CA3068905A1

CA3068905A1 - Emulsions eau-dans-huile injectables et leurs utilisations

Info

Publication number: CA3068905A1
Application number: CA3068905A
Authority: CA
Inventors: Frederic Deschamps; Thierry DE BAERE; Lambros TSELIKAS; Thomas ISOARDO; Nicolas HUANG; Laurence Moine; Nicolas Tsapis; Elias Fattal
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Universite Paris Sud
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Universite Paris Saclay
Priority date: 2017-07-17
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2019-01-24
Also published as: US20210113463A1; AU2018304530B2; KR20200032092A; KR20250004135A; JP7247164B2; JP2020527161A; CN111263632A; IL271898A; WO2019016138A1; AU2018304530A1; EP3654937A1; IL271898B1

Abstract

La présente invention concerne une émulsion eau-dans-huile comprenant une phase huileuse continue et une phase aqueuse dispersée sous forme de gouttes, ladite phase aqueuse comprenant des nanoparticules à base de polyester, et au moins un agent thérapeutique.

Description

EMULSIONS EAU-DANS-HUILE INJECTABLES ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet des émulsions thérapeutiques eau-dans-huile injectables et stables. Elle a également pour objet l'utilisation desdites émulsions notamment pour le traitement du cancer.
La chimio-embolisation artérielle hépatique est le traitement de référence de certaines tumeurs du foie, comme le carcinome hépatocellulaire inopérable et les to métastases hypervasculaires. Ce traitement consiste en l'association d'une injection de chimiothérapie (en général de la doxorubicine) à une embolisation artérielle ischémique, directement dans les artères tumorales. La chimiothérapie est libérée de façon lente et prolongée dans les artères tumorales grâce à l'utilisation d'un vecteur dans lequel la chimiothérapie est préalablement chargée . Ce vecteur doit idéalement posséder des propriétés diagnostique (visibilité en imagerie) et thérapeutique (libération contrôlée et prolongée de la chimiothérapie).
Cependant, aucun des vecteurs utilisés actuellement (Lipiodol ou billes chargées) ne possède cette propriété théranostique (diagnostique et thérapeutique). Les billes chargées sont des microsphères à base d'alcool polyvinylique qui peuvent être chargées avec une chimiothérapie (mécanisme d'échange d'ions) et sont disponibles dans des tailles différentes allant de 70 à 700 pm. Ces billes ont déjà démontré une augmentation significative de l'exposition à la chimiothérapie tumorale et une diminution de la toxicité systémique mais elles ne contiennent pas d'agents de contraste. Ainsi, il est impossible de visualiser avec précision l'administration de la chimiothérapie pendant la procédure et de quantifier la concentration de chimiothérapie dans la tumeur après la procédure. En outre, seuls la doxorubicine et l'irinotécan peuvent être chargés dans des billes jusqu'à présent.
Le lipiodol est utilisé pour ses propriétés d'agent de contraste radio-opaque hydrophobe (huile) visible sous fluoroscopie aux rayons X et pour sa sélectivité pour les artères tumorales. La réalisation d'émulsions de chimiothérapie avec le Lipiodol permet donc d'espérer une délivrance sélective et visible de la chimiothérapie dans les tumeurs hépatiques. Cependant, les propriétés théranostiques de ces émulsions lipiodolées sont limitées par leur faible stabilité : le déphasage entre la chimiothérapie et le lipiodol se fait en quelques minutes. Très rapidement, les deux phases de l'émulsion se séparent et la quasi-totalité de la chimiothérapie qui est soluble dans l'eau disparaît de la tumeur. En outre, comme l'émulsification est

2 obtenue par pompage répétitif de 2 seringues (1 de chimiothérapie et 1 de lipiodol) par un robinet à trois voies, la technique n'est pas reproductible d'un opérateur à
l'autre. Cette mauvaise stabilité se traduit par une concentration tissulaire tumorale aléatoire de la chimiothérapie. Bien que diverses techniques (mélangeur, ultrasons, émulsifiants) et divers types d'émulsion lipiodol (eau-dans-huile par rapport à huile-dans-eau, différents rapports de lipiodol et de chimiothérapie) ont été
utilisés dans des études précliniques pour améliorer la stabilité et la reproductibilité de l'émulsion, aucune d'entre elles n'a réussi.
Jusqu'à présent, les tensioactifs synthétiques sont utilisés pour stabiliser les io émulsions pharmaceutiques. Cependant, ce type d'émulsifiant soulève directement ou indirectement des problèmes de toxicité et d'environnement. En particulier, lors de l'administration parentérale, il a été observé une certaine cytotoxicité et un comportement hémolytique de ces agents.
La présente invention a donc pour but de fournir une nouvelle émulsion thérapeutique eau-dans-huile, stable au cours du temps, notamment pendant au moins 24 heures.
La présente invention a également pour but de fournir une nouvelle émulsion stable possédant de préférence des propriétés théranostiques.
La présente invention a également pour but de fournir une nouvelle émulsion stable comprenant au moins un agent anticancéreux, et présentant une sélectivité
tumorale supérieure à celle des émulsions classiques.
La présente invention a également pour but de fournir une nouvelle émulsion pouvant être chargée avec différents agents thérapeutiques et potentiellement visible par imagerie par résonance magnétique (IRM).
La présente invention a également pour but de fournir une nouvelle émulsion biodégradable, biocompatible et moins toxique ou irritante que les émulsions habituelles stabilisées avec des tensioactifs synthétiques ou des particules minérales.
Ainsi, la présente invention concerne une émulsion eau-dans-huile comprenant une phase huileuse continue et une phase aqueuse dispersée sous forme de gouttes, ladite phase aqueuse comprenant des nanoparticules à base de polyester, et au moins un agent thérapeutique.

3 Phase huileuse L'émulsion selon l'invention comprend une phase huileuse (ou phase grasse) continue.
Selon un mode de réalisation, la phase huileuse selon l'invention comprend au moins une huile. La phase huileuse peut comprendre une huile unique ou un mélange de plusieurs huiles différentes.
Toute huile ou toute huile pharmaceutique appropriée peut être utilisée pour constituer la phase huileuse.
Par huile , on entend un composé non aqueux, non miscible à l'eau, liquide à température ambiante (25 C) et pression atmosphérique (760 mm de Hg).
Parmi les huiles adaptées selon l'invention, on peut citer notamment les acides gras, les esters d'acides gras et les huiles minérales (notamment comme le squalène).
On peut également citer les huiles marines, notamment les huiles de poisson, et en particulier l'huile de saumon. On peut par exemple citer l'icosapentate d'éthyle qui est l'un des acides gras polyinsaturés contenu dans l'huile de poisson.
La phase huileuse selon l'invention comprend de préférence des huiles injectables, de préférence des huiles végétales injectables.
Parmi les huiles injectables, on peut citer celles bien connues de l'homme du métier, notamment comme décrit dans l'article de Hippamgaonkar et al. (2010) AAPS Pharm Sci Tech, 11(4), p.1526-1540.
Selon un mode de réalisation, la phase huileuse selon l'invention comprend des triglycérides à chaîne longue (LCT) et/ou des triglycérides à chaîne moyenne (MCT). Parmi les LCT, on peut citer la trioléine, l'huile de soja, l'huile de carthame, l'huile de sésame et l'huile de ricin. Parmi les MCT, on peut citer l'huile de noix de coco fractionnée, comme encore les triglycérides d'acides caprylique/caprique, comme les produits MIGLYOL 810 ou 812 , NEOBEE M-5 ou Captex 300.
On peut également citer les triglycérides d'acides caprylique/caprique/linoléique (MIGLYOL 818 ), les triglycérides d'acides caprylique/caprique/succinique (MIGLYOL 829 ), ou encore le MIGLYOL 840 (nom INCI : propylène glycol dicaprylate/dicaprate).

4 Selon un mode de réalisation, la phase huileuse comprend au moins une huile végétale, en particulier l'huile de ricin, l'huile de sésame, l'huile d'oeillette, l'huile d'olive, l'huile de soja, l'huile de noix de coco, la trioléine et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation, la phase huileuse comprend au moins une huile qui a été modifiée par de l'iode pour la rendre radio-opaque. Parmi ces huiles, on peut citer l'huile d'oeillette, l'huile de lin (cf. J Pharm Sci, 102 :4150, 2013), le Labrafac WL1349 (Attia et al., Macromol Biosci, 2017), l'huile de ricin (ACS
Nano, 8(10), 10537, 2014) ou encore la vitamine E.
Selon un mode de réalisation, la phase huileuse comprend des esters éthyliques d'acides gras iodés de l'huile d'oeillette, et notamment est constituée de Lipiodol.
Le Lipiodol est constitué des esters éthyliques des acides gras iodés de l'huile d'oeillette. Il contient de 43 à 53% d'iode. Il est préparé par saponification de l'huile d'oeillette ce qui libère les acides gras sous forme de savons qui sont ultérieurement iodés par le chlorure d'iode et enfin estérifiés par l'éthanol. L'huile d'oeillette est extraite des graines de pavot noir (Papaver somniferum). Les principaux acides gras compris dans cette huile sont l'acide linoléique et l'acide linolénique. Le Lipiodol est également utilisé comme agent de contraste dans le cadre d'investigations radiologiques.
Selon un mode de réalisation, la phase huileuse comprend des triglycérides de longueurs de chaîne moyennes, notamment comprenant entre 8 et 12 atomes de carbone, ou une huile minérale composée principalement de squalène.
Selon un mode de réalisation, la phase huileuse de l'émulsion selon l'invention comprend en outre un composé, comprenant pour 100% de sa masse, de 10 % à 95 % d'une huile minérale comprenant :
- de 0,05% à 10% de chaînes hydrocarbonées ayant moins de 16 atomes de carbone ;
- de 0,05% à 5% de chaînes hydrocarbonées ayant plus de 28 atomes de carbone ;
- et possédant un rapport PIN, correspondant au rapport de la quantité
massique des chaînes hydrocarbonées de type paraffinique sur la quantité
massique des chaînes hydrocarbonées de type naphténique, compris entre 2 et 6.

Selon un mode de réalisation, la phase huileuse de l'émulsion selon l'invention peut comprendre au moins un composé choisi parmi les produits MONTANIDE commercialisés par SEPPIC tels que ceux décrits dans la demande FR 2 955 776.

5 La phase huileuse de l'émulsion selon l'invention peut en outre comprendre au moins un tensioactif.
Selon un mode de réalisation, le ratio entre le volume de phase huileuse et le io volume de phase aqueuse est compris entre 4:1 et 3:3. De préférence, ce ratio est égal à 4:1, 3:1, 2:1, 3:2, ou 3:3 et est de préférence 3:1.
Selon un mode de réalisation, l'émulsion selon l'invention comprend de 40% à
80%, de préférence de 60% à 80%, en poids de phase huileuse par rapport au poids total de ladite émulsion.
Phase aqueuse L'émulsion selon l'invention comprend une phase aqueuse dispersée.
La phase aqueuse selon l'invention comprend au moins de l'eau.
Selon un mode de réalisation, l'émulsion selon l'invention comprend de 20% à
60%, de préférence de 20% à 40%, en poids de phase aqueuse par rapport au poids total de ladite émulsion.
La phase aqueuse selon l'invention est sous forme de gouttes, de tailles supérieures au micron.
Selon un mode de réalisation, la taille des gouttes de la phase aqueuse est comprise entre 10 i..tm et 100 11m, de préférence entre 20 i..tm et 50 iim.
Nanoparticules La phase aqueuse de l'invention comprend au moins une nanoparticule à
base de polyester.
L'utilisation de particules solides dans la formulation d'une émulsion permet de réduire, voire d'éviter, l'utilisation de tensioactifs synthétiques, et des interfaces très stables sont obtenues. De telles émulsions stabilisées par des particules solides

6 sont appelées émulsions de Pickering. Les émulsions de Pickering conservent les propriétés basiques des émulsions classiques stabilisées par les tensioactifs, de sorte qu'une émulsion classique peut être substituée par une émulsion de Pickering dans la plupart des applications. Leur caractère sans agent tensioactif les rend très attractives, en particulier pour les applications biomédicales telles que la chimio-embolisation.
Selon un mode de réalisation, les nanoparticules selon l'invention sont biodégradables.
io Les nanoparticules à base de polyester biodégradables sont utilisées comme particules solides pour stabiliser l'interface eau / huile dans les émulsions.
Ces nanoparticules ont une faible toxicité et une réponse inflammatoire limitée est observée en présence de ces nanoparticules. Ainsi, les émulsions selon l'invention présentent les avantages d'être biodégradables, biocompatibles et potentiellement moins toxiques ou irritantes que les émulsions habituelles stabilisées avec des tensioactifs synthétiques ou des particules minérales.
Les nanoparticules selon l'invention sont des nanoparticules polymériques bien connues de l'homme du métier.
Selon l'invention, ces nanoparticules sont des particules pleines ayant au moins deux dimensions inférieures à 1 11m. De préférence, ces nanoparticules sont des nanosphères avec un coeur matriciel de taille moyenne inférieure à 1 i..tm (lorsqu'elles sont mesurées par diffusion de la lumière).
De préférence, les nanoparticules ont une taille en moyenne de 200 nm. Elles sont globalement comprises entre 50 nm et 400 nm et plus précisément entre 100 nm et 300 nm.
Dans le cadre de la présente invention, le terme "taille" désigne le diamètre.
Selon un mode de réalisation, les émulsions de l'invention comprennent entre 5 et 25 mg/mL, de préférence 15 mg/mL, de nanoparticules telles que définies ci-dessus.
Les nanoparticules selon l'invention sont à base de polyester. Comme mentionné ci-dessus, elles sont de préférence pleines et donc constituées d'au moins un polyester.

7 Selon un mode de réalisation, les nanoparticules à base de polyester sont choisies dans le groupe constitué des nanoparticules à base de poly acide lactique (polylactide), poly acide glycolique (polyglycolide), de copolymères de lactide-glycolide (avec différents ratios de lactide / glycolique), de copolymères de lactide-glycolide-co-polyéthylène glycol, de polyorthoesters, de polyanhydrides, de polybutylacétone, de polyvalérolactone, de poly acide malique, de polylactones et de leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation, les nanoparticules à base de polyester io comprennent en outre des particules d'oxyde de fer, de préférence de taille comprise entre 5 nm et 30 nm, et préférentiellement égale à 10 nm.
Un avantage de l'utilisation d'émulsions de Pickering pour l'injection est la possibilité de les rendre détectables par IRM, grâce à la nature huileuse du vecteur et/ou grâce à l'incorporation de particules d'oxyde de fer. Aujourd'hui, l'IRM
est de plus en plus utilisée chez les patients en raison d'une précision et d'une sensibilité
pour le diagnostic significativement plus élevées dans la détection des carcinomes hépatocellulaires par rapport au scanner. Ainsi, un agent d'imagerie a été
introduit dans les nanoparticules stabilisantes utilisées selon l'invention. Les particules d'oxyde de fer sont considérées comme des agents de contraste T2 efficaces.
Par conséquent, selon un mode de réalisation, l'agent thérapeutique est encapsulé
à
l'intérieur des gouttelettes d'eau, alors que les particules d'oxyde de fer sont incorporées dans les nanoparticules stabilisant ces gouttelettes. Avoir l'agent thérapeutique avec les nanoparticules d'oxyde de fer sous une seule forme injectable permet de suivre le devenir de la thérapie après administration.
Agent thérapeutique L'émulsion selon l'invention comprend au moins un agent thérapeutique.
Selon l'invention, ledit agent thérapeutique est encapsulé dans les gouttes de phase aqueuse.
Cette encapsulation est avantageuse en ce qu'elle permet de protéger et donc stabiliser certains types d'agents thérapeutiques, notamment les molécules fragiles comme les anticorps monoclonaux.
Les anticorps monoclonaux de fait de leur structure protéinique peuvent être dégradés quand ils sont exposés à la chaleur, lumière, pH, ou sous forte agitation, en présence de certains métaux et huiles / solvants organiques. Ce sont des molécules fragiles dont la manipulation peut présenter des risques d'agrégation

8 voire de dénaturation. Ils risquent d'être altérés et dénaturés lors de leur incorporation dans un vecteur sauf à prévoir un système de protection. Les émulsions actuelles ne permettent pas le transport de ces principes actifs et leur libération contrôlée. En introduisant une barrière physique via les nanoparticules stabilisantes entre les gouttelettes d'eau contenant l'agent thérapeutique et l'huile, l'anticorps reste stable.
Selon un mode de réalisation, l'agent thérapeutique est choisi parmi les immunomodulateurs, les médicaments anticancéreux, les médicaments anti-angiogéniques, les médicaments anti-infectieux, les médicaments anti-inflammatoires, les agents de contraste d'imagerie, les agents radioactifs et les agents infectieux.
Selon l'invention, le terme immunomodulateur désigne un composé apte à
moduler la réponse immunitaire.
Parmi les agents thérapeutiques, on peut également citer les anticorps ciblant les antigènes tumoraux. Selon l'invention, le terme antigène tumoral désigne une molécule spécifiquement présente à la surface des cellules (par exemple :
facteur de croissance de l'endothélium vasculaire, CTLA-4, PD1 ou PDL-1).
Selon l'invention, le terme médicament anti-angiogénique désigne un médicament destiné à inhiber le processus de croissance de nouveaux vaisseaux sanguins (néovascularisation) à partir de vaisseaux préexistants (par exemple Bevacizumab, Sunitinib ou Sorafenib).
Selon l'invention, le terme médicament anti-infectieux désigne un médicament destiné au traitement des infections d'origine microbienne (antibiotiques, anti-viraux ou anti-fongiques par exemple). Parmi les antibiotiques, on peut citer par exemple l'amoxicilline ou la céfazoline.
Selon l'invention, le terme médicament anti-inflammatoire désigne un médicament destiné au traitement des inflammations (anti-inflammatoires stéroïdiens et non stéroïdiens). Par exemple, on peut citer la méthylprednisolone ou le kétoprofène.
Selon l'invention, le terme agent de contraste d'imagerie désigne une substance qui augmente artificiellement le contraste permettant de visualiser une structure anatomique ou naturellement peu ou pas contrastée. On peut plus particulièrement citer les produits de contraste iodés, les produits de contraste IRM
ou les radio-éléments.

9 Selon l'invention, le terme radio-éléments désigne un élément chimique qui émet un rayonnement a, 13- ou y souvent accompagné de l'émission de photons de haute énergie. Ces éléments sont utilisés en médecine nucléaire à des fins de diagnostic à faible dose, et à des fins thérapeutiques à forte dose pour soigner les cancers (99mTechnetium, 18Fluor, 123Iode, 99Yttrium, 131Iode ou 166Holmium par exemple).
Selon l'invention, le terme agent infectieux désigne un agent biologique responsable d'une maladie infectieuse (comme les bactéries, les virus, les prions, les levures et les parasites).
Selon un mode de réalisation, l'émulsion selon l'invention comprend, à titre d'agent thérapeutique, au moins un médicament anticancéreux.
De préférence, le médicament anticancéreux est choisi dans le groupe constitué des agents alkylants, des dérivés du platine, des agents antibiotiques cytotoxiques, des agents antimicrotubules, des anthracyclines, des inhibiteurs de topoisomérases des groupes I et II, des fluoropyrimidines, des analogues de cytidine, des analogues d'adénosine, du méthotrexate, de l'acide folinique, des enzymes, des agents antivasculaires, des agents anti-angiogéniques, des agents antimitotiques, notamment des agents poisons du fuseau, des inhibiteurs de kinases, des hormones, des anticorps monoclonaux, des radioéléments, des virus oncolytiques et de leurs mélanges.
Parmi les agents alkylants, on peut citer par exemple le cyclophosphamide, le melphalan, l'ifosfamide, le chlorambucil, le busulfan, le thiotepa, la prednimustine, la carmustine, la lomustine, la semustine, la steptozotocine, la decarbazine, la témozolomide, la procarbazine et l'hexaméthylmélamine.
Parmi les dérivés du platine, on peut citer notamment le cisplatine, le carboplatine et l'oxaliplatine.
Parmi les agents antibiotiques cytotoxiques, on peut par exemple citer la bléomycine, la mitomycine et la dactinomycine.
Parmi les agents antimicrotubules, on peut mentionner notamment la vinblastine, la vincristine, la vindésine, la vinorelbine et les taxoïdes (paclitaxel et docétaxel).
Parmi les anthracyclines, on peut mentionner la doxorubicine, la daunorubicine, l'idarubicine, l'épirubicine, la mitoxantrone et la losoxantrone.

Parmi les inhibiteurs de topoisomérases des groupes 1 et 11, on peut par exemple citer l'étoposide, le teniposide, l'amsacrine, l'irinotécan, le topotecan et le tomudex.
Parmi les antimétabolites, on peut citer le métothréxate ou l'hydroxyurée.
5 Parmi les fluoropyrimidines, on peut citer la 5-fluorouracile, l'UFT ou la floxuridine.
Parmi les analogues de cytidine, on peut citer la 5-azacytidine, la cytarabine, la gemcitabine, la 6-mercaptomurine et la 6-thioguanine.
Parmi les analogues d'adénosine, on peut tels que la pentostatine, la

10 cytarabine ou le phosphate de fludarabine Parmi les enzymes et composés divers, on peut aussi citer la L-asparaginase, l'hydroxyurée, l'acide trans-rétinoique, la suramine, la dexrazoxane, l'amifostine, l'herceptine ainsi que les hormones oestrogéniques et androgéniques.
Parmi les agents antivasculaires, on peut mentionner les dérivés de la combretastatine, par exemple la CA4P, des chalcones ou de la colchicine, par exemple le ZD6126, et leurs prodrogues.
Parmi les agents anti-angiogéniques, on peut citer le bevacizumab, le sorafenib ou le sunitinib malate.
Parmi les agents thérapeutiques inhibiteurs de tyrosine kinase, on peut citer l'imatinib, le gefitinib, le sunitinib, le sorafenib, le vandetanib et l'erlotinib.
Parmi les agents poisons du fuseau, on peut citer la vincristine, la vinblastine, le taxol et le taxotère.
Parmi les radioéléments, on peut citer le 99mTechnetium, le 18Fluor, l'123Iode, le 32Phosphore, le 89Strontium, l'93Yttrium, l'131Iode, l'1661-lolmium, le 18 Rhenium et l'169Erbium.
Parmi les virus oncolytiques, on peut citer le T-VEC.
De préférence, l'agent thérapeutique est un médicament anticancéreux choisi dans le groupe constitué de la doxorubicine, de l'irinotécan, de l'oxaliplatine et de leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation, l'émulsion selon l'invention comprend, à titre d'agent thérapeutique, au moins un anticorps ciblant les antigènes, et plus particulièrement au moins un anticorps monoclonal.
Selon un mode de réalisation, l'anticorps est un anticorps ciblant les antigènes tumoraux choisi dans le groupe constitué des anticorps monoclonaux anti-

11 angiogéniques, des anticorps monoclonaux anti-CTLA-4, des anticorps monoclonaux anti-PD-1, des anticorps monoclonaux anti-PD-L1, et de leurs mélanges.
Parmi les anticorps monoclonaux anti-angiogeniques, on peut citer notamment le bévacizumab.
Parmi les anticorps monoclonaux anti-CTLA-4, on peut citer notamment l'ipilimumab et le tremelimumab.
Parmi les anticorps monoclonaux anti-PD-1, on peut citer notamment le nivolumab et le pembrolizumab.
io Parmi les anticorps monoclonaux anti-PD-L1, on peut notamment citer l'Atezolizumab et l'Avelumab.
Selon un mode de réalisation, l'émulsion selon l'invention comprend entre 5 et 25 mg/mL d'agent thérapeutique.
De préférence, lorsque l'émulsion comprend de la doxorubicine à titre d'agent thérapeutique, la concentration en agent thérapeutique est comprise entre 10 et mg/mL, et est de préférence égale à 20 mg/mL.
De préférence, lorsque l'émulsion comprend de l'irinotécan à titre d'agent thérapeutique, la concentration en agent thérapeutique est égale à 20 mg/mL.
De préférence, lorsque l'émulsion comprend de l'oxaliplatine à titre d'agent 20 thérapeutique, la concentration en agent thérapeutique est égale à 5 mg/mL.
De préférence, lorsque l'émulsion comprend de l'ipilimumab à titre d'agent thérapeutique, la concentration en agent thérapeutique est égale à 5 mg/mL.
La présente invention concerne également un médicament, caractérisé en ce 25 qu'il comprend une émulsion telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une émulsion telle que définie ci-dessus, ainsi qu'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Ces compositions pharmaceutiques contiennent une dose efficace d'au moins une émulsion selon l'invention (contenant au moins un agent thérapeutique), ainsi qu'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels qui sont connus de l'homme du métier.
Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intra-veineuse,

12 intra-artérielle, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique ou rectale, l'émulsion peut être administrée sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des excipients pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour le traitement des troubles ou des maladies ci-dessus.
Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient.
La présente invention concerne également une émulsion telle que définie ci-io dessus pour son utilisation à titre de médicament.
La présente invention concerne également une émulsion telle que définie ci-dessus pour son utilisation pour le traitement du cancer.
La présente invention, selon un autre de ses aspects, concerne également une méthode de traitement du cancer comprenant l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'une émulsion selon l'invention.

13 DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente des images de microscopie optique des émulsions obtenues à différentes concentrations de nanoparticules de PLGA.
La Figure 2 représente des images de microscopie optique des émulsions obtenues à différents ratios Lipiodol / sérum physiologique.
La Figure 3 représente le suivi du crémage au turbiscan sur 24 heures d'une to émulsion 3/1 stabilisée avec 15 mg/mL de nanoparticules.
La Figure 4 représente le suivi du déphasage au turbiscan sur 15 minutes d'une émulsion 3/1 non stabilisée par des nanoparticules (avant émulsion et après minutes de suivi).
La Figure 5 concerne l'injectabilité d'émulsions. La Figure 5A concerne l'injectabilité d'émulsions au travers d'un cathéter Progreat 2.4F à
différents ratios à
une vitesse de 2 mm/s (la courbe 'a' correspond à une émulsion avec un ratio huile/eau de 8:3, la courbe 'ID' correspond à une émulsion avec un ratio huile/eau de 3:1, la courbe 'c correspond à une émulsion avec un ratio huile/eau de 6:1 et la courbe 'd' correspond au Lipiodol seul. La Figure 5B concerne l'injectabilité
d'une émulsion 3/1 à différentes vitesses d'injection (a : 6 mm/s ; b : 4 mm/s ; c :
2 mm/s et d : 1 mm/s). La Figure 50 concerne l'injectabilité d'émulsions au travers d'une aiguille 18G à différents ratios à une vitesse de 2 mm/s (a: Lipiodol seul ; b : ratio 3:2 ; c : ratio 6:1 et d : ratio 8:3).
La Figure 6 représente le suivi du crémage au turbiscan sur 24 heures d'une émulsion 3/1 stabilisée avec 15 mg/mL de nanoparticules à une concentration de 20 mg/mL de doxorubicine.
La Figure 7 représente le suivi du déphasage au turbiscan sur 4 heures d'une émulsion 4/1 non stabilisée par des nanoparticules à une concentration de 20 mg/mL de doxorubicine.
La Figure 8 concerne la libération in vitro de la doxorubicine d'émulsions lipiodolées de ratio 3/1 chargées à une concentration de 20 mg/mL en doxorubicine

14 sans nanoparticules (courbe avec les losanges) et avec nanoparticules à 15 mg/mL
(courbe avec les triangles) et de billes chargées (courbe avec les carrés).
La Figure 9 concerne la libération in vitro de l'irinotécan avec des émulsions stabilisées par des nanoparticules (NP) à une concentration en irinotécan à
20 mg/mL (ronds), à un ratio 3/1 comparée à une émulsion non stabilisée (triangles), à des billes chargées en irinotécan (losanges) et à l'irinotécan libre (carrés).
io La Figure 10 concerne la libération in vitro de l'irinotécan avec des émulsions stabilisées par des NP à une concentration de 15 mg/mL, à un ratio 3/1 (triangles), 3/2 (carrés) et 1/1 (losanges).
La Figure 11 représente le pourcentage de libération in vitro de platine avec des émulsions réalisées avec différents ratios de Lipiodol et d'oxaliplatine, avec ou sans nanoparticules stabilisatrices. La courbe avec les losanges correspond à
un ratio 3/1 sans nanoparticules, la courbe avec les carrés correspond à un ratio avec des nanoparticules, la courbe avec les triangles correspond à un ratio 2/1 avec des nanoparticules et la courbe avec les croix correspond à un ratio 1/1 avec des nanoparticules.
La Figure 12 représente la quantité de platine libérée in vitro avec des émulsions réalisées avec différents ratios de Lipiodol et d'oxaliplatine, avec ou sans nanoparticules stabilisatrices. La courbe avec les losanges correspond à un ratio 3/1 sans nanoparticules, la courbe avec les carrés correspond à un ratio 3/1 avec des nanoparticules, la courbe avec les triangles correspond à un ratio 2/1 avec des nanoparticules et la courbe avec les croix correspond à un ratio 1/1 avec des nanoparticules.
La Figure 13 concerne la libération in vitro de l'ipilimumab d'émulsions lipiodolées de ratio 3/1 stabilisées par des NP à une concentration de 15 mg/mL.
La Figure 14 concerne la pharmacocinétique plasmatique de l'oxaliplatine après injection d'émulsions lipiodolées de Pickering (trait pointillé) ou d'émulsions lipiodolées conventionnelles (trait plein) dans les artères gauches hépatiques.

EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation de nanoparticules biodégradables de PLGA
Les nanoparticules PLGA ont été préparées selon le procédé d'émulsion-5 évaporation déjà décrit dans la littérature (Astete, C. E.; Sabliov, C.
M. Synthesis and Characterization of PLGA Nanoparticles. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2006, 17(3), 247-289). 100 mg de PLGA ont été dissous dans un 5 mL de dichlorométhane et émulsif iés par sonication (sonicateur VibraCell, Fisher Scientific, France) à une puissance de 40% pendant 1 minute avec 20 ml d'une solution io aqueuse contenant 2,5 mg / mL de PVA. Le solvant organique a ensuite été
évaporé à température ambiante sous agitation magnétique pendant 2 h. Après évaporation, les NP ont été purifiées par ultracentrifugation (LE-80K
Ultracentrifuge Beckman Coulter OptimaTM) à 4 C, 37 000 g pendant 1 h. Après l'élimination du surnageant, les NP ont été remises en suspension dans une solution aqueuse

15 contenant 50 mg / mL de tréhalose (cryoprotecteur). Puis, la suspension des NP a été lyophilisée. Avant utilisation, les NP lyophilisées ont été redispersées dans de l'eau MilliQ à la concentration désirée.
Exemple 2: Obtention d'une émulsion eau-dans-huile de sérum physiologique stabilisée par différentes concentrations de nanoparticules de PLGA
Les émulsions ont été formulées avec un ratio lipiodol (Guerbet, France) /
sérum physiologique de 3/1 (v/v) par pompage répétitif (70 aller/retour) de 2 seringues de 10 ml au travers d'un robinet 3 voies pendant 70 secondes. La première seringue contient le lipiodol, la seconde est vide et le sérum physiologique disposé dans une 3e" seringue est introduit graduellement dans le système via un pousse-seringue avec un débit de 1 mUmin. La phase aqueuse est une suspension de nanoparticules à différentes concentrations dans du sérum physiologique (cf.
Figure 1).
Exemple 3: Obtention d'une émulsion eau-dans-huile de sérum physiologique stabilisée par des nanoparticules de PLGA à différents ratios huile/eau Les émulsions ont été formulées selon le même protocole que l'exemple 1 à
une concentration de 15 mg/mi de nanoparticules avec des ratios lipiodol /
sérum physiologique variables (cf. Figure 2).

16 Exemple 4 : Détermination du sens de l'émulsion par un drop test Pour chaque émulsion, le type d'émulsion (eau-dans-huile ou huile-dans-eau) a été déterminé par un test colorimétrique en utilisant deux solutions, l'une contenant du Lipiodol (coloré préalablement par du rouge Soudan) et l'autre contenant du sérum physiologique (colorée préalablement par du bleu de méthylène). Une gouttelette de l'une des solutions a été ajoutée sur une goutte de l'émulsion testée. La phase continue de l'émulsion a été révélée en observant la miscibilité éventuelle des gouttelettes de solutions avec la goutte d'émulsion. Le test a été effectué immédiatement après l'émulsif ication.
L'analyse colorimétrique d'une émulsion de ratio 3/1 avec 15 mg/mi de nanoparticule par ajout de colorant à la phase aqueuse ou à la phase Lipiodol, a permis de montrer que l'émulsion obtenue est de type eau-dans-huile. En effet, la phase continue de la goutte d'émulsion est colorée par le Lipiodol, et pas par l'eau.
Exemple 5: Etude de la stabilité des émulsions stabilisées par des nanoparticules vs non stabilisée L'émulsion a été analysée à l'aide d'un Turbiscan MA 2000 (Formulation, L'Union, France). Le tube contenant l'émulsion n'a pas été enlevé ou même touché
de l'appareil jusqu'à la fin de la mesure afin d'éviter toute perturbation du système.
Les mesures ont été effectuées à des temps prédéterminés selon l'évolution du système. Cette surveillance a été effectuée jusqu'à ce que l'évolution des intensités soit négligeable. Le Turbiscan permet de mesurer les phénomènes de déstabilisation réversibles (crémage et sédimentation) et irréversibles (coalescence et ségrégation) dans l'échantillon sans dilution (Figures 3 et 4).
Exemple 6: Etude d'injectabilité des émulsions eau-dans-huile stabilisées par des nanoparticules L'injectabilité des émulsions a été étudiée à l'analyseur de texture (TA-XT2, Texture Technologies). Les mesures ont été faites avec des seringues Médaillon de 1 ml (Merit ) connectées soit à un micro-cathéter vasculaire (diamètre :
2,4 F) soit à une aiguille 18 gauge. Différents ratios huile/eau (8/3, 3/1 et 6/1) ont été
étudiés à une vitesse de 2 mm/s et pour le ratio 3/1, différentes vitesses d'injections ont été testées. L'huile seule (Lipiodol) a été utilisée comme contrôle (Figure 5).

17 Exemple 7: Obtention d'émulsions lipiodolées eau-dans-huile chargées en doxorubicine stabilisées par des nanoparticules Les émulsions ont été formulées selon le même protocole que l'exemple 2. La phase aqueuse est composée de chlorhydrate de doxorubicine reconstituée à une concentration de 10 ou 20 mg/mi dans une solution saline (Adriblastine, Pfizer, USA) pour la formulation d'émulsions. Les émulsions ont été réalisées en utilisant différents ratios Lipiodol/doxorubicine, différentes concentrations de doxorubicine et différentes concentrations de nanoparticules (cf. Tableau 1 ci-dessous).
Concentration de Concentration de Ratio doxorubicine nanoparticules Lipiodol/doxorubicine (mg/mL) (mg/mL) io Les émulsions thérapeutiques obtenues étaient toutes dans le sens eau-dans-huile, c'est-à-dire inverses quelles que soient les conditions utilisées.
Exemple 8: Stabilité des émulsions lipiodolées eau-dans-huile chargées en doxorubicine stabilisées par des nanoparticules Les analyses ont été réalisées suivant le protocole de l'exemple 5. Le crémage des diverses émulsions a été rapidement observée au Turbiscan mais sans déphasage sur un suivi de 24h (Figure 6).
A contrario, les émulsions thérapeutiques de doxorubicine réalisées sans nanoparticules de PLGA montraient un déphasage complet très rapide (<5h)(Figure 7).
Exemple 9: Obtention d'émulsions lipiodolées eau-dans-huile chargées en anticorps monoclonaux stabilisées par des nanoparticules Les émulsions ont été formulées selon le même protocole que l'exemple 2. La phase aqueuse est composée d'un anticorps (5 mg/mi d'Ipilimumab, Yervoy, Bristol

18 Myers Squibb). Les émulsions ont été réalisées à un ratio Lipiodol/ipilimumab de 3/1 avec une concentration de 15 mg/mi en nanoparticules.
Les émulsions obtenues étaient dans le sens eau-dans-huile et stables sur plusieurs semaines. Aucune agrégation des anticorps n'a été observée contrairement aux émulsions préparées sans nanoparticules.
L'intégrité des anticorps a été vérifiée par western-blot en condition dénaturante. La migration a été faite sur gel de polyacrylamide et les échantillons ont été préparés avec 2% de SDS (méthode connue de l'homme du métier).
L'électrophorèse est effectuée à 120V pendant 90 minutes et le transfert sur io membrane à 100V pendant 45 minutes. La membrane est lavée à l'éthanol et la révélation des anticorps a été faite au rouge de Ponceau.
Les nanoparticules ont montré leur efficacité à conserver l'intégrité de l'agent thérapeutique, dans cet exemple, l'ipilimumab.
Exemple 10: Etude de la libération in vitro de la doxorubicine des émulsions lipiodolées stabilisées par des nanoparticules La libération in vitro de la doxorubicine d'émulsions lipiodolées de ratio 3/1 chargées à une concentration de 20 mg/mi en doxorubicine (2 types : sans nanoparticules, avec nanoparticules à 15 mg/mi) ou de billes chargées à 25 mg/mL
en doxorubicine (DC beads, Biocompatibles taille 300-500 iim) a été évaluée.
0,8 mL d'émulsion (correspondant à 4 mg de doxorubicine) ou 0,16 mL de billes chargées ont été introduits dans des tubes GeBAflex (cut-off: 12-14 kDa; Gene Bio-Application Ltd.). Ces tubes ont été immergés dans 40 ml de solution salée tamponnée (TRIS, pH 7,4) et mis dans un incubateur à 37 C à une vitesse de 150 tpm. A des temps prédéterminés, des aliquots (80 !IL) ont été collectés et remplacés par des volumes équivalents de TRIS.
Les quantités libérées de doxorubicine ont été quantifiées par densité optique à 492 nm dans une microplaque à 96 puits (Figure 8).
Exemple 11: Etude de la libération in vitro de l'irinotécan des émulsions lipiodolées stabilisées par des nanoparticules Les émulsions ont été formulées selon le même protocole que l'exemple 2. La phase aqueuse est composée d'irinotécan (chlorhydrate d'irinotécan trihydraté, 20 mg/mL ; Campto , Pfizer).
La libération in vitro de l'irinotécan d'émulsions lipiodolées (4 types : sans nanoparticules ratio 3/1, avec nanoparticules à 15 mg/mL à des ratios 3/1 ;
3/2; 1/1)

19 ou de billes chargées à 20 mg/mL en irinotécan (DC beads, Biocompatibles taille 300-500 iim) a été évaluée. 0,8 mL d'émulsion (correspondant à 4 mg, 6,4 mg et 8 mg d'irinotécan pour les émulsions 3/1 ; 3/2 et 1/1 respectivement) ou 0,08 mL de billes chargées ont été introduits dans des tubes GeBAflex (cut-off: 12-14 kDa;
Gene Bio-Application Ltd.). Ces tubes ont été immergés dans 40 mL de solution salée tamponnée (PBS, pH 7,4) et mis dans un incubateur à 37 C à une vitesse de 150 tpm. A des temps prédéterminés, des aliquots (0,5 mL) ont été collectés et remplacés par des volumes équivalents de PBS.
Les quantités libérées d'irinotécan ont été quantifiées par spectroscopie UV à
370 nm (Figures 9 et 10).
Exemple 12: Etude de la libération in vitro de l'oxaliplatine des émulsions lipiodolées stabilisées par des nanoparticules Les émulsions ont été formulées selon le même protocole que l'exemple 2. La phase aqueuse est composée d'oxaliplatine (Eloxatine , 5 mg/mL, Sanofi-Aventis).
La libération in vitro de l'oxaliplatine d'émulsions lipiodolées (4 types :
sans nanoparticules ratio 3/1, avec nanoparticules à 15 mg/mL à des ratios 3/1 ;
3/2; 1/1) a été évaluée. 0,8 ml d'émulsion (correspondant à 1 mg, 1,33 mg et 2 mg d'oxaliplatine pour les émulsions 3/1 ; 3/2 et 1/1 respectivement). Ces tubes ont été
immergés dans 40 mL de solution salée tamponnée (acétate 25 mM, pH 6,8) et mis dans un incubateur à 37 C à une vitesse de 150 tpm. A des temps prédéterminés, des aliquots (0,1 mL) ont été collectés.
Les quantités libérées de platine ont été quantifiées par spectrométrie de masse ICP (Figures 11 et 12).
Exemple 13: Emulsions eau-dans-huile stabilisées par des nanoparticules formulées à partir de différentes huiles Les émulsions ont été formulées à un ratio 3/1 selon le même protocole que l'exemple 2. La phase aqueuse est composée soit de sérum physiologique soit de doxorubicine à une concentration de 20 mg/mL. La phase huile est composée soit d'huile d'olive, d'huile de sésame, d'huile de ricin, d'huile d'oeillette ou de miglyol.
Toutes les émulsions sont formulées avec des nanoparticules à une concentration de 15 mg/ml.
Les émulsions sont de type eau-dans-huile d'après le test colorimétrique et stables sur plus d'une semaine.

Exemple 14: Préparation des nanoparticules biodégradables de PLGA-Fer Les nanoparticules PLGA-Fer ont été préparées selon le même procédé décrit dans l'exemple 1. 500 pL de solution de nanoparticules Fe304 décorées d'acide 5 oléique (25 mg mL-1, taille 10 nm, Ocean, USA) ont été ajoutés à 100 mg de PLGA
préalablement dissous dans 5 mL de dichlorométhane et émulsif iés par sonication (sonicateur VibraCell, Fisher Scientific, France) à une puissance de 40%
pendant 1 minute avec 20 mL d'une solution aqueuse contenant 2,5 mg / mL de PVA. Le solvant organique a ensuite été évaporé à température ambiante sous agitation to magnétique pendant 2 h. Après évaporation, la suspension a été
centrifugée à
3 000 tpm pendant 5 min, le surnageant a été éliminé, et le culot a été rincé
avec de l'eau désionisée. Le processus de centrifugation a été répété deux fois.
Ensuite, les NP ont été purifiées par ultracentrifugation (LE-80K Ultracentrifuge Beckman Coulter OptimaTM) à 4 C, 37 000 g pendant 1 h. Après l'élimination du surnageant, 15 les NP ont été remises en suspension dans une solution aqueuse contenant 50 mg /
mL de tréhalose (cryoprotecteur). Puis, la suspension des NP a été
lyophilisée.
Avant utilisation, les NP lyophilisées ont été redispersées dans de l'eau MilliQ
à la concentration désirée.

20 Exemple 15: Obtention d'une émulsion lipiodolée eau-dans-huile de sérum physiologique stabilisée par différentes concentrations de nanoparticules de PLGA-Fer Les émulsions ont été formulées selon le même protocole que l'exemple 2 à
différentes concentrations de nanoparticules de PLGA-Fer (20, 15 ou 10 mg/mL).
Les émulsions sont de type eau-dans-huile d'après le test colorimétrique.
Exemple 16: Obtention d'une émulsion lipiodolée eau-dans-huile de doxorubicine stabilisée par des nanoparticules de PLGA-Fer L'émulsion a été formulée selon le même protocole que l'exemple 2 à une concentration de 20 mg/mL en doxorubicine et 15 g/mL en nanoparticules de PLGA-Fer. Une émulsion eau-dans-huile a été obtenue.
Exemple 17 : Microstructure des émulsions La structure microscopique des émulsions a été observée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (Leica TCS 5P8 - STED, Allemagne) équipé
d'un laser WLL (488 et 563 nm d'ondes d'excitation) et d'un objectif d'immersion

21 CS2 63x / 1,40. Pour empêcher la déformation des gouttelettes d'émulsion, l'échantillon a été placé sur une lame en verre incurvée. Les nanoparticules de PLGA-Fer ont été utilisées pour formuler les émulsions afin de pouvoir les visualiser en transmission (évite les interférences avec le spectre d'émission de la doxorubicine). La fluorescence de la doxorubicine a été observée avec un filtre de 600-710 nm sous une illumination au laser à 590 nm. Les émissions de fluorescence rouge ont été collectées sous un mode séquentiel.
Exemple 18 : Evaluation de la quantification par IRM de l'émulsion io Les émulsions ont été évaluées en IRM pour confirmer que cette modalité
d'imagerie permettait de quantifier le ratio d'huile contenu dans un fantôme tumoral.
Pour cela, 9 fantômes tumoraux ont été confectionnés, chacun rempli avec une émulsion contenant des pourcentages variables de Lipiodol. Puis nous avons réalisé des IRM 3T pour chaque fantôme en présence d'un tube de Lipiodol (acquisition IP-OP et ldeal 10). Enfin, nous avons calculé le pourcentage de graisse dans chacun des fantômes en prenant pour référence : Lipiodol = 100%
(cf. Tableau 2 ci-dessous).
% réel % calculé en IRM
1 88,9 91,51 2 85,7 87,06 3 80 83,11 4 75 74,35 5 72,7 72,78 6 66,7 63,54 7 60 65,33 8 57,1 59,75 9 54,5 60,69 Tableau 2 : Quantification par IRM du pourcentage de Lipiodol dans des émulsions possédant des taux décroissants de Lipiodol.
Exemple 19 : Obtention d'émulsions lipiodolées eau-dans-huile chargées en principe actif Les émulsions ont été formulées selon le même protocole que l'exemple 2. La phase aqueuse est composée de principe actif préalablement reconstituée à une concentration thérapeutique recommandée par le fournisseur ou directement d'un principe actif en solution aqueuse à la concentration de la forme commerciale.
Les émulsions ont été réalisées à un ratio Lipiodol/principe actif en solution de 3/1 avec une concentration de 15 mg/mL en nanoparticules.

22 La phase aqueuse est composée soit de gemcitabine (40 mg/mL), de fludarabine (25 mg/mL), de clamoxyl (200 mg/mL), de céfazoline (330 mg/mL), de sunitinib (0,5 mg/mL), de méthylprédnisolone (10 mg/mL) ou de kétoprofène (25 mg/mL).
Les émulsions thérapeutiques obtenues étaient toutes dans le sens eau-dans-huile d'après le test colorimétrique.
Exemple 20 : Taille des gouttes :
La mesure de taille de gouttes a été réalisée avec un compteur de particules io par technique d'analyse d'images (Flowcell FC200S+HR, Occhio, Belgique).
L'émulsion est d'abord diluée 20 fois dans l'huile puis 0,5 mL de l'émulsion diluée sont introduits au travers une entretoise de 400 jim pour analyse. Chaque échantillon a été mesuré au moins 4 fois à J7 et à des jours différents (JO, J7, J35) pour les échantillons contenant le sérum physiologique et l'Ipilimumab. Les calculs ont été faits sur au moins 500 gouttes.
Phase aqueuse NP] Ratio Taille des gouttes (lm) [
Lipiodol/phase (mg/mL) JO J7 J35 aqueuse Sérum 15 3/1 41 3 42+2 43 Physiologique 15 2/1 59 3 51 6 57 15 3/2 44+1 45 4 46 3/1 24+7 17+2 27+2 Ipilimumab 15 3/1 37 3 42 5 41 Doxorubicine 15 3/1 / 54 2 /
Irinotécan 15 3/1 / 37 2 /
Gemcitabine 15 3/1 / 41+4 /
Fludarabine 15 3/1 / 41+2 /
Clamoxyl 15 3/1 / 43 7 /
Céfazoline 15 3/1 / 59 15 /
Sunitinib 15 3/1 / 41+2 /
Méthylprédnisolone 15 3/1 / 45 9 /
Tableau 3 : Taille de gouttes des émulsions Lipiodol/principe actif en solution avec 15 mg/mL de nanoparticu les

23 Exemple 21: Etude de la libération in vitro de l'ipilimumab des émulsions lipiodolées stabilisées par des nanoparticules Les émulsions ont été formulées selon le même protocole que l'exemple 9. La libération in vitro de l'ipilimumab d'une émulsion lipiodolée (ratio 3/1, concentration en nanoparticules 15 mg/mL) a été évaluée. 0,8 mL d'émulsion correspondant à 1 mg d'ipilimumab ont été déposés dans des tubes contenant 20 mL de solution salée tamponnée (PBS, pH 7,4) et mis dans un incubateur à 37 C à une vitesse de 150 tpm. A des temps prédéterminés, des aliquots (300 lit) ont été collectés et io remplacés par des volumes équivalents de PBS. Les quantités libérées d'ipilimumab ont été quantifiées par la méthode BOA: dosage colorimétrique des protéines basé
sur l'acide bicinchonique (Figure 13).
Exemple 22: Etude in vivo : Chimioembolisation du foie à partir d'une émulsion lipiodolée eau-dans-huile chargée en oxaliplatine Les émulsions pour cette étude ont été formulées selon le même protocole que l'exemple 12.
Le protocole expérimental de cette étude a été validé par le comité d'éthique en expérimentation animale. Des tumeurs VX2 du foie ont été implantées par voie percutanée sur des lapins blancs néo-zélandais sous anesthésie générale (injections intramusculaires de Kétamine 20-40mg/kg et de xylazine 3-5 mg/kg, isoflurane 3-5 % pour l'induction et 1,5-3 % en mélange avec 02 à 1Umin pour la procédure).
Deux semaines après implantation des cellules tumorales VX2, les injections intra-artérielles hépatiques ont été effectuées par un radiologue interventionnel.
Cela a été réalisé sous anesthésie générale et sous guidage fluoroscopique dans une salle équipée d'une table d'angiographie à rayons X. Tout d'abord, l'artère fémorale a été exposée chirurgicalement et cathéterisée avec un cathéter d'angiographie vasculaire 4F. Ensuite, un micro-cathéter 2.4F a été utilisé
pour le cathétérisme sélectif de la branche gauche de l'artère hépatique et pour injecter 0,5 mL d'émulsion (soit 0,625 mg d'oxaliplatine).
Des prélèvements de sang (2 mL) veineux ont été effectués à 5, 10, 20, 30 et 60 minutes après injection afin de déterminer la concentration plasmatique d'oxaliplatine.

24 4 groupes de lapins ont été réalisés :
Groupe 1 : Lapins recevant une émulsion conventionnelle d'oxaliplatine non stabilisée par des nanoparticules. Ce groupe a été sacrifié lh après l'injection (n=4) Groupe 2 : Lapins recevant une émulsion d'oxaliplatine stabilisée par des nanoparticules. Ce groupe a été sacrifié lh après l'injection (n=5) Groupe 3 : Lapins recevant une émulsion conventionnelle d'oxaliplatine non stabilisée par des nanoparticules. Ce groupe a été sacrifié 24h après l'injection (n=4) Groupe 4 : Lapins recevant une émulsion d'oxaliplatine stabilisée par des nanoparticules. Ce groupe a été sacrifié 24h après l'injection (n=5).
Immédiatement après le sacrifice, une IRM a été réalisée pour mesurer et compter les tumeurs. Le foie a été prélevé et des échantillons de tissus des lobes de foie droits et gauches, ainsi que les tumeurs ont été disséqués séparément et homogénéisés avec un mélangeur pour la quantification du platine. Le platine a été
dosé par une méthode de spectrométrie de masse à plasma (ICP-MS).
Pharmacocinétique de l'oxaliplatine:
Les pharmacocinétiques de l'oxaliplatine après injection des deux types d'émulsion sont résumées dans le tableau 4 et la figure 14. Le pic plasmatique de l'oxaliplatine (Cmax) est significativement inférieur après injection de l'émulsion de Pickering comparé à l'émulsion conventionnelle (0,49 0,14 ng/mL vs 1,08 0,41 ng/mL, p<0,01). L'AUC à 1h est significativement inférieure pour l'émulsion de Pickering (19,8 5,9 vs 31,8 14,9, p=0,03).

Emulsions:
Conventionnelle Pickering Pharmacocinétique n= 8 lapins n= 10 lapins C max (nG/mL) 1,08 0,41 0,49 0,14 p<0,01*
AUC 31,8 14,9 19,8 5,9 p=0,03*
Sacrifice : H+1 n= 4 lapins (groupe 1) n= 5 lapins (groupe 2) lobe Platine (nG/mG) 2,3 1,4 0,6 0,2 p<0,01*
gauche lobe droit 1,3 0, 9 0,5 0,2 p<0,01*
Ratio G/D 1,8 0,7 1,1 0,2 p=0,07 Sacrifice : H+24 n= 4 lapins (groupe 3) n= 5 lapins (groupe 4) Platine (nG/mG) lobe gauche 0,4 0,1 0,3 0,1 p=0,04*
lobe droit 0,2 0,4 0,2 0,03 p=0,5 Ratio G/D 1,7 0,4 1,4 1,0 p=0,2 *Différence significative Tableau 4 : Concentration moyenne d'oxaliplatine (ng/mg) dans les tissus du foie 5 selon le type d'émulsion injectée et selon le temps de sacrifice.
Concentration d'oxaliplatine dans le foie et les tissus :
Les concentrations d'oxaliplatine dans les tissus sont présentées dans les tableaux 4 & 5. A 24h, le ratio tumeur/lobe gauche est significativement supérieur io avec l'émulsion de Pickering comparé à l'émulsion conventionnelle (43,4 42,9 vs 14,5 6,6, p = 0,04).

Emulsions:
Conventionnelle Pickering Sacrifice: H+1 n= 6 tumeurs (groupe 1) n= 9 tumeurs (groupe 2) Diamètre Max tumeur (mM) 14,1 11,1 16,0 5,9 p=0,6 Platine :Tumeurs (nG/mG) 32,1 21,2 17,6 6,7 p=0,02*
ratio tumeur/lobe gauche 18,0 10,8 33,2 14,9 p=0,07 ratio tumeur/lobe droit 29,1 11,4 40,3 19,3 p=0,3 Sacrifice: H+24 n= 9 tumeurs (groupe 3) n= 9 tumeurs (groupe 4) Diamètre Max tumeur (mM) 15,0 2,9 14,5 5,0 p=0,4 Platine :Tumeurs (nG/mG) 4,4 3,8 10,4 9,8 p=0,08 ratio tumeur/lobe gauche 11,8 8,5 44,1 43,3 p=0,02*
ratio tumeur/lobe droit 18,6 17,5 45,6 38,5 p=0,06 *Différence significative Tableau 5: Concentration moyenne d'oxaliplatine (ng/mg) dans les tumeurs du foie selon le type d'émulsion injectée et selon le temps de sacrifice.
La concentration significativement supérieure d'oxaliplatine dans les tumeurs et les lobes gauches avec l'émulsion conventionnelle à lh est cohérente avec une io faible stabilité de l'émulsion qui induit une libération rapide d'oxaliplatine. A l'inverse, la libération lente d'oxaliplatine à partir des émulsions de Pickering conduit à une exposition systémique moindre des organes non ciblés (lobe droit) à 1h et une tendance pour une exposition des tumeurs supérieure à 24h.

Claims

REVENDICATIONS

1. Emulsion eau-dans-huile comprenant une phase huileuse continue et une phase aqueuse dispersée sous forme de gouttes, ladite phase aqueuse comprenant des nanoparticules à base de polyester, et au moins un agent thérapeutique.

2. Emulsion selon la revendication 1, dans laquelle la phase huileuse comprend au moins une huile, notamment choisie parmi les acides gras, les esters d'acide gras et les huiles minérales.

3. Emulsion selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la phase huileuse comprend au moins une huile végétale, en particulier l'huile de ricin, l'huile de sésame, l'huile d' illette, l'huile d'olive, l'huile de soja, l'huile de noix de coco, la trioléine et leurs mélanges.

4. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la phase huileuse comprend des esters éthyliques d'acides gras iodés de l'huile d' illette, des triglycérides de longueurs de chaîne moyennes comprenant entre et 12 atomes de carbone, ou une huile minérale composée principalement de squalène.

5. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la taille des gouttes de la phase aqueuse est comprise entre 10 µm et 100 µm.

6. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle les nanoparticules à base de polyester sont choisies dans le groupe constitué
des nanoparticules à base de poly acide lactique, poly acide glycolique, de copolymères de lactide-glycolide, de copolymères de lactide-glycolide-co-polyéthylène glycol, de polyorthoesters, de polyanhydrides, de polybutylacétone, de polyvalérolactone, de poly acide malique, de polylactones et de leurs mélanges.

7. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle l'agent thérapeutique est choisi parmi les immunomodulateurs, les médicaments anticancéreux, les médicaments anti-angiogéniques, les médicaments anti-infectieux, les médicaments anti-inflammatoires, les agents de contraste d'imagerie, les agents radioactifs et les agents infectieux.

8. Emulsion selon la revendication 7, dans laquelle le médicament anticancéreux est choisi dans le groupe constitué des agents alkylants, des dérivés du platine, des agents antibiotiques cytotoxiques, des agents antimicrotubules, des anthracyclines, des inhibiteurs de topoisomérases des groupes I et II, des fluoropyrimidines, des analogues de cytidine, des analogues d'adénosine, du méthotrexate, de l'acide folinique, des enzymes, des agents antivasculaires, des agents anti-angiogéniques, des agents antimitotiques, des inhibiteurs de kinases, des hormones, des anticorps monoclonaux, des radioéléments, des virus oncolytiques et de leurs mélanges.

9. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle l'agent thérapeutique est un médicament anticancéreux choisi dans le groupe constitué de la doxorubicine, de l'irinotécan, de l'oxaliplatine et de leurs mélanges.

10. Emulsion selon la revendication 7, dans laquelle l'agent thérapeutique est choisi dans le groupe constitué des anticorps monoclonaux anti-angiogéniques, des anticorps monoclonaux anti-CTLA4, des anticorps monoclonaux anti-PD-1, des anticorps monoclonaux anti-PD-L1, et de leurs mélanges.

11. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle les nanoparticules à base de polyester comprennent en outre des particules d'oxyde de fer.

12. Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend une émulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.

13. Composition pharmaceutique comprenant une émulsion selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, ainsi qu'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

14. Emulsion selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 pour son utilisation pour le traitement du cancer.