder Zinkoxid), ferner Talk und/oder Aluminiumsilikate, welche die Aufgabe haben, vorhandene Feuchtigkeit oder Sekrete zu binden.

Schäume werden aus Druckbehältern verabreicht und sind in Aerosolform vorliegende ÖI-in-Wasser-Emulsionen der erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentrate, wobei halogenierte Kohlenwasserstoffe (wie z.B. Chlorfluorniederalkane: etwa Dichlordifluormethan und Dichlortetrafluoräthan) als

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Treibmittel verwendet werden. Dazu kommen gegebenenfalls die üblichen Zusätze wie Konservierungsmittel usw.

VERFAHRENSBEISPIELE zur Herstellung von Estern mit Apocarotinolen der Formeln (I) bis (IX): a) Herstellung von Apo-ß-8'-carotinoi-10-undecenoat

Zu 85 mg Apo-ß-8'-carotinol (Synthese vgl. R. Rüegg et al., Helv. Chim Acta 42, 847-864)1959), 100 mg Pyridin und 100 mg Dimethylformamid in 20 ml Chloroform werden bei 0°C und unter Schutzgaszuleitung 100 mg 10-Undecenoylchlorid in 10 ml Chloroform zugetropft. Nach einstündigem Rühren bei 0°C und zweistündigem Rühren bei 20 bis 40°C wird mit Wasser verdünnt und ausgeschüttelt. Der Rückstand wird schonend getrocknet und anschliessend auf einer Silicagelsäule mit Hexan/Essigester (90:10) als Eluiermittel chromatographiert.

Man erhält das Apo-ß-8'-Carotinyl-10-undecenoat mit einem Schmelzpunkt von 76-77°C, nach Sintern ab 75°C; UV Xmax. 425 nm (in Methylenchlorid); Rf-Wert im DC mit Hexan/Essigester (80:20) 0,92.

IR 3054 cm-1

8 (Olefin.CH)

2855 cm-1

v (CH)

1724 cm-1

v (C=0) Ester

1639 cm-1

v (C-C)

1465 cm-i

S (CH)

1374 cm-1

8 (CHs)

1185 cm-i v (C-O) Ester

1032 cm-1

v (C-O)

914 cm-1

8 (CH) von Olefin

trans disubst. C=C

Auf analoge Weise wird auch das Azafrinyl-10-undecenoat hergestellt:

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Brechungsindex n— von 1.44210; UV Xmax. 420,0 nm (in Methylenchlorid);

Rf-Wert im DC mit Hexan/Essigester (80:20): 0,94.

b) Herstellung von Apo-ß-8'-carotinyl-10-undecenoat

Ausgangsmaterial: 8'-Apo-ß-carotin-8-säureäthyl und/oder -methylester. In einer geeigneten Apparatur mit Magnetrührer, N2-Einleitrohr, Rückflusskühler und Septum werden 2 g 8'-Apo-ß-carotin-8'-säureme-thylester zu 25 ml EfeO gegeben, das Gemisch unter N2 und Rühren auf -35°C gekühlt und mit der berechneten Menge DIBAH (Diisobutylaluminiumhydrid) in Hexan tropfenweise versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Kühlbad entfernt.

Man lässt auf RT kommen. Nach vollständiger Reduktion wird sehr vorsichtig wenig Eis zugegeben und damit solange fortgefahren, bis eine Trübung eintritt. Jetzt kühlen. AI(OH)3 fällt langsam aus. Nach Beendigung der Fällung wird über genügend Celite filtriert, mit MeOH nachgewaschen und das Filtrat eingedampft. Wenn der Rückstand zu kristallisieren beginnt, kann ohne weitere Reinigung aus heissem Benzol und unter Zugabe von Hexan umkristallisiert werden. Ausbeute 1,2 g braunrote Kristalle; UVA/IS Xmax. 425, 452 nm (in Et20)

Veresterung von 8'-Apo-ß-carotin-8'-ol mit Undecenoylchlorid.

400 mg C3o-Alkohol, sowie 20 ml Et20 und 1 ml Pyridin werden unter Rühren und unter N2 bei —30°C tropfenweise mit 0,22 ml Undecenoylchlorid versetzt. Man lässt langsam auf RT kommen, verdünnt mit Petroläther und schüttelt nacheinander mit Wasser und Sole aus. Dann Trocknen über MgS04, Eindampfen und Chromatographie an 40 g Kieselgel (Merck, 15 bis 40 um Korngrösse) mit Benzol/Hexan 2:1. Nach dem Verwerfen einer gelben Vorzone wird die rote Hauptzone aufgefangen, eingedampft und bei 0,01 Torr bei 40°C getrocknet. Dabei kristallisiert das Produkt vollständig durch. Smp. 76—77°C nach Sintern ab 75°C. UV/VIS Xmax 425,5, 452,5 nm (in EfeO). CI-MS (mit sehr schonender chemischer Ionisation) mit peaks bei 575 und 401 nm; m/z. Mw. (M+ +1); IR-Spektrum Ester-peak bei 1724 cm-1.1H-NMR Spektrum entspricht.

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c) Herstellung von Azafrinyl-10-Undecenoat

Ausgangsmaterial Azafrin, isoliert aus Rhizomen von Escobedia scrabifolia. Herstellung des Methylesters aus der C27-Säure mit Diazomethan/Ether, vgl. W. Eschenmoser und C. H. Eugster, Helv. Chim. Acta, SS, 1722 (1975), Reduktion mit DIBAH analog dem Verfahren b); kein Ausschütteln, sondern direkte Filtration unter Zugabe von 0,5% Hünigbase. Das Filtrat eindampfen, den Rückstand aufnehmen in Et20H und vorhandenes Wasser abscheiden, trocknen über MgS04, filtrieren, eindampfen, den Rückstand mit Toluol/Hexan an einer CaC03-Säule 4,3 x 20 cm chromatographieren. Die Hauptzone wird mit Toluol/Isopropylalkohol (99:1) eluiert, das Filtrat i.V. zur Trockene gebracht. Nach dem Umkristallisieren aus Benzol/Hexan und AcOEt/Hexan erhält man leuchtend gelbe, sehr säureempfindliche Nädelchen mit einem Smp. von 135°C.

Bildung von Azafrin-10'-ol[undec-10-enoyl]ester.

Apparatur wie beim Verfahren b). Ansatz von 450 mg der Verbindung mit Formel

1,5 ml Pyridin, 2 ml DMF, 20 ml Et20; N2, Rührer, Septum, Temperatur minus 40 bis minus 50°C, Zugabe von 0,20 ml Undecenoylchlorid. Auf 0°C kommen lassen, dann nochmals 0,20 ml Undecenoylchlorid zugeben und 31/2 h bei RT rühren. Verdünnen mit Et20 und H2O, Phasentrennung im Scheidetrichter, nochmals H20 zufügen, dann Sole, Trocknen über MgS04; eindampfen. Den Rückstand in wenig CH2CI2/Hexan (10:15) + 0,25% Hünigbase (N,N-Diisopropyläthylamin) lösen und auf einer Se-phadex LH-20-Säule 3,6 x 34,5 cm chromatographieren. Die breite, gelborange Zone auffangen und eindampfen. Zweite Chromatographie-Passage auf einer Kieselgelsäule 3,3 x 17,5 cm mit Toluol/Isopropylalkohol (99:1 bis 98:2), was eine gute Trennung ergibt. Die hellorange Fraktion auffangen, eindampfen, trocknen 0,002 Torr bei 42°C. Man erhält das Produkt: 376 mg als ein viskoses, hellorangero-tes Öl.

AZAFRINYL-10-UNDECENOAT

Charakterisierung: UV/VIS (Et20): scharfes Dreibandenspektrum Xmax. 374, 394,5, 419 nm.

IR-Spektrum (CH2CI2): Carbonylbande ausgeprägt bei 1723 cm-1

CI-MS: m/z 579 (M+ +1 schwach), 395 (M+ +1- Undecenylsäure, sehr stark),

561 (M+ +I-H2O), 593 (M+ +1-H20-H20).

ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren KONZENTRATEN, welche die Wirkstoffe der Formeln (I) bis (IX) enthalten und welche, wenn sie mit Wasser verdünnt werden, thermodynamisch stabile ULTRAMIKROEMULSIONEN mit einem hydrodynamischen Radius von 1,5 bis 3,0 nm ergeben a) 0,5 bis 30 Gew.-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis (IX)

1 bis 40 Gew.-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Miglyol® 812 (Dynamit Nobel)

0 bis 45 Gew.-% eines Phosphorsäureester-Tensides, wie z.B. Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), Tensid 508 (CIBA-GEIGY), Zerostat® AN oder AT (CIBA-GEIGY), Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), Soprophor® FL (Rhône-Poulenc) 5 bis 90 Gew.-% Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY).

b) 0,001 bis 30 Gew.-% eines oder mehrerer antitumoraler Wirkstoffe der Formeln (I) bis (IX) 0,001 bis 50 Gew.-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel ch2oh oh azafrinol

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worin FU Citroneilyi, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyl und Rs eine Cr bis C32-Akyl, bzw. C2- bis C32-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe bedeuten,

0,001 bis 90 Gew.-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidgemisches 0 bis 10 Gew.-% eines Vitamins oder Provitamins

0 bis 10 Gew.-% eines Penetrationsverbesserers oder eines Stabilisators und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel.

c) 10 Gew.-% eines öligen antitumoralen Wirkstoffes der Formeln (I) bis (IX)

0 bis 20 Gew.-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Miglyol® 812 oder eines, bzw. mehrerer der biotensiden Ester der allgemeinen Formel:

r4—eoo—r5

(XXIV)

worin R4 Citroneilyi, Geranyl, Farnesyl, Phytyl oder Isophytyl und Rs eine Cr bis C32-Akyl, bzw. C2- bis C32-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe bedeuten,

35 bis 45 Gew.-% Invadin® JFC 800%

35 bis 45 Gew.-% Soprophor® FL.

d) 2 bis 5 Gew.-% eines kristallinen Wirkstoffes der Formeln (I) bis (IX) 10 bis 20 Gew.-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Miglyol® 812 oder eines, bzw. mehrerer der biotensiden Ester der allgemeinen Formel:

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(XXIV)

35 bis 45 Gew.-% Invadin® JFC 800%

35 bis 45 Gew.-% Diphasol 3873 oder Soprophor® FL.

BEISPIEL für die pharmazeutische Herstellung eines Systempräparates mit erfindungsgemässen Konzentraten in der Form von «multiple units».

a) Granulierung

Metolose® 90 SH-4000 (Shin-Etsu Chemical) 90.0 g

Avicel® PH-101 80.3 g

Erfindungsgemässes KONZENTRAT 139.4 g

Aerosil® 200 80.3 g

£ 390.0 g

Granulieren/formen im Schnellmixer oder im Rotationsbett unter Zusatz von 110g Ethanol, brechen, sieben 18 bis 42 mesh, trocknen 24 h bei 40°C.

b) MSR- und RETARD-Ausrüstung im Rotationsbett mit AQOAT® AS-HG (Shin-Etsu Chemical) und Talk c) Zusammensetzung fertiges Granulat/bzw. Micropellets

Kernmaterial 44%

Erfindungsgemässes KONZENTRAT 25%

MSR-Beschichtung 31%

E 100%

N.B.: MSR = Magensaft-Resistenz. Die Pellets/Granulate gemäss a) können auch ohne Befilmung unmittelbar in Kapseln abgefüllt werden, welche aus AQOAT® (HPMC-AS-M oder HPMC-AS-N) herge20

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stellt sind, mit Aceton/Ethanol 1:1 verschlossen werden und so die Funktionen der MSR und der verzögerten Abgabe (Retard) angemessen steuern.

Biologische Prüfungen.

Die antitumorale Wirkung von spontan dispergierbaren Konzentraten mit Wirkstoffen gemäss den Herstellungsbeispielen a) bis d) für die Ester von Apocarotinolen, sowie den Aufarbeitungsbeispielen a) bis d) für spontan dispergierbare Konzentrate wird anhand folgender Prüfungsergebnisse bestätigt:

1. In vitro-Tests mit geeigneten Tumorzell-Linien

Es wurde ein biologisches Assay-System entwickelt, das mit Mikrotiterplatten und Verdünnungsreihen arbeitet. Angesetzt werden je 104/ml Tumorzellen in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbserum inaktiviert (GIBCO); sie werden so undicht ausgesät, dass sie während des Assays wachsen können, in sog. nichtkonfluenten Monolayers. Die Probenzugabe erfolgt nach 6 bis 24 Stunden, mit 100 (il pro Reihe, die man im 1. Loch mit 100 pj Medium versetzt. Davon wird die Hälfte entnommen und in das folgende Loch eingebracht, wieder mit 100 jim Medium versetzt, usf. Es entsteht eine geometrische Verdünnungsreihe nVz.

Die Proben werden im Plaque Assay während 3 bis 5 Tagen bei 37°C mit 31/2% CO2 inkubiert. Anschliessend färben/fixieren mit 0,1% Kristallviolett (Fluka, Buchs) in einer Lösung von 70% Methanol, 1% Formaldehyd, 29% Wasser. Die Auswertung wird am Mikroskop vorgenommen, Vergrösserung 300-fach. Man bestimmt die grösste zytotoxische Verdünnung. Die quantitative Auswertung lässt sich auch mittels Scanning und Absorptionsmessung am Spektrophotometer vornehmen.

ZYTOTOXIZITÄTSTEST

mit Py6-Zellen (Virus transformierten Maus-Fibroblasten)

Prüfung eines 2%-Konzentrates verschiedener Zusammensetzung mit C 11:1-AZAFRINYLESTER-WIRKSUBSTANZ

KONZENTRAT

Nach 24 h Zelltoxisch bis:

Nach 48 h Zelltoxisch bis:

Nach 72 h Zelltoxisch bis:

No. 1 mit IPM

1:800 000

1:3 200 000

1:6 400 000

No. 2 mit C 11-1-CITRON ELLYLESTER

1:800 000

1:6 400 000

No. 3 mit IPM und AOT

1:800 000

1:3 200 000

1:6 400 000

No. 4 mit C 11:1-CITRO und CAA

1:1 600 000

1:12 800 000

1:25 600 000

No. 1

2 Gew.-% Wirksubstanz C 11:1-AZAFRINYLESTER

12 Gew.-% IPM (= Isopropylmyristat)

86 Gew.-% Invadin JFC 800%/Soprophor FL, 50:50

No. 2 mit 12 Gew.-% C 11:1-Citronellylester statt IPM, sonst gleiche Zusammensetzung wie No. 1

No. 3 mit 86 Gew.-% Invadin JFC 800%/Soprophor FL/AOT, 40:40:20

No. 4 mit 12 Gew.-% C 11:1-Citronellylester statt IPM und mit 86 Gew.-% Invadin JFC 800%/Soprophor FL/Amphonyl CAA 40:40:20

Mikroemulsionen 1:10 000 (100 ppm W.S.), bzw. 6 mg W. S. in 60 ml dest. Wasser N.B.: AOT (Fluka 86 139) = Sulfobernsteinsäure-bis-2-äthyl-hexylester Na-Salz.

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30

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40

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50

55

CH 685 674 A5

ZYTOTOXIZITÄTSTEST

mit Py6-Zeilen (Virus transformierten Maus-Fibroblasten)

Prüfung verschiedener Konzentrate gleicher Zusammensetzung, aber mit unterschiedlichen APOCA-ROTINYL-/AZAFRINYL-Estern (auf 2%-Konzentrat berechnet)

PRÄPARAT 48 h 72 h 96 h

In Verdünnung In Verdünnung In Verdünnung wirksam bis 1 : wirksam bis 1 : wirksam bis 1 :

8-APOCAROTIN-10-UNDECENOAT 160 000 160 000 320 000

C 11:1-AZAFRINYLESTER 320 000 320 000 640 000

ZYTOTOXIZITÄTSTEST

mit Py6-Zellen (Polyoma Virus transformierten 3T3-Maus-Fibroblasten)

PRÄPARAT ZELLTOXISGH bis: ZELLTOXISCH bis:

EXPOSITION 72 h EXPOSITION 72 h auf Konzentrat berechnet auf Wirksubst. berechnet

C3o-Stearat 1

160

000

16 Mio.

8-APOCAROTIN-10-UNDECENOAT 1

640

000

32 Mio.

8-APOCAROTIN-LAU RAT 1

512

000

51 Mio.

8-APOCAROTIN-PALM ITAT 1

128

000

12,8 Mio.

AZAFRINYL-10-UNDECENOAT 1

256

000

25,6 Mio.

VITALITÄTSTEST

mit humanen Tumorzell-Linien

A

HL 60 promyelolytische LEUKÄMIE Proliferationstest (Tritium: 1 (xCi/well H+) 1 x 104 Zellen pro Well

PRÄPARAT

10-5

IO"4

10-3

0,2 ppm W.S.

2 ppm W.S.

20 ppm W.S.

8-APOCAROTIN-10-UNDECENOAT

11,8%

3,5%

3,7%

C 11:1 -AZAFRINYLESTER

32,4%

12,7%

2,7%

AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZENTRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion (in Verdünnung 1:100 000, 1:10 000, 1:1000) dem Medium einmal beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Kontrollen: 76 589 cpm.

Test durchgeführt von Dottoressa Anna Guarini, Università degli Studi di Torino, Clinica medica. 24-27.1. und 14.-17.2.1994

VITALITÄTSTEST

mit humanen Tumorzell-Linien

B

K 562 LEUKÄMIE

Proliferationstest (Tritium: 1 nCi/well H+) 2 x 104 Zellen pro Well

PRÄPARAT

10-5

10-4

IO"3

0,2 ppm W.S.

2 ppm W.S.

20 ppm W.S.

8-APOCAROTIN-10-UNDECENOAT

28,5%

1,1%

0%

C 11:1-AZAFRINYLESTER

68,6%

8,2%

0%

22

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50

55

60

65

CH 685 674 A5

AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZENTRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Kontrollen: 247 125 cpm.

Tests durchgeführt von Dottoressa Anna Guarini, Università degli Studi di Torino, Clinica medica.

VITALITÄTSTEST

mit humanen Tumorzell-Linien

C

TOM MELANOM

Proliferationstest (Tritium: 1 |iCi/well H+)

1 x 104 Zellen pro Well

2 x 104 Zellen pro Well

PRÄPARAT

10-5

10"4

10-3

0,2 ppm W.S.

2 ppm W.S.

20 ppm W.S.

8-APOCAROTIN-10-UNDECENOAT

69,1%

65,5%

17,2%

C 11:1-AZAFRINYLESTER

57,9%

56,8%

9,2%

AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZENTRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion (in Verdünnung 1:100 000, 1:10 000 und 1:1000) dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Kontrollen: 57 816 cpm.

VITALITÄTSTEST

mit humanen Tumorzell-Linien

D

ADK: Humanes pulmonares Adenocarcinom Proliferationstest (Tritium: 1 nCi/well H+) 2 x 104 Zellen pro Well

PRÄPARAT

10-5

10-t 10-3

0,2 ppm W.S.

2 ppm W.S. 20 ppm W.S.

8-APOCAROTIN-10-UNDECENOAT

11,7%

6,7% 0%

AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZENTRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Kontrollen: 57 816 cpm.

VITALITÄTSTEST

mit humanen Tumorzell-Linien

E

HL 60 promyeolytische LEUKÄMIE Proliferationstest (Tritium: 1 nCi/well H+) 2 x 104 Zellen pro Well cpm = 82 667

PRÄPARAT

(2%-MARIGENOL®-KONZENTRAT)

10-4

2 ppm W.S.

IO"3

20 ppm W.S.

C-so-ALKOHOL

2,3

0,99

Cso-SÄURE

1,7

0,75

C 11:1-ß-8'-APOCAROTINYLESTER

1,7

1,5

ZEAXANTHIN-di-UNDECENOAT

3,5

1,2

b-CAROTIN

3,2

1,1

AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZENTRATEN, als wässrige Ul23

5

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60

CH 685 674 A5

tramikroemulsion dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Kontrollen: 82 667 cpm.

Tests durchgeführt am 7.-10.6.1994 von Dottoressa Anna Guarini, Università degli Studi di Torino, Clinica medica.

VITALITÄTSTEST

mit humanen Tumorzell-Linien

F

K 562 Chronische LEUKÄMIE (Leucemia mieloide cronica, crisi blastica) Proliferationstest (Tritium: 1 nCi/well H+) 2 x 104 Zellen pro Well cpm = 138 833

PRÄPARAT

(2%-MARIGENOL®-KONZENTRAT)

10"4

2 ppm W.S.

IO"3

20 ppm W.S.

C-30-ALKOHOL

37,1

0,7

C 30-SÄURE

18,6

0,5

C 11:1-ß-8'-APOCAROTINYLESTER

17,4

0,4

ZEAXANTHIN-di-UNDECENOAT

38,6

1,0

b-CAROTIN

18,5

0,6

AUSWEIS: %-Vitalität nach 48 Stunden mit 2-% MARIGENOL®-KONZENTRATEN, als wässrige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit von 48 h. Kontrollen: 138 833 cpm.

LANGZEITVERSUCH

Um herauszufinden, ob bei längerer Exposition signifikante Veränderungen an der Tumorzelle - sei es in Richtung Regression oder Redifferenzierung festzustellen seien, wurde mit Py6-Zellen auch ein Langzeitversuch angestellt, der über 41 Tage geführt wurde. (Experiment vom 24.5.1994 bis zum 29.6.1994). Eingesetzt wurden als Kontrollen nicht transformierte 3T3 Mausfibroblasten, sowie die Po-lyomavirus-transformierten 3T3 MT 18 Zellen. Als Leitpräparate wurden geprüft: ein 2%-PHYSALIEN-Konzentrat (Zeaxanthin-di-Palmitat) und ein 2% c11:1-ß-8'-ÄPOCAROT!NYLESTER-Konzentrat.

Einzelheiten zum Prüfprotokoll: Nach der Aussaat ist das Zeilwachstum anfänglich langsam. Nach 12 Tagen treten, Dosis-abhängig, viele nekrotische Zellen auf. Auswaschen der Kulturen mit EDTA. Neuzusatz von Medium und wirkstoffhaltiger Mikroemulsion in je 3 verschiedenen Konzentrationen (wie zu Beginn des Versuches) nach 13 und 20 Tagen. Wiedereinsetzen des Zellwachstums bei allen überlebenden Gruppen. Nach 34 Tagen erneutes Auswaschen, sowie Zugabe von frischem Medium und Konzentrat. Abbruch des Versuchs nach 41 Tagen.

Ergebnis: Die morphologischen Unterschiede zwischen den transformierten und den nicht-transfor-mierten Zellen sind im in-vitro Test selbst bei Versuchsende an den überlebenden Populationen immer noch feststellbar. Die transformierten Zellen besitzen längere Filopodien und behalten diese Charakteristik bei.

Analytischer Nachweis

1) Identifikation der APOCAROTIN-ESTER

Kapillarzonen-Elektrophorese mit einem Gerät von Beckman Instruments, bzw. von BIORAD. Bedingungen:

DL-a-Tocopherol 50 mM; Puffer pH = 9,5 Na-tetra-Borat Run 15 kV, Messung bei 195 nm Der Wirksubstanz-Peak erscheint nach ca. 4 Minuten.

Auflösung bis 0,5 ppm.

2) Identifikation der Konzentrat-Mizellen in der wässrigen Mikroemulsion/bzw. im Zellplasma der Tumorzellen.

Gleiche Methodik wie 1).

Der charakteristische Peak für die Apocarotin-Ester erscheint nach ca. 8 Minuten; die Verzögerung gegenüber der reinen W.S.-Messung ist eine Folge der Ummantelung der inneren Phase der Konzentrate mit Tensiden. Sie gibt einen wichtigen Hinweis auf das Diffusionsverhalten der Ultramikroemulsion.

3) Nachweis der Membran-Penetration an der Tumorzelle

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Am Lichtmikroskop (wie auch am Elektronenmikroskop) lässt sich aufzeigen, dass wenige Stunden nach der Inkubation (Beispiel 3T3 Py6-Zellen der Maus; dünn ausgesät, mittlere Verdünnung der Wirkstoff-Konzentrate) sich ein Kranz von Vakuolen um den Zellkern herum ausbildet.

Der analytische Nachweis, dass diese Vakuolen die Apocarotinester-Wirksubstanzen enthalten, kann sehr deutlich dadurch erbracht werden, dass man den gereinigten inkubierten Tumorzellen das Zellplasma entnimmt, es zentrifugiert und mit einer 0,05%-Lösung von Uvitex® CF conc. (CIBA-GEIGY) in Ace-tonAA/asser (85:15) oder von Uvitex® EBF (CIBA-GEIGY) oder von Tinopal®19 GS (CIBA-GEIGY) versetzt.

Die eingesetzten erfindungsgetreuen Apocarotinester löschen die durch den Marker Uvitex CF conc., bzw. Uvitex EBF, bzw. Tinopal GS hervorgerufene Fluoreszenz im langwelligen UV-Lichtbereich aus; auf der Dünnschicht-Platte entsteht eine blaue Färbung. UV-Scanning bei 366 nm. Kontrolle mit Hilfe von mizellarer Kapillar-Zonen-Electrophorese, (Beckman Instruments, P/ACE System 2100).

AUSWIRKUNG auf das BLUTBILD

(Verträglichkeit der MARIGENOL®-PRÄPARATE)

TOXIZITÄT von MARIGENOL®-KONZENTRATEN an der BALB/c-Maus

%-Anteil der Blutkörperchen

Präparat

L

M

N

E

B

G 17

10-7

70 ± 6

11 ± 3

13 ± 4

6 ± 4

0

10-5

77 + 6

6 + 3

11+4

5 ± 4

1 + 1

10-3

69 ± 10

7 + 5

22 ± 8

2 + 2

0

G 41

10-7

77 ± 6

6 ± 3

13 ± 5

3 ±3

0

10-s

78 ± 4

10 ± 2

10 ± 4

1 + 1

1 ± 1

10-3

80 ± 6

8 ± 2

10 + 6

12 + 1

0

G 44

10-7

74 ± 17

10 ± 1

20 ± 9

1 + 1

0

10-5

74 ±6

9 ± 4

14 + 7

4 + 3

0

10-3

76 ±5

6 ± 4

16 ± 8

2 ± 1

0

G 55

10-7

78 + 4

10 ±4

10 ± 4

2 ± 1

0

10-5

69 ± 10

11 ± 3

18 ± 4

1 ± 1

0

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77 ± 5

6 ± 4

14 ± 2

2 ± 1

1 ± 1

KONTROLLEN

76 ±5

8 + 2

15 + 4

1 ± 1

0

(Phys.Puffer)

G 17 2%-Konzentrat mit C 5:0-iso-CHOLESTERYLESTER (Cholesteryl-iso-Valerat)

G 41 2%-Konzentrat mit C 11:1-ERGOSTERYLESTER (Ergosteryl-1O-Undecenoat)

G 44 2%-Konzentrat mit C 18:2-CHOLECALCIFERYLESTER (C 18:2-D3; Vitamin-Ds-Linolat) G 55 2%-Konzentrat mit C 4:1-CHOLECALCIFERYLESTER (C 4:1-D3; Vitamin-D3-Crotonat) Verdünnungen: 10~7 = 0,1 ppm Konzentrat; 0,002 ppm Wirksubstanz 10-5 = 10 ppm Konzentrat; 0,200 ppm Wirksubstanz

10~3 = 1000 ppm Konzentrat; 20 000 ppm Wirksubstanz (auf die wässrige Mikroemulsion berechnet)

Legende:

L = Lymphocyten M = Monocyten (Makrophagen)

N = Neutrophile Granulocyten E = Eosinophile Granulocyten B = Basophile Granulocyten

Durchführung der Proben: Prof. Dott. Guido FORNI, Dotta Stefania VAI, Università di Torino, Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche, Ospedale San Luigi Gonzaga, 1-10 043 ORBASSANO (TO), August/September 1993.

Test mit normalen 8-wöchigen weiblichen BALB/c nAncr (H-2d)-Mäusen, geliefert von Charles River Laboratories, Calco (Italien). Während 4 Wochen täglich zweimalige Injektion i.v. von je 0,250 ml wässriger Mikroemulsion, gebildet aus den angegebenen Konzentraten, bzw. mit physiolgischem Puffer für die Kontrollen. Färbung mit May Grünwald-Giemsa.

Zeit der Behandlung: 28 Tg.

Blutanalyse nach der letzten Injektion Anzahl Tiere: 13 Gruppen zu 5 je Tieren

RESULTAT: Es treten keine signifikanten Unterschiede auf zu den Kontrollen. Es konnte keine Toxi-

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zität der Konzentrate auf die Leukozyten-Population festgestellt werden. Auch die Erythrozyten-Populati-on zeigte normale Werte. Alle Tiere waren und blieben gesund bis zum Schluss der Versuche.

A) Messdaten zur Bestimmung von APOCAROTINYL-ESTERN 1.0 Undec-10-ensäure-[8'-apo-ß-carotin-8'-yl]-ester (APOCAROTIN YL-1 O-UNDECENOAT)

Smp. 76-77°C, nach Sintern ab 75°C; UVA/IS (EfcO), qual.): Xmax: sh 413, 425,5, 450,5 nm; IR (CH2CI2, Auswahl von Banden); frei von OH-Banden, 1724 cm-1 (vs., Estercarbonyl); CI-MS (NH3): 585 [M+1, (14)] 401 [M+1 Undecylensäure (100)], 309, [M+1-Toluol, (88)].

2.0 SCHEMA der nachstehenden Ester

3.0 APOCAROTIN-LAURINSÄUREESTER, n = 9

Orange Kristalle aus t-Butylmethylester/Pentan. Smp. 80-81 °C. UVA/IS (CH2CI2, quantitativ): Xmax: sh 415 (72 700), 434 (103 400), 458 (92 200) nm; IR (CHCI3, Auswahl von Banden); keine OH-Banden, 1726 cm-1 (vs., Estercarbonyl); 1H-NMR (CDCI3), 300 MHz: 0,888 (t, w-CHs); 1,040 [CH3 (16,17)]; 1,269 [(CH2)9]; 1,726 [CH3 (18)]; 1,848 [CHs (19')]; 1,957 [CH3 (20')]; 1,982 [CH3 (19,20)]; 2,346 [t, a-CH2); 4,567 [s, CH2(8')]; 6,1 bis 6,7 ppm (Vinylprotonen).

4.0 APOCAROTIN-PALMITAT, n = 13

Orange Kristalle aus t-Butylmethylester/Pentan bei -20°C. Smp. 73,5-75,5°C, nach Sintern ab 70°C; Wiedererstarren und endgültiger Smp. 87-91°C. UV/VIS (CH2CI2, quantitativ): Xmax sh 410 nm (44 000), 432 nm (59 400) 457 nm (50 800). IR (CHCI3, Auswahl von Banden); frei von OH-Banden, 1728 cm_i (vs., Estercarbonyl); 1H-NMR (CDCI3), 300 MHz: 0,888 (t, w-CH3); 1,038 [CH3 (16,17)]; 1,264 [(CH2)16]; 1,725 [CH3 (18)]; 1,846 [CH3 (19')]; 1,956 [CH3 (19,20)]; 2,344 [t, a-CH2); 4,565 [s, CH2(8')]; 6,1 bis 6,7 ppm (Vinylprotonen).

5.0 APOCAROTIN-STEARAT, n = 15

Orange Kristalle aus t-Butylmethylester/Pentan bei - 20°C. Smp. 80-81 °C, nach Wiedererstarren 80-89°C; IR (CHCI3, Auswahl von Banden); frei von OH-Banden, 1728 cm_i (vs., Estercarbonyl); UV/VIS (CHCI2), quantitativ): Xmax sh 410 nm (61 700), 433 nm (87 900) 458 nm (76 400). 1H-NMR (CDCI3),

300 MHz: 0,888 (t, co-CH3); 1,039 [CH3 (16,17)]; 1,264 [(CH2)16]; 1,726 [CH3 (18)]; 1,848 [CH3 (19')]; 1,957 [CHs (20')]; 1,982 [CH3 (19,20)] 2,345 [t, cü-CH2); 4,566 [s, CH2(8']; 6,1 bis 6,7 ppm (Vinylprotonen).

B. DATEN zu AZAFRINOL und AZAFRINYL-ESTERN 1.0 Eigenschaften von Azafrinol:

Smp. 133-134°C (Vakuumröhrchen). Verbrennungsanalyse für C27H40O3 (412,6): Ber. C 78,59 H 9,77%; gefunden C 78,30 H 9,56%. UVA/IS (EtOH, log e): 432,4 (4,514), 375,2 (4,805), 396,0 (5,011), 420,0 (5,005);

[<x] — = 85,1° (c = 21,80 mg in 2,00 ml EtOH):

D

CD ((EtOH.c = 1,192.10-s M, Ae, Hauptbanden): 237,2 (-2,5), 370,4 (-1,4), 386,0 (-1,2), 420,4 (-1,6). IR (KBr): sehr breite OH-Banden um 3450 cm-1, keine Banden im Carbonylbereich; IR (CH2CI2): 3600 cm-1, keine Cabonylbanden; CI-MS (NH3): 413 [M+1 (13)], 396 [M+2-H20 (30)], 395 [M+1-18 (100)].

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2.0 Eigenschaften von AZAFRINYL-ESTERN

2.1 AZAFRINYL-10-UNDECENOAT

UVA/IS (Et20, qual.): scharfes Dreibandenspektrum mit Xmax 375, 394,5, 419 nm; (Benzol qual.): 377, 402, 428 nm. IR (CH2CI2, Auswahl von Banden): 2,78 n, (= OH-frei), ca. 2,9 n = OH intermolekular gebunden), 5,8 p (1723 cm-1), vs. Estercarbonyl; 1H-NMR (CDCI3), 300 MHz. Auswahl von Banden): für den Azafrinolteil: Neuere NMR-Spektren von Azafrin und Derivaten, vgl. P. Übelhart und C. H. Eugster, Helv. Chim. Acta 1982, SS, 353: 0,85, (CH3(16)); 1,15 (CH3(17)); 1,19 (CH3(18)); 1,91 (CH3(20')); 1,98 (CH3(19,20)); für den Säureteil: 1,30 ((CH2)7); 2,33 (t, a-CH2); 4,9 (m, w)-CH2); 5,8 (m, irCH).

2.2 Andere Ester:

öh n = 9 ;n = 13;n = 15, bzw.

Azafrinyl-Laurat UV/VIS 376, 402, 428 nm,

Azafrinyl-Palmitat UV/VIS 372, 402, 428 nm

Azafrinyl-Stearat UV/VIS 379, 402, 428 nm.

Claims

Patentansprüche

1. Spontan dispergierbare Konzentrate, welche mit Wasser verdünnt, thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen ergeben mit Mizellen, die einen hydrodynamischen Radius von 1,5 bis 3 nm aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Komponenten zu einem System zusammengefügt sind: 0,001 bis 30 Gew.-% einzelner Ester der Apocarotinole der Formeln (I) bis (IX), bzw. einer Kombination solcher Ester

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60

65

CH 685 674 A5

—R.

(IV)

28

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 685 674 A5

O

II

CH^-O— C—^

ch, £h

'4

ch., ch

(VU)

o ch2—o—c

— R.

(Vili)

cho

(IX)

wobei in den Formeln (I) bis (IX) Ri eine Cr bis C32-Alkyl-, eine C2- bis C32-Alkenyl-, bzw. Alkapolyen-, eine C2- bis C32-Alkinylgruppe oder ein Radikal der Formeln (X), bzw. (XI) darstellt:

29

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 685 674 A5

?

h,

r2—(-ch=ch-c=ch-)

n

(X)

Ro

ÇH:

CH&CH—C—ch-)—(—chzch—chz<jî—)—chzch

ch,

(xi)

worin n die Zahlen 1, 2, 3, 4 oder 5 bezeichnet und Ffe für eines der Radikale der Formeln ch ch,

ch,

ch3 *0ch'

çh,

^Jy°ch3

ch,

ch.

ch

CJJjpH,

Ä

CH'-kAoH

ch,

ch

ch,

oh oco ch

.ch,

ch,

oh

30

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 685 674 A5

OCO CH, oder

—CO

steht,

0 bis 40 Gew.-% eines als Hydrotrop oder Co-Emulgator dienenden pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches 0,001 bis 90 Gew.-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidgemisches,

0 bis 10 Gew.-% eines Vitamins oder Provitamins,

0 bis 10 Gew.-% eines Stabilisators oder eines Penetrationsverbesserers und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel.

2. Spontan dispergierbare Konzentrate gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Komponenten zu einem System zusammengefügt sind:

0,5 bis 30 Gew.-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis (IX),

1 bis 40 Gew.-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Neutralöl (Oleum neutrale),

0 bis 45 Gew.-% eines Phosphorsäureester-Tensides und

5 bis 90 Gew.-% des wasserfreien tert. Octylphenylpolyoxyäthylenäther Tensids mit 9 bis 10 Oxyäthylen Gruppen.

3. Spontan dispergierbare Konzentrate gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Komponenten zu einem System zusammengefügt sind:

0,5 bis 30 Gew.-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis (IX) 1 bis 40 Gew.-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (XXIV):

•COO—R«

(XXIV)

5 bis 90 Gew.-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidgemisches,

0 bis 10 Gew.-% eines Vitamins oder Provitamins,

4. Spontan dispergierbare Konzentrate gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Komponenten zu einem System zusammengefügt sind:

10 Gew.-% eines öligen Wirkstoffes der Formeln (I) bis (IX),

0 bis 20 Gew.-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Neutralöl oder eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (XXIV):

r4—eoo r6 (xxiv)

35 bis 45 Gew.-% des wasserfreien tert. Octylphenylpolyoxyäthylenäther Tensids mit 9 bis 10 Oxyäthylen Gruppen,

35 bis 45 Gew.-% eines Alkylphenolpolyglykoläther Phosphat-Tensides oder des Tristyrylphenol-Po-lyoxyäthylen-18-mono/dimethyl Phosphorsäureester Tensides.

5. Spontan dispergierbare Konzentrate gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Komponenten zu einem System zusammengefügt sind:

2 bis 5 Gew.-% eines kristallinen Wirkstoffes der Formeln (I) bis (IX),

10 bis 20 Gew.-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Neutralöl oder eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (XXIV):

ra—eoo—r6 (xxi v)

31

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 685 674 A5

35 bis 45 Gew.-% des wasserfreien tert. Octylphenylpolyoxyäthylenäther Tensids mit 9 bis 10 Oxyäthy-len Gruppen,

6. Ester der Apocarotinole der Formeln (I) bis (IX)

ch2—o—c—r1

—R,

CH

(II)

ch,

O

> Il

)—C—R,

(iii)

CH2—O— c — r1

(iv)

ch ch2—o— c— r,

(V)

32

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 685 674 A5

fi

CHr-O—C—R1

CH, CH3

CH, CH

(VI)

il

C H2—-O—C—

(VU)

fi

CH2—O—c—R1

(IX)

worin Ri für eine C4- bis Cis-Alkyi-, eine C2- bis Cis-Aikenyl-, eine C2- bis Cis-Aikapoiyen-, eine C2- bis Ci8-Alkinylgruppe oder für ein Radikal der Formel (XII)

(XII)

steht.

7. Das 8'-Apo-ß-carotinyl-10-undecenoat, 8'-Apo-ß-carotinyllaurat, 8'-Apo-ß-carotinylpalmitat, 8'-Apo-ß-carotinyistearat, sowie das Azafrinyl-10-undecenoat, Azafrinyllaurat, Azafrinylpalmitat und das Azafrinyl-stearat gemäss Anspruch 6.

8. Verfahren zur Herstellung von Estern der Apocarotinole gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Apocarotin der Formeln (XV) bis (XXXIII):

33

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 685 674 A5

h2oh

(XV)

(xv!)

(xvii)

(XVIII)

(XIX)

34

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 685 674 A5

îh,

ÌH,

:h2oh ch5

ch,

ch, hh mit dem Chlorid, bzw. Bromid einer Säure der Formel (XIV):

R3 COOH

(xx)

ch2oh

(XXI)

ch2oh

(XXIII)

(xiv)

wobei R3 für eine C4- bis Gra-Alkyl-, eine C2- bis Cis-Alkenyl-, eine C2- bis Cis-Alkapolyen-, eine C2- bis Ci8-Alkinylgruppe oder für ein Radikal der Formel (XII) steht:

ch

(xii)

bei einer Temperatur von 0 bis 60°C unter Schutzgaszuleitung in einem indifferenten Lösungsmittel und in Gegenwart eines Katalysatoren umsetzt.

9. Verfahren zur Herstellung von 8'-Apo-ß-carotinylestern laut Formel (III) gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den 8'-Apo-ß-carotin-8'-säuremethylester bei minus 30°C mit DIBAH (Diisobutylaluminiumhydrid) reduziert, um den C3o-Alkohol als Zwischenstufe zu gewinnen, der sodann mit dem Chlorid einer Säure der Formel:

35

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 685 674 A5

R, COOH

in EfeO und Pyridin bei minus 30°C und anschliessend bei Raumtemperatur verestert wird, wobei Ri die gleiche Bedeutung wie im Patentanspruch 1 hat.

10. Verfahren zur Herstellung von Azafrinylestern laut Formel (VII) gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst Azafrinol aus Azafrinmethylester mittels DIBAH-Reaktion herstellt und diese Verbindung unmittelbar anschliessend mit dem Chlorid einer Säure der Formel:

R1 COOH

in EfeO und Pyridin bei minus 30°C und anschliessend bei Raumtemperatur verestert, wobei Ri die gleiche Bedeutung wie im Patentanspruch 1 hat.

11. Spontan dispergierbares Konzentrat, enthaltend Ester der Apocarotinole der Formeln (I) bis (IX) gemäss Anspruch 1, als Mittel zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates mit Wirksamkeit gegen Tumore, Psoriasis und Ekzeme.

36