<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention se rapporte à un procédé de production par fermentation de l'antibiotique tétracycline et de certains autres antibio- tiques. Elle concerne en particulier, la production de ces antibiotiques utiles par culture d'une nouvelle espèce de microorganismes dans des solu- tions nutritives et dans des conditions aérobies.
Le présent procédé offre certains avantages sur d'autres procédés de production de tétracycline et, en outre, fournit d'autres antibiotiques de valeur, notamment le composé appelé antibiotique P.A. 121.
On a trouvé qu'une nouvelle espèce de Streptomyces qui a été appe- lée Streptomyces fuscofaciens sp. nov., cultivée dans des milieux nutritifs et dans des conditions aérobies donne l'antibiotique tétracycline. Pour que cette nouvelle espèce de Streptomyces puisse servir à des comparaisons, on a"déposé des cultures de cet organisme à l'American Type Culture Collec- tion, 2029 M Street, N.W. Washington, D.C. et ces cultures ont été ajoutées aux collections de microorganismes sous le n ATCC 12061. Dans la collec- tion de cultures de Chas Pfizer & Co., Inc., cette culture est identifiée par E66-D.
Les caractéristiques de culture de cette espèce, sur la base de l'é- chantillon E66-D sont données ci-dessous sous forme de tableau (les couleurs accompagnées d'un R sont celles de l'ouvrage de Riggway,Color Standards and Nomenclature).
Caractéristiques de culture ATCC n 12061
EMI1.1
<tb> Milieu <SEP> Importance <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques.
<tb>
<tb>
<tb> du <SEP> dévelop- <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯¯ <SEP> pement <SEP> spores <SEP> ¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> Faible <SEP> à <SEP> Pas <SEP> (sur <SEP> Pourpre <SEP> Développement <SEP> principalement <SEP> sous
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Aspara- <SEP> modéré <SEP> verre <SEP> à <SEP> brunâtre <SEP> la <SEP> surface;
<SEP> mycélium <SEP> même <SEP> couleur
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> gine <SEP> vitre, <SEP> (voisin <SEP> que <SEP> pigment <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> rare, <SEP> de <SEP> gris
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> blanc <SEP> foncé <SEP> vi-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> grisâtre)- <SEP> neux <SEP> R)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Lait <SEP> Faible <SEP> ou <SEP> Pas <SEP> de <SEP> Gris <SEP> la- <SEP> Ni <SEP> coagulation <SEP> ni <SEP> peptonisation
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> écrémé <SEP> faible <SEP> à <SEP> mycélium <SEP> vande <SEP> ni <SEP> hydrolyse; <SEP> pH <SEP> passe <SEP> de <SEP> 6,4 <SEP> à
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> modéré <SEP> aérien;
<SEP> (gris <SEP> 7,0.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> anneaux <SEP> brunâtre
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> jaune <SEP> R <SEP> clair
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> brunâtre <SEP> à <SEP> gris
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> brun <SEP> souris
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> noirâtre <SEP> clair <SEP> R)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (brun <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Buckthorn
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R <SEP> à <SEP> marron
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R <SEP> à <SEP> presque
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> noir)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> Bon <SEP> Pas <SEP> Brun <SEP> Surface <SEP> cireuse; <SEP> partie <SEP> inférieure
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> noirâtre <SEP> de <SEP> la <SEP> culture <SEP> légèrement <SEP> méruliol-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> ;
<SEP> bords <SEP> lichenoides <SEP> et <SEP> à <SEP> convo-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lutins <SEP> radiales <SEP> à <SEP> mérulioldes;
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mycélium <SEP> végétatif <SEP> brun <SEP> très <SEP> foncé
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> avec <SEP> petites <SEP> zones <SEP> brun <SEP> rouge;
<SEP> en-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> vers <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> (cannelle <SEP> R <SEP> à <SEP> pres-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> que <SEP> Sépia <SEP> chaud <SEP> R)
<tb>
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
<tb> Milieu <SEP> Importance <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> du <SEP> dévelop- <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
EMI2.2
pement spores ¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI2.3
<tb> Agar <SEP> Faible <SEP> à <SEP> Pas <SEP> Presque <SEP> Développement <SEP> en <SEP> petites <SEP> co-
<tb>
<tb>
<tb> nutritif <SEP> modéré <SEP> rosâtre <SEP> lonies <SEP> isolées; <SEP> mycélium <SEP> végé-
<tb>
<tb>
<tb> (cannelle <SEP> tatif <SEP> rougeâtre <SEP> (rouge <SEP> vineux
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R) <SEP> R);
<SEP> plusieurs <SEP> colonies <SEP> jaune
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pâle
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> Faible <SEP> Pas <SEP> Brunâtre <SEP> Développement <SEP> sous <SEP> la <SEP> surface
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> synthé- <SEP> clair <SEP> pénétrant <SEP> à <SEP> une <SEP> profondeur <SEP> mo-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> tique <SEP> dérée, <SEP> mycélium <SEP> végétatif
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> translucide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Calcium <SEP> Faible <SEP> Pas <SEP> Rosâtre <SEP> Pas <SEP> de <SEP> digestion <SEP> du <SEP> malate;
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Malate <SEP> pâle <SEP> mycélium <SEP> végétatif <SEP> transluci-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> de <SEP> à <SEP> rouge <SEP> vineux <SEP> (brun <SEP> Pecan
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> R)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cellulose <SEP> Très <SEP> faible
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Tranches <SEP> Bon <SEP> Pas <SEP> Gris <SEP> ou <SEP> Surface <SEP> mérulioîde <SEP> à <SEP> dédéloï-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> pomme <SEP> pourpre <SEP> de <SEP> sur <SEP> plusieurs <SEP> tranches, <SEP> ci-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> terre <SEP> grisâtre <SEP> reuses;
<SEP> mycélium <SEP> végétatif <SEP> oli-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> intense <SEP> ve <SEP> grisâtre <SEP> et <SEP> jaunâtre <SEP> ou
<tb>
<tb>
<tb> (brun <SEP> brun-pourpre <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> fon-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Benzo <SEP> R <SEP> cé <SEP> (olive <SEP> brunâtre <SEP> clair <SEP> R <SEP> et
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ou <SEP> ardoise <SEP> jaune <SEP> miel <SEP> R <SEP> ou <SEP> noisette <SEP> R
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> vineux <SEP> R <SEP> à <SEP> à <SEP> gris <SEP> brunâtre <SEP> R <SEP> à <SEP> brun <SEP> can-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ardoise <SEP> hé- <SEP> nelle <SEP> R <SEP> à <SEP> brun <SEP> noirâtre) <SEP> o-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> liotrope <SEP> deur <SEP> rappellant <SEP> légèrement
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> intense <SEP> R) <SEP> l'écorce <SEP> de <SEP> cannelle.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Plaques <SEP> Faible <SEP> à <SEP> Pas <SEP> Bleu <SEP> en- <SEP> Mycélium <SEP> même <SEP> couleur <SEP> que <SEP> le
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'amidon <SEP> modéré <SEP> cre <SEP> clair <SEP> pigment <SEP> soluble <SEP> ;
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> principalement <SEP> sous <SEP> la <SEP> surfa-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ce, <SEP> zone <SEP> d'hydrolyse <SEP> de <SEP> l'ami-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> don <SEP> 3,6-4,4 <SEP> cm <SEP> de <SEP> diamètre
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Plaques <SEP> Faible <SEP> Pas <SEP> Brun <SEP> rosâ- <SEP> Pas <SEP> de <SEP> liquéfaction;
<SEP> colonies
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> géla- <SEP> tre <SEP> plates <SEP> ou <SEP> légèrement <SEP> en <SEP> relief
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> tine <SEP> mycélium <SEP> végétatif <SEP> crème <SEP> gri-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sâtre <SEP> ou <SEP> brun <SEP> grisâtre <SEP> (sem-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> blable <SEP> au <SEP> brun <SEP> Véronèse <SEP> R)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> Faible <SEP> Pas <SEP> Jaunâtre <SEP> Pas <SEP> de <SEP> réduction <SEP> du <SEP> nitrate.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Nitrate <SEP> faible <SEP> ' <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Bouillon
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> Bon <SEP> Pas <SEP> D'abord <SEP> Surface <SEP> cireuse <SEP> ; <SEP> bords <SEP> à <SEP> fines
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'Emer- <SEP> vert-bleuâ- <SEP> convolutions <SEP> radiales <SEP> mycélium
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> son <SEP> tre, <SEP> finale- <SEP> végétatif <SEP> et <SEP> envers <SEP> brun <SEP> noi-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ment <SEP> noir <SEP> râtre <SEP> à <SEP> l'exception <SEP> des <SEP> bords
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> de <SEP> plusieurs <SEP> petites <SEP> zones
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> brun <SEP> clair
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Asparagi- <SEP> Bon <SEP> Pas <SEP> Brun <SEP> foncé <SEP> Surface <SEP> cireuse;
<SEP> mycélium <SEP> vé-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ne <SEP> Extrait <SEP> à <SEP> noir <SEP> gétatif <SEP> et <SEP> envers <SEP> brun <SEP> noirâ-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> viande <SEP> tre
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Dextrose
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Anar
<tb>
<Desc/Clms Page number 3>
5
10
15
20
25
30
35
40 45 50 55
EMI3.1
<tb> Milieu <SEP> Importance <SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
<tb> du <SEP> dévelop- <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb>
<tb> peinent¯¯¯ <SEP> spores <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb>
<tb> Plaques <SEP> cement <SEP> sores <SEP> La <SEP> plupart <SEP> des <SEP> colonies <SEP> sont
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> dilu- <SEP> noir <SEP> grisâtre <SEP> avec <SEP> pigments
<tb>
<tb>
<tb> tion <SEP> solubles <SEP> noir <SEP> verdâtre;
<SEP> lé-
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> gèrement <SEP> en <SEP> relief; <SEP> aux <SEP> di-
<tb>
<tb>
<tb> Aspara- <SEP> lutions <SEP> plus <SEP> élevées <SEP> avec <SEP> pe-
<tb>
<tb>
<tb> gine <SEP> tites <SEP> zones <SEP> chamois <SEP> grisâtre
<tb>
<tb>
<tb> réparties <SEP> à <SEP> la <SEP> surface <SEP> et
<tb>
<tb>
<tb> souvent <SEP> avec <SEP> secteurs <SEP> cireux
<tb>
<tb>
<tb> chamois <SEP> grisâtre <SEP> ou <SEP> brun.
<tb>
<tb>
<tb>
Plusieurs <SEP> colonies <SEP> presque
<tb>
<tb>
<tb> plates; <SEP> brun <SEP> vineux <SEP> intense;
<tb>
<tb>
<tb> plus <SEP> grandes <SEP> que <SEP> le <SEP> premier
<tb>
<tb>
<tb> type <SEP> de <SEP> colonies; <SEP> à <SEP> convolu-
<tb>
<tb>
<tb> tions <SEP> très <SEP> peu <SEP> profondes;
<tb>
<tb>
<tb> pigment <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> vineux.
<tb>
<tb>
Rares <SEP> colonies <SEP> semblables <SEP> au
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> second <SEP> type <SEP> de <SEP> colonies <SEP> mais
<tb>
<tb>
<tb> jaunâtres <SEP> aux <SEP> bords <SEP> et <SEP> sans
<tb>
<tb>
<tb> pigment <SEP> soluble.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Glucose <SEP> Modéré <SEP> à <SEP> Pas <SEP> Brun <SEP> giro- <SEP> Surface <SEP> cireuse <SEP> ; <SEP> mycélium
<tb>
<tb>
<tb> Aspara- <SEP> bon <SEP> fle <SEP> clair <SEP> végétatif <SEP> noir <SEP> brunâtre <SEP> avec
<tb>
<tb>
<tb> gine <SEP> à <SEP> noir <SEP> petites <SEP> zones <SEP> olive <SEP> grisâtre
<tb>
<tb>
<tb> dans <SEP> le <SEP> ou <SEP> jaune <SEP> terne <SEP> réparties <SEP> à
<tb>
<tb>
<tb> même <SEP> tube <SEP> la <SEP> surface <SEP> ; <SEP> noir <SEP> bru-
<tb>
<tb>
<tb> nâtre
<tb>
10 g de glucose;.'! g d'asparagine; 1 g d'extrait de levure; 1 g de K2HPO4 par litre ; litre d'eau distillée 10 g de glucose; 1/2 g d'asparagine; 1/2 g de K2HP04; 1 litre d'eau distil- lée.
La nouvelle espèce de Streptomyces produisant de la tétracycline peut être conservée sur des tranches d'Agar"d'Emerson ou d'autres milieux appropriés ou bien les organismes peuvent être séchés à partir de la forme congelée et ranimés ultérieurement. Des cultures sur tranches des prépara- tions séchées par congélation peuventtêtre ajoutées à des milieux nutritifs stériles dans de petits flacons pour préparer de petites quantités de l'an- tibiotique ou pour préparer une quantité suffisante du microorganisme pour ensemencer des milieux nutritifs plus importants. En général, le milieu de fermentation doit contenir une source d'hydrate de carbone et une source d'azote, de préférence sous forme organique .
Un grand nombre de sels métal- liques stimulent la production de l'antibiotique, mais l'emploi d'eau de la distribution apporte souvent assez de ces métaux pour obtenir une croissance appropriée. Parmi les sources d'hydrates de carbone utiles ou compte la mé- lasse,la glucose, les amidons, le glycérol, etc.. Les sources d'azote orga- nique comprennént la farine de soya, le gluten de blé, la farine d'arachide Les produits d'hydrolyse de la caséine, et d'autres protéines etc.. Certai- les matières brutes contiennent des substances stimulant le développement lui favorisent des rendements maximum de l'antibiotique. Ce sont notamment La liqueur de macération de mais, les produits solubles de distillerie, l'ex- ;rait de levure, la farine de coton, etc...
Des sels comme le chlorure de ;odium, le nitrate de sodium, le phosphate de potassium et le sulfate de nagnésium ont également une certaine valeur. La proportion des divers anti- biotiques produits par le nouveau microorganisme varie dans une certaine me-
<Desc/Clms Page number 4>
sure. On a trouvé que si la teneur en ions chlorure du milieu de fermenta- tion est réduite à un minimum, la proportion de tétracycline comparée aux autres antibiotiques à larges spectres d'activité est favorablement influen- cée. L'absence de l'ion chlore peut être obtenue de diverses manières, par exemple par l'emploi de matières ayant une faible teneur initiale en cet ion ou par traitement par certaines résines d'échange d'ions.
Bien que l'or- ganisme n' ai t pas tendance à modifier appréciablement le pH du milieu pen- dant son développement, l'emploi d'un agent tampon présente un certain inté- rêt. Si une écume se forme pendant la culture des organismes dans des condi- tions. submergées, l'addition d'huiles comme l'huile de saindoux, l'huile de soya, etc.. peut être à conseiller. Comme on l'a indiqué plus haut, la culture aérobie submergée de l'espèce choisie de Streptomyces est la plus -utile dans la production à grande échelle de l'antibiotique tétracycline.
Pour effectuer cette préparation, il est nécessaire d'aérer le mélange de fermentation par de l'air stérile à raison d'au moins 1/2 volume d'air par volume de milieu par minute . Des vitesses plus élevées donnent parfois de meilleurs résultats.. Ce facteur et d'autres varient dans une certaine mesu- re suivant le type d'organisme utilisée le récipient de réaction, le type d'agitateur et ainsi de suite. Il est très utile d'employer un agitateur dans le milieu de fermentation pour favoriser un bon contact entre l'air et le mélange.
La culture de l'espèce de Streptomyces produisant de la tétracycli- nc- dure de deux à six jours lorsqu'on l'exécute en ballon. Mais une durée moyenne appréciablement plus courte suffit pour atteindre l'activité maximum lorsqu'on utilise une fermentation aérobie en milieu agité submergé. Des quantités appréciables d'antibiotique se forment souvent en un jour et dans de nombreux cas la production maximum d'antibiotique est obtenue en deux jours environ. Il est évidemment essentiel que le milieu utilisé et tout l'appareil soient soigneusement stérilisés avant d'ensemencer avec l'espèce choisie de microorganisme. Pendant toute la fermentation, il y a lieu de prendre les précautions familières aux spécialistes pour que des microorga- nismes contaminants ne puissent troubler la fermentation.
Le présent procédé de fermentation peut être exécuté à une tempéra- ture d'environ 25 à environ 30 C. La température optimum semble être 28 C environ. Pour la mise en marche d'une fermentation grande échelle, il est recommandé d'inoculer le milieu de fermentation préparé et stérilisé avec environ 1 à 10% en volume d'une culture pure d'une espèce fraîchement prépa- rée du streptomyces produisant la tétracycline.
La proportion de tétracycline dans les échantillons solides ou dans les solutions peut être déterminée par des méthodes d'essai microbiologiques standard pour les antibiotiques avec divers microorganismes. L'emploi de Klebsiella pneumoniae dans une méthode turbidimétrique déjà utilisée pour l'oxytétracycline donne de très bons résultats. Différentes mesures physi- ques peuvent être également utilisées pour déterminer la quantité d'antibio- tique présente dans un échantillon déterminé, par exemple l'absorption de rayons ultra-violets à certaines longueurs d'ondes ou l'absorption de rayons infra-rouges.
On prend comme étalon la tétracycline anhydre amphotère, pure et cristallisée à laquelle on attribue une activité ou puissance de 1.000 mcg/mg. La chromatographie sur papier est particulièrement utile pour déce- ler la présence d'antibiotique dans des matières brutes et des produits plus purs.
Bien que le bouillon de fermentation brut formé par culture dans le milieu nutritif dans des conditions aérobies de la nouvelle espèce de Strep- tomyces produisant de la tétracycline ait par lui-même une valeur apprécia- ble,par@exemple en addition à des aliments pour animaux ou pour stimuler la
<Desc/Clms Page number 5>
croissance des plantes, il est souvent utile de séparer l'antibiotique sous la forme d'une matière sèche, à l'état brut ou purifié. Divers pro- cédés peuvent être utilisés à cette fin. Par exemple, le bouillon tout en- tier avant ou après filtration du mycélium peut être séché par congélation pour obtenir un produit brut'contenant des quantités appréciables d'antibio- tique.
Il est recommandé d'effectuer cette opération de séchai à un pH ni trop acide, ni trop basique, pour éviter la dégradation de l'antibiotique par ce traitement.
L'antibiotique tétracycline peut être séparé du bouillon de fermen- tation par différents procédés. On recommande, avant d'appliquer ces pro- cédés, de séparer le mycélium du bouillon par fermentation. La quantité maximum d'antibiotique s'obtient dans le filtre aqueux si le mélange est réglé à un pH d'environ 2 à 3 par un acide fort (acide chlorhydrique, acide .sulfurique, acide phosphorique, etc.) avant la filtration. Bien qu'une lé- gère élévation de la température puisse favoriser la coagulation de certai- nes impuretés finement divisées et donner ainsi un filtrat plus propre , les températures élevées doivent être évitées. L'antibiotique peut être détruit en partie à ce pH (2 à 3) si la solution est chauffée à plus de 40 C ou si elle est maintenue à ce pH pendant une longue durée.
Pour séparer le mycélium du bouillon de fermentation par filtration, différents auxiliaires de filtration, particulièrement à base de terre d'in- fusoires peuvent être utilisés. Le filtrat peut être séché ou soumis à d'autres procédés de séparation pour le purifier. Un procédé qui s'est ré- vélé utile pour l'isolation de la tétracycline du bouillon de fermentation est l'addition de certains ions métalliques polyvalents, préférablement sous forme de sels solubles dans l'eau des métaux. Bien qu'une certaine propor- tion de ces métaux puisse être présente dans le bouillon de fermentation, particulièrement du calcium lorsqu'on utilise du carbonate de calcium comme tampon, cette proportion est souvent insuffisante pour déterminer la préci- pitation de quantités importantes de l'antibiotique lorsque le bouillon est rendu basique.
La précipitation est provoquée après l'addition des sels métalliques nécessaires en rendant ' le pH légèrement alcalin. En général, un pH d'environ 7,5 à 9 convient. L'emploi de plus d'un métal polyvalent comme agent de précipitation est conseillé parce que les produits complexes formés dans le bouillon de fermentation avec une combinaison de ces métaux est souvent beaucoup moins soluble que lorsqu'on n'utilise qu'un seul ion métallique polyvalent. Parmi les métaux les plus utiles pour la précipita- tion de l'antibiotique, on compte le baryum, le calcium, le magnésium, le strontium, le béryllium, le mercure, le cadmium et d'autres ions métalliques polyvalents, particulièrement ceux du groupe 2 du tableau Périodique.
Comme on l'a indiqué plus haut une combinaison de deux ou plusieurs de ces métaux est souvent plus efficace que l'emploi d'un seul métal.
Le précipité complexe de l'antibiotique et des ions métalliques, con- tenant également d'autres éléments du bouillon de fermentation peut être sé- paré de la solution restante par filtration, centrifugation ou tout autre procédé approprié. Le produit peut être ensuite lavé avec un petit volume d'eau pour éliminer la liqueur de fermentation résiduelle qui contient peu d'antibiotique et le produit brut peut être alors séché et utilisé dans cer- taines applications, si les ions polyvalents sont relativement non toxiques comme le calcium et le magnésium par exemple. En variante, le produit brut sous forme humide ou sèche peut être transformé en une forme purifiée de tétracycline amphotère en traitant le produit précipité par un agent préci- pitant sélectivement les ions métalliques utilisés.
Par exemple, si l'on emploie comme métaux du calcium et du baruym, le produit peut être traité par de l'acide sulfurique dilué pour obtenir un précipité de sulfates de cal- cium et de baryum et une solution aqueuse de l'antibiotique. On obtient la
<Desc/Clms Page number 6>
solution de l'antibiotique en séparant la matière solide précipitée par filtration. Après avoir réglé le pH pour empêcher la décomposition de l'an- tibiotique, la solution concentrée peut être utilisée dans diverses applica- tions ou peut être séchée. Si le pH est rendu légèrement alcalin, la tétra- cycline amphotère sous forme purifiée se sépare de la solution aqueuse con- centrée obtenue de cette manière.
Ce produit est généralement assez pur pour être cristallisé par des procédés décrits dans certaines des publications mentionnées plus haut.
Un autre procédé qu'on peut utiliser pour séparer la tétracycline des bouillons de ferment ation comprend'l'extraction de l'antibiotique à un pH fortement acide ou légèrement alcalin par certains solvants organiques immiscibles à l'eau. En général, cette extraction peut être effectuée à un pH de 1 à 2,5 environ ou à un pH de 7,5 à 10 environ. Divers solvants orga- niques polaires immiscibles à l'eau peuvent être utilisés à cette fin.
Ce sont notamment les solvants alcooliques comme les butanols, les pentanols, etc. ainsi que les alcools substitués comme l'alcool benzylique, l'alcool phényléthylique et certains éthers de glycol comme le phénylcellosolve; des cétones immiscibles à l'eau comme la méthyl-isobutyl-cétone; des esters com- me l'acétate d'amyle, l'acétate de propyle, le propionate d'éthyle, etc.
Il est recommandé d'ajouter au bouillon de fermentation filtré avant l'ex- traction, particulièrement aux pH alcalins, un agent de chélation pour les ions métalliques polyvalents. Ces agents comprennent les polyphosphates, divers hydroxyacides comme l'acide gluconique, l'acide citrique, l'acide tartrique, etc.. et des amino-acides comme l'acide éthylène-diamine-tétracé- tique. Cette précaution contribue à empêcher l'extraction des ions métalli- ques polyvalents sous la forme de complexes avec l'antibiotique tétracycline et d'autres éléments du bouillon de fermentation.
L'extraction peut s'effectuer par des procédés statiques ou par ex- traction continue à contre-courant. Un procédé particulièrement utile pour l'extraction comporte l'emploi des appareils industriels appelés extracteurs de Podbielniak. En général, un volume de solvant représentant au moins le dixième environ du volume de la solution aqueuse est utilisé. Des rapports de solvant appréciablement plus élevés peuvent être nécessaires si le solvant choisi n'a pas une efficacité maximum ou si l'appareil n'arrive pas rapide- ment à un équilibre de répartition.
Lorsque l'extraction a été achevée, les phases de solvant peuvent être combinées et l'antibiotique peut être sé- paré, soit par évaporation complète du solvant, soit par évaporation partiel- le du solvant et extraction de l'antibiotique par un petit volume d'acide en solution aqueuse diluée, de préférence un acide minéral. Le concentré ainsi obtenu peut être utilisé à diverses fins. Le produit peut être préci- pité sous la forme de tétracycline amphotère en réglant le pH du concentré' aqueux à une valeur légèrement alcaline . Par exemple, 7,5 environ. La té- tracycline amphotère purifiée ainsi obtenue peut être utilisée dans certai- nes applications thérapeutiques ou-peut être cristallisée.
Un autre procédé de séparation de la tétracycline du bouillon de fer- mentation préparé comme décrit ci-dessus entraîne l'emploi de certaines ha- ses organiques comme agents de précipitation. Sont particulièrement utiles les bases organiques à poids moléculaire élevé légèrement solubles dans l'eau.
En particulier, les substances telles qu'un sel d'ammonium quaternaire à poids moléculaire élevé, par exemple les halogénures d'alkyl- triméthyl-ammonium de C8 à C18; les halogénures d'alkyl-diméthyl-benzyl-ammonium de C8 à C18; les imidazolines substituées par une longue chaîne alkylique, les amines à chaîne alkylique longue, primaires secondaires et tertiaires et diverses au- tres substances basiques organiques peuvent être utilisées. Ces agents de précipitation semblent former des complexes contenant non seulement l'antibio-
<Desc/Clms Page number 7>
tique, mais également certains autres éléments normalement présent dans les sels obtenus. Ces éléments peuvont comprendra de petites quantités de mé- taux polyvalents et de substances organiques.
Après addition de la base or- ganique au bouillon de fermentation filtré de tétracycline, le pH du mélan- ge doit être réglé, de préférence au moyen d'un alcali soluble comme l'hy- droxyde de sodium à une valeur légèrement basique, c'est-à-dire de 8 à 9,5 environ. Le produit qui précipite peut être filtré, de préférence après une courte période d'agitation. Un produit un peu plus pur est obtenu en trai- tant le bouillon de tétracycline acidifié et filtré par un agent de chélation, par exemple par un des agents cités plus haut, avant d'ajouter la base orga- nique servant d'agent de précipitation.
Le produit obtenu par précipitation par une base organique à poids moléculaire élevé comme décrit ci-dessus peut être transformé en un sel sim- ?le de tétracycline, ou en tétracycline amorphe. On y arrive très simple- ment en dissolvant le précipité dans un solvant organique polaire à bas poids moléculaire comme le méthanol. L'addition d'une solution concentrée d'un acide minéral comme l'acide chlorhydrique concentré donne le chlorhydra- te de tétracycline qui cristallise ou précipite sous forme de produit amor- phe si l'on utilise une solution suffisamment concentrée. Les complexes de tétracycline et de base organique ont également une certaine valeur, par exem- ple comme agents antibactériens industriels.
Un autre procédé pour séparer l'antibiotique consiste à mettre en contact le bouillon de fermentation acidifié, après filtration du mycélium, avec certains colorants acides aryl-azosulfoniques. On obtient ainsi la précipitation d'un complexe du colorant et de l'antibiotique dont on peut séparer l'antibiotique par des procédés semblables à certains procédés déjà décrits. Par exemple, le mélange peut être dissous dans un solvant organi- que molaire à bas poids moléculaire. Le réglage du pH à une valeur légère- ment alcaline détermine la séparation de la tétracycline amphotère si l'on utilise une solution suffisamment concentrée.
En plus des procédés de séparation décrits ci-dessus, l'antibioti- que peut être obtenu sous une forme partiellement purifiée en mettant le bouillon de fermentation en contact avec un adsorbant comme les charbons activés, les terres activées et d'autres matières de cette nature. L'adsorp- tion peut être effectuée à un pH de 3 à 8 environ et l'antibiotique adsorbé peut être utilisé tel quel pour enrichir les aliments pour animaux et à d'autres fins analogues. D'une autre manière, la'tétracycline peut être sé- parée de l'adsorbant par lavage, par exemple par un acide en solution aqueu- se diluée ou par une solution diluée d'un acide fort dans un solvant polaire.
Elle peut être utilisée dans cet état ou purifiée davantage par des procédés décrits ci-dessus. L'antibiotique peut être adsorbé à partir du bouillon d3 fermentation sur certains types de résines d'échange d'ions, particuliè- rement les résines fortement acides comme les résines d'échange d'ions à l'a- cide sulfonique, par exemple le Dowex I. L'adsorption s'effectue le mieux à un pH de 3 à 8 environ et le produit peut être utilisé tel quel dans cer- taines applications ou lavé par exemple par un alcali dilué.
Comme on l'a indiqué plus haut, le procédé de fermentation décrit fournit un mélange d'antibiotiques dont on peut isoler la tétracycline. Tou- tefois, dans la mise en oeuvre de plusieurs des procédés décrits ci-dessus, ies mélanges des antibiotiques peuvent être isolés sous forme solide, brute ou partiellement purifiée. Différents procédés peuvent être appliqués à la séparation des antibiotiques et notamment certains des procédés déjà décrits'.. j'antibiotique P.A. 121 peut être initialement extrait de la liqueur de fer- aentation en réglant le pH après filtrationapproximativement à la neutrali- té, c'est-à-dire de 6 à 8 environ.
On extrait ensuite la solution par des
<Desc/Clms Page number 8>
solvants organiques immiscibles à l'eau par exemple par des hydrocarbures aromatiques, des esters, des cétones, des alcools inférieurs et des hydro- carbures halogénés comme l'acétate d'éthyle, la méthyl-isobutyl-cétone, l'a- cétate de propyle, le chloroforme, le benzène, etc.. L'antibiotique P.A.
121 est entraîné dans la phase de solvant et peut enôtre séparé par concen- tration de sa solution dans le solvant, de préférence sous vide ou par addi- tion d'un non-solvant comme l'hexane, ou l'éther de pétrole pour précipiter l'antibiotique. Cet antibiotique est décrit en détail dans la demande de brevet américain n 464.911.
Après élimination de l'antibiotique P.A. 121, la tétracycline qui peut être accompagnée d'antibiotiques très voisins edt alors séparée par un des procédés décrits plus haut. La séparation de la tétracycline des antibiotiques très voisins peut être exécutée suivant le procédé décrit dans la demande de brevet américain n 423.247. Suivant ce procédé, on règle le mélange d'antibiotiques à un pH de 0,5 à 3,5 environ. Les antibiotiques sont extraits par un solvant immiscible à l'eau, de préférence le butanol.
L'extrait dans le solvant est lavé à l'eau et le pH de la phase aqueuse est réglé entre 5 et 8 par de l'hydroxyde de sodium. La tétracycline se sépare, particulièrement si une partie du butanol est éliminée par distillation sous vide. La tétracycline solide purifiée peut être ensuite séparée du mélange par f iltra tion.
On notera que les différentes souches de l'espèce Streptomyoes fus- cofaciens produisent des quantités différentes d'antibiotiques. C'est ainsi qu'une souche peut produire sensiblement plus de P.A. 121 qu'une autre.
Mais chacune de ces souches est caractérisée par sa production de quantités appréciables de tétracycline. On notera également qu'on peut rencontrer des souches dont les caractéristiques s'écartent plus ou moins des caractéristi- tiques mentionnées dans le tableau pour la souche type de l'organisme. En outre, différents produits de mutation et des variations de l'espèce peuvent être obtenus soit à partir de matières naturelles soit sous l'action de cer- tains agents comme la lumière ultra-violette, les rayons X ou les gaz azo- tés.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre d'illustration et ne sont pas les seules formes d'exécution de l'invention.
EXEMPLE 1.
On prépare un milieu de fermentation contenant les éléments suivants
EMI8.1
<tb> Dextrose <SEP> hydratée <SEP> 10 <SEP> g/litre
<tb>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> coton <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb> Matières <SEP> solubles <SEP> de <SEP> distillerie <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 7H2O <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> de <SEP> la <SEP> distribution <SEP> q.s.
<tb>
On place des portions de 20 cm3 de ce milieu dans des flacons de 50 cm3 et après stérilisation, on les inocule à l'aide d'une culture sur agar de Strep- tomyces fuscofaciens ATCC 12061. On agite le mélange et on le maintient à 28 C pendant 80 heures. On utilise ce produit pour inoculer des portions d'un litre du même milieu qu'on stérilise après les avoir placées dans des récipients métalliques de deux litres équipés pour la fermentation submer- gée dans des conditions aérobies. On utilise environ 5% en volume d'inoculum, c'est-à-dire 50 cm3 par litre de milieu. Après inoculation, on agite le con- tenu des récipients et on l'aère dans des conditions stériles à 29 C pendant 70 heures. Le mélange est ensuite réglé au pH 2,5 par de l'acide sulfuri- que et on y ajoute une petite quantité d'auxiliaire de filtration.
Le mélan- ge est filtré et la solution aqueuse réglée au pH 7 environ par une solution d'hydroxyde de sodium. Cette solution est très active contre divers micro-
<Desc/Clms Page number 9>
organismes. Lorsqu'on soumet la liqueur de fermentation à un essai par le procédé standard sur plaque avec Escherichia coli comme organisme, la solu- tion de fermentation se révèle très active. Comme il est connu que l'anti- biotique P.A. 121 est inactif contre cet organisme, ce résultat démontre la présence d'autres antibiotiques dans le bouillon. La chromatographie sur papier utilisant une préparation standard de tétracycline met en évidence la présence de cet antibiotique dans le bouillon de fermentation. L'anti- biotique P.A.121 est séparé par des extractions répétées par de petites por- tions d'acétate d'éthyle.
La tétracycline contenue dans le bouillon est ensuite éliminée en ajoutant un composé d'ammonium quaternaire, le chlorure de dodécyl-triméthyl-ammonium et en réglant le pH à 8,5 environ. Le produit brut obtenu par précipitation se révèle très efficace dans l'inhibition des développements de nombreux microorganismes Gram-positifs et Gram-négatifs.
EXEMPLE 2 . -
On prépare un milieu de fermentation contenant 15 g de farine de soya par litre, 5 g de chlorure de sodium, 5 g de Curbay BG, 5 g de N-Z-ami- ne, B, 10 g d'amido, 10 g de Cérélose et 1 g de carbonate de calcium. On dilue le mélange avec de l'eau de la distribution pour obtenir le volume dé- siré, puis on le règle au pH 6,8 par une solution d'hydroxyde de sodium. On place des portions de 100 cm3 de ce mélange dans des Erlenmeyer de 500 cm3 qu'on bouche au moyen d'un tampon d'ouate.
On stérilise à la vapeur les Er- lenmeyer contenus et après refroidissement on inocule les milieux avec des cultures de Streptomyces fuscofaciens. Le mélange est ensuite agité pendant 75 heures à une température d'environ 27 C. L'essai de la solution obtenue révèle la présence de l'antibiotique P.A. 121 de tétracycline et d'un second antibiotique à large spectre d'activité. Ce produit est utilisé pour inocu- ler des portions plus importantes du même milieu placées dans des récipients métalliques équipés pour la fermentation aérobie submergée dans des conditions stériles. Le mélange antibiotique ainsi produit est traité par filtration acide, neutralisé, puis l'antibiotique P.A. 121 est extrait à la méthyl-iso- butyl-cétone et la tétracycline est extraite à un pH de 9,5 environ au buta- nol.
L'acidification de l'extrait par le butanol au pH 6,5 environ et sa concentration donnent la tétracycline à l'état brut.
REVENDICATIONS.
1. - Procédé de préparation d'un antibiotique, caractérisé en ce qu'on cultive dans un milieu nutritif et dans des conditions aérobies submergées
EMI9.1
une souche de Streptomyces, fusçofaciens.