CH677798A5

CH677798A5 -

Info

Publication number: CH677798A5
Application number: CH410/88A
Authority: CH
Inventors: Juergen Dr Christner; Ernst Pfleiderer; Tilman Dr Taeger; Ursula Bernschein
Original assignee: Roehm Gmbh
Priority date: 1987-02-13
Filing date: 1988-02-05
Publication date: 1991-06-28
Also published as: IT8867104A0; GB8803314D0; BR8805403A; DE3704465A1; FI884592A0; FR2610947B1; JP2703250B2; AU618523B2; SE8800238D0; FI884592A; ES2008974A6; US4943530A; AU1165688A; JPS63216480A; FR2610947A1; DK73688A; WO1988006183A1; KR880010113A; GB2201960B; KR960016075B1

Description

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Beschreibung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Flüssigformulierungen von Enzymen zur technischen Anwendung, beispielsweise in der Lederindustrie, Die Formulierungen enthalten im wesentlichen wasserfreie, organische Flüssigkeiten und anorganische, pulverförmige Disper-gatoren.

Stand der Technik

Die industrielle Anwendung von Enzymen kann gegenwärtig hohes Interesse beanspruchen, gilt sie doch als der Prototyp einer «sanften» Technologie.

Die Art und die Anzahl der industriellen Verfahren, in denen Enzyme eingesetzt werden, ist noch begrenzt. Eine Erweiterung ist jedoch zu erwarten (Vgl. Ullmann's Encyclopädie der technischen Chemie, Band 10, S. 522-526 ff, Verlag Chemie 1975; Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd Ed. Vol. 9, pp. 173-224, J. Wiley 1980).

Zu nennen sind insbesondere die Gebiete der Nahrungs- und Futtermitteltechnologie, der Wasch-mitteltechnotogie und der Lederherstellung, auf denen die Enzymanwendung bereits eine längere Tradition hat. Darüber hinaus finden Enzyme auch für gezielte chemische Umsetzungen Anwendung (vgl. Raul Prawe, Jahrbuch Biotechnologie, 1986/87, Carl Hanser Verlag München, Wien, S. 359-397).

Wichtige Vertreter der industriell verwendeten Enzyme (Industriai Enzymes s IH) sind u.a. f-Ami-nobutyrotransaminase, Amylase, Cellulase, Collagenase, Glucose-Oxidase, GIutaminsäure-DeGar-boxylase, Hemicellulase, Invertase, Katalase, Lipa-se, Pectinase, Penicîllase, Protease, Streptokinase.

Da es sich bei den Medien, in denen die in der Natur vorgefundenen Enzyme wirksam sind, ganz überwiegend um wässrige Medien handelt, wobei oft auch noch eine gewisse Abhängigkeit vom pH-Wert und den gelösten Bestandteilen des wässrigen Mediums registriert wird, darf das wässrige Milieu als Standardmedium bei enzymatischen Reaktionen gelten.

Da Enzyme als Polypeptide, deren Wirksamkeit in erster Näherung von ihrer strukturellen Organisation abhängt, wie andere Proteine auch durch gewisse organische Lösungsmittel denaturiert werden können, empfahl sich von jeher Zurückhaltung bei der Anwendung organischer Lösungsmittel zusammen mit Enzymen.

In neuerer Zeit hat man z.B. bei Untersuchungen an immobilisierten Enzymen den Einfluss von Zusätzen wasserlöslicher organischer Soiventien zum wässrigen Medium bestimmt und festgestellt, dass mit abnehmender Dielektrizitätskonstante die Reaktionsgeschwindigkeit steigt. [Vgl. H. Weetall, P. Vann in «Enzyme Engineering Vol. 4. (Ed. G.B. Brown, et al) «NCl Monograph No. 27 (Ed. M.P. Stulberg) 1967, pp 141-152].

Aufgabe und Lösung

Bei der Handhabung, insbesondere der Dosierung von chemischen Agentien wird oft als vorteilhaft empfunden, wenn diese in flüssiger Form vorliegen. In der Regel ist das Einmischen von flüssigen Zubereitungen in flüssige Reaktionsmedien mit weniger Problemen behaftet als das Eintragen von Pulvern oder anderen Festkörpern. Dies gilt auch für Enzympräparationen.

Entsprechende Tendenzen lassen sich z.B. in der Waschmittelindustrie verfolgen. Auf der anderen Seite sieht man sich gerade bei flüssigen Enzympräparaten einer ganzen Reihe von Problemen gegenüber. An erster Stelle steht die Stabilität solcher Enzympräparate. Wie bereits angedeutet, unterliegen Enzyme in wässrigem Medium der Beeinflussung durch die übrigen vorhandenen Bestandteile des Mediums wie Säuren, Basen, Salze, oberflächenaktive und komplexaktive Bestandteile, andere Makromoleküle, insbesondere andere Enzyme, die Substrate der Enzymwirkung u.a.

Diese Zusätze können sowohl stabilisierend als destabilisierend wirken. Als stabilisierende Zusätze für bestimmte Enzyme in wässrigen Lösungen sind beispielsweise Glykole, Polyglykole, Tenside, Proteine und Proteinhydrolysate, synthetische Polymere, Carbonsäuren, spezifische Kationen, bzw. Anionen u.a. vorgeschlagen worden.

[Vgl. US-Patent Nr. 4519 934;

L. Kravetz, K.F. Guin, Journal of the Am. Oil, Chem. Soc. Vol. 62,5 (1985);

L. Gianfreda, M. Modafferri und G. Greco, Enzyme Microb. Techno!. Z. 78-82 (1985);

K. Martinek, V.P. Torchilin, Enzyme Microb. Techno!.

Vol. 1,74-82 (1979);

US-A 4111 855(1978);

US-A4318 818 (1982);

US-A 3 557 002 (1971);

US-A 4 169 817 (1979)]

Als eine weitere Möglichkeit, Enzyme in wäss-riger Lösung zu stabilisieren, wurde die Bildung inverser Micellen im System Wasser/Tensid/orga-nisches Lösungsmitte! in Betracht gezogen (vgl. P.L. Luisi, Angew. Chem. 97,449-460 (1985)).

Die vorliegende Aufgabe sei am Beispiel der in der Lederherstellung angewendeten Enzyme bzw. Enzymsysteme näher erläutert.

Gerade bei der Lederherstellung hat die Flüssigdosierung gegenüber der Feststoffdosierung in jüngerer Zeit stark an Boden gewonnen, da sie in der Tat Vorteile u.a. bei der Handhabung aufweist. Das Problem bei der Herstellung flüssiger, Enzyme enthaltender Präparationen, beispielsweise enzymati-scher Beiz- und Weichhilfsmittel liegt jedoch in der ungenügenden Stabilität solcher Produkte. Die Instabilität, insbesondere von Pankreaspräparatio-nen, kommt keinesfalls unerwartet; man kennt sie zum Teil bereits von der Enzymaufarbeitung her. Soweit es sich um Proteasen handelt, muss speziell auch mit der selbstverdauenden Wirkung und mit der Abbauwirkung auf sonstige anwesende Enzymproteine gerechnet werden, (Vgl K. Martinek, V.P.

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Torchilin, Enzyme Microb. Techno!. Vol. 1, S. 74-82 (1979).

Es bleibt zu konstatieren, dass sich Flüssig-En-zympräparate in der Praxis bislang nicht durchsetzen konnten. Es bestand also nach wie vor die Aufgabe, flüssige Formulierungen für Enzyme zur Verfügung zu stellen, die a) unter Praxisbedingungen hinreichend stabil sein sollten, b) bei denen die Aktivität der Enzyme möglichst nicht, bzw. nicht irreversibel beeinflusst sein sollte, c) die mit den vorgesehenen Einsatzgebieten der Enzyme kompatibel sein sollten und die d) ökonomisch und ökologisch tragbar sein sollten.

Die Anforderungen an ein solches sogenanntes «Flüssigenzym» für die modernen Methoden der Lederherstellung gehen dahin, dass der Aktivitätsabfall innerhalb 4 bis 6 Monaten nicht grösser als 15% sein darf.

Lösung

Es wurde nun gefunden, dass die erfindungsge-mässen flüssigen Enzymformulierungen die Anforderungen der Technik überraschenderweise in hohem Masse erfüllen. Die Erfindung betrifft Flüssig-Formulierungen von Enzymen zur technischen Anwendung, wobei als Trägerflüssigkeit für die Enzyme mindestens ein im wesentlichen wasserfreies organisches Lösungsmittel (LM) oder Gemische von solchen eingesetzt werden. Als Lösungsmittel kommen im Einklang mit den oben dargestellten Aufgaben stehende, vorteilhaft an sich übliche, vorzugsweise umweltunbedenkliche, insbesondere wenig toxische, nicht-enzymschädigende Lösungsmittel in Frage. Die erfindungsgemäss zu verwendenden organischen Lösungsmittel LM enthalten vorzugsweise neben Kohlenstoff, Wasserstoff und gegebenenfalls Sauerstoff und weniger bevorzugt Schwefel keine weiteren Heteroatome. Bevorzugt sind Lösungsmittel der Struktur I

R1-X-R2

worin X für Sauerstoff oder Schwefel und worin Ri für einen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, oder für einen Rest

- CH - OH,

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wobei R3 Wasserstoff -CH3 oder -CH2OH bedeutet oder für einen Rest -(CH2-CH20)n-H, wobei n eine Zahl von 1 bis 15 bedeutet und R2 für Wasserstoff- oder einen Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht oder, worin Ri und R2 für einen Rest -CH2-CH2OH stehen oder worin

Ri und R2 zusammen mit dem Sauerstoff einen fünf-oder sechsgliedrigen Ring bilden, wobei alle Ringglieder aus -CH2-Gruppen bestehen oder ein Ringglied eine Carbonylgruppe darstellen, und wobei gegebenenfalls ein weiteres Ringglied aus Sauerstoff bestehen kann, oder worin

X für eine Carbonylgruppe -C=0 steht, mit der Massgabe, dass in diesem Falle Ri Und R2 einen Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder worin

X für eine COO-Gruppe steht, mit der Massgabe, dass in diesem Fall Rt und R2 für einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen stehen oder Ri für Wasserstoff und R2 für einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen steht.

Weiter sind als Lösungsmittel LM solche der Struktur II brauchbar

M - R5 II

worin R5 für einen Rest -CH3 oder-CH=CH2 steht.

Besonders genannt seien als Vertreter der Formel I Kohlensäureester, insbesondere cyclische Kohlensäureester, wie Ethylencarbonat und speziell Propylencarbonat. Weiter sind von Interesse mehrwertige Alkohole wie Glycerin, Ethylenglykol, Butylglykol, Butyldiglykol, Diethyienglykol, Po-lyethylenglykole (MW<400), Polypropylenglykol, soweit sie flüssig sind, sowie veretherte Derivate, einwertige Alkanole bzw. Fettalkohole, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-ButanoI, Isobutanol, 2-Ethylhexanol, Cyclohexanol, Äther wie Diethy-lether, Methoxypropanol, Diethylenglykolmonometh-ylether, insbesondere cyclische Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Ketone wie Aceton, Ethylmethyl-keton, Cyclohexanon, Ester wie Ethylacetat, Butyl-acetat, Lactone wie y-ButyroIacton. Daneben seien genannt: Oxoalkohole und deren Ethoxylierungspro-dukte mit 3 bis ca. 14 Ethylenoxideinheiten. Fettalkohole und deren Ethoxylierungsprodukte, Olefine bzw. deren sulfonierte Derivate wie z.B. C9-C12-CC-Olefinsulfonat, etwa in Form des Natriumsalzes, Fettalkohol-Ethersulfate wie z.B sulfatierte C12-Ci5-Alkohole, mît Ethylenoxid kondensiert.

Alkanolamide von Fettsäuren wie Ci6-Ci8-Fett-säureethanolamid, Phenolderivate wie Octylphenol, und ethoxyiierte Derivate wie Nonyiphenolethoxylat mit 8-9 mol Ethylenoxid. Auch Mischung von organischen Flüssigkeiten können von Vorteil sein.

Als Vertreter der Formel II seien Toluol und Sty-rol genannt, ferner sind Terpentin, Solventnaphtha, Lackbenzine, aliphatische Kohlenwasserstoffe und Mineralöle (Siedebereiche vorzugsweise zwischen 50 und 180 Grad C, speziell zwischen 70 und 150 Grad C) brauchbar. Mit Ausnahme der Polyethy-lenglykole handelt es sich bei den Flüssigkeiten in der Regel um solche mit einem Molekulargewicht <110 und überwiegend mit Siedepunkten unter 300 Grad C bei Normaldruck. (Weitere Daten zu den Lösungsmitteln können z.B. der Monographie Gramm, Fuchs, Lösungsmittel und Weichmachungsmittel, 8. Auflage, Wissensch. Veriagsgesellschaft, Stuttgart, 1980, entnommen werden). Die erfindungsgemäss zu verwendenden organischen Flüssigkeiten sind im wesentlichen wasserfrei, d.h. sie enthalten in der Regel weniger als 1 Gew.-% Wasser, vorzugsweise nicht mehr als die übliche Haftfeuchtigkeit. Die Trocknung der Flüssigkeiten wird in an

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sich üblicher Weise vorgenommen, z.B. durch Anwendung gebräuchlicher Trockenmittel, Destillation, Azeotropierung usw. (vgl. Houben Weyl, Auflage, Bd. 1/2, pg. 765-886, Georg-Thieme-Verlag, 1959).

Das Vorhandensein von Wasser in den erfin-dungsgemässen Formulierungen ist im allgemeinen nicht vorgesehen, zumindest nicht in den Erfindungszweck beeinträchtigenden Mengen. Bei der Verwendung von Lösungsmitteln, welche sich nicht mit Wasser mischen, können die Enzymformulierungen zusätzlich Tenside enthalten. Bevorzugt sind hier nichtionische Tenside von Typ Fettalkohol-/Alkylphenotethoxylate (z.B. mît Oleocetyl- und Ol-einalkohol) ferner Addukte von Polyglykolen mit 4-42 Mol Ethylenoxid neben anionischen Typen wie Al-kylsulfate, Alkylethersulfate, Alkylphosphate, AI-kyletherphosphate, Alkylsulfonate und Alkylaryl-sulfonaten. (Vgl. DE-A 3 322 840). Der Anteil an den Tensiden beträgt im allgemeinen 0,001 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 0,005 bis 20 Gew.-% bezogen auf die Trägerflüssigkeit Im allgemeinen liegt der HLB-Wert der Emulgatoren (bez. Ö/W-Emul-gierwirkung) bei 8-18, vorzugsweise 9-15. (Zu Emulgatoren und HLB-Wert. Vgl. Kirk-Othmer 3rd. Ed. Vol.8., 910-916). Bevorzugt sind ferner die Lösungsmittel LM, die sich mit Wasser mischen, insbesondere die mit Wasser in jedem Verhältnis mischbaren Lösungsmittel. In erster Näherung ist davon auszugehen, dass die Enzyme in den Lösungsmitteln LM völlig ungelöst bleiben. Daher tritt die Tendenz zur Selbstverdauung bzw. zum Abbau anderer Enzyme weitestgehend zurück.

Die Menge der eingesetzten Lösungsmittel LM bemisst sich in erster Linie aus der Zweckmässigkeit bei der Handhabung der Enzyme; sie ist nicht eigentlich kritisch. Im allgemeinen wird man aus Gründen der Handhabbarkeit ein Gewichtsverhältnis Enzym zu Lösungsmittel LM von 1:10 nicht unterschreiten, Im Interesse vernünftiger Konzentrationsverhältnisse wird die obere Grenze der Gewichtsrelation Enzym zu LM in der Regel mit 1:30 bis 1:500 anzusetzen sein.

Als Faustregel hat sich ein Verhältnis Enzym zu LM von 1 zu ca. 50 als gut brauchbar erwiesen. Geeignet sind gegebenenfalls auch Gemische aus den oben genannten Lösungsmitteln LM. Bei der Zugabe der im wesentlichen aus Protein bestehenden Enzyme zu den im wesentlichen wasserfreien Lösungsmitteln LM können Probleme auftreten wie zögernde Benetzung und/oder Verteilungsprobleme wie Absatz- oder AufrahmersGheinungen.

Gemäss der vorliegenden Erfindung enthalten die Lösungsmittel LM anorganische, pulverförmige Zusätze AZ in eindispergierter Form, Durch diese Massnahme lassen sich die mit der Herstellung homogener, flüssiger Enzym-Formulierungen verbundenen Probleme, wie das Aufrahmen und das Absetzen, zumindest teilweise lösen.

Pulverförmige Zusätze aus anorganischen Dispergatoren sind für gänzlich andere Anwendungszwecke beschrieben worden, z.B. als Dispergatoren von «Öl in Wasser»-Dispersionen, bzw. als Dispergatoren bei der radikalischen Perlpolymerisation (Vgl. Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band XiV/1 Makromolekulare Stoffe, S. 420-421, Georg-Thieme-Verlag 1961). Als solche anorganische Dispergatoren werden z.B. unlösliche Salze der Erdalkalimetalle (Carbonate, Phosphate, Sulfate, Silikate) Aluminiumhydroxid, Talkum und Bentonit empfohlen. Zur Lösung der vorliegenden Aufgabe werden Tone wie Bentonit und ganz besonders Siliciumdioxid, speziell pyroge-nes Siliciumdioxid empfohlen. (Vgl. Kirk-Othmer, 3rd., ed. loacit, Vol. 20, pg. 748-781, pg. 763ff; Ulimanns Encyclopédie der Technischen Chemie, 4. Auflage, Bd. 18, S. 652-656, Verlag Chemie, 1979).

Die pyrogenen Siliciumdioxid-Modifikationen wurden bekanntlich in Gasphasenreaktion erzeugt, z.B. durch Flammenhydrolyse bzw. im Lichtbogen-Verfahren, Sie bestehen im allgemeinen aus kugelförmigen Partikeln mit einer Primärteilchengrösse im Bereich 5-500 nm. Die Dichte liegt bei 2,2 g/cm3.

Als Handelsprodukte seien z.B. Aerosil® und Cab-o-sil® genannt Der Viskositätsbereich der stabilisierten Lösungen liegt im allgemeinen bei 10-60 000 mPas.

Unter Tonen seien die üblichen Aluminiumsilikate, unter Bentonit die hauptsächlich aus Montmorillonit (AI2O3ASÌO2.H2O) bestehenden, handelsüblichen Präparationen verstanden. Von besonderem Interesse sind organisch aktivierte Bentonite, z.B. die durch Umsetzung von Na-Montmorillonit mit quartä-ren Alkylammoniumverbindungen entstandenen. Durch Kationenaustausch bilden sich sogenannte organophile Bentonite, die in organischen Flüssigkeiten quellen (Vgl. Ullmann loacit S. 323). Im allgemeinen können die Lieferformen des Handels (Plättchen, Teilchengrössen im Bereich 0,5-5 jim) eingesetzt werden, wobei zweckmässigerweise aber eine Behandlung unter Scherbeanspruchung in dem gewählten Lösungsmittel LM erfolgen soll. Im allgemeinen beträgt der Gehalt der Lösungsmittel LM an anorganischen Zusätzen AZ 0,1 bis 3 Gew.-% bezogen auf das Lösungsmittel, vorzugsweise 0,3 bis 1 Gew.-%. Als besonders vorteilhaft hat sich erwiesen, den anorganischen Zusatz des Enzymkonzentrats zusammen mit dem Lösungsmittel LM mittels eines geeigneten Aggregats, insbesondere eines Dispergators der Scherwirkung zu unterwerfen. Als Dispergatoren kommen handelsübliche Geräte in Frage (Vgl. Ullmanns Encyclopädie der technischen Chemie, 4. Auflage, Bd. 1, S. 239, Verlag Chemie 1972).

Die Drehzahlen bzw, die anzuwendenden Bearbeitungszeiten sind in erster Linie von der Art des Aggregats abhängig. Als Anhalt für die Einwirkung handelsüblicher dispergierwirksamer Aggregate auf Bentonit in einem der erfindungsgemäss zu verwendenden Lösungsmittel LM seien 2 bis 60 Minuten genannt bei einer Umfangsgeschwindigkeit von 4-36m/sec.

Als besonders geeignet hat sich das Lösungsmittel Propylencarbonat, insbesondere in Kombination mit Siliciumdioxid, daneben auch mit Bentonit erwiesen.

Die erfindungsgemässen Formulierungen unterliegen in Bezug auf die Enzymkomponente keinen erkennbar gewordenen Beschränkungen (es sei denn im Hinblick auf die Stabilität der Enzyme selbst ge5

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genüber organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen). Vorausgesetzt werden soll, dass die Lösungsmittelkomponente LM mit der endgültigen Verwendung der Enzyme kompatibel ist. Zur Steigerung des Anti-Absetz- bzw. Antiaufrahmeffekts können den Trägerflüssigkeiten, insbesondere, wenn es sich um polare Lösungsmittel, etwa vom Typ der Formel I handelt, noch wenig polare Lösungsmittel zugesetzt werden. So kann es vorteilhaft sein, dass die Trägerflüssigkeit 1—10 Gew.-% Kohlenwasserstoffe, insbesondere verzweigte oder geradkettige Alipha-ten mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält. Genannt seien z.B. Petroleumfraktionen etwa im Siedebereich 50-180 Grad C (Vgl. auch vorstehende Definition von LM). Als Enzyme seien insbesondere die bereits industriell oder in sonstigen Anwendungsfeldern genutzten hervorgehoben (vgl. Stand der Technik, oben)

A) Proteasen (E.G. 3.4; Kirk-Othmer, loacit. Vol. 9, K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industriai Aspects of Biochemistry, Vol. 30 (I), pp 23-46, North Holland 1974.)

a) tierischen Ursprungs, wie beispielsweise a) Rennin (E.G. 3.4.23.4)

ß) Pankreas-Proteasen Pancreatin, insbesondere Trypsin,

Chymotrypsin (pH-Wirkungsbereich ca. 7-10) Pepsin (E.C. 3.4.23.1) (pH-Wirkungsbereich ca. 1,5-4,0)

Kathepsin (E.C. 3.4.23.5) (pH-Wirkungsbereich ca. 4,0-5,0)

b) pflanzlichen Ursprungs a) Papain (E.C. 3.4.22.1) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-8,0

ß) Ficin (E.C. 3.4.22.3) pH-Wirkungsbereich ca. 4,0-9,0

y) Bromelain (E.C. 3.4.22.4 und 3.4.22.5) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-7,0

c) mikrobiellen Ursprungs (Vgl. L. Keay in

«Process Biochemistry», 1971,17-21.

a) aus Bacillus-Arten wie B. subtilis, B. licheni-

formis, B. alkalophilus, B. cereus, B. natto, B.

vulgatus, B. mycoides.

ß) aus Streptococcus-Arten y) aus Streptomyces-Arten wie Streptomyces fradiae, S. griseus, S.rectus

S) aus Aspergillus-Arten wie Aspergillus fla-

vus-oryzae, A. niger, A. saitoi, A. usamii e) aus Mucor- und Rhizopus-Arten wie Mucor pusillus, M. mietrei

0 Endothia-Arten wie Endothia parasitica ti) aus Trametes-Arten wie Trametes sanguinea

Ausser der Unterscheidung nach der Herkunft findet auch die Unterscheidung gemäss dem Angriffsort (Exo-versus Endo-Enzyme) und aufgrund der «Active Site» der Proteasen (Serin-Proteasen, die durch DFP gehemmt werden, Sulfhydryl-Enzy-me) Anwendung.

Weiter ist von erheblicher praktischer Bedeutung die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität. Man unterscheidet daher vor allem unter praktischen Gesichtspunkten i) Alkalische Proteasen, mit Wirkungsoptimum etwa im Bereich von pH 7,5 bis 13, insbesondere alkalische Bakterienproteasen (E.C. 3.4.21.) (die zumeist dem Serin-typ angehören) und alkal. Pilz-proteasen ii) Neutrale Proteasen, mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 6,0-9,0 insbesondere neutrale Bakterienprotease (E.C.3.4.24.) (die zu den Metalloenzymen gehören) und Pilzproteasen, beispielsweise Baciltus-Proteasen, Pseudomonas-Proteasen, Streptomyces-Proteasen, Aspergillus-Proteasen.

iii) Saure Proteasen mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 2,0-5,0 (E.C. 3.4.23) insbesondere saure Pilzproteasen, z.B. aus Rhizopus spp., Aspergillus spp., Pennicillium spp., Mucor spp., und Impex lacteus und Endothitia parasitica

Proteasen finden u.a. bei der Lederherstellung, in Waschmitteln und bei der Reinigung, in der Entschlichtung, bei der Käseherstellung, beim Fleischabbau und bei der Stabilisierung von Bier industrielle Anwendung.

Genannt seien als alkalische Proteasen insbesondere die Subtilisine, alkalische Bakterienproteinasen vom Serin-Typ, die im pH-Bereich 9-10 stabil und gegen Perborat einigermassen unempfindlich sind.

Die proteolytische Wirksamkeit von Enzymen wird gebräuchlicherweise nach der Anson-Hämo-globin-Methode (M.L. Anson J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939) bzw. nach der Löhlein-Volhard-Methode (die Löhlein-Volhard'sche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität. Gerbereichem. Taschenbuch. Dresden-Leipzig, 1955) als «LVE» (Löhlein-Volhard-Einheit) bestimmt.

Unter einer Löhlein-Volhard-Einheit ist diejenige Enzymmenge zu verstehen, die unter den spezifischen Bedingungen der Methode 1,725 mg Casein verdaut. Weiter werden im folgenden für die Aktivitätsbestimmung der im sauren Bereich wirksamen Enzyme Einheiten verwendet, die aus der Anson-Methode abgeleitet sind. Diese werden als «Proteinase-Units (Hämoglobin)» Uhò bezeichnet. Eine UHb entspricht der Enzymmenge, welche die Freisetzung von trichloressigsäure-löslichen Bruchstücken aus Hämoglobin äquivalent 1 pMol Tyrosin pro Minute bei 37 Grad C (gemessen bei 280 nm) katalysiert. (1 mUnb = 10-3 UHb.)

B) Amylasen (E.C. 3,2, Vgl, Ullmann, loc.cit Bd. 10. S. 506-510, und B. Spencer, industriai Aspects of Biochemistry loc.cit, pp 143-144,1-75). a) Endo-Amylasen ai) a-Amyläsen (a-1,4 Glucanhydrolasen) (E.C. 3.2.1.1)

ß2) a-1,6-Glucanhydrolasen ß) Exo-Amylasen (saccharogene Amylasen) ßi) ß-Amylasen (a-1,4-Glucanmaltohydrola-sen) (E.C. 3.2.1.2)

ß2) Glucamylasen (a-1,4-Glucan-Glucohydro-lasen) (E.C. 3.2.1.3)

a-Amylasen kommen bekanntlich u.a. in Pflanzen zusammen mit ß-Amylasen vor. Die technische Ge5

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winnung erfolgt z.B. aus Pankreasdrüsen und aus Bakterien- und Piizkulturen.

Besonders günstig ist die Herstellung aus Bacil-lus-Arten wie B. subtilis, B. mesentericus, B. polymi-xa> B. amyloliquefaciens, B« licheniformis, ferner aus Pilzen, insbesondere Aspergiilus-Arten wie A. niger, A. phoenicis, A. oryzae, A. awamori, Mucor-Arten wie M. rouxianus, Rhizopus-Arten wie R. de-lemar, R. oryzae, R. Japonicus, und Endomyces-Ar-ten wie E. fibuliger. Das pH-Optimum der a-Amyla-sen liegt überwiegend im Bereich von 4,7 bis 7,2. Amylasen finden u.a. Anwendung auf dem Ernährungssektor [Vgl. H.-J. Rehm & G. Reed Ed. «Biotechnology» Vol. 5, Verlag Chemie 1983; B. Spencer, Ed. Industriai Aspects of Biochemistry; Vol. 30. part I, pp. 139-186, 213-260, Elsevìers (1973)] in der Stärkeverflüssigung, Malzgewinnung, in der Ethanolgewinnung, Entschlichtung, in der Lederherstellung u.ä. Die Aktivität von a-Amy-lasen unter Verwendung von Stärke als Substrat kann nach der Methode von Sandstedt, Kneen & Blish (Cereal Chem. 16.172(1939) und Technical Bulletin Nr. 1024, U.S. Dept. of Agriculture) bestimmt werden. Dabei ist 1 Amylaseneinheit (= 1 SKB-Ein-heît) diejenige Enzymmenge, die bei 30 Grad C und den Im übrigen gegebenen Reaktionsbedingungen imstande ist, 1 g lösliche Stärke im Laufe von 1 Stunde zu dextrînîeren.

Ferner wird die Methode von Willstätter zur Bestimmung der Aktivität der Pankreas-Amylase herangezogen (Hoppe-Seyfers, Z. physiol. Chem. 126. 143 (1923). Dabei wird eine Willstätter-Amylase-Ein-heit als das Hundertfache derjenigen Enzymmenge definiert, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen die Starke mit einer solchen Geschwindigkeit spaltet, dass die monomolekulare Reaktionskon-stante gleich 0,01 ist.

C) Lipasen (E.C. 3.1.1.3)

Als Lipasen werden bekanntlich Carboxylesterasen bezeichnet, die Glycerinester in wässriger Emulsion spalten. Sie unterscheiden sich insofern von anderen Carboxylesterasen, die das Substrat in wässriger Lösung spalten.

a) Pankreas-Lipasen

Der pankreatische Enzymkomplex enthält neben Lipasen meist Esterasen sowie Proteasen und Amylasen als technisch wichtige Begleitenzyme. Das pH-Optimum (gegenüber Olivenöl) liegt im Bereich 7-8,5 der Aktivitätsbereich liegt bei pH 6,5-9,5.

Lipasen sind La. sehr instabil, insbesondere gegenüber proteolytischem Abbau durch Begleit-proteasen.

ß) Mikrobiologische Lipasen z.B. aus Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (z.B. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotri-chum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pu-siilus, Pénicillium sp, (z.B. chrysogenum, P. oxa-licum, Rhizopus sp. (R. nigricans, R. oryzae)

Diese Lipasen weisen in der Regel mindestens ein pH-Optimum bei pH >7,0. Lipasen finden, soweit ihre Instabilität dies zulässt, Verwendung u.a. in der Abfallbeseitigung, Lederindustrie und in der Ernährungsbranche,

D) Katalasen/Hydroperoxidasen (E.C. 1.11.1.6)

a) aus tierischem Gewebe z.B. aus Leber

ß) aus Pflanzen z.B. aus Meerrettich y) aus Mikroorganismen z.B. aus Micrococcus lysodeicticus

Katalasen finden Anwendung zur Peroxid-Bleichung und in der Milchindustrie.

E) Cellulasen [E.C, 3.2.1.4] (Vgl. UHmanti Ioc,cit, pp, 510-511)

Cellulase ist bekanntlich ein Enzymkomplex, dessen Komponenten sukzessive am Abbau der nati-ven Cellulose beteiligt sind.

Cellulasen finden sich in Insekten, Mollusken und Mikroorganismen (Bakterien/Schimmelpilzen). Kommerziell genutzte Quellen für Cellulasen sind insbesondere Aspergillus-, Neurospora-, Rhizopus-, Trichoderma- und Trametes-Arten.

Das Wirkungsoptimum technischer Präparate liegt zwischen pH 4-6. Cellulasepräparate des Standes der Technik verlieren bei kühler und trockner Lagerung ca, 10-20% ihrer Aktivität pro Jahr.

Cellulasen finden technisch Anwendung in der Nahrungsmittelindustrie zur Umwandlung cellulo-sehaltiger Abfallstoffe u.ä.

Die vorliegende Erfindung sei am Beispiel der Venwendung von Enzymen in der Lederherstellung näher erläutert. Die Anwendung von Enzymen, insbesondere von proteolytischen Enzymen ist seit der Einführung der enzymatischen Beize/tryptische Verdauungsenzyme der Bauchspeicheldrüse in der OROPON®-Beize durch Dr. Otto Röhm (DE-PS 200 519) vor rd. 80 Jahren fester Bestandteil der Lederherstellung, insbesondere der Wasserwerkstatt:

Neben den Anwendungen in der Beize (DE-PS 927 464; DE-PS 976 107; DE-PS 941 811; DE-PS 974 813, DE-PS 975 095; DE-PS 976 928; DE-PS 1 120 066; DE-PS 1 134474; DE-PS 1 219 620; DE-PS 1 282 837; US-PS 3 939 040; US-PS 4 273 876) finden Enzympräparate auch Anwendung in der Weiche (DE-PS 288 095; DE-PS 976 602; DE-PS 1 022748 ; DE-PS 1 034317, DE-PS 1 282 838, DE-PS 2 059 453, US-PS 4278432, US-PS 4344 762) bei der Haarlockerung und dem Haut-aufschluss (US-PS 4 294 087).

Zur Enthaarung (DE-PS 1 026 038, DE-PS 1 211 349, DE-PS 1 155 560, DE-PS 1230169, DE-PS 1 288 728, US-PS 3 623 950) und im Äscher (DE-PS 1 023 183; DE-PS 1 203 416, DE-PS 2 053 016, DE-OS 3 429 047) im Pickel (DE-PS 847 947, DE-PS 941 680) oder in einem Kompaktverfahren (US-PS 3 986 926, US-PS 3 986 926, US-PS 3 966 551) zur Nassentfettung (DE-A 3 312 840),

zur Lockerung des Fasergefüges von Rauchwaren (US-PS 3 549 495; US-PS 3 558 430) usw.

Ferner dienen Enzympräparationen zum Auflösen von Maschinenleimleder u, sonstigen Nebenprodukten der Lederherstellung (US-PS 4 210 721, GH-PS 631 486, US-PS 4 293 647, US-PS 4 220 723) von keratinhaltigen Rohstoffen (US-PS 4 232 123) von elastinhaltigen Präparaten (US-PS 4 179 333)

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zur Aufarbeitung von kollagenhaltigem Rohmaterial (US-PS 4 220 714) u.ä.

In Anlehnung an die vorstehend genannten, en-zymatischen Verfahren können Enzym-Flüssig-Formulierungen entsprechend den vorliegenden Ansprüchen in den einzelnen Schritten der Lederherstellung eingesetzt werden (Vgl. Ulimanns Encyclopédie der Techn. Chemie, 3. Auflage, Bd. 11, S. 609, Urban/Schwarzenberg, Ullmanns Encyclopédie der Techn. Chemie, 4. Auflage, Bd. 16, S, 111-174, Verlag Chemie, 1978, F. Stather, Gerbereichemie und Gerbereitechnologie, 4. Auflage, Akademie-Verlag Berlin 1967)

I) In der Weiche

II) Bei der Haarlockerung, im Äscher und in der Enthaarung

III) Bei der Entkälkung und in der Beize und gegebenenfalls

IV) Im Pickel

Zu I.) Die Weiche

Die Weiche von Hautmaterial bei der die bei der Salzkonservierung eintretende Verhärtung der Häute rückgängig gemacht wird, wird üblicherweise bei pH 7,0 bis 10,0 durchgeführt. Die Mitverwendung von Enzymen, insbesondere von proteolytischen Enzymen [siehe A)J beschleunigt die Weichwirkung durch «Verdauen» der wasserlöslichen und sonstigen Eiweisskörper, die nicht zum kollagenen Fasergefüge der Haut gehören.

Im allgemeinen finden in der Weiche Enzyme mit dem Wirkungsbereich (bzw. pH-Optimum der proteolytischen Wirkung) bei pH 7,0-10,0 Anwendung. Mit der Entfernung der nicht-kollagenen Eiweisse wird eine schnellere und intensivere Benetzung der Haut gewährleistet.

Vorteilhafterweise wird das Weichwasser leicht alkalisch gestellt, jedoch muss der pH-Wert stets <12 bleiben. Ausserdem sind Weichhilfsmittel (wei z.B. Monoethanolamin mit Antiseptikum wie Zephy-roi oder Naphthalinsulfosäure in Kombination mit substituierten Phenolen; hochsulfierter Ricinolsäu-rebutylester mit Methylhexalin; Fettalkoholsulfate mit Lösungsmittel) in den üblichen Konzentrationsbereichen (10-1000 g/l) vorteilhaft. Als enzymatische Zusätze in den erfindungsgemässen Enzym-Flüs-sig-Formulierungen kommen z.B. die vorstehend unter A) genannten Proteasen insbesondere die unter A)c) genannten Proteasen in Frage: speziell mikro-bielle Proteasen im Wirkungsbereich 4-9,5, insbesondere Pilzproteinasen, z.B. aus Aspergillusarten wie A. saitoi und A. usamii, insbesondere saure Proteinasen mit pH-Wirkungsbereich 2,5 bis 4,5, weiter solche aus A. oryzae mit pH-Wirkungsbereich 4,0-9,5, ferner aus A. niger und A. flavus mit pH-Wirkungsbereich 9,5-11,0.

Im allgemeinen liegt die Konzentration proteolytischer Aktivitäten der verwendeten Proteinasen im Bereich 0,1-1,0, Anson-Einheiten bzw. 1000 bis 3000 Löhlein-Volhard-Einheiten pro 1 Weichbrühe.

Schliesslich können die Weichbrühen noch Amylasen gemäss B) enthalten. Die Amylasen treten z.B. als Begleitenzyme von Pilzproteinasen auf. Sie begünstigen die Spaltung glykosidischer Bindungen bei den Proteoglykanen und Glykoproteinen der Haut

Insbesondere eignen sich Amylasen mikrobiellen Ursprungs, besonders solche aus Aspergillus-Ar-ten wie A. oryzae und A. niger speziell solche mit einem pH-Wirkungsbereich von 3,0-5,8, ausserdem solche bakteriellen Ursprungs wie z.B. aus Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. polymixa mit einem Wirkungsbereich von 5,0-7,0.

Im allgemeinen liegen die glykolytischen Aktivitäten der Amylasen im Bereich von 50Q-2000 SKB.

Die Temperatur der Weichbrüherr liegt vorteilhaft bei >20 Grad C. Die Weichdauer ist möglichst kurz zu bemessen, sie liegt im allgemeinen zwischen 4 und 36 Stunden.

Zu II) Haarlockerung, Äscher, Hautaufschluss

Zur Enthaarung werden meist Äscher benutzt (Vgl. Ullmann loc. cit., 3, Auflage Bd. H, S. 560; 4. Auflage Bd. 16, S. 118-119. Man arbeitet durchweg mit sogenannten angeschärften Äschern, vorzugsweise einer Kombination von Calciumhydroxid und Natriumsulfid und in Anwesenheit von puffernden, quellungshemmenden Äscherhilfsmitteln (z.B. Netzmittel, insbesondere kationenaktive Netzmittel in Kombination mit Monoethanolamin und Desinfektionsmittel wie quartäre Alkyl-dimethyl-benzylammoni-umverbindungen, bzw. Dialkylamin und dessen Sulfat). Für die Haarlockerung und den Hautaufschluss können Enzyme neben den üblichen Äscherchemikalien verwendet werden, die In diesem pH-Bereich genügend stabil bleiben. Die Weiche und der Ascher lassen sich durch allmähliches Ansteigen des pH-Wertes und Einsatz entsprechender Enzyme zusammenfassen.

Die Anwendung der Enzyme im Zusammenhang der Äscher/Haarlockerungs-ZEnthaarungswirkung geschieht im allgemeinen im pH-Bereich von 9-13, speziell 9-12.

Im Anschluss an die DE-A 2 917 376 bzw. US-A 4 294 687 kann die vom Konservierungssalz befreite Haut zunächst im sauren pH-Bereich mit Disulfid-brücken-spaltenden Substanzen vorbehandelt und anschliessend ohne vorhergehende Weiche unter Verwendung von im alkalischen Bereich wirksamen Proteasen bei einem pH-Wert von ca. 11—13 Haarlockerung und Hautaufschluss gleichzeitig herbeigeführt werden. Es folgen dann die weiteren, in der Wasserwerkstatt üblichen Bearbeitungsschritte III) und gegebenenfalls IV).

Zweckmässigerweise werden in den Operationen der Wasserwerkstatt unter II) alkalische Proteasen vom Typ i) (s. oben) angewendet, insbesondere alkalische Bakterienproteinasen (Serin-Proteasen), beispielsweise aus B. subtilis, B. licheniformis, B. firmus, B. alcaiophilus, B. polymixa, B. mesenthe-ricus.

Diese Proteasen haben im allgemeinen eine Aktivität die zwischen 8000 und 10 000 Löhlein-Volhard-Einheiten (LVE) pro Gramm liegt. Man verwendet sie zweckmässig in Mengen, die bei 0,1-10 Gew.-%, vorzugsweise 1-5 Gew.-% bezogen auf das Ge5

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wicht der gesalzenen Häute und Felle (Rohgewicht) ausmachen.

Die enzymatische Reaktion bei der Haargewin-nung/Hautaufschluss führt man bei ca. 18-28 Grad C durch, wobei die Reaktionszeiten La. zwischen 12 und 24 Stunden, speziell bei 12-16 Stunden liegen.

Enthaarung bzw. Entwollung kann auch mit alkalischen Pilzproteinasen vom Typ i) durchgeführt werden, beispielsweise mit Aspergillus-Proteasen, insbesondere aus A. niger und A. flavus mit einem Wirkungsbereich bei pH 9,5 bis 11,0.

Weiter ist das enzymatische Enthaarungsverfahren nach DE-A 3 429 047 anwendbar, demzufolge Häute und Felle in einer Flotte im pH-Bereich von 9-11 mit solchen proteolytischen Enzymen behandelt wurden, deren Wirkungsoptimum in einem pH-Bereich von 2 bis 7,5 liegt und man die Enthaarung durchführt. Zur Anwendung kommen somit Proteasen vom Typ iii) (s. oben) insbesondere aus A. oryzae, A. saitoi, A. parasitas, A. usami!, A. awa-mori, aus Paelomyces sp, aus Pénicillium sp. auch Rhizopus sp. und/oder aus Mucor pusillus, sowie die sauren Proteasen unter A)a) und A)b) (s. oben).

Im allgemeinen werden 0,5 bis 6 Gew.-% vorzugsweise 1,0 bis 3 Gew.-% bezogen auf das Gewicht der gesalzenen Häute oder Felle angewendet. Dabei liegt die Aktivität im allgemeinen im Bereich von 50 bis 200 mÜHb-

Zu III)

Bei der Entkälkung und in der Beize finden bevorzugt Enzyme Anwendung. Die Entkälkung dient dazu, die Alkalität der Blossen von pH-Werten von 13-14 auf pH-Werte im Bereich 7-8 herabzusetzen. Zum Entkälken sollen vorzugsweise keine stark dissoziierten, sondern schwache organische Säuren, z.B. vom Typ der Dicarbonsäuren oder schwachsauren Salze verwendet werden. Bei der Beize sollen Epidermis-, Haar- und Pigmentreste entfernt und ein zusätzlicher Hautaufschluss bewirkt werden. Ausserdem werden nicht-kollagene Eiweiss-bestandteile entfernt (Vgl. Ullmann, 4. Auflage, Bd, 16 Ioc.cit S. 119-120). Bei der Beize wird konventionell bei pH 7,5 bis 8,5 gearbeitet. Aus der DE-A 3 108428 ist die Anwendung cyclischer Carbonate in der Entkälkung bekannt

Gleichzeitig können bei der Beize auch Lipasen gemäss G, beispielsweise Pankreas-Lipasen mit einem Wirkungsbereich bei pH 7,0-9,0 eingesetzt werden.

Auch Amylasen gemäss B., beispielsweise Pan-kreas-Amylasen, mit einem Wirkungsbereich bei pH 5,5-8,5, welche die Spaltung glykosidischer Bindungen bei der Beize begünstigen, sind (vor allem als Begleitenzyme von Trypsin und Chymotrypsin) von günstigem Einfluss auf die Beize,

Zu IV) Im Picket

Bekanntlich muss die Blosse zur Vorbereitung auf die mineralische Gerbung sauer gestellt werden, d.h. vom pH-Wert von ca 8 auf 3-4 gebracht werden. Dies geschieht z.B. im Pickel, der eine Säure/Salzlösung in Wasser darstellt, beispielsweise

Schwefelsäure oder Ameisensäure zusammen mit Kochsalz.

Empfohlen werden z.B. Schimmelpilztryptasen, Pankreastryptasen und Bakterientryptasen gegebenenfalls zusammen mit Kohlehydrat-spaltenden Enzymen, insbesondere aus Bakterien oder Schimmelpilzen.

Vorteilhafte Wirkungen

Die Flüssig-Formulierungen gemäss der vorliegenden Erfindung bieten eine verallgemeinerungsfähige und relativ problemlose Lösung der vielfach vorhandenen, wenn auch nicht immer ausgesprochenen Aufgabe, nämlich flüssige Enzymformulierungen zur Anwendung bringen zu können. Vorteilhaft ist auch die Möglichkeit Enzyme mit anderen Komponenten zu kombinieren, die in wässrigem Milieu und bei längerer Einwirkungsdauer die Enzymwirkung beeinträchtigen. Dies gilt vor allem für die Kombination verschiedener Enzyme, z.B. von Proteasen mit Amylasen, Lipasen, u.ä., aber auch mit Hydrotropica wie z.B. Harnstoff, Guanidiniumsal-ze, Cumolsulfonat etc.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der erfindungsgemässen Flüssig-Formulierungen und ihrer Anwendung.

BEISPIELE

Beispiel A

Herstellung einer flüssigen Enzympräparation auf Basis Pankreas- und Pilzenzym.

700 g Propylencarbonat (0,6% Wasser) werden nach Zusatz von 3,5 g eines organisch modifizierten Betonits (z.B. Betone 27, Fa. Kronos/Titan Leverkusen) 45 bis 60 Minuten lang bei einer Umdrehung von 16 m/Sek. in einem Zahnscheibenrührer dispergiert (Scheibe:Gefäss = 1:2,5; Einfüllhöhe ist das 2 bis 2,5fache des Scheibendurchmessers, der Bodenabstand des Rührers ist der halbe Scheibendurchmesser),

Unter weiterem Dispergieren werden 2,54 g eines Pilzproteasekonzentrates aus Aspergillus parasiticus (pH-Optimum 7,5-9) (150 000 LVE) und 1,48 g eines Pankreasenzympräparates (pH-Optimum 6-8) (220 000 LVE) zugegeben. Bei gleichbleibender Drehzahl wird weitere 30 Minuten lang dispergiert, wobei darauf zu achten ist, dass die Temperatur 40 Grad C nicht überschreitet Das Endprodukt hat eine Aktivität von 1000 LVE und nach 4 Wochen bei 20 Grad C keinen Aktivitätsabfall. Das Produkt zeigt keine Aufrahm- bzw. Absetzerscheinungen des Enzyms.

Entsprechend der Art des Lösungsmittels, der Korngrösse und der Konzentration des Enzymkonzentrates müssen die Dispergierbedingungen (Drehzahl) und der Typ des organisch modifizierten Bentone geändert werden.

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Beispiel B

Kombinierte Entkälkung und Beize mit einem flüssigen Enzymprodukt auf Basis Pankreas- und Pilzenzym in Propylencarbonat.

10 kg geäscherte und gewaschene Rindsblössen, Spaltstärke 3 bis 4 mm, 30% Wasser, Temperatur 35 Grad C, 3% Enzymlösung auf Pankreas- und Pilzenzymbasis in Propylencarbonat wie in Beispiel A (Aktivität 1000 LV/g), 0,2% nichtionogenes Netzmittel auf Basis Fettalkoholethoxylat mit 8 bis 9 mol Ethylenoxyd.

Nach 80 Minuten ist die Blosse vollständig durch-entkälkt sowie Grund und Gneist hervorragend gelockert. Der End-pH der Flotte liegt bei 8,0. Während der Entkälkung entweicht kein giftiger Schwefelwasserstoff, da der pH nie unter pH 8,0 fällt.

Beispiel C

920 g Butylglykol und 40 g Petroleum Kp 110-130 werden nach Zusatz von 30 g eines organisch, modifizierten Bentonits (z.B. Bentone 27, Firma Kro-nos-Titan, Leverkusen) 38 Minuten lang in einem Ul-tra-Turrax-Rührer mit 16 m/sec. dispergiert.

Die Dispersion lässt man 24 Stunden stehen. Unter obigen Dispersionsbedingungen werden nun 18,5 g einer neutralen Protease aus einem Bazillus subtilis-Stamm (pH-Optimum 5,5-7) (70 000 LVE/g) zugegeben. Man dispergiert insgesamt weitere 5 Minuten. Das Endprodukt hat eine Aktivität von 1300 LVE. Nach 5 Wochen ist kein Aktivitätsabfall in der LVE-Messung zu beobachten. Die Enzymflüssigformulierung bleibt homogen ohne abzusetzen bzw. aufzurahmen.

Beispiel D

Enzymatische Weiche und Entfettung von schmutzgeweichten Rindshäuten

Prozentangaben auf Salzgewicht:

100,0 kg schmutzgeweichte Rindshäute, 200,0% Wasser mit T = 26 Grad C 0,8% Enzymflüssigformulierung aus Beispiel C, 0,4% nichtionogenes Netzmittel auf Basis Fettalkoholethoxylat mit 6 Mol Ethylenoxid.

0,2% eines Bakterizids auf Basis Ghloracetamid.

Nach 5 Stunden Weichdauer sind die Häute völlig zurückgeweicht und gleichzeitig zur Haarlockerung bereit. Ein grosser Teil des Naturhautfetts ist in der Weichflotte emulgiert.

Die auf obiger Art und Weise geweichten Häute werden nach bekannten Verfahren geäschert und zum Crustleder für Schuhe weitergearbeitet.

Beispiel E

1000 g Petroleum Kp 110-130 Grad C werden auf 40 Grad C erhitzt und nach Zusatz eines organisch modifizierten Bentonits (z.B. MPA-X-2000, Firma Kronos-Titan, Leverkusen) 10 Minuten lang dispergiert, dann werden 2,5 g einer sauren Pilzprotease (pH-Optimum 3,5-5) aus Aspergillus parasiticus (80 000 LVE/g) zugesetzt und weitere 5 Minuten dispergiert.

Man erhält eine flüssige Enzymformulierung mit einer Aktivität von 200 LVE, welche nach 4 Wochen bei 20 Grad C keinen Aktivitätsabfal! zeigt. Die Lösung ist homogen und rahmt weder auf noch setzt sie ab.

Beispiel F

Entfetten und enzmyatische Auflockerung von Schaf- und Lammpickelblössen.

Aufwalken (Prozentangaben auf Pickelgewicht)

200% Wasser 35 Grad C, 15% Kochsalz, 5 Minuten bewegen, 10 kg Pickelblössen zugeben und 30 Minuten bewegen, entfleischen, Flotte ablassen.

Entfetten

(Prozentangaben auf Entfleischgewicht)

30% Wasser, 35 Grad C, 2% eines nichtionoge-nen Netzmittels auf Basis Fettalkoholethoxylat (6-8 Mol Ethylenoxid), 6% des Flüssigenzyms aus Beispiel E (200 LVE/g), 8 kg Pickelblösse, 30 Minuten bewegen.

Die Blossen sind durch die Wirkung der Kombination Enzym/Tensid/Petroleum gut entfettet und aufgelockert.

Zur Entpicklung können in verlängerter bzw. neuer Flotte handelsübliche Entpickelungsgerbstof-fe zugegeben werden und kann in bekannter Weise weitergearbeitet werden.

Beispiel G

In einem Rührkessel werden 927,5 g eines nichtio-nogenen wasserfreien Netzmittels auf der Basis Nonylphenol + 8,5 Mol Ethylenoxid mit 12 g Aerosil 380® (Fa. Degussa, Hanau, W-Germany, hoch-disperses amorphes Siliziumdioxid) versetzt sowie 5 g Borchigen STL® (Netz- und Aufschlussmittel, Basis modifizierte Fettsäure, Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten lang bei 15-18 m/sec mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert. Die Viskosität steigt von 15 mPas auf 255 mPas (Bestimmung mit dem Brookfield-Viskosimeter, Bedingung I/6 upm). Nun wird 55,5 g a-Amylase-Konzentrat (90 000 SKB/g (SKB-Analyse siehe Sandstedt, R.M.E., E. Kneen und M.J. Blish, Cereal Chem, 16, 712 (1939) gewonnen aus Bacillus subtilis) zugegeben. Man dispergiert weitere 15 Minuten.

Die flüssige Fertigformulierung mit einer Ausgangsstabilität von 5000 SKG/g hat nach 4 Wochen weder abgesetzt noch aufgerahmt. Der Aktivitätsverlust bei Lagerung bis 25 Grad C beträgt 3,4%.

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Seispiel H

Enzymatisches Vorweichen von Jeansstoffen

10 kg Denimgewebe (Jeansstoffe), welches mit einer Stärkeschlichte behandelt ist, wird in 50 I Wasser bei 40 Grad C gegeben. Nach Zusatz von 50 ml des Produktes aus Beispiel G wird die Temperatur innerhalb 10 Minuten auf 60 Grad C erhöht und das Gewebe 5-10 Minuten lang gewaschen und anschliessend mit je 50 I Wasser von 40 Grad C zweimal gespült. Ein zusätzlicher Waschvorgang mit einem Netzmittel zur Entfernung der Stärkeabbauprodukte entfällt. Das entschlichfete Gewebe hat einen schönen weichen Griff,

Beispiel 1

Flüssiges, biologisch abbaubares Grobwaschmittel

In einem Rührkesset werden 466 g 1,2-PropyIen-glykol, 400 g nichtionisches Tensid Marlipal 013-90® (Isotridecytalkohol + 9 Mol Ethylenoxid, Produkt der Chemischen Werke Hüls, W-Germany), 100 g Ethylalkohol (98%ig) mit 10 g Aerosi! 380® (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W-Germa-ny) und 4 g Borchigen STL® (Netz- und Aufschlussmittel auf Basis modifizierter Fettsäuren (verethert), Fa. Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten lang bei 15-18 m/sec mittels eines Zahn-scheibenrührers dispergiert. Die Viskosität steigt auf 1250 mPas. Nun werden in folgender Reihenfolge unter weiterem Dispergieren folgende Festprodukte zugegeben:

6 g alkalische Protease (aus Bacillus subtilis, Aktivität 92 000 LVE/g)

4 g a-Amylase (aus Bacillus subtilis, 90 000 SKB/g

6 g optischer Aufheller (4,4'-Bis-(4-amino-6-[N-(2-

hydroxyethyl)-N-(2-carbamoyIethyl)-amino]-S-tria-

zin-2-yl-amino-2,2-stiIben-disuIfonsäure

2 g Na-Salz von EDTA (Ethylendamin-tetraessig-

säure)

6 g a-Cg-Ciz-ÖlefinsuIfonat Na-salz (98%)

Nach erfolgter Zugabe wird weitere 15 Minuten dispergiert. Die erhaltene dickflüssige, gut giessba-re Lösung hat nach 4 Wochen Lagerzeit bei 25 Grad C weder abgesetzt noch aufgerahmt.

Der Aktivitätsverlust an a-Amylase betrug nach 4 Wochen bei 25 Grad C 1%; die Protease hatte 1,4% an ihrer Ausgangsaktivität verloren.

Beispiel J

Weiche eines blutverschmierten Baumwollgewebes bei 60 Grad C

500 g weisses Baumwollgewebe, welches mit Rinderblut getränkt und getrocknet wurde, wird in 2,5 I Wasser mit 6 g Flüssigwaschmittel (Lagerzeit 3 Monate) aus Beispiel I und 2 g Natrium-metasilikat 15 Minuten bei 60 Grad C behandelt und anschliessend 2 x bei 30 Grad C mit 2,51 Wasser gewaschen.

Im Vergleich dazu wurde dasselbe Gewebe unter gleichen Bedingungen mit ebenfalls 6 g eines Flüs-sigwaschmittels gleicher Lagerzeit behandelt, welches identisch ist mit Beispiel l, jedoch wurde anstelle von 1,2-PropyIenglykol Wasser verwendet.

Die Auswertung der beiden Versuchsgewebe im Remissionsphotometer ELREFOMAT DFC5® (Zeiss, W-Germany) ergab für die Behandlung mit dem wasserfreien Waschmittel ein um 46% bessere Entfernung des Bluts vom Gewebe. •

Beispiel K

Herstellung eines flüssigen Lipaseproduktes

In einem Rührkessel werden 968 g Genapol 0-050® Ct6-Ci8-Fetfa!koho! mit 5 Mol Ethylenoxid, Höchst AG, W-Germany) mit 12 g Aerosii 380® (hochdisperses Siliciumdioxid, Degussa, W-Germany) und 4 g Borchigen STL® (Netz- und Aufschlussmittel auf der Basis modifizierter Fettsäuren, Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten bei 15-18 m/sec mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert. Die Viskosität steigt von 18 mPas auf 290 mPas an. Nun werden 16 g eines Lipasekonzentrats (aus Pseudomonas spez. Aktivität 5000 LCA/mg, Definition und Bestimmung von LCA-Einheiten: Semeriva, Biochem. 10,2143 (1971) zugegeben und 10 Minuten weiterdispergiert.

Man erhält ein flüssiges Enzymprodukt mit 80 LCA/mg Aktivität, welches nach 6 Wochen Lagerung bei 25 Grad C weder abgesetzt noch aufgerahmt hat. Die Aktivität nach dieser Lagenzeit beträgt noch 77-78 LCA/mg.

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Beispiel L

Verseifung von Rindertalg

400 g Rindertalg und 600 g Wasser werden mit 5 g Lipaseprodukt aus Beispiel K bei 50 Grad C emulgiert und 3 Stunden lang bei dieser Temperatur gerührt. Nach dieser Zeit wird durch Titration der durch Hydrolyse freigesetzten Fettsäuren (JUPAC-Standard Methods of oils, Fats and Derivatives, Pergamon Press, Oxford, 6th édition, pg, 56,1979) ein Hydrolysegrad von 72% festgestellt.

Beispiel M

Herstellung eines flüssigen Cellulase/ Hemicellulasepräparates

In einem Rührkessel werden 882 g Ethylenglykol mit 13 g Aerosii 200® (hochdisperses Siliziumdioxid, Höchst AG, W-Germany) und 5 g Borchigen STL® (Netz- und Aufschlussmittel auf der Basis modifizierte Fettsäure, Fa. Borchers, Goslar, W-Germa-ny) 10 Minuten bei 15-18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert. Die Viskosität steigt von 35 mPas auf 330mPas. Nun werden 100 g eines Celiulase/He-micellulase Konzentrats (aus Trichoderma viridi, Aktivität 10 000 FPU/g, FPU-Einheit: Mandels, M„ Andreotti, R., and Roche C., (1976) Biotech. Bioeng. Symp. 6, 17) zugegeben und weitere 10 Minuten dispergiert.

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Man erhält ein viskoses, homogenes Enzymprodukt (2600 mPas) 1000 FPU/g, welches nach 5 Wochen Lagerzeit bei 25 Grad C weder abgesetzt noch aufgerahmt hat. Die Aktivität nach dieser Lagerzeit beträgt 95%.

Beispiel N

Cellulase/Hemicellulasen für die Glutenfiltration

10 kg Glutensuspension (Trockengehalt~30%), welche durch Zëntrifugation von Maisstärke getrennt wird, wird mit 3 g des Cellulaseproduktes 1 Stunde bei 40 Grad C behandelt. Polysaccharide, welche die Filtration behindern, werden abgebaut und eine schnellere und eifachere Filtration auf dem Vakuumdrehfilter ist das Ergebnis.

Beispiel O

In einem Rührkessel werden 975 g Glycerin (Wassergehalt <1%) mit 20 g Ärosil 380® (hoch-disperses Siliziumdioxid, Degussa, W-Germany) 15 Minuten lang mit einem Zahnscheibenrührer (Umdrehungsgeschwindigkeit 15-18 m/sec dispergiert. Man gibt nun 5 g eines Pectinase-Konzentrats (aus Aspergillus oryzae, Aktivität 100 000 PGU/mg, Definition und Bestimmung PGU-Einheit, vgl. Röhm-Analysenvorschrift PZV-30) zu und dispergiert weitere 10 Minuten.

Man erhält ein flüssiges, gut giessbares, homogenes Pectinaseprodukt mit 5000 PGU/mg Aktivität, welches nach 6 Wochen Lagerung bei 25 Grad C weder aufgerahmt noch abgesetzt hat.

Die Aktivität nach dieser Lagerzeit beträgt noch 97% des Ausgangswertes.

Beispiel P

Pectinasen zur Saftklärung

1000 I frisch abgepresster Apfelsaft werden mit 50 g des Pectinaseproduktes aus Beispiel O behandelt. Es erfolgt der Abbau von Pectinen sowie von kolloidalen Substanzen, welche in den Trubpartikeln sitzen. Diese Kolloide stören bei der Trubflockung, bzw. bei einer Klärung durch Ultra- oder Mikrofil-tration. Nach 2 Stunden Behandlung wird durch Zugabe von Bentoniten eine Trubflockung durchgeführt. Der anschliessende Filtrationsprozess gestaltet sich leicht und unproblematisch.

Beispiel Q

Flüssiges Hilfsmittel für die enzymatische Weiche

In einem Rührkessel werden 300 g nichtionisches Tensid auf der Basis Ci3-Oxo-alkohol + 6 Mol Ethylenoxid und 682 g nichtionisches Tensid, Basis C13-Oxoaikohol, + 9 Mol Ethylenoxid mit 13 g Aerosii 380® (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W-Germany) und 5 g Borchigen STLR (Netz- und Aufschlussmittel auf Basis einer modifizierten Fettsäure, Fa. Borchers, Goslar, W-Germany) 15 Minuten lang mit einem Zahnscheibenrührer bei 15-18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit dispergiert.

Nun werden nacheinander 27,5 g einer alkalischen Protease (aus Bacillus subtilis, Aktivität 80 000 LVE/g) und 10 g einer Pilzprotease (aus Aspergillus parasiticus, 220 000 LVE/g) zugegeben und weitere 10 Minuten dispergiert.

Man erhält ein flüssiges homogenes, gut giess-und pumpbares Enzymprodukt, welches nach 4 Wochen Lagerzeit weder abgesetzt, noch aufgerahmt hat. Die Aktivität nach dieser Zeit beträgt bei 25 Grad C Lagertemperatur noch 97% der Ausgangsaktivität von 4400 LVE/g.

Beispiel R

Enzymatische Weiche von schmutzgeweichten Rindshäuten (Prozentangaben beziehen sich auf Salzgewicht)

100 kg schmutzgeweichte Rindshäute 200% Wasser, 26 Grad C 0,25% Enzymprodukt aus Beispiel Q 0,2% Natronlauge, 50%ig

Nach 5 Stunden Weichdauer im Fass sind die gesalzenen Häute vollständig zurückgeweicht, von einem Grossteil des Hautfetts und Schmutzes befreit und zur Haarlockerung vorbereitet.

Beispiel S

Herstellung eines flüssigen Beizmittels mit entkalkender und entfettender Wirkung

In einem Rührkessel werden 400 g Ethylencarbo-nat eingetragen und mit 300 g Methylethylketon und 264 g nichtionisches Tensid (Ci6-Ci8-Fettalkohol mit 9 Mol Ethylenoxid) gemischt, auf 40 Grad C erwärmt und mit 10 g Aerosii 380® (hochdisperses Siliziumdioxid, Degussa, W-Germany) sowie 6 g Borchigen STL® (Borchers, Goslar, W-Germany, siehe Beispiel Q) versetzt. Die Mischung wird 15 Minuten bei 15-18 m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit mit einem Zahnscheibenrührer dispergiert.

Die Viskosität steigt von 60 mPas auf 1040 mPas. Nun wird 20 g Pankreasenzym-Konzentrat (Aktivität 40 000 LVE/g) zugegeben und weitere 20 Minuten dispergiert. Man erhält eine flüssige, gut gies-sbare homogene Enzymformulierung, welche nach 5 Wochen Lagerzeit bei 25 Grad C nicht absetzt oder aufrahmt. Die Aktivität nach dieser Zeit bei 25 Grad C beträgt 760 LVE/g. (Ausgangsaktivität 800 LVE/g).

Beispiel T

Enzymatische Beize und Entkälkung von Rindsblös-sen

10 kg geäscherte und gewaschene Rindsblässen, Spaltstärke 3-4 mm, 30% Wasser, 35 Grad C, 1 Gew,-% Enzymprodukt (800 LVE/g, identisch mit Beispiel S), 2 Gew.-% Ammoniumsulfat.

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CH677798A5

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Nach 70 Minuten ist die Blosse vollständig durch-entkälkt, sowie Grund und Gneist hervorragend gelockert. Der End-pHWert der Flotte liegt bei pH 7,8. Das Naturfett ist gut aus der Haut entfernt und in der Flotte emulgiert.

Beispiel U

In einem Becherglas werden 984 g 1,2-Propylen-glykol (wasserfrei) mit 10 g Aerosii 380® (siehe Beispiel G) und 5 g Borchigen STL® (siehe Beispiel G) 10 Minuten mit einem Zahnscheibenrührer bei ISIS m/sec Umdrehungsgeschwindigkeit dispergiert. Die Viskosität steigt von 20 mPas auf 310 mPas. Nun wird 1 g Meerrettich-Peroxidase (1000 Units/g, Definition und Bestimmung: Taele, F.W.J., Biochem. Biophys. Acta, 35, 543 (1959) zugegeben und 10 Minuten weiter dispergiert.

Man erhält eine flüssig gut fliessende Produkt-formulierung (280 mPas), welche nach 4 Wochen Lagerzeit weder absetzt noch aufrahmt. Die Aktivität ist nach dieser Zeit um 2% zurückgegangen.

Beispiel V

Herstellung einer Farbstofflösung (Modellreaktion) Lösung A

1 g m-Phenylendiamin wird in 999 g 0,1 m Phosphatpuffer (0,1 m, pH 7) gelöst.

Lösung B

Wasserstoffperoxid (30%).

Reaktionsdurchführung

1 g des Peroxidaseprodukts aus Beispiel U werden in 1000 g Lösung A gegeben und unter Rühren mit 5 g, Lösung B versetzt. Man beobachtet die Bildung eines roten, nach einigen Minuten immer dunkler werdenden Azofarbstoffs.

Claims

Patentansprüche

1. Flüssigformulierung von Enzymen zur technischen Anwendung, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme in einer Trägerflüssigkeit für das Enzym bestehend aus wenigstens im wesentlichen wasserfreien organischen Flüssigkeiten mit anorganischen pulverförmigen Dispergatoren dispergiert vorliegen.

2. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserfreien organischen Lösungsmittel ein Molekulargewicht <110 und einen Siedepunkt unterhalb 300°C Normaldruck besitzen.

3. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gewfchtsverhältnis Enzym zu Lösungsmittel von 1:10 bis 1:500 besteht.

4. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerflüssigkeit aus einem wasserfreien, aber an sich wassermischbaren, organischen Lösungsmittel besteht.

5. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerflüssigkeit aus einem nicht mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel besteht.

6. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der pulverförmige Dispergator Siliciumdioxid ist.

7. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an anorganischen pulverförmigen Dispergatoren 0,1 bis 6 Gew.-% bezogen auf die Trägerflüssigkeit beträgt.

8. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die wassermischbaren, organischen Lösungsmittel 1 bis 10 Gew-% bezogen auf diese an Kohlenwasserstoffen mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen enthalten.

9. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie Tenside in Anteilen von 0,001 bis 50 Gew,-% bezogen auf die Trägerflüssigkeit enthält.

10. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerflüssigkeit aus einem cycli-schen Kohlensäureester besteht oder diesen enthält.

11. Flüssigformulierung von Enzymen gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerflüssigkeit aus Propylencarbonat besteht oder dieses enthält.

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