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CH648565A5 - Antitumorantibiotika und verfahren zu deren herstellung. - Google Patents

Antitumorantibiotika und verfahren zu deren herstellung. Download PDF

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CH648565A5
CH648565A5 CH10358/79A CH1035879A CH648565A5 CH 648565 A5 CH648565 A5 CH 648565A5 CH 10358/79 A CH10358/79 A CH 10358/79A CH 1035879 A CH1035879 A CH 1035879A CH 648565 A5 CH648565 A5 CH 648565A5
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
antibiotic
formula
mixture
compound
fermentation
Prior art date
Application number
CH10358/79A
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English (en)
Inventor
Giuseppe Cassinelli
Arpad Grein
Sergio Merli
Giovanni Rivola
Original Assignee
Erba Farmitalia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Anthracy-clinantibiotika, die als Antitumormittel und als antibakterielle Mittel wirksam sind, auf ein mikrobiologisches Verfahren zu ihrer Herstellung und auf sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue antibiotische Verbindungen zur Verfügung zu stellen, deren Wirksamkeit, sowie deren chemische und physikalische Eigenschaften von denjenigen der bisher bekannten und beschriebenen Antibiotika verschieden sind. Diese Aufgabe konnte durch die vorliegende Erfindung gelöst werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die antibiotischen Verbindungen W, Y und Z, die folgende Formel aufweisen:
OH
OK
0
H
NH
OH
Antibiotikum W R = -CO-CH2-OH Antibiotikum Y R = -CO-CH3 Antibiotikum Z R = -CH2-CH3
und deren Aglycone und nicht-toxische, pharmazeutisch verwendbare Säureadditionssalze.
Das Antibiotikum W wird als 1 l-Deoxy-14-hydroxy-car-minomycin, das Antibiotikum Y als 11-Deoxy-carmino-mycin und das Antibiotikum Z als 1 l-Deoxy-13-deoxo-car-minomycin bezeichnet.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung der neuen Antibiotika W, Y und Z, der Formel I, sowie der Verbindung X, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Streptomyces peucetius var. aureus, ATCC 31 428, unter aeroben Bedingungen einem wässerigen Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoff quelle und Mineralsalze enthält, kultiviert wird.
Der beim erfindungsgemässen Verfahren verwendete Mikroorganismus wird durch mutagene Behandlung von
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Streptomyces peucetius var. caesius (Arcamone et al., Bio-technol. Bioengeen., XI, 1969,1101-1110) mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erhalten. Dem so erhaltenen neuen Stamm wurde die Code-Nr. 416 F.I., der Farmitalia-Samm-lung von Mikroorganismen gegeben, und er wurde am 7. September 1978 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter der Nummer ATCC 31 428 hinterlegt. Überdies wurde der Mikroorganismus ebenfalls bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nr. DSM 1367, und beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Nr. F.R.I. 4622 hinterlegt.
Wie bei vielen Antibiotika bildenden Kulturen, führt die Fermentation des Stammes ATCC 31 428 im erfindungsge-mässen Verfahren zur Bildung einer Mischung oder eines Komplexes von antibiotischen Komponenten. Es konnten vier bioaktive Anthracyclinkomponenten, nämlich die Antibiotika W, X, Y und Z, aus dem durch die Fermentation gebildeten Komplex abgetrennt werden.
Die neuen Antibiotika können in verdünnter Form, als rohe Konzentrate oder in reinen kristallinen Formen vorliegen.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die aus einem oder mehreren der antibiotischen Verbindungen W, Y und Z in Mischung mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger besteht.
Wie aus Formel (I) ersichtlich, sind die Verbindungen W, Y und Z Anthracyclinglycoside mit einem Gehalt an Dau-nosamin (3-Amino-2,3,6-trideoxy-L-lyxohexose), der Ami-nozuckerkomponente von Daunomycin und Adriamycin (F. Arcamone, G. Cassinelli, P. Orezzi, G. Frachceschi und R. Mondelli, J. Am. Chem. Soc. 86, 5335, 1964, und die eigene US-PS 3 590 028). Die Strukturen der Komponenten wurden durch Analyse ihrer IR-, UV-, sichtbaren, Masse-und NMR-Spektren bestimmt und stimmen mit den im folgenden angegebenen chemischen und physikalischen Daten überein.
Der neue Anthracyclinkomplex und seine einzelnen Komponenten bilden sowohl mit Säuren als auch mit Basen Salze und somit fallen pharmazeutisch annehmbare Salze des Komplexes und der Komponenten unter den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Beispiele derartiger pharmazeutisch verwendbarer Salze sind Salze mit Säuren, wie Salzsäure, s Schwefelsäure, Salpetersäure und Phosphorsäure, und mit Metallkationen, z.B. Alkalimetall- oder Erdalkalimetallkationen, wie Natrium, Kalium, Kalzium und Magnesium, und auch mit anderen Kationen, wie dreiwertigen Eisenkationen. Die Herstellung der neuen Anthracyclinantibiotika der vor-lo liegenden Erfindung wird im nachstehenden beschrieben.
Mikroskopische Eigenschaften des Stammes 416 F.I.
Das Substratmycel wird durch deutlich verzweigte Hyphen, 0,5 bis 0,9 (im im Durchmesser, variabler Länge ls gebildet; das Luftmycel, das aus ersterem entsteht, wird von ziemlich langen, geraden bis gewundenen Hyphen, 1,1 bis 1,6 (im im Durchmesser, gebildet; von diesen führen durch Scheinachsenverzweigung in Büschelform sporentragende Hyphen unterschiedlicher Länge weg, die in Haken oder 20 Schleifen enden. Die Sporen sind sphärisch und im Durchmesser 1 bis 2 [im, zuerst sind sie in Ketten angeordnet und dann frei. Unter dem Elektronenmikroskop scheinen die Sporen nahezu sphärisch mit unregelmässigen Konturen und mit einer warzigen Oberfläche zu sein.
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Makroskopische Eigenschaften des Stammes 416 F.I.
Die Kultureigenschaften des Stammes 416 F.I. sind in Tabelle I angegeben.
Das Wachstum ist sowohl auf organischen als auch auf 30 synthetischen Medien im allgemeinen gut. Das Wachstum auf den in Tabelle I angegebenen Medien wurde ab dem 5. Tag der Inkubation bei 28°C bis zum Ende desselben beobachtet.
Die biochemischen und physiologischen Eigenschaften des 35 Stammes 416 F.I. sind in Tabelle II angegeben.
Bei einer Temperatur über 40°C wurde kein Wachstum festgestellt.
Sklerotienbildung wurde auf den in Tabelle I angegebenen Medien nicht festgestellt.
Tabelle I
Kultureigenschaften des Stammes 416 F.I.
Medium
Substratmycel
Luftmycel lösliche Pigmente
Bennett's-Agar (Waksman, 1961)
Czapek's-Agar (Waksman, 1961)
Asparagin-Glucose-Agar (Waksman, 1961)
Glycin-Glycerin-Agar (Waksman, 1961)
Emerson's-Agar (Waksman, 1961)
anorganische Salze-Stärke-Agar (Pridham et al., 1957)
Kartoffel-Glucose-Agar Wachstum reichlich, leicht erhaben, hell-orange gefärbt (Waksman, 1961)
Wachstum reichlich, leicht lichenoid, stroh- bis zitronengelb gefärbt gutes Wachstum, flach, kompakt, farblos
Wachstum reichlich, flach, kompakt, zitronengelb gefärbt reichliches Wachstum, erhaben und starr, Kolonien manchmal kraterartig, zitronengelb-orange reichliches Wachstum, erhaben und gefurcht, kraterähnlich; honigfarben reichliches Wachstum, flach, strohgelb gefärbt
Asparagin-Glycerin-Agar (Waksman, 1961)
Hefeextrakt-Glucose-Agar (Waksman, 1961)
Wachstum reichlich, erhaben und gefurcht, kraterähnliche Kolonien, zitronengelb gefärbt
Wachstum reichlich, erhaben und gefurcht, Kolonien kraterähnlich, strohgelb gefärbt keines reichlich, grau reichlich, grau-blau-grün keines keines zitronengelb strohgelb zitronengelb bis leicht grün zitronengelborange gelb reichlich-grau-grün strohgelb massig, grau keines keines zitronengelb-ok-ker zitronengelb gelb
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Tabelle I (Fortsetzung)
Kuitureigenschaften des Stammes 416 F.I.
Medium Substratmycel Luftmycel lösliche Pigmente
Stärke-Kasein-Agar Wachstum reichlich, flach, strohgelb gefärbt grau strohgelb
(Waksman, 1961)
SA-Agar* Wachstum reichlich, erhaben und gefurcht, strohgelb grau mit blaugrünen strohgelb gefärbt Tönungen
* Zusammensetzung siehe Aufrechterhaltungsmedium in Beispiel 1
Waksman S.A. «The Actinomycetes», Bd. II, 1961, William Wilkins Co., Baltimore;
Pridham T. G., Anderson P., Foley C., Lindenfelser L. A., Hesseltine C. W. und Benedict R. G. « A selection of media for maintenance and taxonomic studies of Streptomyces Antibiotics Ann. 1956/1957,947-953.
Tabelle II
Physiologische und biochemische Eigenschaften des Stammes 416 F.I. *
Verwertung von Glucose +
Verwertung von Saccharose -
Verwertung von D-Xylose +
V erwertung von Mannit —
Verwertung von m-Inosit +
Verwertung von L-Arabinose +
Verwertung von D-Fructose +
Verwertung von Adonit —
Verwertung von Lactose -
Verwertung von d(+)-Mannose +
Verwertung von Maltose +
Verwertung von Raff mose -
Verwertung von L-Rhamnose —
Verwertung von a,a-Trehalose +
Verwertung von Äskulin +
Verwertung von Glycerin +
Verwertung von Na-Citrat +
Verwertung von NHU-Succinat +
Verwertung von N a-Acetat -
Verwertung von NHU-Tartrat -
Verwertung von Glykogen +
Verwertung von Paraffin -
negative Kontrolle -
Verflüssigung von Gelatine +
Tyrosinzersetzung +
Melaninbildung —
Stärkehydrolyse +
EhS-Bildung +
Nitratreduktion +
Milch (Pepton und koag.) +
gebildete Antibiotika: neue Anthracycline
+ = positive Reaktion - = negative Reaktion
* = Das für den Kohlehydratverwertungstest verwendete Medium ist das von R. D. Gordon und M. L. Smith: J. Bacte-riology 69,1955, S. 147 bis 150, beschriebene. Die für die anderen physiologischen Reaktionen verwendeten Medien sind jene, die von S.A. Waksman «The Actinomycetes», Bd. II, 1961, The Williams Wilkins Company, Baltimore, angegeben wurden.
Identifizierung und Klassifikation des Stammes 416 F.I. 15 Die von Stamm 416 F.I. gezeigten Gesamteigenschaften entsprechen klar jenen, die für die Art Streptomyces Waksman et Henrici angegeben wurden. Weiterhin entsprechen die morphologischen, Kultur- und physiologischer Eigenschaften des Stammes 416 F.I. jenen, die für die Specie 20 Streptomyces peucetius var. caesius beschrieben wurden (US-PS 3 590 028; Arcamone et al., Biotechnol. Bioengeen., XI, 1969,1101-1110), von dem er sich aber trotzdem wegen seiner Fähigkeit unterscheidet, ein gelbes lösliches Pigment zu bilden, weil er m-Inosit, L-Arabinose und Äskulin ver-25 wertet, während er Saccharose, Mannit und Raffinose nicht verwertet, und schliesslich, weil er neue Anthracyclinantibio tika bildet.
Der Stamm 416 F.I. ist somit eine Varietät von Strepto-30 myces peucetius var. caesius, der die Bezeichnung Streptomyces paucetius var. aureus gegeben wurde.
Fermentierungsverfahren
Die Produktion erfolgt in der Regel durch Kultivieren des 35 mutierten Mikroorganismus in einem vorher sterilisierten flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37°C (vorzugsweise bei 28°C) während eines Zeitraumes von 3 bis 7 Tagen (vorzugsweise 5 Tagen) und bei einem pH-Wert von anfänglich 6,5 bis 7,0 40 und am Ende des Fermentierungsverfahrens von 6,5 bis 8,0. Das Kulturmedium enthält Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze.
Die Kohlenstoffquelle kann beispielsweise Stärke, Dex-4strin, Glucose, Glycerin, Mannit, Maltose, Getreideweiche, Trebern, Sojabohnenöl oder Sojabohnenmehl sein. Die Stickstoffquelle kann ausser den obenerwähnten Kohlenstoffquellen, die Stickstoff enthalten, beispielsweise Trockenhefe, Fleischpepton oder Kasein sein. Gute Ergebnisse so werden sogar durch Verwendung von Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfaten und Diammoniumphosphaten, erhalten. Die für die Produktion verwendbaren Mineralsalze können je nach dem verwendeten Medium variieren. So erwies sich in einem Medium, 55 das komplexe Substanzen, wie verschiedene Mehle und Fermentationsrückstände enthält, der Zusatz von Kalziumcar-bonat und Natrium- oder Kaliumphosphaten als zweckmässig. In Medien, die Glucose oder Ammoniumsalze enthalten, sind höhere Mengen an Mineralsalzen von Kalium, 60 Natrium oder Kalzium erforderlich und zusätzlich Mikro-mengen von Metallsalzen, wie Eisen-, Zink-, Kupfer-, Magnesium- und Mangansalzen. Der Zusatz von schwefelhaltigen Verbindungen, wie Sulfanilamid, Sulfathiatzol, Sul-fapyridazin, Penthiobarbital und Äthionin kann ebenfalls 65 zweckdienlich sein.
Die Fermentierung kann in Erlenmeyer-Kolben oder in Laboratoriums- oder Industriefermentern mit verschiedenem Fassungsvermögen durchgeführt werden.
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Analytische Methoden
Als Proben der Fermentationsbrühen und roher Zubereitungen unter Verwendung von Whatman Nr. 1-Papier, gepuffert mit M/15 Phosphatpuffer auf pH 5,4 der Papierchromatographie unterworfen wurden, wobei als Eluierungs-mittel eine Mischung von n-Propanol:Äthylacetat: Wasser (7:1:2) verwendet wurde, und der Papierstreifen gegen Bacillus subtilis bioautographiert wurde, wurde gefunden, dass vier Hauptkomponenten wiederkehren, und diese wurden als Antibiotikum W (Rf 0,45), Antibiotikum X (Rf 0,60), Antibiotikum Y (Rf 0,64) und Z (Rf 0,70) bezeichnet. Auch zwei geringere Komponenten kehrten wieder und diese wurden als Glycoside A und C (Rf 0,30 bzw. 0,55) identifiziert, wie in der eigenen GB-Anmeldung 5246/78 beschrieben.
Eine quantitative Bestimmung aller in den Fermentationsbrühen vorhandenen gelben Bestandteile kann nach folgender Methode durchgeführt werden. Zu einer Probe der Brühe, auf einen pH-Wert von 8,6 eingestellt, werden zwei Volumina Chloroform: Methanol (9:1) zugesetzt und die erhaltene Mischung 1 min bei Raumtemperatur mit Schall behandelt. Dann kann an einer Probe der organischen Phase, die mit saurem Methanol verdünnt ist, der Gesamtgehalt der gelben Anthracycline und ihrer Aglycone bei 430 nm spektro-photometrisch bestimmt werden. An einer Probe der organischen Phase, die unter vermindertem Druck konzentriert wurde, kann die quantitative Bestimmung der einzelnen Antibiotika durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung des oben angegebenen Systems erfolgen. Die verschiedenen gelb-gefärbten Zonen werden abgekratzt und mit Methanol eluiert. Jeder Bestandteil wird spektropho-tometrisch bei 430 nm bestimmt. Das Antibiotikum Y ist gewöhnlich der Hauptbestandteil in den Fermentationsbrühen.
Isolierverfahren
Nach Beendigung der Fermentation sind die aktiven Verbindungen in den Mycelen und in den Fermentationsflüssigkeiten vorhanden. Diese Anthracyclinantibiotika können bei pH 8,5 bis 9,0 als freie Basen aus der Kulturbrühe «in toto» mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Methylisobutylketon, Chloroform, Methylendichlor und Äthylacetat, extrahiert werden. Vorzugsweise werden die Mycele und die Fermentationsflüssigkeiten durch Filtrieren bei pH 4 mit Hilfe von Diatomeenerde getrennt und dann separat extrahiert.
Der Filtrationskuchen wird mit einem wasserlöslichen Lösungsmittel, wie Aceton und nied. Alkoholen, vorzugsweise mit Methanol, extrahiert.
Die Mycelextrakte werden gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert.
Das Konzentrat wird mit der filtrierten Brühe vereinigt, auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9 eingestellt und dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder n-Butanol, extrahiert. Die Extrakte werden unter vermindertem Druck konzentriert und die Anthracyclinantibiotika können durch Zusetzen des fünffachen Volumens an n-Hexan ausgefällt werden. Die Bestandteile der rohen Mischung können fraktioniert und durch Säulenchromatographiemethoden gereinigt werden.
Reinigungsverfahren
Die weitere Reinigung sowie die Trennung in die vier Komponenten, nämlich die Antibiotika W, X, Y und Z, kann durch Säulenchromatographie auf Silikagel bewirkt werden. Das rohe orange-braune Pulver wird in Chloroform gelöst und die Lösung auf gepuffertem Silikagel mit einem Gradienten Chloroform: Methanol: Wasser chromatographiert. Zuerst wird das Antibiotikum Z mit einer Mischung 94,8:5:0,2 und dann das Antibiotikum Y mit einer Mischung s 92,2:7,5:0,3 eluiert; das Antibiotikum X wird mit einer Mischung 89,5:10:0,5 und das Antibiotikum W mit einer Mischung 300:55:6 eluiert. Die Komponenten werden wie üblich getrennt, wie durch Papier- und Dünnschichtchromatographie gezeigt, und die Antibiotika W, Y und Z werden als io Hydrochloride in kristalliner Form durch Zusetzen eines Äquivalents von methanolischem Chlorwasserstoff erhalten.
Chemische und physikalische Eigenschaften
Die Antibiotika W, X, Y und Z zeigen einige Eigen-i5 schaften, die bei bekannten Anthracyclinantibiotika üblich sind, doch können sie auf Grund ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften unterschieden werden.
Alle neuen Anthracycline weisen ähnliche Löslichkeit auf; als freie Basen sind sie in Chloroform, Methylendichlorid, 20 Aceton, Methanol, Äthanol, wässerigen Alkoholen, angesäuertem Wasser, Dioxan und Pyridin löslich, während sie in Diäthyläther, n-Hexan, Cyclohexan und Petroläther kaum löslich oder unlöslich sind. Als Hydrochloride sind sie in Wasser, Methanol, Äthanol und wässerigen Alkoholen 25 löslich und in Aceton, Benzol, Chloroform, Diäthyläther und Petroläther unlöslich. Die neuen Verbindungen können als Indikatoren verwendet werden, wobei sie in neutralen und in sauren Lösungen orange-gelb sind, in welchen sie unter UV-Licht auch grünlich-gelbe Fluoreszenz zeigen. Ihre alkali-30 sehen Lösungen sind rotbraun und, wenn sie mit alkoholischem Magnesiumacetat behandelt werden, ergeben sie orangerote Lösungen. Alle diese Eigenschaften und die Absorptionsspektren in den UV- und sichtbaren Regionen zeigen, dass diese neuen Verbindungen der Gruppe der Anthracyclin-35 antibiotika angehören.
Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der drei Hauptkomponenten, nämlich der Antibiotika W, Y und Z, als Hydrochloride isoliert, sind in Tabelle III angegeben.
Die Antibiotika W, X, Y und Z sind Glycosidverbin-dungen, die von einem tetracyclischen Aglycon (Anthracy-clinon) und einem Aminozucker gebildet werden. Beispielsweise ergibt Säurehydrolyse des Antibiotikums Y mit 0,2n Salzsäure während 25 min bei 90°C ein wasserunlösliches Aglycon in Form von gelborangefarbenen Nadeln, Fp. 168°C; UV-Spektrum 227,258,430 nm (E^ = 880, 560,263); IR-Spektrum (KBr): 3430,2920,1710,1670,1620, 1470, 1450, 1420,1385, 1355, 1285,1260, 1210, 1185, 1160, 1125,1085,1040, 1015,982,930,900,885,860 und 835 cm"1.
Das Aglycon des Antibiotikums Y weist eine empirische Formel entsprechend C20H16O7 auf; MG 368,22. Das Molgewicht wurde durch Massenspektroskopie bestätigt; m/e 368 (M+), 332 (M-2 H2O), 317 (M-2 H2O-CH3) und 289 (M-2 H2O-COCH3).
Säurehydrolyse der anderen gereinigten Antibiotika ergibt drei verschiedene gelbe Aglycone, die durch ihr chromatographisches Verhalten charakterisiert und identifiziert wurden, wie in Tabelle IV angegeben.
Die wässerigen löslichen Fraktionen der Säurehydrolyse 60 aller gereinigten Antibiotika W, X, Y und Z enthalten einen reduzierenden Aminozucker mit dem gleichen chromatographischen Verhalten wie Daunosamin (3-Amino-2,3,6-tri-deoxy-L-lyxohexose), die Aminozuckerkomponente von Daunomycin und Adriamycin. Die Ausdrücke «Dauno-65 myein» und «Adriamycin» sind eigene Markennamen, die hier für Daunorubicin und Doxorubicin verwendet werden.
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Tabelle III
Chemische und physikalische Eigenschaften der Antibiotika W, Y und Z
Eigenschaft
Antibiotikum W.HC1
Antibiotikum Y.HC1
Antibiotikum Z.HC1
Fp.
208-210°C (Zers.)
195-196°C (Zers.)
200-201°C (Zers.)
Md (c = 0,1 in MeOH)
+ 130°
+ 150°
+ 134°
UV sichtbares Spektrum
1 MeOH ^max
228,258,430 nm
228,258,430 nm
228,258,430 nm
C'I cm
650,435,217
670,440,208
660,430,216
ï 0,01 nNaOH ^rriax
520 nm
520 nm
520 nm
e 1% c'l cm
152
150
150
IR-Spektren (KBr):
cm-1
3700-2600
1180
3700-2600
1162
3650-2500
1158
1720
1155
1710
1118
1665
1115
1670
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1085
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1245
750
1230
780
1215
440
1215
755
450
Empirische Formel
C26H27NO10-HC1
C26H27N09-HC1
C26H29N08-HC1
Molgewicht, durch
564
548
534 .
Massespektroskopie bestätigt
Tabelle IV
Dünnschichtchromatographie Rf-Werte der Aglycone auf 0,25 mm dicken Silikagel 60-F-254-Platten (Merck): Lösungsmittel 1: Chloroform-Aceton 4:1 Lösungsmittel 2: Methylendichlorid-Methanol 97:3
Tabelle V
Testorganismus
MIC in g/ml
40
Antibio- Anfibio- Antibio-
Verbindung
Lösungsmittel 1
Lösungsmittel 2
Aglycon des Antibiotikums W
Rf0,15
Rf 0,30
Aglycon des Antibiotikums X
Rf0,ll
Rf 0,20
Aglycon des Antibiotikums Y
Rf0,50
Rf 0,62
Aglycon des Antibiotikums Z
Rf 0,42
Rf0,56
Staphylococcus aureus 209 P Sarcina lutea ATCC 9341 45 Bacillus subtilis ATCC 6633 Escherichia coli B
tikum W
tikum Y
tikum Z
25
25
100
12,5
3,12
6,25
50
12,5
25
12,5
6,25
25
50
Biologische Aktivitätsdaten a) Antibakterielle Wirksamkeit Die minimalen Hemmungskonzentrationen (MIC) der Antibiotika W, Y und Z als Hydrochloride in vitro, bestimmt für einige Mikroorganismen unter Verwendung der Stan- ss dardrohrverdünnungsmethode, sind in Tabelle V angegeben.
b) Antitumorwirksamkeit
Die neuen Antibiotika W, Y und Z wurden gegen HeLa-Zellen in vitro (Zeit, während der sie den Heilmitteln ausgesetzt waren: 24 h) und an L 1210 und P 388-Leukämie an Mäusen im Vergleich mit Daunorubicin (Daunomycin) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben.
Tabelle VI
Verbindung
Effekt auf HeLa-Zellen (a) Entwicklungsfähigkeit in vitro ID5ong/ml
Dosis mg/kg L-1210 (b)
P-388 (b)
T/C% Toxische T/C% Toxische
Todesfälle (c) Todesfälle (c)
Daunorubicin.HCl (Daunomycin)
7,5
2,9 4,4 6,6
144-150 140-162 144-162
1/20 3/19
170 175 160
2/8 6/8 7/8
7
Tabelle VI (Fortsetzung)
648565
Verbindung
Effekt auf HeLa-Zellen (a) Entwicklungsfähigkeit in vitro IDwng/ml
Dosis mg/kg L-1210 (b)
T/C %
P-388 (b)
Toxische T/C% Todesfälle (c)
Toxische Todesfälle (c)
Antibiotikum W.HC1
8,8
1,0
159
0/10
(IMI-103)
1,5
172
0/20
2,25
163
0/20
3,4
190
0/10
5,0
204
1/9
Antibiotikum Y.CHI
9,6
0,8
111
(IM 1-86)
1,2
128
145
1,9
122
159
2,9
111
8/10
Antibiotikum Z.HC1
15,0
1,0
140
(IMI-87)
2,0
140
2,9
125
4,4
131
2/10
100
7/8
6,6
137
5/10
lui HeLa-Zellen waren den Heilmitteln 24 h lang ausgesetzt, dann wurden sie plattiert, ibi Maust' wurden am 1. Tag nach der Tumorzelleninokulation i.p. behandelt.
c) Auf Grund makroskopischer Ergebnisse berechnet.
Beispiel 1
Eine Kultur von Streptomyces peucetius var. aureus Stamm 416 F.I. wurde 14 Tage lang bei 28°C auf Agarschräg-hängen des Mediums SA folgender Zusammensetzung gezüchtet: Glucose 3%, Brauerei-Trockenhefe 1,2%, Natriumchlorid 0,1%, Monokaliumdihydrogenorthophosphat 0,05%, KalziumcarbonatO,l%, Magnesiumsulfat 0,005%, Eisen(II)sulfatheptahydrat 0,0005%, Zinksulfathpetahydrat 0,0005%, Kupfersulfatpentahydrat 0,0005%, Agar 2%, Leitungswasser auf 100 ml, pH 6,7. Die Sterilisierung erfolgte durch Erhitzen in einem Autoklaven auf 115°C während 20 min.
Die Sporen der so erhaltenen Kultur wurden gesammelt und in 3 ml sterilem destillierten Wasser suspendiert; die so erhaltene Suspension wurde in 300 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einem Gehalt an 60 ml des folgenden flüssigen Wachstumsmediums angeimpft: Brauerei-Trockenhefe 0,3%,
Pepton 0,5%, Kalziumnitrattetrahydrat 0,05%, Leitungswasser auf 1000 ml. Die Sterilisierung erfolgte durch Erhitzen in einem Autoklaven auf 120°C während 20 min. Der pH-Wert dieses Mediums nach Sterilisierung betrug 6,8 bis 7,0.
Die angeimpften Kolben wurden 2 Tage bei einer Temperatur von 28°C auf einem Rotationsschüttler, der mit 250 Upm betrieben wurde und einen Umkreis von 7 cm im Durchmesser beschrieb, geschüttelt. 1,5 ml jeder der oben gezüchteten Kulturen wurden in 300 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einem Gehalt an 50 ml des folgenden Produktionsmediums angeimpft: Glucose 6%, Brauerei-Trockenhefe 3%, Natriumchlorid 0,2%, Monokaliumdihydrogenorthophos-phat0,l%, Kalziumcarbonat 0,2%, Magnesiumsulfat 0,01%, Eisen(II)sulfatheptahydrat 0,001%, Zinksulfatheptahydrat 0,001%, Kupfersulfatpentahydrat 0,001%, Leitungswasser auf 100 ml, pH 6,7. Die Sterilisierung erfolgte durch Erhitzen in einem Autoklaven auf 115°C während 20 min. Die so angeimpften Kolben wurden 7 Tage lang bei 28°C unter identischen Bedingungen, wie sie oben für die Samenphase angegeben sind, bebrütet.
In der 24. Fermentationsstunde wurde ein Zusatz von Sul-fanilamid in einer Konzentration von 0,5 g/1 zu jedem
Kolben vorgenommen. In der 48. Fermentationsstunde 30 erfolgte ein weiterer Zusatz dieser Substanz in einer Konzentration von 1 g/1 zu jedem Kolben.
Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen wurde zwischen dem 6. und 7. Tag der Fermentation mit einer Produktion von 70 mcg/ml erzielt.
Beispiel 2
Die Kultur des Stammes 416 F.I. wurde, wie in Beispiel 1 40 beschrieben, erhalten. Die Sporen der drei Schräghänge wurden zusammengegeben und in 10 ml sterilem destillierten Wasser gesammelt; die so erhaltene Suspension wurde in einem 21-Kolben mit rundem Boden, der mit Scheidewänden versehen war und 500 ml des in Beispiel 1 beschriebenen 45 Samenmediums enthielt, angeimpft. Der Kolben wurde 48 h auf einem Rotationsschüttler, der mit 120 UpM betrieben wurde und einen Umkreis von 70 mm im Durchmesser beschrieb, bei einer Temperatur von 28°C bebrütet.
Der gesamte Samen wurde in einem rostfreien 801-Stahl-50 fermenter mit einem Gehalt an 50 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Produktionsmediums angeimpft, wobei durch Erhitzen auf 120°C während 30 min sterilisiert wurde. In der 24. Fermentationsstunde erfolgte ein Zusatz von Sulfanil-amid in einer Konzentration von 0,5 g/1. In der 48. Fermen-55 tationsstunde erfolgte ein weiterer Zusatz dieser Substanz in einer Konzentration von 1 g/1. Die Fermentation wurde bei 28°C unter Rühren bei 230 UpM durchgeführt und es wurde mit einem Luftstrom von 0,71/1 Medium/min belüftet.
Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen 60 wurde zwischen dem 6. und 7. Tag der Fermentation erreicht; Produktion 50 mcg/ml.
Beispiel 3
65 Beispiel 2 wurde wiederholt, wobei jedoch keine Sulfanil-amidzusätze erfolgten. Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen wurde zwischen dem 6. und 7. Tag der Fermentation mit einer Produktion von 5 mcg/ml erzielt.
648565
8
Beispiel 4
Die gesamte Brühe (301) von einer gemäss Beispiel 2 erzielten Fermentation wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa 4 eingestellt und unter Verwendung von 3%iger Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert, wobei ein Kuchen und ein Filtrat erhalten wurden, die getrennt extrahiert wurden.
Der nasse Filterkuchen wurde mit etwa 15 ml Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt und dann mit der filtrierten Brühe vereinigt. Die Mischung wurde auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann zweimal mit einem halben Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, auf wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Durch Zusetzen von 11 n-Hexan fiel die rohe glycosidische Fraktion als gelbbraunes Pulver (1,5 g) aus.
Beispiel 5
Eine Chloroformlösung der rohen Glycoside in Form der freien Basen (1,5 g in 30 ml) wurde auf eine mit M/15 Phosphatpuffer auf pH 7 gepufferte Silikagelsäule, hergestellt in Chloroform, aufgebracht. Die Säule wurde mit Chloroform gewaschen und mit einem Gradienten einer Chloroform-Methanol-Wassermischung eluiert.
Unter Verwendung einer 92,2:3,5:0,2 Mischung wurden einige gelbgefärbte Aglycone und danach das Antibiotikum Z eluiert. Die Eluierung mit einer 92,2:7,5:0,3 Mischung ergab das Antibiotikum Y, die Eluierung mit einer 89,5:10:0,5 Mischung das Antibiotikum X, worauf das Antibiotikum W unter Verwendung einer 300:55:6 Mischung eluiert wurde. Die die reinen Komponenten enthaltenden Fraktionen wurden auf kleine Volumina eingeengt, mit Wasser verdünnt, auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann mit Chloroform extrahiert. Nach Waschen s mit Wasser wurden die organischen Extrakte auf Natriumsulfat getrocknet und dann auf ein kleines Volumen eingeengt. Der Zusatz eines Äquivalents an methanolischem Chlorwasserstoff ergab praktisch reine Hydrochloride des Antibiotikums Z (0,04 g), des Antibiotikums Y (0,2 g), des io Antibiotikums X (0,02 g) und des Antibiotikums W (0,03 g) als mikrokristalline Pulver. Durch Umkristallisieren der Antibiotika W, Y und Z aus Methanol: n-Butanol wurden dit entsprechenden reinen Hydrochloride als gelborangefarbene Kristalle erhalten, Fp. 208 bis 210°C (Zers.) für das Antibio-15 tikum W, Fp. 195 bis 196°C (Zers.) für das Antibiotikum Y und Fp. 200 bis 201 °C (Zers.) für das Antibiotikum Z.
Beispiel 6
Eine 20 mg-Probe des Antibiotikums W wurde in 1 ml 0,2r 2o wässeriger Salzsäure gelöst und die Lösung 25 min auf 90°C erhitzt. Ein kristalliner gelb-orangefarbener Niederschlag wurde nach Abkühlen durch Filtrieren gesammelt, dann mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxyd über Nacht unter Vakuum getrocknet. 10 mg des Aglycons des Antibioti-2s kums Y wurden auf diese Weise in reiner Form erhalten, Fp. 168°C, m/e 368 (M+). Nach der Ausfällung des Aglycons ent hielt die fast farblose wässerige saure Lösung eine Verbindung, die eine Fehling-Lösung reduzierte und mit Ninhydrin eine positive Reaktion ergab. Durch Dünnschicht- und 30 Papierchromatographie der Verbindung war sie von einer authentischen Probe von Daunosamin (3-Amino-2,3,6-tri-deoxy-L-lyxohexose), der Aminozuckerkomponente von Daunomycin und Adriamycin, nicht unterscheidbar.
B

Claims (12)

  1. 648565
  2. 2. Antibiotische Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R in der Formel I-CO-CH2-OH bedeutet und deren Aglycon.
    2
    PATENTANSPRÜCHE 1. Antibiotische Verbindungen W, Y und Z der Formel
    0
    OH
    OH
    «
    0
    NH
    OH
    worin R für W -CO-CH2-OH, für Y -CO-CH3 und für Z -CH2-CH3 bedeutet, deren Aglycone und deren nichttoxische pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze.
  3. 3. Antibiotische Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R in der Formel I-CO-CH3 bedeutet und deren Aglycon.
  4. 4. Antibiotische Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R in der Formel I-CH2-CH3 bedeutet und deren Aglycon.
  5. 5. Antibiotische Verbindung der Formel I, gemäss Anspruch 1, in Form eines nicht-toxischen pharmazeutisch annehmbaren Sèureadditionssalzes einer Verbindung der Formel I.
  6. 6. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung einer antibiotischen Mischung, enthaltend die Verbindungen W, Y und Z, der Formel I nach Anspruch 1, sowie Verbindung X, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces peucetius var. aureus, ATCC 31 428, unter aeroben Bedingungen in einem wässerigen Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, kultiviert wird.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur von 25-37°C bis 3-7 Tage lang bei einem Ausgangs-pH-Wert von 6,5-7,0, und am Ende des Fermentationsverfahrens von 6,5-8,0 durchgeführt wird.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die antibiotische Mischung aus der Fermentationsmasse, dem abgetrennten Mycel oder der filtrierten Brühe extrahiert wird.
  9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltene antibiotische Mischung durch Säulenchromatographie auf Kieselsäuregel in seine vier antibiotischen Antracyclinkomponenten, die Glycoside W, X, Y und Z, getrennt wird.
  10. 10. Antibiotische Verbindung X, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 9.
  11. 11. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer oder mehreren der antibiotischen Verbindungen W, Y und Z der Formel I, nach Anspruch 1, in
    Mischung mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger besteht.
  12. 12. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus der antibiotischen Verbindung X nach Anspruch 10 in Mischung mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger besteht.
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