Procédé de préparation de nouveaux composés à action thérapeutique, dérivant du suc pancréatique La présente invention a pour objet un procédé de préparation de nouveaux composés à action thérapeutique, dérivant du suc pancréatique.
Ce pro cédé est caractérisé en ce que l'on traite du pancréas frais, de préférence dégraissé, haché à l'état de pulpe, par un solvant formé au moins en partie d'éther di- éthylique, de préférence sous agitation intermittente, puis en ce que l'on sépare mécaniquement, par exem ple par centrifugation, d'une part le solvant éthéré chargé de lipides, d'autre part la pulpe, et d'autre part encore le suc pancréatique, et en ce que l'on traite celui-ci par du sulfate d'ammonium à raison de 20 g environ de sulfate d'ammonium par litre de suc,
en ce que l'on filtre le précipité obtenu, cons titué au moins en partie par des glucoprotéines com portant des restes d'acide sulfurique provenant du sulfate d'ammonium et fixés sur la partie glucidique desdites glucoprotéines, et en ce que l'on répète ledit traitement avec 20 g/1 environ de sulfate d'ammo nium et la filtration subséquente du précipité jusqu'à saturation du suc pancréatique par ledit sulfate. L'en semble de ces opérations est avantageusement effec tué à une température comprise entre 15 et 250 C, et de préférence entre 18 et 22o C.
La séparation du suc pancréatique s'effectue dans les meilleures conditions en observant les prescrip tions suivantes 1) le pancréas est traité dans les deux heures qui suivent l'abat de l'animal. Toutefois, si le pancréas est mis aussitôt en glacière et main tenu aux environs de 00 à 2o C, le traitement peut être retardé, par exemple jusqu'à 48 heures après l'abat ; 2) le pancréas est soigneusement dégraissé avant de le hacher ; cette opération a pour but d'éviter la dissolution des graisses par l'éther diéthylique qui entraînerait une consomma- tion inutile de ce dernier.
Ce dégraissage peut être effectué, par exemple, au couteau ; 3) le pancréas est haché très fin, pour donner une pulpe ayant une dimension moyenne de grains de 1 à 2 mm. Grâce à cette disposition, le traitement à l'éther diéthylique donne une exolyse complète ; 4) pour le traitement à l'éther, on emploie envi ron 1 litre d'éther pour 2 kg de pulpe de pancréas. Toutefois, cette proportion peut varier dans de larges limites car elle dépend en particulier de l'état histologique du pan créas au moment de l'abat (nourriture, diges tion, ... ).
La proportion indiquée est une pro portion qui, en moyenne, donne satisfaction, c'est-à-dire assure une exolyse complète des enzymes sans trop grand excès d'éther ; 5) le traitement à l'éther est effectué sous agita tion intermittente, par périodes de 10 à 20 minutes d'agitation, suivies de 10 à 20 minu tes de repos, pendant 3 à 6 heures environ.
Selon une méthode qui a donné satisfaction à l'expérience ceci peut être réalisé dans une sorte de baratte en forme de tonnelet rotatif autour d'un axe transversal, et dans lequel sont placés des moyens, tels qu'une grille fixe, propres à briser tout agglomé rat quand la baratte tourne.
Pendant cette phase du procédé, les enzymes exsudent lentement des cellules (exolyse). 6) L'éther diéthylique peut être mélangé à d'au tres solvants, notamment l'acétone.
7) On distille l'extrait éthéré, ce qui permet de recueillir d'une part des lipides utiles et d'au tre part l'éther qui peut être recyclé. De la pulpe on sépare également, en même temps que l'éther ou après celui-ci, le suc pancréatique.
On obtient en général 3 à 3,5 litres de suc pan- créatique pour 12 kg de pancréas traité.
L'opération de précipitations successives par le sulfate d'ammonium de préférence sera exécutée de la façon suivante On dissout du sulfate d'ammonium dans le suc pancréatique à raison de 20 g/litre environ, ce qui donne un précipité que l'on filtre.
On dissout dans le filtrat (solution après filtra tion) une nouvelle quantité de 20 g/litre de sulfate d'ammonium, ce qui donne un second précipité que l'on filtre.
La même opération est ainsi répétée jusqu'à satu ration, c'est-à-dire jusqu'à ce que le sulfate d'ammo nium ne se dissolve plus, c'est-à-dire, d'ordinaire, environ 25 fois.
Les différents précipités obtenus sont tous doués de propriétés enzymatiques ; ils peuvent être caracté risés par leur pouvoir enzymatique. Ils sont distincts les uns des autres et présentent chacun un intérêt thérapeutique.
Ces précipités ou fractions sont avantageusement déshydratés au-dessous de 500 C, par exemple sous vide, et utilisés sous forme pulvérulente. Les pou dres obtenues seront soigneusement conservées à l'abri de l'humidité.
L'étude chimique et spectrographique des préci pités obtenus comme décrit ci-dessus a démontré qu'ils sont des produits de la réaction du sulfate d'ammonium avec des glucoprotéines. Ils donnent une réaction de Molish intense, ils précipitent par l'acétone et l'acide flavianique, mais non par la tri- chloracétine ni l'acide picrique. La réaction de Millon est positive et celle des pentoses négative. Donc au départ ces protéines sont dénuées de soufre dans leur structure.
Ces protéines comprennent un groupe hétéros.i- dique constitué par une hexosaminedigalactose isola ble sous forme de méthylphénylhydrazone.
Les précipités 4 et 11 de la série des 25 précipi tations ont été soumis à une analyse spectrale dans l'infrarouge, après avoir été soigneusement débarras sés du sel précipitant, par dialyse. Cette dialyse a été poursuivie jusqu'à ce que toute trace de sulfate d'ammonium ait disparu dans l'eau distillée du dialy seur. Les fractions ont été ensuite déshydratées à nouveau.
L'analyse montre les raies caractéristiques des restes d'acide sulfurique combiné. Ces restes sont liés à la partie saccharide de la glucoprotéine entre l'amine de l'hexosamine et le galactose; et, en effet, une partie de ces restes sacchades ne subit plus la transformation osonique du fait de son blocage par le reste acide sulfurique.
Pour la mise en oeuvre du présent procédé, on pourra utiliser des appareillages de natures diverses. On a toutefois utilisé avec succès a) pour le traitement à l'éther diéthylique, un tonnelet cylindrique, de hauteur égale à son diamètre, au couvercle duquel est fixée une grille de tiges métalliques dirigée vers l'inté rieur du tonnelet et s'étendant sur les E/, de sa hauteur, ledit tonnelet étant animé d'un mouvement intermittent (voir plus haut) de rotation autour d'un axe transversal (perpen diculaire à l'axe du tonnelet), avec une vitesse de 25 à 28 tours/min.
b) comme appareil de séparation mécanique pulpe-phases liquides. un séparateur à dis ques du type connu dans le commerce sous la marque de fabrique Alfa-Laval ou un cen trifugeur à godets du type connu dans le commerce sous la marque Jouan .
Ces appareils opèrent directement la séparation des trois phases (éther, suc, pulpe). On peut, soit les recharger continuellement jusqu'à un engorgement, soit opérer par quantités successives correspondant à la capacité de l'appareil.
Le procédé ci-dessus décrit est particulièrement applicable au pancréas du porc qui donne dies pro duits d'autant plus intéressants que le porc est un animal omnivore (herbivore secondairement carni vore). Il va de soi que le procédé s'applique aux pan créas d'autres espèces animales, mais que les gam mes des produits obtenus ne seront pas nécessaire ment identiques ou même comparables.
Process for preparing new compounds with therapeutic action, derived from pancreatic juice The present invention relates to a process for preparing new compounds with therapeutic action, derived from pancreatic juice.
This process is characterized in that the fresh pancreas, preferably defatted and chopped in the pulp state, is treated with a solvent formed at least in part from diethyl ether, preferably with intermittent stirring, then in that one separates mechanically, for example by centrifugation, on the one hand the ethereal solvent loaded with lipids, on the other hand the pulp, and on the other hand also the pancreatic juice, and in that one treats the latter with ammonium sulphate at a rate of approximately 20 g of ammonium sulphate per liter of juice,
in that one filters the precipitate obtained, constituted at least in part by glucoproteins comprising residues of sulfuric acid originating from ammonium sulfate and fixed on the carbohydrate part of said glucoproteins, and in that one repeats said treatment with about 20 g / l of ammonium sulfate and the subsequent filtration of the precipitate until saturation of the pancreatic juice with said sulfate. All of these operations are advantageously carried out at a temperature between 15 and 250 ° C., and preferably between 18 and 22 ° C.
The separation of the pancreatic juice is carried out under the best conditions by observing the following prescriptions 1) the pancreas is treated within two hours of the slaughter of the animal. However, if the pancreas is immediately placed in a cooler and held at around 00 to 2o C, the treatment may be delayed, for example up to 48 hours after the slaughter; 2) the pancreas is carefully defatted before chopping it; the purpose of this operation is to avoid the dissolution of the fats by the diethyl ether, which would lead to unnecessary consumption of the latter.
This degreasing can be carried out, for example, with a knife; 3) the pancreas is chopped very fine, to give a pulp with an average grain size of 1 to 2 mm. Thanks to this arrangement, the treatment with diethyl ether gives complete exolysis; 4) for the ether treatment, approximately 1 liter of ether is used per 2 kg of pancreatic pulp. However, this proportion can vary within wide limits because it depends in particular on the histological state of the pan crea at the time of slaughter (food, digestion, etc.).
The proportion indicated is a pro portion which, on average, gives satisfaction, that is to say ensures complete exolysis of the enzymes without too great excess of ether; 5) the ether treatment is carried out with intermittent stirring, for periods of 10 to 20 minutes of stirring, followed by 10 to 20 minutes of rest, for about 3 to 6 hours.
According to a method which has given satisfaction to the experiment, this can be carried out in a sort of churn in the form of a barrel rotating around a transverse axis, and in which are placed means, such as a fixed grid, suitable for breaking. all agglomerated rat when the churn spins.
During this phase of the process, enzymes slowly exude from the cells (exolysis). 6) Diethyl ether can be mixed with other solvents, in particular acetone.
7) The ethereal extract is distilled, which makes it possible to collect on the one hand useful lipids and on the other hand the ether which can be recycled. Pancreatic juice is also separated from the pulp, at the same time as or after the ether.
In general, 3 to 3.5 liters of pancreatic juice are obtained for 12 kg of treated pancreas.
The operation of successive precipitations by ammonium sulphate preferably will be carried out as follows: Ammonium sulphate is dissolved in the pancreatic juice at a rate of approximately 20 g / liter, which gives a precipitate which is filtered. .
A further 20 g / liter of ammonium sulfate is dissolved in the filtrate (solution after filtration), which gives a second precipitate which is filtered.
The same operation is thus repeated until saturation, that is to say until the ammonium sulfate no longer dissolves, that is to say, usually about 25 times. .
The various precipitates obtained are all endowed with enzymatic properties; they can be characterized by their enzymatic power. They are distinct from each other and each have a therapeutic interest.
These precipitates or fractions are advantageously dehydrated below 500 ° C., for example under vacuum, and used in powder form. The powders obtained should be carefully stored away from humidity.
The chemical and spectrographic study of the precipitates obtained as described above has demonstrated that they are products of the reaction of ammonium sulfate with glucoproteins. They give an intense Molish reaction, they precipitate with acetone and flavianic acid, but not with trichloroacetin or picric acid. The Millon reaction is positive and that of the pentoses negative. So initially these proteins are devoid of sulfur in their structure.
These proteins include a heteroid group consisting of a hexosaminedigalactose isolable in the form of methylphenylhydrazone.
Precipitates 4 and 11 of the precipitation series were subjected to infrared spectral analysis, after having been carefully freed of the precipitating salt, by dialysis. This dialysis was continued until all traces of ammonium sulfate had disappeared in the distilled water of the dialysis machine. The fractions were then dehydrated again.
The analysis shows the characteristic lines of the remains of combined sulfuric acid. These residues are linked to the saccharide part of the glucoprotein between the amine of the hexosamine and the galactose; and, in fact, part of these sacchad residues no longer undergoes the osonic transformation due to its blockage by the sulfuric acid residue.
For the implementation of the present method, it is possible to use apparatus of various kinds. However, a) has been successfully used for the treatment with diethyl ether, a cylindrical barrel, of height equal to its diameter, to the cover of which is fixed a grid of metal rods directed towards the interior of the barrel and extending on the E /, of its height, said barrel being driven by an intermittent movement (see above) of rotation about a transverse axis (perpendicular to the axis of the barrel), with a speed of 25 to 28 turns / min.
b) as a mechanical pulp-liquid phase separation device. a disc separator of the type known commercially under the trademark Alfa-Laval or a bucket cen trifuge of the type known commercially under the brand Jouan.
These devices operate directly the separation of the three phases (ether, juice, pulp). It is possible either to recharge them continuously until they become blocked, or to operate in successive quantities corresponding to the capacity of the device.
The method described above is particularly applicable to the pancreas of the pig, which gives products which are all the more interesting as the pig is an omnivorous animal (secondarily carni vore herbivore). It goes without saying that the process applies to pan crea of other animal species, but that the ranges of the products obtained will not necessarily be identical or even comparable.