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La présente invention se rapporte à la séparation de la tétracycli- ne de la chlortétracycline, et plus spécialement à la séparation de la té- tracycline de la chlortétracycline dans des bouillons de fermentation et d'autres solutions aqueuses contenant des mélanges de ces antibiotiques.
La tétracycline est un antibiotique à large spectre d'activité dont la structure a été donnée pour la première fois dans le Journal of the
American Chemical Society, Vol. 74, page 4976 (1952). La préparation de cet antibiotique par réduction catalytique de la chlortétracycline a été également décrite (Journal of the American Chemical Society, Vol. 74, pages 4621-23,1953).
La chlortétracycline est également un antibiotique à large spectre d'activité et peut être séparée des produits du métabolisme de Streptomyces aureofaciens, comme décrit dans le Brevet Américain n 2.482.055, qui donne à l'antibiotique son appellation commerciale "Auréomycine".
Bien qu'il soit possible de produire de la tétracycline par réduc- tion catalytique de la chlortétracycline, sa production par un processus de fermentation directe présente de nombreux avantages. Par exemple, l'ap- pareil de traitement généralement nécessaire pour l'hydrogénation de la chlortétracycline peut être supprimé. En oute, il n'est pas nécessaire d'utiliser des catalyseurs d'hydrogénation coûteux et les dangers inhérents à ces réactions d'hydrogénation sont évités. La production de tétracycline directement par des procédés de fermentation a été à présent obtenue en cul- tivant des souches sélectionnées de microorganismes du genre Streptomyces dans des solutions nutritives et dans des conditions aérobies.
Toutefois, dans la plupart des procédés qui ont été mis au point,de la chlortétracycli- ne se trouve dans le bouillon de fermentation dans la tétracycline désirée.
La proportion de chlortétracycline ainsi obtenue varie considérablement sui- vant l'organisme particulier employé dans la fermentation et la composition du milieu de fermentation, entre autres facteurs. Dans le cas de quantités appréciables, un problème de séparation sérieux est créé par les similitudes entre les propriétés physiques et chimiques des deux antibiotiques. Dans ces circonstances, les procédés de séparation connus ne donnent que des mé- langes des deux antibiotiques qui doivent être soumis à de nouveaux traite- ments, par exemple à une réduction catalytique de la chlortétracycline, avant qu'on puisse obtenir de la tétracycline pure.
Un problème semblable peut se poser dans la réduction catalytique de la chlortétracycline si la réduction n'est pas complète, puisqu'on ob- tient alors des mélanges de tétracycline et de chlortétracycline résiduelle.
L'importance de trouver un moyen de séparer la tétracycline de la chlortétra- cycline sera donc facilement reconnue.
On a trouvé à présent que la tétracycline peut être séparée de la hlortétracycline dans des bouillons de fermentation ou d'autres solutions aqueuses contenant les deux antibiotiques, en extrayant les antibiotiques Par un solvant organique immiscible à l'eau dans des conditions de pH acide, puis en précipitant la tétracycline de l'extrait par le solvant en neutrali- sant ce dernier, ce qui laisse la chlortétracycline dans l'extrait.
Suivant la présente invention, on acidifie unmélange de tétracycli- le et de chlortétracycline en solution aqueuse à un pH d'environ 0,5 à 3,5, le préférence voisin de 2, par un acide inorganique approprié, comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, etc. Les antibio- siques peuvent être en solution aqueuse obtenue à partir du bouillon de fer- lentation ou sous la forme de solides bruts obtenus par fermentation ou L'autres sources, solides, qu'on met en suspension dans l'eau. Ils peuvent 'gaiement être sous la forme de leursbases libres, de leurs sels ou de leurs
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complexes, etc.. obtenus par divers procédés de séparation connus dans la partie.
Après l'acidification de la solution aqueuse contenant les anti- 'biotiques, divers agents peuvent être utilisés si on le désire pour amélio- rer la qualité du produit final de tétracycline. C'est ainsi qu'on peut a- jouter du ferrocyanure de potassium pour éliminer les matières colorantes indésirables et empêcher leur précipitation lorsque la tétracycline est sé- parée par la suite. En outre,on peut.se servir d'oxalate d'ammonium pour empêcher la précipitation subséquente des sels de calcium, si la solution contient une quantité particulièrement élevée d'ions calcium. La solution acidifiée ainsi traitée est ensuite soumise à l'extraction par un solvant organique immiscible à l'eau, particulièrement des alcools inférieurs comme le butanol, l'isobutanol, les pentanols, les hexanols, etc. Le butanol est très avantageux à cette fin.
En général, 0,2 à 2,0 volumes du solvant orga- nique par volume de solution aqueuse permettent d'obtenir le résultat dési- ré, mais des volumes de solvant plus élevés peuvent être utilisés, si on le désire.
On a trouvé que l'extraction des deux antibiotiques par le solvant organique est fortement facilitée en traitant la solution aqueuse acidifiée par un sel inorganique-soluble dans l'eau comme le chlorure de sodium, le sulfate de sodium, le sulfate de potassium, le chlorure de potassium, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, etc. avant l'extraction. Ce traitement semble avoir un effet de "relarguage" sur les deux antibiotiques et permet l'emploi de volumes de solvant organique beaucoup plus faibles . qu'il n'en faudrait sinon pour l'extraction. La quantité de sel utilisée à cette fin peut varier considérablement suivant la teneur totale en antibio- tiques de la solution aqueuse et la concentration des antibiotiques dans cet- te solution.
Toutefois, une quantité de sel suffisante pour former une con- centration d'environ 3,0 à 25,0% dans le mélange traité est généralement suffisante dans la plupart des cas.
Lorsque l'extraction est achevée, les extraits par le solvant or- ganique sont préférablement filtrés pour éliminer les matières insolubles, puis traités par de l'eau et une matière alcaline pour régler le mélange à un pH pratiquement neutre. Des exemples de matières alcalines appropriées sont l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde d'ammonium, la triéthylamine et diverses autres amines aliphatiques. Ce traitement s'ef- fectue facilement en mélangeant de l'eau à l'extrait par le solvant et en ajoutant graduellement la matière alcaline jusqu'à ce que le pH de la couche aqueuse reste entre 5 et 8, de préférence entre 6 et 7. Ensuite, la tétra- cycline sous la forme de la base peut être précipitée par un certain nombre de procédés différents.
Par exemple, le mélange d'eau et de solvant organi- que peut être agité ou laissé au repos pendant un certain temps, par exemple de 8 à 12 heures, pendant lequel la base libre de tétracycline se sépare par cristallisation. D'une autre manière, le mélange peut être concentré dans le vide pour éliminer entièrement ou en partie le solvant organique et lais- ser assez d'eau dans le produit concentré pour former le tétracycline trihy- dratée. La tétracycline cristallisée par ces procédés est facilement séparée par filtration ou par un autre moyen et peut être encore purifiée par recris- tallisation de l'acétone, de mono-éthers d'éthylène glycol ou d'autres sol- vants organiques si on le désire.
La chlortétracycline présente dans l'extrait initial reste dans la solution ou dans le filtrat après élimination de la tétracycline. Ce filtrat peut être soumis à de nouveaux traitements comme indiqué plus haut pour sépa- rer et récupérer de nouvelles quantités de tétracycline restant éventuelle- ment dans le filtrat avec la chlortétracycline, La chlortétracycline peut
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être séparée par évaporation de la matière retraitée jusqu'à siccité ou en soumettant celle-ci à différents processus de purification connus dans la partie.
La précipitation de la tétracycline par le procédé décrit ci-des- sus est particulièrement inattendue vu les similitudes entre les propriétés physiques et chimiques de la tétracycline et de la chlortétracycline. Par exemple, tous deux forment des sels avec les acides et sous cette forme sont facilement extraits par des solvants organiques par acidification de solu- tions aqueuses contenant les deux antibiotiques. En outre, leurs deux sels d'acide sont facilement neutralisés en donnant les bases libres par addition d'une matière alcaline. Toutefois, la tétracycline neutralisée précipite facilement de la solution, tandis qie la chlortétracycline reste dans la so- lution dans les conditions indiquées.
L'invention est encore illustrée par les exemples qui suivent, qui ne peuvent être considérés comme limitatifs.
EXEMPLE 1.-
On cultive sur agar une souche sélectionnée de Streptomyces dépo- sée à l'American Type Culture Collection, Washington D.C., sous le n ATCC 11654, dans des conditions déterminées pour développer des spores afin d'en- semencer un milieu nutritif de la composition suivante.
EMI3.1
<tb>
Enzymine <SEP> B <SEP> 10 <SEP> g/1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cérélose <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> Calcium <SEP> 1
<tb>
Le mélange de ces éléments nutritifs est dilué à un volume de 1 litre avec de l'eau, réglé à un pH de 6,7 et soumis à la stérilisation par la chaleur. On refroidit ensuite le mélange et on ajoute les spores dans des conditions aseptiques.
Après culture de l'organisme dans des récipients agités, pendant deux jours, le mélange de bouillon et de mycélium ainsi for- mé est placé dans 25 gallons (95 1, env.) d'un milieu de fermentation stéri- le de la composition suivante :
EMI3.2
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> 4,0 <SEP> %
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> Sodium <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soya <SEP> 5 <SEP> cm3/1.
<tb>
Ce mélange est réglé au pH 6, 25 et stérilisé de la façon habituel- le avant d'y faire passer le bouillon et le mycélium venant des récipients agités. Le milieu est ensuite ensemencé avec l'organisme et soumis à une agitation et à une aération dans des conditions stériles pendant 26 heures à la vitesse de 1 volume d'air par volume de bouillon par minute. La tempé- rature pendant cette période est maintenue à 28 C.
Les 25 gallons d'inoculum ainsi préparés sont ensuite introduits dans 150 gallons (570 1 env.) de milieu de la même composition et stérilisés comme indiqué plus haut. La fermentation s'effectue également dans des con- ditions stériles en utilisant 3/4 de volume d'air par volume de bouillon par minute à une température de 28 C pendant 67 heures. L'activité du bouillon à ce moment est 715 mcg/cm3.
Les 108 gallons (410 1. env.) du bouillon de fermentation ainsi pré- paré sont acidifiés à un pH de 2,5 à 3 par de l'acide sulfurique et filtrés à l'aide de Supercel pour éliminer le mycélium. Après avoir lavé le gâteau de filtration à l'eau, on ajoute 0,4 % en poids/volume d'acide citrique au
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bouillon filtré, puis 2,3 cm3/1 d'amines quaternaires à longue chaîne alkyli- que à 50% vendues sous la dénomination "Arquad C". Ces amines sont principalement de la dodécyl-amine.
Ensuite, on ajoute 6 cm3 d'une solution de chlo- rure de calcium à 3% en poids/volume par litre de bouillon et on règle le pH à 9 à 9,5 environ par de la soude caustique pour précipiter les sels d'ammo- nium quaternaires de tétracycline et de chlortétracyc line. Ces sels préci- pités sont filtrés à l'aide de Supercel, lavés à l'eau et séchés.
On met en suspension 50 g de ces sels mélangés, contenant environ 30. 000 mcg d'activité totale d'antibiotique par gramme, dans 200 cm3 d'eau et on règle le pH à 2 par de l'acide chlorhydrique 6 N. On ajoute ensuite 2g de ferrocyanure de potassium et 25 cm3 d'une solution d'oxalate d'ammonium à 5% et on agite le mélange pendant 15 minutes, puis on règle à nouveau le pH3 à 2. Le mélange est filtré et le gâteau de filtration est lavé avec 100 cm3 d'eau également réglée au pH 2. On combine cette eau de lavage au fil- trat pour obtenir 305 cm3 de solution contenant une activité totale d'antibio- tique de 1.690.000 mcg.
La solution obtenue est ensuite extrait six fois par des portions de 100 cm3 de n-butanol, ce qui laisse 217 cm3 d'une couche aqueuse extraite contenant 211.000 mcg d'activité totale d'antibiotique, soit 12,4% de l'activité totale de la solution initiale.
Les extraits par le butanol sont filtrés, combinés et agités avec 100 cm3 d'eau, et on ajoute lentement une solution d'hydroxyde de sodium à 10% jusqu'à ce que le pH de la couche aqueuse reste entre 6 et 7. Le mé- lange de butanol et d'eau est ensuite concentré dans levide, en ajoutant de nouvelles quantités d'eau pour faciliter l'élimination du butanol. On ob- tient ainsi 80 à 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant des cristaux de la base libre de tétracycline. La solution ainsi obtenue est réglée à un pH de 5 à 6,8 par une nouvelle solution d'hydroxyde de sodium à 10%, puis on la refroidit et on la filtre. Le filtrat aqueux obtenu contient 374.000 mcg d'activité totale d'antibiotique, soit 22,1 % de l'activité totale de la so- lution initiale.
Les cristaux pèsent 0,89 g,contiennent à l'essai 882.000 mcg d'activité totale de tétracycline ou 990 mcg d'activité de tétracycline par mg. Ceci correspond environ à 52% de l'activité totale de la solution aqueuse initiale et montre qu'une partie importante de la tétracycline pré- sente dans cette solution en a été récupérée. L'analyse dans l'ultra-violet et les mesures par chromatographie sur papier montrent que seule la tétracy- cline est présenté, dans le produit cristallin. L'analyse du produit est la suivante :
Calculé : pour C22H24N2O8 : C : 59,45 ; H 5,44.
Trouvé : C : 59,59 : H : 5,44.
Le procédé ci-dessus est repris avec un. mélange de sels d'ammonium quaternaires de tétracycline et de chlortétracycline sans extraction par le butanol. On obtient un produit brut de tétracycline contenant 30% en poids de chlortétracycline.
EXEMPLE II.
On met en suspension dans 1500 cm3 d'eau au pH 2, 500 mg des sels d'ammonium quaternaires combinés detétracycline et de chlortétracycline et on ajoute 20 g de ferrocyanure de sodium. La solution obtenue est ensuite filtrée et lavée avec 1000 cm3 d'eau au pH 2. Le filtrat combiné à l'eau de lavage contient 61.100.000 mcg d'activité totale d'antibiotique.
La solu- tion est ensuite traitée par 340 g de chlorure de sodium, puis extraite trois fois par des portions de 800 cm3 de n-butanol. La solution aqueuse épuisée contient 870.000 mcg d'activité totale d'antibiotique ou 1,4% de l'activité totale de la solution initiale avant l'extraction. Les extraits par le buta- nol sont combinés, agités avec de l'eau et neutralisés par de l'hydroxyde de
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sodium à 10%, jusqu'à ce que le pH de la couche aqueuse soit 6,8. Ensuite, le butanol est partiellement éliminé dans le vide etle mélange est laissé au repos toute une nuit sous réfrigération. On détermine ainsi la cristal- lisation de la base libre de tétracycline qu'on sépare de la solution par filtration et qu'on sèche dans le vide.
Le produit ainsi obtenu pèse 22,1 g et contient à l'essai 1047 mcg/mg, ayant une activité totale de tétracy- --lino de 23. 100.000 mcg ou 37,7 % de l'activité totale de la solution ini- tiale. Le produit cristallisé ne contient pas de chlortétracycline.
Le butanol restant dans le filtrat est éliminé dans le vide et on obtient encore 5, 9 g de tétracycline contenant à l'essai 950 mcg/mg.
L'activité totale de cette tétracycline supplémentaire est 5.610.000 mog, représentant 9,2% de l'activité totale de la solution initiale. D'autre part, les filtrats combinés contiennent 28.500.000 mcg d'activité dont 30 à 40% sont de la chlortétracycline. En reprenant le même procédé, on obtient encore de la tétracycline des liqueurs mères, ce qui permet d'en séparer la chlortétracycline par des procédés connus,par exemple par extraction par du butanol.
Diverses modifications peuvent être apportées au procédé de l'in- vention sans sortir de cadre de celle-ci.
REVENDICATIONS.
1. - Procédé pour séparer la tétracycline de la chlortétracycline dans des solutions aqueuses en contenant, caractérisé en ce qu'on règle la solution à un pH acide, on extrait les deux antibiotiques par un solvant or- ganique immiscible à l'eau, on sépare l'extrait obtenu, on neutralise cet extrait en présence d'eau et on cristallise la tétracycline du mélange neutra- lisé.
2. - Procédé pour séparer la tétracycline de la chlortétracycline dans des solutions aqueuses en contenant, caractérisé en ce qu'on règle la solution à un pH compris entre 0,5 et 3,5, on extrait les deux antibiotiques par un solvant organique immiscible à l'eau, on sépare l'extrait obtenu, on lave cet extrait à l'eau en réglant le pH de la phase aqueuse entre 5 et 8 et on cristallise la tétracycline du mélange neutralisé.