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CH651319A5 - Substrat enzymatique utilisable pour la determination d'enzymes et procede pour sa fabrication. - Google Patents

Substrat enzymatique utilisable pour la determination d'enzymes et procede pour sa fabrication. Download PDF

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CH651319A5
CH651319A5 CH6129/79A CH612979A CH651319A5 CH 651319 A5 CH651319 A5 CH 651319A5 CH 6129/79 A CH6129/79 A CH 6129/79A CH 612979 A CH612979 A CH 612979A CH 651319 A5 CH651319 A5 CH 651319A5
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CH
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substrate
methoxy
ome
nitrostyrene
formula
Prior art date
Application number
CH6129/79A
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English (en)
Inventor
Anthony Charles Richardson
Percy Francis George Praill
Robert Graham Price
Original Assignee
Nat Res Dev
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Publication date
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Description

L'invention se rapporte à un substrat enzymatique utilisable pour la détection et la détermination d'enzymes, ainsi qu'à un procédé pour sa fabrication.
La présence ou l'absence de certains enzymes dans des
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échantillons physiologiques tels que l'urine ou des échantillons de sérum de patients humains est un indicateur valable de maladie ou déficiences dans l'organisme concerné, par exemple de mauvais fonctionnement d'organes chez des patients humains. Par exemple, une augmentation dans la teneur de l'enzyme N-acétyl ß-D-glucosaminidase (NAG) excrété dans l'urine de patients à «rein transplanté» est un signe précoce d'un rejet imminent du rein transplanté, à part le fait d'être un indicateur général d'affections rénales et autres. Actuellement, le test clinique habituel pour la NAG implique l'incubation d'un échantillon d'urine avec le substrat d'enzyme méthyl-4 umbelliferyl glycoside qui interagit pour libérer l'umbelliférone correspondante qui est contrôlée par fluori-métrie. Alternativement, un substrat nitrophényl glycoside, le p-nitrophényl acétamido-2 déoxy-2 ß-D-glucopyranoside, peut être utlisé, celui-ci interagissant avec l'enzyme pour libérer le p-nitrophénol qui est contrôlé par colorimétrie. Toutefois, ces deux tests exigent l'utilisation d'un appareillage spec-trophotométrique sophistiqué et sont donc seulement convenables à utiliser s'il y a accès aux facilités d'un laboratoire bien équipé.
De nouveaux réactifs de détermination d'enzymes ont été conçus et qui, dans certains cas, peuvent être utilisés sans avoir recours à l'utilisation d'un appareillage de contrôle sophistiqué.
La présente invention a pour objet un substrat enzymatique de formule S'-O-A—Y-N02, dans laquelle A consiste en un noyau aromatique, Y un groupe insaturé capable de transmettre la résonnance électronique entre le noyau aromatique et le substituant nitro et S'-O représente un groupe propionyloxy, palmitoyloxy, phosphate, diphosphate, sulfate ou glycoside.
Le substrat enzymatique selon l'invention comprend une portion clivable enzymatiquement et une autre portion donnant lieu à la formation d'un composé de formule HO-A-Y-N02.
Les substrats enzymatiques selon l'invention sont largement applicables à la détermination des enzymes en général, la portion de substrat enzymatique étant variée conformément à l'enzyme particulier que l'on désire déterminer. Toutefois et typiquement, les enzymes pouvant être déterminés sont des enzymes cataboliques, tels ceux qui jouent un rôle important dans la dégradation de macromolécules dans les tissus cellulaires. Par exemple, les enzymes qui peuvent être déterminés comprennent des estérases de type propionate et palmi-tate, des phosphatases acides et alcalines, des phosphodiesté-rases et des sulphatases. Ainsi des substrats correspondants peuvent comprendre des esters appropriés de type propionate. phosphate, diphosphate et sulphate. De même, en particulier, l'invention est applicable à la détermination de glycosidases, cas dans lequel la portion de substrat S'du réactif représente un groupe glycosyle sans l'atome d'oxygène tel un radical a ou ß-glucopyranosyle, -galactosyle ou -mannopyranosyle. Lorsque S'représente un groupe 2-acétamido-2-déoxy^-D-glucopyranosyle, l'invention se trouve être particulièrement convenable dans l'application de la détermination du N-acétyl-P-D-glucosaminidase (NAG).
Le contenu de l'urine en NAG peut être déterminé pour la détection précoce d'une affection rénale ou dans un cas spécifique comme indicateur avancé d'un rejet rénal chez des patients à «rein transplanté». De même, les substrats selon l'invention peuvent apporter des outils commodes dans l'usage de la recherche biochimique et médicale.
De préférence, le composé H0-A-Y-N02 libéré par le substrat selon l'invention est capable de produire un changement de couleur facilement perceptible à l'œil et, sous ce dernier rapport, la couleur produite est typiquement substantiellement différente de la couleur de fond de l'échantillon. Par
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exemple, des substrats selon l'invention pour l'utilisation avec des échantillons d'urine, comme les substrats de détermination du NAG, libèrent typiquement des substances capables de produire des couleurs substantiellement différentes de la couleur de fond de l'urine. Préférentiellement, les substrats selon l'invention libèrent des composés qui sont capables de produire des couleurs distinctes, de préférence rouges ou bleues. Ainsi, des composés libérés convenables ont habituellement un X max sous des conditions alcalines dans la limite de 450 à environ 700, de préférence d'environ 500 à environ 600, surtout en combinaison avec un coefficient d'extinction élevé, à savoir un 8 plus grand qu'environ 20 000.
Il sera apprécié qu'à l'intérieur de la formule générale des composés HO-A-Y-NO2 il existe plusieurs composés colorés et colorants typiques et des composés convenables fournissant le signal visuel facilement perceptible qui sera apparent à des travailleurs compétents dans le domaine. De préférence, toutefois, le groupe A consiste en un noyau aromatique monocyclique, spécialement un noyau benzénique.
Le groupe Y peut aussi comprendre tout groupe insaturé convenable capable de transmettre la résonance électronique entre A et le substituant N02 et peut inclure des systèmes contenant des hétéroatomes et/ou des systèmes annulaires. Ainsi, par exemple, le groupe A peut comprendre un noyau benzène qui est un cycle du noyau naphthalène, l'autre cycle du noyau naphthalène fournissant le groupe Y. Le groupe Y peut aussi comprendre une insaturation acétylénique. Plus préférable-ment, toutefois, le groupe Y comprend une insaturation éthy-lénique qui est conjugée par rapport au noyau aromatique A, à savoir un substituant éthényle, butadiényle ou hexatriényle. Ainsi, dans une mise en application préférée, le substrat selon l'invention est capable d'interagir avec l'enzyme pour donner naissance à un composé de formule I
R1
NO
HO
où n = 1,2 ou 3 et R1, R2, R3 et R4 = H, OMe, N02, CH3, -CH = CR'R" ou C02H. Les groupes R' et R" du substituant -CH = CR'R" peuvent représenter OMe, CH3, C02H ou, de préférence, H, N02 ou une autre substitution conjuguée insaturée, à savoir de formule -CH=CR'R" où R' et R" représentent chacun H, OMe, N02, CH3 ou C02H.
En pratique, de manière particulièrement préférée, A consiste en un groupe styryle. Ainsi, des substrats particulièrement préférés selon l'invention sont ceux qui, par interaction avec l'enzyme donne lieu à la formation d'un composé hydroxy-4ca-nitrostyrène, à savoir de formule II, plus bas,
R1
où R1, R2, R3 et R4 sont comme définis plus haut. Les composés de formule II manifestent en général des propriétés de couleur surprenantes et hautement désirables ce qui fait que les substrats générateurs de ces couleurs sont dans leur application à la détermination d'enzymes. Il a été trouvé que les composés de formule II sont typiquement de couleur rouge foncé sous des conditions alcalines par comparaison avec la couleur orange-jaune faible du p-nitrophénol et aussi qu'ils ont des maxima d'absorbance (À, max) qui sont de manière inattendue et de façon significative plus élevés que ceux du p-nitrophénol ( ~ 400 sous des conditions alcalines). On pense maintenant que ces propriétés de couleur renforcées sont dues à la formation d'un ion radical résultant d'un processus d'oxydation, comme montré plus bas.
L'existence de substituants donneurs d'électrons comme les groupes alkoxy, p. ex. méthoxy adjacent au substituant hydroxyle paraît stabiliser la formation de cet ion radical, ce qui est corroboré par les propriétés de couleur des analogues méthoxy-3 et spécialement diméthoxy-3,5 montrés plus bas sous les formules respectivement III et IV et sur lesquels, les substrats préférés sont basés.
III IV
HO
OMe
MeO
Ainsi, le composé mono-méthoxy III et le composé di-méthoxy IV ont des maxima d'absorbance (X max) de 506 et 530 avec des coefficients d'extinction (s) de 24 600 et 22 300 respectivement dans un milieu tampon de pH 8,8; ils manifestent des colorations rouge écarlate satisfaisantes sous ces conditions.
Des exemples de substrat selon l'invention sont donnés dessous par les formules A à E qui se réfèrent, dans un but de simplicité, seulement à des substrats comprenant un substituant simple, oxy-4(a-nitrostyryle. On appréciera, cependant, que ce dernier substituant peut être remplacé par un substituant se rapportant aux composés H0-A-Y-N02 en général.
Ces substrats conviennent à la détermination d'estérases ou lipases (A), de phosphatases acides ou alcalines (B), de phosphodiestérases (C), d'arylsulphatases (D) et de glyco-sidases (E) respectivement. Rz dans la formule représente un radical glucosyle de type a ou ß-glucopyranosyle, -galacto-pyranosyle ou -mannopyranosyle.
En accord avec l'invention, il a été trouvé que les substrats préférés dérivant de nitrostyryle substitué peuvent être préparés à partir de vanilline ou de produits similaires basés sur l'hydroxybenzaldéhyde ou à partir du p-hydroxybenzal-
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déhyde lui-même, par nitrométhylation du produit d'addition rence, des conditions alcalines douces durant la nitrométhy-substrat-vanilline ou -composé similaire. On utilise, de préfé- lation.
0
(ko)2 P—O
B.
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KO—S — 0-
0
R 0-
b.
Il y a des raisons de croire que des substrats similaires se laissent préparer par des routes correspondantes semblables.
Les échantillons qui peuvent être déterminés sont commodément sous forme liquide et incluent des échantillons comprenant des liquides physiologiques, tels que le sérum ou l'urine. D'autres échantillons convenables peuvent aussi être déterminés comprenant des échantillons provenant d'homogé-nats cellulaires comme ces échantillons utilisés communément dans l'étude de désordres génétiques.
Le substrat enzymatique et l'échantillon sont incubés ensemble; par exemple, l'échantillon et la solution contenant le substrat sont mélangés et on les laisse interagir sous des con55
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ditions appropriées pour une période de temps convenable. De préférence, la température utilisée durant l'incubation est plus élevée qu'environ 30 °C, à savoir d'environ 30 à environ 40 °C et, sous ces conditions, une période d'incubation jusqu'à environ 30 minutes, à savoir d'environ 10 à 15 jusqu'à environ 30 minutes, est habituellement satisfaisante. Comme alternative à l'utilisation du substrat en solution, on peut utiliser le substrat en association, à savoir absorbé avec un matériel à phase solide convenable comme des particules de cellulose, c'est-à-dire de la cellulose microcristalline, ce qui peut surmonter avantageusement des problèmes résultant de l'insolubilité ou de la faible solubilité du substrat. Ce cernier peut
être utilisé également avec un matériel à support solide poreux, comme le papier, afin de fournir un papier test commode ou une tige de plongée pour un simple test d'immersion. De tels produits comprenant le substrat selon l'invention en association avec un matériel solide inerte convenable ou un matériel à support solide poreux sont inclus dans les limites du cadre de l'invention.
Lors de l'incubation, le substrat libère ou plus généralement donne lieu à la formation d'un composé qui peut, sans autre traitement, fournir le signal visuel, à savoir la couleur qui est révélatrice de la présence de l'enzyme dans l'échantillon. Souvent, toutefois, le composé nécessite un traitement ultérieur pour développer le signal visuel et un tel traitement comprend typiquement une activation pour développer le signal visuel inhérent du composé. Ce traitement ultérieur ne comprend pas d'étapes de chimie synthétique ou préparative comme les procédés de couplage diazonium utilisés antérieurement avec quelques réactifs donnés. Communément, le traitement comprend un traitement alcalin qui peut conduire à la formation de sel permettant la délocalisation de la charge électronique, par exemple, le traitement alcalin de substances préférées à chromophore insaturé conjugué donnant lieu avantageusement au développement de signaux visuels colorés. Le traitement alcalin peut comprendre l'addition d'alcali à une solution contenant le composé libéré ou, de préférence, une solution contenant le composé est mise en contact avec un réactif à phase solide, à savoir un absorbant qui présente simultanément un environnement alcalin au composé. Par exemple, la solution contenant le composé est mise en contact avec un matériel d'échange anionique qui est préférablement de couleur neutre, à savoir blanc ou légèrement coloré et qui se trouve dans sa forme base libre, p.ex. sous la forme hydroxyle (OH-).
La concentration de substrat utilisé, à savoir présent en association avec le matériel à phase solide inerte, peut être variée selon le désir, par exemple, en accord avec la concentration limite d'enzyme que l'on désire contrôler; l'augmentation en concentration de substrat permet généralement la détection de concentrations d'enzyme de limite inférieure.
Le signal visuel, à savoir le changement de couleur, produit par la substance libérée procure avantageusement un moyen simple et rapide pour détecter la présence de l'enzyme dans l'échantillon par rapport aux méthodes utilisées précédemment qui reposent sur l'emploi d'un appareillage de contrôle sophistiqué. De même, l'intensité du signal visuel, à savoir de la couleur, produit peut être utilisée commodément comme indicateur visuel approché de la concentration d'enzyme présent dans l'échantillon. Si, toutefois, des mesures plus précises sont nécessaires, les réactifs de l'invention peuvent être contrôlés spectrophotométriquement de manière conventionnelle, par exemple. Ainsi, la couleur produite peut être estimée par colorimétrie, d'habitude après ajustage du pH à 8,5-9,5 avec un tampon approprié et, dans de telles méthodes, lesdits réactifs peuvent être plus convenables que des réactifs correspondants antérieurs comme les substrats p-ni-trophénolique et o-nitrophénolique.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples suivants.
Exemple 1
Préparation de nitrostyryl glycosides pour la détection et la détermination de glycosidases correspondantes I. Préparation de glycosides de l'hydroxybenzaldéhyde
Comme première étape dans la préparation de substrats d'enzyme nitrostyryl glycosides selon l'invention, on prépare les glycosides d'hydroxybenzaldéhyde appropriés.
Une solution de l'halogénure de glycopyranosyle approprié (70 mmole) dans de l'acétone (200 ml) est traitée avec une
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solution du dérivé de p-hydroxybenzaldéhyde approprié (100 mmole) dans de l'hydroxyde dé sodium M, le mélange résultant étant maintenu à température ambiante sous agitation pendant une période d'environ 16 heures. Le mélange réac-tionnel est ensuite dilué avec de l'eau jusqu'à ce que le produit se sépare. Les produit glycosidiques cristallins sont filtrés directement et les produits non cristallins sont isolés par extraction au chloroforme de manière habituelle.
Après filtration des produits cristallins, on peut récupérer du produit additionnel à partir des eaux-mères par extraction au chloroforme ou dichlorométhane.
Les résultats obtenus durant la préparation d'une série de glycosides d'hydroxybenzaldéhyde sont donnés ci-dessous.
(a) L'(acétamido-2 tri-O-acétyl-3,4,6 déoxy-2a-D-glu-copyranosyloxy)-4 méthoxy-3 benzaldéhyde est obtenu avec un rendement de 55% à partir du chlorure d'(acétamido-2 tri-O-acétyl-3,4,6 déoxy-2a-D-glucopyranosyle et a un PF de 220-221°, (éthanol) [a]D -13,5° (c 1, DMSO).
(b) L'(acétamido-2 tri-O-acétyl-3,4,6 déoxy-2P-D-glu-copyranosyl-oxy)-4 benzaldéhyde est obtenu similairement avec un rendement de 47%, [a]D —19° (g 1, CHC13).
(c) L'(acétamido-2 tri-O-acétyl-3,4,6 déoxy-2p-D-glu-copyranosyloxy)-4 diméthoxy-3,5 benzaldéhyde est obtenu similairement avec un rendement de 15%, PF 239-240°, (mé-thanol) [<x]D + 3,8° (g 1,2, DMSO).
(d) Le (tétra-O-acétyl-2,3,4,6 ß-D-glucopyranosyloxy)-4 méthoxy-3 benzaldéhyde est obtenu à partir du bromure de tétra-O-acétyl-2,3,4,6 a-D-glucopyranosyle avec un rendement de 62%, PF 135-136 °C, (éthanol), [a]D -24,2° (c 1,1, CHC13)
(e) Le (tétra-O-acétyl-2,3,4,6 ß-D-galactopyranosyloxy)-4 méthoxy-3 benzaldéhyde est obtenu à partir du bromure de tétra-O-acétyl-2,3,4,6a-D-galactopyranosyle initialement sous forme d'un sirop (47%) qui cristallise et recristallise avec difficulté d'un mélange éthanol-éther-éther de pétrole léger, PF 148-149°, [a]D -4,4° (g 1,1, CHC13)
(f) Le (tétra-O-aeétyl-2,3,4,6 a-D-mannopyranosyloxy)-4 méthoxy-3 benzaldéhyde est obtenu sous forme d'un sirop avec un rendement de 14% à partir du bromure de tétra-O-acétyl-2,3,4,6 a-D-mannopyranosyle (15), [a]D +15,9° (c 1,4, CHCI3).
II. O-Déacétylation des glycosides d'hydroxybenzaldéhyde
Dans l'étape suivante de la préparation des substrats d'enzyme nitrostyryles, certains des glycosides d'hydroxybenzaldéhyde sont O-déacétylés par traitement avec du méthoxyde de sodium méthanolique.
Des solutions de glycosides acétylés (15 mmole) dans le méthanol (50-500 ml) sont traités avec du méthoxyde de sodium méthanolique M(0,5-2 ml) et on laisse reposer les solutions à température ambiante pour 20-30 minutes ou jusqu'à l'achèvement de la réaction qui est indiqué par c.c.m. Les solutions sont ensuite passées au travers de tampons de gel de silice pour éliminer les ions sodium et puis évaporées à sec.
Les résultats obtenus pour divers glycosides sont donnés ci-dessous.
(a) L'(acétamido-2 d0oxy-2ß-D-glucapyranosyloxy)-4 méthoxy-3 benzaldéhyde cristallise directement du mélange réactionnel avec un rendement de 90% et a un PF 199-200° (dee.), [a]D -20° (g 1, DMSO)
(b) Le (ß-D-glucopyranosyloxy)-4 méthoxy-3 benzaldéhyde est obtenu avec un rendement de 85% sous forme d'une poudre blanche, PF 188-190°, [ct]D +2,2° (g 0,7, DMSO)
(c) Le (a-D-galactopyranosyloxy)-4 méthoxy-3 benzaldéhyde est obtenu sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 92%, PF 204-206°, [a]D + 4,8° (g 1,1, DMSO)
(d) Le (a-D-mannopyranosyloxy)-4 méthoxy-3 benzal-
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déhyde est obtenu sous forme cristalline avec un rendement de 64%, PF 196-197° (éthanol), [a]D +119,6° (c 1, DMSO
III. Nitroméîhylation des glycosides d'hydroxybenzaldéhyde
Aussi bien les glycosides d'hydroxybenzaldéhyde acétylés que déacétylés, comme préparés plus haut, sont ensuite nitro-méthylés pour fournir les glycosides nitrostyrylés correspondants.
Du nitrométhane (16 ml), de l'acétate d'ammonium (8g) et de l'acide acétique (4 ml) sont ajoutés à une solution agitée ou une suspension du glycoside (20 mmole) dans de l'éthanol (150-250 ml) et le mélange agité à température ambiante pour une période d'environ 20 à environ 250 heures, habituellement environ 20 heures. Dans la plupart des cas le produit se sépare du mélange réactionnel et est recueilli à partir du mélange réactionnel, bien que dans certains cas le produit soit précipité par addition d'eau suivi soit d'une filtration ou d'une extraction par le chloroforme ou autre solvant convenable.
Alternativement, le mélange réactionnel décrit plus haut est reflué pour 15-45 minutes fournissant des rendements semblables quoique souvent de pureté améliorée.
Les résultats obtenus lors de la préparation des divers nitrostyryl glycosides sont donnés ci-dessous indiquant la méthode utilisée, soit la méthode (A) la méthode à température ambiante ou la méthode (B) la méthode à reflux.
(a) L'(acétamido-2 tri-O-acétyl-3,4,6 déoxy-2P-D-glu-copyranosyloxy)-4 méthoxy-3a>-nitrostyrène est préparé avec un rendement de 88% par la méthode (A) et de 76% par la méthode (B) sous forme d'un solide cristallin jaune, PF 239-240°, [a]D -6,9° (c 1,15,DMSO).
(b) L'(acétamido-2 döoxy-2ß-D-glucapyranosyloxy)-4 méthoxy-3oû-nitrostyrène est préparé par la méthode (B) avec un rendement de 87% sous forme d'un solide jaune pâle, PF 200-201,5° (dee.), [a]D -1,4° (g 0,9, DMSO).
(c) L'(acétamido-2 tri-O-acétyl-3,4,6 déoxy-2p-D-glu-copyranosyloxy)-4(û-nitrostyrène est préparé par la méthode (B) sous forme d'un solide jaune très pâle, PF 258-259°, [a]D -14,3 (g 1,1, CHC13).
(d) Le (tétra-0-acétyl-2,3,4,6P-D-glucopyranosyloxy)-4 méthoxy-3co-nitrostyrène est préparé par la méthode (A) sous forme d'un solide jaune crémeux avec un rendement de 96%, PF 192-194°, [a]D -12,4° (g 1,2, CHC13).
(e) Le (tétra-0-acétyl-2,3,4,6P-D-galactopyranosyloxy)-4 méthoxy-3co-nitrostyrène est préparé par la méthode (A) avec un rendement de 25% après extraction du mélange réactionnel avec du dichlorométhane et Chromatographie sur une colonne de gel de silice utilisant comme éluant un mélange éther -éther de pétrole léger. IlaunPF 148-149°, [a]D —4,4° (g 1,1, CHCI3).
(f) Le P-D-galactopyranosyloxy-4méthoxy-3(0-nitrosty-rène est obtenu par la méthode (A) sous forme de cristaux jaunes pâle avec un rendement de 69%, PF 212-214°, [a]D +1,3° (g 1,5, DMSO).
(g) Le (tétra-0-acétyl-2,3,4,6a-D-mannopyranosyloxy)-4 méthoxy-3co-nitrostyrène est obtenu par la méthode (A) sous forme d'un solide amorphe jaune pâle, PF 131-132°, [a]D
—15,7° (g 0,8, CHCI3).
IV. O-Déacétylation de nitrostyryl glycosides
Finalement, les nitrostyryl glycosides O-acétylés comme préparés plus haut sont déacétylés.
Une solution agitée ou une suspension du nitrostyryl glycoside O-acétylé (2 mmole) dans le méthanol (150 ml) est traitée avec du méthoxyde de sodium méthanolique M(2,5 ml). Le mélange est agité à température ambiante pour 10—20 minutes et passé ensuite au travers d'un tampon de gel de silice pour éliminer les ions sodium. Le gel de silice est bien lavé avec du méthanol, le filtrat et les liquides de lavage évaporés à sec. Le solide résultant est ensuite filtré avec l'aide d'un peu d'éthanol.
s Les résultats obtenus pour les divers nitrostyryl glycosides préparés sont donnés ci-dessous.
(a) L'(acétamido-2 déoxy-2p-D-glucopyranosyloxy)-4 méthoxy-3<a-nitrostyrène est obtenu sous forme d'une poudre amorphe jaune pâle, avec un rendement quantitatif, qui ne
10 peut être recristallisée de façon satisfaisante sans causer un peu de décomposition. Le produit a un PF 198-199° (dee.), [a]D -7,8° (g 1,4, DMSO).
(b) Le (ß-D-glucopyranosyloxy)-4 méthoxy-3co-nitrosty-rène est préparé avec un rendement de 77% sous forme de
15 cristaux jaunes, PF 140-141°, [a]D — 8,7° (c 1,0, DMSO).
(c) Le (a-D-mannopyranosyloxy)-4 méthoxy-3co-nitrosty-rène (23) est obtenu sous forme d'un solide orange amorphe hygroscopique, [a]D +80,1° (g 0,8, DMSO).
Les glycosides préparés ci-dessus sont convenables pour la 20 détermination des glycosidases correspondantes. Typiquement, les glycosides libèrent le composé hydroxy-nitrostyryle correspondant lors de l'interaction avec l'enzyme adéquat ce qui fournit le signal visuel facilement discernable, habituellement une coloration rouge 25 Un matériel à phase solide inerte peut être imprégné avec les glycosides préparés ci-dessus ou d'autres substrats enzy-matiques selon l'invention. Par exemple, la quantité requise de cellulose microcristalline («AVICÈLL») est ajoutée à l'éluat du gel de silice, comme préparé plus haut, évaporée à 30 sec dans un évaporateur rotatif et le solide résultant est broyé en une poudre fine avec un mortier et un pilon.
Exemple 2
Préparation de dérivés esters des hydroxy-4(â-nitrostyrènes 35 pour la détection et la détermination d'estérases correspondantes.
Une série de dérivés esters des hydroxy-4co-nitrostyrènes a été préparée pour l'utilisation dans des réactifs selon l'invention pour la détection et la détermination d'estérases corres-40 pondantes.
(1) Propionyloxy-4-méthoxy-3(ù-nitrostyrène
On dissout de l'hydroxy-4 méthoxy-3œ-nitrostyrène (3,9 g, 20 mmol) dans de la pyridine sèche (15 ml) et l'on addi-45 tionne du chlorure de propionyle (2,8 g, 30 mmole). Le mélange réactionnel s'échauffe et un précipité rouge foncé se forme. Après env. 5 min. le mélange est versé sur de l'eau glacée et le précipité jaune résultant filtré, bien lavé à l'éthanol et recristallisé d'un mélange chloroforme - éthanol pour donner 50 le propionate (4,8 g, 95%), PF 101-104,5°.
Le propionate est convenable pour l'usage dans la détection d'estérases de type propionate et similairement donne lieu à la formation de l'hydroxy-4 méthoxy-3co-nitrostyrène lors de l'interaction avec l'enzyme.
55
(2) Palmitate de (ft-nitroéthényl) -4 méthoxy-3phényle
On dissous de l'hydroxy-4 méthoxy-3a>-nitrostyrène
(5,2 g, 25 mmole) dans de la pyridine (20 ml) et l'on additionne du chlorure de palmitoyle (8 g, 29 mmole). Un solide 60 jaune se forme immédiatement et le mélange réactionnel est alors chauffé à reflux pour 15 min. Le mélange réactionnel est versé sur de l'eau glacée et le solide jaune résultant filtré. Le produit est agité avec de l'hydroxyde de sodium dilué (ÎO^M) pour éliminer le phénol libre, filtré, bien lavé à l'eau et l'éthanol puis recristallisé d'un mélange chloroforme-éthanol, PF 96-99° (9,1 g, 84%).
Ce produit est convenable pour l'usage dans la détection et la détermination d'estérases de type palmitate, libérant
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l'hydroxy-4 méthoxy-3a>-nitrostyrène par interaction avec l'enzyme.
(3) Palmitate de (fi-nitroéthényl)-4phényle
Du chlorure de palmitoyle (3,6 g) est ajouté à de la pyridine sèche (20 ml); il y a une précipitation immédiate. A ce mélange on ajoute de l'hydroxy-4co-nitrostyrène (1,65 g, 10 mmole) et le mélange est chauffé à reflux pour 1-2 min. Le mélange est ensuite versé sur de l'eau glacée et le précipité jaune amorphe, filtré. Une solution du précipité dans un mélange de chloroforme-DMSO fournit des germes de l'ester et le gros est cristallisé par dissolution dans du chlorure de méthylène bouillant suivi de l'addition d'éthanol. Lorsque tout le chlorure de méthylène est évaporé, la solution éthano-lique est ensemencée pour donner le palmitate sous forme de cristaux fauve pâle, PF 83-84° (2 g, 50%).
Similairement, ce produit convient à la détection et la détermination d'estérases de type palmitate et libère l'hydroxy-4co-nitrostyrène par interaction avec l'enzyme.
(4) Phosphate de ($-nitroéthényl)-4 méthoxy-3 phényle (comme sel monosodique monohydraté)
A une solution refroidie par de la glace et vigoureusement agitée de chlorure de phosphoryle (6,2 g, 40 mmole) dans de la pyridine (40 ml) on ajoute, goutte à goutte et sur une période de 45 min., une solution d'hydroxy-4 méthoxy-3cû-ni-trostyrène (7,8 g, 40 mmole) dans de la pyridine (20 ml). Le mélange réactionnel est ensuite décomposé par l'addition goutte à goutte de pyridine aqueuse (50 ml, contenant 10% d'eau) ce qui provoque la séparation d'un peu de solide. L'addition goutte à goutte d'hydroxyde de sodium 2M (20 ml, 40 mmole) résulte initialement dans une solution claire, puis de la séparation d'un sel monosodique amorphe, sous forme d'hydrate (7,1 g, 59%), PF >250°. Le sel a une faible solubilité dans l'eau et convient pour la détection et la détermination de phosphatases.
(5) Phosphate de (fi-nitroéthényl)-4 méthoxy-3 phényle (sous forme de son sel disodique).
La réaction ci-dessus (4) est répétée excepté que le mélange réactionnel décomposé est versé sur une solution concentrée de soude caustique (6 g) dans de l'eau. Le produit se sépare initialement sous forme d'une huile qui se solidifie en un solide amorphe (11 g, 86%) PF > 250°. Il est plus soluble dans l'eau que le sel monosodique et se dissout aisément dans l'eau bouillante, avec un peu de décomposition pour reprécipiter lors du refroidissement pour donner un solide jaune pâle. Une solution 2 mmolaire du sel disodique se prépare aisément.
Exemple 3
Une série d'hydroxy œ-nitrostyrènes a aussi été préparée pour déterminer et comparer les propriétés de couleur de ces composés, ceux-ci étant des exemples de composés tombant dans les limites de la formule générale H0-A-Y-N02, à savoir des composés dont la formation est le résultat de l'interaction du substrat selon l'invention avec l'enzyme correspondant.
Le procédé général de préparation était comme suit: L'hydroxybenzaldéhyde correspondant (40 mmole) est dissous dans l'éthanol (200 ml) et l'on ajoute le nitrométhane (32 ml) l'acétate d'ammonium (12 g) et de l'acide acétique. Le mélange réactionnel est soit agité durant la nuit à température ambiante soit chauffé au reflux pour 15-60 minutes. Dans certains cas, le co-nitrostyrène cristallise du mélange réactionnel refroidi ou cristallise lorsque de l'eau est ajoutée au mélange réactionnel refroidi. Dans les cas où aucun produit cristallin ne peut être isolé par ces méthodes, le produit est extrait à l'éther qui est bien lavé à l'eau, séché (MgSO^ et repris à
l'état sec. Les rendements, points de fusion et propriétés spectrales des divers produits d'hydroxy co-nitrostyrène ont été déterminés par des méthodes conventionnelles et sont donnés ci-dessous, les propriétés spectrales étant déterminées en termes d'absorbance (X max) dans l'éthanol en présence du tampon TRIS au pH 8,8 et de coefficient d'extinction (s) au pH 8,8.
(1) L'hydroxy-4 méthoxy-3(ù-nitrostyrène a un PF 164-166 °C (éthanol), est obtenu avec un rendement de 75% et a un X max (éthanol) de 380 et un X max (TRIS 8,8) de 506 avec un e 20 900.
(2) L'hydroxy-4ra-nitrostyrène a un PF 185-186° (éthanol aqueux) est obtenu avec un rendement de 52% et a un A, max (éthanol) de 358 et un X max (TRIS 8,8) de 460 avec un e
24 627.
(3) L'hydroxy-4 diméthoxy-3, 5co-nitrostyrène a un PF 184-186° (éthanol), est obtenu avec un rendement de 72% et a un X max (éthanol) de 385 et un X max (TRIS 8,8) de 530 avec un s de 22 330.
(4) L'hydroxy-4 nitro-3o>nitrostyrène a un PF 132-133°, est obtenu avec un rendement de 57%, a un X max (éthanol) de 320 et un X max (TRIS 8,8) de 405 avec un e de 7400.
(5) L'hydroxy-4 méthoxy-3 nitro-2oo-nitrostyrène a un PF 188-189° (acide acétique aqueux), est obtenu avec un rendement de 42%, a un X max de 400 (éthanol) et un X max (TRIS 8,8) de 436 avec un s de 14 000.
(6) L'hydroxy-4 méthoxy-3 nitro-5<»-nitrostyrène a un PF de 170-171° (acide acétique aqueux), est obtenu avec un rendement de 67%, a un X max (éthanol) de 334 et un X max (TRIS 8,8) de 415 avec un s de 5200.
(7) L'hydroxy-2 méthoxy-3co-nitrostyrène a un PF 138-139° (éthanol aqueux), est isolé avec un rendement de 38%, a un X max (éthanol) de 322 et un X max (TRIS 8,8) de 492 avec un coefficient d'extinction e de 7380.
Le méthoxy-2 (a-méthyl P-nitroéthényl)-4 phénol a aussi été préparé par une variation du procédé ci-dessus dans lequel la vanilline est traitée avec du nitroéthane au lieu de nitrométhane. Toutefois, les conditions employées pour la réaction furent essentiellement les mêmes que celles décrites ci-dessus pour la nitrométhylation. Le produit a-méthyl P-nitroéthényl phénol est obtenu avec un rendement de 80% avec un PF 110-112°, a un X max (éthanol) de 368 et un X max (TRIS 8,8) de 475 avec un s de 13 100.
Les hydroxy œ-nitrostyrènes, comme préparés ci-dessus, sont des composés typiquement colorés qui peuvent procurer le signal visuel facilement perceptible des réactifs de l'invention. Les composés particulièrement préférés sont les composés méthoxy-3 et diméthoxy-3,5,1 et 3, qui présentent des colorations rouge foncé nettes sous des conditions alcalines. Généralement, les composés de type co-nitrostyrène manifestent des propriétés de coloration nettement accrues par rapport à la coloration orange-jaune pâle du p-nitrophénol (A, max (éthanol) 320, X max (TRIS 8,8) 400 avec un e de 15 000) ce que l'on pense être dû à la formation d'ions radicaux avec les composés nitrostyryle. L'existence de tels ions radicaux est étayée par les spectres e.s.r des composés nitrostyryle. Par exemple, le composé diméthoxy-3,5 (3) en solution dans le DMSO auquel on additionne une goutte de méthoxyde de sodium M, donne un spectre e.s.r. intense comprenant 7 signaux pour les six protons méthoxy dans le rapport 1:6:15:20:15:6:1 avec un dédoublement calculé de 0,680 gauss et 3 signaux pour les deux protons aromatiques dans le rapport 1:2:1 avec und dédoublement calculée de 1,74 gauss, aucun signal n'étant observé pour les protons éthyliques.
Détermination du N-acétylglucosaminidase (NAG) dans l'urine à l'aide d'un substrat selon l'invention
100 mg de cellulose microcristalline contenant environ 3% d'(acétamido-2 déoxy-2p-D-glucopyranosyloxy)-4méth-
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oxy-3 (a-nitrostyrène, le substrat pour NAG, comme préparé dans l'Exemple 1, est traité, dans un petit tube à échantillons en plastique, avec de l'urine fraîche (1 ml) à la température du corps ou de l'urine stockée préchauffée à 35-38°. Les contenus du tube sont incubés pour 15-30 minutes à 30-35°, à savoir 20 minutes à 37° et on les laisse s'écouler à travers une colonne courte (environ 3 x 0,6 cm) de cellulose fibreuse DEAE (Whatmann DE 22) contenue dans une pipette Pasteur bouchée au fond avec de la ouate. La présence de NAG dans l'échantillon d'urine est indiquée par le développement d'une bande rouge pourpre environ 0,5 cm en-dessous du sommet de la colonne de cellulose DEAE. Parfois, une bande large brune claire se forme au-dessus de la bande rouge pourpre due à la présence d'urochrome dans l'urine et chez quelques patients qui ont eu des transplantations rénales, une bande brune-mauve se déplaçant rapidement est observée, probablement dûe aux médicaments que le patient reçoit. De plus,
pour les diabétiques ou les nourrissons qui ont une faible concentration en électrolyte dans leur urine, la bande rouge se forme à la surface d'interface sommitale de la cellulose DEAE et est plus diffuse en nature. Ce dernier effet peut être surmonté par incorporation de quantités appropriées d'électroly-tes dans le réactif. Dans tous les cas, cependant, la largeur et l'intensité de la bande rouge est approximativement proportionnelle à la concentration de NAG dans l'urine.
5 En utilisant du glycoside à 3 % sur la cellulose, l'urine normale (environ 40-75 n mol/ml de NAG) donne une bande rouge faible compacte et étroite alors que les urines anormales ( > 200 n mol/ml de NAG) donnent des bandes intenses plus larges qui se renforcent avec des concentrations croissantes de io NAG. Sous les mêmes conditions de test, l'eau et de l'urine qui a été bouillie pour détruire le NAG donnèrent des résultats négatifs.
Dans une modification de l'essai de base, on utilise une cellulose à 8% en glycoside à la place du matériel à 3% en i5 glycoside. On estime que ce nouveau matériel possède un seuil de détection du NAG d'environ 20-30 n mol/ml. Dans le procédé modifié, de l'urine normale donne des bandes plus intenses que celles observées plus haut, ce qui indique comment il est possible de choisir un seuil de détection par variation de la 2o quantité de substrat glycoside utilisé tout en prêtant attention à la température et au temps d'incubation.
C

Claims (7)

  1. 651 319
    2
    REVENDICATIONS
    1. Substrat enzymatique de formule S'-0-A-Y-N02,
    dans laquelle A consiste en un noyau aromatique, Y un groupe insaturé capable de transmettre la résonance électronique entre le noyau aromatique et le substituant nitro et S'-O s représente un groupe propionyloxy, palmitoyloxy, phosphate, diphosphate, sulfate ou glycoside.
  2. 2. Substrat selon la revendication 1, caractérisé en ce que S' représente un groupe a- ou ß-glucopyranosyle, a- ou ß-galac-topyranosyle ou a- ou ß-mannopyranosyle. io
  3. 3. Substrat selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que S'représente un groupe 2-acétamido-2-déoxy-P-D-glucopyranosyle.
  4. 4. Substrat selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que A représente le noyau benzène. 15
  5. 5. Substrat selon l'une des revendications 1 à 4, de formule
    20
    25
    dans laquelle S'est défini comme indiqué ci-dessus, n = 1,2 ou 3 et R1, R2, R3, R4 = H, OMe, N02, CH3, -CH=CR'R" ou C02H, les symboles R' et R" représentant chacun H, OMe, N02, CH3, C02H ou une autre substitution subséquente insaturée, de formule -CH=CR'R", R' et R" représentant chacun H, OMe, N02, CH3 ou C02H.
  6. 6. Substrat selon l'une des revendications 1 à 5, qui, lors 35 de l'interaction avec l'enzyme, libère du hydroxy-4 méthoxy-3co-nitrostyrène ou du hydroxy-4 diméthoxy-3,5co- nitro-styrène.
  7. 7. Procédé pour la préparation d'un substrat enzymatique selon la revendication 1 de formule
    30
    40
    45
    50
    dans laquelle S'est défini comme indiqué ci-dessus, n = 1, R1, R2, R3 et R4 = H, OMe, N02, CH3, -CH=CR'R" ou C02H, les symboles R' et R" représentant chacun H, OMe, N02, CH3, C02H ou une autre substitution subséquente insaturée, de formule-CH=CR'R", R' et R" représentant chacun H, OMe, 55 N02, CH3 ou C02H, caractérisé en ce que ledit substrat est préparé à partir d'un p-hydroxybenzaldéhyde correspondant en faisant réagir ledit p-hydroxybenzaldéhyde avec un dérivé de substrat enzymatique approprié pour donner un produit d'addition résidu de substrat enzymatique-oxybenzaldéhyde 60 qui est ensuite soumis à nitrométhylation.
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