CH238922A - Procédé de préparation d'une substance ayant une activité bactériostatique. - Google Patents

Description

  Procédé de préparation d'une substance ayant une activité     bactériostatique.       Cette invention concerne un procédé de  préparation d'une substance bactériostatique.  



  Généralisant les travaux de Fleming,       13rit.    J.     exp.        Path    1929, 10, 226,     Maclean     Rogers and Fleming,     Lancet    1939, 1, 562, et  d'autres, Chain, Florey, Gardner,     Heatley,          Jennings,        Orr-Ewing    et     Sanders,        Lancet    1940,  2, 226, et à nouveau,     Abraham,    Gardner,  Chain     Reatley,    Fletcher,     Jennings    et Florey,       Lancet,    1941, 2, 177, ont décrit une méthode  par laquelle on peut isoler,

   lors de la crois  sance du     Penicillium        notatum    dans un bouil  lon de culture de     Czapek-Dox        contenant    4%  de glucose, une substance antibactérienne  qui a été appelée     penicilline.     



  Pendant la fermentation effectuée selon  la méthode décrite dans la littérature citée,  la concentration des ions hydrogènes du bouil  lon de culture, après avoir eu une tendance  initiale de courte     durée    à rendre le     milieu     acide, diminue     jusqu'à    la neutralité ou même  au delà. Lorsque la     fermentation    est com  plète, la     penicilline,    qui est soluble d'ans les    solvants organiques, est extraite du bouillon  neutre ou alcalin avec de l'acétate d'amyle,  avec un rendement d'environ 0,013 g de       penicilline    par litre de bouillon de culture.  



  On a trouvé que si l'on utilise une espèce  de     Penicillium        notatum    sélectionnée selon     ce     qu'on expliquera plus complètement ci-des  sous, la     concentration    en ions hydrogène  reste telle que le milieu est     maintenu    acide  pendant un temps plus long, en fait 14 jours  ou     plus    encore, pendant le développement de  la culture de     penicillium    et     une    substance  peut être isolée du     milieu    acide, ayant une       puissante    action bactériologique, c'est-à-dire       qui    inhibe la croissance des bactéries,

   mais  qui est à d'autres points de vue fondamen  talement .différente de la     penicilline        sus-          indiquée,    puisqu'elle est, par exemple, inso  luble ou faiblement soluble dans les solvants  organiques ordinaires; la substance est en  outre obtenue avec de meilleurs rendements  que la     penieilline.     



  La présente     invention    concerne donc un      procédé pour préparer une substance ayant  une action bactériostatique. Il est caractérisé  par le fait qu'avec une espèce sélectionnée de       Penicillium        notatum,    qui a la propriété, lors  qu'il croît dans un milieu légèrement acide  de     Czapek-Dox    contenant 4      Jo    de glucose, de  maintenir le pH de ce milieu en dessous de 7  pendant le développement du ferment, on en  semence un milieu de culture approximative  ment neutre et dont le pH diminue sous l'ac  tion du ferment, en laissant se développer le  ferment en milieu acide,

   et qu'on isole du  filtrat de culture acide un principe bactério  statique insoluble ou seulement peu soluble  dans les solvants organiques ordinaires tels  que l'acétone et l'acétate d'amyle, et qui est  une flavoprotéine.  



  La sélection d'une espèce convenable de  ferment joue un rôle important; si elle n'est  pas faite, la substance cherchée ne se forme  pas. Une espèce convenable de     Penicillium          notatum    peut être obtenue en sélectionnant,  dans une culture de ferments, les colonies qui  produisent une substance ayant une puissante  action inhibitrice sur les bactéries     Gra.m-          positives    en présence de glucose. Les bactéries  Gram-positives sont celles qui se colorent  lorsqu'elles sont traitées par du violet de  méthyle, puis par une solution d'iode-iodure  de potassium et enfin par de l'acétone ou par  de l'alcool éthylique.

   Les colonies sélection  nées sont     ensuite    cultivées dans un milieu de       Czapek-Dox    contenant 4     ro    de glucose et l'on  examine l'activité bactériostatique et la, solu  bilité des     principes    actifs dans les solvants    organiques des filtrats de la culture. On sé  lectionne alors pour les utiliser les espèces  dont les filtrats de culture ont montré avoir  la plus grande action bactériostatique et dont  le principe actif du filtrat ne peut pas être  extrait par des solvants organiques.  



  Dans la préparation du produit bactério  statique selon l'invention, un milieu de  culture approprié, par exemple un     Czapek-          Dox    contenant     4/11ô'    de glucose, est stérilisé  puis ensemencé de l'espèce sélectionnée, que  l'on laisse se développer de préférence à       20     C environ de la manière ordinaire jus  qu'à ce qu'il ne reste que peu de glucose, en  général 8 à 14 jours approximativement. Pen  dant le développement, le pH du milieu di  minue, jusqu'à ce qu'il atteigne environ 3,5  après 3 ou 4 jours, et demeure à cette valeur  pour le reste du temps du développement.

   Si  toutefois le temps de développement était  exagérément prolongé, le milieu deviendrait  alcalin et la     substance    bactériostatique cher  chée serait finalement perdue.  



  Le principe bactériostatique est alors  isolé du filtrat de la culture, par exemple, en  concentrant ce filtrat par évaporation sous  pression réduite ou par élimination par con  gélation d'une partie de l'eau, puis en préci  pitant ledit principe de la solution concentrée  par un solvant organique.  



  Le procédé peut être mis en     oeuvre,    par  exemple, de la façon suivante:  On prépare un bouillon de culture de       Czapek-Dox;    celui-ci a la composition sui  vante:  
EMI0002.0020     
  
    Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> g
<tb>  Phosphate <SEP> acide <SEP> de <SEP> potassium <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> 1 <SEP> g
<tb>  Chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>  Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> cristallisé <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>  Sulfate <SEP> de <SEP> fer <SEP> cristallisé <SEP> selon <SEP> Pharmacopée <SEP> anglaise <SEP> . <SEP> .

   <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb>  Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 40 <SEP> g
<tb>  Eau <SEP> distillée <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1000 <SEP> cm'       Ce milieu a un pH approximatif de 6,5;  on le stérilise, par exemple, en le passant à  la vapeur pendant 11/2 h. ou en le mettant  30 minutes à l'autoclave à 115 .

      Les cultures de     Penicillium        notatum    sont  faites sur de     l'agar    nutritif ordinaire et on  sélectionne dans celles-ci les colonies produi  sant une     substance    qui inhibe puissamment      les     bactéries        Gram-positives    en présence de  glucose. On élève alors dans les     bouillons    de  culture indiqués ci-dessus les colonies qui  ont le plus grand pouvoir inhibiteur et on  examine le pouvoir bactériostatique des fil  trats de ces cultures, puis on vérifie l'insolu  bilité du principe actif des filtrats dans les       solvants    organiques.  



  On choisit pour la pratique les     cultures     dont les filtrats ont le plus fort pouvoir bac  tériostatique et dont le principe     actif    est le  plus insoluble dans les solvants organiques.  Les     cultures    réussies ont en général une  teinte gris-vert pâle sur la surface du haut et  blanche ou jaune à la     surface    inférieure.  



  Des prises de 450 à 500 cm' d'un milieu  de culture ayant la composition ci-dessus  indiquée sont introduites dans des bouteilles  de flint     glass    blanc de<B>1250</B> g qui sont alors  bouchées avec de l'ouate et stérilisées dans la  vapeur 11/2 h.; on ensemence ensuite ces  prises d'une culture de l'espèce de     penicillium     qui a été     sélectionnée    de la manière décrite  et     qui    s'est développée pendant environ 14  jours sur une couche peu épaisse du même  milieu de culture.

   On laisse la culture se dé  velopper     à,    environ 20  en couches peu pro  fondes dans des bouteilles qui sont placées  sur     leurs    côtés, jusqu'à ce que, par des essais       bactériologiques,    on décèle la présence du  principe bactériostatique à une forte concen  tration et qu'il ne reste que peu de glucose.  



  Le pH du     milieu    est d'environ 6,5 % au       début;    après 3 ou 4 jours, il tombe à environ  3,5 et reste à cette valeur pendant tout le  temps du développement, qui dure de 8 à 14  jours. Une même croissance des ferments  apparaît à la surface du milieu     en,    3 ou 4  jours, ceux-ci se développant graduellement  et sont de couleur blanche au début     puis     virent souvent au gris-vert pâle.  



  Lorsque la liqueur a une action bacté  riostatique convenable et contient peu de  glucose, elle est décantée du mélange et fil  trée. Le filtrat peut être conservé à basse  température en y ajoutant de préférence une  substance protectrice, par exemple 1     cm@    par  litre de chloroforme.

      On isole le principe actif de préférence en  concentrant le filtrat soit par évaporation en  le     réduisant    au-dessous du     cinquième    de son  volume, autant que possible à une tempéra  ture inférieure à 26  et sous pression réduite,  soit par congélation et     élimination    de l'eau  dans le filtrat de la     culture,        puis    en précipi  tant le principe actif de la solution concen  trée par un solvant organique, de préférence  par l'acétone.

   Ainsi, par exemple, l'isolement  de la substance     active    du filtrat de la culture  obtenue par fermentation, comme     indiqué        ci-          dessus,    dans un     milieu    acide, peut être fait  en refroidissant le filtrat de la culture dans       un    mélange réfrigérant en agitant et en sé  parant l'eau congelée sous forme d'une molle  pâte de     cristaux    de glace     qui    est éliminée par       filtration    sur un filtre convenablement re  froidi.

   Le filtrat est à nouveau congelé et  toutes les     opérations    sont répétées en tout       cinq    fois, en sorte que le volume du filtrat       final    représente environ le     cinquième    du vo  lume du     filtrat    de la culture employée. Le       filtrat    final est alors précipité par l'adjonc  tion de son triple volume d'un solvant misci  ble dans l'eau, par exemple l'acétone. Le  principe actif brut se sépare alors sous forme  d'un solide     volumineux    et amorphe.

   On peut       obtenir    ultérieurement encore une     certaine     quantité de substance en fondant les     cristaux     de glace et en opérant par précipitation frac  tionnée avec un solvant selon la manière dé  crite     ci-dessus.     



  Les données     quantitatives    fournies dans  les exemples ci-dessus ont uniquement pour  but de montrer un mode de réalisation du  procédé, et il est bien entendu que des modi  fications peuvent y être apportées lorsqu'on  l'exécute, par exemple, en     éliminant    une  quantité d'eau variable et en ajoutant di  verses quantités de solvant à un filtrat de       culture        d'une    activité différente; d'autres       milieux    de culture peuvent être     utilisés    ayant  une     composition    autre que celle     indiquée     dans l'exemple cité.  



  La substance active brute peut être puri  fiée par     dissolution    dans l'eau et     reprécipita-          tion    avec l'acétone et par     trituration    - avec      l'acétone, l'alcool, l'éther ou d'autres solvants  organiques convenables.  



  La substance ainsi obtenue est un solide  amorphe, hygroscopique, jaunâtre ou brun  clair, qui a une action antibactérienne au  moins aussi grande que la     penicilline,    quoi  que ses autres propriétés soient très diffé  rentes de celles de ce produit, que l'on trouve  dans la littérature citée plus haut. Ainsi, la  substance ne peut pas être extraite par  l'acétate d'amyle d'une solution aqueuse  acide, elle est insoluble ou seulement peu  soluble dans les solvants organiques tels que  l'acétone et l'acétate d'amyle, mais est     solu=          ble    dans l'eau, y formant une solution légère  ment trouble à réaction acide. Le rendement  est d'au moins 0,5 g du produit par litre de  filtrat de culture; il est d'une très grande  efficacité bactériostatique.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation d'une substance ayant une activité, bactériostatique, caracté risé par le fait qu'avec une espèce sélection née de Penicillium notatum, qui a la pro priété, lorsqu'il croît dans un milieu légère ment acide de Czapek-Dox contenant 4 % de glucose, de maintenir le pH de ce milieu en dessous de 7 pendant le développement du ferment, on ensemence un milieu de culture approximativement neutre et dont le pg di minue sous l'action du ferment, en laissant se développer le ferment en milieu acide,

   et qu'on isole du filtrat de culture acide un principe bactériostatique insoluble ou seule ment peu soluble dans les solvants organiques ordinaires tels que l'acétone et l'acétate d'amyle, et qui est une flavo-protéine. SOUS-REVENDICATIONS: 1. Procédé selon la revendication, carac térisé par le fait que le px initial du milieu de culture est d'environ 6,5 et passe à 3,5 après le développement du ferment. 2. Procédé selon la revendication, carac térisé par le fait que le milieu de culture est un milieu de Czapek-Dox contenant 4 de glucose. 3.

   Procédé selon la revendication, carac térisé par le fait que l'espèce requise de Penieillium notatum est obtenue: a) en sélectionnant dans une culture de ferments les colonies qui ont un fort pouvoir inhibiteur sur les bactéries Gram-positives en présence de glucose, b) en faisant des cultures des meilleures colonies sur un milieu de Czapek-Dox conte- ; nant environ 4 % de glucose, c) en sélectionnant enfin les cultures dont les filtrats ont un fort pouvoir bactériosta tique et dont le principe actif n'est pas extrac tible avec des solvants organiques. 4.

   Procédé selon la revendication, carac térisé par le fait que la concentration du principe bactériostatique est effectuée par évaporation du filtrat de la culture sous pres sion réduite. 5. Procédé selon la revendication, dans lequel la concentration du principe bactério statique est effectuée en éliminant une partie de l'eau par congélation. 6. Procédé selon la revendication et la sous-revendication 4, caractérisé par le fait que l'isolement du principe bactériostatique est effectué en précipitant la solution concen trée par un solvant organique soluble dans l'eau. 7.

   Procédé selon la revendication et la sous-revendication 5, caractérisé par le fait que l'isolement du principe bactériostatique est effectué en précipitant la solution concen trée par un solvant organique soluble dans l'eau. 8. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 4 et 6, caractérisé par le fait que le solvant organique utilisé est l'acétone. 9. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 5 et 7, caractérisé par le fait que le solvant organique utilisé est l'acétone.