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PATENTANSPRÜCHE
1. Die Substanz SF-1739 HP mit folgenden physikochemischen Eigenschaften: (1) Schwärzlich purpurne Substanz (2) Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 1 (3) Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig. 2 mit folgenden charakteristischen Absorptionsbanden bei 3350, 1655, 1600, 1540,1355, 1265,1235,1180,1120,1080,1020,1000,965,945, 920, 910, 865, 830, 790 und 750 cm' (4) Magnetisches Kernresonanzspektrum gemäss Fig. 3 (5) Rotationssdispersionskurve gemäss Fig. 4 (6) Elementaranalyse: gef.:
: C 62,19 % H 6,95 % N 8,50 % O 22,36 % (Differenz) (7) Löslichkeit: In Wasser und Methanol leicht löslich, in Äthylacetat löslich und in Hexan spärlich löslich (8) Chromatographie: Mittels Dünnschichtchromatographie über Kieselgel: Rf-Werte= 0,45; Chloroform:Methanol = 9:1 oder 0,23; Mischung von Butanol, Methanol und 0,1n Salzsäu- re = 4:2:1.
2. Die Substanz SF-1739 HP-C mit folgenden physikochemischen Eigenschaften: (1) Schwärzlich purpurne Substanz (2) Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 5 (3) Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig.6 mit den folgenden charakteristischen Absorptionsbanden bei 3350, 1660, 1600, 1535,1355, 1265,1235,1200,1175, 1140,1120, 1080,1060,1000, 9401 910, 880, 835 und 795 cm-1.
(4) Rotationsdispersionskurve gemäss Fig. 7 (5) Magnetisches Kernresonanzspektrum gemäss Fig. 8 (6) Elementaranalyse: gef.: C 59,58 % H 6,14% N 12,63 % O 21,65 % (Differenz) (7) Löslichkeit: In Wasser und Methanol leicht löslich, in Aceton und Äthylacetat löslich und in Hexan spärlich löslich (8) Chromatographie: Mittels Dünnschichtchromatographie über Kieselgel: Rf-Werte = 0,40; Chloroform:Methanol = 9:1 und 0,70; Äthylacetat:Methanol = 3:2.
3. Die Substanz SF-1739 HP-F mit folgenden physikochemischen Eigenschaften: (1) Schwärzlich purpurne Substanz (2) Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 9 (3) Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig. 10 mit folgenden charakteristischen Absorptionsbanden bei 3300,1660,1530, 1350,1310,1265,1235,1205,1175,1125,1085, 920, 830 und 795 cm-1.
(4) Elementaranalyse: gef.: C 57,26 % H 6,33 % N 12,14 % O 24,27 % (Differenz) (5) Löslichkeit: In Wasser und Methanol leicht löslich, in Aceton und Äthylacetat löslich und in Hexan spärlich löslich (6) Chromatographie: Durch Dünnschichtchromatographie über Kieselgel Rf-Werte = 0,28; Chloroform:Methanol = 9:1 und 0,53; Äthylacetat:Methanol = 3:2.
4. Die Substanz SF-1739 HP-5 mit folgenden physikochemischen Eigenschaften: (1) Schwärzlich purpurne Substanz (2) Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 11 (3) Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig. 12 mit den folgenden charakteristischen Absorptionsbanden bei 3300,1655, 1600,1540,1350,1260,1235,1175,1085,1025, 835, 790 und 775 cm-1.
(4) Magnetisches Kernresonanzspektrum gemäss Fig. 13 (5) Elementaranalyse: gef.: C 60,93 % H 7,05 % N 8,41 % O 23,61 % (Differenz) (6) Löslichkeit: In Wasser und Methanol leicht löslich, in Äthylacetat und Aceton löslich und in Hexan spärlich löslich (7) Chromatographie: Durch Dünnschichtchromatographie über Kieselgel Rf-Werte = 0,12; Chloroform:Methanol = 9:1 und 0,12; Äthylacetat:Methanol = 3:2.
5. Die Substanz SF-1739 HP-3 mit folgenden physikochemischen Eigenschaften: (1) Schwärzlich purpurne Substanz (2) Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 14 (3) Infrarotabsorptionsspektrum gemäss Fig.15 mit den folgenden charakteristischen Absorptionsbanden bei 3355,1680, 1655,1600,1545,1350,1310.1265,1180,1155, 1020, 950, 955, 900, 835 und 790 cm-1 (4) Magnetisches Kernresonanzspektrum gemäss Fig. 16 (5) Elementaranalyse: gef.: C 64,13 % H 5,01 % N 9,25 % O 21,61 % (Differenz) (6) Löslichkeit:
In Wasser und Methanol leicht löslich, in Aceton und Äthylacetat löslich und in Hexan spärlich löslich (7) Chromatographie: Durch Dünnschichtchromatographie überKieselgelRf-Werte = 0,22; Chloroform:Methanol = 9:1 und 0,39; Äthylacetat:Methanol = 3:2.
6. Verfahren zur Herstellung der Substanz SE;-1739 HP, dadurch gekennzeichnet, dass man die Substanz SF-1739 mit einer Säure behandelt.
7. Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1739 HP-C, dadurch gekennzeichnet, dass man die Substanz SF-1739 mit einer Säure so behandelt, dass man die Substanz SF-1739 HP erhält, und dass man hierauf das so erhaltene Produkt mit einem Cyanid umsetzt.
8. Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1739 HP-F, dadurch gekennzeichnet, dass man die Substanz SF- 1739 mit einer Säure so behandelt, dass man die Substanz SF-1739 HP erhält und das so erhaltene Produkt mit Formamid umsetzt.
9. Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1739 HP-5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein antibiotisches Metabolit mit einer Säure behandelt, wobei der Metabolit durch Züchtung von Streptomyces griseoplanus Stamm SF-1739 und durch nach- folgende Fraktionierung der Kulturbrühe erzeugt wird.
10. Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1739 HP-3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein antibiotisches Metabolit mit einer Säure behandelt, wobei das Metabolit durch Züchtung von Streptomyces griseoplanus Stamm SF-1739 und durch nach- folgende Fraktionierung der Kulturbrühe erhalten wird.
11. Antibakterielles Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirksubstanz eine oder mehrere der folgenden antibiotischen Substanzen, nämlich Substanz SF-1739 HP-F, Substanz SF-1739 HP-C, Substanz SF-1739 HP-F, Substanz SF-1739 HP-5 und Substanz SF-1739 HP-3, und einen pharmazeutisch zulässigen Träger enthält.
12. Antitumorpräparat, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirksubstanz eine oder mehrere der folgenden Substanzen, nämlich SF-1739 HP, Substanz SF-1739 HP-C, Substanz SF-1739 HP-F, Substanz SF-1739 HP-5 und Substanz SF-1739 HP-3, und einen pharmazeutisch zulässigen Träger enthält.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Gruppe von Derivaten der Substanz SF-1739, auf Verfahren zur Herstellung solcher Derivate und auf mindestens ein solches Derivat als Wirksubstanz enthaltende antibakterielle und krebsverhindernde Präparate.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue und wertvolle Derivate der Substanz SF-1739, nämlich Substanz SF-1739 HP, Substanz SF-1739 HP-C, Substanz SF-1739 HP-F, Substanz SF-1739 HP-3 und Substanz SF-1739 HP-5, auf Verfahren zur Herstellung solcher Derivate vonSF-1739 sowie auf als Wirksubstanz mindestens ein Derivat der Substanz SF-1739 enthaltende antimikrobielle und krebsbekämpfende Präparate.
In der nicht geprüften veröffentlichten Japanischen Patentanmeldung Nr. 125 798/1976, am 24. April 1975 durch die Firma Meiji Seika Kaisha Ltd., Japan unter. 49 131/1975 eingereicht wird offenbart. dass man eine antibiotische Substanz SF-1739
durch Züchtung von Streptomyces griseoplanus Stamm SF-1739 erhalten kann. Ferner ist gemäss Bericht im Annual Report of Meiji Seika Laboratories. Bd. 16,S.20, die Substanz SF-1739 eine disäurige Base von nichtidentifizierter chemischer Struktur, wobei die physikochemischen und biologischen Eigenschaften dieser Substanz in jenem Bericht ausführlich beschrieben werden. Ferner ist bekannt, dass die Substanz SF-1739 unter alkalischen Bedingungen ausserordentlich unbeständig ist und selbst in freier Basenform in verschiedene Fraktionen zersetzt wird, welche nach dem Stehenlassen in trockenem Zustand während einigen Tagen keine antibakteriellen Eigenschaften aufweisen, während diese Substanz unter sauren Bedingungen ausserordentlich beständig ist.
Die Beständigkeit der Substanz SF-1739 unter sauren Bedingungen wurde nun gründlich untersucht, wobei festgestellt wurde, dass man durch deren Behandlung mit einer starken Säure eine neue Substanz SF-1739 HP erhalten kann, welche starke antibakterielle und krebsverhindernde Wirkung ausübt.
Angesichts des Umstandes, dass diese neue und wertvolle Substanz SF-1739 HP überdies eine beträchtlich höhere Toxizität aufweist, wurden Studien mit Derivaten der Substanz SF-1739 HP eingeleitet, um die Toxizität dieser Verbindung zu vermindern, wobei man überdies feststellen konnte, dass man eine neue Gruppe von Derivaten der Substanz SF-1739 HP, nämlich die Substanz SF-1739 HP-C und Substanz SF-1739 HP-F, durch Umsetzung der Substanz SF-1739 HP mit einem Cyanid oder Formamid erhalten kann. Es wurde ferner festgestellt, dass diese Derivate für die beabsichtigen Zwecke besonders geeignet sind.
Anderseits wurden weitere Metabolite untersucht, welche in einer Kulturbrühe durch Züchtung eines Actinomyceten, wie Streptomyces griseoplanus Stamm SF-1739, hergestellt werden können (vergl. ungeprüfte Japanische Patentanmeldung Nr.
125798/1976. Dabei wurde festgestellt, dass in einer Kulturbrühe gelbe Metabolite anfallen, welche sich von der Substanz SF-1739 eindeutig unterscheiden, wenngleich sie ähnliche Rf-Werte aufweisen. Es wurde ferner festgestellt, dass diese neuen antibiotischen Subtanzen, nämlich die Substanz SF-1739 HP-3 und Substanz SF-1739 HP-5 sich durch Behandlung mit einer starken Säure von den gelben Metaboliten herstellen lassen.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung einer neuen Gruppe von fünf neuen antibiotischen Substanzen, nämlich Substanz SF-1739 HP, Substanz SF-1739 HP-C, Substanz SF
1739 HP-F, Substanz SF-1739 PH-3 und Substanz SF-1739 HP-5.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung dieser antibiotischen Substanzen.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die
Schaffung von antibakteriellen und krebsverhindernden Präparaten, welche als Wirksubstanz mindestens ein Derivat der soeben genannten Substanz SF-1739 enthalten.
Wie soeben erwähnt wurde. visiert die vorliegende Erfindung fünf verschiedene Derivate der Substanz SF-1739. Jedes dieser Derivate und die Herstellung derselben werden nachstehend ausführlich beschrieben.
I. Substanz SF-1739 HP (1) Physikochemische Eigenschaften:
Diese Substanz besitzt keinen genauen Schmelzpunkt und schmilzt unter Schwarzwerden in einem Temperaturbereich von ungefähr 150 bis 1800 C. Sie besitzt in Methanol ein ultraviolettes
Absorptionsspektrum gemäss beiliegender Fig. 1 [dargestellt mit der ausgezogenen Linie (-) in Fig. 1] mit drei Absorptionsmaxi ma bei 220 nm (E'?Äm =407), 275 nm (132) und 535 nm (21), ein
Spektrum in 0.05n Salzsäure und 95Ncigem Methanol [dargestellt durch eine punktierte Linie (..
..) in Fig. 1] mit zwei Absorptionsmaxima bei 265 nm (E1%rn = 754),410 (16) und ein weiteres Spektrum in 0,05n Natriumhydroxydlösung und 95%igem Methanol [dargelegt mit einer strichpunktierten Linie(-.-.-.-) in Fig. 1] mit Absorptionsmaxima bei 221 nm (E1"fcm = 440), 277 (124), 345 (Schulter) und 540 (24). Sie zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (in Nuj ol) gemäss Fig. 2 mit zwei charakteristischen Absorptionsbanden bei 3350, 1655,1600,1540,1355, 1265, 1235,1180,1120,1080, 1020,1000,965,945,920, 910,865,830, 790 und 750 cm¯l und ein magnetisches Kernresonanzspektrum (in D2O) gemäss Fig. 3.
Das Massenspektrum dieser Substanz zeigt Peaks bei m/e 412,430, so dass das Molekulargewicht dieser Substanz als praktisch das Gleiche wie für die Substanz SF-1739 geschätzt wird. Sie besitzt die folgende analytische Zusammen setzung: C = 62,19%; H = 6,95%;N = 8,50%; O =22,36% (Differenz). Sie weist eine Rotationsdispersionskurve gemäss Fig. 4 auf, aufgrund welcher die spezifische Drehung [a]'5860 +70 (in 0,05%igem Methanol) berechnet wird. Sie stellt eine schwärzlich purpurne Substanz dar, welche in Wasser und Methanol leicht löslich, in Aceton und Äthylacetat löslich und in Hexan spärlich löslich ist. Die Rf-Werte dieser Substanz über Kieselgel mittels Dünnschichtchromatographieplatten, die bei der Fa.
Merk, Bundesrepublik Deutschland, erhältlich sind, liegen bei 0,45, sofern die Entwicklung mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 erfolgt, und 0,23, sofern die Entwicklung mit einer Mischung von n-Butanol, Methanol und 0, ln Salzsäure im Mischungsverhältnis von 4:2:1 erfolgt, während die entsprechenden Werte für die Substanz SF1739 bei 0,76 bzw. 0,39 liegen. Die Beständigkeit der Substanz SF-1739 HP ist, verglichen mit der Ausgangssubstanz SF-1739 wesentlich besser, wobei diese Substanz unter sauren und alkalischen Bedingungen beständig ist. Lässt man sie beispielsweise über Nacht bei Zimmertemperatur in einer 5n Salzsäurelösung liegen, so verhält sie sich vollständig beständig, während die Ausgangssubstanz SF-1739 sich unter den gleichen Bedingungen in die Substanz SF-1739 HP umwandelt.
Selbst beim Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur in einer methanolischen 0, ln Natriumhydroxydlösung wird keine signifikante Verringerung der antibakteriellen Wirkung verursacht, während die Ausgangssubstanz SF-1739 in einer solchen Lösung im wesentlichen inaktiviert wird.
(2) Herstellung:
Diese Substanz wird durch Behandeln der Substanz SF-1739 mit einer Säure erhalten. Als für diese Behandlung verwendbare Säuren kommen beispielsweise Mineralsäuren, wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure usw. sowie organische Säuren, wies. B. Tetrafluoressigsäure, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure usw. in Frage. Die Reaktionsparameter können je nach der Art und der Konzentration der zu verwendenden Säure und des zu verwendenden Lösungsmittels schwanken.
Verwendet man eine Mineralsäure, so erfolgt die Behandlung vorzugsweise unter Kühlen oder bei Zimmertemperatur bei 1 Tag bis 1 Woche, wenn eine höhere Konzentration von 5 bis 10normal zur Anwendung gelangt, oder bei Zimmertemperatur oder einer höheren Temperatur während 1 bis mehreren Tagen, wenn eine geringere Konzentration von nicht mehr als 5-normal angewandt wird. Bei einer erhöhten Temperatur von mehr als 80" C besteht hin und wieder Neigung zur Bildung von Nebenprodukten. Die Behandlung kann in einer wässrigen Lösung rascher durchgeführt werden als in wässrigem Methanol. Die Überführung der Substanz SF-1739 in die Substanz SF-1739 HP kann bei einem pH-Wert von weniger als 3 durchgeführt werden.
Nach beendeter Behandlung kann man die Substanz SF-1739 HP leicht in an sich bekannter Weise aus dem Reaktionsgemisch gewinnen, wobei man die oben erwähnten physikochemischen Eigenschaften der Substanz SF-1739 HP erzielt. So kann man das Reaktionsgemisch beispielsweise mit einer Base, wie Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat und dergl., neutralisieren, dann zur Trockne einengen und den Rückstand mit Methanol extrahieren und hierauf den Extrakt direkt durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel reinigen.
Andererseits kann man das Reaktionsgemisch im Hinblick darauf, dass weniger Nebenprodukte gebildet werden, einengen, den Rückstand in Methanol lösen und die entstandene Lösung neutralisieren und hierauf durch eine Sephadex LH-20-Säule (erhältlich bei der Firma Pharmacia, Schweden) hindurchführen, worauf die Entwicklung mit Methanol oder mit einem Mischlösungsmittel von Äthylacetat und Methanol erfolgt. Auf diese Weise erhält man das gereinigte Produkt.
II. Substanz SF-1739 HP-C und Substanz SF-1739 HP-F (IIa) Substanz SF-1739 HP-C (1) Physikochemische Eigenschaften
Diese Substanz besitzt keinen bestimmten Schmelzpunkt und schmilzt unter Schwarzwerden innerhalb eines Bereiches von ungefähr 120 bis 1500 C. Sie besitzt in Methanol ein Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 5 [dargestellt mit einer ausgezogenen Linie in Fig. 5] mit drei Absorptionsmaxima bei 222 nm (E17"cm = 400), 273 nm (146) und 540 nm (30), ein weiteres Spektrum in einer Mischung von O,ln Salzsäure und 90%igem Methanol [dargestellt mit einer gestrichelten Linie in Fig.
5] mit Absorptionsmaxima bei 204 nm, 266 nm (E117rn = 174) und 410 nm (22) und ein Spektrum in einer Mischung von O,ln Natriumhydroxyd und 90%igem Methanol [dargestellt mit einer strichpunktierten Linie in Fig. 5] mit Absorptionsmaxima bei 222 nm (E1ícm =422), 275 nm (140) und 550 nm (32). Sie besitzt ein Infrarotabsorptionsspektrum (in Nujol) gemäss Fig. 6 mit cha rakteristischen Absorptionsbanden bei 3350,1660, 1535, 1355, 1265, 1235, 1200, 1175, 1140, 1120, 1080,1060, 1000,940,910, 880,835 und 795 cml. Die Rotationsdispersionskurve ist aus Fig.
7 ersichtlich. Das magnetische Kernresonanzspektrum (in D20) entspricht der Fig. 8. Die analytische Zusammensetzung ist die folgende: C = 59,58%; H = 6,14 %; N = 12,63 %; 0 = 27,65 % (Differenz). Die Substanz ist schwärzlich purpurrot, in Wasser und Methanol leicht löslich, in Aceton und Äthylacetat löslich und in Hexan spärlich löslich. Die Rf-Werte dieser Substanz, gemessen auf einer mit Kieselgel beschickten Dünnschichtchromatographieplatte (erhältlich bei der Firma E. Merck, BundesrepublikDeutschland) sind bei 0,40, sofern die Entwicklung mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 vorgenommen wird, und bei 0,70, sofern die Entwicklung mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 3:2 geschieht.
Die entsprechenden Werte für die Substanz SF-1739 HP liegen bei 0,26 bzw. 0,31. Die hier beschriebene Substanz ist in trockenem Zustand und in neutraler, saurer und alkalischer methanolischer Lösung beständig.
(II-b) Substanz SF-1739 HP-F (1) Physikochemische Eigenschaften:
Diese Substanz besitzt keinen bestimmten Schmelzpunkt und schmilzt unter Schwarzwerden in einem Bereiche von 110 bis 140 C. Sie besitzt in Methanol ein Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 9 [dargestellt mit einer ausgezogenen Linie in Fig. 9] mit drei Absorptionsmaxima bei 220 nm, 275 nm (E1locm = 121) und 540 nm (24), einweiteres Spektrumin0,inSalzsäurelö- sung und 90%igem Methanol [dargestellt mit einer gestrichelten Linie in Fig. 9] mit Absorptionsmaxima bei 205 nm, 268 nm (E17'c0m = 133) und 405 nm (19) und ein weiteres Spektrum in 0,1n Natriumhydroxyd und 90%igem Methanol [dargestellt mit einer strichpunktierten Linie in Fig.
9) bei 221 nm, 277 nm (E1ifcm = 117) und 540 nm (29). Sie besitzt ein Infrarotabsorptionsspektrum (in Nujol) gemäss Fig. 10 mit charakteristischen Absorptionsbanden bei 3300,1660,1530,1350, 1310, 1265, 1235 1205, 1175,1125,1085,1025, 1000,940,920, 830 und 795 cml. Die analytische Zusammensetzung dieser Substanz ist die folgende: C = 57,26 %;H = 6,33 %;N = 12,14 Nc; O = 24,27 % (Diffe- renz). Es handelt sich um eine schwärzlich purpurrote Substanz, welche in Wasser und Methanol leicht löslich, in Aceton und Äthylacetat löslich und in Hexan spärlich löslich ist. Ihre Rf Werte bei der Dünnschichtchromatographie über Kieselgel auf einer Platte, wie sie durch die Firma E.
Merck, BRD, erhältlich ist, liegen bei 0,28, sofern die Entwicklung mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 erfolgt, und bei 0,53, sofern die Entwicklung mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 3:2 geschieht, während die entsprechenden Werte für die Substanz SF-1739-HP bei 0,26 bzw. 0,31 liegen. Die neue Substanz ist in trockenem Zustand und in neutraler und alkalischer methanolischer Lösung beständig, in saurer Methanollösung allerdings weniger beständig.
(II-c) Herstellung beider Substanzen
Substanz SF-1739 HP-C wird aus der Substanz SF-1739 HP, welche gemäss den in obigem Absatz I (2) gemachten Angaben erhalten wird, durch Umsetzung mit einem Cyanid erhalten.
Als verwendbares Cyanid kommen beispielsweise Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Metall- oder organische Aminsalze der Cyanwasserstoffsäure, einschliesslich Ammoniaksalze dieser Säure, z. B. Natrium-, Kalium-, Lithium-, Magnesium- oder Ammoniumcyanid usw. in Frage. Ferner kann man auch Cyanidionen (CN-) zu erzeugen vermögende Verbindungen, wie z. B.
Bromcyan usw., einsetzen.
Andererseits wird die Substanz SF-1739 HP-F durch Umsetzung der Substanz SF-1739 HP mit Formamid erhalten.
In beiden Fällen erfolgt die Umsetzung mit Vorteil rasch unter Kühlen oder bei Zimmertemperatur und ist im wesentlichen nach ungefähr 5 bis 30 min beendet. Bei einer höheren Temperatur als der Zimmertemperatur ist die Neigung zur Bildung von Nebenprodukten erhöht. Als in beiden dieser Fälle verwendbare Lösungsmittel kann man beispielsweise Wasser, Alkohole, Dimethylformamid, Mischungen von Lösungsmitteln, d. h. eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels und Wassers usw. verwenden. Überdies kann das Formamidim Überschuss verwendet werden, wobei es dann sowohl als Reaktionsmittel als auch als Lösungsmittel für die Herstellung der Substanz SF-1739 HP-F wirkt.
Nach beendeter Umsetzung kann man das gewünschte Produkt in an sich bekannter Weise leicht gewinnen und reinigen, wobei man die oben erwähnten physikochemischenEigenschaften einer jeden Substanz verwerten kann. So kann man das Reaktionsgemisch zur Trockene einengen und den Rückstand mit Methanol extrahieren und den so erhaltenen Extrakt direkt durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel reinigen.
Da geringe Mengen von Nebenprodukten bei diesen Umsetzungen anfallen, kann man das Reaktionsgemisch einengen, den Rückstand in Methanol lösen und die entstandene Lösung durch eine Säule aus Sephadex LH-20 (erhältlich bei der Firma Pharmacia, Schweden) hindurchleiten, worauf man mit Methanol oder einem Lösungsmittelgemisch von Äthylacetat und Methanol entwickeln kann, um das gewünschte Produkt zu reinigen.
III. Substanz SF-1739 HP-5 und Substanz SF-1739-HP-3 (III-a) Substanz SF-1739-HP-5 (1) Physikochemische Eigenschaften:
Diese Substanz stellt eine schwärzlich purpurrote, pulvrige Substanz dar, welche keinen bestimmten Schmelzpunkt aufweist und unter Schwarzwerden in einem Bereiche von ungefähr 150 bis 1800 C schmilzt.
Sie besitzt ein Ultraviolettabsorptionsspektrum in Methanol gemäss Fig. 11 [dargestellt durch eine ausgezogene Linie in Fig. 11] mit drei Absorptionsmaxima 220 nm (El m = 375), 275 nm (156) und 535 nm (28), ein Spektrum in 0,05n Salzsäure und 95 %igem Methanol [dargestellt mit der punktierten Linie in Fig. 11] mit zwei Absorptionsmaxima bei 266 nm (El ícm = 199) und 410 nm (22) und ein Spektrum in 0,05n Natriumhydroxid und 95%igem Methanol [dargestellt mit einer strichpunktierten Linie in Fig. 11] mit Absorptionsmaxima bei 276 nm (E1lycm = 148) und 550 nm (34).
Sie besitzt ein Infrarotabsorptionsspektrum (in Nujol) gemäss Fig. 12 mit charakteristischen Absorptionsbanden bei 3300, 1655, 1600, 1540, 1350,1260, 1235,1175,1085,1025,1000,905,865,835,790 und 775 cm¯1 und überdies ein magnetisches Kernresonanzspektrum (in D20) gemäss Fig. 13. Die Analyse am magnetischen Kohlenstoff 13 mittels Resonanzspektl um gibt wieder, dass mindestens 19 Kohlenstoffatome im Molekül der Substanz SF-1739 HP-5 vorhanden sind. Das gemäss der Dampfdruckmethode geschätzte Molekulargewicht liegt bei ungefähr 550. Die analytische Zusammenset zungistdiefolgende: C = 60,93 %; H = 7,05 %; N = 8,41 %; O = 23,61 % (Differenz). Die Substanz ist in Wasser und Methanol leicht löslich, in Aceton und Äthylacetat löslich und in Hexan spärlich löslich.
Ihre Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie über Kieselgel auf einer Platte, die durch die Firma E.
Merck, BRD, erhältlich ist, liegen bei 0,12 beim Entwickeln mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 und bei 0,12 beim Entwickeln mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 3:2, während die entsprechenden Werte für die Substanz SF-1739 HP bei 0,26 bzw. 0,31 liegen. Die Substanz ist in trockenem Zustand und in Methanol beständig, in wässrigem Methanol leicht unbeständig und in alkalischem Methanol weniger beständig.
(III-b Substanz SF-1739 HP-3 (1) Physikochemische Eigenschaften
Diese Substanz stellt eine schwärzlich purpurrote, pulvrige Substanz dar, welche keinen bestimmten Schmelzpunkt aufweist, hingegen unter Schwarzwerden in einem Temperaturbereich von 130 bis 150"C schmilzt. Sie zeigt in Methanol ein Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäss Fig. 14 [dargestellt mit einer ausgezogenen Linie in Fig. 14] mit vier Absorptionsmaxima oder einem Wendepunkt bei 219 nm (E'i7c'm = 890), 267 nm (314), 330 nm (Schulter) und 543 nm (54), ein Spektrum in 0,05n Salzsäure und 95 %igem Methanol [dargestellt mit einer punktierten Linie in Fig.
14] mit drei Absorptionsmaxima bei 264 nm (E1lcm = 372), 325 nm (62), 420 nm (40) und ein Spektrum in 0,05n Natriumhydroxyd und 95%igem Methanol [dargestellt mit einer strichpunktierten Linie in Fig. 14] mit drei Maxima bei 267 nm (E'7'c0m =276), 375 nm (44) und 543 nm (64). Sie besitzt auch ein Infrarotabsorptionsspektrum (in Nujol) gemäss Fig. 15 mit charakteristischen Absorptionsbanden bei 3355, 1680,1655, 1600, 1545, 1350, 1310, 1265, 1180, 1155, 1085, 1070,1055, 1020, 950,955,900,835 und 790 cm' und ein magnetisches Kernresonanzspektrum in (D20) gemäss Fig. 16. Das Molekulargewicht dieser Substanz liegt bei der Dampfdruckmethode bei ungefähr 350.
Die analytischen Werte sind die folgenden: C = 64,13 H = 5,01 %; N = 9,25%; O = 21,61 % (Differenz). Die Substanz ist in Wasser und Methanol leicht löslich, in Aceton und Äthylacetat löslich und in Hexan spärlich löslich. Ihre Rf-Werte über einer mit Kieselgel beschickten Dünnschichtchromatographierplatte, erhältlich bei der Firma E. Merck, BRD, liegen bei 0,22 beim Entwickeln mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 und bei 0,39 beim Entwickeln mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 3:2, während die entsprechenden Werte der Substanz SF-1739 HP bei 0,26 bzw. 0,31 liegen.
Die Substanz ist in neutralem oder saurem Methanol beständig, in alkalischem Methanol aber weniger beständig.
(III-c) Herstellung beider Substanzen
Diese Substanzen werden aus natürlichen gelben Metaboliten durch Behandeln mit einer Säure erhalten, wobei die besagten Metabolite in einer Kulturbrühe durch Züchtung eines Actinomycetes, wie Streptomyces griseoplanus Stamm SF-1739 (beschrieben in der oben erwähnten, nicht geprüften, jedoch publizierten Patentanmeldung) und nachfolgende Fraktionierung der Kulturbrühe erhalten werden.
Als für diese Behandlung zu verwendende Säuren kommen Mineralsäuren, wies. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure usw. sowie organische Säuren, wie z. B. Trifluoressigsäure, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure usw.
in Frage. Die Reaktionsparameter können je nach der Art und der Konzentration der zu verwendenden Säure und des zu verwendenden Lösungsmittels schwanken. Verwendet man eine Mineralsäure, so erfolgt die Behandlung vorzugsweise unter Kühlen oder bei Zimmertemperatur während 1 Tag bis 1 Woche, sofern höhere Konzentrationen als 5- bis 10-normal zur Anwendung gelangen, oder bei Zimmertemperatur oder einer höheren Temperatur während einem bis mehreren Tagen, sofern eine niedrigere Konzentration von nicht mehr als 5-normal angewandt wird. Bei einer erhöhten Temperatur über 80" C ist die Neigung zur Bildungvon Nebenprodukten erhöht. Die Behandlung kann in einer wässrigen Lösung rascher durchgeführt werden als in wässrigem Methanol. Die Umwandlung der gelben Metabolite in die Substanzen SF-1739 HP-3 und SF-1739 HP-5 kann bei einem pH-Wert von weniger als 3 erfolgen.
Nach beendeter Behandlung kann man die Substanzen SF1739 HP-3 und SF-1739 HP-5 leicht in an sich bekannter Weise aus dem Reaktionsgemisch gewinnen, wobei man die oben erwähnten physikochemischen Eigenschaften der Substanzen SF-1739 HP-3 und SF-1739 HP-5 zu Nutze zieht. So kann man beispielsweise das Reaktionsgemisch mit einer Base, wie Na triumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat oder dergl., neutralisieren, zur Trockene einengen und den Rückstand mit Methanol extrahieren und dann den Extrakt direkt durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel reinigen. Andererseits kann man bei Anwesenheit geringer Nebenprodukte bei dieser Behandlungsmethode das Reaktionsgemisch einengen, den Rückstand in Methanol lösen und die so erhaltene Lösung neutralisieren, worauf man sie über eine Sephadex LH-20-Säule, erhältlich bei der Firma Pharmacia, Schweden, leitet.
Dann wird mit Methanol oder mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol als Mischlösungsmittel entwickelt, um das gewünschte Produkt zu reinigen.
(III-d) Bezüglich des Stammes SF-1739, welcher die als Aus gangsmaterialien verwendeten gelben Metabolite zu erzeugen vermag, sei auf die folgenden Hinterlegungsstellen verwiesen:
Steptomyces griseoplanus Stamm SF-1739 wurde unter der Nr.
3002 beim Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan, und am 8. November 1978 unter der Nr.31451 bei American Type Culture Collection (ATCC), USA, hinterlegt. Die morphologischen Eigenschaften des vorgenannten Stammes Nr. 3002 sind die folgenden: (I) Morphologie
Das Luftmycel wächst reichlich auf Weizenmehlagar, Hefe Malz-Agar und dergl. und dies mit reicher Sporulierung. Einfache Verzweigungen werden beobachtet, büschelartige Verzweigungen hingegen nicht. Am oberen Ende des Luftmycels bildet sich eine lose offene Spirale. Eine spezifische Konfiguration wie Sclerotia lässt sich nicht feststellen. Unter dem Mikroskop beobachtet, stellt man eine warzenartige Sporenfläche fest, welche teilweise stachelförmig ist.
Die Sporen besitzen eine elliptische bis kurzzylindrische Form und Dimensionen von 0,6 bis 0,8 x 0,8 bis 1,2 u. Die Sporenketten weisen im allgemeinen 10 oder mehr Sporen pro Sporenkette auf.
(II) Wachstum auf verschiedenen Medien (beobachtet nach der Züchtung bei 28ob) Medium Wachstum und Farbe Luftmycel lösliches Pigment Saccharosenitrat-Agar- gut, blassgelblich grau grau keines Glucose-Asparagin-Agar spärlich, cremefarben wenig, weiss keines Glycerin-Asparagin-Agar blassgrau grau keines Stärkeagar gut, blassgelb-lichtgrau- grau-olivgrau keines schwach olivgrau Weizenmehlagar gut, blassgelbgrau reichlich grau keines Hefe-Malz-Agar gut, gräulich-gelbbraun reichlich, dunkelgrau keines Tyrosinagar dunkelgrau olivgrau keines Nähragar blassgelb-gräulichgelb grau keines (III) Physiologische Eigenschaften: Temperaturbereich 20 bis 40"C auf Hefe-Malz-Agarfür Wachstum:
Medium Gelatineverflüssigung: langsam bei Züchtung bei 20 C in einem Zeitablauf von nicht weniger als 21 Tagen Hydrolyse der Stärke positiv (stark bei 28"C) Koagulation von entrahmter Milch: positiv (stark bei 28 und 37"C) Petonisierung von entrahmter Milch: positiv (bei 28 und 37"C) Melaninbildung:
negativ (IV) Kohlenstoffquelleverwertungstabelle (bei Pridham-Gottlieb's Agarmedium bei 28"C) D-Glucose + D-Fructose - + D-Xylose + D-Mannitol + Inosit + L-Arabinose + Rhamnose + Saccharose + Raffinose
Aufgrund der oben erwähnten Eigenschaften gehört der Stamm SF-1739 zur Gattung Streptomyces, ist spiralförmig am oberen Ende des Luftmycels und besitzt eine warzige Sporenoberfläche. Das Wachstum auf verschiedenen Medien ist grau bis gräulichgelbbraun und das Luftmycel ist grau. Die Melaninbildung konnte nicht festgestellt werden, ebenso nicht lösliche Pigmente.
Die Eigenschaften des Stammes SF-1739 sind unter den Vertretern der Gattung Streptomyces jenen von Streptomyces griseoplanus äusserst ähnlich. Insbesondere sind beide bezüglich der Spiralenbildung, der warzigen Sporenoberfläche, dem grauen Luftmycel und der Nichtbildung von Melanin durchaus gleichartig. Im Vergleich zum Stamm SF-1739 mit Streptomyces griseoplanus, wie dies in ISP (International Streptomyces Project) [cf.
International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 12S126, (1968)], ist der in ISP angegebene Stamm vom Stamm SF-1739 bezüglich des schlechten Wachstums auf Stärkeagar, der Verwertung von Raffinose und der Nichtverwertung von Saccharose, Inosit, D-Mannitol und Rhamnose verschieden, wobei der erstere dem letzteren bezüglich der Sporenoberfläche, welche warzartige bis stachelartige Beschaffenheit aufweist, sehr ähnlich ist.
Aus den obigen Ausführungen geht hervor, dass es vernünftig ist, den Stamm SF-1739 als zur Art Streptomyces griseoplanus gehörend zu bezeichnen, weil die morphologischen Eigenschaften durchaus miteinander übereinstimmen und andere wesentliche Eigenschaften beiden gemeinsam sind. Der erstere Stamm unterscheidet sich allerdings von dem in ISP wiedergegebenen Stamm bezüglich des Kohlenstoffquelleverwertungsverhaltens und bezüglich anderer Eigenschaften. Deshalb wurde der Stamm SF-1739 als Streptomyces griseoplanus Stamm SF-1739 bezeichnet.
Wenngleich die Herstellung hier hauptsächlich in bezug auf den Stamm SF-1739 erklärt wird, so ist doch darauf hinzuweisen, dass es bestens bekannt ist, dass verschiedene Eigenschaften sämtlicher zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismen nicht eindeutig sind, sondern dass die Mikroorganismen der Gattung Streptomyces auf natürlichem Wege und künstlich leicht verändert werden können. Daher sei festgehalten, dass sämtliche Stämme, welche die als Ausgangsmaterialien vewendeten antibiotischen Metaboliten zu erzeugen vermögen und in die Gattung Streptomyces eingereiht werden, einschliesslich der Varianten und Mutanten, für die vorliegenden Zwecke in Betracht fallen und verwendet werden können.
Die Züchtung kann in der gleichen Weise, wie dies üblicherweise für die Züchtung beliebiger Stämme der Gattung Streptomyces geschieht, zufriedenstellend durchgeführt werden. Als Komponenten des Mediums kann man die beliebigen, für die Gattung Streptomyces bekannten Nährmaterialien vewenden.
So kann man beispielsweise als Kohlenstoffquelle Glucose, Saccharose, Stärke, Glycerin, Maisquellflüssigkeit, Melassen, Sojabohnenöl usw. verwenden. Als Stickstoffquellen kommen Sojabohnenmehl, Weizenembryo, Fleischextrakte, Pepton, trockene Hefe, Maisquellflüssigkeit, Ammoniumsulfat, Natriumnitratusw. in Frage. Als anorganische Salze kommen ferner Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate usw. in Frage, die man nötigenfalls dem Medium zusetzen kann.
Auch kleine Mengen anderer Substanzen, welche das Wachstum des Stammes zu begünstigen und die Herstellung der antibiotischen gelben Metaboliten zu begünstigen vermögen, können zugesetzt werden.
Die Züchtung kann, wie dies für die Herstellung der bekannten antibiotischen Substanzen der Fall ist, in einem flüssigen Kulturmedium und vorzugsweise in submerser Kultur durchgeführt werden. Die Züchtungstemperatur liegt mit Vorteil im Bereich von 25 bis 35 C und häufig bei ca. 28 C. Die maximale Herstellung ist gewöhnlich innerhalb von 2 bis 6 Tagen erreicht.
Die auf diese Weise in einer Kulturbrühe angereicherten gelben Metabolite sind basische, in Wasser zur Hälfte lösliche Substanzen, welche ausserordentlich unbeständig und nicht mit Erfolg isoliert und identifiziert worden sind.
Bei der Verwendung der vorgenannten Metabolite für die Behandlung mit einer Säure zwecks Herstellung der Substanzen SF-1739 HP-3 und SF-1739 HP-5 kann man eine solche Metabolite enthaltende Kulturbrühe als solche mit einer Säure behandeln.
Andererseits und dies mit Vorteil. kann man die Metabolite einengen und hierauf einer Behandlung mit einer Säure unterwerfen.
Zum Einengen der Metabolite kann man sich üblicherTechniken bedienen, welche man gewöhnlich für die Gewinnung eines basischen, in Wasser nur teilweise löslichen, natürlichen Produktes anwendet. So kann man beispielsweise eine Kulturbrühe filtrieren. das Filtrat alkalisch stellen, mit Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder dgl. sättigen und hierauf mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. n- Butanol, Äthylacetat, Butylacetat, Äther oder dgl. extrahieren.
Man kann das Filtrat auch auf einem Kationenaustauschharz, wie z. B. einem Amberlite IRC-50, CG-50, IR-120 oder Dowex 50W adsorbieren, und hierauf mit einer Säure, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, eluieren, um auf diese Weise die Metabolite in konzentriertem Zustande zu erhalten.
Um die gewünschten Metabolite in reinerem Zustande zu erhalten, kann man die oben erwähnten Extraktionsmethoden beliebig miteinander kombinieren. Man kann auch mit einem Harz, z. B. XAD-2, adsorbieren, desorbieren, durch Säulenchromatographie mit Sephadex G-10, Carboxymethylcellulose oder dgl. reinigen und/oder mit einer kieselgelhaltigen Dünnschichtplatte usw. abschaben.
Schliesslich kann man die so eingeengten und fraktionierten Metabolite mit Vorteil für die Behandlung mit einer Säure einsetzen, um dann zu den Substanzen SF-1739 HP-3 und SF1739 HP-5 zu gelangen.
Die biologischen Wirkungen der erfindungsgemässen Derivate der Substanz SF-1739 finden sich nachstehend.
Tabelle 1
Antimikrobielle Wirkung der Derivate der Substanz SF-1739
MIC (mcg./ml.) Microben Substanz SF-1739
HP HP-C HP-F HP-5 HP-3 Bacillus subtilis < 0,09 0,78 1,56 12,5 3,1 Staphylococcus aureus < 0,09 3,125 1,25 50 3,1 209P Sarcina lutea < 0,09 < 0,19 0,39 6,25 0,78 Escherichia coli 3,125 > 100 > 100 > 100 > 100 Escherichia coli > 3,125 > 100 > 100 > 100 > 100 K-12R Klebsiella pneumonia 3,125 50 > 100 > 100 > 100 Pseudomonas aeruginosa 3,125 > 100 > 100 > 100 > 100 Proteus vulgaris 0,39 50 6,25 > 100 > 100
I. Antimikrobielle Wirkung
Die folgende Tabelle 1 zeigt die minimalen Hemmkonzentrationswerte der erfindungsgemässen fünf Derivate der Substanz SF-1739.
II. Antitumorwirkung
A: Cytopathogene Wirkung in vitro
Die folgende Tabelle 2 zeigt die minimalen cytopathogenen Konzentrationswerte der erfindungsgemässen fünf Derivate der Substanz SF-1739.
Tabelle 2 Test- Minimale cytopathogene Konzentration Substanz (mcg./ml.)*
HeLa S3 Hep. 2 Sarcoma 180 SF-1739 HP 0,9 < 0,4 < 0,4 SF-1739-HP-C 0,9 < 0,4 0,9 SF-1739 HP-F 0,9 < 0,4 0,9 SF-1739 HP-5 7,8 1,9 3,9 SF-1739 HP-3 3,9 - *geschützt, nachdem das Gewebe während 48 Stunden behandelt worden war.
B: Karzinostatische Wirkung in vivo bei Mäusen
Männliche Mäuse vom Stamm CDFl (ca. 5 Wochen alt mit einem Gewicht von 19+1 g, wobei jede Gruppe 3 bis 5 Tiere umfasste) wurden intraperitoneal mit P-388 Leukämiezellen bei
106/0,02 ml/Maus inokuliert. Jede Substanz wurde bei den angegebenen Dosismengen in Wasser gelöst und 24 h nach erfolgter Inokulation während drei einanderfolgenden Tagen in einer Menge von 2-0,2 ml/Tag/Maus intraperitoneal verabreicht. Hierauf wurde eine Zunahme der Lebensdauer (nachstehend mit ILS bezeichnet) berechnet. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 3.
Tabelle 3 Testsubstanz Dosis (mg./kg.) ILS (%) SF-1739 HP 2 75,0
1 43,3
0,5 43,3
0,25 45,0 SF-1739 HP-C 16 70,2
8 53,8
4 113,5
2 61,5
1 59,4 SF-1739 HP-F 16 47,1
8 34,6 SF-1739 HP-5 40 56,7
20 51,9
8 30,0
4 25,0
III. Akute Toxizität
Die folgende Tabelle 4 zeigt die akuten Toxizitätswerte (LD50) der erfindungsgemässen fünf Derivate der Substanz SF-1739 nach der intravenösen Verabreichung an Mäuse.
Tabelle 4 Substanz LDs0 (mg./kg.) SF-1739 HP 2 SF-1739 HP-C 225 SF-1739 HP-F > 25 SF-1739 HP-5 > 10 SF-1739 HP-3 > 10 SF-1739 0,45
Bei der Anwendung der erfindungsgemässen Derivate der Substanz SF-1739 für die Behandlung verschiedener Arten von Tumoren kann man sie oral oder parenteral in Form eines gewöhnlich mit einem üblichen festen oder flüssigen, pharmazeutisch zulässigen Trägermittel oder Füllstoff vermischten Präparates verabreichen. Die für die orale Verabreichung verwendbaren, festen Präparate können in Form von Kapseln, Tabletten.
Granulaten, Pillen und dgl. und die topisch anwendbaren Präparate in Form von Suppositorien, Salben oder dgl. vorliegen. Die flüssigen Präparate können in Form von Lösungen, Suspensionen, Sirupen und dgl. vorliegen und oral, topisch oder durch Injektion verabreicht werden. Solche Präparate lassen sich nach dem Fachmann bestens bekannten Methoden herstellen. Die in den erfindungsgemässen Präparaten vorhandene Menge an Wirksubstanz sowie die Wahl der zur Anwendung gelangenden Form des Präparates schwanken gewöhnlich je nach der Art und dem Ausmass der zu behandelnden Krankheit, nach der Verabreichungsmethode, je nach Körpergewicht und Alter des Patienten, je nach Wirkung und Toxizität der Derivate der Substanz SF-1739 usw.
Bei einem injizierbaren Präparat ist es bei Erwachsenen wünschenswert, die Verabreichung subkutan, intramuskulär oder vorzugsweise intravenös oder intraarteriell bei täglichen Dosierungsmengenvon 1 bis 100 mg innerhalb mehrerer einanderfolgender Tage oder in Dosierungsmengen von 2 bis 200 mg nach jeweils 2 Tagen oder 3 Tagen durchzuführen. Je nach Art des Tumors kann es hin und wieder wirksam sein, das Präparat direkt in den Tumor zu injizieren.
Bei oraler Verabreichung bei Erwachsenen ist es wünschenswert, die Verabreichung mit einer einzigen täglichen Dosierung von 1 bis 500 mg oder aber alle 2 Tage vorzunehmen.
Bei der topischen Anwendung kann man die Wirksubstanz direkt auf die befallene oder erkrankte Stelle in Form einer Mischung mit einer geeigneten Grundlage, um einen Gehalt von 1 bis 20 % Wirksubstanz zu gewährleisten, applizieren.
Man kann auch eine oder mehrere der erfindungsgemässen Wirksubstanzen oder aber eine Kombination mit anderen bekannten Antitumormitteln und/oder Immunoacceleratoren einsetzen.
In jenen Fällen, in denen die erfindungsgemässen Derivate der Substanz SF-1739 als antimikrobielle Mittel, insbesondere als antibakterielle Mittel, verwendet werden sollen, können diese auch oral oder parenteral in Form von festen oder flüssigen Präparaten, wie sie üblicherweise im Zusammenhang mit anderen bekannten antibakteriellen Mitteln oder Antibiotika verwen detwerden, verabreicht werden. Präparate für die orale Verabreichung können beispielsweise Kapseln, Tabletten, Pulver, Granulate, Lösungen, Suspensionen oder Sirupe sein. Für die topische Applikation kann man beispielsweise Suppositorien, Salben usw. einsetzen. Als Präparate für die parenterale Verabreichung kann man injizierbare Lösungen oder Suspensionen verwenden, wobei das Präparat subkutan, intramuskular oder intravenös verabreicht werden kann.
Die zur Verabreichung in Frage kommende Menge an Wirksubstanz kann je nach Art und Ausmass der Krankheit, dem Körpergewicht und Alter des Patienten, der Wirkung und Toxizität der Derivate der Substanz
SF-1739 und anderen Faktoren schwanken. Bei Erwachsenen wird die Wirksubstanz gewöhnlich bei oraler Verabreichung in einer einzelnen Dosierung oder aufgeteilt in verschiedene Dosie rungen in einer Menge von 1 bis 500 mg verabreicht. Bei der parenteralen, z. B. intramuskulären oder intravenösen Verabrei chung, liegt die einzelne Dosierungsmenge bei 1 bis 100 mg. Je nach Ausmass der Krankheit, des physischen Zustandes des
Patienten und je nach dessen Reaktion kann der Arzt auch höhere oder geringere Dosierungsmengen bestimmen.
Die erfindungsgemässen Derivate der Substanz SF-1739 können als solche, in Form von Mischungen mehrerer dieser Deriva te oder in Kombination mit anderen bekannten antimikrobiellen
Mitteln, wies. B. verschiedenen Antibiotika usw., verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele mögen die vorliegende Erfindung erläutern.
Beispiel 1
Herstellung der Substanz SF-1739 HP
Eine Lösung von 6 mg SF-1739-Hydrochlorid in 3 ml Sn Salzsäure wurde während 1 Woche bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann wurde die Lösung mit festem Natriumhydrogencarbonat neutral gestellt und die neutralisierte Lösung unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in wenig Methanol gelöst, die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltriertund das Filtrat wurde eingeengt. Dann wurde der Rückstand auf eine präparative Dünnschichtchromatographieplatte (2 x 100 x 100 mm, erhältlich bei der Firma E. Merck, BRD) über Kieselgel aufgetragen, wobei die Entwicklung mit einer Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 erfolgte. Ein purpurrotes Band mit Rf von 0,45 wurde aus der Platte herausgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Der Extrakt wurde zur Trockene eingeengt und der Rückstand erneut in einer Mischung von Methanol und Aceton im Mischungsverhältnis von 2:1 gelöst und die unlöslichen Bestandteile abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt.
Auf diese Weise erhielt man 3,3 mg Substanz SF-1739 HP.
Beispiel 2
Herstellung der Substanz SF-1739 HP-C
Zu einer Lösung von 71 mg Substanz SF-1739 HP in 5 ml Wasser wurden 144 mg Natriumcyanid hinzugegeben und das so erhaltene Gemisch während 30 min bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Hierauf wurde es unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von weniger als 35 C unter Zugabe von n Butanol zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in wenig Methanol gelöst, die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltriert und das Filtrat wurde eingeengt. Der Rückstand wurde dann auf eine für die Dünnschichtchromatographie geeignete, mit Kieselgel versehene Platte (2 x 100 x 100 mm, erhältlich bei der Firma E. Merck, BRD) aufgetragen und dann mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 3:2 entwickelt.
Ein purpurrotes Band mit Rf von 0,70 wurde abgeschabt und mit Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockne eingeengt und der Rückstand erneut in einer Lösung von Methanol und Aceton im Mischungsverhältnis von 2:1 gelöst. Dann wurden die unlöslichen Bestandteile abfiltriert und das Filtrat anschliessend zur Trockene eingedampft. Auf diese Weise erhielt man 35 mg der Substanz SF-1739 HP-C.
Beispiel 3
Herstellung der Substanz SF-1739 HP-F
Eine Lösung von 35 mg der Substanz SF-1739 HP in 1,5 ml Formamid wurde während 5 min bei Zimmertemperatur sich selbst überlassen. Hierauf wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von weniger als 500 C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in wenig Methanol aufgelöst und die so erhaltene Lösung auf eine für die präparative Dünnschichtchromatographie geeignete, mit Kieselgel versehene Platte (2x 100x 100 mm, erhältlich bei der Firma E. Merck, BRD) aufgetragen. Dann erfolgte die Entwicklung mit einem Lösungsgemisch von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 3:1. Ein purpurrotes Band mit Rf von 0,53 wurde abgeschabt und mit Methanol extrahiert.
Der Extrakt wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand erneut in einem Lösungsmittel von Methanol und Aceton im Mischungsverhältnis von 2:1 gelöst, die unlöslichen Bestandteile abfiltriert und das Filtrat schliesslich zur Trockene eingeengt. Auf diese Weise erhielt man 25 mg der Substanz So 1739 HP-F.
Beispiel 4
Herstellung der Substanz SF-1739 HP-C
Eine Lösung von 73 mg der Substanz SF-1739 HP in 2 ml Methanol wurde mit 72 mg Kaliumcyanid versetzt und das so erhaltene Gemisch während 5 min bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wurde das Lösungsgemisch auf eine für die präparative Dünnschichtchromatographie geeignete, mit Kieselgel beschickte Platte (2x 100x 100 mm, erhältlich bei der Firma E.
Merk, BRD) gebracht, worauf man die Entwicklung mit einem Lösungsmittelgemisch von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 3:2 durchführte. Ein purpurrotes Band mit Rf = 0,70 wurde abgeschabt und mit Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockene eingedampft, der Rückstand erneut in einem Lösungsmittelgemisch von Methanol und Aceton im Mischungsverhältnis von 2:1 gelöst, die unlöslichen Bestandteile abfiltriert und das Filtrat schliesslich zur Trockene eingeengt, wobei man 50 mg der Substanz SF-1739 HP-C erhielt.
Beispiel 5 Herstellung der Substanz SF-1739 HP-3, SF-1739 HP-5 und SF
1739 HP
Sporen von Streptomyces griseoplanus Stamm SF-1739 (hinterlegt unter der Nr.3002 beim Technical Research Institute of Microbial Industry) wurden in 1,61 eines flüssigen Mediums, welches aus 1,0 % Stärke und 0,3 % Sojabohnenmehl bestand und einen pH-Wert von 7,0 aufwies, inokuliert und die Kultur während 30 h bei 28 C unter Verwendung von 16 Sakaguchi Kolben geschüttelt, um eine Samenkultur zu erzeugen.
Die so erhaltene Samenkultur wurde mit 701 eines flüssigen Mediums, bestehend aus 3,0 % Stärkesirup, 2,0% Sojabohnenmehl, 1,0% Rinderextrakt, 1,0% Weizenembryo und 0,3 % Natriumchlorid, bei einem pH-Wert von 6,6 inokuliert und die Kultur während 90 h bei 28 C und Belüftung und unter Verwendung von zwei Fermentierkolben mit jeweils 501 Volumen geschüttelt.
Der pH-Wert der Kulturbrühe wurde durch Zugabe von 6n Salzsäure auf 3 bis 4 eingestellt und mit einem Filterhilfsstoff, nämlich Hyflo Super Cel, filtriert. Das aus ungefähr 471 bestehende Filtrat wurde mit 3n Natriumhydroxyd behandelt, um den pH-Wert auf 6 einzustellen, worauf man das Filtrat durch eine Säule von ungefähr 41 eines Ionenaustauschharzes, nämlich Amberlite IRC-50 (H+) führte, um die antibiotischen Metabolite zu adsorbieren. Die Säule wurde hierauf gründlich mit Wasser gewaschen und mit einer wässrigen 0,2n Salzsäurelösung eluiert.
Die aktive Fraktion, bestehend aus ungefähr 4,51 Flüssigkeit, wurde mit Natriumchlorid gesättigt, deren pH-Wert mittels Natriumhydroxyd auf 8,0 eingestellt und dann zweimal mit jeweils 11 Äthylacetat unter Kühlen extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wurde erneut mit 200 ml einer wässrigen 0,ozon Salzsäurelösung extrahiert. Dann wurde die einen pH-Wert von 2,0 aufweisende wässrige Lösung unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wobei man 1,68 g antibiotische Metabolite in Form eines rohen Pulvers erhielt. Dieses rohe Pulver wurde in 20 ml 5n Salzsäure gelöst und die Lösung hierauf während 1 Woche bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschliessend erneut unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.
Der Rückstand wurde in 20 ml Methanol gelöst und die so erhaltene, gelblichrote Lösung durch Zugabe von festem Natriumhydrogencarbonat bis zur Erreichung einer purpurroten Farbe neutralisiert. Die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltnert, das Filtrat eingeengt und hierauf der Rückstand auf 7 für die präparative Dünnschichtchromatographie geeignete, mit Kieselgel beschickte Platten (2x100x 100 mm, erhältlich bei der Firma E. Merck, BRD) aufgetragen. Die Entwicklun erfolgte hierauf mit einer Mischung von Äthylacetat und Methanol im Mischungsverhältnis von 3:2. Ein purpurrotes Band mit Rf von 0,12 wurde von jeder Platte abgeschabt und mit Methanol extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden zur Trockne eingeengt, wobei man die Substanz SF-1739 HP-5 als rohes Pulver erhielt.
Dieses rohe Pulver wurde in wenig Methanol gelöst und auf drei für die präparative Dünnschichtchromatographie geeignete Kieselgelplatten aufgetragen und hierauf mit einem Lösungsmittelgemisch von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 entwickelt. Die purpurroten Bande mit Rf von 0,12 wurden abgeschabt, mit Methanol extrahiert und der Extrakt zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in einem Lösungsmittelgemisch von Methanol und Aceton im Mischungsverhältnis von 3:1 gelöst, die unlöslichen Bestandteile abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Auf diese Weise erhielt man 153 mg der Substanz SF-1739 HP-5.
Von den ersten kieselgelhaltigen Dünnschichtchromatographieplatten wurden Purpurbande mit Rf von 0,39 abgeschabt und mit Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockene eingeengt und der Rückstand in wenig Methanol gelöst und auf eine kieselgelhaltige präparative Dünnschichtchromatographieplatte (2 x 100 x 100 mm, erhältlich bei der Firma E. Merck, BRD) aufgebracht, worauf man die Entwicklung mit einem Lösungsmittelgemisch von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 durchführte. Ein purpurrotes Band mit Rf von 0,22 wurde abgeschabt und mit Methanol extrahiert.
Der Extrakt wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand in einem Lösungsmittelgemisch von Methanol und Aceton im Mischungsverhältnis von 2:1 gelöst, die unlöslichen Bestandteile abfiltriert und das Filtrat schliesslich zur Trockene eingeengt, wobei man 27 mg der Substanz SF-1739 HP-3 erhielt.
Aus den ersten kieselgelhaltigen Dünnschichtchromatographieplatten wurden purpurrote Bande mit Rf von 0,31 abgeschabt und mit Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand in wenig Methanol gelöst und dann auf zwei kieselgelhaltige präparative Dünnschichtchromatographieplatten (2 x 100 x 100 mm, erhältlich bei der Firma E. Merck, BRD) gebracht, worauf man die Entwicklung mit einem Lösungsmittelgemisch von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 9:1 durchführte. Die purpurroten Bande mit Rf von 0,26 wurden abgeschabt und mit Methanol extrahiert. Der Extrakt wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand in einem Lösungsmittelgemisch von Methanol und Aceton im Mischungsverhältnis von 2:1 gelöst, die unlöslichen Bestandteile abfiltriert und das Filtrat hierauf zur Trockene eingeengt.
Auf diese Weise erhielt man 99 mg der Substanz SF1739 HP.
** WARNING ** beginning of DESC field could overlap end of CLMS **.
PATENT CLAIMS
1. The substance SF-1739 HP with the following physicochemical properties: (1) blackish purple substance (2) ultraviolet absorption spectrum according to FIG. 1 (3) infrared absorption spectrum according to FIG. 2 with the following characteristic absorption bands at 3350, 1655, 1600, 1540, 1355, 1265, 1235, 1180, 1120, 1080, 1020, 1000, 965, 945, 920, 910, 865, 830, 790 and 750 cm '(4) Magnetic nuclear magnetic resonance spectrum according to FIG. 3 (5) Rotation dispersion curve according to FIG. 4 (6) elemental analysis : found:
: C 62.19% H 6.95% N 8.50% O 22.36% (difference) (7) Solubility: Easily soluble in water and methanol, soluble in ethyl acetate and sparingly soluble in hexane (8) Chromatography: medium Thin layer chromatography on silica gel: Rf values = 0.45; Chloroform: methanol = 9: 1 or 0.23; Mixture of butanol, methanol and 0.1N hydrochloric acid = 4: 2: 1.
2. The substance SF-1739 HP-C with the following physicochemical properties: (1) blackish purple substance (2) ultraviolet absorption spectrum according to FIG. 5 (3) infrared absorption spectrum according to FIG. 6 with the following characteristic absorption bands at 3350, 1660, 1600, 1535 , 1355, 1265, 1235, 1200, 1175, 1140, 1120, 1080, 1060, 1000, 9401, 910, 880, 835 and 795 cm-1.
(4) Rotation dispersion curve according to FIG. 7 (5) Magnetic nuclear magnetic resonance spectrum according to FIG. 8 (6) Elemental analysis: found: C 59.58% H 6.14% N 12.63% O 21.65% (difference) (7 ) Solubility: Easily soluble in water and methanol, soluble in acetone and ethyl acetate and sparingly soluble in hexane. (8) Chromatography: Using thin layer chromatography over silica gel: Rf values = 0.40; Chloroform: methanol = 9: 1 and 0.70; Ethyl acetate: methanol = 3: 2.
3. The substance SF-1739 HP-F with the following physicochemical properties: (1) blackish purple substance (2) ultraviolet absorption spectrum according to FIG. 9 (3) infrared absorption spectrum according to FIG. 10 with the following characteristic absorption bands at 3300, 1660, 1530, 1350, 1310,1265,1235,1205,1175,1125,1085, 920, 830 and 795 cm-1.
(4) Elemental analysis: found: C 57.26% H 6.33% N 12.14% O 24.27% (difference) (5) Solubility: Easily soluble in water and methanol, soluble in acetone and ethyl acetate and in Sparingly soluble hexane (6) Chromatography: by thin layer chromatography on silica gel Rf values = 0.28; Chloroform: methanol = 9: 1 and 0.53; Ethyl acetate: methanol = 3: 2.
4. The substance SF-1739 HP-5 with the following physicochemical properties: (1) blackish purple substance (2) ultraviolet absorption spectrum according to FIG. 11 (3) infrared absorption spectrum according to FIG. 12 with the following characteristic absorption bands at 3300.1655, 1600.1540 , 1350, 1260, 1235, 1175, 1085, 1025, 835, 790 and 775 cm-1.
(4) Nuclear magnetic resonance spectrum according to FIG. 13 (5) Elemental analysis: found: C 60.93% H 7.05% N 8.41% O 23.61% (difference) (6) Solubility: Slightly in water and methanol soluble, soluble in ethyl acetate and acetone and sparingly soluble in hexane (7) Chromatography: by thin layer chromatography on silica gel Rf values = 0.12; Chloroform: methanol = 9: 1 and 0.12; Ethyl acetate: methanol = 3: 2.
5. The substance SF-1739 HP-3 with the following physicochemical properties: (1) blackish purple substance (2) ultraviolet absorption spectrum according to FIG. 14 (3) infrared absorption spectrum according to FIG. 15 with the following characteristic absorption bands at 3355.1680, 1655.1600 , 1545, 1350, 1310, 1265, 1180, 1155, 1020, 950, 955, 900, 835 and 790 cm-1 (4) Magnetic nuclear magnetic resonance spectrum according to FIG. 16 (5) Elemental analysis: found: C 64.13% H 5, 01% N 9.25% O 21.61% (difference) (6) Solubility:
Easily soluble in water and methanol, soluble in acetone and ethyl acetate and sparingly soluble in hexane (7) Chromatography: by thin layer chromatography on silica gel Rf values = 0.22; Chloroform: methanol = 9: 1 and 0.39; Ethyl acetate: methanol = 3: 2.
6. Process for the preparation of the substance SE; -1739 HP, characterized in that the substance SF-1739 is treated with an acid.
7. A process for the preparation of the substance SF-1739 HP-C, characterized in that the substance SF-1739 is treated with an acid so that the substance SF-1739 HP is obtained, and that the product thus obtained is then treated with a Cyanide.
8. A process for the preparation of the substance SF-1739 HP-F, characterized in that the substance SF-1739 is treated with an acid so that the substance SF-1739 HP is obtained and the product thus obtained is reacted with formamide.
9. A process for the preparation of the substance SF-1739 HP-5, characterized in that an antibiotic metabolite is treated with an acid, the metabolite being produced by cultivating Streptomyces griseoplanus strain SF-1739 and by subsequent fractionation of the culture broth.
10. A process for the preparation of the substance SF-1739 HP-3, characterized in that an antibiotic metabolite is treated with an acid, the metabolite being obtained by cultivating Streptomyces griseoplanus strain SF-1739 and by subsequent fractionation of the culture broth.
11. Antibacterial preparation, characterized in that it contains one or more of the following antibiotic substances as active substance, namely substance SF-1739 HP-F, substance SF-1739 HP-C, substance SF-1739 HP-F, substance SF-1739 HP -5 and substance SF-1739 HP-3, and contains a pharmaceutically acceptable carrier.
12. Antitumor preparation, characterized in that it contains one or more of the following substances as active substance, namely SF-1739 HP, substance SF-1739 HP-C, substance SF-1739 HP-F, substance SF-1739 HP-5 and substance SF -1739 HP-3, and contains a pharmaceutically acceptable carrier.
The present invention relates to a new group of derivatives of the substance SF-1739, to processes for producing such derivatives and to at least one such derivative containing antibacterial and cancer-preventing preparations as active substance.
In particular, the present invention relates to new and valuable derivatives of the substance SF-1739, namely substance SF-1739 HP, substance SF-1739 HP-C, substance SF-1739 HP-F, substance SF-1739 HP-3 and substance SF -1739 HP-5, on processes for the preparation of such derivatives of SF-1739 and on antimicrobial and anti-cancer preparations containing at least one derivative of the substance SF-1739 as active substance.
In Unexamined Published Japanese Patent Application No. 125 798/1976, on April 24, 1975 by Meiji Seika Kaisha Ltd., Japan. 49 131/1975 is disclosed. that you have an antibiotic substance SF-1739
can be obtained by breeding Streptomyces griseoplanus strain SF-1739. Furthermore, according to the report in the Annual Report of Meiji Seika Laboratories. Vol. 16, p.20, the substance SF-1739 is a diacid base of unidentified chemical structure, the physicochemical and biological properties of this substance being described in detail in that report. Furthermore, it is known that the substance SF-1739 is extraordinarily unstable under alkaline conditions and is decomposed even in free base form into various fractions which have no antibacterial properties for a few days after standing in the dry state, while this substance is extraordinarily resistant under acidic conditions is.
The resistance of the SF-1739 substance under acidic conditions has now been thoroughly investigated, and it has been found that by treating it with a strong acid, a new substance SF-1739 HP can be obtained which has strong antibacterial and anti-cancer effects.
In view of the fact that this new and valuable substance SF-1739 HP also has a considerably higher toxicity, studies with derivatives of the substance SF-1739 HP have been initiated in order to reduce the toxicity of this compound, and it has also been found that a new group of derivatives of the substance SF-1739 HP, namely the substance SF-1739 HP-C and substance SF-1739 HP-F, can be obtained by reacting the substance SF-1739 HP with a cyanide or formamide. It has also been found that these derivatives are particularly suitable for the intended purposes.
On the other hand, other metabolites were investigated, which can be produced in a culture broth by cultivating an actinomycete, such as Streptomyces griseoplanus strain SF-1739 (see unexamined Japanese patent application no.
125798/1976. It was found that yellow metabolites occur in a culture broth, which clearly differ from the substance SF-1739, although they have similar Rf values. It has also been found that these new antibiotic substances, namely substance SF-1739 HP-3 and substance SF-1739 HP-5, can be produced from the yellow metabolites by treatment with a strong acid.
The aim of the present invention is therefore to create a new group of five new antibiotic substances, namely substance SF-1739 HP, substance SF-1739 HP-C, substance SF
1739 HP-F, substance SF-1739 PH-3 and substance SF-1739 HP-5.
Another object of the present invention is to provide a method for producing these antibiotic substances.
Yet another object of the present invention is that
Creation of antibacterial and cancer-preventing preparations which contain at least one derivative of the substance SF-1739 just mentioned as the active substance.
As just mentioned. the present invention targets five different derivatives of the substance SF-1739. Each of these derivatives and the preparation thereof are described in detail below.
I. Substance SF-1739 HP (1) Physicochemical properties:
This substance has no precise melting point and melts under blackening in a temperature range of approximately 150 to 1800 C. It has an ultraviolet in methanol
Absorption spectrum according to the attached Fig. 1 [shown with the solid line (-) in Fig. 1] with three absorption maxima at 220 nm (E '? Äm = 407), 275 nm (132) and 535 nm (21)
Spectrum in 0.05N hydrochloric acid and 95N methanol [represented by a dotted line (..
..) in Fig. 1] with two absorption maxima at 265 nm (E1% rn = 754), 410 (16) and another spectrum in 0.05N sodium hydroxide solution and 95% methanol [shown with a dash-dotted line (-.- .- .-) in Fig. 1] with absorption maxima at 221 nm (E1 "fcm = 440), 277 (124), 345 (shoulder) and 540 (24). It shows an infrared absorption spectrum (in Nuj ol) according to Fig. 2 with two characteristic absorption bands at 3350, 1655,1600,1540,1355, 1265, 1235,1180,1120,1080, 1020,1000,965,945,920, 910,865,830, 790 and 750 cm¯l and a magnetic nuclear magnetic resonance spectrum (in D2O) according to Fig . 3.
The mass spectrum of this substance shows peaks at m / e 412.430, so that the molecular weight of this substance is estimated to be practically the same as for substance SF-1739. It has the following analytical composition: C = 62.19%; H = 6.95%; N = 8.50%; O = 22.36% (difference). It has a rotation dispersion curve according to FIG. 4, on the basis of which the specific rotation [a] '5860 +70 (in 0.05% methanol) is calculated. It is a blackish purple substance which is easily soluble in water and methanol, soluble in acetone and ethyl acetate and sparingly soluble in hexane. The Rf values of this substance over silica gel using thin-layer chromatography plates, which the company
Merk, Federal Republic of Germany, are 0.45 if the development is carried out with a mixture of chloroform and methanol in a mixing ratio of 9: 1 and 0.23 if the development is carried out with a mixture of n-butanol, methanol and 0.1 in hydrochloric acid in a mixing ratio of 4: 2: 1, while the corresponding values for the substance SF1739 are 0.76 and 0.39, respectively. The resistance of the substance SF-1739 HP is much better compared to the starting substance SF-1739, whereby this substance is resistant under acidic and alkaline conditions. For example, if it is left overnight in a 5N hydrochloric acid solution at room temperature, it behaves completely continuously, while the starting substance SF-1739 converts to the substance SF-1739 HP under the same conditions.
Even when left standing overnight at room temperature in a methanolic 0. Sodium hydroxide solution, no significant reduction in the antibacterial effect is caused, while the starting substance SF-1739 is essentially inactivated in such a solution.
(2) Manufacturing:
This substance is obtained by treating SF-1739 with an acid. Suitable acids for this treatment are, for example, mineral acids, such as. As hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc. and organic acids. B. tetrafluoroacetic acid, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, etc. in question. The reaction parameters may vary depending on the type and concentration of the acid and solvent to be used.
If a mineral acid is used, the treatment is preferably carried out with cooling or at room temperature for 1 day to 1 week if a higher concentration of 5 to 10 normal is used, or at room temperature or a higher temperature for 1 to several days if a lower one Concentration of no more than 5-normal is applied. At an elevated temperature of more than 80 "C there is a tendency to form by-products from time to time. The treatment can be carried out more quickly in an aqueous solution than in aqueous methanol. The conversion of substance SF-1739 into substance SF-1739 HP can be carried out at a pH of less than 3.
After the treatment has ended, the substance SF-1739 HP can easily be obtained from the reaction mixture in a manner known per se, the physicochemical properties of the substance SF-1739 HP being achieved as mentioned above. For example, the reaction mixture can be neutralized with a base such as sodium bicarbonate, potassium carbonate and the like, then evaporated to dryness and the residue extracted with methanol and then the extract can be purified directly by preparative thin layer chromatography on silica gel.
On the other hand, the reaction mixture can be concentrated so that fewer by-products are formed, the residue is dissolved in methanol and the resulting solution is neutralized and then passed through a Sephadex LH-20 column (available from Pharmacia, Sweden), whereupon the Development with methanol or with a mixed solvent of ethyl acetate and methanol. In this way you get the cleaned product.
II. Substance SF-1739 HP-C and substance SF-1739 HP-F (IIa) substance SF-1739 HP-C (1) physicochemical properties
This substance does not have a specific melting point and melts under blackening within a range of approximately 120 to 1500 C. It has an ultraviolet absorption spectrum according to FIG. 5 [shown with a solid line in FIG. 5] with three absorption maxima at 222 nm in methanol (E17 " cm = 400), 273 nm (146) and 540 nm (30), another spectrum in a mixture of O, 1N hydrochloric acid and 90% methanol [shown with a broken line in FIG.
5] with absorption maxima at 204 nm, 266 nm (E117rn = 174) and 410 nm (22) and a spectrum in a mixture of O, l sodium hydroxide and 90% methanol [shown with a chain line in FIG. 5] with absorption maxima at 222 nm (E1ícm = 422), 275 nm (140) and 550 nm (32). It has an infrared absorption spectrum (in nujol) according to FIG. 6 with characteristic absorption bands at 3350, 1660, 1535, 1355, 1265, 1235, 1200, 1175, 1140, 1120, 1080.1060, 1000.940.910, 880.835 and 795 cml. The rotation dispersion curve is shown in Fig.
7 can be seen. The nuclear magnetic resonance spectrum (in D20) corresponds to FIG. 8. The analytical composition is the following: C = 59.58%; H = 6.14%; N = 12.63%; 0 = 27.65% (difference). The substance is blackish purple, easily soluble in water and methanol, soluble in acetone and ethyl acetate and sparingly soluble in hexane. The Rf values of this substance, measured on a thin-layer chromatography plate loaded with silica gel (available from E. Merck, Federal Republic of Germany) are 0.40, provided that the development is carried out with a mixture of chloroform and methanol in a mixing ratio of 9: 1. and at 0.70 if the development is done with a mixture of ethyl acetate and methanol in a mixing ratio of 3: 2.
The corresponding values for the substance SF-1739 HP are 0.26 and 0.31. The substance described here is stable when dry and in neutral, acidic and alkaline methanolic solution.
(II-b) Substance SF-1739 HP-F (1) Physicochemical properties:
This substance has no specific melting point and melts in a range from 110 to 140 C when it turns black. In methanol it has an ultraviolet absorption spectrum according to FIG. 9 [shown with a solid line in FIG. 9] with three absorption maxima at 220 nm, 275 nm ( E1locm = 121) and 540 nm (24), another spectrumin0, in hydrochloric acid solution and 90% methanol [shown with a broken line in FIG. 9] with absorption maxima at 205 nm, 268 nm (E17'c0m = 133) and 405 nm (19) and another spectrum in 0.1N sodium hydroxide and 90% methanol [shown with a dash-dotted line in Fig.
9) at 221 nm, 277 nm (E1ifcm = 117) and 540 nm (29). It has an infrared absorption spectrum (in nujol) according to FIG. 10 with characteristic absorption bands at 3300, 1660, 1530, 1350, 1310, 1265, 1235, 1205, 1175, 125, 105, 1085, 1025, 1000, 940, 920, 830 and 795 cml. The analytical composition of this substance is as follows: C = 57.26%; H = 6.33%; N = 12.14 Nc; O = 24.27% (difference). It is a blackish purple substance that is easily soluble in water and methanol, soluble in acetone and ethyl acetate and sparingly soluble in hexane. Your Rf values in thin-layer chromatography on silica gel on a plate, as described by E.
Merck, FRG, is available at 0.28 if development is carried out with a mixture of chloroform and methanol in a mixing ratio of 9: 1, and 0.53 if development is carried out with a mixture of ethyl acetate and methanol in a mixing ratio of 3: 2 happens, while the corresponding values for the substance SF-1739-HP are 0.26 and 0.31. The new substance is stable when dry and in neutral and alkaline methanolic solution, but less stable in acidic methanol solution.
(II-c) Production of both substances
Substance SF-1739 HP-C is obtained from substance SF-1739 HP, which is obtained according to the information given in paragraph I (2) above, by reaction with a cyanide.
Examples of suitable cyanide are alkali metal, alkaline earth metal, metal or organic amine salts of hydrocyanic acid, including ammonia salts of this acid, e.g. B. sodium, potassium, lithium, magnesium or ammonium cyanide, etc. in question. Furthermore, one can also generate cyanide ions (CN-) to produce rich compounds, such as. B.
Use cyanogen bromide, etc.
On the other hand, the substance SF-1739 HP-F is obtained by reacting the substance SF-1739 HP with formamide.
In both cases, the reaction is advantageously carried out rapidly under cooling or at room temperature and is essentially complete after about 5 to 30 minutes. At a temperature higher than room temperature, the tendency to form by-products is increased. Examples of solvents which can be used in both of these cases are water, alcohols, dimethylformamide, mixtures of solvents, i.e. H. use a water-miscible organic solvent and water, etc. In addition, the formamide can be used in excess, in which case it acts both as a reactant and as a solvent for the preparation of the substance SF-1739 HP-F.
After the reaction has ended, the desired product can be easily obtained and purified in a manner known per se, the physicochemical properties of each substance mentioned above being able to be exploited. The reaction mixture can thus be evaporated to dryness and the residue extracted with methanol and the extract obtained in this way can be purified directly by preparative thin layer chromatography on silica gel.
Since small amounts of by-products are obtained in these reactions, the reaction mixture can be concentrated, the residue can be dissolved in methanol and the resulting solution can be passed through a column of Sephadex LH-20 (available from Pharmacia, Sweden), followed by methanol or a Solvent mixture of ethyl acetate and methanol can develop to purify the desired product.
III. Substance SF-1739 HP-5 and substance SF-1739-HP-3 (III-a) substance SF-1739-HP-5 (1) Physicochemical properties:
This substance is a blackish purple, powdery substance which has no definite melting point and melts in a range from approximately 150 to 1800 ° C. when it becomes black.
It has an ultraviolet absorption spectrum in methanol according to FIG. 11 [represented by a solid line in FIG. 11] with three absorption maxima 220 nm (El m = 375), 275 nm (156) and 535 nm (28), a spectrum in 0, 05n hydrochloric acid and 95% methanol [shown with the dotted line in Fig. 11] with two absorption maxima at 266 nm (El ícm = 199) and 410 nm (22) and a spectrum in 0.05N sodium hydroxide and 95% methanol [ shown with a dash-dotted line in FIG. 11] with absorption maxima at 276 nm (E1lycm = 148) and 550 nm (34).
It has an infrared absorption spectrum (in nujol) according to FIG. 12 with characteristic absorption bands at 3300, 1655, 1600, 1540, 1350, 1260, 1235, 1175, 1085, 1025, 1000, 905, 865, 835, 790 and 775 cm-1 and, moreover, a magnetic nuclear magnetic resonance spectrum ( in D20) according to FIG. 13. The analysis on magnetic carbon 13 by means of resonance spectra shows that at least 19 carbon atoms are present in the molecule of the substance SF-1739 HP-5. The molecular weight estimated according to the vapor pressure method is approximately 550. The analytical composition is as follows: C = 60.93%; H = 7.05%; N = 8.41%; O = 23.61% (difference). The substance is easily soluble in water and methanol, soluble in acetone and ethyl acetate and sparingly soluble in hexane.
Your Rf values in thin layer chromatography on silica gel on a plate, which were
Merck, Germany, is 0.12 when developing with a mixture of chloroform and methanol in a mixture ratio of 9: 1 and 0.12 when developing with a mixture of ethyl acetate and methanol in a mixture ratio of 3: 2, while the corresponding values for the substance SF-1739 HP are 0.26 and 0.31. The substance is stable in the dry state and in methanol, slightly unstable in aqueous methanol and less resistant in alkaline methanol.
(III-b substance SF-1739 HP-3 (1) Physicochemical properties
This substance is a blackish purple, powdery substance which has no specific melting point, but melts when blackening in a temperature range from 130 to 150 ° C. It shows an ultraviolet absorption spectrum in FIG. 14 in methanol [shown with a solid line in FIG. 14] with four absorption maxima or a turning point at 219 nm (E'i7c'm = 890), 267 nm (314), 330 nm (shoulder) and 543 nm (54), a spectrum in 0.05N hydrochloric acid and 95% Methanol [shown with a dotted line in Fig.
14] with three absorption maxima at 264 nm (E1lcm = 372), 325 nm (62), 420 nm (40) and a spectrum in 0.05N sodium hydroxide and 95% methanol [shown with a chain line in Fig. 14] with three maxima at 267 nm (E'7'c0m = 276), 375 nm (44) and 543 nm (64). It also has an infrared absorption spectrum (in nujol) according to FIG. 15 with characteristic absorption bands at 3355, 1680, 1655, 1600, 1545, 1350, 1310, 1265, 1180, 1155, 1085, 1070.1055, 1020, 950.955.900.835 and 790 cm ' and a nuclear magnetic resonance spectrum in (D20) according to FIG. 16. The molecular weight of this substance is approximately 350 in the vapor pressure method.
The analytical values are as follows: C = 64.13 H = 5.01%; N = 9.25%; O = 21.61% (difference). The substance is easily soluble in water and methanol, soluble in acetone and ethyl acetate and sparingly soluble in hexane. Their Rf values over a thin-layer chromatography plate loaded with silica gel, available from E. Merck, Germany, are 0.22 when developing with a mixture of chloroform and methanol in a mixing ratio of 9: 1 and 0.39 when developing with a Mixture of ethyl acetate and methanol in a mixing ratio of 3: 2, while the corresponding values of the substance SF-1739 HP are 0.26 and 0.31, respectively.
The substance is stable in neutral or acidic methanol, but less stable in alkaline methanol.
(III-c) Production of both substances
These substances are obtained from natural yellow metabolites by treatment with an acid, said metabolites in a culture broth by culturing an Actinomycetes such as Streptomyces griseoplanus strain SF-1739 (described in the above-mentioned, unexamined but published patent application) and subsequent fractionation of the culture broth can be obtained.
Mineral acids are used as the acids to be used for this treatment. As hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc. and organic acids, such as. B. trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid etc.
in question. The reaction parameters may vary depending on the type and concentration of the acid and solvent to be used. If a mineral acid is used, the treatment is preferably carried out with cooling or at room temperature for 1 day to 1 week if concentrations higher than 5 to 10 normal are used, or at room temperature or a higher temperature for one to several days if a lower concentration of no more than 5-normal is used. At an elevated temperature above 80 "C, the tendency to form by-products is increased. The treatment can be carried out more quickly in an aqueous solution than in aqueous methanol. The conversion of the yellow metabolites into the substances SF-1739 HP-3 and SF-1739 HP -5 can be done at a pH of less than 3.
After the end of the treatment, the substances SF1739 HP-3 and SF-1739 HP-5 can easily be obtained from the reaction mixture in a manner known per se, the physicochemical properties of the substances SF-1739 HP-3 and SF-1739 HP- mentioned above 5 takes advantage. For example, the reaction mixture can be neutralized with a base such as sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate or the like, concentrated to dryness and the residue extracted with methanol and then the extract can be purified directly by preparative thin layer chromatography on silica gel. On the other hand, in the presence of small by-products, the reaction mixture can be concentrated in this treatment method, the residue dissolved in methanol and the solution thus obtained neutralized, whereupon it is passed over a Sephadex LH-20 column, available from Pharmacia, Sweden.
Then developed with methanol or with a mixture of ethyl acetate and methanol as a mixed solvent to purify the desired product.
(III-d) Regarding the strain SF-1739, which is able to produce the yellow metabolites used as starting materials, reference is made to the following depositors:
Steptomyces griseoplanus strain SF-1739 was registered under the no.
3002 at the Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan, and on November 8, 1978 under No. 31451 at American Type Culture Collection (ATCC), USA. The morphological properties of the aforementioned strain No. 3002 are as follows: (I) morphology
The aerial mycelium grows abundantly on wheat flour agar, yeast malt agar and the like, and this with rich sporulation. Simple branches are observed, but tuft-like branches are not. A loosely open spiral forms at the upper end of the aerial mycelium. A specific configuration like Sclerotia cannot be determined. Observed under the microscope, a wart-like spore surface is found, which is partly spiky.
The spores have an elliptical to short cylindrical shape and dimensions from 0.6 to 0.8 x 0.8 to 1.2 u. The spore chains generally have 10 or more spores per spore chain.
(II) growth on different media (observed after cultivation at 28ob) medium growth and color aerial mycelium soluble pigment sucrose nitrate agar - good, pale yellowish gray gray no glucose-asparagine agar sparse, cream-colored little, white no glycerin-asparagine agar pale gray gray no starch agar good, pale yellow-light gray-gray-olive gray none weak olive gray wheat flour agar good, pale yellow gray abundant gray none yeast-malt agar good, greyish-yellow-brown abundant, dark gray no tyrosine agar dark gray olive-gray no nutrient agar pale yellow-greyish-yellow physiological gray Properties: Temperature range 20 to 40 "C on yeast-malt agar for growth:
Medium gelatin liquefaction: slow when grown at 20 C over a period of not less than 21 days hydrolysis of starch positive (strong at 28 "C) coagulation of skimmed milk: positive (strong at 28 and 37" C) petonization of skimmed milk: positive (at 28 and 37 "C) melanin formation:
negative (IV) carbon source utilization table (at Pridham-Gottlieb's agar medium at 28 "C) D-glucose + D-fructose - + D-xylose + D-mannitol + inositol + L-arabinose + rhamnose + sucrose + raffinose
Due to the properties mentioned above, the strain SF-1739 belongs to the genus Streptomyces, is spiral at the upper end of the aerial mycelium and has a warty spore surface. The growth on various media is gray to greyish-yellow-brown and the aerial mycelium is gray. The formation of melanin could not be determined, nor could insoluble pigments.
The properties of the SF-1739 strain are very similar among those of the genus Streptomyces to those of Streptomyces griseoplanus. In particular, both are quite similar in terms of spiral formation, the warty spore surface, the gray aerial mycelium and the non-formation of melanin. Compared to the SF-1739 strain with Streptomyces griseoplanus, as described in ISP (International Streptomyces Project) [cf.
International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 12S126, (1968)], is the strain from strain SF-1739 specified in ISP regarding poor growth on starch agar, the utilization of raffinose and the non-utilization of sucrose, inositol, D-mannitol and rhamnose different, the former being very similar to the latter in terms of the spore surface, which has a wart-like to prick-like nature.
From the above it is clear that it is reasonable to call the strain SF-1739 as belonging to the species Streptomyces griseoplanus, because the morphological properties agree with each other and other essential properties are common to both. However, the former strain differs from the strain shown in ISP in terms of carbon source utilization behavior and other properties. Therefore, the strain SF-1739 was called Streptomyces griseoplanus strain SF-1739.
Although the production here is mainly explained in relation to the SF-1739 strain, it should be pointed out that it is well known that various properties of all microorganisms belonging to the Streptomyces genus are not unique, but that the microorganisms of the Streptomyces genus are natural Paths and can be artificially easily changed. It should therefore be noted that all strains which are capable of producing the antibiotic metabolites used as starting materials and are classified in the genus Streptomyces, including the variants and mutants, can be considered and used for the present purposes.
The cultivation can be carried out satisfactorily in the same way as is usually done for the cultivation of any strains of the genus Streptomyces. Any of the nutrient materials known for the Streptomyces genus can be used as components of the medium.
For example, glucose, sucrose, starch, glycerin, corn steep liquor, molasses, soybean oil, etc. can be used as a carbon source. Soybean meal, wheat embryo, meat extracts, peptone, dry yeast, corn steep liquor, ammonium sulfate, sodium nitrate, etc. come as nitrogen sources. in question. Calcium carbonate, sodium chloride, potassium chloride, phosphates, etc., which can be added to the medium if necessary, are also suitable as inorganic salts.
Small amounts of other substances which can promote the growth of the strain and which can promote the production of the antibiotic yellow metabolites can also be added.
The cultivation can, as is the case for the production of the known antibiotic substances, be carried out in a liquid culture medium and preferably in submerged culture. The breeding temperature is advantageously in the range from 25 to 35 C and often around 28 C. The maximum production is usually reached within 2 to 6 days.
The yellow metabolites enriched in this way in a culture broth are basic substances which are half soluble in water and which have been extraordinarily unstable and have not been successfully isolated and identified.
When the aforementioned metabolites are used for the treatment with an acid to produce the substances SF-1739 HP-3 and SF-1739 HP-5, culture broth containing such metabolites can be treated as such with an acid.
On the other hand, and with advantage. the metabolites can be concentrated and then treated with an acid.
Conventional techniques can be used to concentrate the metabolites, which are usually used to obtain a basic natural product which is only partially soluble in water. For example, you can filter a culture broth. make the filtrate alkaline, saturate with sodium chloride, ammonium sulfate or the like and then with a water-immiscible organic solvent, e.g. B. extract n-butanol, ethyl acetate, butyl acetate, ether or the like.
You can also the filtrate on a cation exchange resin such. B. an Amberlite IRC-50, CG-50, IR-120 or Dowex 50W, and then with an acid, e.g. As hydrochloric acid or sulfuric acid, elute to obtain the metabolites in a concentrated state.
In order to obtain the desired metabolites in a purer state, the extraction methods mentioned above can be combined with one another as desired. You can also with a resin, e.g. B. XAD-2, adsorb, desorb, clean by column chromatography with Sephadex G-10, carboxymethyl cellulose or the like. And / or scrape off with a thin-layer plate containing silica gel, etc.
Finally, the so narrowed and fractionated metabolites can advantageously be used for treatment with an acid, in order to then obtain the substances SF-1739 HP-3 and SF1739 HP-5.
The biological effects of the derivatives of the substance SF-1739 according to the invention can be found below.
Table 1
Antimicrobial activity of the derivatives of the substance SF-1739
MIC (mcg./ml.) Microben substance SF-1739
HP HP-C HP-F HP-5 HP-3 Bacillus subtilis <0.09 0.78 1.56 12.5 3.1 Staphylococcus aureus <0.09 3.125 1.25 50 3.1 209P Sarcina lutea <0.09 <0.19 0.39 6.25 0.78 Escherichia coli 3.125> 100> 100> 100> 100 Escherichia coli> 3.125> 100> 100> 100> 100 K-12R Klebsiella pneumonia 3.125 50> 100> 100> 100 Pseudomonas aeruginosa 3.125> 100> 100> 100> 100 Proteus vulgaris 0.39 50 6.25> 100> 100
I. Antimicrobial effect
The following Table 1 shows the minimum inhibitory concentration values of the five derivatives of the substance SF-1739 according to the invention.
II. Antitumor effect
A: Cytopathogenic effect in vitro
The following Table 2 shows the minimum cytopathogenic concentration values of the five derivatives of the substance SF-1739 according to the invention.
Table 2 Test - Minimum cytopathogenic concentration substance (mcg./ml.)*
HeLa S3 Hep. 2 Sarcoma 180 SF-1739 HP 0.9 <0.4 <0.4 SF-1739-HP-C 0.9 <0.4 0.9 SF-1739 HP-F 0.9 <0.4 0.9 SF-1739 HP-5 7.8 1.9 3.9 SF-1739 HP-3 3.9 - * protected after treating the tissue for 48 hours.
B: Carcinostatic effect in vivo in mice
Male mice from the strain CDFl (approx. 5 weeks old weighing 19 + 1 g, each group comprising 3 to 5 animals) were intraperitoneally with P-388 leukemia cells
106 / 0.02 ml / mouse inoculated. Each substance was dissolved in water at the stated dose amounts and administered intraperitoneally in an amount of 2-0.2 ml / day / mouse 24 hours after the inoculation was carried out for three consecutive days. An increase in life (hereinafter referred to as ILS) was then calculated. The results can be found in Table 3 below.
Table 3 Test substance dose (mg./kg.) ILS (%) SF-1739 HP 2 75.0
1 43.3
0.5 43.3
0.25 45.0 SF-1739 HP-C 16 70.2
8 53.8
4 113.5
2 61.5
1 59.4 SF-1739 HP-F 16 47.1
8 34.6 SF-1739 HP-5 40 56.7
20 51.9
8 30.0
4 25.0
III. acute toxicity
The following Table 4 shows the acute toxicity values (LD50) of the five derivatives of the substance SF-1739 according to the invention after intravenous administration to mice.
Table 4 Substance LDs0 (mg./kg.) SF-1739 HP 2 SF-1739 HP-C 225 SF-1739 HP-F> 25 SF-1739 HP-5> 10 SF-1739 HP-3> 10 SF-1739 0.45
When the derivatives of the substance SF-1739 according to the invention are used for the treatment of various types of tumors, they can be administered orally or parenterally in the form of a preparation which is usually mixed with a customary solid or liquid, pharmaceutically acceptable carrier or filler. The solid preparations which can be used for oral administration can be in the form of capsules, tablets.
Granules, pills and the like. And the topically applicable preparations are in the form of suppositories, ointments or the like. The liquid preparations can be in the form of solutions, suspensions, syrups and the like and can be administered orally, topically or by injection. Such preparations can be prepared by methods well known to those skilled in the art. The amount of active substance present in the preparations according to the invention and the choice of the form of the preparation used usually fluctuate depending on the type and extent of the disease to be treated, on the method of administration, on the body weight and age of the patient, on the effect and toxicity derivatives of substance SF-1739 etc.
For an injectable preparation, it is desirable in adults to administer subcutaneously, intramuscularly, or preferably intravenously or intraarterially at daily dosage levels of 1 to 100 mg for several consecutive days or in dosage levels of 2 to 200 mg every 2 days or 3 days. Depending on the type of tumor, it can sometimes be effective to inject the preparation directly into the tumor.
For oral administration in adults, it is desirable to administer with a single daily dose of 1 to 500 mg or every 2 days.
In the case of topical application, the active substance can be applied directly to the affected or diseased area in the form of a mixture with a suitable base in order to ensure a content of 1 to 20% of active substance.
One or more of the active substances according to the invention or a combination with other known antitumor agents and / or immunoaccelerators can also be used.
In those cases in which the derivatives of the substance SF-1739 according to the invention are to be used as antimicrobial agents, in particular as antibacterial agents, they can also be taken orally or parenterally in the form of solid or liquid preparations, as is usually the case in connection with other known antibacterial agents Agents or antibiotics are used. Preparations for oral administration can be, for example, capsules, tablets, powders, granules, solutions, suspensions or syrups. Suppositories, ointments, etc. can be used for topical application. Injectable solutions or suspensions can be used as preparations for parenteral administration, and the preparation can be administered subcutaneously, intramuscularly or intravenously.
The amount of active substance that can be administered can vary depending on the type and extent of the disease, the body weight and age of the patient, the action and toxicity of the derivatives of the substance
SF-1739 and other factors fluctuate. In adults, the active ingredient is usually administered by oral administration in a single dosage or divided into various dosages in an amount of 1 to 500 mg. In the parenteral, e.g. B. intramuscular or intravenous administration, the individual dosage amount is 1 to 100 mg. Depending on the extent of the disease, the physical condition of the
Depending on the patient's reaction, the doctor can also determine higher or lower dosage amounts.
The derivatives of the substance SF-1739 according to the invention can be used as such, in the form of mixtures of several of these derivatives or in combination with other known antimicrobial agents
Means pointed. B. various antibiotics, etc. are administered.
The following examples may illustrate the present invention.
example 1
Preparation of the substance SF-1739 HP
A solution of 6 mg of SF-1739 hydrochloride in 3 ml of Sn hydrochloric acid was left to stand at room temperature for 1 week. The solution was then neutralized with solid sodium hydrogen carbonate and the neutralized solution was evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was dissolved in a little methanol, the insolubles were filtered off and the filtrate was concentrated. The residue was then applied to a preparative thin-layer chromatography plate (2 × 100 × 100 mm, available from E. Merck, FRG) over silica gel, the development taking place with a mixture of chloroform and methanol in a mixing ratio of 9: 1. A purple tape with Rf of 0.45 was cut out of the plate and extracted with methanol.
The extract was evaporated to dryness and the residue was redissolved in a mixture of methanol and acetone in a mixing ratio of 2: 1 and the insoluble constituents were filtered off. The filtrate was evaporated to dryness.
In this way, 3.3 mg of substance SF-1739 HP was obtained.
Example 2
Preparation of the substance SF-1739 HP-C
144 mg of sodium cyanide were added to a solution of 71 mg of substance SF-1739 HP in 5 ml of water and the mixture thus obtained was left to stand at room temperature for 30 minutes. It was then evaporated to dryness under reduced pressure at a temperature of less than 35 ° C. with the addition of n butanol. The residue was dissolved in a little methanol, the insolubles were filtered off and the filtrate was concentrated. The residue was then applied to a plate which was suitable for thin-layer chromatography and provided with silica gel (2 × 100 × 100 mm, available from E. Merck, FRG) and then developed with a mixture of ethyl acetate and methanol in a mixing ratio of 3: 2 .
A purple band with Rf 0.70 was scraped off and extracted with methanol. The extract was evaporated to dryness and the residue was redissolved in a solution of methanol and acetone in a mixing ratio of 2: 1. Then the insoluble constituents were filtered off and the filtrate was then evaporated to dryness. In this way, 35 mg of the substance SF-1739 HP-C were obtained.
Example 3
Preparation of the substance SF-1739 HP-F
A solution of 35 mg of the substance SF-1739 HP in 1.5 ml of formamide was left to stand for 5 minutes at room temperature. The reaction mixture was then concentrated to dryness under reduced pressure at a temperature of less than 500.degree. The residue was dissolved in a little methanol and the solution thus obtained was applied to a plate provided with silica gel (2 × 100 × 100 mm, available from E. Merck, FRG) and suitable for preparative thin-layer chromatography. Then the development was carried out with a mixed solution of ethyl acetate and methanol in a mixing ratio of 3: 1. A purple band with Rf of 0.53 was scraped off and extracted with methanol.
The extract was evaporated to dryness, the residue redissolved in a solvent of methanol and acetone in a mixing ratio of 2: 1, the insoluble constituents were filtered off and the filtrate was finally evaporated to dryness. In this way, 25 mg of the substance So 1739 HP-F were obtained.
Example 4
Preparation of the substance SF-1739 HP-C
72 mg of potassium cyanide were added to a solution of 73 mg of the substance SF-1739 HP in 2 ml of methanol, and the mixture thus obtained was stirred at room temperature for 5 min. The mixture of solutions was then placed on a plate loaded with silica gel (2 × 100 × 100 mm), suitable for preparative thin-layer chromatography, available from E.
Merk, FRG), whereupon the development was carried out with a solvent mixture of ethyl acetate and methanol in a mixing ratio of 3: 2. A purple band with Rf = 0.70 was scraped off and extracted with methanol. The extract was evaporated to dryness, the residue redissolved in a mixed solvent of methanol and acetone in a mixing ratio of 2: 1, the insoluble constituents were filtered off and the filtrate was finally evaporated to dryness, giving 50 mg of the substance SF-1739 HP-C .
Example 5 Preparation of substance SF-1739 HP-3, SF-1739 HP-5 and SF
1739 HP
Spores of Streptomyces griseoplanus strain SF-1739 (deposited under No. 3002 with the Technical Research Institute of Microbial Industry) were in 1.61 a liquid medium, which consisted of 1.0% starch and 0.3% soybean meal and a pH Was 7.0, inoculated and the culture shaken for 30 hours at 28 ° C using 16 Sakaguchi flasks to produce a seed culture.
The seed culture thus obtained was treated with 701 of a liquid medium consisting of 3.0% starch syrup, 2.0% soybean meal, 1.0% bovine extract, 1.0% wheat embryo and 0.3% sodium chloride at a pH of 6 , 6 and the culture was shaken for 90 hours at 28 ° C. with aeration and using two fermentation flasks, each with a volume of 501.
The pH of the culture broth was adjusted to 3 to 4 by adding 6N hydrochloric acid and filtered with a filter aid, namely Hyflo Super Cel. The approximately 471 filtrate was treated with 3N sodium hydroxide to adjust the pH to 6 and the filtrate was passed through a column of approximately 41 of an ion exchange resin, Amberlite IRC-50 (H +), to adsorb the antibiotic metabolites . The column was then washed thoroughly with water and eluted with an aqueous 0.2N hydrochloric acid solution.
The active fraction, consisting of approximately 4.51 liquid, was saturated with sodium chloride, the pH of which was adjusted to 8.0 using sodium hydroxide and then extracted twice with 11 ethyl acetate with cooling. The ethyl acetate extract was extracted again with 200 ml of an aqueous 0, ozone hydrochloric acid solution. Then, the aqueous solution having a pH of 2.0 was concentrated to dryness under reduced pressure, whereby 1.68 g of antibiotic metabolites were obtained in the form of a crude powder. This crude powder was dissolved in 20 ml of 5N hydrochloric acid and the solution was then left to stand at room temperature for 1 week and then concentrated to dryness again under reduced pressure.
The residue was dissolved in 20 ml of methanol and the yellowish-red solution thus obtained was neutralized by adding solid sodium hydrogen carbonate until a purple color was reached. The insoluble constituents were filtered off, the filtrate was concentrated, and the residue was then applied to 7 plates (2 × 100 × 100 mm, available from E. Merck, Germany) suitable for preparative thin-layer chromatography. The development was then carried out with a mixture of ethyl acetate and methanol in a mixing ratio of 3: 2. A purple band with Rf of 0.12 was scraped off each plate and extracted with methanol. The combined extracts were evaporated to dryness to give SF-1739 HP-5 as a crude powder.
This crude powder was dissolved in a little methanol and applied to three silica gel plates suitable for preparative thin-layer chromatography and then developed with a mixed solvent of chloroform and methanol in a mixing ratio of 9: 1. The purple band with Rf 0.12 was scraped off, extracted with methanol and the extract evaporated to dryness. The residue was dissolved in a solvent mixture of methanol and acetone in a mixing ratio of 3: 1, the insoluble constituents were filtered off and the filtrate was evaporated to dryness. In this way, 153 mg of the substance SF-1739 HP-5 were obtained.
Purple bands with Rf of 0.39 were scraped off the first silica gel-containing thin-layer chromatography plates and extracted with methanol. The extract was evaporated to dryness and the residue dissolved in a little methanol and applied to a preparative thin-layer chromatography plate containing silica gel (2 × 100 × 100 mm, available from E. Merck, FRG), followed by development with a solvent mixture of chloroform and methanol in a mixing ratio of 9: 1. A purple band with Rf of 0.22 was scraped off and extracted with methanol.
The extract was evaporated to dryness, the residue was dissolved in a solvent mixture of methanol and acetone in a mixing ratio of 2: 1, the insoluble constituents were filtered off and the filtrate was finally evaporated to dryness, giving 27 mg of the substance SF-1739 HP-3.
Purple bands with Rf of 0.31 were scraped off from the first silica gel-containing thin layer chromatography plates and extracted with methanol. The extract was evaporated to dryness, the residue dissolved in a little methanol and then placed on two silica gel-containing preparative thin-layer chromatography plates (2 x 100 x 100 mm, available from E. Merck, FRG), whereupon the development was carried out with a mixed solvent of chloroform and Methanol in a mixing ratio of 9: 1 carried out. The purple band with Rf of 0.26 was scraped off and extracted with methanol. The extract was evaporated to dryness, the residue was dissolved in a mixed solvent of methanol and acetone in a mixing ratio of 2: 1, the insoluble constituents were filtered off and the filtrate was then evaporated to dryness.
In this way, 99 mg of the substance SF1739 HP was obtained.