<B>Verfahren</B> zur fermentativen <B>Herstellung von</B> Siderochromen Bei der Hydrolyse der Ferrimycine A, A, und A2 sowie der Ferrioxamine A, B, C, D, E und X wird 1-Amino-5-hydroxylamino-pentan erhalten. Es wurde gefunden, dass diese Verbindung als Präkursor bei der fermentativen Herstellung von Siderochromen mit komplex gebundenem Eisen dient.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Siderochromen mit komplex gebundenem Eisen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass 1-Amino-c)-hydro- xylamino-alkane der allgemeinen Formel H2N- (CH2)n -NHOH in der n eine ganze Zahl von 4-10, vorzugsweise 5, bedeutet, oder deren Salze als Präkursoren verwendet werden.
Durch die Zugabe der neuen Verbindungen zu den Fermentationsbrühen wird die Ausbeute an den entsprechenden Substanzen verbessert. Die Sidero- chrome sind Pilzstoffwechselprodukte, die kom plex gebundenes Eisen enthalten. Man unterscheidet die Sideramine und die Sideramycine. Als Sideramine wird eine Gruppe von Wuchsstoffen für Mikroorga nismen bezeichnet, die komplex gebundenes Eisen enthalten. In diese Gruppe gehören z.
B. die Ferriox- amine A, B, C, D, E und X, die Ferrichrome, der Terregens-Faktor und das Coprogen. Die Sidero- mycine sind Antibiotika, die ebenfalls komplex ge bundenes Eisen enthalten. Ihre antibiotische Aktivi tät beruht auf ihrer antagonistischen Wirkung gegen über den Sideraminen. Zu dieser Antibiotika-Gruppe gehören z.
B. die Ferrimycine, die Griseine, die Al- bomycine, das Antibiotikum A 22 765, das Antibio tikum A 1787 (Thrum) sowie die Antibiotika L.A. 5352 und L.A. 5937.
Die Ausgangsstoffe sind bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden gewonnen werden. Die Temperaturen sind im folgenden Beispiel in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel <I>1</I> a) 20 500-ml-Schüttelkolben mit 4 Schikanen (baffles) mit je 100 ml Nährlösung werden sterilisiert und unter sterilen Bedingungen mit bis zu 10 % einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur von Streptomyces griseoflavus 9578
(NRRL 2717) be- impft. Der Rotationsradius der Schüttelmaschine be trägt 2,5 cm, die Frequenz 160/Min. Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung (g/Liter):
EMI0001.0071
Rapsschrot <SEP> 20
<tb> Distiller <SEP> solublesN <SEP> 20
<tb> Glucose <SEP> 10
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2
<tb> KIHPO4 <SEP> 2. <SEP> 10-1
<tb> (NH4)2H'04 <SEP> <B>2. <SEP> 10-1</B>
<tb> KNO3 <SEP> 1. <SEP> 10-1
<tb> M9S04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 5. <SEP> 10-2
<tb> Ferricitrat <SEP> 2. <SEP> 10-2
<tb> ZnS04 <SEP> 7<B>11</B>20 <SEP> 1. <SEP> 10-2
<tb> MnC12 <SEP> 1. <SEP> 10-3
<tb> COC12 <SEP> 1. <SEP> 10-3
<tb> CUS04 <SEP> 5H20 <SEP> 5. <SEP> 10-4
<tb> H,BOss <SEP> 2. <SEP> 10-5 Das Ausgangs-pH beträgt 6,5.
Die Temperatur wird auf 27 gehalten. Nach 18 Stunden werden in 9 Kolben je 0,1 %o 5-Hydroxylamino-pentylamin-(1)- dihydrochlorid zugegeben. Nach 96 Stunden Bebrü- tung hat die Kulturlösung den grössten Hemmwert gegenüber dem Testorganismus (Staphylococcus aureus) erreicht.
Man unterbricht die Kulturen, trennt das Mycel ab und bestimmt die Aktivität der Kultur lösung, bezogen auf ein Standard-Ferrimycin-Präpa- rat. b) Der Versuch wird in gleicher Weise, wie unter a) beschrieben, durchgeführt, mit der Abänderung, dass in 10 Kolben ausser der Zugabe von 0,1 %0 5- Hydroxylamino-pentylamin-(1)-dihydrochlorid noch 0,1 %o Bernsteinsäure zugefügt werden.
Die Ergeb nisse der Versuche a) und b) sind in Tabelle I dar gestellt:
EMI0002.0007
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Anzahl <SEP> Mittlere <SEP> Ausbeute
<tb> Kolben <SEP> in <SEP> mg/Liter
<tb> (Standard <U>präparat)</U>
<tb> 1) <SEP> Kontrolle <SEP> 11 <SEP> 67
<tb> 2) <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 0,1 <SEP> %ao <SEP> 5-Hydro xylamino-pentylamin-(1) dihydrochlorid <SEP> 9 <SEP> 86
<tb> 3) <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 0,1 <SEP> %o <SEP> 5-Hydro xylamino-pentylamin-(1) dihydrochlorid <SEP> + <SEP> <B>0,10/00</B>
<tb> Bernsteinsäure <SEP> 10 <SEP> 95 Die als Präkursor verwendete Verbindung kann wie folgt hergestellt werden:
a) 1 Mol Phthalimidkalium wird in 6 gleichen Teilen innerhalb 4 Stunden unter Rühren zu einer siedenden Lösung von 2 Mol 1,5-Dibrompentan in der 3fachen Menge Aceton gegeben. Diese Mischung wird weitere 24 Stunden unter Rückfluss erhitzt.
Nach Abkühlen und Abfiltrieren des Kaliumbromids wird das Aceton abdestilliert und anschliessend der Rück stand im Vakuum destilliert. Die Fraktion vom Kp12 97-99 enthält unverbrauchtes 1,5-Diebrompentan. Im Hochvakuum werden Reste dieses Stoffes aus dem Reaktionsgemisch entfernt, und man erhält einen öligen Rückstand von N-(5-Brompentyl)-phthalimid,
das aus heissem Benzol oder in der Kälte aus Benzol- Petroläther in farblosen Nadeln kristallisiert; 0,75 Mol (= 75 % d. Th.). Nach zweimaligem Umkristal- lisieren zeigt es F. 58-59 .
b) Zu einer 60 warmen Lösung von 1 Mol N (5- Brompentyl)-phthaUmid in der doppelten Menge 1- Nitropropan wird unter Rühren während 11/2 Stunden 1,1 Mol Silbernitrit in kleinen Portionen zugegeben. Dann wird 1 Stunde auf 80 , 1 Stunde auf 100 und schliesslich 1 Stunde auf 125 erhitzt.
Nach Abküh- len und Abfiltrieren des grau gefärbten Silberbromids wird das Filtrat im Vakuum vom 1-Nitropropan be freit. Der schwach gelbe, ölige Rückstand (1,0 Mol) ist das N-(5-Nitropentyl)-phthalimid.
c) 1 Mol N-(5-Nitropentyl)-phthalimid wird in der 5fachen Menge absolutem Alkohol gelöst, mit 1 Mol Hydrazinhydrat versetzt und 4 Stunden bei 25 stehen gelassen. Nach beendeter Reaktion wird mit 1,1 Mol konzentrierter Salzsäure versetzt und noch 1/2 Stunde bei 25 stehen gelassen.
Das ausge- fallene Phthalhydrazid wird abfiltriert, mit 95 % Al- kohol gewaschen und das Filtrat auf ein Viertel des ursprünglichen Volumens eingeengt. Verdünnen mit Wasser ergibt weiteres Phthalhydrazid. Nach Abfil- trieren wird das Filtrat erneut eingeengt,
nochmals filtriert und schliesslich im Vakuum zur Trockne ein gedampft. Kristallisation aus Alkohol-Äther liefert 5 Nitropentylamin-(1)-hydrochlorid in farblosen Nadeln (Ausbeute 70 %), F. 113-l15 .
d) 1 Mol 5-Nitropentylamin-l-hydrochlorid wird in der 8fachen Menge Wasser gelöst und unter Kon- stanthalten der Temperatur bei 15 und Rühren wäh rend 15 Minuten mit kleinen Portionen von insgesamt 2 Mol Zink versetzt.
Bei der gleichen Temperatur wird noch 45 Minuten weiter gerührt und dann vom Zinkoxyd abfiltriert. Das mit 1,1 Mol Salzsäure ange säuerte Filtrat gibt beim Eindampfen im Vakuum ein schwach gelbes Öl.
Kristallisation aus Methanol- Äther liefert 5-Hydroxylamino-pentylamin-(1)-di- hydrochlorid in 65 % Ausbeute. Die zu Drüsen ver- einigten Nadeln schmelzen nach mehrmaligem Um kristallisieren bei 134-137 .
<B> Process </B> for the fermentative <B> production of </B> siderochromes During the hydrolysis of ferrimycins A, A, and A2 as well as ferrioxamines A, B, C, D, E and X, 1-amino 5-hydroxylamino-pentane obtained. It has been found that this compound serves as a precursor in the fermentative production of siderochromes with complex-bound iron.
The present invention now relates to a process for the fermentative production of siderochromes with complex-bound iron, which is characterized in that 1-amino-c) -hydro- xylamino-alkanes of the general formula H2N- (CH2) n -NHOH in the n is an integer from 4-10, preferably 5, or the salts thereof are used as precursors.
The addition of the new compounds to the fermentation broths improves the yield of the corresponding substances. The siderochromes are fungal metabolites that contain complex iron. A distinction is made between the sideramines and the sideramycins. Sideramines are a group of growth substances for microorganisms that contain complex iron. This group includes:
B. the ferrioxamines A, B, C, D, E and X, the ferrichromes, the terregens factor and the coprogen. The sideromycins are antibiotics that also contain complex-bound iron. Their antibiotic activity is based on their antagonistic effect on the sideramines. This antibiotic group includes, for.
B. the ferrimycins, the griseins, the albomycins, the antibiotic A 22 765, the antibiotic A 1787 (Thrum) and the antibiotics L.A. 5352 and L.A. 5937.
The starting materials are known or can be obtained by methods known per se. In the following example, the temperatures are given in degrees Celsius.
Example <I> 1 </I> a) 20 500 ml shake flasks with 4 baffles each with 100 ml nutrient solution are sterilized and under sterile conditions with up to 10% of a partially sporulating vegetative culture of Streptomyces griseoflavus 9578
(NRRL 2717) vaccinated. The rotation radius of the shaker be 2.5 cm, the frequency 160 / min. The nutrient solution has the following composition (g / liter):
EMI0001.0071
Rapeseed meal <SEP> 20
<tb> Distiller <SEP> solublesN <SEP> 20
<tb> Glucose <SEP> 10
<tb> calcium carbonate <SEP> 2
<tb> KIHPO4 <SEP> 2. <SEP> 10-1
<tb> (NH4) 2H'04 <SEP> <B> 2. <SEP> 10-1 </B>
<tb> KNO3 <SEP> 1. <SEP> 10-1
<tb> M9S04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 5. <SEP> 10-2
<tb> Ferricitrate <SEP> 2. <SEP> 10-2
<tb> ZnS04 <SEP> 7 <B> 11 </B> 20 <SEP> 1. <SEP> 10-2
<tb> MnC12 <SEP> 1. <SEP> 10-3
<tb> COC12 <SEP> 1. <SEP> 10-3
<tb> CUS04 <SEP> 5H20 <SEP> 5. <SEP> 10-4
<tb> H, BOss <SEP> 2. <SEP> 10-5 The starting pH is 6.5.
The temperature is kept at 27. After 18 hours, 0.1% o 5-hydroxylaminopentylamine (1) dihydrochloride is added in each of 9 flasks. After 96 hours of incubation, the culture solution has reached the greatest inhibitory value against the test organism (Staphylococcus aureus).
The cultures are interrupted, the mycelium is separated off and the activity of the culture solution is determined based on a standard ferrimycin preparation. b) The experiment is carried out in the same way as described under a), with the modification that in addition to the addition of 0.1% 0 5-hydroxylaminopentylamine (1) dihydrochloride, 0.1% o succinic acid is added.
The results of tests a) and b) are shown in Table I:
EMI0002.0007
<I> Table <SEP> 1 </I>
<tb> Number of <SEP> Average <SEP> yield
<tb> Flask <SEP> in <SEP> mg / liter
<tb> (standard <U> preparation) </U>
<tb> 1) <SEP> control <SEP> 11 <SEP> 67
<tb> 2) <SEP> Addition <SEP> of <SEP> 0.1 <SEP>% ao <SEP> 5-hydroxylamino-pentylamine- (1) dihydrochloride <SEP> 9 <SEP> 86
<tb> 3) <SEP> Addition <SEP> of <SEP> 0.1 <SEP>% o <SEP> 5-hydroxylamino-pentylamine- (1) dihydrochloride <SEP> + <SEP> <B> 0, 10/00 </B>
<tb> Succinic acid <SEP> 10 <SEP> 95 The compound used as a precursor can be made as follows:
a) 1 mole of phthalimide potassium is added in 6 equal parts within 4 hours with stirring to a boiling solution of 2 moles of 1,5-dibromopentane in 3 times the amount of acetone. This mixture is refluxed for a further 24 hours.
After cooling and filtering off the potassium bromide, the acetone is distilled off and then the residue is distilled in vacuo. The fraction from Kp12 97-99 contains unused 1,5-diebrompentane. Residues of this substance are removed from the reaction mixture in a high vacuum, and an oily residue of N- (5-bromopentyl) phthalimide is obtained,
which crystallizes in colorless needles from hot benzene or in the cold from benzene petroleum ether; 0.75 mol (= 75% of theory). After two recrystallization it shows F. 58-59.
b) To a 60 warm solution of 1 mol N (5-bromopentyl) -phthaUmid in double the amount of 1-nitropropane is added 1.1 mol of silver nitrite in small portions over 11/2 hours with stirring. The mixture is then heated to 80 for 1 hour, to 100 for 1 hour and finally to 125 for 1 hour.
After cooling and filtering off the gray-colored silver bromide, the filtrate is freed from 1-nitropropane in vacuo. The pale yellow, oily residue (1.0 mol) is N- (5-nitropentyl) phthalimide.
c) 1 mol of N- (5-nitropentyl) phthalimide is dissolved in 5 times the amount of absolute alcohol, 1 mol of hydrazine hydrate is added and the mixture is left to stand at 25 for 4 hours. When the reaction has ended, 1.1 mol of concentrated hydrochloric acid is added and the mixture is left to stand at 25 for a further 1/2 hour.
The precipitated phthalhydrazide is filtered off, washed with 95% alcohol and the filtrate is concentrated to a quarter of the original volume. Dilution with water yields more phthalhydrazide. After filtering off, the filtrate is concentrated again,
filtered again and finally evaporated to dryness in vacuo. Crystallization from alcohol-ether gives 5-nitropentylamine- (1) -hydrochloride in colorless needles (yield 70%), mp 113-115.
d) 1 mol of 5-nitropentylamine-1-hydrochloride is dissolved in 8 times the amount of water and, while maintaining the temperature at 15 and stirring for 15 minutes, small portions totaling 2 mol of zinc are added.
Stirring is continued for 45 minutes at the same temperature and the zinc oxide is then filtered off. The filtrate, acidified with 1.1 mol of hydrochloric acid, gives a pale yellow oil on evaporation in vacuo.
Crystallization from methanol-ether gives 5-hydroxylaminopentylamine- (1) -dihydrochloride in 65% yield. The needles, which have united to form glands, melt after repeated recrystallization at 134-137.