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Procédé de préparation de la vitamine Bl2 cristallisée L'objet de la présente invention est un nouveau procédé de préparation de la vitamine Bl. sous forme cristallisée (ou cyanocobalamine de formule CssH9oNl4O'l4PCo dont la constitution a été élucidée par TORD et coll., Nature, 1955 176, 328),à partir de solutions aqueuses diluées de celle-ci, comme par exemple les bouillons de culture de microorganismes qui la se- crètent.
Le procédé peut également s'appliquer à l'isolement de la vitamine Bl, à partir d'autres sources naturelles comme les boues des eaux d'égout ou les extraits de foie ou de solutions très diluées de produit pur.
On sait que la teneur en vitamine 1312 des bouillons de culture des microorganismes qui la secrètent (et qui sont des fongi appartenant aux classes des Schizomycètes, Eumycètes et Myxomycètes, notamment des Streptomycès) est extrêmement faible. Elle est généralement de l'ordre du millionième.
Les méthodes. connues d'isolement procèdent par étapes, successives, en commençant généralement par une adsorption préliminaire sur charbon actif, une terre ou résine échangeuse d'ions d'où l'on élue la vitamine 1312 accompagnée d'impuretés de solubilités voisines. On effectue ensuite des purifications intermédiaires par extraction à contrecourant à l'alcool benzylique, ou par passage alternatif de la vitamine BI, dans un solvant non miscible à l'eau et dans l'eau.
Pour cela, on épuise les solutions aqueuses avec un solvant ou mélange de solvants insolubles dans l'eau, ajoute généralement un tiers. solvant dans lequel la vitamine Bl, est insoluble et épuise à l'eau. Des solutions de vitamine 131.2 dans des phénols substitués ou non peuvent être épuisées par la pyridine aqueuse. Finalement, en répétant les passages. en phase aqueuse et phase organique, on arrive à une purification plus complète du produit et procède pour terminer à une chromatographie sur alumine ou sur résine échangeuse d'ions qui donne une solution de vitamine B,, dont le degré de pureté est de l'ordre de 90 %. Une précipitation par l'acétone, suivie d'une ou plusieurs recristallisations, conduit généralement au produit pur.
Comme on le voit, l'extrême dilution du produit de départ et le peu de sélectivité de l'agent d'adsorption utilisé, fait que l'agent d'adsorption ayant servi au premier traitement, renferme rarement plus de 50 y de vitamine Bit par gramme, soit 5/ioo ooo ce qui conduit à des opérations multiples et diverses, néces- sitant l'emploi de différents, solvants et agents. d'adsorption sur une grande échelle et à la manipulation de gros volumes comportant parfois des récupérations onéreuses de solvants.
Il est donc intéressant de pouvoir disposer dans l'industrie d'un procédé sélectif permettant d'éviter ces opérations multiples portant sur des volumes importants.
La présente invention qui se rapporte donc à un procédé de préparation de la vitamine 1312 sous forme cristallisée à partir de solutions aqueuses diluées de celle-ci, est caractérisé en ce qu'on forme au sein de ladite solution du cuprocyanure de zinc qui se combine à la vitamine B12 en donnant un composé insoluble dans l'eau, sépare ledit composé de vitamine Bh, libère la vitamine Bl2 par l'action d'un agent susceptible de former avec le zinc un dérivé hydrosoluble,
extrait la vitamine Bl2 par au moins un solvant pour la débarrasser des impuretés minérales, la fait repasser en solution aqueuse et la précipite de sa solution aqueuse par addition d'un solvant dans lequel elle est insoluble.
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Selon une forme particulière du procédé selon l'invention, on forme au sein d'un bouillon de culture dont les cellules du mycelium ont été soumises à une lyse préalable, du cuprocyanure de zinc, sel complexe, qui se combine à la vitamine B12 avec formation d'un dérivé insoluble de celle-ci. Après une simple filtration ou centrifugation, on se trouve en présence d'un précipité de poids et de volume très restreints d'où il est possible de régénérer aisément la vitamine B,, en redissolvant le précipité formé, dans l'eau par action d'un agent de chelatation qui complexe le zinc.
Il suffit alors d'extraire de cette solution riche en produits minéraux la vitamine B1n par un solvant ou mélange de solvants d'où on la fait repasser dans l'eau, en répétant, au besoin, ces deux dernières opérations. On la précipite de cette solution par addition de dioxane et vérifie le degré de pureté sur une partie aliquote de la cyanocobalamine obtenue.
Si ce degré est insuffisant pour permettre la recristallisation directe, on redissout dans l'eau et effectue une deuxième fois le traitement par le cupro- cya.nure de zinc et traite le précipité obtenu comme précédemment. On évite à la fois les chromatographies et les opérations portant sur de gros volumes.
La littérature technique ou scientifique mentionne déjà certains procédés de précipitation de la vitamine B12 en faisant réagir sur des concentrais de ce produit un cyanure alcalin et un sel soluble de zinc, en utilisant, par conséquent, du cyanure de zinc et en partant d'un produit préalablement concentré par un autre traitement.
A l'opposé de ce procédé, on utilise ici le cupro- cyanure de zinc qui donne avec la vitamine B12 au sein de solutions très diluées ou d'un bouillon de culture lysé une combinaison insoluble. Ce réactif peut être formé en introduisant d'abord dans la solution renfermant la vitamine B1,2 du cuprocyanure tri- potassique [Cu(CN)4]K3 et ensuite un sel soluble de zinc comme le sulfate ou l'acétate de zinc.
Comme le montrent les exemples, le cuprocyanure de zinc permet non seulement l'isolement de la vitamine B12 à partir des bouillons de culture, mais également sa récupération quantitative à partir d'une solution diluée de vitamine B,, cristallisée. Par contre, si en présence d'une telle solution on fait réagir du cyanure de potassium et un sel de zinc, on n'isole que des quantités faibles de vitamine B,.,.
Le cuprocyanure tripotassique utilisé pour le faire réagir au sein du bouillon de culture sur un sel soluble de zinc, se trouve dans le commerce ou est facile à préparer selon les. méthodes de la littérature. Sa formule est aisément vérifiable par analyse chimique ou par les méthodes physiques. On l'introduit en général dans le bouillon lysé en quantité telle qu'après addition de la quantité stoechiométrique ou d'un léger excès d'un sel soluble de zinc, on dépasse les limites de solubilité du cuprocyanure de zinc formé dans l'eau.
On emploie donc de préférence un large excès de ce réactif par rapport à la vitamine B12, la solubilité du cuprocyanure de zinc étant de l'ordre de 0,5 %. Bien entendu, au lieu d'introduire d'abord dans le bouillon de culture ou dans une autre solution diluée de vitamine B,., la solution de cuprocya- nure tripotassique et ensuite le sel de zinc, on peut aussi procéder inversement.
A l'encontre de l'adsor- bat qu'on obtient lorsqu'on essaie de précipiter la vitamine B,,, par l'action d'un cyanure alcalin sur un sel de zinc et d'où elle est extractible par les solvants, on obtient ici une combinaison chimique. En effet, l'action des solvants n'extrait pas de vitamine B1_ et mieux encore, on peut, par action du diméthyl- form.amide, extraire la combinaison cuprocyanure de zinc-vitamine B,= et la séparer du cuprocyanure de zinc coprécipité. Par addition d'acétone à cette solution, la combinaison. précipite inchangée.
Pour l'isolement industriel de la vitamine B,_,, on se contente généralement du précipité brut obtenu comme on vient de l'indiquer. Après filtration ou centrifugation on peut le traiter par la solution aqueuse d'un agent de chelatation comme le sel sodique de l'acide éthylène-diamino-tétracétique qui complexe le zinc et procède ensuite par extraction et redissolution dans l'eau d'où l'on précipite la vitamine B,_, par le dioxane comme il a été indiqué au début de la description.
Dans les exemples qui suivent, on peut employer pour la réaction avec le cuprocyanure tripotassique, d'autres. sels de zinc solubles dans l'eau que ceux mentionnés ou, employer le cuprocyanure trisodique, ou bien, utiliser d'autres agents de lyse du bouillon que ceux indiqués s'ils n'influent pas sur la solubilité de la combinaison. De même, s'il est plus commode de travailler à la température ambiante et sans changer le pH du bouillon, on peut encore chauffer celui-ci vers 800 ou refroidir à -F- 5,1 ou l'alcaliniser légèrement. De même peut-on changer d'adjuvant de filtration en utilisant d'autres produits que ceux mentionnés.
Finalement, on. peut employer d'autres agents de chelatation du zinc que ceux indiqués, notamment le sel trisodique de l'acide nitrilo-triacétique ou le sel trisodique de l'acide N-hydroxyéthyl-éthy- lène-diamine-triacétique ou d'autres agents susceptibles de complexer le zinc sous forme de dérivés hydrosolubles. Exemple a) A partir d'une solution diluée du produit pur, on prépare 11 de solution aqueuse à laquelle on ajoute 2,110 mg de vitamine B,_, pure. On ajoute 2 g de cuprocyanure tripotassique [Cu(CN)4]K., puis 3 g de sulfate de zinc dissous dans 30 cm3 d'eau distillée.
On laisse décanter, puis filtre en s'aidant d'une petite quantité de terre filtrante. Le filtrat est incolore et ne contient pas de vitamine B,_, décelable par titrage biologique. On redissout le précipité dans 25 cm3 d'une solution aqueuse de sel tétrasodique de l'acide éthylène-diamino-tétracétique. On filtre pour éliminer la terre filtrante, lave par 3 fois 5 em3 d'eau distillée que l'on joint au filtrat rouge et ajoute 20 g de sulfate d'ammonium et extrait la vitamine B, , par épui-
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sements répétés à l'alcool amylique pour obtenir la cyanocobalamine exempte d'impuretés minérales.
La solution amylique est ensuite épuisée par l'eau.
Le titrage de la vitamine B12, dans cette solution, montre qu'on a récupéré 2,104 mg de produit cris- tallisable directement par addition de 10 volumes de dioxane, soit un rendement de 99 %. b) La solution diluée est une matière naturelle A 101 de bouillon de culture de S. Olivaceus titrant 1500,( de vitamine B1. au litre, on ajoute 260 g de chlorure de calcium et agite pendant trois heures à 500 C pour provoquer la lyse du mycelium. Après filtration, on laisse refroidir à 1a température ambiante et ajoute 20 g de cuprocyanure tripotassi- que [Cu(CN4)]K;
j, agite jusqu'à dissolution et introduit, sous agitation, 30 g de sulfate de zinc dissous dans 300 cmf; d'eau distillée. On arrête l'agitation, laisse décanter une nuit et sépare le précipité sur filtre presse après addition d'un adjuvant de filtration (10 g de Hyflo-Super Cel) puis on lave sur filtre avec 31 d'eau distillée. Le filtrat, ainsi que les eaux de lavage, ne renferment plus de vitamine 131.2 décelable par titrage biologique.
Le précipité essoré est mis en suspension dans 250 crW d'eau distillée et on ajoute 100 g de sel tétrasodique de l'acide éthylène-diamino-tétracétique. Le filtrat, d'un volume de 300 cm3 environ renferme les 15 mg de vitamine Bic précédemment contenus dans 101 de bouillon. On ajoute de l'acide chlorhydrique jusqu'à pH 8,5 et extrait avec un mélange phénol-dichloréthane à plusieurs reprises. Les extraits, organiques réunis sont lavés à l'eau et les eaux de lavage sont jetées. On ajoute alors à l'extrait un volume égal de dichloréthane pour insolubiliser la vitamine 1312 et épuise à l'eau.
La solution aqueuse renferme, d'après le titrage spectrophotométrique, 14,5 mg de vitamine B1, soit un rendement quantitatif et se trouve ramenée à quelques dizaines de cm3. On la soumet à un traitement identique au précédent en utilisant 40 mg de cuprocyanure tripotassique et 60 mg de sulfate de zinc, et sépare la combinaison du complexe zincique. Le filtrat de celle-ci ne titre que 0,264 mg de vitamine B1=. On libère la vitamine B1 , comme il a été indiqué plus haut et la fait passer en phase organique puis en phase aqueuse comme indiqué plus haut.
On ajoute 10 volumes de dioxane et obtient 8 mg de vitamine Bit cristallisée en belles aiguilles rouges. Les eaux-mères renfermant le reste de la vitamine B1c peuvent être concentrées, précipitées et recristallisées à nouveau ce qui procure un deuxième jet important, ou plus simplement être ajoutées après élimination du solvant et détermination de leur titre (6 mg) à une nouvelle venue de vitamine B1= provenant de la deuxième précipitation par le cuprocyanure de zinc.
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Process for the preparation of crystallized vitamin B1 2 The object of the present invention is a new process for the preparation of vitamin B1 in crystallized form (or cyanocobalamin of formula CssH9oNl4O'l4PCo, the constitution of which was elucidated by TORD et al., Nature. , 1955 176, 328), from dilute aqueous solutions thereof, such as for example the culture broths of microorganisms which secrete it.
The process can also be applied to the isolation of vitamin B1 from other natural sources such as sewage sludge or liver extracts or from very dilute solutions of pure product.
It is known that the vitamin 1312 content of culture broths of the microorganisms which secrete it (and which are fungi belonging to the classes of Schizomycetes, Eumycetes and Myxomycetes, in particular Streptomycetes) is extremely low. It is generally of the order of a millionth.
The methods. known isolation processes proceed in successive stages, generally starting with a preliminary adsorption on activated carbon, an earth or ion exchange resin from which vitamin 1312 is eluted together with impurities of similar solubilities. Intermediate purifications are then carried out by countercurrent extraction with benzyl alcohol, or by alternating passage of vitamin BI, in a solvent immiscible with water and in water.
For this, the aqueous solutions are exhausted with a solvent or mixture of solvents insoluble in water, generally added a third. solvent in which vitamin B1 is insoluble and depletes in water. Solutions of vitamin 131.2 in substituted or unsubstituted phenols can be exhausted by aqueous pyridine. Finally, repeating the passages. in aqueous phase and organic phase, one arrives at a more complete purification of the product and proceeds to finish with a chromatography on alumina or on ion exchange resin which gives a solution of vitamin B ,, whose degree of purity is of around 90%. Precipitation with acetone, followed by one or more recrystallizations, generally results in the pure product.
As can be seen, the extreme dilution of the starting material and the low selectivity of the adsorption agent used, means that the adsorption agent which was used for the first treatment rarely contains more than 50 y of vitamin Bit per gram, that is to say 5 / 1000,000, which leads to multiple and diverse operations, requiring the use of different solvents and agents. adsorption on a large scale and handling large volumes sometimes involving expensive recoveries of solvents.
It is therefore advantageous to be able to have in industry a selective process making it possible to avoid these multiple operations involving large volumes.
The present invention, which therefore relates to a process for preparing vitamin 1312 in crystallized form from dilute aqueous solutions thereof, is characterized in that within said solution zinc cuprocyanide is formed which combines with vitamin B12, giving a compound insoluble in water, separates said vitamin Bh compound, releases vitamin B12 by the action of an agent capable of forming a water-soluble derivative with zinc,
extracts vitamin B1 2 with at least one solvent in order to rid it of mineral impurities, makes it go back to aqueous solution and precipitates it from its aqueous solution by adding a solvent in which it is insoluble.
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According to a particular form of the process according to the invention, in a culture broth in which the mycelium cells have been subjected to prior lysis, zinc cuprocyanide, a complex salt, which combines with vitamin B12 with formation of an insoluble derivative thereof. After a simple filtration or centrifugation, we find ourselves in the presence of a precipitate of very limited weight and volume from which it is possible to easily regenerate the vitamin B ,, by redissolving the precipitate formed in water by the action of 'a chelating agent which complexes zinc.
It is then sufficient to extract from this solution rich in mineral products vitamin B1n by a solvent or mixture of solvents from which it is passed through water again, repeating, if necessary, these last two operations. It is precipitated from this solution by addition of dioxane and the degree of purity is checked on an aliquot of the cyanocobalamin obtained.
If this degree is insufficient to allow direct recrystallization, the mixture is redissolved in water and the treatment is carried out a second time with zinc cuprocyanide and the precipitate obtained is treated as above. Both chromatography and operations involving large volumes are avoided.
The technical or scientific literature already mentions certain processes for the precipitation of vitamin B12 by reacting with concentrates of this product an alkaline cyanide and a soluble zinc salt, using, consequently, zinc cyanide and starting from a product previously concentrated by another treatment.
In contrast to this process, zinc cuprocyanide is used here, which together with vitamin B12 gives an insoluble combination in very dilute solutions or in a lysed culture broth. This reagent can be formed by first introducing into the solution containing vitamin B1,2 tri-potassium cuprocyanide [Cu (CN) 4] K3 and then a soluble zinc salt such as zinc sulfate or acetate.
As the examples show, zinc cuprocyanide not only allows the isolation of vitamin B12 from culture broths, but also its quantitative recovery from dilute solution of crystallized vitamin B,. On the other hand, if in the presence of such a solution potassium cyanide and a zinc salt are reacted, only small amounts of vitamin B,., Are isolated.
The tripotassium cuprocyanide used to make it react in the culture broth with a soluble zinc salt, is commercially available or is easy to prepare depending on. literature methods. Its formula is easily verifiable by chemical analysis or by physical methods. It is generally introduced into the lysed broth in such an amount that after addition of the stoichiometric amount or of a slight excess of a soluble zinc salt, the solubility limits of the zinc cuprocyanide formed in water are exceeded. .
A large excess of this reagent is therefore preferably used relative to vitamin B12, the solubility of zinc cuprocyanide being of the order of 0.5%. Of course, instead of first introducing the solution of tripotassium cuprocyanide and then the zinc salt into the culture broth or into another dilute solution of vitamin B, it is also possible to proceed in reverse.
Contrary to the adsorbate obtained when trying to precipitate vitamin B ,,, by the action of an alkaline cyanide on a zinc salt and from which it is extractable by solvents , here we get a chemical combination. Indeed, the action of solvents does not extract vitamin B1_ and better still, it is possible, by the action of dimethylform.amide, to extract the zinc cuprocyanide-vitamin B combination, = and to separate it from the coprecipitated zinc cuprocyanide . By adding acetone to this solution, the combination. precipitates unchanged.
For the industrial isolation of vitamin B, _ ,, we are generally satisfied with the crude precipitate obtained as has just been indicated. After filtration or centrifugation, it can be treated with the aqueous solution of a chelating agent such as the sodium salt of ethylenediamino-tetraacetic acid which complexes the zinc and then proceeds by extraction and redissolution in water from which the Vitamin B, _, is precipitated by dioxane as indicated at the start of the description.
In the examples which follow, others can be used for the reaction with tripotassium cuprocyanide. Zinc salts soluble in water than those mentioned or, use trisodium cuprocyanide, or alternatively, use other broth lysis agents than those indicated if they do not affect the solubility of the combination. Likewise, if it is more convenient to work at room temperature and without changing the pH of the broth, it can still be heated to around 800 or cooled to -F-5.1 or made slightly alkaline. Likewise, the filter aid can be changed by using products other than those mentioned.
Finally, we. may employ other zinc chelating agents than those indicated, in particular the trisodium salt of nitrilotriacetic acid or the trisodium salt of N-hydroxyethyl-ethylene-diamine-triacetic acid or other susceptible agents. to complex zinc in the form of water-soluble derivatives. Example a) From a dilute solution of the pure product, 11 of aqueous solution is prepared to which 2.110 mg of pure vitamin B 3 are added. 2 g of tripotassium cuprocyanide [Cu (CN) 4] K. Are added, then 3 g of zinc sulfate dissolved in 30 cm3 of distilled water.
Allowed to settle, then filtered with the help of a small amount of filtering earth. The filtrate is colorless and does not contain vitamin B, _, detectable by biological titration. The precipitate is redissolved in 25 cm 3 of an aqueous solution of tetrasodium salt of ethylenediamino-tetracetic acid. Filtered to remove the filter earth, washed with 3 times 5 em3 of distilled water which is joined to the red filtrate and added 20 g of ammonium sulfate and extract the vitamin B,, by exhaustion.
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repeated sessions with amyl alcohol to obtain cyanocobalamin free of mineral impurities.
The amyl solution is then exhausted with water.
Titration of vitamin B12 in this solution shows that 2.104 mg of crystallizable product was recovered directly by addition of 10 volumes of dioxane, ie a yield of 99%. b) The diluted solution is a natural material A 101 of S. Olivaceus culture broth titrating 1500, (of vitamin B1. per liter, 260 g of calcium chloride are added and stirred for three hours at 500 C to cause lysis mycelium After filtration, the mixture is allowed to cool to room temperature and 20 g of tripotassium cuprocyanide [Cu (CN4)] K;
j, stirred until dissolved and introduced, with stirring, 30 g of zinc sulfate dissolved in 300 cmf; of distilled water. Stirring is stopped, allowed to settle overnight and the precipitate is separated on a filter press after adding a filter aid (10 g of Hyflo-Super Cel) and then washed on filter with 31 of distilled water. The filtrate, as well as the washing waters, no longer contain vitamin 131.2 detectable by biological titration.
The drained precipitate is suspended in 250 cc of distilled water and 100 g of tetrasodium salt of ethylenediamino-tetracetic acid are added. The filtrate, with a volume of approximately 300 cm3, contains the 15 mg of vitamin Bic previously contained in 101 broth. Hydrochloric acid is added to pH 8.5 and extracted with a phenol-dichloroethane mixture several times. The combined organic extracts are washed with water and the washing water is discarded. An equal volume of dichloroethane is then added to the extract to insolubilize the vitamin 1312 and depleted with water.
The aqueous solution contains, according to the spectrophotometric titration, 14.5 mg of vitamin B1, ie a quantitative yield and is reduced to a few tens of cm3. It is subjected to a treatment identical to the previous one using 40 mg of tripotassium cuprocyanide and 60 mg of zinc sulfate, and the combination of the zinc complex is separated. The filtrate thereof only titrates 0.264 mg of vitamin B1 =. Vitamin B1 is released, as indicated above, and passed to the organic phase and then to the aqueous phase as indicated above.
10 volumes of dioxane are added and 8 mg of vitamin Bit crystallized in beautiful red needles are obtained. The mother liquors containing the rest of the vitamin B1c can be concentrated, precipitated and recrystallized again, which provides a second important jet, or more simply be added after removal of the solvent and determination of their titer (6 mg) to a new arrival. of vitamin B1 = from the second precipitation by zinc cuprocyanide.