CH666043A5 - Glycosid-antibiotika und verfahren zu ihrer herstellung. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue bioaktive Glycoside und auf ihre mikrobiologische Herstellung, Gewinnung und Trennung in zwei bioaktive Komponenten.

Die zwei antibiotischen Glycoside sind aus dem Aglycon, Chartarin, dem Aglycon von Chartreusin und aus einem oder zwei Zuckerresten zusammengesetzt. BBM-2478B hat einen Zuckerrest der Formel

HO

V^i-0 H0^7lsV>'-

der an das Aglycon gebunden ist, während BBM-2478A - das andere Antibiotikum der vorliegenden Erfindung - zusätzlich noch den Amino-Zucker der Formel

OH

CH3° TA

H2N I 2 O"

aufweist.

Das Antibiotikum Chartreusin, das beispielsweise in «J. Am. Chem. Soc.», 75,4011-4012 (1953), und in «Helv. Chim. Acta», 47,1459-1484 (1964), beschrieben ist, hat den gleichen Äglyconteil wie die vorliegenden Antibiotika, enthält jedoch zwei verschiedene Zucker, d.h. D-Fructose und D-Digitalose. Chartreusin hat die Struktur

OH

H.CO

D-Digitalose

HO

CH

CH

(8)

HO

CH

OH

D-Fucose

OH

und wird hergestellt durch Fermentation des Mikroorganismus Streptomyces chartreusis, Streptomyces Sp. Nr. 747 (S. viridis), Streptomyces Sp. 6A36 (S. viridochromogenes) und durch zwei Actinomycetes-Stämme, die als Streptomyces Sp. X-3988 und S-465 bezeichnet werden. Chartreusin ist offensichtlich das Gleiche wie das Antibiotikum 747 und das Antibiotikum X-465A.

Die vorliegende Erfindung stellt zwei neue antibiotische Verbindungen zur Verfügung. Diese werden durch die Kultivierung eines Actinomycetes-Stamms mit der Bezeichnung

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15

20

25

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45

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60

65

3

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J907-21 (ATCC 39417) oder durch Varianten oder Mutanten davon in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen unter submersen aeroben Bedingungen hergestellt. Wenn ein wesentlicher Anteil eines Stoffgemisches, das nachstehend als BBM-2478-Komplex bezeichnet wird, durch den genannten Mikroorganismus im genannten Kulturmedium produziert ist, wird der BBM-2478-Komplex aus dem Kulturmedium gewonnen. Der BBM-2478-Komplex enthält die zwei erfindungsgemässen bioaktiven Antibiotikakomponenten, die als BBM-2478A und BBM-2478B bezeichnet werden, und die durch übliche Chromatographieverfahren getrennt und in wesentlich reiner Form isoliert werden können.

BBM-2478A und B zeigen eine antibakterielle Wirkung gegen aerobe gram-positive Bakterien und anaerobe Bakterien. BBM-2478A zeigt ebenfalls eine Hemmwirkung auf das Wachstum von bösartigen Tumoren bei Tumoren in Versuchstieren.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von BBM-2478A;

Fig. 2 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von BBM-2478B ;

Fig. 3 zeigt das Kernresonanzspektrum (80 MHz) von BBM-2478A in CD3OD, und

Fig. 4 zeigt das I3C-Kernresonanzspektrum (20 MHz) von BBM-2478A in ds-DMSO.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die Glyco-sidantibiotika BBM-2478A gemäss Anspruch 1 und BBM-2478B gemäss Anspruch 2 und Verfahren zu ihrer Herstellung durch Fermentation eines Actinomycetes-Stamms, der als Stamm J907-21 bezeichnet wird. Die produzierenden Mikroorganismen wurden aus einer Bodenprobe aus El Salvador isoliert. Der Organismus wurde gegenwärtig nur als nicht Streptomyces-actinomycetes-Stamm bezeichnet. Eine biologisch reine Kultur dieses Organismus wurde durch übliche Verfahren hergestellt und am 1. August 1983 bei der «American Type Culture Collection», 12301, Parktown Drive Rock-ville, Md. 20852 USA, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungs-Nr. ATCC 39417.

Taxonomie der produzierenden Kultur

Der Stamm J907-21 bildet gut verzweigte, nicht fragmentierende vegetative Mycele, hat jedoch keine Fähigkeit, echte aeriate Mycelien zu tragen. Wie bisher festgestellt wurde, ist sie asoprogenisch. Da sie in der Zellwand Mesodiaminopi-melinsäure und im gesamten Zellhydrolysat Madurose enthält, wird der Stamm J907-21 dem Zellwand-Typ IIIb zugeordnet. Der Stamm J907-21 trägt keine morphologisch wichtigen Körper wie Sporenketten und Sporangien. Demzufolge kann gegenwärtig der Stamm J907-21 nur als nicht Strepto-myces-actinomycetes-Stamm klassifiziert werden.

Morphologie

Der Stamm J907-21 bildet lange, gut verzweigte vegetative Mycele (0,4 [im Weite) und zerfällt nicht in Stäbchen oder Coccoid-Zellen. Rudimentäre kurze aeriale Mycele werden gelegentlich auf gewissen Agarmedien gebildet, auf allen beschriebenen Medien werden jedoch keine wahren aerialen Mycele gebildet. Soweit geprüft, werden keine Sporen bildende Körper oder Sporen beobachtet.

Kulturelle Charakteristika

Wie in Tabelle 1 dargestellt, wächst der Stamm gemässigt auf natürlichen organischen Medien, jedoch gering auf den meisten chemisch definierten Medien. Trotzdem der Stamm

J907-21 kein echtes aeriales Mycélium bildet, werden teilweise rudimentäre kurze aeriale Mycelien auf ISP-Medien Nr. 2 und 4 und Bennett's Agar gebildet. Das rudimentäre aeriale Mycélium wird ebenfalls auf ISP-Medium Nr. 7, das 5 mit Kobalamin oder Vitaminkomplex ergänzt ist, gebildet. Auf den meisten Agarmedien geht die Farbe der Umkehrseite des vegetativen Mycéliums von schwachem Gelb bis zu verschiedenen Schattierungen von Braun. Tiefrötliche Mycelien-pigmente werden auf dem ISP-Medium Nr. 2 von VDYA (V8 io Saft-Dextrose-Hefe-Extrakt-Agar) gebildet. Das melanoide Pigment wird nicht gebildet in den ISP-Medien Nr. 1,6 und 7. Kolonien auf dem ISP-Medium Nr. 2 sind extrem aufgerichtet, starr und gefaltet.

15 Physiologische Charakteristika

Das maximale Wachstum wird bei 28 und 37 °C beobachtet. Kein Wachstum wird bei 7 und 45 °C festgestellt. Wachstum ist möglich im Bereich von 15-43 °C. Aus L-3,4-Dihy-droxy-phenylalanin (L-DOPA) wird kein Melanin gebildet. 20 Der Stamm J907-21 ist tolerant gegenüber 4% oder weniger Natriumchlorid, jedoch nicht bei 5%, und ist ebenfalls empfindlich auf Lysozym. Der Stamm J907-21 verwendet fast alle Pentosen und Hexosen. Die physiologischen Charakteristika und die Kohlenhydratverwendung wird in den Tabellen 2 25 bzw. 3 dargestellt.

Zellwand-Aminosäuren und Gesamtzell-Zuckerkomponenten Die Aminosäurezusammensetzung in der Zellwand wurde nach den Methoden von Becker at al., in «Appi. Microbiol.», 30 13,236-243 (1965) und von Yamaguchi in «J. Bacteriol.», 89, 444-453 (1965) geprüft und wurde ebenfalls durch den Ami-nosäureanalyzer (Hitachi 0342U Modell) bestimmt. Die Zuk-kerkomponente des gesamten Zellhydrolysates wurde nach den Methoden von Lechevalier und Lechevalier in «Chemi-35 cal Methods As Criteria For the Separation Of Nocardiae From Other Actinomycetes. Biology Of The Actinomycetes And Related Organisms», 11,78-92 (1976), hergestellt. Die Zellwand des Stammes J907-21 enthält Meso-Diaminopime-linsäure und einen kleinen Anteil Glycin. Im gesamten Zell-40 hydrolysat wurde die Gegenwart von Glukose, Mannose, Madurose und Ribose festgestellt. Die obengenannte Zellwandzusammensetzung und die Gesamtzell-Zuckerkompo-nenten weisen daraufhin, dass der Stamm J907-21 zum Zellwandtyp IIIb gehört.

45

Taxonomie

Der Stamm J907-21, welcher zu den mesophilen, grampositiven Actinomycetes gehört, bildet gelegentlich rudimentäre kurze aeriale Mycelien, weist jedoch keine Fähigkeit zur so Bildung wahrer aerialer Mycelien, sporenbildender Körper und Sporen auf. Der Stamm J907-21 besitzt eine Zellwand des Types IIIb. Bekannte Actinomycetes, die eine Zellwand vom Typ IIIb besitzen, umfassen die Gattungen Actinoma-dura, Microbispora, Streptosporangium, Spirillospora, Plano-55 monospora, Planobispora und Dermatophilus. Das vegetative Mycélium der Gattung Dermatophilus, welches in der Natur für Tiere zwingend pathogen ist, weist sowohl transversale wie auch longitudinale Trennwände auf. Demzufolge ist der Stamm J907-21 klar verschieden von der Gattung Dermato-60 philus. Die verbleibenden sechs Gattungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie auf dem aerialen Mycélium ein Sporenbläschen (Sporangium) oder Arthrosporen aufweisen. Im Gegensatz zur Art der Streptomyces wird von vielen Stämmen dieser sechs Gattungen berichtet, dass sie mehr oder weniger es wählerisch in der Sporenbildung sind. Daher gehört der Stamm J907-21 wahrscheinlich zu einer der obengenannten sechs Gattungen. Unter den sechs Gattungen ist die Gattung Actinomadura bekannt als weltweit verbreiteter Bewohner

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4

des Erdbodens. Gordon charakterisierte in «J. Gen. Micro-biol.», 109, 69-78 (1978), physiologisch 14 Taxa von Nucar-diae einschliesslich Actinomadura madurae. Auf Basis der physiologischen Prüfungen von Görden wurde der Stamm J907-21 verglichen mit A. madurae (Tabelle 4). Der Stamm J907-21 war den Actinomadura madurae (Ähnlichkeit 85,7%) näher verwandt als andere Taxa mit dem Zellwandtyp IIIc und IV (Ähnlichkeit 54,8-76,9%). Physiologische Beziehungen zwischen den sechs Gattungen mit dem Zellwandtyp IIIb konnten jedoch keine festgestellt werden, da sie sich in der Morphologie voneinander deutlich unterscheiden. Folglich kann der Stamm J907-21 nur als asporogenes Nicht-Strepto-myces klassifiziert werden.

Tabelle 1

Kulturelle Charakteristika* des Stammes J902-21

Trypton-Hefeextraktbrühe G**: gering, Fioccose, schwach gelbe Kiigelchen keine

(ISP Nr. 1) D

Saccharose-Nitrat-Agar G (Czapek-Agar) R

A D

Glukose-Asparagin-Agar G

R

A D

Glycerin-Asparagin-Agar G (ISP Nr. 5) R

Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP Nr. 4)

Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3)

A D G

R: A:

D:

Tyrosin-Agar (ISP Nr. 7) G:

R:

A D

Nähragar G

R

A D

Hefeextrakt-Malzextrakt- G Agar (ISP Nr. 2)

R: A:

Bennett-Agar io Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP Nr. 6)

VDYA-Agar (Papavizas, 1964)

A: keine D: keine G: massig

R: dunkel gräulichgelb (91) bis dunkel olivbraun (96) A : keine oder sehr spärlich ; wenn gebildet rudimentär, gelblichweiss (92) D: tiefgelb (85)

G:

massig

R:

20

D: G:

R:

gering gelblichweiss (92)*** bis hell olivbraun (94)

keine keine gering gelblichweiss (92) bis mässig olivbraun (95)

keine keine gering hell gräulich-gelblichbraun (79) bis dunkel gräulich-gelblichbraun (81) keine mässig gelblichbraun (77) gering gräulich-gelblichbraun (80) keine oder sehr spärlich; wenn gebildet rudimentär, gelblichweiss (92)

dunkel gräulich-gelblichbraun (81) mässig gräulichgelb (90) bis tief gelblichbraun (75)

keine keine gering tiefgelb (85) bis dunkelolivbraun (96)

keine keine mässig dunkel gräulichgelb (91) bis dunkel olivbraun (96)

keine oder sehr spärlich; wenn gebildet rudimentär, leicht gräulich-gelblichbraun (79) dunkel gelblichbraun (78) mässig gelblichweiss (92) bis gräulichgelb (90)

Maismehl-Agar (Riker & Riker, 1936)

25

C-2-Agar (Nonomura, 1971)

Kartoffel-Karotten-Agar (Cross et al., 1963)

35

Kolonie auf ISP-Medium Nr. 2

hell olivbraun (94) bis tief gelblichbraun (75)

keine brillant orangegelb (67) reichlich lebhaft tiefes Rot (14) bis schwärzlichrot (21)

keine dunkelrot (16)

reichlich tief gelblichbraun (75) bis dunkel gelblichbraun (78) keine starkbraun (55)

gering hell gelblichbraun (76) bis tief gelblichbraun (75)

keine oder sehr spärlich; wenn gebildet, rudimentär weiss (263)

keine gering bis mässig gräulichgelb (90) bis dunkel gelblichbraun (78) A: keine

D: dunkel gelblichrosa (30) gutes Wachstum; extrem aufgerichtet, hart und gefaltet; 3-5 mm Durchmesser, rötlichschwarze (24) Oberflächenfarbe, Bildung von keinem oder nur einem rudimentären Mycélium

A D

G R

A D G R

A D G R

D G R

45 '

50

* Beobachtet nach Inkubation bei 28 °C während 3 Wochen. ** Abkürzungen: G = Wachstum; R= Umkehrfarbe; A = ae-riales Mycélium; D = diffundierbares Pigment. *** Farbe und Nummer in Klammern gemäss dem Farbstandard in «Kelly, K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS color-name Charts illustrated with Centroid Colors. U.S. Dept. of Comm. Cir. 553, Washington, D.C., Nov., 1975».

55

Tabelle 2

Physiologische Charakteristika des Stammes J907-21

Test

Antwort

Methode und verwendetes Medium

Temperaturbereich zum Wachstum

65

Maximales Wachstum bei 28-37 °C. Wachstumsbereich 15-43 °C. Kein Wachstum bei 7 und 45 °C

Bennett-Agar

5

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Test

Antwort

Methode und

verwendetes Medium

Gelatine-

verflüssigt

1% Malzextrakt,

Verflüssigung

0,4% Hefeextrakt,

0,4% Glukose,

20% Gelatine

Stärke-Hydrolyse hydrolysiert

Stärke-Agar-Platte

Reaktionen in nicht koaguliert und

Difco abgerahmte abgerahmter vollständig

Milch

Milch peptonisiert

Bildung von negativ

Tyrosin-Agar,

melanoidem

Pepton-Hefeextrakt-

Pigment

Eisen-Agar und

Trypton-Hefeextrakt-

Brühe

Tyrosinase-

negativ

Arai-Methode*

Reaktion

Nitrat-Reduktion

'negativ

0,5% Hefeextrakt,

1% Glukose, 0,5%

KNO.3,0,1% CaCCh pH-Toleranz

Wachstum bei

Hefeextrakt-Malz-

pH-Wert 5,0-11,0.

extraktagar

NaCl-Toleranz

Lysozym-Toleranz

Kein Wachstum bei pH-Wert 4,5. Wachstum bei 4% NaCl oder weniger. Kein Wachstum bei 5% NaCl. empfindlich, kein Wachstum bei 0,001% Lysozym.

Basismedium: 1% Hefeextrakt, 2% lösl. Stärke, 1,5% Agar

Trypticase-Soja-Brühe mit 1,5% Agar

* Arai, T. and Y. Mikami: Chromogenicity of Streptomyces, «Appi. Microbiol.» 23, 402-406, 1972.

Tabelle 3

Kohlenhydrat-Verwendung des Stammes J907-21

Glycerin

+

D(—)-Arabinose

+

L(+)-Arabinose

+

D-Xylose

+

D-Ribose

+

L-Rhamnose

+

D-Glukose

+

D-Galactose

+

D-Fructose

+

D-Mannose

+

L(—)-Sorbose

—

Saccharose

—

Lactose

—

Cellobiose

+

Melibiose

—

Trehalose

+

Raffinose

—

D(+)-Melezitose

—

lösliche Stärke

+

Cellulose

—

Dulcitol

—

Inositol

+

D-Mannit

+

D-Sorbit

—

Salicin

+

Hergestellt nach der Inkubation bei 37 °C während 3 Wochen.

Basis-Medium: Anorganisches Medium nach Pridham-Gottlieb

5 Abkürzungen: + = positive Verwendung, - = negative Verwendung.

Tabelle 4

]0 Vergleiche der diagnostischen physiologischen Eigenschaften zwischen dem Stamm J907-21 und Actinomadura madurae

Stamm J907-21

Actinomadura* madurae (47)**

15 Zersetzung von:

Adenin

+

—

Casein

+

+

Hypoxanthin

+

+

Tyrosin

+

+

20 Harnstoff

—

—

Xanthin

—

—

Resistenz gegen:

Lysozym

-

-

Rifampin

+

V

25 Hydrolyse von:

Aesculin

+

+

Hippurate

+

-

Stärke

+

+

Säure aus:

30 Arabinose

+

+

Cellobiose

+

+

Glucose

+

+

Glycerin

+

+

Inositol

+

V

35 Lactose

—

V

Mannit

+

+

Mannose

+

+

Melezitose

—

—

Melibiose

—

—

40 Raffinose

—

—

Rhamnose

+

+

Sorbit

—

—

Trehalose

+

+

Xylose

+

+

45 Verwendung von:

Benzoat

—

—

Citrat

—

V

Mucat

—

-

Succinat

+

V

50 Tartrat

—

-

Nitrit aus Nitrat

—

+

Überlebende bei

—

+

55

60

+ = positiv, - = negativ, V = 15-84% der Stämme positiv * Daten von Gordon et al.

** Nr. der geprüften Stämme

Wie im Fall von anderen Mikroorganismen können die Charakteristika des Stammes J907-21 variiert werden. Beispielsweise können künstliche Varianten und Mutanten des Stammes J907-21 durch Behandlung mit verschiedenen Mutagenen, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktive Strahlen und Chemikalien, erhalten werden. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten (nachstehend als Mutanten bezeichnet) des Stammes J907-21, welche die BBM-2478-Antibiotika produzieren,

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6

sollen durch die vorliegende Erfindung ebenfalls umfasst werden.

Antibiotika-Produktion

Die erfindungsgemässen Antibiotika BBM-2478 werden durch den kultivierenden Stamm J907-21 (ATCC 39417) oder durch einen BBM-2478-produzierenden Mutanten davon unter submersen aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium produziert. Die produzierenden Organismen werden in einem Nährmedium gezüchtet, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, z.B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, enthält. Beispiele von geeigneten Kohlenstoffquellen umfassen Glycerin, Arabinose, Xylose, Glucose, Fructose, Mannose, lösliche Stärke, Mannit und Cellobiose. Das Nährmedium soll auch eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Fischmehl, Sojabohnenmehl, Maiswasser, Peptone, Fleischextrakte, Erdnussmehl, Hefeextrakte oder Ammoniumsalze, enthalten. Anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kalziumcarbonat, Phosphate usw., werden nötigenfalls beigefügt. Spurenelemente, wie Kupfer, Mangan, Eisen, Zink usw., werden gewünschtenfalls zum Medium gegeben, oder sie können ebenfalls als Verunreinigung anderer Bestandteile des Mediums bereits vorhanden sein. Die Inkubationstemperatur kann jede Temperatur sein, bei welcher der produzierende Stamm fähig ist zu wachsen, beispielsweise von 15-43 °C, aber es wird bevorzugt, die Fermentation bei 25-35 °C, insbesondere bei 27-32 °C durchzuführen. Ein neutraler oder nahezu neutraler pH-Wert des Mediums wird bevorzugt, und die Herstellung der Antibiotika wird während einer Periode von 6-10 d durchgeführt. In der Regel wird die optimale Produktion nach 6-7 d erzielt. Für die Zubereitung von verhältnismässig kleinen Anteilen können Schüttelflaschen und Oberflächenkulturen verwendet werden, für die Herstellung von grösseren Anteilen werden jedoch submerse aerobe Kulturen in sterilen Tanks bevorzugt. Bei der Durchführung der Tank-Fermentation ist es vorteilhaft, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe herzustellen, indem die Kulturbrühe mit Sporen des Organismus inokuliert wird, und wenn ein junges aktives vegetatives Inokulum erhalten worden ist, dieses aseptisch in den Fermentationstank transferiert wird. Die Belüftung der Tanks und Flaschen kann durchgeführt werden, indem sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentationsmediums geleitet wird. Weiter kann durch ein mechanisches Rührwerk gerührt werden. Antischaummittel, wie Specköl, können nach Bedarf ebenfalls beigefügt werden.

Die Herstellung vom BBM-2478 im Fermentationsmedium kann während dem Verlauf der Fermentation leicht verfolgt werden, indem der Papier-Disc-Agar-Diffusionstest unter Verwendung des Micrococcus luteus PCI 1001 als Testorganismus durchgeführt wird.

Die Isolierung der Antibiotika BBM-2478

Nachdem die optimale Brühenpotenz erreicht worden ist, werden das Mycélium und die unlöslichen Rückstände aus der Fermentationsbrühe entfernt durch übliche Mittel, wie Filtration oder Zentrifugation. Das Antibiotikum im mycel-haltigen Kuchen kann gewonnen werden durch Extraktion des mycelhaltigen Kuchens mit Methanol, Filtrierung des unlöslichen Materials und Konzentration des Methanolextraktes zu einer wässrigen Lösung. Die Aktivität des Brühen-überstandes kann gewonnen werden durch Extraktion mit n-Butanol und Konzentration des Butanolextraktes zu einer wässrigen Lösung. Die wässrigen Methanol- und Butanolex-trakte, die die Antibiotika BBM-2478A und B enthalten, können anschliessend üblichen Chromatographie-Reinigungsverfahren unterzogen werden, so dasss das gereinigte BBM-

2478 A und B resultiert. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren wird im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben.

Physikalisch-chemische Eigenschaften der Antibiotika BBM-2478

BBM-2478A und B wurden als gelblich-orangefarbene kristalline Feststoffe erhalten. Beide Komponenten von BBM-2478 sind unterscheidbar von Chartreusin durch Dünnschichtchromatographie (TLC) wie in Tabelle 5 dargestellt. BBM-2478A ist in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dioxan und angesäuertem Wasser leicht löslich, in Methanol, Ethanol und Chloroform schwachlöslich und in anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich. Die Löslichkeit von BBM-2478B ist ähnlich wie diejenige von BBM-2478A mit der Ausnahme, dass BBM-2478B unlöslich ist in angesäuertem Wasser. BBM-2478A und B geben positive Reaktionen mit Eisenchlorid und Anthron-Reagentien. BBM-2478A zeigt eine positive Reaktion gegenüber Ninhydrin, während BBM-2478B im gleichen Test eine negative Reaktion zeigt. Tollensund Sakaguchi-Reaktionen sind mit beiden Komponenten negativ. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von BBM-2478A und B werden in Tabelle 6 zusammengefasst. Die UV-Spektren der beiden Komponenten sind ähnlich und zeigen Maxima bei 236,266,398 und 422 nm in neutralen und sauren Lösungen und bei 240,268 und 435 nm in alkaliner Lösung. Diese Spektren sind demjenigen von Chartreusin nahe verwandt. Die IR-Spektren von BBM-2478A und B werden durch die Figuren 1 bzw. 2 dargestellt. Die Protonen (PMR) und »C-NMR (CMR) Spektren von BBM-2478A werden durch die Fig. 3 und 4 dargestellt.

Tabelle 5

TLC von BBM-2478A und B und Chartreusin

SiCh

SÌO2

CHCh-MeOH (7:3)

EtOAc-MeOH (1:1)

BBM-2478A

Rf 0,37

0,16

BBM-2478B

Rf 0,78

0,57

Chartreusin

Rf 0,65

0,48

Tabelle 6

Physikalisch-chemische Eigenschaften von

BBM-2478AundB

BBM-2478A

BBM-2478B

Nature gelbes, amorphes gelbes, amorphes

Pulver

Pulver

F.

225-226 °C

271-272°C

(Zers.)

[aP (c 0,5, Pyridin)

+ 124°

-8°

U?ÄH nm (E/cm)

236 (590)

236 (740)

266 (550)

266 (700)

333 (100)

333 (118)

378 (132)

378 (169)

398 (205)

398 (255)

422 (225)

422 (290)

Analyse gefunden:

C 59,28

C 63,07

H 5,40

H 4,51

N 2,06

berechnet für:

C33H35NO13 • H2O

C26H22O10

C 59,01

C 63,16

H 5,55

H 4,48

N 2,09

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

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Strukturstudien an den Antibiotika BBM-2478

Das CMR-Spektrum von BBM-2478A zeigt die Gegenwart von 33 C-Atomen, die vier C-CHb, eine -OCH3, neun

^CH-, eine fünf -CH= und 13 ^C= Gruppen umfassen. Diese CMR-Spektraldaten, kombiniert mit mikroanalytischen Daten von BBM-2478A, führen zur Molekularformel C33H35NO13 für das Antibiotikum. BBM-2478A wurde mit 0,4N methanolischer Salzsäure unter Rückfluss während 1 h hydrolysiert. Die ausgefällten gelben Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und das Filtrat im Vakuum konzentriert, wobei ein Sirup, der Ninhydrin-positive Zuckerfragmente enthielt, erhalten wurde. Das kristalline Material wurde als Chartarin, dem Aglycon von Chartreusin identifiziert, indem eine vergleichbare Spektralanalyse mit einem authentischen Beispiel durchgeführt wurde.

Chartarin

Struktur übereinstimmte. Im weiteren sind die physikalischchemischen Daten von N,0-Diacetyl-Ila [F. 163-164 °C und [aF: + 154° (c 0,3, CHCb)] ähnlich zu denjenigen, die dem Methyl-2-acetamido-4-0-acetyl-2,6-dideoxy-3-0-methyl-<x-D-5 galactopyranosid zugeschrieben wurden durch M.B. Perry in «Can. J. Chem.», 52,3251-3255 (1974).

IIa: = OCH3, R2 = H

IIb:

= H,

OCH-

Das Zuckerfragment, das in dem wässrigen Konzentrat enthalten war, war eine anomere Mischung eines Disacchari-des (Verbindung I), welche mittels Amberlit CG-50 (NH4+ Form)-Chromatographie aufgetrennt wurde, wobei a- und ß-Methylglycoside (Ia) und (Ib) in nahezu äquivalenten Anteilen erhalten wurden. Die Molekularformel der Verbindungen Ia und Ib wurden als C15H29NO8 ermittelt unter Verwendung des Massen-(M+ +1 :m/z 352)- und des CMR-Spek-trums. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Ia und Ib sind in der Tabelle 7 zusammengefasst. Die Verbindungen Ia und Ib widerstanden einer weiteren sauren Hydrolyse und eine weitreichende Zersetzung der resultierenden Zuckerfragmente wurde unter sauren Bedingungen erzielt, die stark genug waren, um die Glycosid-Bindungen zu spalten. Eine Mischung der Verbindungen Ia und Ib (370 mg) wurde in Methanol azetyliert, wobei ein mono-N-Acetyl-Derivat (460 mg, M+ +1 :m/z 394) erhalten wurde, welches in 4,5N methanolischer Salzsäure hydrolysiert wurde. Das Produkt wurde auf einer Silikagelsäule chromatographiert, mit der Niederphase von CHCb-MeOH-c- NHtOH (6:1:1), wobei die a- und ß-Anomere des N-Acetyl-amino-Zuckers (Verbindung N-Ac-IIa, 140 mg und N-Ac-IIb, 22 mg) und ein neutraler Zucker (Verbindung lila, 85 mg, und IIIb, 79 mg) erhalten wurde. Bei Behandlung mit gesättigter Ba(OH)2-Lösung wurde N-Ac-IIa quantitativ in die aminofreie Form (Verbindung IIa) übergeführt. Die physikalisch-chemischen Daten von IIa, lila und IIIb sind in Tabelle 8 dargestellt. IIa wurde als Methyl-2-amino-2,6-dideoxy-3-0-methyl-a-D-galactopy-ranosid ermittelt, aus der Analyse seines NMR-Spektrums. Wie in Tabelle 8 dargestellt, zeigte das NMR-Spektrum von IIa 5 Ringprotonen zusammen mit zwei OCH3- und einem C-CH3-Signal. Die Analyse erster Ordnung der Ringprotonen ergab die Kupplungskonstanten Ji_2 = 3,8; J2-3 = 10,5 ; J3_ 4=3,0; J4-5 < 1,0; und Js-6 = 6,4 Hz, was mit der zugewiesenen

Das PMR-Spektrum von lila zeigte Kupplungskonstanten von J1-2 = 4,5 ; J4-5 < 1,0 ; und J5-6=6,7 Hz, während diejenigen von IIIb Ji_2=7,8 ; J4-5 < 1,0; und J5-6 = 6,5 Hz betrugen. 20 Die Abwesenheit eines Ringprotones am C3 war in beiden Spektren offensichtlich. Die Spektralanalysen gaben an, dass lila bzw. IIIb die. a- bzw. ß-Methyl-glycoside von 6-Deoxy-3-C-methylgulopyranosid (Methylvirenosid) oder 6-Deoxy-3-C-methylgalactopyranosid waren. Die authentische Probe von 25 Methyl-ß-D-Virenosid erwies sich als verschieden von IIIb durch Dünnschichtchromatographie und das NMR-Spektrum: Die Hi- und Hs-Signale von Methylvirenosid wurden in einem beträchtlich tieferen Gebiet als diejenigen von IIIb beobachtet, was angibt, dass C3-OH von Methylvirenosid in 30 axialer Orientierung war, während diejenige von IIIb equato-rial orientiert war. Für III wurde die D-Konfiguration ermittelt, auf Basis der optischen Rotationswerte von lila und IIIb und A[M]CuAm ermittelt für Illa (-1309°). Demzufolge wurden lila und IIIb als Methyl-6-deoxy-3-C-methyl-a- bzw. 35 ß-D-Galactopyranosid ermittelt.

lila: Rx = OCH3, R2 = H

IIIb:

= H,

= OCH,

45

Die Bindung der beiden Zucker wude durch Massenspektroskopie von Ia und Ib und den Azetaten davon bestimmt, wobei Fragmente erhalten wurden, die einer II —► III-Sequenz des Disaccharides zugeschrieben werden konnten.

5o Das 200 MHz PMR-Spektrum und das Entkupplungsexperi-ment, das mit N,0-triacetyl-Ia durchgeführt wurde, zeigte, dass der Zucker II mit dem C2-OH von III durch eine a-gly-cosidische Bindung verbunden war und somit folgende Strukturen von Ia und Ib bestimmt werden konnten.

666 043

8

Das UV-Spektrum von BBM-2478A, das bei verschiedenen pH-Werten gemessen wurde, war demjenigen von Chartreusin sehr ähnlich. Daraus konnte gefolgert werden, dass der Disaccharidrest von BBM-2478A mit der gleichen Hydroxylgruppe an Chartarin gebunden war wie in Chartreusin. Das IR-Spektrum von BBM-2478A und Chartreusin in Chloroform, das die gleichen Kurven der Carbonylabsorption zeigte, unterstützte die obengenannte Zuordnung. Im NMR-Spektrum von N-Acetyl-BBM-2478A gab das anomere Proton von III Anlass zu einem Dublett mit einem Zwischenraum von J = 8,0 Hz, welches den Urhebern der vorliegenden Erfindung erlaubte, der Verbindung III eine ß-Pyranosid-Konformation für das Antibiotikum zuzuordnen.

Die Molekularformel von C26H22O10 wurde BBM-2478B auf Basis von Mikroanalysen zugeordnet. Durch milde saure Methanolyse wurde aus BBM-2478B Chartarin und neutralen Zuckern (lila und IIIb) erhalten, die identisch waren mit denjenigen, die aus BBM-2478A erhalten wurden. Folglich ist offensichtlich, dass BBM-2478B das Analoge von BBM-2478A sein muss, jedoch ohne Aminozuckerrest II. Demzufolge weisen die Antibiotika BBM-2478A und B die folgenden Strukturformeln auf :

(B)

HO-

Tabelle 7

Physikalisch-chemische Eigenschaften der Verbindungen Ia und Ib

Natur

Verbindung Ia Verbindung Ib weisses Pulver weisses Pulver

(A)

F.

Mo (c 1,0, HaO) 25 TLC

n-BuOH-AcOH-H2O (63:10:27) Summenformel Massenspektrum 3o (m/z)

PMR (60 MHz in D2O) 8 in ppm

35

79-82 °C + 211° Rf 0,19

80-83 °C + 116° 0,15

OH

C15H29NO8

352 (M+ +1)

319

235

160

1,25 (3H, d) 1,28 (3H, d) 1,37 (3H, s) 3,03 (1H, d-d) 3,41 (3H, s) 3,46 (3H, s) 3,6-4,5 (6H, m) 4,90 (lH,d,J = 4,3 Hz) 4,98 (lH,d,J = 3,5Hz)

C15H29NO8

352 (M+ +1)

319

235

160

1,23 (3H, d) 1,26 (3H, d) 1,29 (3H,s) 3,07 (1H, d-d) 3,44 (3H, s) 3,54 (3H, s) 3,4-4,4 (6H, m) 4,50 (lH,d,J = 8,0Hz) 5,09(1 H,d,J = 3,5Hz)

Tabelle 8

Physikalisch-chemische Eigenschaften der Verbindungen IIa, lila und IIIb

Natur

IIa schwachgelber Sirup lila schwachgelber Sirup

IIIb schwachgelber Sirup

[a]D

+ 106° (c 0,2 MeOH)

+ 152° (c0,5,CHCb)

-33° (c 0,5,CHC13)

TLC: Rf

CHCb-MeOH-NHjOH (2:1:1)

0,67

0,35

0,32

niedere Phase

n-Bu0H-Ac0H-H20 (63:10:27)

0,20

0,47

0,40

Summenformel

C8H17NO4

C8H16O5

C8H16O5

PMR, 60 MHz in D2O 5 in ppm

1,26 (d, 3H, 6,4)*

1,27 (d, 3H, 6,7)

1,27 (s, 3H)

2,97 (d-d, 1H, 3,8 und 10,5)

1,34 (s, 3H)

1,28 (d, 3H, 6,5)

3,41 (s, 3H) -

3,38 (s, 3H)

3,45 (br-s, 1H)

3,43 (s, 3H)

3,48 (br-s, 1H)

3,52 (d,lH, 7,8)

3,45 (d-d, 1H, 3,0 und 10,5)

3,83 (d, 1H, 4,5)

3,60 (s, 3H)

4,00 (q,lH, 6,4)

4,18 (q,lH, 6,7)

4,00 (q,lH, 6,5)

4,02 (br-d, 1H, 3,0)

4,75 (d, 1H, 4,5)

4,39 (d,lH, 7,8)

4,72 (d, 1H, 3,8)

* (Multiplizität, Proton, J in Hz)

9

666 043

Biologische Eigenschaften

Die minimale Hemmkonzentration (MIC) von BBM-2478 wurde im Vergleich mit Chartreusin gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien und Fungi bestimmt, wie auch gegen einige anaerobe Organismen, durch die Methode der fortlaufenden Zweifach-Agarverdünnung. Das Agarnährmedium wurde für gram-positive und gramnegative Bakterien verwendet, GAM-Agar-Medium für anaerobe Bakterien und Sabouraud-Agar-Medium für Fungi. Wie die Tabelle 9 zeigt, wiesen BBM-2478A, B und Chartreusin ähnliche antibakterielle Spektren gegen gram-positive Bakterien und Anaerobe auf, während sie inaktiv waren gegen gram-negative Bakterien und Fungi. Die Antistaphylococcen-Aktivität von BBM-2478A war zweimal höher als diejenige von BBM-2478B oder Chartreusin.

Tabelle 9

Antibakterielle Aktivität von BBM-2478A und B

moraktivität. Die akute Toxizität von BBM-2478A wurde in Mäusen (DDY-Stamm) durch eine einzige intraperitoneale Verabreichung bestimmt, LDso betrug 38 mg/kg.

Tabelle 10

Wirkung von BBM-2478 auf P388-Leukämie

Testorganismus

MIC ftig/ml) BBM-2478B BBM-2478A

Chartreusin

Staphylococcus aureus

1,6

3,1

3,1

209P

Staphylococcus aureus

0,8

6,3

6,3

Smith

Bacillus subtilis PCI 219

0,8

0,8

0,4

Micrococcus luteus

0,8

3,1

0,8

PCI 1001

Micrococcus flavus D12

0,8

1,6

0,4

Escherichia coli NIHJ

100

>100

>100

Klebsiella pneumoniae

100

>100

>100

Dil

Pseudomonas

100

>100

>100

aeruginosa D15

Candida albicans IAM

>100

>100

>100

4888

Cryptococcus

>100

>100

>100

neoformans D49

Aspergillus fumigatus

>100

>100

>100

IAM 2530

Trichophyton

>100

>100

>100

mentagrophytes Dl55

Bacteroides fragilis

12,5

6,3

Clostridium difficile

12,5

25

Clostridium perfringens

6,3

1,6

Propionibacterium

6,3

3,1

acnes

20

30

Dosis, iP (mg/kg/d*)

MST (d)

T/C (%)

mittlere Gewichtsänderung Tag 5 (g)

Überlebende am

Tag 5 Tag 45

BBM-

3

20,0

222**

-1,0

5/5 0/5

2478 A

1

21,5

239**

+ 0,8

6/6 0/6

0,3

17,0

189**

+ 1,8

6/6 0/6

0,1

14,5

161**

+ 1,2.

6/6 0/6

0,03

10,0

111

+ 2,3

6/6 0/6

0,01

10,0

111

+ 2,0

6/6 0/6

Char

10

19,5

217**

+ 1,3

6/6 0/6

treusin

3

15,0

167**

+ 1,5

6/6 0/6

1

14,0

156**

+ 1,3

6/6 0/6

0,3

10,5

117

+ 2,0

6/6 0/6

0,1

9,0

100

+ 2,8

6/6 0/6

Träger

-

9,0

-

+ 2,4

12/120/12

* qd 1 —9 35 ** bedeutsamer Antitumor-Effekt

40

Tabellen

Wirkung von BBM-2478 auf L1210-Leukämie

45

Die Antitumoraktivität von BBM-2478A wurde in Mäusen im Vergleich mit Chartreusin gegen die lymphozytische Leukämie P388, die lymphoide Leukämie L1210 und das melanoti-sche Melanom B16 bestimmt. Die Tumore wurden intraperitoneal in BDFi-Mäuse implantiert, wobei das Inokulum jeweils eine Grösse von 104, 105 bzw. 106 Zellen pro Maus aufwies. Die Testverbindungen wuden in 0,9% Salzlösung mit 10% Dimethylsulfoxid aufgelöst, und die abgestuften Dosen des Antibiotikums wurden intraperitoneal 24 h nach der Tumorimplantation verabreicht. Die Behandlung wurde einmal täglich während 9 d durchgeführt (qd 1 —>• 9). Die Resultate sind in den Tabellen 10,11 und 12 dargestellt. BBM-2478A war 10—30 mal aktiver als Chartreusin bezüglich der minimalen effektiven Dosis und zeigte T/C-Werte, die denjenigen von Chartreusin gegenüber allen getesteten Tumoren überlegen waren. BBM-2478B erwies sich als frei von Antitu-

55

60

65

Dosis, iP (mg/kg/d*)

MST (d)

T/C (%)

mittlere Gewichtsänderung Tag 5 (g)

Überlebende am

Tag 5 Tag 45

BBM-

3

12,0

150**

-0,1

6/6 0/6

2478A

1

11,0

138**

+ 0,8

6/6 0/6

0,3

10,5

131**

+ 1,3

6/6 0/6

0,1

8,0

100

+ 2,6

6/6 0/6

0,03

8,0

100

+ 2,9

6/6 0/6

0,01

8,0

100

+ 3,2

6/6 0/6

Char

10

11,5

244**

+ 1,3

6/6 0/6

treusin

3

9,0

113

+ 1,4

6/6 0/6

1

9,0

113

+ 1,9

6/6 0/6

0,3

8,0

100

+ 3,2

6/6 0/6

0,1

8,0

100

+ 3,1

6/6 0/6

Träger

-

8,0

-

+ 2,8

12/120/12

* qd 1 -+9 ** bedeutsamer Antitumor-Effekt

666 043

10

Tabelle 12

Wirkung von BBM-2478 auf das B16-Melanom

Dosis, iP (mg/kg/d*)

MST (d)

T/C (%)

mittlere Gewichtsänderung Tag 5 (g)

Überlebende am

Tag 5 Tag 45

BBM-

3

41,5

296**

+ 1,5

6/6 0/6

2478A

1

34,5

246**

+ 2,2**

6/6 0/6

0,3

25,5

182**

+ 2,5

6/6 0/6

0,1

18,5

132**

+ 2,5

6/6 0/6

0,03

16,0

114

+ 2,0

6/6 0/6

Char

10

25,0

179**

+ 1,7

6/6 0/6

treusin

3

20,5

146**

+ 2,3

6/6 0/6

1

16,0

114

+ 2,3

6/6 1/6

0,3

14,0

100

+ 1,8

6/6 0/6

Träger

-

14,0

-

+ 2,3

10/100/10

* qd —► 9

** bedeutsamer Antitumor-Effekt

Wie vorstehend gezeigt, besitzt BBM-2478A und B eine potente antibakterielle Aktivität gegen aerobe gram-positive Bakterien und anaerobe Bakterien und ist folglich nützlich für die therapeutische Behandlung von Warmblütlern und anderen Tieren gegen infektiöse Leiden, die von solchen Bakterien verursacht werden. Zusätzlich können diese Verbindungen für andere konventionelle Anwendungen eingesetzt werden, z.B. als antibakterielle Mittel zur Desinfektion von medizinischen und zahnmedizinischen Ausrüstungen.

Die bedeutsame Antitumoraktivität, die BBM-2478A gegen experimentelle Mäusetumorsysteme zeigt, weist darauf hin, dass BBM-2478A ebenfalls therapeutisch nützlich ist für die Hemmung des Wachstums von Tumoren in Warmblütlern.

Die erfindungsgemässen Verbindungen können somit verwendet werden für die therapeutische Behandlung eines Wirtstieres, das eine bakterielle Infektion aufweist, indem dem Wirt eine antibakteriell wirksame Dosis BBM-2478A oder BBM-2478B oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon verabreicht wird. Zusätzlich können die erfindungsgemässen Verbindungen ebenfalls eingesetzt werden zur Behandlung eines Warmblütler-Wirts, der einen bösartigen Tumor aufweist, indem diesem Wirt eine tumorhemmende Dosis BBM-2478A oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon verabreicht wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame antibakterielle Anteile von BBM-2478A oder BBM-2478B in Kombination mit einem inerten pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel aufweisen. Ein weiterer Gegenstand ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine wirksame tumorhemmende Menge von BBM-2478A in Kombination mit einem inerten pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel aufweist. Diese Zusammensetzungen können in jede übliche pharmazeutische Form gebracht werden, die für eine parenterale Verabreichung geeignet ist.

Die erfindungsgemässen Zubereitungen für die parenterale Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nichtwäss-rige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können ebenfalls hergestellt werden in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einigen anderen sterilen injizierbaren Medien unmittelbar vor dem Gebrauch verdünnt werden können.

Es ist anerkannt, dass die jeweils bevorzugt eingesetzten Anteile der Antibiotika BBM-2478 je nach der besonderen Komponente, der besonders formulierten Zusammensetzung, der Art der Verabreichung und des besonderen Ortes, des Wirts und des behandelten Leidens variiert wird. Der Fachmann muss viele Faktoren in Betracht ziehen, welche einen Einfluss auf die Wirkung der Drogen ausübt, beispielsweise das Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Zeit der Verabreichung, Weg der Verabreichung, Ausmass der Ausscheidung, Bedingung des Wirts, Drogenkombinationen, empfindliche Reaktionen und Ernsthaftigkeit des Leidens. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis durchgeführt werden. Der optimale Applikationsgrad für einen vorgegebenen Satz von Bedingungen kann durch die Fachleute in üblicher Weise ermittelt werden, indem Dosierungsbestimmungstests im Hinblick auf die vorstehenden Richtlinien durchgeführt werden.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung. Temperaturangaben erfolgen in °C, wenn nicht anders angegeben. Amberlit CG-50 ist eine Warenmarke von Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pa., USA, für ein schwachsaures Kationenaustauscherharz des Carbonsäuretyps. Diaion HP-20 ist eine Warenmarke von Mitsubishi Chemical Industries, Japan, für ein nichtionisches grobmaschiges Polymerharz.

Beispiel 1

Fermentation von BBM-2478A und B

Eine gut bewachsene Neigeplatte mit dem Actinomycetes-Stamm Nr. J907-21 wurde verwendet, um ein vegetatives Medium, bestehend aus 3% löslicher Stärke, 1% Bacto-Leber (Difco), 0,5% Fischmehl, 0,3% NaCl, 0,1% (NHO2SO4 und 0,6% CaCOî zu inokulieren, wobei der pH-Wert vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt wurde. Das vegetative Medium wurde bei 28 °C während 72 h auf einem Rotationsschüttler (250 Umdrehungen/min) inkubiert, und 5 ml der Brühe wurden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben transferiert, der 100 ml Fermentationsmedium mit der gleichen Zusammensetzung wie das vegetative Medium enthielt. Die Fermentation wurde in einem Rotationsschüttler bei 28 °C während 7-10 d durchgeführt. Die antibiotische Aktivität in der Fermentationsbrühe wurde durch die Papier-Disc-Agar-Diffusionsme-thode unter Verwendung des Micrococcus luteus PCI 1001 als Testorganismus durchgeführt. Die Produktion'des Antibiotikums erreichte eine maximale Potenz von 150 |ig/ml nach 6-7 d Fermentation.

Beispiel 2

Isolierung und Reinigung von BBM-2478A und B

Die geerntete Brühe (201, pH-Wert 6,8), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde ein einen mycelischen Kuchen und einen Überstand aufgetrennt unter Verwendung einer Sharpless-Zentrifuge (Kokusan Nr. 4A). Der mycelische Kuchen wurde dreimal mit 5 1 Methanol gewaschen. Nach der Entfernung der unlöslichen Bestandteile durch Filtration wurden die methanolischen Extrakte vereinigt und im Vakuum zu einer wässrigen Lösung konzentriert. Der Überstand der Fermentationsbrühe wurde mit n-Butanol (201) extrahiert, und der Extrakt wurde im Vakuum zu einer wässrigen Lösung abgedampft. Die zwei wässrigen Konzentrate wurden vereinigt und auf eine Säule gegeben mit Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Industries, Tokyo, 0 5,5 x 60 cm), welche sukzessive mit Wasser (51), 50% wässrigem Methanol (51) und 80% wässrigem Methanol (61) entwickelt wurde. Die Fraktionen, die BBM-2478 enthielten, wurden ermittelt durch

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

666 043

den Papier-Disc-Test, unter Verwendung von B. subtilis M45 (Ree-) als Testorganismus. Die aktiven Fraktionen, welche mit 80% wässrigem Methanol extrahiert wurden, wurden vereinigt, unter reduziertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet, wobei 4,5 g eines gelben Feststoffes, dem rohen BBM-2478-KompIex, erhalten wurden. Der rohe Komplex wurde auf eine Silicagelsäule gegeben (0 3,5 x 55 cm), welche mit Chloroform vorgewaschen wurde, und die Aktivität durch eine Chloroform-Methanolmischung mit stufenweise zunehmender Methanolkonzentration (5-10% v/v) eluiert wurde. Die ersten aktiven Fraktionen, die durch 5% Methanol eluiert wurden, wurden gesammelt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei BBM-2478B (72 mg) erhalten wurde. Die zweiten aktiven Fraktionen, die bei 10% Methanol eluiert wurden, wurden in ähnlicher Weise aufgearbeitet, wobei das semi-reine feste BBM-2478A (2,51 g) erhalten wurde. Der letztgenannte Feststoff wurde weiter auf Silicagel 5 chroamtographiert, unter Verwendung der Mitteldruck-Flüssigchromatographie (Säule: Kiriyama 0 11 x 500 mm; Pumpe: FMI Laborpumpe, Druck 551-620 kPa [80-90 psi)]. Die Elution mit Chloroform-Methanol (97:3, v/v) ergab aktive Fraktionen, welche nach Konzentration im Vakuum io das homogene feste BBM-2478A (1,30 g) ergab. Dieser Feststoff wurde aus Methanol kristallisiert, wobei gelblich orange Stäbchen des BBM-2478A-Monohydrats erhalten wurden.

g

4 Blatt Zeichnungen

Claims (7)

1. 666 043

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Das Antibiotikum BBM-2478A der Formel

   HO

   HO-

   NH

   CH

   CH,0

   OH
2. 2. Das Antibiotikum BBM-2478B der Formel

   HO

   HOCH
3. 3. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BBM-2478A nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Actinomycetes-Stamm J907-21 mit der Hinterlegungs-Nr. ATCC 39417 in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis ein wesentlicher Anteil BBM-2478A durch diesen Mikroorganismus im genannten Kulturmedium produziert ist und dann BBM-2478A aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
4. 4. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BBM-2478B gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Actinomycetes-Stamm J907-21 mit der Hinterlegungs-Nr. ATCC 39417 in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert wird, bis ein wesentlicher Anteil BBM-2478B durch den Mikroorganismus produziert ist und dann BBM-2478B aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
5. 5. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen antibakteriell wirksamen Anteil BBM-2478A gemäss Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthält.
6. 6. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekenn-zichnet, dass sie einen antibakteriell wirksamen Anteil BBM-2478B gemäss Anspruch 2 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthält.
7. 7. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen tumorhemmenden Anteil BBM-2478A

   nach Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthält.