CH639277A5

CH639277A5 - Antitumour agent containing a beta-1,3-glucan

Info

Publication number: CH639277A5
Application number: CH279282A
Authority: CH
Inventors: Takuma Sasaki; Yukio Sugino
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-11-02
Filing date: 1982-05-06
Publication date: 1983-11-15
Also published as: CH637972A5

Description

L'invention se rapporte à un agent antitumoral contenant une quantité efficace d'un ß-l,3-glucane utilisable pour le traitement préventif et curatif de tumeurs.

Des recherches ont été effectuées, depuis des années, en vue de trouver une substance capable de provoquer, par administration pa-rentérale ou orale, l'inhibition de la croissance de tumeurs et la prolongation du temps de survie des animaux à sang chaud atteints de tumeurs, sans effets secondaires sérieux.

On a trouvé qu'un ß-l,3-glucane thermogélifiable insoluble dans l'eau, produit par des micro-organismes appartenant au genre Alca-ligenes et au genre Agrobacterium, des polymères inférieurs partiellement hydrolysés de ce glucane, ou des dérivés carboxyméthylés dudit glucane ou desdits polymères inférieurs présentent une forte activité antitumorale contre la croissance de tumeurs telles que sarcome, carcinome ou leucémie chez les animaux à sang chaud,

sans effets secondaires nuisibles.

Le but de l'invention est de fournir un agent antiumoral renfermant comme ingrédients actifs le ß-1,3-glucane, ses polymères inférieurs ou ses dérivés carboxyméthylés.

On sait déjà, par les brevets japonais publiés sous les Nos 32673/ 1973 et 32674/1973, et par le brevet anglais N° 1352938, que certaines souches de micro-organismes du genre Alcaligenes et du genre Agrobacterium produisent un ß-l,3-glucane thermogélifiable insoluble dans l'eau (désigné ci-après, de façon abrégée, par TAK-N). Aucun usage pharmaceutique du glucane n'a toutefois été indiqué.

Les études poussées effectuées par les inventeurs sur le TAK-N, ses polymères inférieurs obtenus par hydrolyse partielle (ci-après désignés par TAK-D) et les dérivés carboxyméthylés de TAK-N ou desdits polymères inférieurs (ci-après désignés par CMTAK) ont abouti à la découverte selon laquelle ces substances possèdent une forte activité antitumorale, se traduisant par un taux d'inhibition des tumeurs remarquablement élevé, et par une régression complète de ces tumeurs.

Le TAK-N utilisable est celui qui, comme décrit en détail dans les brevets précités, est produit par la culture de certains microorganismes tels que VAgrobacterium radiobacter (IFO 13127,

ATCC 6466), l'Agrobacterium radiobacter U-19 (IFO 13126,

ATCC 21679, FERM P-l 166) et Y Alcaligenes faecalis var. myxoge-nes NTK-u (IFO 13140, ATCC 21680, FERM P-l 168). Ce ß-1,3-glucane renferme des liaisons ß-1,3, en tant que liaisons glucosides,

et est insoluble dans l'eau, la plupart des espèces ayant des degrés 30 moyens de polymérisation (désignés ci-après par DP) qui ne sont pas inférieurs à environ 70, et une propriété caractéristique selon laquelle ces produits sont gélifiables à DP 170 par chauffage, par exemple à environ 60° C, en présence d'eau.

Le DP de TAK-N varie en fonction du procédé de préparation. 35 Déterminé selon la méthode de Manners et al. («Carbohydrate Research» 17,109 (1971), il est d'environ 70 à 1000 et, dans certains cas, de 100 à 600. En outre, tandis que ces variantes de types de glu-canes sont généralement thermogélifiables en présence d'eau, elles perdent leur pouvoir gélifiant lorsque leurs DP diminuent. Par 40 exemple, le glucane d'un DP de 113 n'est pas gélifiable, alors que celui de DP 170 est gélifiable. On a découvert que tous les TAK-N, TAK-D et CMTAK présentaient une puissante activité antitumorale.

Il est particulièrement surprenant que même certains types de 45 TAK-D, qui ne peuvent être appelés Polysaccharides en raison de leur faible degré de polymérisation, conservent et manifestent une telle activité antitumorale.

Le TAK-D est produit par hydrolyse partielle du TAK-N. Parmi les méthodes d'hydrolyse utilisables à cette fin, on mentionne des so méthodes connues comme l'hydrolyse acide, l'hydrolyse alcaline et l'hydrolyse enzymatique avec la ß-l,3-glucanase.

Le TAK-D peut être séparé du mélange réactionnel suivant des techniques variées couramment utilisées pour la purification ou le fractionnement de Polysaccharides et d'oligosaccharides, telles que 55 précipitation en milieu acide, précipitation par addition d'éthanol et filtration par gel. Par de telles techniques, des polymères inférieurs variés ayant chacun le DP désiré peuvent être obtenus séparément.

Le terme TAK-D utilisé dans la présente description signifie l'un quelconque et tous les types de polymères inférieurs qui sont 60 obtenus par hydrolyse partielle de TAK-N.

Comme déjà mentionné, les DP de TAK-N tels qu'obtenus à partir des cultures des micro-organismes précités sont largement dispersés. Du fait que le degré de polymérisation du ß-l,3-glucane obtenu lors d'un processus de fermentation tend à décroître lorsque 65 le temps de culture est prolongé, il est même possible d'obtenir un TAK-N de DP inférieur aux valeurs de la gamme précitée.

Par ailleurs, du fait que le TAK-D est obtenu par hydrolyse de TAK-N, son DP est naturellement plus faible que celui du TAK-N

3

639 277

de départ. Toutefois, de façon générale, des TAK-N de degrés de polymérisation correspondant à ceux d'un grand nombre de types de TAK-D peuvent être obtenus par culture desdits micro-organismes. Pour autant que les TAK-N et les TAK-D aient les mêmes DP, on n'a trouvé entre eux aucune différence appréciable dans leur activité antitumorale et dans leur pouvoir gélifiant.

La méthode de production de TAK-D à partir de TAK-N sera maintenant décrite au moyen des résultats des essais de production expérimentale.

Essai I (hydrolyse par l'acide sulfurique) :

Dans 6 1 d'acide sulfurique 4N, on met en suspension 60 g de TAK-N (DP 540, mesuré suivant la méthode de Manners et al. Sauf indication contraire, tous les DP indiqués ci-après sont mesurés suivant cette méthode.) La réaction d'hydrolyse est effectuée à 60° C. Après 30 min et 1 h, on prélève une fraction de 21 du mélange réac-tionnel. Ces fractions du mélange réactionnel sont désignées respectivement par S, et S2. Le reste du mélange réactionnel est encore incubé à 60° C pendant 1 h supplémentaire pour obtenir un autre échantillon S3. A partir de Sj, S2 et S3, les produits d'hydrolyse sont préparés de la manière suivante. Tout d'abord, chaque échantillon est centrifugé et le précipité est rassemblé. Chaque précipité est ensuite lavé avec 1,6 1 d'eau distillée et centrifugé. Cette technique est répétée, et le précipité est mis en suspension dans 1,2 1 d'eau distillée. La suspension est neutralisée par une solution 8N d'hydr-oxyde de sodium et lyophilisée. La technique précipitée permet d'obtenir, à partir de Si, S2 et S3, respectivement 22, 20 et 19 g de poudre. Des portions de 7 g de ces poudres sont mises chacune en suspension dans 700 ml d'eau distillée, et l'on ajuste le pH à 12,5 avec une solution 8N d'hydroxyde de sodium, de manière à obtenir, respectivement, S/, S2' et S3'.

On ajoute de l'éthanol à chaque solution, pour avoir une concentration finale de 60%, et, après avoir éliminé par centrifugation le précipité formé, on ajoute encore de l'éthanol au surnageant, de manière à avoir une concentration de 70%. On neutralise ensuite la solution avec de l'acide chlorhydrique dilué. Le précipité formé est rassemblé par centrifugation, lavé 4 fois avec des portions de 250 ml d'eau distillée, puis lyophilisé.

On obtient de cette manière, à partir de S/ et S2', respectivement 1,8 et 1,5 g de poudres blanches (S-I et S-II). On ajoute à S3' une quantité suffisante d'éthanol pour obtenir une concentration finale de 70%, et l'on centrifuge le mélange. On remet en suspension le précipité dans environ 500 ml d'eau distillée et, après addition d'éthanol pour avoir une concentration de 70%, on neutralise la suspension avec une petite quantité d'acide chlorhydrique. Le précipité formé est rassemblé par centrifugation, lavé 4 fois avec des portions de 250 ml d'eau distillée et lyophilisé, ce qui fournit 5,6 g d'une poudre blanche (S-III).

Les propriétés physico-chimiques de S-I, S-II et S-III sont indiquées au tableau I.

Tableau I

S-I

S-II

S-III

DP*

125

82

68

Analyse élémentaire (%)

C 40,13

C 40,65

C 40,94

H 6,74

H 6,77

H 6,76

Pureté (%)**

93,1

91,1

93,8

Teneur en glucose (%)***

<0,1

[a]|J dans NaOH 0,1N

25,6

19,5

18,8

(C = 1,16)

(C = 1,10)

(C = 0,82)

* Mesuré suivant la méthode de Manners et al.

** Calculée à partir de la teneur en glucose déterminée par la méthode à l'acide phénolsulfurique.

*** Mesurée par Chromatographie gazeuse.

Essai 2 (hydrolyse à l'acide fornique):

I) Dans 150 ml d'acide formique à 85%, on dissout 6 g de TAK-N (DP 540) et l'on effectue la réaction d'hydrolyse à 88° C pendant 20 min. Après refroidissement, le mélange réactionnel est concentré à sec, et le concentrât est mis en suspension dans l'eau. La suspension est amenée à pH 12,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 5N, de manière à obtenir une solution limpide. Cette solution est amenée à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique 5N, et le précipité formé est rassemblé par centrifugation. Le précipité est bien lavé à l'eau distillée et lyophilisé. On obtient, par ce processus, 5,4 g d'une poudre blanche (F-I).

II) 12 g du même TAK-N que celui utilisé dans I sont hydroly-sés dans 300 ml d'acide formique à 90% pendant 20 min, à 95°C, et le mélange réactionnel est traité presque de la même manière que dans I, ce qui fournit 10,3 g d'une poudre blanche (F-II).

III) 12 g du même TAK-N que celui utilisé dans I sont hydroly-sés dans 300 ml d'acide formique à 90%, à 95°C, pendant 40 min, et le mélange réactionnel est traité presque de la même manière que dans I, ce qui fournit 5,4 g d'une poudre blanche. On dissout cette poudre dans une solution aqueuse 0,05N d'hydroxyde de sodium pour obtenir une concentration finale de 1,0%, et l'on ajoute encore de l'éthanol à la solution, de manière à avoir une concentration de 57,5%. Le précipité formé est rassemblé par centrifugation, mis en suspension dans l'eau distillée et neutralisé avec de l'acide chlorhydrique dilué. La suspension est centrifugée et le précipité est lavé convenablement à l'éthanol aqueux à 70% et lyophilisé, ce qui fournit 2,2 g d'une poudre blanche (F-V).

Au surnageant obtenu après récupération du précipité éthanoli-que précité, on ajoute de l'éthanol pour avoir une concentration de 70% et l'on neutralise le mélange avec de l'acide chlorhydrique. Le précipité formé est rassemblé par centrifugation, lavé à l'éthanol aqueux à 70% et lyophilisé. Par le processus précité, on obtient 2,3 g d'une poudre blanche (F-III). Le surnageant restant après récupération du premier précipité (5,4 g) provenant du mélange d'hydroly-sats renferme une quantité notable d'hydrolysats partiels à l'état solubilisé. En conséquence, cette solution surnageante est concentrée et centrifugée pour séparer le précipité formé. Le précipité est lyophilisé pour obtenir 2,9 g d'une poudre blanche (F-VII). La solution surnageante est ensuite fractionnée par filtration par gel et Chromatographie sur colonne de Sephadex G-25 (solvant: bicarbonate d'ammonium 0,1M), suivie de la lyophilisation des fractions combinées. On obtient par ce processus 0,7 g d'une poudre blanche (F-VIII).

IV) Le même TAK-N (18 g) que celui utilisé dans I est hydrolysé dans 450 ml d'acide formique à 90%, à 95 C, pendant 40 min, et l'on applique à ce mélange réactionnel presque la même technique de fractionnement que dans III, telle que concentration, précipitation à l'éthanol, filtration par gel, etc. On obtient suivant cette technique quatre fractions de poudres blanches (F-IV, 2,3 g; F-VI, 2,8 g, etc.).

Les propriétés physico-chimiques de ces poudres (F-I, F-II,

F-III, F-IV, F-V, F-VI, F-VII et F-VIII) sont indiquées au tableau II. Lorsque six échantillons de plus faibles DP (F-III à F-VIII) sont dissous chacun dans une solution 0,02N d'hydroxyde de sodium, et chromatographiês respectivement sur la même colonne Sephadex G-200 équilibrée avec la même solution que précédemment, ils sont élués dans l'ordre décroissant des DP (de F-III à F-VIII), chaque échantillon donnant un pic symétrique, ce qui indique que chaque échantillon présente une distribution normale en ce qui concerne le degré de polymérisation.

( Tableau en tête de la page suivante )

On a découvert que la carboxyméthylation de TAK-N et de TAK-D fournit de nouveaux dérivés (CMTAK), dans lesquels les groupes hydroxyles de ces glucanes sont plus ou moins carboxyméthylés.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

639 277 4

Tableau II

DP*

Analyse

élémentaire (%)

C H

Pureté (%)**

Teneur en glucose (%)***

[apD5 dans NaOH 0,1N

F-I

299

40,73 6,46

92,3

<0,03

30,6 (C = 0,35)

F-II

113

41,71 6,91

98,4

<0,03

22,3 (C = 0,57)

F-III

50

41,98 6,77

93,5

<0,03

12,1 (C = 1,06)

F-IV

44

42,35 6,50

90,8

<0,03

10,9 (C = 2,24)

F-V

39

41,44 6,71

93,3

<0,03

4,0 (C= 1,62)

F-VI

24

42,62 6,99

92,5

<0,03

-1,5 (C= 1,07)

F-VII

16

42,46 6,99

91,8

<0,03

0,4 (C= 1,06)

F-VIII

7

39,84 6,37

94,1

<0,03

0,0 (C = 0,57)

*, ** et *** : voir la note en bas du tableau I.

L'invention concerne des dérivés de ß-1,3-glucane ayant la formule générale suivante, et leurs sels

^ N

ch2or ch2or h,or

(I)

\

(Formule dans laquelle au moins l'un des R est — CH2COOH, le reste, s'il en existe, étant H; n est un nombre entier compris entre 2 et 1000.)

Le CMTAK peut être obtenu par carboxyméthylation de TAK-N ou de TAK-D, de façon connue, par exemple en faisant réagir TAK-N ou TAK-D avec l'acide monochloracétique en présence d'un alcali. Outre cette méthode, on peut employer tout autre procédé conventionnel utilisé pour la carboxyméthylation des hydrates de carbone.

Pour récupérer le CMTAK à partir du mélange réactionnel, il est possible d'avoir recours à des procédés conventionnels qui sont couramment utilisés pour la purification des hydrates de carbone, tels que la précipitation par addition d'un solvant organique. En outre, d'autres techniques telles que Chromatographie échangeuse d'ions, filtration par gel, etc., peuvent être utilisées suivant la teneur en groupes carboxyméthylés dans le CMTAK, ou suivant la solubilité dans l'eau de CMTAK.

Alors que le CMTAK ainsi obtenu renferme des groupes carboxyméthylés dans sa molécule, la teneur des groupes carboxyméthylés varie largement en fonction des conditions de la réaction de carboxyméthylation. Comme déterminé par titration, la teneur en

/

n groupes carboxyméthyle du CMTAK obtenu par réaction normale 35 de carboxyméthylation est généralement inférieure à trois groupes carboxyméthyle par résidu de glucose dans la molécule de CMTAK. Le CMTAK, en tant que produit convenant pour les buts de l'invention, renferme toutes les substances qui peuvent être obtenues par carboxyméthylation de TAK-N ou de TAK-D, dont les molécules 40 renferment des groupes carboxyméthyle décelables, indépendamment du degré de carboxyméthylation.

Comme cela ressort de la formule générale I indiquée précédemment, le CMTAK, sous la forme de son acide libre, est apte à réagir avec des bases variées pour former les sels correspondants, tels que 45 sels de sodium, de potassium, de calcium, d'aluminium, de magnésium et d'amines. Dans le contexte de l'invention, le CMTAK comprend non seulement son acide libre, mais également ses sels, en particulier ceux de faible toxicité.

Le tableau III illustre les propriétés physiques de quelques so espèces types de CMTAK préparées à partir de TAK-N et de TAK-D, suivant les techniques précédemment indiquées. Les déterminations de ces propriétés physiques ont été effectuées après que chaque échantilon eut été préalablement séché sous pression réduite et sur pentoxyde de phosphore à 60° C, pendant 10 h.

Tableau III

CMTAK N°

Exemple N°*

Produit de départ

Teneur***

-ch2cooh

Analyse élémentaire (%)

Viscosité**** (cPo)

[a]jf dans NaOH 0,1N

Type

DP**

C

H

Na

1

13

TAK-N

540

0,54

40,97

5,57

2,7

2,57

6,0 (C = 0,77)

2

14

TAK-N

540

0,75

38,51

5,45

5,7

2,71

10,1 (C = 0,76)

3

15

TAK-N

540

1,07

37,89

4,77

10,0

2,60

3,7 (C = 0,79)

4

16

TAK-N

255

0,30

40,82

6,05

2,7

2,10

15,1 (C = 0,80)

5

17

TAK-N

255

0,36

39,82

6,06

3,9

2,27

10,0 (C = 0,74)

6

18

TAK-D

299

0,59

38,84

5,71

4,8

2,25

14,6 (C = 0,82)

5

Tableau III (suite)

639 277

* Numéros des exemples dans lesquels le CMTAK est produit.

** Déterminé par la méthode de Manners et al.

*** Nombre de groupes carboxyméthyle par résidu de glucose.

**** Déterminée au viscosimètre à rotation coaxiale, dans les conditions suivantes: solvant: solution 0,1N d'hydroxyde de sodium;

concentration: 0,2%; température: 30°C;

vitesse de cisaillement: 1046,7 s-1.

CMTAK

N°

Exemple N°*

Produit de départ

Teneur*** -CH2COOH

Analyse élémentaire (%)

Viscosité**** (cPo)

[a]ff dans NaOH 0,1N

Type

DP**

C

H

Na

7

18

TAK-D

299

1,15

37,93

4,86

9,0

2,29

1,5 (C = 0,81)

8

19

TAK-D

113

0,51

40,22

5,74

4,7

1,96

12,2 (C = 0,71)

9

20

TAK-D

113

1,22

37,03

4,78

9,9

1,49

3,1 (C = 0,78)

10

19

TAK-D

68

0,36

40,46

5,96

3,5

1,68

10,0 (C = 0,74)

11

20

TAK-D

68

0,45

39,41

5,93

4,6

1,83

9,5 (C = 0,78)

Les fig. 1 et 2 illustrent les spectres IR dans le bromure de potassium de CMTAK, respectivement Nos 2 et 11 au tableau III. Les chiffres en haut, à gauche et en bas de chaque figure indiquent respectivement les longueurs d'ondes (|x), les coefficients de transmis- 25 sion ou transmittances (%) et les nombres d'ondes (cm"1).

Les absorptions caractéristiques ont été trouvées à 1440-1400 et 891 cm"1.

Les TAK-N, TAK-D et CMTAK obtenus comme précédemment, de DP allant de 2 à environ 1000, de préférence de 15 à 800, et 30 plus avantageusement de 40 à 600, présentent une activité inhibitrice remarquable contre différentes sortes de tumeurs chez les animaux à sang chaud comprenant les animaux domestiques, volailles, chiens, chats, lapins, rats, souris, etc., et notamment contre de sérieuses tumeurs connues comme étant moins sensibles aux traitements par 35 des médicaments antitumoraux cytotoxiques généralement connus.

Par exemple, la croissance du sarcome 180, du carcinome d'Ehr-Iich, de la leucémie SN-36, de l'adénocarcinome CCM ou du sarcome à cellules réticulaires NTF, chaque tumeur étant transplantée par voie sous-cutanée dans les souris, fut notablement inhibée en 40 administrant le TAK-N, le TAK-D ou le CMTAK par voie intrapé-ritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, avant, après ou au moment de la transplantation, en une fois ou à plusieurs reprises, à des doses d'environ 1 à 1000 mg/kg/d.

Les toxicités des TAK-N, TAK-D et CMTAK sont extrêmement 45 faibles. Par exemple, aucun effet toxique n'est observé, à la fois chez les souris et chez les rats, à une dose de 3000 mg/kg par voie intrapé-ritonéale, ou de 10000 mg/kg par voie orale. Ainsi, ces Polysaccharides peuvent être administrés, de façon sûre et à plusieurs reprises, à des animaux à sang chaud.

L'administration peut être réalisée suivant les techniques générales habituellement appliquées pour le traitement des cancers. Sont ainsi applicables les injections intratumorales, sous-cutanées, intramusculaires ou intraveineuses, si nécessaire des administrations J5 orales et rectales, ou encore des applications externes, badigeon-nages, instillations et autres méthodes d'administration.

Selon l'invention, le TAK-N, le TAK-D ou le CMTAK est administré à un animal à sang chaud en une quantité suffisante pour inhiber la croissance de sa tumeur. . 60

Le dosage et la méthode d'administration des TAK-N, TAK-D ou CMTAK à des animaux à sang chaud affectés de néoplasies peuvent varier suivant le type d'agents (TAK-N, TAK-D ou CMTAK), d'animaux et de patients, de symptômes de tumeurs, de formes d'administration et autres facteurs. En général, la quantité 65 suffisante de dosage par administration est d'environ 0,02 à 2000 mg/kg de poids vif, de préférence de 0,2 à 2000 mg/kg de poids vif, la limite supérieure préférée étant d'environ 500 mg/kg de poids vif. Dans bien des cas, la limite supérieure la plus avantageuse est d'environ 200 mg/kg.

L'administration peut être effectuée, par exemple, une à six fois par jour, pendant plusieurs jours consécutifs ou par intermittence.

Les TAK-N, TAK-D et CMTAK peuvent être administrés en combinaison avec d'autres agents antitumoraux. La combinaison avec de tels agents entraînant une activité immunologique accrue chez les animaux atteints de tumeurs est également avantageuse.

L'invention sera maintenant décrite en se référant aux exemples ci-après. Certains de ces exemples illustrent la technique de production de TAK-D à partir de TAK-N, la technique de production de CMTAK, les propriétés physiques des TAK-N, TAK-D et CMTAK et de certaines formes injectables de ces produits. D'autres exemples mettent en évidence les activités antitumorales des TAK-N, TAK-D et CMTAK contre les tumeurs chez les souris, par l'intermédiaire de modèles types.

Comme indiqué précédemment, le traitement des animaux atteints de tumeurs au moyen des composés produit une régression énergique des différents types de tumeurs, tels que sarcomes, carcinomes, sarcomes à cellules réticulaires et leucémies. Tous ces types de tumeurs, chez les rongeurs, se sont révélés être des types classiques exacts de tumeurs chez d'autres animaux à sang chaud.

Ces exemples ne présentent bien entendu aucun caractère limitatif de l'invention.

La plupart des essais suivants sur l'activité antitumorale des TAK-N, TAK-D et CMTAK sont évalués en employant approximativement les mêmes méthodes que celles décrites pour l'activité antitumorale du lentinane, glucane ramifié provenant d'un champignon comestible, selon Chihara, G. et al. (voir «Nature», 222, 687-688,1969, et «Cancer Research» 30,2776-2781,1970).

Les tumeurs des souris utilisées dans ces essais, telles que sarcome 180 (S 180), carcinome d'(Ehrlich) et sarcome à cellules réticulaires NTF (NTF), adénocarcinome CCM (CCM) et leucémie SN-36 (SN-36), sont maintenues chez des souris du type ICR-JCL, de 5 à 7 semaines, chacune sous des formes ascites. Un élément approprié de ces cellules tumorales est transplanté par voie sous-cutanée sur des souris ICR-JCL, et les nodosités tumorales qui se sont développées sont excisées pour la pesée le 35e jour après transplantation de la tumeur.

Un TAK-N ou un TAK-D a été mis en suspension ou dissous dans l'eau distillée ou dans une solution physiologique, et le CMTAK a été dissous dans l'eau distillée ou dans une solution saline physiologique, à des concentrations appropriées et à des pH voisins de la neutralité. Chaque préparation a été administrée par voie intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse à des souris (0,2 ml/20 g de poids vif), quotidiennement pendant 10 d, en commençant 24 h après la transplantation de la tumeur, quotidienne

639 277

6

ment pendant 5 d avant transplantation de la tumeur, ou seulement en une fois entre le 7e d avant et le 21e d après l'implantation de la tumeur.

Exemple 1:

Effet de suppression d'une tumeur par le TAK-N (DP 540) : injection unique

Quatre millions de cellules S 180 sont transplantées par voie sous-cutanée dans la région inguinale gauche de souris femelles du type ICR-JCL, de 4 à 5 semaines. Les nodosités de la tumeur sont excisées le 35e d après transplantation et pesées. Le poids moyen d'une tumeur d'un groupe traité (T) comprenant 5 souris a été comparé avec celui d'un groupe témoin (C) de 10 souris, et l'on a calculé le taux d'inhibition de la tumeur (% inhibition = (C—T)/ C x 100). On a également compté le nombre d'animaux exempts de tumeur (régression complète) au 35e d.

Du TAK-N (DP 540), mis en suspension dans une solution saline physiologique (10mg/ml), a été administré par voie intrapéri-tonéale (0,2 ml/20 g de poids vif) une fois à chaque animal, à la dose de 100 mg/kg, le 7e, 3e ou 1er d avant, ou le 1er, 2e, 3e, 5e, 7e, 10e, 14e 5 ou 21e d après transplantation de la tumeur, ou le jour de la transplantation de la tumeur.

Comme on le voit au tableau IV, le TAK-N à la dose de 100 mg/ kg inhibe de façon marquée la croissance de S 180, lorsque l'échantillon test est administré une fois entre le 7e d avant et le 21e d après 10 transplantation de la tumeur.

En outre, avec administration unique de TAK-N (DP 540) le 7e d après transplantation de la tumeur à des doses de 20, 60 et 100 mg/kg, on a observé une suppression marquée de la croissance 15 de la tumeur aux deux doses plus élevées, 60 et 100 mg/kg.

Tableau IV

Taux d'inhibition de la tumeur (%)

Nombre de

Echantillon

Dose mg/kg (i.p.)

Jour d'injection

Poids moyen delà tumeur (g)

régressions complètes/ nombre de souris traitées

7,06

—

0/10

100x1

-7*

2,27

67,8

3/5

TAK-N

100x1

-3

1,64

76,8

3/5

(DP 540)

100x1

-1

0

100

5/5

100x1

0**

0,56

92,1

3/5

6,94

0/10

riooxi

1,19

82,9

4/5

TAK-N (DP 540)

100x1 100x1 100x1

2

3 5

0,59 0

1,25

91,5 100 82,0

4/5 5/5 3/5

[lOOxl

7

0

100

5/5

5,08

—

0/10

100x1

7

0

100

5/5

TAK-N

100x1

10

0,01

99,8

4/5

(DP 540)

100x1

14

0,01

99,8

4/5

100x1

21

1,71

66,3

1/5

5,36

0/5

TAK-N (DP 540)

20x1 60x1 .100x1

7 7 7

3,72 0,12 0,03

30,6 97,8 99,4

1/5 3/5 4/5

* Le TAK-N a été administré le 7e d avant la transplantation de la tumeur.

** Le TAK-N a été administré le 1er d après la transplantation de la tumeur.

*** Le TAK-N a été administré le jour de la transplantation de la tumeur.

Ces résultats indiquent que le TAK-N (DP 540) est efficace dans la suppression de la croissance de la tumeur, à tous les stades de progression de la tumeur, sur des animaux à sang chaud, même par administration unique.

Exemple 2:

Effet de suppression d'une tumeur par le TAK-N (DP 540) et le TAK-Nfloculé en autoclave (DP 540)

Six millions de cellules S 180 sont transplantées par voie sous-cutanée dans la région inguinale droite de souris du type ICR-JCL d'un poids vif d'environ 23 g. Les nodosités tumorales sont excisées le 35e d après transplantation et pesées. Le taux d'inhibition de la tumeur dans un groupe traité a été calculé comme dans l'exemple 1.

On a utilisé du TAK-N (DP 540) et du TAK-N (DP 540). Ce dernier a été obtenu en chauffant une suspension à 2% de TAK-N

(DP 540) à 120° C pendant 25 min, puis en séchant et en pulvérisant

55 le gel formé. Les échantillons furent mis en suspension dans l'eau distillée aux concentrations voulues, et chaque suspension a été administrée par voie intrapêritonéale à un groupe de 5 souris, quotidiennement pendant 10 d, en commençant 24 h après transplantation de la tumeur.

60

Comme on le voit au tableau V, le TAK-N (DP 540) exerce un effet prononcé sur la croissance des tumeurs à des doses de 1 à 50 mg/kg, cet effet étant particulièrement important à des doses de 5 à 25 mg/kg.

65

Le TAK-N (DP 540) s'est révélé également efficace dans la suppression de la croissance des tumeurs à des doses de 10 mg/kg. On n'a observé aucune toxicité.

7

Tableau V

639 277

Taux d'inhibition de la tumeur (%)

Nombre de

Dose

Poids moyen régressions

Echantillon mg/kg de la complètes/

(i.p.)

tumeur (g)

nombre de

souris traitées

—

6,00

—

0/6

"1x10

4,80

20,0

0/6

3x 10

3,58

40,3

1/6

5x10

0,02

99,7

5/6

TAK-N

7x10

0,73

87,8

5/6

(DP 540)

10x10 15x10

0,01 0,10

99,8 98,3

5/6 4/5

20x10

0

100

5/5

25x10

0,42

93,0

3/6

-50x10

1,19

80,2

1/6

Gel*

—

3,67

—

0/6

TAK-N

10x10

(DP 540)

0,29

92,1

5/6

* Traité à l'autoclave.

Ces résultats montrent que le TAK-N est utilisable dans le ralentissement de la croissance de tumeurs, à des doses relativement faibles, et que l'échantillon peut être stérilisé par traitement à l'autoclave, sans perte de son activité.

Exemple 3:

Activité inhibitrice des tumeurs de divers types de TAK-N et de TAK-D

A partir de 24 h après la transplantation de S 180, comme décrit dans l'exemple 2, divers types de TAK-N et de TAK-D mis en suspension dans l'eau distillée ont été administrés, par voie intrapérito-néale, à une dose de 10 mg/kg, à un groupe de 5 souris quotidiennement pendant 10 d. Les nodosités tumorales ont été excisées le 35e d après transplantation de la tumeur et pesées. Les taux d'inhibition 30 ont été calculés comme dans l'exemple 1.

Comme on le voit au tableau VI, tous les échantillons utilisés présentent une activité inhibitrice contre la croissance des tumeurs. En particulier, les échantillons de DP supérieur à 50 présentent une 35 forte activité antitumorale avec régression complète.

Tableau VI

Taux d'inhibition de la tumeur (%)

Nombre de

Dose

Poids moyen régressions

Echantillon mg/kg de la complètes/

(i.p.)

tumeur (g)

nombre de souris traitées

—

5,46

—

0/6

(DP 565)

10x10

0,07

98,7

5/6

TAK-N

(Dp380)

10x10 10x10

0,20 0,46

96,3 91,6

5/5 4/6

(DP 125)

10x10

0

100

6/6

5,46

0/6

S-II

(DP 82)

10x10

0

100

6/6

S-III (DP 68)

10x10

0,03

99,5

5/6

F-III TAK-D (DP 50)

10x10

0

100

6/6

F-V (DP 39)

10x10

2,03

62,8

1/6

F-VI (DP 24)

10x10

3,60

34,1

0/6

F-VII (DP 16)

10x10

1,54

71,8

1/6

Ces résultats montrent que le TAK-N et le TAK-D sont tous deux efficaces dans la régression de la croissance des tumeurs, indépendamment des valeurs de leurs DP.

639 277

8

Exemple 4:

Effets de suppression de tumeurs par le CMTAK et le CMTAK traité à l'autoclave

L'activité antitumorale de trois types de CMTAK préparés à partir de TAK-N (CMTAK N°* 1, 4, 5) et de CMTAK traité à l'autoclave a été essayée comme décrit dans l'exemple 2. Les échantillons furent dissous dans l'eau distillée, en vue de l'injection, et le pH

a été ajusté à environ 7,0. Dans certains essais, l'un de ces échantillons (CMTAK N° 1) a été stérilisé par traitement à l'autoclave (120 C, 25 min) avant toute autre administration.

Comme on le voit au tableau VII, tous les échantillons de CMTAK, aux doses de 10 mg/kg, ont inhibé de façon importante la croissance de la tumeur. L'inhibition de croissance par le CMTAK a été observée à des doses de 1 à 40 mg/kg.

Tableau VII

Dose

Echantillon mg/kg (i.p.)

Poids moyen de la tumeur (g)

Taux d'inhibition de la tumeur (%)

Nombre de régressions complètes/ nombre de souris traitées

CMTAK N° 1 10x9 CMTAK N" 4 10x9 CMTAK N" 5 10x9

2,87 0

0,28 0,01

100 90,2 99,7

0/7 7/7 4/7 6/7

CMTAK N° 1 traité à l'autoclave

1x10 3x10 5x10

3,65 0,77 0,03 0,23

78,9 99,2 93,7

0/6 1/6 5/6 4/6

CMTAK N« 1 traité à l'autoclave

—

2,17

C 5x10

0

10x10

0,07

15x10

0,08

20 x 10

0,21

140x10

OO

o

100 96,8 96,3 90,3 91,7

0/6 6/6 5/6 5/6 3/6 1/6

Ces résultats montrent que le CMTAK peut être stérilisé sans perte de son activité antitumorale et être utilisé sous une forme injectable pour le traitement du cancer.

Exemple 5:

Effets de suppression de tumeurs par les TAK-N, TAK-D et CMTAK suivant des méthodes variées d'administration

_ Les TAK-N (DP 540), TAK-D (F-III, DP 50), TAK-D (F-VII, DP 16) et CMTAK N° 1 ont été administrés à des doses de 5 mg/kg par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intrapéritonéale, pendant

10 d consécutifs, à des souris ICR-JCL qui avaient préalablement subi une transplantation avec 4 x 106 cellules, 24 h avant la première injection. Les taux d'inhibition de la croissance de la tumeur ont été calculés comme dans l'exemple 1.

Comme on le voit au tableau VIII, on a observé dans chaque cas une inhibition importante de la croissance de la tumeur. Par administration intraveineuse, le TAK-N, le CMTAK et même F-VII (DP 16) inhibent presque complètement la croissance de la tumeur, le taux d'inhibition étant supérieur à 85%, avec régression complète de 45 la tumeur sur 4 ou 5 des 5 souris traitées.

40

Tableau VIII

Taux d'inhibition delà tumeur (%)

Nombre de

Echantillon

Dose mg/kg

Méthode d'administration

Poids moyen de la tumeur (g)

régressions complètes/ nombre de souris traitées

—

7,30

—

0/10

CMTAK No 1

'5x10 5x10

i.v. s.c.

0,84 3,77

87,5 48,4

4/5 0/5

5x10

i.p.

0,91

88,5

2/5

—

7,30

—

0/10

TAK-N (DP 540)

5x10 5x10 5x10

i.v. s.c. i.p.

0

2,72 0,17

100 63 98

5/5 3/5 4/5

TAK-D

5x10

i.v.

3,02

59

2/5

F-III

5x10

s.c.

0,91

88

3/5

(DP 50)

5x10

i.p.

2,30

68

3/5

639 277

9

Tableau Vili (suite)

Echantillon

Dose mg/kg

Méthode d'administration

Poids moyen de la tumeur (g)

Taux d'inhibition de la tumeur (%)

Nombre de régressions complètes/ nombre de souris traitées

TAK-D

5x 10

i.v.

1,06

85

4/5

F-VII

5x 10

s.c.

2,67

63

3/5

(DP 16)

5x10

i.p.

2,34

68

2/5

Ces résultats montrent que les TAK-N, CMTAK et TAK-D sont 15 efficaces dans la suppression des tumeurs par toute voie d'administration.

Exemple 6:

Effets de suppression de tumeurs par les TAK-N, TAK-D 20

et CMTAK administrés avant transplantation de la tumeur: prétraitement

Des TAK-N et TAK-D de différents degrés de polymérisation et le CMTAK N° 1 furent administrés par voie intrapéritonéale à des souris ICR-JCL de poids vif d'environ 23 g, à des doses de 3 à 25 80 mg/kg, quotidiennement pendant 5 d consécutifs. Le TAK-N et le TAK-D furent mis en suspension, et le CMTAK dissous, dans l'eau distillée. Dans le cas du CMTAK, le pH final fut ajusté à environ 7,0. Puis, le 1er ou le 3e d après la dernière administration, 6 x 106 cellules de S 180 furent transplantées par voie sous-cutanée dans la région inguinale droite de chaque animal. Le 35e d après transplantation, les nodosités tumorales furent excisées et pesées. Les taux d'inhibition de la tumeur furent calculés comme dans l'exemple 1.

Comme on le voit au tableau IX, on observe pour chaque échantillon une inhibition marquée de la croissance de la tumeur. En particulier, les TAK-N (DP 540), CMTAK et TAK-D de DP supérieur à 50 présentent une forte activité inhibitrice. Le CMTAK fut efficace pour le retardement de tumeurs, à des doses faibles de l'ordre de 3 mg/kg.

Tableau IX

Taux d'inhibition de la tumeur (%)

Nombre de

Echantillon

Dose mg/kg (i.p.)

Jour d'injection

Poids moyen de la tumeur (g)

régressions complètes/ nombre de

souris traitées

—

5,06

0/5

TAK-N (DP 540)

20x5

—5 à — 1

0,37

92,7

4/6

TAK-N (DP 125)

20x5

— 5 à — 1

0,98

80,6

2/6

—

10,10

—

0/6

S-II (DP 82)

20x5

— 5 à —1

0,20

98,0

4/5

S-III

(DP 68)

20x5

— 5 à — 1

0,35

96,5

5/6

F-III (DP 50)

20x5

— 5 à — 1

1,30

87,1

3/5

F-V (DP 39)

20x5

— 5 à — 1

5,52

45,3

0/6

F-VI (DP 24)

20x5

— 5 à —1

4,18

58,6

0/6

F-VII (DP 16)

20x5

—5 à —1

5,84

42,2

0/6

—

6,43

—

0/6

' 3x5

—5 à — 1

1,44

77,6

3/5

CMTAK

5x5

— 5 à — 1

3,55

44,8

1/6

N° 1

10x5

— 5 à -1

0,19

97,1

3/6

s20x 5

— 5 à -1

0,05

99,2

4/6

—

5,03

0/5

CMTAK 1

40x5

— 5 à — 1

0,11

97,8

4/6

No 1 I

80x5

—5 à — 1

0,15

97,0

4/6

639 277

10

Tableau IX (suite)

Taux d'inhibition de la tumeur (%)

Nombre de

Echantillon

Dose mg/kg (i.p.)

Jour d'injection

Poids moyen delà tumeur (g)

régressions complètes/ nombre de souris traitées

—

7,45

—

0/5

TAK-N (DP 540)

20x5

—7 à —3

0,18

97,6

3/5

TAK-D

S-III

20x5

CO

1

-cd r-1

0,75

89,9

4/5

(DP 68)

Ces résultats montrent que les Polysaccharides mentionnés précédemment sont utiles en tant qu'agents prophylactiques dans le traitement du cancer.

Exemple 7:

Activité répressive des tumeurs par les TAK-N et CMTAK vis-à-vis de divers types de tumeurs

Le carcinome d'Ehrlich, l'adénocarcinome CCM, le sarcome à cellules réticulaires NTF et la leucémie SN-36 sont utilisés pour examiner l'activité des TAK-N et CMTAK pour le retardement de divers types de tumeurs.

On a transplanté sur des souris ICR-JCL, d'un poids moyen de

23 g, par voie sous-cutanée, 3,1 x 10® cellules d'Ehrlich,

1,1 x 107 cellules CCM, 4,5 x 10® cellules NTF ou 7,2 x 104 cellules 20 SN-36, et l'on a administré à ces souris, par voie intrapéritonéale, du TAK-N (DP 540) en suspension dans l'eau distillée, ou du CMTAK N° 1 dissous dans l'eau distillée (pH 7,0) et passé à l'autoclave, à des doses de 10 à 50 mg/kg, quotidiennement pendant 10 d, en commençant 24 h après transplantation. Les tumeurs furent excisées et 25 pesées 35 d après transplantation, et les taux d'inhibition des tumeurs dans les groupes traités furent calculés comme dans l'exemple 1.

Comme on le voit au tableau X, on a observé dans chaque cas une inhibition importante de la croissance de la tumeur.

Tableau X

Tumeur

Echantillon

Dose mg/kg (i.p.)

Poids moyen de la tumeur (g)

Taux d'inhibition de la tumeur (%)

Nombre de régressions complètes/ nombre de souris traitées

Carcinome d'Ehrlich

TAK-N (DP 540)

10x10 20x10 40x10

3,54 2,37 0,50 0,93

33,1 85,9 73,7

0/5 0/5 2/6 0/5

CMTAK N« 1

20x10 40x10

1,93 0,80 0,60

58,5 68,9

1/6 3/6 2/6

Adénocar-cinome CCM

TAK-N (DP 540)

20x10

3,42 0,79

76,9

0/6 2/6

CMTAK No 1

20x10

3,42 1,03

69,9

1/6 1/6

Leucémie SN-36

TAK-N (DP 540)

10x10 25x10 50x10

0,91 0,18 0,19 0,23

80,2 79,1 74,7

2/6 4/5 3/5 2/6

Sarcome à cellules réticulaires NTF

TAK-N (DP 540)

10x10 30x10

7,64 0,38 2,21

95.0

71.1

0/6 2/6 0/6

Les résultats montrent que le TAK-N et le CMTAK présentent une activité antitumorale vis-à-vis de divers types de tumeurs, à savoir sarcomes, carcinomes, adénocarcinomes, leucémies, etc.

Exemple 8:

Les quatre préparations de CMTAK (CMTAK Nos 2, 6, 9 et 11) sont dissoutes chacune dans une solution saline physiologique, et

11

639 277

l'on examine leurs effets sur la tumeur S 180, conformément au processus de l'exemple 4. Tous les échantillons, à des doses quotidiennes de 5 mg/kg administrées pendant 10 d en commençant 24 h après transplantation de la tumeur, suppriment de façon remarquable la croissance de la tumeur.

Exemple 9:

TAK-N (remplaçable par le TAK-D ou le CMTAK) 150 mg

Lactose 48 mg

Stéarate de magnésium 2 mg

Total: 200 mg

La quantité précitée forme une capsule.

Le TAK-N (TAK-D ou CMTAK) et le lactose sont mélangés dans les proportions indiquées, pastillés et pulvérisés. On ajoute ensuite le stéarate de magnésium. Le mélange est distribué en capsules.

Exemple 10:

TAK-N (remplaçable par le TAK-D ou le CMTAK) 400 mg Lactose 95 mg

HPC-L (hydroxypropylcellulose) 5 mg

Total: 500 mg

La quantité précitée forme une dose unique.

Les trois ingrédients indiqués sont mélangés dans les proportions mentionnées et, avec addition d'une petite quantité d'eau, le mélange est passé au malaxeur, granulé, séché, de nouveau granulé, tamisé et aggloméré suivant les doses indiquées ci-dessus.

Exemple 11:

a) On dissout 1 g de TAK-D (DP 16) dans 1000 ml d'eau distillée pour l'injection (ou d'une solution saline physiologique) et l'on filtre la solution, le filtrat étant réparti dans des ampoules en portions de 500 ml. Après scellage, les ampoules sont stérilisées à chaud de la façon habituelle.

b) On dissout 2 g de CMTAK (produit de l'exemple 14) dans 100 ml d'eau distillée pour l'injection (ou d'une solution saline physiologique) et l'on filtre la solution. Le filtrat est réparti dans des ampoules en portions de 20 ml et, après scellage, les ampoules sont stérilisées à chaud de la façon habituelle.

Exemple 12:

TAK-N (remplaçable par le TAK-D ou le CMTAK) 160 mg

Sorbitol 200 mg

Carboxyméthylcellulose, sel de sodium 10 mg

Polysorbate 80 3,2 mg

Méthyl-p-hydroxybenzoate 4 mg

Propyl-p-hydroxybenzoate 0,4 mg

Les ingrédients ci-dessus sont mélangés dans l'eau distillée pour l'injection, pour former un volume total de 4 ml. (Lorsque CMTAK est employé, la solution est neutralisée, si nécessaire, avec de l'hydr-oxyde de sodium N10.)

Exemple 13:

Dans 80 ml d'alcool isopropylique, on met en suspension 3 g de TAK-N (DP 540) et l'on agite cette suspension à la température ambiante pendant 30 min. On ajoute ensuite lentement, tout en agitant, pendant environ 60 min, 8 ml d'une solution à 30% d'hydroxyde de sodium. On continue d'agiter vigoureusement le mélange à température ambiante, pendant environ 90 min, en vue d'empêcher la formation d'un gel. On ajoute ensuite 3,6 g d'acide monochloracétique et le mélange est agité à 60-70° C pendant 5 h, afin que la carboxyméthylation s'effectue. Le produit est recueilli par filtration et lavé à fond avec un mélange de méthanol et d'acide acétique (7:3, v/v). On recueille le précipité par filtration, on le lave convenablement avec du méthanol aqueux à 80%, du méthanol et de l'acétone, dans l'ordre mentionné, et on le sèche sous pression réduite. On obtient,

selon cette technique, 2,9 g de CMTAK. Teneur en carboxyméthyle (nombre de groupes carboxyméthyle par résidu de glucose, la même définition s'appliquant également ci-après): 0,54.

Exemple 14:

Dans 40 ml d'alcool isopropylique, on met en suspension 1,5 g de TAK-N (DP 540) et l'on agite à température ambiante pendant 30 min. On ajoute ensuite, sous agitation, 2 ml d'une solution à 30% d'hydroxyde de sodium, en quatre fractions, chacune de 0,5 ml, à intervalles de 15 min. Le mélange est ensuite agité à température ambiante pendant 90 min. On ajoute 0,9 g d'acide monochloracétique, en trois fractions, chacune de 0,3 g, à intervalles de 10 min. La carboxyméthylation est ainsi conduite à 50° C, sous agitation pendant 150 min. Le produit est rassemblé par centrifugation, dissous dans 50 ml d'eau et neutralisé à l'acide acétique. A cette solution neutre on ajoute 120 ml de méthanol, et le précipité formé est rassemblé par centrifugation. Le précipité est lavé par un mélange de 300 ml de méthanol aqueux à 80% et 100 ml d'éthanol, puis par un mélange de 300 ml de méthanol aqueux à 80% et 200 ml d'éther. Le produit est finalement lyophilisé, de manière à obtenir 1,7 g de CMTAK.

Teneur en carboxyméthyle: 0,75.

Exemple 15:

Dans 40 ml d'alcool isopropylique, on met en suspension 1,5 g de TAK-N (DP 540) et l'on agite la suspension à température ambiante pendant 30 min. On ajoute ensuite 4 ml d'une solution à 30% d'hydroxyde de sodium, en quatre fractions de 1 ml chacune, à intervalles de 15 min, puis on continue l'agitation à température ambiante pendant 90 min.

On ajoute ensuite 1,8 g d'acide monochloracétique, en trois fractions, chacune de 0,6 g, à intervalles de 10 min. On agite le mélange à 50° C pendant 150 min, ce qui permet d'effectuer la carboxyméthylation. Le produit est rassemblé par centrifugation, dissous dans 40 ml d'eau et neutralisé par l'acide acétique. A cette solution neutre on ajoute 90 ml de méthanol et l'on rassemble le précipité formé par centrifugation. Le précipité est bien lavé avec un mélange de 200 ml de méthanol aqueux à 80% et 100 ml d'éthanol, puis avec un mélange de 200 ml d'éthanol aqueux à 80% et 200 ml d'éther. On lyophilise ensuite pour obtenir 2,0 g de CMTAK. Teneur en carboxyméthyle: 1,07.

Exemple 16:

Dans 33 ml d'eau, on met en suspension 3,2 g de TAK-N (DP 255) et l'on ajoute sous agitation, à température ambiante, 1 g d'hydroxyde de sodium, puis 2,4 g de monochloracétate de sodium. La réaction de carboxyméthylation est ainsi conduite à température ambiante, sous agitation constante, pendant 2 h. On ajoute ensuite 1 g d'hydroxyde de sodium et 2,4 g de monochloracétate de sodium, de nouveau, et l'on continue la réaction à température ambiante,

sous agitation, pendant 3 h. On ajoute encore 1 g d'hydroxyde de sodium et 2,4 g de monochloracétate de sodium. On poursuit la réaction à température ambiante, sous agitation, pendant 2 h supplémentaires. On ajoute, au mélange réactionnel, 1 1 d'éthanol, et le précipité formé est lavé convenablement à l'éthanol sur filtre en verre fritté, jusqu'à ce que le filtrat cesse de donner une coloration rouge à la phénolphtaléine. On sèche ensuite à 50° C sous pression réduite. La poudre formée (3,7 g) est dissoute dans 90 ml d'eau et neutralisée à l'acide acétique, puis on ajoute 210 ml d'éthanol. Le précipité formé est rassemblé par centrifugation, lavé à l'éthanol aqueux à 80% et lyophylisé. On obtient par cette méthode 2,6 g de CMTAK. Teneur en carboxyméthyle: 0,30.

Exemple 17:

Dans 66 ml d'eau, on met en suspension 6,4 g de TAK-N (DP 255) et l'on ajoute, sous refroidissement à la glace et agitation, 4 g d'hydroxyde de sodium, puis 9,6 g de monochloracétate de sodium. La carboxyméthylation est conduite sous refroidissement à la glace et agitation pendant 2 h. On ajoute de nouveau 4 g d'hydr-

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oxyde de sodium et 9,6 g de monochloracétate de sodium, et l'on agite le mélange pendant 3 h en refroidissant avec de la glace. On ajoute ensuite 4 g d'hydroxyde de sodium et 9,6 g de monochloracétate de sodium, une nouvelle fois, et l'on poursuit la réaction,

avec refroidissement à la glace et agitation, pendant 3 h. On ajoute au mélange réactionnel 1 1 d'éthanol et le précipité formé est bien lavé à l'éthanol sur filtre en verre fritté, jusqu'à ce que le filtrat cesse de donner une couleur rouge à la phénolphtaléine, puis on sèche à 50 C sous pression réduite. La poudre formée (8,6 g) est dissoute dans 172 ml d'eau et neutralisée à l'acide acétique. Puis, après addition de 480 ml d'éthanol, le précipité est rassemblé par centrifugation, lavé à l'éthanol aqueux à 80% et lyophilisé. On obtient, suivant cette méthode, 5,6 g de CMTAK. Teneur en carboxyméthyle: 0,36.

Exemple 18:

Dans 40 ml d'alcool isopropylique, on met en suspension 1,5 g de TAK-D (F-I, DP 299) et l'on effectue la carboxyméthylation comme dans l'exemple 14. Le produit est lavé comme dans l'exemple 14, pour obtenir 1,9 g de CMTAK. Teneur en carboxyméthyle: 0,59.

On met en suspension dans 40 ml d'alcool isopropylique le même TAK-D que ci-dessus, et l'on effectue la carboxyméthylation suivant la méthode décrite dans l'exemple 15. Le produit réactionnel est lavé comme dans l'exemple 15, ce qui permet d'obtenir 2,2 g de CMTAK. Teneur en carboxyméthyle: 1,15.

Exemple 19:

Dans 40 ml d'alcool isopropylique, on met en suspension 1,5 g, respectivement, de TAK-D (F-II, DP 113) et de TAK-D (S-III, DP 68), puis l'on effectue la carboxyméthylation comme dans l'exemple 14. Les produits réactionnels respectifs sont rassemblés par centrifugation, dissous dans 40 ml d'eau et neutralisés à l'acide acétique. On ajoute à chacune de ces deux solutions neutres 90 ml de méthanol, et le précipité résultant est rassemblé par centrifugation et bien lavé, tout d'abord avec 200 ml de méthanol aqueux à 80%, puis 5 on effectue la lyophilisation. On obtient par cette méthode deux types de CMTAK.

Rendement

Teneur en

(g)

carboxyméthyle

CMTAK (obtenu à partir de

F-II)

1,4

0,51

CMTAK (obtenu à partir de

S-III)

1,4

0,36

Exemple 20:

Dans 40 ml d'alcool isopropylique, on met en suspension 1,5 g, respectivement, de TAK-D (F-II, DP 113) et de TAK-D (S-III, 20 DP 68), puis l'on effectue la carboxyméthylation comme dans l'exemple 15. Les produits réactionnels sont lavés chacun comme dans l'exemple 19, ce qui permet d'obtenir deux types de CMTAK.

Rendement

Teneur en

(g)

carboxyméthyle

CMTAK (obtenu à partir de

F-II)

2,3

1,22

CMTAK (obtenu à partir de

S-III)

1,4

0,45

R

1 feuille dessins

Claims

639 111

REVENDICATIONS

1. Agent antitumoral contenant une quantité efficace d'un 1,3-glucane ayant la formule suivante:

ch2or h,or dans laquelle R est hydrogène ou au moins l'un des R est — CH2COOH, le reste étant H, n est un nombre entier et le degré moyen de polymérisation se situe entre 2 et 1000.
2. Agent antitumoral selon la revendication 1, caractérisé en ce que le degré moyen de polymérisation se situe entre 15 et 800.
3. Agent antitumoral selon la revendication 1, caractérisé en ce que le degré moyen de polymérisation se situe entre 40 et 600.
4. Agent antitumoral selon la revendication 1, caractérisé en ce que le degré de substitution des groupes carboxyméthylés se situe

20 entre 0,30 et 1,22 lorsque le composé comporte au moins un — CH2COOH défini dans le groupe R.
5. Agent antitumoral selon la revendication 1, caractérisé en ce que le degré de substitution des groupes carboxyméthylés se situe entre 0,45 et 0,75 lorsque le composé comporte au moins un

25 — CH2COOH défini dans le groupe R.