CH658728A5 - Process for the production of particulate reagents for immunoassays, and these reagents and their use - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von teilchenförmigen, magnetisch anziehbaren Reagenzien für Immunoassays sowie auf diese Weise hergestellte Reagenzien und immunologische Bestimmungen (Assays) unter Verwendung dieser Reagenzien.
Bekanntlich lassen sich Antigene (und Haptene), Antikörper (und andere bindende Proteine) sowie weitere Substanzen, wie Arzneimittel, in Flüssigkeiten von beispielsweise biologischer Herkunft, durch eine kompetitive Bindungsreaktion unter Verwendung eines markierten Reagenzes bestimmen, wobei die Bestimmung (der Assay) dadurch bewirkt wird, dass man entweder die Menge an Markierung misst, die in einem Komplex gebunden vorliegt, oder diejenige, die in Lösung ungebunden geblieben ist. Ein Beispiel für ein derartiges Verfahren ist der bekannte Radioim-munoassay, bei dem eine radioaktive Markierung verwendet wird. Analoge Techniken sind unter Verwendung anderer Markierungen, wie beispielsweise von Enzymen und Fluoro-phoren, bekannt.
Bei diesen Verfahren ist es im allgemeinen erforderlich, entweder die gebildete Komplexe oder das freie, nicht gebundene, markierte Reagenz von dem Rest des Umsetzungsgemisches abzutrennen, um die Menge an Markierung in einem der beiden Teile zu bestimmen. Diese Abtrennung lässt sich selten leicht durchführen und stellt daher bei diesen Assays eine Fehlerquelle dar.
Um diese Schwierigkeiten zu vermeiden oder zuminde-stens zu verringern, bedient sich ein Verfahren gemäss der BE-PS 852 327 magnetisch anziehbarer Teilchen, die auf ihrer äusseren Oberfläche ein kovalent an diese gebundenes Reagenz aufweisen. Die Teilchen können zusammen mit dem Umsetzungsprodukt zwischen dem Reagenz und einer markierten Komponente aus dem Umsetzungsgemisch sauber und leicht von dem Rest des Reaktionsgemisches abgetrennt werden, wonach die Markierung in diesem Rest oder auf den Teilchen selbst gemessen werden kann.
Eine Einschränkung oder ein Nachteil dieses Verfahrens, wie es bisher bekannt war, liegt in der Tatsache, dass die Herstellung der das Reagenz tragenden magnetischen Teilchen häufig arbeits- und zeitaufwendig ist. Die Teilchen bestehen aus magnetisch anziehbarem Material, das in einer Polymeri-satmatrix eingebettet ist, wofür gewöhnlich Cellulose verwendet wird, und um ein teilchenförmiges Reagenz daran zu binden, muss man die Cellulose zunächst aktivieren und anschliessend mit dem Reagenz umsetzen, wobei normalerweise eine bifunktionelle Brückengruppe verwendet wird. Die als Zwischenprodukt auftretenden aktivierten Cellulose-teilchen können nicht beliebig lange aufbewahrt werden, so dass die beiden Herstellungsschritte (Aktivierung und anschliessende Umsetzung) jedesmal neu durchgeführt werden müssen.
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Es vs urde nun ein Weg zur Vermeidung dieser Schwierigkeiten gefunden. Insbesondere wurde ein lagerungsstabiles reaktionsfähiges magnetisches Material gefunden, an das bestimmte Reagenzien einstufig gebunden werden können; dieses Material stellt ein Zwischenprodukt des erfindungsge-mässen Verfahrens dar.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines teilchenförmigen. magnetisch anziehbaren Reagenzes zur Verwendung bei Immunoassays, das dadurch gekennzeichnet ist. dass man a) ein oder mehrere Monomere in Gegenwart magnetisch anziehbarer Feststoffteilchen unter unmittelbarer Ausbildung einer synthetischen, wasserunlöslichen Polymerisatmatrix. in der die genannten Feststoffteilchen gleichmässig eingebettet sind, in Masse in Gegenwart eines Katalysators und/ oder Initiators polymerisiert, wobei man a 1 ) das Monomer bzw. die Monomere derart auswählt, dass die gebildete Matrix Aldehyd-, Keto-, Cyanat-, Iso-cyanat-, Thiocyanat-, Isothiocyanat-, halogen-nitro-aroma-tische, s-Triazin, aromatische Sulfonylchlorid-, Isoxazol-, Aziridin-, Imino-, Imid-, Carboxyl-, Epoxid-oder Säureanhydrid-Gruppen oder mehrere Arten dieser Gruppen enthält, die frei sind, so dass sie unmittelbar mit einem Reagenz kuppeln können, das mit ihnen zu reagieren vermag, so dass das Reagenz an die Matrix gebunden wird, oder a2) die Matrix durch Polymerisation über die ethylenische Doppelbindung von Monomer erzeugt, bei der das bzw. jedes Monomer eines der Monomere Acrylnitril, Methacrylnitril, Acryloylchlorid und Methacryloylchlorid ist,
b) nach der Polymerisation die gebildete Polymerisatma-trix zu Teilchen zerkleinert und c) das erhaltene teilchenförmige Material mit einem Reagenz in Berührung bringt, das unmittelbar mit den auf Grund der Monomerauswahl gemäss al) in der Polymerisatmatrix enthaltenen freien kupplungsfähigen Gruppen bzw. unmittelbar mit den durch die Monomerpolymerisation gemäss a2) in die Polymerisatmatrix eingebrachten, Hetero-atome aufweisenden funktionellen Gruppen reagiert, und diese Umsetzung ablaufen lässt, um das Reagenz unmittelbar an die Polymerisatmatrix zu binden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin das auf diese Weise hergestellte teilchenförmige magnetisch anziehbare Reagenz.
Gegenstand der Erfindung ist schliesslich die Verwendung eines teilchenförmigen Reagenzes gemäss der Erfindung in einem Immunoassay zur Bestimmungeines Bestandteiles in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Flüssigkeit mit den Reagenzteilchen gemäss der Erfindung in Berührung bringt und anschliessend diese Teilchen aus der Flüssigkeit magnetisch abtrennt.
Im folgenden werden die einzelnen Teilchen des Reagenzes gemäss der Erfindung als «Reagenzteilchen gemäss der Erfindung» bezeichnet.
Von den verschiedenen möglichen freien Gruppen in der gebildeten Polymerisatmatrix sind die Aldehyd- und Keto-gruppen bevorzugt.
Gemäss der Erfindung werden eines oder mehrere der Monomere (in Gegenwart von magnetisch anziehbarem festem Material) derart polymerisiert. dass unmittelbar ein festes Polymerisat erzeugt \v ird. das nach geeigneter Abtrennung von dem Umsetzungsgemisch und notwendigem Auswaschen fein zerkleinert werden kann. Eine derartige Polymerisation wird in Abwesenheit eines Lösungsmittels (d.h. als Substanzpolymerisation j unter Verwendung eines Katalysators bzw. Initiators durchgeführt. Beispielsweise w ird im Falle von Acrolein das monomere Acrolein mit Tetramethylendiamin vermischt, und es tritt rasch eine Polymerisation unter Ausbildung eines festen Produktesein.
Im Falle von Acrylnitril wird ausserdem Ammoniumpersulfat zugesetzt, um die Reaktion zu beschleunigen.
Weiterhin ist es bevorzugt, die Polymerisatmatrix durch Radikalpolymerisation von Acrolein in Gegenwart von Tetramethylendiamin herzustellen. Wenn auf diese Weise Acrolein in Gegenwart von FeiCh pohmerisiert wird, bildet sich leicht eine homogene Masse aus Substanzpolymerisat und Fe.iO-i. Diese Masse kann leicht zu kleinen Teilchen vermählen werden.
Die Polymerisatmatrix und insbesondere die freien reaktionsfähigen Gruppen in ihr werden je nachdem ausgewählt, was für ein Reagenz an sie gekuppelt werden soll. Im allgemeinen enthält das Reagenz freie Amino- oder Sulfhydryl-gruppen, weshalb in diesen Fällen eine Aldehvdgruppen enthaltende Polymerisatmatrix verwendet wird. Reagenzien, die freie Aminogruppen enthalten, sind beispielsweise Proteine, wie beispielsweise Antikörper und Enzyme, sowie bestimmte Antigene, Haptene, Arzneimittel und Antibiotika. Beispiele für derartige Substanzen sind dieThyroidhormone T» und Tj (Thyroxin und Triizothyronin), die tricyclischen Antidepressiva (Nortriptylin, Desipramin und Protriptylin), die Amino-glycosid-Antibiotika (Gentamicin, Sisomycin, Netilmicin, Amikacin. N'eomycin. Streptomycin, Kanamycin undTobra-mycin), Absorbentien mit verschiedener Affinität für die Isolierung oder die Bestimmung von Antikörpern und anderen bindenden Proteinen, sowie Zwischenprodukte bei der Herstellung von ersten Antikörpern in fester Phase, die zur Bestimmung des paarweise verbundenen Haptens (conjugate hapten) verwendet werden sollen.
Ein grosser Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das Reagenz an die Teilchen, die in der Stufe b) des Verfahrens gemäss der Erfindung erhalten werden, einstufig gebunden werden kann. So kann das Reagenz beispielsweise einfach in einem Medium von geeignetem pH-Wert mit den Teilchen in Berührung gebracht werden. Polymerisatmatrices, die freie Aldehydgruppen enthalten, sind gegenüber freien Aminogruppen «selbstreagierend», und das Reagenz wird somit mit der Matrix umgesetzt und unmittelbar an diese gebunden. Die auf diese Weise gebildeten Reagenzteilchen gemäss der Erfindung sind anschliessend gebrauchsfertig. DieSelbstreaktiv ität der Teilchen, die , in der Stufe b) des Verfahrens gemäss der Erfindung erhalten werden, ist ein sehr grosser Vorteil, da sich durch sie die Notwendigkeit der Verwendung von Brückengruppen (Stand der Technik) erübrigt; es resultiert ausserdem insgesamt ein einfacherer, schnellerer und wirksamerer Vorgang.
Die Reagenzteilchen gemäss der Erfindung können eine beliebige Grösse besitzen, im allgemeinen ist es jedoch zweckmässig, dass sie 1 bis 20 um gross sind. Insbesondere im Falle der Verwendung in Verfahren mit kontinuierlichem Durchfluss sollte das spezifische Gewicht der Teilchen vorzugsweise etwa 1,4 bis 3.2 betragen, um ein übermässiges Aufschwimmen oder Absetzen der Teilchen in dem strömenden flüssigen Reaktionsgemisch zu vermeiden.
Die in Stufe b) des Verfahrens gemäss der Erfindung erhaltenen Teilchen (d.h. in dem Zustand, bevor das Reagenz an sie gebunden ist) können vor ihrer Verwendung aufbewahrt werden. Wie dem Fachmann klar ist. müssen die Teilchen während der Aulbewahrungsdauer von Substanzen ferngehalten werden, mit denen sie reagieren könnten. Alternativ kann die in Stufe a) des Verfahrens gemäss der Erfindung erhaltene feste Masse aus selbstreagierender Pohmerisatma-trix, die die magnetischen Teilchen enthalt, aulbewahrt werden, und wenn Teilchen benötigt werden, können feile der .Masse zerkleinert werden, damit sie mit einem Reagenz umgesetzt werden können. So können die Reagenzteilehen gemäss der Erfindung einlach und frisch unmittelbar vor ihrer Verwendung hergestellt werden.
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Die Reagenzteilchen gemäss der Erfindung sind in Immunoassays zur Bestimmung eines interessierenden Bestandteils in Flüssigkeiten von Nutzen. Sie können auf diese Weise bei manuellen oder automatischen Bestimmungen mit kontinuierlichem Durchfluss verwendet werden, wiesie beispielsweise in der US-PS 2 797 149 beschrieben sind. Sie können dort verwendet werden, wie beispielsweise in der BE-PS 852 327 beschrieben.
Derartige Bestimmungen schliessen insbesondere ein Analyseverfahren ein, bei dem man entlang einer Leitung ein Umsetzungsgemisch strömen lässt, das aus einer flüssigen Phase mit einer einen zu bestimmenden Bestandteil enthaltenden flüssigen Probe und einer festen Phase aus Reagenzteilchen gemäss der Erfindung besteht, dass man in dem " Gemisch eine Umsetzung ablaufen lässt, wobei ein Bestandteil des Umsetzungsgemisches mit der festen Phase reagiert oder selektiv an sie adsorbiert wird, dass man die Teilchen in der Leitung magnetisch einfängt, um sie gegen die Strömung zu halten und auf diese Weise die feste Phase von der strömenden flüssigen Phase zu trennen, und dass man stromabwärts davon die zu bestimmende Komponente in der Probe durch Analyse der abgetrennten festen oder flüssigen Phase bestimmt.
Eine bevorzugte Ausführungsform einer Analysevorrichtung zur Durchführung dieser Methode ist in der BE-PS 852 327 beschrieben.
Die genaue Art und Weise, auf die die Reagenzteilchen bei Immunoassays wirken, hängt von der Art des Reagenzes ab, wie dem Fachmann klar ist. Beispielsweise kann in einem Immunoassay auf ein Antigen unter Verwendung eines markierten Antigens und eines Antikörpers oder anderen bindenden Proteins der Antikörper das Reagenz auf den Reagenzteilchen sein. Unter diesem Umständen bildet das Reagenz sowohl mit markiertem als auch mit unmarkiertem Antigen Komplexe und kann nach Entfernung aus dem Reaktionsgemisch aufgrund der Markierung bestimmt werden, oder das zurückbleibende Umsetzungsgemisch kann auf die Markierung hin bestimmt werden.
In einer bevorzugten Durchführungsform der erfindungs-gemässen Verwendung enthält das Umsetzungsgemisch (als zweites Reagenz) eine bestimmte Menge einer markierten Substanz, die mit der zu bestimmenden Komponente unter Ausbildung eines Komplexes mit ihr reagiert, und das Reagenz auf den Reagenzteilchen gemäss der Erfindung bindet sich an den Überschuss aus dem zweiten Reagenz, wonach das abgetrennte Gemisch analysiert wird, um die zu bestimmende Komponente in der Probe zu bestimmen. Bei diesem Verfahren wird die Analyse entweder auf den Komplex oder auf den nicht umgesetzten Überschuss des zweiten Reagenzes durchgeführt, wie es zweckmässig ist.
Die vorstehenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung, und die vielseitige Einsetzbarkeit der Reagenzteilchen gemäss der Erfindung bei verschiedenen unterschiedlichen Beslimmungsverfahren sind dem Fachmann klar.
Die folgenden weiteren Beispiele dienen ebenfalls der Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung von Teilchen mit einem Gehalt an Polyacro-lein
2 g Acrolein und 2 g magnetisierbares Eisen (11, HI)-Oxid (Fe.'O-i) wurden bei Raumtemperatur kräftig miteinander vermischt und das Gemisch mit 100 (il Tetramethylendiamin versetzt und das Rühren etwa 6 bis 7 min fortgeführt, wonach Polymerisation eintrat und ein homogenes festes Produkt erhalten wurde. Dieses Produkt wurde in einer elektrischen Kaffeemühle (Braun) zu feinem Granulai vermählen. Weiteres Vermählen in einer Feinstmahlvorrichtung (McCrone)
während 30 min ergab ein stabiles .selbstreagierendes Produkt mit geeigneter Teilchengrösse.
Beispiel 2
Herstellung von Teilchen mit einem Gehalt an Polyacryl-nitril
2.5 ml Acrylnitril und 2 g magnetisch anziehbares Eisen (II, III)-Oxid wurden bei Raumtemperatur kräftig miteinander vermischt und das Ganze mit 100 al Tetramethylendiamin versetzt. Danach wurde 1 ml einer 33%igen (Gewicht/Volumen) Ammoniumpersulphatlösung zugefügt. Nach etwa 7 min trat Polymerisation ein, und man erhielt ein homogenes festes Produkt. Dieses Produkt wurde auf eine Teilchengrösse von unter 1 mm zerstossen und 72 h bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Das Produkt wurde weiter in einer Feinstmahlvorrichtung (McCrone) vermählen. wonach man stabile, selbstreagierende Teilchen erhielt.
Beispiel 3
Kupplung von Anti-T-i-Serum (y-Globulinfraktion)an Teilchen gemäss Beispiel 1
1 g der Polyacrolein/FesCU-Teilchen gemäss Beispiel 1 wurde viermal mit je 20 ml Wasser und anschliessend zweimal mit 0,1 m Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffervom pH 9.0 gewaschen. Eine Suspension der Teilchen in dem Puffer wurde auf ein Volumen von 14 ml gebracht. Die Kupplung wurde durchgeführt, indem man 1 ml Anti-TA-Serum (y-Globulinfraktion) der Teilchensuspension zusetzte und das Ganze 24 h bei 4°C leicht vermischte. Die Teilchen wurden anschliessend auf einem mehrpoligen Ferritmagneten absetzen gelassen und die überstehende Flüssigkeit entfernt. Die auf diese Weise hergestellten Reagenzteilchen wurden dreimal mit dem Bicarbonat/Carbonat-Puffer und anschliessend zweimal mit 0.05 m Phosphatpuffer vom pH 7.4 gewaschen. Schliesslich wurde das Volumen der Suspension mit Phospatpuffer auf 20 ml gebracht. —
Beispiel 4
Kupplung von Antidigoxin-Serum (y-Globulinfraktion) an Teilchen gemäss Beispiel 1
Es wurde das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt mit der Abweichung, dass anstelle von Anti-T4-Serum 1 ml Antidigoxin-Serum (y-GlobuIinfrak-tion) verwendet wurde.
Beispiel 5
Kupplung von Anti-HPL (Iactogenes Hormon der menschlichen Placenta)-Serum (y-Globulinfraktion) an Teilchen gemäss Beispiel 1
Es wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, gearbeitet mit der Abweichung, dass anstelle des Anti-Ti-Serums 1 ml Anti-HPL-Serum (y-Globulinfraktion) verwendet wurde.
Beispiel 6
Kupplung von Antidigoxinserum (y-Globulinfraktion) an Teilchen gemäss Beispiel 2
1 g der Teilchen gemäss Beispiel 2 wurde viermal mit je 20 ml Wasser und danach zweimal mit 0.1 m Natriumcar-honat/Bicarbonat-Puffer vom pH 9,0 gewaschen. Die Suspension der Teilchen in der Pufferlösung wurde auf ein Volumen von 14 ml gebracht. Die Kupplung wurde durchge-lührt. indem man 1 ml Antidigoxinserum (y-Globulinfraktion) zu derTeilchensuspension hinzufügte und das Ganze 24 h bei 4°C leicht vermischte. Die Reagenzteilchen, die auf diese Weise hergestellt wurden, wurden danach auf einem mehrpoligen Ferritmagneien absitzen gelassen, wonach die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Die Teilchen
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wurden dreimal mit dem Bicarbonat/Carbonat-Puffer und anschliessend zweimal mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH 7.4 gewaschen. Schliesslich wurde das Volumen der Suspension mit Phosphatpuffer auf 20 ml ergänzt.
Beispiel 7
Manueller Radioimmunoassay von T4 unter Verwendung der Anti-T4-Polyacrolein/Fe304-Reagenzteilchen
Antikörperverdünnungskurven: Das Verdünnungsmittel für sämtliche Assays war 0,05 m Phosphatpuffer vom pH 7,4. Es wurde eine Verdünnungsreihe aus der Suspension der Reagenzteilchen hergestellt: 5,2,5,1,25,0,625,0,312,0156 g Matrix je 100 ml Suspension. Danach wurde eine T4-l2SI-Indi-katorlösung hergestellt, so dass 500 cps in 50 |il erzielt wurden. Der Indikatorlösung wurde in einem Verhältnis von 8 ng/ml Serumprobe 8-Anilin-l-naphthalinsulphonsäure zugesetzt. Die Verdünnungskurven wurden durch Vermischen der Reagenzien in der folgenden Reihenfolge und in den folgenden Mengen aufgestellt.
Kurve für die maximale Bindung:
(I) SerumT4 frei 50 (il
(II) T4-'-5I-Indikatorlösung(imVerdünnungsmittel fürdenAssay) 50 jj.1
(III) Anti-T4-Reagenzteilchensuspension (Beispiel 3)
bei den oben aufgeführten Verdünnungen 50 (il
Kurve für die obere Standardbindung (top standard binding curve):
(I) Oberer Standard im T4-freien Serum (400 nMol/1) 50 p.1
(II) T4-i:5I-Indikatorlösung 50|il
(III) Anti-T4-Reagenzteilchensuspension (Beispiel 3) 50 p.1
Kurve für die unspezifische Bindung (non-specific binding curve):
(I) 20fache Konzentration des oberen Standards
(8 ii.Mol/1) inT4-freiem Serum 50 jj.1
(II) T4-':5I-Indikator-Lösung 50jil
(III) Anti-T4-Reagenzteilchensuspension (Beispiel 3) 50 [il
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht bebrütet. Die Teilchen aus fester Phase wurden auf einem Ferritmagneten absitzen gelassen und die überstehende Lösung verworfen. Die Teilchen wurden dreimal mit dem für den Assay bestimmten Verdünnungsmittel gewaschen und schliesslich mit einer Wilj-Apparatur gezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
In den beiliegenden Figuren 1,2 und 3 ist die Kurve der maximalen Bindung mit I bezeichnet, II bedeutet die Kurve der oberen Standardbindung und III ist die Kurve der unspezifischen Bindung.
(III) Antidigoxinreagenzteilchensuspension
(Beispiel 4) 50 p.1
Kurve der oberen Standardbindung:
(I) Oberer Standard 8 nMol/1 in Plasma 200 (il 5 (II) Digoxin-l25I-Indikatorlösung 50|il
(III) Antidigoxin-Reagenzteilchensuspension
(Beispiel 4) 50 jxl
Kurve der nichtspezifischen Bindung:
10 (I) 20fache obere Standardkonzentration
(160 nMol/1) in Plasma 200 p.1
(II) Digoxin-125I-lndikatorlösung 50 p.1
(III) Antidigoxinreagenzteilchensuspension
(Beispiel 4) 50 ul
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Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht bebrütet. Die Festphasenteilchen wurden auf einem Ferritmagneten absitzen gelassen und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die Teilchen wurden dreimal mit dem für den 20 Assay verwendeten Verdünnungsmittel gewaschen und schliesslich mit Hilfe eines Wilj-Apparates gezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
Beispiel 9
is Manueller Radioimmunoassay von HPL (lactogenes Hormon der menschlichen Placenta) unter Verwendung der Anti-HPL-Polyacrolein/Fe304-Reagenzteilchen
Antikörperverdünnungskurven: Eine Verdünnungsreihe wurde aus der Antikörper-Reagenzteilchensuspension wie 30 folgt hergestellt, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 g Teilchen je 100 ml Suspension. HPL-125I-Indikatorlösung wurde hergestellt, so dass 500 cps in 50 |il erzielt wurden. Die Verdünnungskurven wurden aufgestellt, indem man die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge und in den folgenden Mengen mitein-35 ander vermischte:
Kurve der maximalen Bindung:
(I) Männer-Serum 50 jj.1
(II) HPL-'25I-Indikatorlösung 50 jj.1 40 (III) Anti-HPL-Reagenzteilchensuspension bei den oben angegebenen Verdünnungen 50p.l
Kurve der oberen Standardbindung:
(I) Oberer Standard (12 (ig/ml) 50 p.1
45 (II) HPL-l25I-IndikatorIösung 50 p.1
(III) Anti-HPL-Reagenzteilchensuspension 50 (j.1
Kurve der unspezifischen Bindung:
(I) 20fache obere Standardkonzentration (240 ug/ml) 50 jj.1
50(11) HPL-l2SI-Lösung ' 50 p.1
(III) Anti-HPL-Reagenzteilchensuspension 50 jj.1
Beispiel 8
Manueller Radioimmunoassay von Digoxin unter Verwendung der Antidigoxin-Polyacrolein/Fe304-Reagenzteilchen Antikörperverdünnungskurven: Eine Verdünnungsreihe wurde mit der Antikörper-Reagenzteilchen-Suspension wie folgt hergestellt: 5, 2,5 1,25, 0,625, 0,312, 0,156, 0,078 g Teilchen je 100 ml Suspension. Ferner wurde eine Digoxin-l:5I-Indikatorlösung hergestellt, so dass in 50 p.1 500 cps erzielt Wurden. Die Verdünnungskurven wurden hergestellt, indem man die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge und in den folgenden Mensen miteinander vermischte.
Kurve der maximalen Bindung:
(I) Plasma
(II) Digoxin-l25I-Indikatorlösung
200 ul 50 (il
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht bebrütet. Die Festphasenteilchen wurden auf einem Ferrit-55 magneten absitzen gelassen und die überstehende Lösung verworfen. Die Teilchen wurden dreimal mit dem für den Assay verwendeten Verdünnungsmittel gewaschen und schliesslich mit einem Wilj-Gerät gezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Die Antikörperverdünnungskurven 6« der Fig. 1 bis 3 zeigen, dass die Antiseren gegenüber Tj, HPL und Digoxin ihre Immunreaktivität beibehalten, wenn sie kovalent an das Polyacrolein gebunden worden sind.
Beispiel 10
65 Automatischer Radioimmunoassay von HPL (lactogenes Hormon der menschlichen Placenta) unier Verwendung der Anti-HPL-Polyacrolein/Fe30-i-Reagenzteilchen
Die in Beispiel 9 angegebenen Reagenzien wurden in
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einem automatischen Gerät mit kontinuierlichem Durch-fluss (BE-PS 852327) verwendet, wobei eine on-Iine-Bebrü-tung des strömenden diskreten Assaygemisches während 10 min und anschliessend eine magnetische Abtrennung der Reagenzteilchen von dem Gemisch angewandt wurden. Dies abgetrennten Teilchen, die nunmehr die an die Antikörper gebundene Fraktion des lactogenen Hormons der menschlichen Placenta trugen, wurden anschliessend durch einen Gammazähler strömen gelassen, wonach die Zählungen aufgezeichnet wurden. Diese Daten wurden dazu verwendet, um eine Standardkurve herzustellen, aus der die unbekannten Konzentrationen an HPL in den zu untersuchenden Proben durch 1 nterpolation gefunden wurden.
Verdünnungsmittel-Puffer
0,05 m Phosphatpuffer vom pH 7,4 mit einem Gehalt an 0,25%Tween 20,0,1% Natriumazid und 0,25% Rinderserumalbumin.
HPL-Standards (50 jxl)
Normales Männerserum wurde mit reinem lactogenen Hormon der menschlichen Placenta versetzt (spiked), so dass Konzentrationen von 0,1,2,4,6,8,10,12 ug/ml erhalten wurden.
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HPL-l25I-Indikator(50^1)
Die hergestellte Indikatorvorratslösung wurde mit Pufferlösung verdünnt, so dass eine Gesamtzählung von 1700 je 50 jj.1 und Sekunde erzielt wurde.
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Anti-HPL-Polyacrolein/FeßO-t-Teilchensuipension (50 fil)
Diese Suspension wurde in einer Konzentration von 0,625 mg je 50 u.1 Pufferverdünnung verwendet. Die Standardkurve, die durch Auftragen der Zählungen in Form von js Ci/Co% gegen den Logarithmus der Konzentrationen der Standards erhalten wurde, ist in Fig. 4 dargestellt. In Fig. 4 ist also die Standardkurve für den Assay auf Lactogenes Hormon der menschlichen Placenta (HPL) in einer automatischen Vorrichtung mit kontinuierlichem Durchfluss darge-20 stellt.
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3 Blatt Zeichnungen
Claims (10)
- 658 728PATENTANSPRÜCHE1. Verfahren zur Herstellungeines teilchenförmigen, magnetisch anziehbaren Reagenzes zur Verwendung bei Immunoassays, dadurch gekennzeichnet, dass man a) ein oder mehrere Monomere in Gegenwart magnetisch anziehbarer Feststoffteilchen unter unmittelbarer Ausbildung einer synthetischen, wasserunlöslichen Polymerisatmatrix. in der die genannten Feststoffteilchen gleichmässig eingebettet sind, in Masse in Gegenwart eines Katalysators und/ oder Initiators polymerisiert, wobei man al ) das Monomer bzw. die Monomere derart auswählt, dass die gebildete Matrix Aldehyd-, Keto-, Cyanat-, Iso-cyanat-, Thiocyanat-, Isothiocyanat, halogen-nitro-aroma-tische. s-Triazin-, aromatische Sulfonylchlorid-, Isoxazol-, Aziridin-, Imino-, Imid-, Carboxyl-, Epoxid-oder Säureanhydrid-Gruppen oder mehrere Arten dieser Gruppen enthält, die frei sind, so dass sie unmittelbar mit einem Reagenz kuppeln können, das mit ihnen zu reagieren vermag, so dass das Reagenz an die Matrix gebunden wird, oder a2) die Matrix durch Polymerisation über die ethylenische Doppelbindung von Monomer erzeugt, bei der das bzw. jedes Monomer eines der Monomere Acrylnitril, Methacrylnitril, Acryloylchlorid und Methacryloylchlorid ist,b) nach der Polymerisation die gebildete Polymerisatmatrix zu Teilchen zerkleinert und c) das erhaltene teilchenförmige Material mit einem Reagenz in Berührung bringt, das unmittelbar mit den auf Grund der Monomerauswahl gemäss al) in der Polymerisatmatrix enthaltenen freien kupplungsfähigen Gruppen bzw. unmittelbar mit den durch die Monomerpolymerisation gemäss a2) in die Polymerisatmatrix eingebrachten, Hetero-atome aufweisenden funktionellen Gruppe reagiert, und diese Umsetzung ablaufen lässt, um das Reagenz unmittelbar an die Polymerisatmatrix zu binden.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das oder jedes Monomer aus Acrylnitril, Methacrylnitril, Acryloylchlorid, Methacryloylchlorid, Acrolein, Methacrolein, Dimethylketen, Acrylsäure oder Methacryl-säure auswählt und das Monomer bzw. die Monomere über die ethylenische Doppelbindung polymerisiert.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man im Verfahrensschritt b) die Polymerisatmatrix zu Teilchen von einer Grösse von 1 bis 20 (im und einem spezifischen Gewicht von 1,4 bis 3,2 zerkleinert.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Acrolein oder Acrylnitril in Masse polymerisiert.
- 5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Katalysator oder Initiator Tetrameth-ylendiamin verwendet.
- 6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mit dem Reagenz umzusetzende teilchenförmige Material freie Aldehydgruppen enthält, und dass man als Reagenz ein solches verwendet, das freie Amino-oderSulfhydrylgruppen enthält und ein Protein, Antigen, Hapten oder Enzym ist.
- 7. Teilchenförmiges, magnetisch anziehbares Reagenz zur Verwendung bei Immunoassays, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6.
- 8. Suspension eines Reagenzes gemäss Anspruch 7, in einer wässrigen Flüssigkeit.
- 9. Verwendungeines Reagenzes gemäss Anspruch 7, in einem Immunoassay zur Bestimmung eines Bestandteils in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man die Flüssigkeit mit dem teilchenförmigen Reagenz gemäss Anspruch 7 in Berührung bringt und anschliessend das teilchenförmige Reagenz aus der Flüssigkeit magnetisch abtrennt.
- 10. Verwendung gemäss Anspruch 9. dadurch gekennzeichnet, dass man ein Umsetzungsgemisch aus einer flüssigen Phase, die eine Probe der Flüssigkeit enthält, und einer festen Phase, die teilchenförmiges Reagenz gemäss Anspruch 7 enthält, eine Leitung entlangströmen lässt, wobei in dem Gemisch zwischen dem Reagenz und einem oder mehreren anderen Bestandteilen des Gemisches eine Umsetzung stattfindet, durch die die Komponente selektiv an die Teilchen gebunden wird, dass man die Teilchen in der Leitung magnetisch einfängt, um sie gegen die Strömung festzuhalten und auf diese Weise die feste Phase von der strömenden flüssigen Phase zu trennen, und dass man stromabwärts davon den zu bestimmenden Bestandteil in der Probe durch Analyse der abgetrennten festen Phase oder flüssigen Phase bestimmt.
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