Procédé de préparation de nouveaux composés de la série des tétracyclines
La présente invention a pour objet la préparation de nouveaux composés de la série des tétracyclines.
Les composés en question comprennent la 6-dé méthyl-6-désoxytétracycline répondant à la formule :
EMI1.1
Les composés mentionnés sont apparentés à la tétracycline, antibiotique à large spectre bien connu et largement utilisé. La 6-déméthyl-6-desoxytétracy- cline diffère essentieulement de la tétracycline par le fait que le groupe hydroxyle et le groupe méthyle en position 6 du noyau naphtacène sont remplacés chacun par un atome d'hydrogène. Cette modification produit une différence frappante dans l'activité de la 6-déméthyl-6-désoxybétracycline ainsi obtenue, qui a une activité biologique vis-à-vis du Staphylococcus aureus égale à 1, 5 fois oelle de la tétracycline.
En outre la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline est active contre certaines souches de bactéries qui sont résis, tantes à la tétracyoline.
Une caractéristique vraiment surprenante de la 6-déméthyl-6-désoxytétracyc3int est qu'elle garde l'activité antibactériemne à large spectre qui caracté- rise la tétracycline, surtout lorsqu'on sait que Fan- hydrotétracyctique qui est aussi dépourvue de groupe hydroxyle en position 6 du noyau naphtacène ne présente qu'une activité antibactérienne très inférieure à óelle de la tétracycline. De plus, il est tout à fait inattendu qu'un composé dépourvu du groupe mé- thyle et du groupe hydroxyle de la tétracycline soit un agent antibactérien plus actif que la tétracycline elle-même.
Suivant la nomenclature internationale, le nom chimique correct de cet analogue de la tétracycline est 4-diméthylamino-1, 4, 4a, 5, 5a, 6, 1 1, 12a-octahydro-3, 10, 12, 12a-tetrahydroxy-1, 1 1-dioxo-naphracènv2-car- boxamide. Il est commode d'attribuer à ce composé la désignation courante de 6-déméthyl-6-désoxytétra- cycline ainsi qu'on le fera ici.
Un autre avantage important que possèdent les composés d cette nouvclle classe par rapport aux tétracyclines décrites antérieurement est sa stabilité accrue en présence d'acides et d'alcalis. L'instabilité de la tétracycline en milieu acide et l'instabilité de la chlorotétracycline en milieu alcalin sont bien connues.
La chlbrotétracycline en solution aqueuse avec un tampon au carbonate de sodium à pH 9, 85 perd 50 % de son activité en 29, 2 minutes à 230 C. Par contre, la 6-déméthyl-6-désloxytétracycline ne perd pas plus de 1 % de son activité en 24 heures dans les mêmes conditions. La tétracycline a une demi- vie inférieure à 1 minute dans l'acide chlorhydrique 3N, à 100 C. La 6-déméthyl-6-désoxytétracycline par contre a une demi-vie de 1644 minutes dans les mêmes conditions.
La tétracycline a une demi-vie d'environ 6 minutes dans une solution de soudé 0, 1N à 100 C. Par contre, la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline a une demi-vie de 198 minutes dans les mêmes conditions. Ces propriétés inattendues sont très précieuses étant donné que l'instabilité de la tétra- cycline en milieu acide et l'instabilité de la chloro- tétracycline en milieu alcalin limitent ou excluent entièrement l'usage de ces antibiotiques dans de nombreuses applications. Grâce à la stabilité bien meil leure de la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline, il est possible de préparer de nombreux produits pharma
ceutiques qui ne pourraient pas être préparés de façon
satisfaisante avec les tétracyclines antérieurement connues.
D'autre part, la stabilité accrue permet d'amé- liorer les méthodes de récupération et de purification, car on peut utiliser des conditions de pH et de températures plus sévères sans détruire le composé nouveau.
Comme on l'a indiqué plus haut, l'activité antibactérienne de la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline est tout à fait similaire à de nombreux égards à celle des tétracyclines antérieurement connues, et dans certains cas, notamment contre le Staphylococcus aureus, elle est bien supérieure, ce qui fait que le médecin peut administrer le composé nouveau de la même façon et approximativement aux mêmes doses que les tétracyclines actuellement utilisées.
De plus, étant donné que la nouvelle tétracycline présente l'activité antibiotique à spectre large qui caractérise les tétra- cyclines antérieurement connues,, elle peut servir à traiter diverses infections produites par des bactéries
Gram + > aussi bien que Gram- , là où le trai tement de ces infections par la tétracycline ou la ohlorotétracycline est indiqué.
Le spectre antibactérien du nouveau composé, représentant la quantité nécessaire pour inhiber la croissance de diverses bactéries typiques, est déterminé de façon usuelle par la méthode du tube à dilution nutritive qui sert communément à essayer les nouveaux antibiotiques. Les concentrations minima d'inhibition de la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline, exprimées en grammes par cm3, vis-à-vis de divers organismes essayés,, sont indiquées dans le tableau ci-dessous. A titre de comparaison, on indique aussi l'activité antibactérienne de la tétracycline vis-à-vis des mêmes organismes.
Tableau 1 6-déméthyl-Chlor-
Organisme 6-dsoxy-hydrate de
tëracyctîne tétracycline
Mycobacterium ranae 0, 4 0, 4
Mycobacterium smegmatis 0, 4 0, 4
ATCC 607
Micrococcus pyogenes var aureus 0, 8 0, 8 (Staph. aureus) ATCC 6538P
Sarcina lutea ATCC 9341 0, 8 0, 8
Bacillus subtilis ATCC 6633 0, 4 0, 4
Streptococcus pyogenes, 12, 0 50, 0 y hémolytique
Micrococcus pyogenes var albus 12, 0 50, 0 (Staph.
albus)
Streptococcus pyogenes 12, 0 50, 0 P hémolytique
Bacillus cereus ATCC 10702 0, 8 0, 2 Proteus vulgaris 6, 0 6, 0
Salmonella gallinarum 6, 0 6, 0 Escherichia coli 6, 0 6, 0
D'après ce qui précède, on remarquera qu'à bien des points de vue, le spectre antibactérien du nouveau composé est étroitement parallèle à celui de la tétracycline, mais qu'en outre le nouveau composé est efficace contre certaines souches de bactéries résistantes à la tétracycline, telles que le Streptococcus pyogenes gamma hemolytique, le Micrococcus pyoge- nes var albus,
le Streptococcus pyogenes beta hémo- lytique, etc., et qu'il a aussi l'avantage très important de posséder un titrage biologique égal à environ 1, 5 fois celui de la tétracycline vis-à-vis du Staphylococcus aureus, d'après les mesures faites par titrage tur bidimétrique courant (Annales, de l'Académie des
Sciences de New York, 5, 218 (1940)).
Selon la présente invention, on prépare la 6-dé méthyl-6-désoxytétracycline ou l'épimère 4 corres- pondant par une réduction catalytique d'une démé- thyltétracycline de formule :
EMI2.1
dans laquelle Z est un atome d'hydrogène, de chlore ou de brome, ou bien un épimère 4 correspondant, en solution dans un solvant, en présence d'une substance capable de former un noyau chélaté avec un hydronaphtalène péridioxygéné. Ces déméthyltétra- cyclines sont décrites dans J. A. C.
S. 79, 4561 (1957) ; sont produites par certaines souches mutantes de S. aureofaciens dont certaines ont été appelées S 604,
S 1071, V 62 et B 740.
Des cultures de ces souches sont déposées dans la collection américaine des cultures types (ATCC), à Washington, et ont reçu respectivement les numéros d'inscription ATCC 12551, 12552, 12553 et 12554.
On peut conduire la réduction par hydrogène en présence d'un catalyseur approprié tel que le palladium métallique finement divisé, ou un autre métal de la famille du platine, ou bien l'hydroxyde de palladium sur du charbon de bois. Des composés appropries qui possèdent la propriété de former un noyau chélaté et qui peuvent servir avec succès dans le présent procédé de réduction sont l'acide borique, les trihalogénures de bore tels que le trifluorure de bore, ! es sels d'aluminium et de magnésium tels que le chlorure d'aluminium, l'acétate de magnésium, etc.
L'acide borique ou les trihalogéllures de bore sem blent être les composés les plus utiles au point de vue du rendement en produit désiré. Habituellement, l'acide borique ou le trihalogénure de bore est utilisé en quantité au moins équimolaire. On peut conduire la réduction à des températures variant de 0 à 100 C, et de préférence entre la température am
Mante et 500 C environ, et sous des pressions d'hydrogène de 0, 5 à 100 atmosphères environ.
Les solvants inertes appropriés qui peuvent servir dans la réaction sont les solvants polaires divers tels que l'eau, le dioxane, l'acide acétique glacial, le 2réthoxyéthanol, et l'acétate d'éthyle. On a trouvé qu'un rapport de 1 : 1 entre l'eau et la diméthylfor- mamide donnait un mélange solvant particulièrement bon pour cette réaction. On ajoute habituellement t une petite quantité d'acide perchlorique à la solution.
Une concentration de catalyseur d'au moins 5 % en poids de la 6-déméthyltétracycline est généralement nécessaire, et on peut en utiliser jusqu'à 100 % environ. On conduit habituellement l'hydrogénolyse jusqu'à ce qu'une-mole d'hydrogène soit absorbée, lorsque la matière première est la 6-déméthy1tétracy- cline, et à ce moment le taux d'absorption tend à diminuer. Quand on utilise la 7-chloro-6-déméthyl- tétracycline, il faut évidemment 2 moles d'hydrogène.
Il faut veiller à ne pas prolonger l'hydrogénation pendant un temps excessif, car il pourrait se dérouler des réductions plus poussées et indésirables avec formation de produits moins intéressants.
Les. substances capables de former un noyau ché laté comme indiqué ci-dessus et qui sont utilisées dans le processus de réduction décrit, sont des réactifs très importants, car ils jouent apparemment le rôle de formateurs de complexes et ont pour effet d'empêcher la réduction des fonctions oxygénées, en position 11 et 12 du noyau naphtacène. Ces réactifs sont très importants dans la réduction, car en l'absence de ces agents, la réduction se fait en position 12, de préférence à la position 6, et le composé résultant ne possède aucune activité biologique.
Mais dans le pro cessus de réduction décrit, la chélation a pour effet de bloquer ces fonctions oxygénées et d'empecher leur réduction, de sorte que l'activité antibactérienne du composé se conserve.
Une fois l'hydrogénation achevée, on récupère la 6-déméthylL6Wdésoxytétracycline par tous moyens dé- sirés, par exemple en éliminant le catalyseur et en concentrant la solution. On évapore généralement le produit jusqu'à siccité, on purifie, de préférence par précipitation fractionnée dan, s le méthanol et on peut encore purifier en recristalisant dans, l'alcool de fa çon usuelle. On peut convertir le produit neutre ainsi formé en un sel d'acide minéral, par exemple en chlorhydrate, en le traitant par des acides tels que l'acide chlorhydrique, à un pH inférieur à 4 environ.
On peut former de façon similaire d'autres sels d'acides, tels que le sulfate, le phosphate, le trichloracétate, etc. De préférence, on peut mettre la 6-démé- thyl-6-désoxytetracycline en suspension dans un solvant approprié pendant l'acidification. On peut former simplement les sets alcalins et alcalino-terreux en traitant le composé amphotère par un équivalent environ de la base choisie, par exemple la soude, la potasse, la chaux, la baryte, etc. On peut préparer les sels métalliques en solution aqueuse ou dans un solvant approprié. De préférence, on prépare les sels basiques à un pH de 6 ou supérieur. On peut obtenir la base libre à un pH de 4 à 6 environ.
On peut former les complexes, par exemple le complexe de 6 déméthyl-6-désoxytétracycline et de gluconate d'alumiinium en mélangeant simplement le chlorhydrate du composé nouveau et le gluconate d'aluminium en solution aqueuse.
Pour former l'épimère 4 de la 6-déméthyl-6-dés- oxytétracycline,c'est-à-direcelui qui a une forme épimèresurl'atomedecarbone en position 4, ainsi qu'on l'a décrit à propos des autres composés de la série tétracycline, on peut ajuster simplement l'e pH d'une solution concentrée de l'antibiotique entre 3, 0 et 5, 0, et laisser reposer la solution jusqu'à ce que l'isomérisationsoit parvenue à l'équilibre.
Le plus commode est de conduire 1'isomérisation à la température ambiante, bien que l'on obtienne un taux de conversion plus élevé aux températures supérieures. Le pH doit être compris entre 3, 0 et 5, 0, de préférence entre 3, 5 et 4, 5. Il se produit une certaine épimérisation aux pH qui sortent de ces intervalles, et même dans l'eau distillée ; mais la vitesse d'épimérisation est très faible. La concentration de l'antibiotique dans la solution aqueuse doit être aussi forte que possible, afin de donner les plus grandes vitesses d'épimérisation.
L'équilibre complet peut né- cessiter un laps de temps d'environ 24 heures à 250 C mais un équilibre satisfaisant peutêtreobtenu en un temps beaucoup plus court dans des conditions par ticulières. Toutefois, en générait, on obtient les meil- leurs résultats en laissant reposer les solutions pen dant une durée d'une semaineou plus. Il semble que l'équi9, ibre soit atteint dans la plupart des cas à 50 % environ ; autrement dit, la moitié environ de l'antibiotique se convertit en épimère à l'équilibre.
Etant donné que la concentration est un facteur important pour obtenir dos rendements élevés pendant de courts laps de temps, on choisit avantageusement un système solvant qui donne la plus, forte concentration en antibiotique. Il est préférable de tamponner ces systèmes de manière à obtenir un pH situé dans l'intervalle préférentiel. Comme solvants, on citera le méthanol, 1'méthanol, le butanol, l'acétone, le 2-éthoxyéthanol, le 2-méthoxy-propanol, l'acide acétique glacial, le tétrahydrofurane, la diméthylformamide et les mélanges de ces solvants. On peut utiliser encore d'autres solvants.
Un tampon préfé- rentiel est le phosphate monosodique, mais on peut utiliser d'autres tampons et couples de tampons qui maintiennent le pH dans l'intervalle désiré.
Exemple 1
On met en suspension 12 g de 6-déméthyltétra- cycline neutre (J. A. C. S. 79, 4561, 1957), dans 10 volumes d'un malange 1 : 1 d'eau et de diméthyl- formamide. On prépare le chlorhydrate en traitant t par l'acide chlorhydrique concentré à pH 1, 8. A ce mélange, on ajoute 1, 48 g d'acide borique, 12 g de palladium non réduit à 5 % sur charbon, et 0, 03 cm3 d'acide perchlorique. On conduit l'hydrogénation par la réaction sur l'hydrogène à environ 1, 4 kg/cm2, sur une secoueuse Parr, pendant 2 heures environ. On arrete l'hydrogénation des que 1 mole environ d'hy- drogène a été absorbée.
On filtre la solution et on lave le catalyseur avec 10 cm3 de dimothylformamide, puis on lave une deuxième fois avec 10 cm3 d'eau.
On évapore jusqu'à siccité le filtrat obtenu. On ajoute 50 cm3 d'eau et on agite le mélange, puis on sèche par congélation. On délaie la matière séchée dans 100 cm3 de méthanol, puis on centrifuge. A 88 cm3 de la solution mathanoliquc, on ajoute 88 cl3 d'éther. Il se forme un précipité qu'on centrifuge.
Le liquide qui surnage est formé d'une solution mé- thanol : éther ai : 1, qui a un volume de 130 cm3 ; on l'évapore jusqu'à 1/3 de son volume. On ajoute 0, 5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré, et on éva- pore la solution jusqu'à 5, 5 cm3 sous atmosphère d'azote. On ensemence la solution et on la laisse reposer 18 heures à la température ambiante. On filtre les cristaux, on les lave à l'acétone puis à l'éther, et on les sèche sous vide à 400 C pendant 20 heures, pour obtenir 0, 675 g de 6-déméthyl-6-désoxytétfa- cycline brute.
Pour obtenir une 6-déméthyl-6-désoxy- tétracycline pure, on ajoute à 1, 36 g de 6-déméthyl- 6-désoxytétracycline 196 cm3 d'eau et on ajuste le pH à 1, 2 à l'aide d'acide chlorhydrique, puis on filtre le produit. On ajuste le pH du filtrat à 2, 75 à l'aide d'ammoniaque, et on lave à trois reprises avec 200cmd'éther. On concentre la solution lavée à 40-500 C sous pression réduite, jusqu'à un volume de 50 cm3.
On ajuste le pH à 4, 5 à l'aide d'ammoniaque, et il se forme des, cristaux de 6-déméthyl-6- désoxytétracycline neutre. On laisse reposer les cristaux, on les lave à l'eau et on les sèche sous vide à 400 C pendant 23 heures. Rendement : 0, 710 g.
Exemple 2
On délaie 2/3 de gramme de 6-déméthyl-6-dés- oxytétracycline dans 13, 5 cm3 d'alcool éthylique. On ajoute 0, 5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré pour ajuster le pH à 0, 8-1, 0. On Msse reposer la solution 3 1/2 heures,. Il se forme des cristaux de chlor- hydrate de 6-déméthyl-6-désoxytétracycline qu'on sèche sous. vide à 100 C pendant 20 heures.
Le produit a un point de fusion de 215-220o C avec décomposition.
Analyse : calculée pour C2lH22N, 07. HCI. 1/2H20, poids moléculaire 459, 5 :
C 54, 9 ; H 5, 26 ; N 6, 10 ; Cl 7, 72 ; O 26, 1 ; 1/2H2O : 1, 96 ; analyse effective :
C 54, 81 ; H 5, 32 ; N 6, 16 ; Cl 7, 80 ; O 25, 91 (par différence) ; H20 : 2, 06.
Equivalent de neutralisation 477.
Le produit a une rotation optique [u D de -109, 0 (en solution dans HnSO4 0, 1 N). On détermine le spectre d'absorption d'ultraviolet sur un échantillon du composé dans 1'acide sulfurique 0, 1 N à une concentration de 30, 65 gammas par cm3. On détermine le spectre d'absorption d'infrarouge sur un échantillon du composé mélangé à des cristaux de
KBr et comprimé en un disque.
Exemple 3
A 1 g de 6-déméthyltétracycline neutre, on ajoute 25 cm3 d'un mélange à 1 : 1 de diméthylformamide et d'eau, et 3 cm3 (10 équivalents molaires) d'une solution à 45 % de trifluorure de bore dans PÚther.
On ajuste le pH à 1, 5 à l'aide de triéthylamine. On ajoute 1 g de palladium à 5 % sur charbon et on place le mélange sur une secoueuse Parr, et on le laisse réagir sur l'hydrogène pendant 150 minutes (absorption d'hydrogène : 1 mole). On filtre la solution réduite et on lave les insolubles avec 3 cm3 d'eau. Le rendement de 6-déméthyl-6-désoxytétra- cycline est d'environ 26 %.
Exemple 4
On répète l'opération de l'exemple précédent, sauf que l'on utilise 1, 1 g d'acétate de magnésium,
Mg (C2H302) 2, 41-LO au lieu du trifluorure de bore utilisé dans l'exemple 5. On obtient de la 6-démé thyl-6-désoxy-tétracycline.
Exemple 5
On répète le procédé de l'exemple précédent sauf que l'on utilise 0, 55 g de chlorure de calcium au lieu du trifluorure de bore utilisé dans l'exemple 5.
On obtient de la 6-déméthylL6-désoxytétracycline.
Exemple 6
On répète l'opération de l'exemple précédent, sauf que l'on utilise 0, 27 g de chlorure d'aluminium à la place du trifluorure de bore utilisé dans l'exemple 5.
On obtient de la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline.
Exemple 7
A 1, 0 g de 6-déméthyltétracycline neutre on ajoute 0, 13 g d'acide borique dissous dans 28 cm3 d'un mélange à 1 : 1 de diméthylformamide et d'eau. On ajuste le pH à 2, 1 à l'aide d'acide chlor- hydrique. A 13 cm3 de cette solution, on ajoute 0, 75 g de palladium à 5 % sur charbon. On-place le mélange dans un autoclave en acier inoxydable et on le laisse réagir sur l'hydrogène à une pression de 133 kg/cm2 pendant 80 minutes. On filtre le mélange et on lave les insolubles avec de Peau. Les titrages spectrophotométriques du filtrat de réduc- tion indiquent la présence de 6-déméthyl-6-désoxy- tétracycline.
Exemple 8
A 5 mg de 6-déméthyl-6-désoxytétracycline, on ajoute 1 cm3 d'acide acétique glacial. On agite bien le mélange et on le laisses'équilibreràlatempéra- ture ambiante pendant 18 heures, puis on le filtre.
La chromatographie sur bande de papier indique la présence de 6-dóméthyl-6-désoxy-4-épitébracycline, par les Rf suivants :
Les Rf dans un système à l'acétate d'éthyle à pH 4, 5 sont : 6-déméthyl ; 6-d'ésoxytétracycline : 0, 75 6-déméthyl-6-désoxy-4-épitétracycline : 0, 44
Exemple 9
A 12 g de chlorhydratede7-chloro-6-déméthyl- tétracycline, (J. A. C. S. 79, 4561, 1957), on ajoute 120 cm3 d'un mélange ai : 1 de diméthylformamide et d'eau. On ajuste le pH à 1, 8 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré, on ajoute 1, 48 g d'acide borique et 10 gouttas d'acide perchlorique.
On ajoute au mélange 12. g de palladium à 5 % sur charbon, et on fait réagir sur l'hydrogène sur une secoueuse
Parr pendant 300 minutes, temps au bout duquel 2 moles d'hydrogène sont absorbées. On filtre le mélange et on rince les insolubles avec de l'eau et de la diméthylformamide. On isole le produit et on le recristallise pour obtenir la 6-déméthyl-6-désoxytétra- cycline.
Exemple 10
A 4 cm3 d'une solution obtenue en mélangeant 25 cm3 de diméthylformamide, 25 cm3 d'eau, 32, 5 g d'acide borique et 1 cm3 d'acide perchlorique, on ajoute 5, 51 mg de chlorhydrate de 6-déméthyl-4-épi- tétracycline et 7 mg de palladium à 5 % sur charbon. On fait réagir le mélange sur l'hydrogène à une pression de 2, 1 kg/cm2 pendant 2 heures. On filtre le mélange et on lave les insolubles avec de veau.
L'analyse spectrophotométrique et la chromatographie sur papier indiquent la présence de 6-déméthyl- 6-désoxy-4-épitétracycline.
Exemple 11
A 4 cm3 d'une solution obtenue en mélangeant 25 cm3 de diméthylformamide, 25 cm3 d'eau, 32, 5 g
d'acide borique et 1 cm3 d'acide perchlorique, on
ajoute 5 mg de 7-chloro-6-déméthyl-Sépitétracycline.
On ajoute 7 mg de paNadium à 5 % sur charbon et
on fait réagir le mélange sur l'hydrogène à une pres
sion de 2, 1 kg/cm2 pendant 4 heures. On filtre le mélange et on lavelesinsolublesavecdel'eau.L'ana- lyse chromatographique sur papier et l'analyse spectrophotométrique indiquent la présence de 6-déme thyl-6-désloxy-4-épitétracycline.
Process for the preparation of new compounds of the tetracycline series
The present invention relates to the preparation of new compounds of the tetracycline series.
The compounds in question include 6-de-methyl-6-deoxytetracycline corresponding to the formula:
EMI1.1
The compounds mentioned are related to tetracycline, a well known and widely used broad spectrum antibiotic. 6-Demethyl-6-deoxytetracycline differs essentially from tetracycline in that the hydroxyl group and the methyl group at position 6 of the naphtacene ring are each replaced by a hydrogen atom. This modification produces a striking difference in the activity of the 6-demethyl-6-deoxybetracycline thus obtained, which has a biological activity against Staphylococcus aureus equal to 1.5 times that of tetracycline.
In addition, 6-demethyl-6-deoxytetracycline is active against certain strains of bacteria which are resistant to tetracyolin.
A really surprising feature of 6-demethyl-6-deoxytetracyc3int is that it retains the broad spectrum antibacterial activity which characterizes tetracycline, especially when one knows that Fan-hydrotetracyctic which is also devoid of a hydroxyl group in position. 6 of the naphtacene ring exhibits only much less antibacterial activity than that of tetracycline. Moreover, it is quite unexpected that a compound lacking the methyl group and the hydroxyl group of tetracycline would be a more active antibacterial agent than tetracycline itself.
According to international nomenclature, the correct chemical name for this tetracycline analogue is 4-dimethylamino-1, 4, 4a, 5, 5a, 6, 1 1, 12a-octahydro-3, 10, 12, 12a-tetrahydroxy-1 , 1 1-dioxo-naphracènv2-carboxylamide. It is convenient to give this compound the common designation of 6-demethyl-6-deoxytetra-cyclin as will be done herein.
Another important advantage which compounds of this new class possess over the tetracyclines described previously is their increased stability in the presence of acids and alkalis. The instability of tetracycline in an acidic medium and the instability of chlorotetracycline in an alkaline medium are well known.
Chlbrotetracycline in aqueous solution with sodium carbonate buffer at pH 9.85 loses 50% of its activity in 29.2 minutes at 230 C. On the other hand, 6-demethyl-6-desloxytetracycline does not lose more than 1% of its activity in 24 hours under the same conditions. Tetracycline has a half-life of less than 1 minute in 3N hydrochloric acid at 100 C. 6-demethyl-6-deoxytetracycline, on the other hand, has a half-life of 1644 minutes under the same conditions.
Tetracycline has a half-life of about 6 minutes in 0.1N weld solution at 100 C. On the other hand, 6-demethyl-6-deoxytetracycline has a half-life of 198 minutes under the same conditions. These unexpected properties are very valuable since the instability of tetracycline in an acidic medium and the instability of chlorotetracycline in an alkaline medium limit or entirely exclude the use of these antibiotics in many applications. Thanks to the much better stability of 6-demethyl-6-deoxytetracycline, it is possible to prepare many pharma products.
ceuticals that could not be properly prepared
satisfactory with the previously known tetracyclines.
On the other hand, the increased stability allows improved recovery and purification methods, since more severe pH and temperature conditions can be used without destroying the new compound.
As indicated above, the antibacterial activity of 6-demethyl-6-deoxytetracycline is quite similar in many respects to that of previously known tetracyclines, and in some cases, notably against Staphylococcus aureus, it is much higher, so that the physician can administer the new compound in the same way and at approximately the same doses as the tetracyclines currently in use.
In addition, since the new tetracycline exhibits the broad spectrum antibiotic activity that characterizes previously known tetracyclines, it can be used to treat various infections produced by bacteria.
Gram +> as well as Gram-, where treatment of these infections with tetracycline or ohlorotetracycline is indicated.
The antibacterial spectrum of the new compound, representing the amount necessary to inhibit the growth of various typical bacteria, is determined in the usual way by the nutrient dilution tube method which is commonly used in testing new antibiotics. The minimum inhibitory concentrations of 6-demethyl-6-deoxytetracycline, expressed in grams per cm3, against various organisms tested, are shown in the table below. By way of comparison, the antibacterial activity of tetracycline towards the same organisms is also indicated.
Table 1 6-Demethyl-Chlor-
Body 6-dsoxyhydrate
tetracyctin tetracycline
Mycobacterium ranae 0, 4 0, 4
Mycobacterium smegmatis 0, 4 0, 4
ATCC 607
Micrococcus pyogenes var aureus 0, 8 0, 8 (Staph. Aureus) ATCC 6538P
Sarcina lutea ATCC 9341 0, 8 0, 8
Bacillus subtilis ATCC 6633 0, 4 0, 4
Streptococcus pyogenes, 12.0 50.0 y hemolytic
Micrococcus pyogenes var albus 12.0 50.0 (Staph.
albus)
Streptococcus pyogenes 12.0 50.0 P hemolytic
Bacillus cereus ATCC 10702 0, 8 0, 2 Proteus vulgaris 6, 0 6, 0
Salmonella gallinarum 6, 0 6, 0 Escherichia coli 6, 0 6, 0
From the above, it will be appreciated that in many ways the antibacterial spectrum of the new compound closely parallels that of tetracycline, but that in addition the new compound is effective against certain strains of bacteria resistant to tetracycline, such as Streptococcus pyogenes gamma hemolytic, Micrococcus pyogenes var albus,
hemolytic Streptococcus pyogenes beta, etc., and that it also has the very important advantage of having a biological titration equal to approximately 1.5 times that of tetracycline vis-à-vis Staphylococcus aureus, according to measurements made by current bidimetric tur titration (Annales, de l'Académie des
New York Sciences, 5, 218 (1940)).
According to the present invention, 6-de-methyl-6-deoxytetracycline or the corresponding epimer 4 is prepared by a catalytic reduction of a demethyltetracycline of formula:
EMI2.1
in which Z is a hydrogen, chlorine or bromine atom, or else a corresponding epimer 4, in solution in a solvent, in the presence of a substance capable of forming a chelated nucleus with a peridioxygenated hydronaphthalene. These demethyltetracyclins are described in J. A. C.
S. 79, 4561 (1957); are produced by certain mutant strains of S. aureofaciens, some of which have been called S 604,
S 1071, V 62 and B 740.
Cultures of these strains are deposited in the American Collection of Type Cultures (ATCC), in Washington, and have received ATCC registration numbers 12551, 12552, 12553 and 12554 respectively.
The hydrogen reduction can be carried out in the presence of a suitable catalyst such as finely divided metallic palladium, or another metal of the platinum family, or alternatively palladium hydroxide on charcoal. Suitable compounds which possess the property of forming a chelated nucleus and which can be used successfully in the present reduction process are boric acid, boron trihalides such as boron trifluoride,! aluminum and magnesium salts such as aluminum chloride, magnesium acetate, etc.
Boric acid or boron trihalogellides appear to be the most useful compounds from the standpoint of desired product yield. Usually, boric acid or boron trihalide is used in at least equimolar amount. The reduction can be carried out at temperatures varying from 0 to 100 C, and preferably between temperature am
Mantis and about 500 C, and under hydrogen pressures of about 0.5 to 100 atmospheres.
Suitable inert solvents which can be used in the reaction are various polar solvents such as water, dioxane, glacial acetic acid, 2rethoxyethanol, and ethyl acetate. It was found that a 1: 1 ratio of water to dimethylformamide gave a particularly good solvent mixture for this reaction. Usually, a small amount of perchloric acid is added to the solution.
A catalyst concentration of at least 5% by weight of 6-demethyltetracycline is generally required, and up to about 100% can be used. The hydrogenolysis is usually carried out until one mole of hydrogen is absorbed, when the raw material is 6-demethyltetracycline, and at this time the absorption rate tends to decrease. When using 7-chloro-6-demethyl-tetracycline, obviously 2 moles of hydrogen are required.
Care must be taken not to prolong the hydrogenation for an excessive time, as further and undesirable reductions could take place with the formation of less interesting products.
The. substances capable of forming a nucleus ché laté as indicated above and which are used in the described reduction process, are very important reagents, since they apparently play the role of complex formers and have the effect of preventing the reduction of oxygen functions, in position 11 and 12 of the naphtacene nucleus. These reagents are very important in the reduction, because in the absence of these agents, the reduction takes place at position 12, preferably at position 6, and the resulting compound has no biological activity.
But in the reduction process described, the chelation has the effect of blocking these oxygen functions and preventing their reduction, so that the antibacterial activity of the compound is preserved.
Once the hydrogenation is complete, the 6-demethylL6Wdeoxytetracycline is recovered by any means desired, for example by removing the catalyst and concentrating the solution. The product is generally evaporated to dryness, it is purified, preferably by fractional precipitation in methanol, and it is possible to further purify by recrystallizing from alcohol in the usual way. The neutral product thus formed can be converted into an inorganic acid salt, for example the hydrochloride, by treating it with acids such as hydrochloric acid, at a pH below approximately 4.
Other salts of acids, such as sulfate, phosphate, trichloroacetate, etc. can similarly be formed. Preferably, the 6-demethyl-6-deoxytetracycline can be suspended in a suitable solvent during the acidification. The alkaline and alkaline-earth sets can be formed simply by treating the amphoteric compound with approximately one equivalent of the chosen base, for example soda, potash, lime, barite, etc. The metal salts can be prepared in aqueous solution or in a suitable solvent. Preferably, the basic salts are prepared at a pH of 6 or higher. The free base can be obtained at a pH of about 4 to 6.
The complexes, for example the complex of 6-demethyl-6-deoxytetracycline and aluminum gluconate can be formed by simply mixing the hydrochloride of the novel compound and the aluminum gluconate in aqueous solution.
To form epimer 4 of 6-demethyl-6-de-oxytetracycline, i.e. that which has an epimeric form on the carbon atom at position 4, as has been described in connection with the other compounds of the tetracycline series, one can simply adjust the pH of a concentrated solution of the antibiotic to between 3.0 and 5.0, and allow the solution to stand until the isomerization has reached equilibrium.
The most convenient is to carry out the isomerization at room temperature, although a higher conversion rate is obtained at higher temperatures. The pH should be between 3.0 and 5.0, preferably between 3.5 and 4.5. Some epimerization occurs at the pH values outside these ranges, and even in distilled water; but the epimerization rate is very low. The concentration of the antibiotic in the aqueous solution should be as high as possible, in order to give the highest rates of epimerization.
Complete equilibrium may require a period of about 24 hours at 250 ° C., but satisfactory equilibrium may be obtained in a much shorter time under particular conditions. However, the best results are obtained by allowing the solutions to stand for a period of one week or more. It seems that the equilibrium is reached in most cases at about 50%; that is, about half of the antibiotic converts to an epimer at equilibrium.
Since concentration is an important factor in obtaining high yields for short periods of time, a solvent system is advantageously chosen which gives the highest concentration of antibiotic. It is preferable to buffer these systems so as to obtain a pH in the preferential range. As solvents, mention will be made of methanol, methanol, butanol, acetone, 2-ethoxyethanol, 2-methoxy-propanol, glacial acetic acid, tetrahydrofuran, dimethylformamide and mixtures of these solvents. Still other solvents can be used.
A preferred buffer is monosodium phosphate, but other buffers and pairs of buffers can be used which maintain the pH in the desired range.
Example 1
12 g of neutral 6-demethyltetracyclin (J. A. C. S. 79, 4561, 1957) are suspended in 10 volumes of a 1: 1 mixture of water and dimethylformamide. The hydrochloride is prepared by treating t with concentrated hydrochloric acid at pH 1.8. To this mixture are added 1. 48 g of boric acid, 12 g of palladium not reduced to 5% on charcoal, and 0.03 cm3 of perchloric acid. The hydrogenation is carried out by the reaction with hydrogen at about 1.4 kg / cm2, on a Parr shaker, for about 2 hours. The hydrogenation is stopped as soon as about 1 mole of hydrogen has been absorbed.
The solution is filtered and the catalyst is washed with 10 cm3 of dimothylformamide, then washed a second time with 10 cm3 of water.
The filtrate obtained is evaporated to dryness. 50 cm3 of water are added and the mixture is stirred, then dried by freezing. The dried material is stirred in 100 cm3 of methanol, then centrifuged. To 88 cm3 of the mathanoliquc solution, 88 cl3 of ether are added. A precipitate forms which is centrifuged.
The supernatant liquid is formed from a methanol: ether a1: 1 solution, which has a volume of 130 cm3; it is evaporated to 1/3 of its volume. 0.5 cm3 of concentrated hydrochloric acid is added, and the solution is evaporated to 5.5 cm3 under a nitrogen atmosphere. The solution is inoculated and allowed to stand for 18 hours at room temperature. The crystals were filtered, washed with acetone and then with ether, and dried under vacuum at 400 ° C. for 20 hours, to obtain 0.675 g of crude 6-demethyl-6-deoxytetfacyclin.
To obtain pure 6-demethyl-6-deoxy-tetracycline, one adds to 1.36 g of 6-demethyl-6-deoxytetracycline 196 cm3 of water and the pH is adjusted to 1.2 with acid. hydrochloric acid, then the product is filtered. The pH of the filtrate is adjusted to 2.75 with ammonia, and washed three times with 200 cc of ether. The washed solution is concentrated at 40-500 C under reduced pressure, to a volume of 50 cm 3.
The pH is adjusted to 4.5 with ammonia, and crystals of neutral 6-demethyl-6-deoxytetracycline form. The crystals are left to stand, washed with water and dried under vacuum at 400 ° C. for 23 hours. Yield: 0.710 g.
Example 2
2/3 gram of 6-demethyl-6-de-oxytetracycline is stirred in 13.5 cm3 of ethyl alcohol. 0.5 cm3 of concentrated hydrochloric acid are added to adjust the pH to 0.8-1.0. The solution is left to stand for 3 1/2 hours. Crystals of 6-demethyl-6-deoxytetracycline hydrochloride form, which are dried under. vacuum at 100 C for 20 hours.
The product has a melting point of 215-220o C with decomposition.
Analysis: calculated for C21H22N, 07. HCl. 1 / 2H20, molecular weight 459.5:
C 54.9; H 5.26; N 6, 10; Cl 7.72; O 26, 1; 1 / 2H2O: 1.96; effective analysis:
C 54, 81; H 5.32; N 6, 16; Cl 7, 80; O 25.91 (by difference); H2O: 2.06.
Equivalent of neutralization 477.
The product has an optical rotation [u D of -109.0 (in solution in 0.1N HnSO4). The ultraviolet absorption spectrum is determined on a sample of the compound in 0.1N sulfuric acid at a concentration of 30.65 gammas per cm 3. The infrared absorption spectrum is determined on a sample of the compound mixed with crystals of
KBr and compressed into a disc.
Example 3
To 1 g of neutral 6-demethyltetracycline are added 25 cm3 of a 1: 1 mixture of dimethylformamide and water, and 3 cm3 (10 molar equivalents) of a 45% solution of boron trifluoride in PÚther.
The pH is adjusted to 1.5 using triethylamine. 1 g of 5% palladium on charcoal is added and the mixture is placed on a Parr shaker, and allowed to react with hydrogen for 150 minutes (hydrogen absorption: 1 mole). The reduced solution is filtered and the insolubles are washed with 3 cm3 of water. The yield of 6-demethyl-6-deoxytetracyclin is about 26%.
Example 4
The operation of the previous example is repeated, except that 1.1 g of magnesium acetate is used,
Mg (C2H302) 2, 41-LO instead of the boron trifluoride used in Example 5. 6-demethyl-6-deoxy-tetracycline is obtained.
Example 5
The process of the previous example is repeated except that 0.55 g of calcium chloride is used instead of the boron trifluoride used in Example 5.
6-demethylL6-deoxytetracycline is obtained.
Example 6
The operation of the previous example is repeated, except that 0.27 g of aluminum chloride is used in place of the boron trifluoride used in Example 5.
6-demethyl-6-deoxytetracycline is obtained.
Example 7
To 1.0 g of neutral 6-demethyltetracycline is added 0.13 g of boric acid dissolved in 28 cm3 of a 1: 1 mixture of dimethylformamide and water. The pH is adjusted to 2.1 with hydrochloric acid. To 13 cm3 of this solution, 0.75 g of 5% palladium on charcoal is added. The mixture is placed in a stainless steel autoclave and allowed to react with hydrogen at a pressure of 133 kg / cm2 for 80 minutes. The mixture is filtered and the insolubles washed with water. Spectrophotometric titrations of the reduction filtrate indicate the presence of 6-demethyl-6-deoxy-tetracycline.
Example 8
To 5 mg of 6-demethyl-6-deoxytetracycline, 1 cm3 of glacial acetic acid is added. The mixture is stirred well and allowed to equilibrate at room temperature for 18 hours, then filtered.
Chromatography on a paper strip indicates the presence of 6-dómethyl-6-deoxy-4-epiterbracycline, by the following Rf's:
The Rf's in an ethyl acetate system at pH 4.5 are: 6-demethyl; 6-esoxytetracycline: 0.75 6-demethyl-6-deoxy-4-epitetracycline: 0.44
Example 9
To 12 g of 7-chloro-6-demethyl-tetracycline hydrochloride (J. A. C. S. 79, 4561, 1957), 120 cm3 of an al: 1 mixture of dimethylformamide and water are added. The pH is adjusted to 1.8 with concentrated hydrochloric acid, 1.48 g of boric acid and 10 drops of perchloric acid are added.
12 g of 5% palladium on charcoal are added to the mixture, and the mixture is reacted with hydrogen on a shaker.
Parr for 300 minutes, after which time 2 moles of hydrogen are absorbed. The mixture is filtered and the insolubles are rinsed with water and dimethylformamide. The product is isolated and recrystallized to give 6-demethyl-6-deoxytetracycline.
Example 10
To 4 cm3 of a solution obtained by mixing 25 cm3 of dimethylformamide, 25 cm3 of water, 32.5 g of boric acid and 1 cm3 of perchloric acid, 5.51 mg of 6-demethyl hydrochloride is added. 4-epitetracycline and 7 mg of 5% palladium on charcoal. The mixture is reacted with hydrogen at a pressure of 2.1 kg / cm2 for 2 hours. The mixture is filtered and the insolubles washed with veal.
Spectrophotometric analysis and paper chromatography indicate the presence of 6-demethyl-6-deoxy-4-epitetracycline.
Example 11
To 4 cm3 of a solution obtained by mixing 25 cm3 of dimethylformamide, 25 cm3 of water, 32.5 g
boric acid and 1 cm3 of perchloric acid, we
add 5 mg of 7-chloro-6-demethyl-Sepitetracycline.
7 mg of 5% paNadium on charcoal are added and
the mixture is reacted with hydrogen at a pres
sion of 2.1 kg / cm2 for 4 hours. The mixture was filtered and washed insoluble with water. Paper chromatographic analysis and spectrophotometric analysis indicated the presence of 6-thyl-6-desloxy-4-epitetracycline.