Verfahren zur Herstellung von D-Ribose Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Ribose.
Die bisher zur Herstellung von D-Ribose zur An wendung gelangten Verfahren (beispielsweise durch Hy drolyse von Hefe-Nuklein-Säure) hängen von der Zer setzung von Stoffen ab, die mit der Ribonukleinsäure verwandt sind; infolgedessen sind diese bekannten Ver fahren ziemlich kostspielig.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass bei Gärungen, die mit einer Vielzahl von Mikro organismen in Medien durchgeführt werden, die eine verhältnismässig hohe Konzentration an Metallsalzen, insbesondere Kalium- und Magnesiumsalzen, enthalten, eine bemerkenswert grosse Menge von D-Ribose in dem Gärungsmedium angesammelt wird, wenn diesem ge trennt oder in Kombination ein Zusatz von bestimmten Metallsalzen in verhältnismässig hoher Konzentration bei gefügt wird.
Es hat sich dabei herausgestellt, dass die oben be schriebene Beobachtung vom Stamm der Mikroorganis men unabhängig ist, also auch für Stämme von Mikro organismen gültig ist, die beispielsweise zu den Gattun gen Micrococcus, Brevibacterium, Aerobacterium, Co rynebacterium, Bacillus usw., gehören. Die Erfindung kann auch bei Nährstoffe benötigenden Mutanten ange wendet werden, die man durch verschiedene mutations- fördernde Behandlungen erhält.
Das Kulturmedium kann genügende Mengen von Sacchariden und anderen Kohlenstoffquellen (beispiels weise Glukose, Stärke, Hydrolyse-Stärke und Melasse), Stickstoffquellen (beispielsweise Harnstoff, Ammonium chlorid und Ammoniumnitrat), anorganische Verbindun gen (beispielsweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Eisensulfat, Eisenchlorid, Zink chlorid und Kalziumchlorid) sowie stickstoffhaltige na türliche Stoffe (beispielsweise Flüssigkeit der Maismai sche, Hefeextrakt,- Fleischextrakt,
Pepton, Hydrolyse- Protein und Fischmehl) enthalten. Im Falle von Nähr stoffe benötigenden Mutationsstämmen müssen natür lich die erforderlichen Nährstoffe dem Medium zugesetzt werden, um das Wachstum dieser Mutanten zu gewähr leisten.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von D-Ribose kennzeichnet sich dadurch, dass man in einem ein Saccharid enthaltenden wässrigen Näheboden mit 0,01 bis 0,2 Gew.- /o Magnesiumionen, 0,1 bis 1,5 Gew.-7o Kaliumionen und 0,0001 bis 1 g Mangan-, Eisen- und/ oder Zinkionen in<B>100</B> Milliliter Lösung einen D-Ribose bildenden Mikroorganismus aerobisch züchtet und die erzeugte D-Ribose abtrennt.
Die Gärung wird aerobisch, z.B. mit einer Rühr- oder Belüftungs - Gärungs - Anlage, beispielsweise bei einer Züchtungstemperatur von 20 bis 40 C durchgeführt. Nach einer Züchtungsdauer von 2 bis 8 Tagen hat sich eine bemerkenswert grosse Menge von D-Ribose in dem Kulturmedium und in den Zellen gebildet.
Nach Beendigung der Gärung kann die D-Ribose durch Behandlung mit einem Ionenaustauscher-Harz, Ad sorption, Fällung und Extraktion gewonnen werden, wie in den nachstehend aufgeführten Beispielen beschrieben wird, die nur zur Erläuterung dienen und die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.
In den folgenden Beispielen sind, wenn nicht aus drücklich etwas anderes vermerkt ist, die Prozentsätze auf das Gewicht bezogen.
<I>Beispiel 1</I> Brevibaeterium ammoniagenes ATCC No. 6872 wird verwendet. Es wird unter Rühren in dem Impfkultur medium gezüchtet, das 2% Glukose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,25% NaCI enthält und dann in 30 Mil- liliter-Portionen in einen 250 Milliliter-Erlenmeyerkolben gegeben, in welchem es 24 Stunden lang bei 30 C bleibt.
Ein unten angeführtes Gärungsmedium, das in 20 Milli- liter-Portionen in den 250 Milliliter-Erlenmeyerkolben eingeführt wird, wird mit ungefähr 10 Vol.-% der oben angeführten Impfkultur geimpft. Das Gärungsmedium wird ebenfalls bei 30 C unter Rühren gezüchtet.
<I>Zusammensetzung des Gärungsmediums:</I> 100 Gramm Glukose, 6 Gramm Harnstoff, 10 Gramm KH.-P04, 10 Gramm K,HP04, 10 Gramm MgSO, -7H1!0, 30 y Biotin, 0,1 Gramm CaCl2 - 2H20 und 2 Gramm MnSO, - 4H20 werden mit Wasser zu einem Liter er gänzt, wonach der pH-Wert vor der Sterilisation auf 8,0 eingestellt wird.
Auf diese Art und Weise werden in dem 120 Stunden gezüchteten Gärungsmedium 11 Milligramm D-Ribose pro Milliliter erzeugt. Eine ähnliche Ansammlung von D-Ribose wird ebenfalls in den Zellen festgestellt. Die Glukose wird beinahe vollständig verbraucht.
Die Zellen werden aus diesem Gärungsmedium ent fernt und ein Liter des Filtrates wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und dann durch eine Harz-Dia-Ionen-Kolonne SK No. 1 (H-Typ) geschickt.
Danach wird destilliertes Wasser durch die Kolonne geschickt und Ribose-Anreicherungen in den Ausflüssen werden gesammelt und wieder durch eine Dia-Ionen- Kolonne SA No. 21A (OH-Typ) geschickt, wobei der pH-Wert unverändert beibehalten wird. Die Ribose-An- reicherungen der Ausflüsse werden zusammen gesam melt, auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und dann unter verringertem Druck bei 50 C konzentriert.
Die konzentrierte Lösung entfärbt man mit Aktivkohlepulver und lässt sie dann nach Zusatz von Alkohol in einem Kühlraum stehen. Man erhält Ribose in kristallinischer Form (Ausbeute 8,6 Gramm).
<I>Beispiel 2</I> Brevibacterium ammoniagenes ATCC No. <I>6872</I> wird für die Gärung verwendet. Für das Impfpräparat werden 30 Milliliter eines wässrigen Kulturmediums, das 2% Glukose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0.25% Na triumchlorid enthält, in einen Erlenmeyerkolben einge führt und sterilisiert, wonach man den oben angeführten Stamm unter Rühren in diesem Medium bei 30 C wäh rend 24 Stunden wachsen lässt.
Das Gärungsmedium, das die folgende Zusammensetzung hat, wird in 250 Milli- liter-Erlenmeyerkolben in einzelnen, 20 Milliliter-Portio- nen hergestellt und sterilisiert, anschliessend mit der oben beschriebenen Impfkultur geimpft und nach der Impfung während des weiteren Wachstums bei 30 C gerührt.
EMI0002.0048
Glukose <SEP> 10 <SEP> % <SEP> MgSO, <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb> Harnstoff <SEP> 1,0% <SEP> Biotin <SEP> 30/Liter
<tb> KH,P04 <SEP> 1,0% <SEP> CaCl2 <SEP> - <SEP> 211_O <SEP> <B>0,010/,</B>
<tb> K,HP04 <SEP> 1,0% Nach der Sterilisation wird der pn-Wert auf 8,0 ein gestellt.
Danach werden verschiedene Arten von Metallsalzen getrennt zugesetzt und Mangansalze und andere metal lische Salze werden ebenfalls in Mischungen dem wie oben beschrieben hergestellten Kulturmedium zugesetzt. Die Mengen von D-Ribose, die sich nach 96 Stunden Züchtung angesammelt haben, sind in Tabelle 1 ange geben:
EMI0002.0053
Tabelle <SEP> 1
<tb> Art <SEP> des <SEP> metal- <SEP> Konzentration <SEP> Erzeugte <SEP> D lischen <SEP> Ions <SEP> des <SEP> Zuschlages <SEP> Ribose-menge
<tb> O <SEP> 0 <SEP> 0,08 <SEP> mg/ml
<tb> Fe-- <SEP> 0,05% <SEP> 4,2 <SEP> > >
<tb> Mn-- <SEP> 0,05% <SEP> 7,9 <SEP> <SEP>
<tb> Co- <SEP> 0,05% <SEP> 0,0 <SEP> <SEP>
<tb> Ni-"-" <SEP> 0,05% <SEP> 0,0 <SEP> <SEP>
<tb> Zn++ <SEP> 0,05% <SEP> 3,0 <SEP> <SEP>
<tb> Mn- <SEP> -f- <SEP> Fe- <SEP> 0,05% <SEP> -I-- <SEP> 0,05% <SEP> 8,3 <SEP> <SEP>
<tb> Mn++ <SEP> -f- <SEP> Zn++ <SEP> 0,05% <SEP> -I- <SEP> 0,05% <SEP> 7,7 <SEP> > >
<tb> Mn- <SEP> -I- <SEP> Co- <SEP> 0,05% <SEP> -I- <SEP> 0,05% <SEP> 0,0 <SEP> <SEP>
<tb> <I>MW-'</I> <SEP> -I-- <SEP> Ni- <SEP> 0,05 .o <SEP> -f- <SEP> 0,05% <SEP> 0,
0 <SEP> <SEP> <I>Beispiel 3</I> Bei Verwendung des gleichen Stammes und der glei chen Züchtungsbedingungen wie im Beispiel 2 wird die Menge des dem Medium zugesetzten MnS04 - 4H20 ver ändert. Nach 96 Stunden haben sich folgende D-Ribose- Mengen angesammelt:
EMI0002.0058
Tabelle <SEP> 2
<tb> Menge <SEP> von
<tb> zugesetztem <SEP> Mn-H- <SEP> Erzeugte <SEP> D-Ribose-Menge
<tb> 0 <SEP> % <SEP> 0,1 <SEP> Milligramm/Milliliter
<tb> <B>0,0001%</B> <SEP> 2,0 <SEP> <SEP>
<tb> <B>0,0008%</B> <SEP> 3,8 <SEP> <SEP>
<tb> 0,008 <SEP> % <SEP> 7,4 <SEP> <SEP>
<tb> 0,004 <SEP> % <SEP> 10,7 <SEP> <SEP>
<tb> 0,08 <SEP> % <SEP> 6,5 <SEP> > >
<tb> 0,4 <SEP> % <SEP> 5,1 <SEP> <SEP>
<tb> <U>0,8 <SEP> %</U> <SEP> 1,2 <SEP> <SEP> <I>Beispiel 4</I> Der verwendete Stamm ist Micrococcus glutamicus KY <I>3803</I> (ATCC No. 15455).
Das Gärungsverfahren und die Zusammensetzung des Impfkulturmediums sind die gleichen wie in Beispiel 1.
Die Zusammensetzung des Gärungsmediums wird un ten angegeben.
Zusammensetzung <I>des</I> Gärungsmediums: 100 Gramm Glukose, 3 Gramm Harnstoff, 2 Gramm KH2P04, 1 Gramm Kf!HP04, 1 Gramm MgS04 - 7H20, 10 Gramm Biotin, 0,1 Gramm CaCl, - 2H20 und 2 Gramm MnS0, - 4H20 werden mit Wasser zu einem Liter ergänzt und der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 8,0 eingestellt.
Nach 120 Stunden Züchtung haben sich 8,2 Milli gramm D-Ribose in jedem Milliliter des Gärungsmediums angesammelt.
Das Gärungsmedium wird auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt, während 10 Minuten auf 70 C erhitzt und zentrifugiert um die Zellen abzuscheiden. Aus der sich ergebenden Flüssigkeit wird ein Liter der oben schwimmenden Flüssigkeitsschicht abgetrennt und mit wässrigem NaOH auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt und mit 50 Gramm zugesetzter gepresster Brothefe wäh rend 10 Minuten bei 37 C zur Reaktion gebracht, um die Restglukose zu verbrauchen. Die Flüssigkeit wird zentrifugiert und die obenschwimmende Flüssigkeits schicht wird gemäss dem gleichen Verfahren wie in Bei- spiel 1 beschrieben, behandelt.
Man erhält 5,7 Gramm kristalliner Ribose.
<I>Beispiel 8</I> Baciltus cereus (ATCC No. 9139) wird in einem im Beispiel 2 beschriebenen Medium gezüchtet und auf ein Medium mit der folgenden Zusammensetzung übertra gen und darin während 102 Stunden unter Zusatz von Mn- und Zn- (0,05% bzw. 0,02%) gezüchtet. Die Men ge von angesammelter D-Ribose beträgt 7,1 Milligramm pro Milliliter des Gärungsmediums.
EMI0003.0011
Glukose <SEP> 10 <SEP> a/o <SEP> NH,CI <SEP> <I>0,7 /o</I>
<tb> <B>K2HPO4</B> <SEP> 0,6% <SEP> <B>KH2PO1</B> <SEP> 0,6%
<tb> MgS04 <SEP> - <SEP> <B>7H20</B> <SEP> 0,6% <SEP> Hefeextrakt <SEP> <B>1,0%</B> Die gemäss dem obigen erhaltene D-Ribose ergibt nach der gleichen Behandlung wie im Beispiel 1 5,7 Gramm kristalliner Ribose.
<I>Beispiel 6</I> Brevibacterium ammoniagenes (ATCC No. 6872) wird in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 2 gezüch tet. Das Impfkulturmedium wird in Portionen von 150 Millilitern in 2-Liter-Erlenmeyerkolben gegeben, 18 Stun den lang unter Rühren gezüchtet und dann in 5-Liter- Gärungskolben (in Portionen von 3 Litern) eingeführt, worin es mit einem Belüftungsvolumen von 3 Liter/Mil- liliter und unter Rühren mit 400 U/min. weiter gezüchtet wird.
Die Zusammensetzung des wässrigen Gärungsmit tels ist folgende: 10% Glukose; 1,07, KH@P04; 1,0% K@HP04; 1,0% MgS04 - 7H20; 100 y/Liter Biotin; 0,010/, CaCl2 . 2H20; 0,2a/o Harnstoff und O,loo MnSO, -4H,0.
Das pH des Gärungsmediums wird mit Harnstoff auf einen geeigneten Wert eingestellt. Nach 66 Stunden Züch tung haben sich 12,7 Milligramm D-Ribose in jedem Milliliter des Gärungsmediums angesammelt. Die D-Ri- bose wird in der gleichen Art und Weise wie im Beispiel 2 behandelt. Man erhält 30 Gramm D-Ribose-Kristalle.