CH650514A5 - Verfahren zur herstellung von 5'-desoxy-5'-methylthioadenosin. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein besonders einfaches und vom industriellen Standpunkt aus ökonomisches Verfahren zur Herstellung von 5'-Desoxy-5'-methyl-thioadenosin. Diese Verbindung, der Einfachheit halber nachstehend als «MTA» bezeichnet, ist ein therapeutischer Wirkstoff mit entzündungshemmender, analgetischer und antipyretischer Wirksamkeit, der sich als besonders interessant erwiesen hat.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge das im Anspruch 1 definierte Verfahren. Dieses neue Verfahren, das im wesentlichen in der Hydrolyse von S-Adenosylmethionin, nachstehend mit «SAME» bezeichnet, besteht, in der Regel unter genau kontrollierten kritischen Bedingungen, die zu praktisch totaler Hydrolyse und vollständiger Kristallisation des «MTA» führt. Die Reaktion wird durch das nachstehende Reaktionsschema erläutert:

NH.

NH,

+ I .

CH,-S-CH--CH,-CH-COOH

OH OH

NH,

CH.-S-CH

OH OH

Dieses genau kontrollierte Hydrolyseverfahren kann auf nach beliebiger Art hergestelltes SAME angewendet werden. Die Herstellung der SAME-Lösung ist jedoch ein Faktor, der die ökonomisch annehmbare Ausführung des erfindungsge-mässen Verfahrens beeinflusst.

Die nachstehenden, bevorzugten Verfahrensstufen führen zur wirtschaftlichsten Ausführungsform des erfindungsge-mässen Verfahrens :

a) SAME wird in normaler Brothefe angereichert durch Behandlung mit Methionin nach der von F. Schlenk in «Enzymologie», 29 (1965), S. 283 beschriebenen Schlenk-Methode.

b) Die in Wasser suspendierten Hefezellen werden durch Behandlung mit Äthyl- oder Methylacetat bei Zimmertemperatur lysisiert nach dem in der DE-OS P 23 36 401.4 beschriebenen Verfahren. Durch Einstellen eines pH-Wertes von 4-6 und Filtration wird eine Lösung erhalten, die praktisch das gesamte in der ursprünglichen Hefe vorhandene SAME enthält.

c) Die Lösung wird unter Vakuum bei 35-40 °C auf etwa '/io des ursprünglichen Volumens konzentriert.

d) Das Konzentrat wird während etwa 30 min auf Rückflusstemperatur erwärmt und der pH-Wert mit Soda auf 7 gestellt.

e) Die Lösung wird bei 0-5 °C stehengelassen und das ausgefällte MTA praktisch vollständig und mit guter Reinheit abgetrennt.

Die vorstehend beschriebenen Verfahrensstufen c, d und e, die wie angegeben kritisch und notwendig für vollständige selektive Hydrolyse von SAME zu MTA ohne Bildung von Nebenprodukten sind, sind neu.

Im nachstehenden Beispiel sind die prozentualen Konzentrationsangaben gewichtsmässig, wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel

Für die Herstellung von 5'-Desoxy-5'-methylthioadenosin (MTA) werden bei Zimmertemperatur 90 kg Brothefe, deren Gehalt an SAME durch Zusatz von Methionin auf 6,88 g/kg angereichert wurde, mit 11 Liter Äthylacetat und 11 Liter Wasser vermischt.

Nach heftigem Rühren während 30 min wird der pH-Wert mit verdünnter Schwefelsäure auf 4,5 gestellt, das Gemisch filtriert und der Rückstand mit Wasser gewaschen, wobei 140 1 einer Lösung mit einem Gehalt an SAME von 4,40 g/1 anfallen, was 99,5% des im Ausgangsmaterial vorhandenen SAME entspricht.

Das so erhaltene Lysat wird bei 40 mbar Vakuum und 35-40 °C auf ein Volumen von etwa 141 konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird bei normalem Atmosphärendruck während 30 min unter Rückfluss beim Sieden gehalten, dann auf 20 °C gekühlt, der pH-Wert mit 40%iger Sodalösung auf 7 gestellt und die Lösung dann in einem Kühlschrank bei + 3 °C über Nacht stehengelassen.

Die gebildete weisse Ausfällung wird abfiltriert, in 101 siedendem destilliertem Wasser gelöst und durch Kühlung der Lösung kristallisiert.

Es werden 410 g kristallines MTA hoher Reinheit erhalten, was, bezogen auf das der Hydrolyse unterzogene SAME, 90%iger Ausbeute entspricht. Die Kennzeichen des erhaltenen Produktes entsprechen denjenigen von auf andere Arten hergestelltem, reinem MTA.

Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen der Formel I weisen eine starke entzündungshemmende Wirksamkeit auf, mit welcher analgetische und antipyretische Wirkung einhergehen.

Als erstes wurde die entzündungshemmende Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindung der Formel II durch den

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Test mit experimentell durch Carrageen in Ratten induziertem Ödem abgeklärt, indem die prozentuale Schutzwirkung nach der in «J. Pharm. Exper. Therap.», 141 (1963), S. 369 beschriebenen Winter-Methode bestimmt wurde. In der nachstehenden Tabelle 1 sind die jeweilige Verabreichungsdosierung und die dabei erhaltenen prozentualen Schutzwirkungen im Vergleich zum bekannten therapeutischen Mittel Indome-thacin zusammengefasst.

Tabelle 1

Dosierung, oral EDso mg/kg

Schutzwirkung auf

Ödementwicklung

%

MTA

37

50

MTA intramuskulär

verabreicht

23 (a)

50

Indomethacin

9

50

Aus Tabelle 1 geht hervor, dass die EDso von MTA bei oraler Verabreichung 37 mg/kg beträgt. Im Vergleichsversuch betrug die EDso der bekannten Verbindung Indomethacin 9 mg/kg, wobei bei dieser Dosierung ernsthafte Magengeschwüre auftreten, während das MTA bei einer Dosierung mit EDso keinen Sekundäreffekt auf das gastro-intestinale System ausübt. Es ist auch zu beachten, dass die LD von Indomethacin bei Ratten 12 mg/kg beträgt, wie von A. Martelli in «Aspetti die Farmacologia dell'Infiammazione», S. 73, Verl. Tamburini, Mailand (1973), beschrieben, während die LDso von MTA bei oraler Verabreichung an Ratten mehr als 200 mg/kg beträgt.

Es werden somit vergleichsweise die nachstehenden therapeutischen Indices (TI) erhalten:

Indomethacin TI = 1,3

MTA TI = >54,05

MTA wurde auch einer Reihe von pharmakologischen Tests unterzogen, um seine entzündungshemmende Wirksamkeit zu bestätigen und seine analgetische und antipyretische Wirksamkeit zu erläutern.

Die in einigen dieser Tests mit MTA erzielten Versuchsresultate sind im nachstehenden angeführt, wobei dieses Produkt in allen Fällen bei oraler Verabreichung die höchste Wirksamkeit zeigte und mit Gewissheit die sicherste Verbindung darstellt, da sie, wie bereits erwähnt, physiologisch im Organismus vorkommt.

Wiederum vom Gesichtspunkt der industriellen Herstellung ist die vorstehend beschriebene Methode zur Herstellung von MTA aus SAME bei weitem die einfachste und wirtschaftlichste Methode und ermöglicht den Verkauf des Produktes zu einem besonders niedrigen Preis.

A. Hinsichtlich entzündungshemmender Wirksamkeit wurden die Produkte auf in Ratten durch Carrageen nach der von G.P. Velo, C.J. Dunn et al. in «J. Path.», 111 (1973),

S. 149 beschriebenen Velo-Methode induzierter Pleuritis getestet.

Bei oraler Verabreichung einer Dosierung von 75 mg/kg ergab MTA, errechnet aus dem Volumen des Exsudats, eine Schutzwirkung von 42,4% und, errechnet aus der Gesamtzahl Zellen im Exsudat, von 48,8%.

Eine vergleichbare Schutzwirkung wurde mit Indomethacin in einer Dosierung von 10 mg/kg, d.h. bei einer viel näher bei der LDso liegenden Dosierung, erzielt.

B. Bei Prüfung der entzündungshemmenden Wirkung in dem von C.A. Winter, E.A. Riseley et al. in «J. Pharm. Exper.

Ther.», 141 (1963), S. 369 beschriebenen Test auf in Ratten durch Baumwollkügeichen erzeugtes Granulom, der für chronische Entzündung bedeutsam ist, ergab MTA bei oraler Verabreichung in einer Dosierung von 9 mg/kg bei einem TI von 222 eine Schutzwirkung von 30%.

C. Die analgetische Wirksamkeit der Produkte wurde nach zwei als sehr bedeutsam erachteten Testmethoden geprüft.

In dem von E. Roberts und D.G. Simonsen in «Biochem. Pharmac.», 15 (1966), S. 1875 beschriebenen Heissplattentest an Mäusen ergibt MTA bei oraler Verabreichung in einer Dosierung von 37 mg/kg eine Schutzwirkung von 50%. Eine etwa äquivalente Schutzwirkung von 58% wird vergleichsweise bei oraler Verabreichung von Amidopyrin in einer Dosierung von 100 mg/kg erzielt.

In dem von E. Siegmund, R. Cadmus, GO-LU in «Proc. Soc. Exp. Biol. Med.», 95 (1957), S. 729 beschriebenen Strecktest mittels Phenylchinon ergibt MTA bei oraler Verabreichung in einer Dosierung von 37 mg/kg eine Schutzwirkung von 51%.

D. Die antipyretische Wirksamkeit wurde nach der von C.V. Winder et al. in «J. Pharmacol. Exp. Ther.», 133 (1961), S. 117 beschriebenen Methode auf in Ratten durch Bierhefe erzeugtes Fieber getestet.

Die antipyretische, 1 h nach oraler Verabreichung von MTA in einer Dosierung von 300 mg/kg ermittelte Wirkung ergab eine Temperatursenkung um 4,59%, bezogen auf Blindversuche an nur mit Bierhefe behandelten Ratten. Der angegebene prozentuale Wert entspricht einer Temperatursenkung von 38,8 °C auf 37,4 °C.

Zum Vergleich ergab Amidopyrin bei oraler Verabreichung in einer Dosierung von 200 mg/kg eine Temperatursenkung um 4,69%, und bei intramuskulärer Verabreichung ergab MTA bei einer Dosierung von 80 mg/kg eine Temperatursenkung von 2,35%.

E. MTA wurde auch auf seine Fähigkeit zur Verhinderung der Agglomeration von Thrombozyten getestet.

Die Agglomeration von Thrombozyten ist als komplexe Erscheinung bekannt, die in ein primäres Stadium aufgrund der direkten Wirkung eines Stimulans, beispielsweise Adeno-sin-diphosphat, d.h. ADP, oder Epinephrin, und ein sekundäres Stadium aufgrund der durch das aus den Thrombozyten freigesetzte ADP induzierten Agglomeration aufgeteilt werden kann. Wenn in dieser Hinsicht die Thrombozyten mit dem subendothelialen Collagen in Berührung gelangen, regt das Collagen eine ganze Reihe von Reaktionen an, die zur Freisetzung von ADP aus den Thrombozyten führt. Durch dieses ADP wird die zweite Welle der Agglomeration von Thrombozyten erzeugt. Die nachstehenden Tests wurden ausgeführt, um die agglomerationsverhindernde Wirkung der beschriebenen Verbindungen der Formel I zu bestimmen:

1. In-vitro-Tests auf die durch ADP und Collagen in Gegenwart von Verbindungen der Formel I induzierte Thrombozyten-Agglomeration ;

2. In-vitro-Tests auf die durch Arachidonsäure (AA) induzierte Thrombozyten-Agglomeration ;

3. In-vivo-Tests auf durch ADP und Collagen in mit den Verbindungen der Formel I behandelten Personen induzierte Thrombozyten-Agglomeration.

Die Testresultate der nachstehend beschriebenen Versuche sind in Fig. 1 -4 der Zeichnungen diagrammatisch dargestellt.

1) In-vitro-Tests:

Blut wurde ohne Stauung entnommen und mit so viel 3,8%iger Natriumzitrat-Lösung versetzt, um ein Gewichtsverhältnis Blut:Natriumzitrat von 9:1 zu erhalten. Durch Zentri-fugieren bei Zimmertemperatur wurde Plasma mit einem

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hohen und solches mit einem niedrigen Gehalt an Thrombozyten hergestellt. Die Thrombozyten-Agglomeration wurde nach der von G.V.R. Born und M.J. Cross in «J. Physiol.», London, 168 (1963), S. 178 beschriebenen Born-&-Cross Methode an der Plasmafraktion mit hohem Gehalt an Thrombozyten bestimmt. Die Agglomerationsmittel wurden in den nachstehenden Konzentrationen eingesetzt: ADP (Sigma) I |iM; Collagen (Horn) 5 ug/ml; Arachidonsäure 4x 10_4M.

Als Vergleichssubstanz eines die Aglgomeration verhindernden Mittels wurde Adenosin in einer Konzentration von 1 x IO-5 M eingesetzt.

Im Diagramm von Fig. 1 sind die mit ADP als Agglomerationsmittel erhaltenen Testresultate aufgezeichnet, wobei auf der Abszisse die Zeitdauer in min und auf der Ordinate die prozentuale Agglomeration eingetragen sind. Die Kurve 1 bezieht sich auf Blindversuche, die Kurve 2 auf die mit 1 x IO-5 M Adenosin behandelten Muster und Kurve 3 auf die mit 5 x 10-4 M MTA behandelten Muster.

Aus den Kurven des Diagramms geht hervor, dass MTA die durch ADP induzierte primäre Thrombozyten-Agglome-ration stark vermindert und demzufolge die zweite Agglomerationswelle unterdrückt.

Die gleichen, jedoch mit Collagen als Agglomerationsmittel ausgeführten Tests ergaben negative Resultate, d.h. MTA zeigte höchstens eine vernachlässigbare Wirksamkeit in bezug auf die Verhinderung der durch Collagen induzierten Thrombozyten-Agglomeration.

2. Das Diagramm von Fig. 2 zeigt die Auswirkung von verschiedenen MTA-Konzentrationen auf durch AA in einer Konzentration von 4 x IO-4 M induzierter Thrombozyten-Agglomeration. Die Kurve 1 bezieht sich auf Blindversuche, die Kurve 2 auf eine Anwendungskonzentration des MTA von 2,5 x IO-4 M, die Kurve 3 auf eine Anwendungskonzentration des MTA von 5 x IO-4 M und die Kurve 4 auf eine Anwendungskonzentration des MTA von IO-3 M. Es ist offensichtlich, dass die Wirksamkeit in bezug auf die Verhinderung der Thrombozyten-Agglomeration durch MTA proportional zu dessen Anwendungskonzentration verläuft.

Ebenfalls geprüft wurde die Fähigkeit von MTA, die Wirksamkeit von Prostacyclin (PGh) zur Verhinderung von durch AA induzierter Thrombozyten-Agglomeration zu erhöhen. Im Diagramm der Fig. 3 sind die erhaltenen Testresultate dargestellt. Die Kurve 1 bezeiht sich auf Blindversuche, die Kurve 2 auf eine Anwendungskonzentration des MTA von 5 x IO-4 M, die Kurve 3 auf eine Anwendungskonzentration von PGh von 5 x 10~9 M und die Kurve 4 auf ein Gemisch von MTA in einer Anwendungskonzentration von 5 x 10-5 M und PGh in einer Anwendungskonzentration von 5 x IO-9 M. Aus Fig. 3 ist ersichtlich, dass durch Anwendung des Gemischs eine starke Erhöhung der Wirksamkeit zur Verhinderung der Thrombozyten-Agglomeration bei Anwendungskonzentrationen der beiden Wirkstoffkomponenten erzielt wird, die bei einzelner Anwendung unwirksam sind.

3. Für die Ausführung der In-vivo-Tests wurden drei offensichtlich gesunde freiwillige Prüfpersonen im Alter von 35,42 bzw. 48 Jahren, die zuvor während mindestens 15 d keinerlei Arzneimittel eingenommen hatten, vor und nach der Einnahme von zu prüfenden Verbindungen der Formel I in einer Dosierung von je 100 mg alle 8 h während 3 d Agglomerationstests unterworfen und die erhaltenen Testresultate ausgewertet. Die Blutprobe für die Bestimmung der Thrombozyten-Agglomeration wurde 2 h vor Einnahme der letzten Dosis der zu prüfenden Verbindung entnommen.

Im Diagramm von Fig. 4 sind die mit MTA erzielten Testresultate dargestellt. Die ausgezogenen Kurven beziehen sich auf die Testresultate von Blindproben mit den unbehandelten Prüfpersonen, und die gestrichelten Kurven beziehen sich auf die Testresultate der gleichen Prüfpersonen nach der

Behandlung mit MTA. Es ist offensichtlich, dass in vivo durch ADP in einer Anwendungskonzentration von 1 |j.M induzierte Thrombozyten-Agglomeration durch die Behandlung mit MTA stark unterdrückt wird.

5 Wiederholung der gleichen Testreihe unter Zusatz von Collagen in einer Anwendungskonzentration von 5 ug/ml zum Blut ergab, dass MTA keine Wirksamkeit zur Verhinderung von durch Collagen induzierter Thrombozyten-Agglo-meration aufweist, sondern nur die Latenzzeit der Erschei-io nung verlängert.

Die Tatsache, dass MTA und in mehr oder weniger vergleichbarem Ausmass die übrigen Verbindungen der gleichen Klasse durch ADP induzierte Thrombozyten-Agglomeration stark unterdrückt, dagegen praktisch keine Wirkung auf 15 durch Collagen induzierte Thrombozyten-Agglomeration zeigt, deutet daraufhin, dass durch MTA das erste Agglomerationsstadium verhindert wird, während eine direkte Auswirkung auf das zweite Agglomerationsstadium von vernachlässigbarem Ausmass ist.

20 Die Verwendung in Kombination mit anderen bekannten Arzneimitteln gegen Thrombozyten-Agglomeration, die im allgemeinen gegen das zweite Agglomerationsstadium wirksam, gegen das erste Agglomerationsstadium jedoch kaum wirksam sind, ist daher von besonderem Interesse. 25 Durch die erwiesene Wirksamkeit wird angeregt, MTA nicht nur als therapeutisches Mittel gegen die Thrombozyten-Agglomeration einzusetzen, sondern auch als antithrombotisches und antiatherosklerotisches Arzneimittel, da das veränderte Verhältnis zwischen Thrombozyten und Aderwandun-30 gen, neben der Tatsache, die Basis für thrombogenetische Mechanismen darzustellen, auch eine primäre Rolle in athe-rosklerotischen Erkrankungen spielt.

F. Die einschläfernde Wirkung wurde nach dem von R.W. Morris in «Arch. int. Pharmacodyn», 161, Nr. 2 (1966), S. 380

35 beschriebenen Morris-Test geprüft. In diesem Test wurde die Dauer des in Mäusen durch intramuskuläre Verabreichung von Pentobarbital in einer Dosierung von 20 mg/kg erzeugten Schlafs durch MTA um 87% verlängert.

G. Hinsichtlich akuter Toxizität sind die beschriebenen 40 Verbindungen der Formel I bei oraler Verabreichung praktisch ohne akute Toxizität. In therapeutischer Dosierung sind sie bei jeder beliebigen Verabreichungsform praktisch ohne Toxizität.

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MTA

oral intravenös

> 2000 DL50, mg/kg 360 DLso, mg/kg

MTA kann verdünnt mit entsprechenden pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmitteln in jeder beliebigen therapeutisch wirksamen Form verabreicht werden, oral, parenteral, in die so Venen oder rektal wie auch in Produkten für äusserliche örtliche Anwendung.

Im nachstehenden sind beispielsweise einige typische, MTA enthaltende pharmazeutische Zubereitungen angeführt:

55 100-mg-Kapseln MTA Mannit

M agnesiumstearat

60 50-mg-Kapseln MTA Mannit

Magnesiumstearat

65 100-mg-Tabletten MTA Stärke

Magnesiumstearat

100,2 mg 195,0 mg 5,0 mg 300,2 mg

50,1 mg

100.0 mg 3,0 mg

153.1 mg

100.2 mg 100,0 mg

15,0 mg

5

650 514

.actose

;0-mg-Tabletten

»ITA

Jtärke

Magnesiumstearat .actose

OO-mg-Suppositorien vITA

>uppositorienmasse iO-mg-Suppositorien vlTA

iuppositorienmasse i'0-mg-lnjektionsampulle vlTA-HCl (56,15 mg basisch äquivalent)

Jdocain-HCl

Wasser auf

85,0 mg

25-mg- Injektionsampulle

300,2 mg

MTA-HCl (28,07 mg basisch äquivalent)

25 mg

Lidocain-HCl

20 mg

50,1 mg

Wasser auf

2 ml

120,0 mg s 100 mg orale Dosierung

15,0 mg

MTA-HCl (112,3 mg basisch äquivalent)

100 mg

115,0 mg

Zitronenaroma

0,025 mg

300,1 mg

Zucker lg

Antifermentierungsmittel

50 mg

100,2 mg io Wasser auf

5 ml

1700,0 mg

50 mg orale Dosierung

1800,2 mg

MTA-HCl (56,15 mg basisch äquivalent)

50 mg

Zitronenaroma

0,015 mg

50,1 mg

Zucker

0,5 g

1450,0 mg i5 Antifermentierungsmittel

30 mg

1500,1 mg

Wasser auf

5 ml

100 g Salbe

50 mg

MTA

5g

25 mg

Basis für wasserlösliche Salbe, auf

100 g

3 ml

20 Antioxidant

0,1g o

Claims (3)

1. 650 514
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das gebildete 5'-Desoxy-5'-methylthioadenosin durch Kühlen auf 0-5 °C ausfällt.

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   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von 5'-Desoxy-5'-methyl-thioadenosin der Formel

   OH OH

   dadurch gekennzeichnet, dass man S-Adenosylmethionin in konzentrierter wässeriger Lösung durch Erwärmen auf Rückflusstemperatur hydrolisiert und das gebildete 5'-Desoxy-5'-methylthioadenosin nach Neutralisation des Reaktionsgemisches durch Kühlen abtrennt.
3. 3. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 auf eine konzentrierte, wässerige Lösung von S-Adenosylmethionin, die man durch Eindampfen bei 35-40 °C aus einer verdünnten wässerigen Lösung von S-Adenosylmethionin erhält.