CA2661567C

CA2661567C - Microparticules a base de copolymere amphiphile et de principe(s) actif(s) a liberation modifiee et formulations pharmaceutiques en contenant

Info

Publication number: CA2661567C
Application number: CA2661567A
Authority: CA
Inventors: Alain Constancis; You-Ping Chan
Original assignee: Flamel Ireland Ltd
Current assignee: Flamel Ireland Ltd
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2007-07-30
Publication date: 2016-09-20
Anticipated expiration: 2027-07-30
Also published as: WO2008025425A1; IL196426A; WO2008025425A8; JP5302197B2; KR101407033B1; CA2661567A1; FR2904219B1; CN101568328B; FR2904219A1; IL196426A0; WO2008025425A9; ZA200900929B; BRPI0714943A2; WO2008025425B1; JP2009544759A; CN101568328A; KR20090054976A; EP2049085A1; MX2009000951A; AU2007291577A1

Abstract

La présente invention concerne de nouvelles microparticules de polyaminoacides amphiphiles transporteurs de principe(s) actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s), ainsi que de nouvelles formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdites microparticules de PA. Le but de l'invention est de mettre au point de nouvelles microparticules chargées en PA obtenues par agrégation de nanoparticules de polyaminoacides amphiphiles, et ayant des propriétés améliorées, notamment sous forme solide sèche, au regard de leur aptitude à la dispersion, et, s'agissant de la suspension reconstituée, de sa stabilité et de son aptitude à être facilement manipulée et injectée. L'invention concerne dans un premier aspect, des microparticules de polyaminoacide amphiphile (PO) contenant au moins un PA (associé de façon non covalente), formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH 7,0, en condition isotonique; lesdites microparticules étant caractérisées a. en ce qu'elles sont obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO comprenant au moins un PA, b. par une taillecomprise entre 0,5 et 100 µm, c. et en ce qu'elles sont dispersables en suspension colloïdale. L'invention concerne également le procédé de préparation de ces microparticules, une formulation liquide comprenant une suspension de ces microparticules PO/PA, un procédé et un nécessaire de reconstitution de cette formulation, et une forme sèche de cette formulation.

Description

MICROPARTICULES A BASE DE COPOLYMERE AlVIPHIPHILE ET DE
PRINCIPE(S) ACTIF(S) A LIBÉRATION MODIFIÉE ET FORMULATIONS
PHARMACEUTIQUES EN CONTENANT
Domaine de l'invention La présente invention concerne de nouveaux transporteurs de principe(s) actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s), ainsi que de nouvelles formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdits transporteurs de PA.
Les applications thérapeutiques (humaines et vétérinaires) de ces formulations sont nombreuses.
La référence PA utilisée dans tout le présent exposé vise au moins un principe actif.
Par "libération modifiée", on désigne une libération prolongée ou retardée ou pulsatile.
Plus précisément les nouveaux transporteurs de PA visés par l'invention sont des microparticules de polymères amphiphiles, par exemple des polyaminoacides modifiés par des groupements hydrophobes. Ces microparticules contiennent au moins un PA
associé
au polymère et peuvent se présenter sous forme de suspensions colloïdales ou sous forme sèche.
Contexte de l'invention Dans le domaine de la libération prolongée des PA pharmaceutiques, notamment des peptides et protéines thérapeutiques, on cherche très souvent à reproduire au mieux chez le patient une concentration plasmatique en peptide ou en protéine proche de la valeur observée chez le sujet sain.
Cet objectif se heurte à la faible durée de vie des protéines dans le plasma, ce qui conduit à injecter de façon répétée la protéine thérapeutique. La concentration plasmatique en protéine thérapeutique présente alors un profil en dents de scie, caractérisé par des pics élevés de concentration et des minima de concentration très bas. Les pics de concentration, très supérieurs à la concentration basale chez le sujet sain, ont des effets nocifs très marqués du fait de la toxicité élevée des protéines thérapeutiques telles que l'interleukine IL-2. Par ailleurs, les minima de concentration sont inférieurs à la concentration nécessaire pour avoir un effet thérapeutique, ce qui entraîne une mauvaise couverture thérapeutique du patient et des conséquences graves à long terme.
Aussi, pour reproduire chez le patient une concentration plasmatique en protéine thérapeutique proche de la valeur idéale pour le traitement du patient, il importe que la formulation pharmaceutique considérée permette de libérer la protéine thérapeutique sur une durée prolongée, de façon à limiter les variations de concentration plasmatique au

2 cours du temps.
Par ailleurs, cette formulation active doit, de préférence, satisfaire au cahier des charges suivant, déjà connu de l'homme de l'art :
1 - libération prolongée d'une protéine thérapeutique active et non dénaturée, par exemple humaine ou synthétique, de sorte que la concentration plasmatique est maintenue au niveau thérapeutique ;
2 - viscosité de la formulation suffisamment basse pour être aisément injectable ;

3 - forme biocompatible et biodégradable ;

4 - forme ne présentant ni toxicité, ni immunogénicité ;

5 - forme ayant une excellente tolérance locale.
Pour tenter d'atteindre ces objectifs, l'une des meilleures approches proposées dans l'art antérieur fut de développer des formes à libération prolongée de protéine(s) thérapeutique(s) constituées par des suspensions, liquides et peu visqueuses, de nano-particules chargées en protéines thérapeutiques. Ces suspensions ont permis l'adminis-tration aisée de protéines thérapeutiques natives.
Ainsi, la protéine thérapeutique a été associée à des nanoparticules d'un copolyaminoacide comprenant des groupements hydrophobes et des groupements hydrophiles.
Le brevet US-B-5,904,936 décrit des particules submicroniques (NPV) - de taille moyenne comprise entre 0,01 et 0,5 1.fin - et des particules micrométriques (microniques) (MPV) - de taille moyenne comprise entre 0,5 et 20 1.im - de copolymère amphiphile de poly-aminoacides comprenant au moins deux types d'aminoacides, l'un étant neutre hydro-phobe, l'autre étant ionisable. Des protéines telles que l'insuline s'adsorbent spontanément en solution aqueuse à ces particules. Le copolymère de polyaminoacide est, par exemple, un copolymère bloc de poly(L-leucine-b-L-glutamate de sodium). Ce brevet décrit l'agrégation de NPV en MPV par addition à une suspension colloïdale de poly-Leu/Glu de sels monocationiques (sulfate d'ammonium), polycationiques (Fe2+, Fe3+, Zn2+, Ca2+, Al2+, Al3+ ou Cu2+), d'acide (HC1) ou de polymères cationiques (polylysine).
La demande de brevet WO-A-03/104303 divulgue des polyaminoacides amphiphiles comprenant des résidus aspartique ou des résidus glutamique, au moins une partie de ces résidus étant porteurs de greffons comportant au moins un motif alpha-tocophérol (par ex.:
polyglutamate ou polyaspartate greffé par l'alpha tocophérol d'origine synthétique ou naturelle). Ces homopolyaminoacides modifiés hydrophobes forment spontanément dans l'eau une suspension colloïdale de nanoparticules, lesquelles sont aptes à
s'associer aisément en suspension aqueuse à pH = 7,4 avec au moins une protéine active (insuline).
La durée de libération in vivo de la (ou les) protéine(s) active(s) (par ex.
insuline) vectorisée par les suspensions selon US-B-5,904,936 ou WO-A-2003/104303 gagnerait à
être augmentée.

L'augmentation de la durée de libération a été partiellement obtenue par les formes pharmaceutiques décrites dans la demande PCT WO-A-05/051416. Dans cette demande est divulguée une suspension colloïdale de nanoparticules (0,001 - 0,5 m) de poly(L-glutamate de sodium) modifié hydrophobe, utilisée à une concentration telle qu'après injection sous-cutanée, il se forme in situ chez le patient un gel au contact de l'albumine endogène. La protéine est alors lentement libérée sur une période typiquement d'une semaine. Cependant, lorsque la concentration en protéine thérapeutique à
administrer est relativement élevée, comme c'est le cas par exemple pour l'hormone de croissance humaine, la durée de libération est limitée à quelques jours seulement.
Objectifs de l'invention Il est souhaitable d'améliorer cet art antérieur en proposant une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée de PA :
= permettant après injection par voie parentérale (par ex. sous-cutanée) d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée pour des PA (par ex.
protéines, peptides thérapeutiques et petites molécules) non dénaturés et fortement concentrés, par exemple à plusieurs mg/ml.
= et qui serait stable à la conservation tant sur le plan physico-chimique que biologique.
Pour ce faire, il convient d'agréger entre elles les nanoparticules de la formulation selon

6 en microparticules, au moyen d'ions multivalents de polarité
opposée à
celle des groupements (GI) ionisables du polyaminoacide amphiphile, lesdits ions étant présents dans des proportions bien définies. Cela conduit à une sélection d'une population spécifique de microparticules, permettant une prolongation significative de la durée de libération du PA (par ex. protéine ou peptide) avec lequel elles sont associées. Certains ions multivalents, comme Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2 ou leurs mélanges ou Al3+, Fe3+ ou leurs mélanges, confèrent une excellente tolérance à une telle formulation pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA.
Cette formulation peut par exemple comprendre une suspension colloïdale, aqueuse, de basse viscosité, à base de particules micrométriques de polyglutamate greffé
par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique, de taille comprise entre 0,5 et 100 lm, contenant des ions multivalents Mg2+, Ca2 , Zn2+, Fe2+, Cu2+ Al3+ ou Fe3+, avec un rapport r, répondant à la formule r = n x[1M] , õou [GI]
- n est la valence desdits ions multivalents, - [IM] est la concentration molaire en ions multivalents, - [GI] est la concentration molaire en groupements ionisables GI, compris entre 0,3 et 10.
Ces particules micrométriques sélectionnées sont issues de l'agrégation d'un grand nombre de nanoparticules de copolymère amphiphile.
Une suspension de microparticules chargée en PA (par ex. hGH) peut ainsi être fabriquée par floculation avec des ions multivalents Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+ A13 ou Fe3+, cette floculation étant suivie d'une maturation et d'un lavage. La suspension peut être ensuite lyophilisée ou atomisée puis reconstituée avec de l'eau pour réaliser une formulation prête à injecter.
Il est clair que ces formes de poudres sèches de microparticules sont a priori avantageuses au regard de la conservation. En effet, elles devraient permettre d'accroître la stabilité physique de ces microparticules et la stabilité du PA.
Cependant, dans le cadre d'une utilisation thérapeutique de ces poudres de microparticules par voie parentérale, la difficulté consiste à pouvoir aisément disperser (ou mettre en suspension) extemporanément ces poudres pour obtenir une forme liquide micro-particulaire, plus précisément une suspension reconstituée qui soit stable, par exemple au moins pendant quelques minutes, voire au moins quelques dizaines de minutes, à

température ambiante. Cette stabilité est notamment recherchée afin de permettre une manipulation aisée de cette suspension reconstituée. Il importe également que cette suspension reconstituée puisse être facilement injectée par passage au travers d'une aiguille creuse associée à une seringue ou à un stylo d'injection (type stylo à insuline).
Enfin, il convient de tenir compte du fait que les opérations de dispersion, de manipulation et d'injection de la suspension reconstituée sont destinées à être exécutées par les patients ou le personnel médical.
Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de l'invention serait de proposer de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon la formulation décrite dans le WO-A-05/051416, ces microparticules étant chargées en PA et ayant vocation à présenter des propriétés améliorées, notamment sous forme solide sèche, en particulier au regard de leur aptitude à la dispersion (ou dispersibilité), et, s'agissant de la suspension reconstituée, de sa stabilité et de son aptitude à être facilement manipulée et injectée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, lesdites microparticules étant chargées en PA et ayant de bonnes propriétés de dispersion que ce soit en phase aqueuse ou organique, tout en conservant l'intégrité
desdites microparticules.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et 5 hydrosoluble, lesdites microparticules étant chargées en PA et ayant d'excellentes propriétés de stabilité sous forme solide et sèche.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de préparation de microparticules sous forme solide et sèche, ces microparticules étant par ailleurs :
¨> obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon la formulation décrite dans le WO-A-05/051416, ¨> chargées en PA, ¨> et telles que définies dans les objectifs ci-dessus.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de préparation de microparticules sous forme solide et sèche, du type de celui visé dans l'objectif précédent et qui soit par ailleurs simple, économique et industriel.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique comprenant de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon la formulation décrite dans le WO-A-03/104303, ces microparticules étant par ailleurs :
¨> chargées en PA, ¨> et telles que définies dans les objectifs ci-dessus.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée de PA, remédiant aux carences de l'art antérieur, et en particulier permettant après injection par voie parentérale (par ex. sous-cutanée) d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée de PA (par ex. protéines, peptides thérapeutiques ou petites molécules) non dénaturés. Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique permettant après injection par voie parentérale (par ex. sous-cutanée) d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée de protéines ou peptides thérapeutiques fortement concentrés, par exemple à plusieurs mg/ml.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique à
libération prolongée du PA in vivo, qui soit stable à la conservation tant sur le plan physico-chimique que biologique.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique à
libération prolongée du PA in vivo, qui présente au moins l'une des propriétés suivantes :
biocompatibilité, biodégradabilité, atoxicité, bonne tolérance locale.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée lente de PA in vivo, comprenant des microparticules de polymère PO amphiphile auto-associées à au moins un PA (microparticules PO/PA), le polymère PO étant un polymère biodégradable, hydrosoluble, porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles (de préférence ionisables (GI) au moins en partie ionisés) formant spontanément dans l'eau une suspension de nanoparticules colloïdales, ce polymère PO étant, par exemple, un polyaminoacide dont la chaîne principale est formée par des résidus aspartique ou des résidus glutamique, au moins une partie de ces résidus étant modifiée par greffage d'au moins un groupement hydrophobe GH, dans la chaîne ou en bout de chaîne.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un nécessaire de reconstitution de la formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés, ce nécessaire étant par exemple simple à l'utilisation, de sorte qu'il puisse être mis en oeuvre aisément par le patient ou par le personnel médical.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de reconstitution de la formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés, ce procédé étant par exemple simple à mettre en oeuvre en particulier par le patient ou le personnel médical.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée de PA, en particulier une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire :
= à base de microparticules de PO associées à au moins un PA telles que définies dans les objectifs sus-énoncés ; ou = obtenue à partir de la formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés.
Brève description de l'invention Pour atteindre ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le mérite de découvrir, après de longues et laborieuses recherches, que, de façon tout à
fait surprenante et inattendue, l'atomisation de formulations à base de PO amphiphile (par exemple de copolyamino-acides) et de PA conduit à des microparticules PO/PA sèches, très stables, permettant de reconstituer des suspensions aqueuses de microparticules en milieu liquide dont la taille est comprise entre 0,5 et 100 p.M.
Par ailleurs, les inventeurs ont eu le mérite de mettre au point des moyens de reconstitution d'une suspension à partir de ces microparticules, lesdits moyens permettant d'optimiser leur dispersion aussi bien en phase liquide aqueuse qu'en phase liquide organique.
Une dispersion aisée, de bonne qualité et stable est en effet un préalable à
l'utilisation de ces suspensions reconstituées à partir de microparticules sèches PO/PA, à
titre de formulations injectables.

7 L'atomisation est une technique industrielle connue pour obtenir des particules sèches à partir d'une solution ou suspension de la matière constitutive desdites particules.
L'atomisation ou spray chying consiste à évaporer très rapidement dans un flux d'air ou de gaz inerte chaud des gouttelettes nébulisées de cette solution ou suspension.
Dans le domaine pharmaceutique, l'atomisation peut être délicate car elle impose une contrainte thermique qui peut s'avérer rédhibitoire pour certains PA thermosensibles tels que les PA à
base de protéines ou d'autres composés peptidiques. Le recours à l'atomisation pour produire des particules sèches à base d'excipients et de PA ne va donc pas de soi, sauf à
choisir des excipients aptes à empêcher ou à minimiser la dénaturation des PA
peptidiques.
C'est ainsi que la demande US-A-2005/0158392 divulgue la préparation de microparticules solides lipophiles chargées en PA peptidique par atomisation.
Cette dernière consiste soit à atomiser une solution aqueuse contenant de l'acide hyaluronique, du PA et un agent de surface lipophile (par ex. lécithine) voire un autre tensioactif du type Tween 80 ; soit, dans un premier temps, à atomiser une solution aqueuse contenant de l'acide hyaluronique, du PA et éventuellement un tensioactif du type Tween 80 pour obtenir des particules primaires, et, dans un deuxième temps, à atomiser une solution alcoolique d'agent de surface lipophile (par ex. lécithine) dans laquelle sont dispersées les particules primaires. On met l'accent dans cette demande US sur la combinaison protectrice acide hyaluronique et agent de surface lipophile (par ex.
lécithine), ce dernier étant destiné à former un film d'enrobage des microparticules à base d'acide hyaluronique et de PA. Ce document ne fait pas mention ni même allusion à la mise en oeuvre de PO
amphiphiles et encore moins de copolyaminoacides amphiphiles, à titre d'excipients ou de transporteurs de PA formant ensemble les microparticules.
Un autre exemple d'atomisation est celui décrit dans l'article Maa et al, J
Pharm Sci, 87(2), 152-159, 1988. Selon ce document, le PA (l'hormone de croissance humaine) est complexé par du zinc en présence de tensio-actifs biodégradables, avant d'être atomisé
en microparticules.
Il apparaît donc que l'atomisation de protéines est une opération délicate nécessitant l'utilisation de formulations complexes comprenant de nombreux excipients présents pour protéger le PA lors du procédé et garantir sa stabilité au stockage, ce qui est particulièrement crucial pour certaines molécules sensibles telles que l'hormone de croissance humaine ("human Growth Hormone" hGH).
Par ailleurs, le mérite des inventeurs est d'autant plus grand que l'art antérieur n'enseigne rien sur le difficile problème de la dispersion et de la stabilisation dans un liquide de microparticules sèches (s'agissant notamment des microparticules de PO
amphiphile) conçues pour la libération prolongée de PA.

8 D'où il s'ensuit que l'invention concerne dans un premier aspect, des microparticules de polymère (PO) contenant au moins un principe actif (PA), le polymère P0:
= étant un (co)polymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (OH) et de groupements hydrophiles, = formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH = 7,0, en condition isotonique, = et étant associé de façon non covalente avec le PA;
lesdites rnicroparticules étant caractérisées :
a. en ce qu'elles sont obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO comprenant au moins un PA, b. par une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 0,5 et 100 pm, de préférence entre 1 et 70 pm, de préférence entre 2 et 40 lun, c. et en ce qu'elles sont dispersibles en suspension colloïdale dans un test de dispersibilité DP I.
Dans un deuxième aspect, l'invention concerne un procédé de préparation de microparticules de polymère PO associé avec au moins un principe actif (PA), ces microparticules PO/PA étant en particulier celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention, i. le polymère PO :
O étant un (co)polymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles (de préférence ionisables (GI), au moins en partie ionisés), e formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH = 7,0, en condition isotonique, e et étant associé de façon non covalente avec le PA, ii. lesdites microparticules ayant une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 0,5 et 100 gm, de préférence entre 1 et 70 pm, de préférence entre 2 et 40 gm, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à atomiser une solution ou une suspension colloïdale de PO contenant du PA.
Selon une variante intéressante, les microparticules obtenues par atomisation sont redispersées dans un milieu liquide essentiellement aqueux (de préférence comprenant des ions multivalents comme moyen de dispersion) puis la dispersion obtenue est lyophilisée.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne une formulation pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA, caractérisée en ce qu'elle comprend une suspension colloïdale, de basse viscosité, à base de microparticules de PO, contenant au RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA/EP

9 moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention.
Dans un quatrième aspect, l'invention concerne un nécessaire de reconstitution en particulier de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième aspect de l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend :
= des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention ;
= et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant :
¨> les liquides essentiellement aqueux ;
¨> les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau ;
¨> et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau.
Dans un cinquième aspect, l'invention concerne un procédé de reconstitution en particulier de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième aspect de l'invention, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement :
= à mélanger :
= des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention ;
= et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant :
--> les liquides essentiellement aqueux ;
¨> les liquides essentiellement organiques et miscibles à
l'eau ;
¨> et les liquides essentiellement organiques non miscibles à
l'eau.
= et à agiter ce mélange.
Dans un sixième aspect, l'invention concerne une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée de PA, caractérisée en ce qu'elle comprend une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire :
= à base de microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention ;
= ou obtenue à partir de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième aspect de l'invention.

Avantages :
Sans vouloir être lié à la théorie, on peut penser que les groupements hydrophobes des polymères PO, qui peuvent s'assembler en domaines hydrophobes, jouent un rôle important dans le processus de libération modifiée du PA, tout comme dans la stabilisation 5 de celui-ci.
On peut avancer que des interactions physiques (non covalentes) se développent entre les domaines hydrophobes du polymère amphiphile PO et le PA, en particulier protéinique. Cette forte affinité de la protéine pour le polymère conduit à sa libération prolongée après administration sous-cutanée. Ce mécanisme de libération diffère

10 notablement, et peut être éventuellement conjugué, à celui observé pour les micro-particules d'acide polylactique, d'acide polylactique-glycolique ou encore à
celles de hyaluronate de sodium, dans lesquelles la libération du PA est essentiellement liée à la diffusion de l'actif et à la dégradation/érosion de la particule.
L'affinité de la protéine pour le polymère PO permet de limiter le phénomènes d'agrégation des protéines et autres dégradations qui peuvent intervenir lors du procédé
d'atomisation, sans nécessité d'avoir recours à d'autres stabilisants (par ex.
sucres, tensio-actifs). Cet effet protecteur de PO permet également d'obtenir aisément des formulations liquides stables au stockage. Enfin le PO, lorsqu'il a un caractère essentiellement amorphe (notamment lorsque c'est un polyaminoacide), confère aux microparticules d'excellentes propriétés de stabilité physique lorsqu'elles sont conservées sous forme sèche.
Il apparaît donc que la présence de ces polyaminoacides amphiphiles PO apporte des leviers supplémentaires pour la libération modifiée du PA ainsi que pour sa stabilisation vis-à-vis de l'agrégation ou d'éventuelles dégradations chimiques.
De plus, la nature amphiphile du polymère PO permet, lors du procédé
d'atomisation, de pouvoir utiliser soit une phase entièrement aqueuse, soit une phase entièrement organique volatile, soit un mélange volatil de phase aqueuse et organique, ce qui offre une grande souplesse dans la mise en oeuvre du procédé.
En outre, du fait de leur nature chimique, les microparticules formées à
partir d'un PO du type (co)polyaminoacide sont biodégradables, biocompatibles et elles possèdent généralement de bonnes propriétés de tolérance locale.
Concernant le procédé d'obtention des microparticules solides et sèches suivant l'invention, à savoir l'atomisation, il est par nature facilement industrialisable.

11 Enfin, les microparticules selon l'invention et les formulations en contenant sont non toxiques et bien tolérées localement.
Description détaillée de l'invention Définitions :
Dans l'ensemble de cette demande, la conjonction "ou" doit être prise dans le sens inclusif de "l'un ou l'autre ou les deux".
Ainsi, par exemple, un alkyle linéaire pouvant comporter au moins un hétéroatome (0, N ou S) ou au moins une insaturation peut avoir deux hétéroatomes, N et S, et une insaturation.
Dans tout le présent exposé, à la différence des microparticules selon l'invention, le terme "particules submicroniques" ou "nanoparticules" désigne des particules de taille (mesurée dans un test T décrit ci-après), supérieure ou égale à 1 nm et inférieure à
500 nm, de préférence comprise entre 5 et 250 nm.
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, le terme "polyaminoacide"
couvre aussi bien les polyaminoacides naturels que les polyaminoacides synthétiques, ainsi que les oligoaminoacides comprenant de 10 à 20 résidus acide aminé au même titre que les polyaminoacides comprenant plus de 20 résidus acide aminé.
Les résidus acide aminé préférés de la chaîne polyaminoacide principale sont ceux ayant la configuration L; le type de liaison préféré est le type alpha, c'est-à-dire une liaison peptidique entre un groupe alpha-amino d'un aminoacide et le groupe carboxyle, en position 1, d'un autre alpha-aminoacide.
Au sens de l'invention, le terme "protéine" désigne, par exemple, aussi bien une protéine qu'un peptide, qu'il s'agisse d'un oligo ou d'un polypeptide. Cette protéine (ou ce peptide) peut être modifiée ou non, par exemple, par greffage d'un ou de plusieurs groupements polyoxyéthyléniques.
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes "association" ou "associer" employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs PA et les polymères PO signifient en particulier que le ou les principes actifs sont liés au(x) polymère(s) PO
par une liaison non covalente, par exemple par interaction électrostatique ou hydrophobe ou liaison hydrogène ou gêne stérique.
l' aspect de l'invention : les microparticules Caractéristique (a):
Le fait d'associer, avant atomisation, le PA, par exemple une protéine ou un autre composé peptidique, avec un polymère PO amphiphile, tel qu'un (co)polyaminoacide

12 amphiphile, présente de nombreux avantages, à la fois au niveau du procédé lui-même et au niveau des propriétés des microparticules produites par atomisation.
Le traitement physique d'atomisation confère aux microparticules sèches solides obtenues une structure particulière à l'origine de bon nombre de leurs propriétés avantageuses. Cette structure est correctement caractérisée par ce mode d'obtention par atomisation, de même que par les fonctions attachées à ces propriétés avantageuses.
Caractéristique (b):
Cette caractéristique est définie objectivement par le test T décrit ci-après.
Test T de mesure de la taille des microparticules par diffraction laser :
a-Test TO dans le cas où les microparticules sont sous forme sèche 1 Matériel et conditions opératoires Granulomètre laser Malvern Mastersizer 2000 Module Voie liquide Hydro 2000SM
Volume du fluide vecteur dispersant 150 ml Longueurs d'onde (bleu et rouge) 466 et 632 nm Vitesse d'agitation 2400 tr/min Domaine d'analyse 0,02 !lm à 2000 m Modèle optique (théorie de Mie) Valeurs des indices de réfraction utilisés :
Fluide dispersant (heptane) nfluide = 1,39 + i0 Polystyrène latex nPolystyrène latex = 1,59 +
i0 Valeurs de l'obscuration pour déclencher l'analyse Entre 5 % et 20 %
Temps d'acquisition 10 s 2 Préparation de l'échantillon - Préparer une solution de Span 80 à 0,1 % dans l'heptane (pour cela peser 0,01 g de poudre de Span 80 dans un flacon de 20 ml puis ajouter par pesée de l'heptane afin d'obtenir au final 10 g), - Peser environ 6 mg de poudre dans un tube à essai de 5 mL, - Ajouter 0,7 g d'heptane contenant 0,1 % de Span80 dans le dans le tube à
essai, - Placer le tube à essai pendant 2 min dans un bain à ultrason afin de bien disperser la poudre.

13 3 Analyse de l'échantillon Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos est vidangé et remplacé par de l'heptane. L'agitation du module Hydro 2000SM est positionnée à 2400 tr/min.
Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales précitées :
- alignement du faisceau laser, - enregistrement des bruits de fond.
Après ces étapes, introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante :
ajouter au goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon dilué jusqu'à ce que l'obscuration soit comprise entre 5 % et 20 % et lancer l'acquisition.
On obtient les données relatives au D50, qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50 % des objets analysés.
Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations différentes.
b- Test T1 dans le cas où les microparticules sont sous forme de dispersion aqueuse 1 Matériel et conditions opératoires Granulomètre laser Malvern Mastersizer 2000 Module Voie liquide Hydro 2000SM
Volume du fluide vecteur dispersant 150 ml Longueurs d'onde (bleu et rouge) 466 et 632 mn Vitesse d'agitation 2400 tr/min Domaine d'analyse 0,02 kun à 2000 jam Modèle optique (théorie de Mie) Valeurs des indices de réfraction utilisés :
Fluide dispersant (eau) nfluide = 1,33 + i0 Polystyrène latex= 1 59 + i0 Ilpolystyrène latex 5 Valeurs de l'obscuration pour déclencher l'analyse Entre 5 % et 20 %
Temps d'acquisition 10 s 2 Préparation de l'échantillon L'échantillon à analyser est introduit dans la cellule tel quel ou peut éventuellement être redilué par de l'eau dans le cas d'échantillons très diffusants.

14 3 Analyse de l'échantillon Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos est vidangé et remplacé par de l'eau déminéralisée fraîche. L'agitation du module Hydro 2000SM est positionnée à 2400 tr/min.
Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales précitées :
- alignement du faisceau laser, - enregistrement des bruits de fond.
Après ces étapes, introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante :
ajouter au goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon dilué jusqu'à ce que l'obscuration soit comprise entre 5 % et 20 % et lancer l'acquisition.
On obtient les données relatives au D50, qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50 % des objets analysés.
Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations différentes.
c-Test T2 dans le cas où les microparticules sont en dispersion dans un solvant organique Ce test est analogue au test Ti. Il faut remplacer néanmoins dans ce cas l'eau par un solvant parfaitement miscible au liquide de dispersion et dans lequel les particules ne gonflent pas. Dans de nombreux cas l'heptane est utilisé.
1 Matériel et conditions opératoires Granulomètre laser Malvern Mastersizer 2000 Module Voie liquide Hydro 2000SM
Volume du fluide vecteur dispersant 150 ml Longueurs d'onde (bleu et rouge) 466 et 632 nm Vitesse d'agitation 2000 tr/min Domaine d'analyse 0,02 Jim à 2000 Modèle optique (théorie de Mie) Valeurs des indices de réfraction utilisés :
Fluide dispersant (par exemple heptane) nheptane = 1,39 + i0 Polystyrène latex= 1 59 + i0 npolystyrène latex Valeurs de l'obscuration_pour déclencher l'analyse Entre 5 % et 20 %
Temps d'acquisition 10 s 2 Préparation de l'échantillon Pour préparer l'échantillon à analyser, il faut diluer 400 L de l'échantillon à analyser dans un tube à essai de 5 mL avec 600 ilL d'heptane, puis passer la préparation au vortex pendant 10 5 s.
5 3 Analyse de l'échantillon Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos est vidangé et remplacé par de l'heptane. L'agitation du module Hydro 2000SM est positionnée à 2400 tr/min.
Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales précitées :
10 - alignement du faisceau laser, - enregistrement des bruits de fond.
Après ces étapes, introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante :
ajouter au goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon dilué jusqu'à ce que l'obscuration soit comprise entre 5 % et 20 % et lancer l'acquisition.

15 On obtient les données relatives au D50, qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50 % des objets analysés.
Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations différentes.
Caractéristique (c):
Cette caractéristique est définie objectivement par le test DP1 décrit ci-après.
Test de dispersibilité DP1 des poudres :
mg environ de poudre de particules sont introduits dans un flacon de 3 ml muni d'un septum. La masse précise des particules est alors déterminée (mi). 1 ml de solution de 25 reconstitution est ajouté à la poudre à travers le septum à l'aide d'une seringue de 1 ml munie d'une aiguille de 25G 5/8 - 0,5x16 mm (de type BD MicrolanceTM3 par exemple) et le flacon est agité de manière manuelle par intermittence pendant 15 min. Le flacon est pesé de façon à connaître la masse exacte de solution introduite (m2). A
l'issue de ce temps, la totalité de la suspension est aspirée à travers une seringue de 1 ml (de type Braun 30 Injeckt-F Luer 1 ml ¨ ref 9166017V) munie d'une aiguille de 25G et transvasée dans un nouveau flacon préalablement taré et on détermine la masse m3 de solution récupérée.
On note l'aspect qualitatif de la dispersion (facilité à disperser, opacité, homogénéité
visuelle de la solution), la possibilité ou non de l'injecter à travers une aiguille de 25G, le pourcentage de solution récupérée :

16 % = M3 x 1 00/(Mi+m2) et on mesure la taille des microparticules selon un test Ti ou T2 (selon que le liquide de dispersion est une solution aqueuse ou un liquide organique).
On considère que la poudre a de bonnes propriétés de dispersion dans le liquide si:
- la suspension obtenue contient des microparticules de diamètre moyen compris entre 2 et 40 jam, - l'aspect de la suspension est homogène, - elle peut être injectée à travers une aiguille de 25G et si - au moins 80 % de la suspension peuvent être ainsi récupérés.
Au-delà des caractéristiques (a), (b) & (c), les microparticules selon l'invention peuvent être définies objectivement par le fait qu'elles sont stables dans un test ST1 ou dans un test ST2.
Test ST1 de stabilité physique des microparticules sèches :
La taille des microparticules présentes dans la poudre sèche atomisée est mesurée dans la semaine qui suit l'atomisation de la poudre sur un granulomètre laser selon le test TO. La poudre est alors placée dans une étuve à 30 C pendant une semaine. Un échantillon témoin est laissé à 5 C. Une mesure de taille est réalisée à nouveau après dispersion dans les mêmes conditions qu'au temps tO. Les distributions des particules avant et après vieillissement sont comparées.
Test ST2 de stabilité colloïdale des particules en suspension :
La poudre de microparticules est dispersée dans le liquide de dispersion sous agitation magnétique à la concentration à laquelle on veut observer sa stabilité et est laissée à agiter sous agitation magnétique modérée pendant au minimum 2 h (mesure t0).
La taille des particules est mesurée sur un granulomètre laser selon le test Ti ou T2 en fonction du milieu (aqueux ou organique) de dispersion.
La suspension est ensuite laissée au repos pendant 7 jours à 5 C. Le culot de sédimentation est dispersé par agitation quelques minutes (jusqu'à obtention d'une suspension homogène après observation visuelle). Une mesure de taille est réalisée à
nouveau après dispersion dans les mêmes conditions qu'au temps tO.
Le polymère PO
Les polymères PO selon l'invention sont des polymères biodégradables, hydrosolubles et porteurs de groupements hydrophobes GH et de groupements

17 hydrophiles (de préférence des groupements GI ionisables, au moins en partie ionisés).
Les groupements hydrophobes GH peuvent être en nombre réduit vis-à-vis du reste de la chaîne et peuvent se situer latéralement à la chaîne ou intercalés dans la chaîne, et être répartis de façon aléatoire (copolymère statistique) ou répartis sous forme de séquences ou de greffons (copolymères blocs ou copolymères séquencés).
Suivant un mode préféré de réalisation de l'invention, le polymère PO est un (co)polyaminoacide amphiphile.
Un tel choix de PO procure une excellente compatibilité avec les PA de type protéine(s)/peptide(s). Il est ainsi possible de simplifier grandement la composition de la solution ou suspension de départ du PA de type protéine(s)/peptide(s) avec le polymère PO. Cette solution ou suspension de départ peut comprendre uniquement le PA et le PO
dans une phase aqueuse ou organique. L'absence d'autres ingrédients permet qu'une telle solution ou suspension de départ peut être filtrée (taille des pores : 0,2 i.tm) avant l'atomisation, ce qui permet de réaliser cette dernière dans des conditions aseptiques.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le PO est choisi parmi les (co)polyaminoacides amphiphiles et leurs mélanges.
De préférence, les polyaminoacides selon la présente invention sont des oligomères ou des homopolymères comprenant des résidus récurrents acide glutamique ou aspartique ou des copolymères comprenant un mélange de ces deux types de résidus . Les résidus considérés dans ces polymères sont des acides aminés ayant la configuration D, L ou D/L
et sont liés par leurs positions alpha ou gamma pour le résidu glutamate ou glutamique et alpha ou bêta pour le résidu aspartique ou aspartate.
Suivant un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, le polymère PO
est un polyaminoacide formé par des résidus aspartiques ou des résidus glutamiques, au moins une partie de ces résidus étant porteuse de greffons comportant au moins un groupement hydrophobe GH. Ces polyaminoacides sont notamment du type de ceux décrits dans la demande de brevet PCT W0-A-00/30618.
Selon une première éventualité, le (ou les) PO est (sont) défini(s) par la formule générale (I) suivante (le radical ¨COOR3 inclut les formes où la liaison entre le carboxyle et R3 est une liaison ionique ¨000- R3):

18 A.-COOR3 -R24 _ _ i .... Ir.,,m NHR1 r'qy-------=N
- n Oy A H 0 [GH]
(I) dans laquelle :
= RI est choisi dans le groupe constitué par H, alkyle linéaire en C2 à
C10, alkyle ramifié en C3 à C10, benzyle, et -R4-[GE1], ou = I\IFIRI est un résidu acide aminé terminal ;
= R2 est choisi dans le groupe constitué par H, acyle linéaire en C2 à Cm, acyle ramifié en C3 à C10, et -R4-[GH] ou = R2 est un résidu pyroglutamate terminal ;
= R3 est H, ou = R3 est de préférence sélectionné dans le groupe comprenant :
- les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, - les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant :
= les cations à base d'amine, = les cations à base d'oligoamine, = les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant particulièrement préférée), = les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine, - ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine ;
= R4 représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
= A représente indépendamment un radical -CH2- (résidu aspartique) ou -CH2-CH2- (résidu glutamique) ;
= n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est suffisamment basse pour que PO mis en solution dans l'eau à pH = 7 et à
25 C, forme une suspension colloïdale de particules submicroniques de

19 PO ; de préférence en + mlest compris entre 1 et 25 % molaire et mieux encore entre 1 et 15 % molaire ;
n + m est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300;
9 MI représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone.
Dans une forme préférée de réalisation de l'invention :
GH est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type :
--OCH2(CH2-CH2)3.8-CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle, et Io 114 représente une liaison de valence simple.
Selon une deuxième éventualité, PO répond à l'une des formules générales (II), (III) et (IV) suivantes (le radical ¨COOR3' inclut les formes où la liaison entre le carboxyle et R3' est une liaison ionique --00(- R3)+
COOR 3' A H H A/C00R30*
L_LR4 pH]
PH]
====.. N
I _mg R3 I -ni (II) ' H A A H
- , PHI
4 [GH]
0 H H o COOR
[GH] n" I
\ 4 N 4 ./.[GH1 R R

V) dans lesquelles :
GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone ;
R30 est une chaine alkylène linéaire bivalente en C2 à C6;
13 R3 est H, ou 9 +R3 est de préférence sélectionné dans le groupe comprenant :
- les cations métalliques= avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, RECTIFIED SHEET (RULE 91) ISA/EP

- les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant :
= les cations à base d'amine, = les cations à base d'oligoamine, 5 = les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant par-ticulièrement préférée), = les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine, - ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le 10 sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine, = R5 est une chaine alkylène linéaire bivalente en Ci à C8 dans laquelle une ou deux unités méthylènes, de préférence à chaque extrémité de R50, peuvent être indépendamment remplacées par ¨0¨ ou ¨NI-1¨ ;
= R4 représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 résidus acide 15 aminé ;
= A représente indépendamment un radical -CH2- (résidu aspartique) ou -CH2-CH2- (résidu glutamique) ;
= n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à
1000, de préférence entre 50 et 300.
Suivant une variante intéressante, R4 représente une liaison de valence simple.
Selon une troisième éventualité, PO comprend au moins une copolyhydroxyalkylglutamine (de préférence alkyl est éthyl) essentiellement neutre comprenant une multiplicité de groupements hydrophobes (GH) pendants, identiques ou différents entre eux. La copolyhydroxy-alkylglutamine est porteuse de groupes hydroxy-alkylamino. Ces groupes hydroxyalkylamino sont, de préférence, liés au copolymère par l'intermédiaire d'une liaison amide. Les hydroxyalkylamines utilisables pour amidifier le carboxyle de résidus glutamates et donner cette copolyhydroxyalkylglutamine sont identiques ou différentes entre elles et sont par exemple choisies parmi la 2-hydroxyéthylamine, la 3-hydroxypropylamine, la 2,3-dihydroxypropylamine, le tris(hydroxyméthyl)aminométhane et la 6-hydroxyhexylamine.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement (spacer) permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne principale de copolyglutamates. Cette rotule peut comprendre, par ex. au moins une liaison covalente directe ou au moins une liaison amide ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment : les résidus acide aminé, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple des diamines), les dérivés des polyols (par exemple des diols) et les dérivés des hydroxyacides. Le greffage des GH sur la chaîne copolyglutamate ou polyhydroxyalkylglutamine peut passer par la mise en oeuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne copolyglutamate ou copolyhydroxyalkylglutamine. Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les amines, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Pour plus de détails sur cette copolhydroxyalkylglutamine (de préférence alkyl est éthyl), on se référera au FR-A-Suivant une variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, tout ou partie des radicaux hydrophobes GH des PO sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant :
= un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S) ou au moins une insaturation, = un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs cycloalkyles annelés et contenant éventuellement au moins une insatu-ration ou au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S), = un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S).
Suivant une autre variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, le groupement hydrophobe GH est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type : ¨OCH2(CH2-CH2)3_8-CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle, et R4 représente une liaison de valence simple.
Suivant une autre variante avantageuse, les n groupements GH du PO, notamment selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical monovalent de formule suivante :

I

R

(GH) dans laquelle :
- R5 est méthyle (résidu alanine), isopropyle (valine), isobutyle (leucine), secbutyle (isoleucine), benzyle (phénylalanine) ;
- R6 représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de carbone ;
- 1 varie de 0 à 6.
Selon une caractéristique remarquable de l'invention, tout ou partie des radicaux hydrophobes R6 des PO sont choisis de façon indépendante, dans le groupe de radicaux comportant :
= un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S) ou au moins une insaturation, = un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs cycloalkyles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S), = un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation ou au moins un hétéroatome (de préférence 0, N ou S).
En pratique et sans que cela ne soit limitatif, le radical hydrophobe R6 du greffon du PO est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alkoxy du type :
¨OCH2(CH2-CH2)3_8¨CH3 , oléyle, tocophéryle ou cholestéryle.
Avantageusement, la chaîne principale du polyaminoacide est:
un homopolymère d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique ;
un homopolymère d'alpha-L-aspartate ou d'alpha-L-aspartique ou un copolymère d'alpha-L-aspartate/alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-aspartique/
alpha-L-glutamique.
De manière remarquable, la distribution des résidus aspartiques ou glutamiques de la chaîne polyaminoacide principale du PO est telle que le polymère ainsi constitué est soit aléatoire, soit de type bloc, soit de type multibloc.
Selon un autre mode de définition, PO a une masse molaire qui se situe entre 2 et 100 000 g/mol, et de préférence entre 5 000 et 40 000 g/mol.
Selon une variante, PO est porteur d'au moins un greffon de type polyalkylène-glycol lié à une résidu glutamate ou aspartate.
Avantageusement, ce greffon est de type polyalkylène-glycol est de formule (V) suivante.

4 p 8 R.....,....-n ---..x..---",......7017-1,,,--(V) dans laquelle :
- R'4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
- X est un hétéroatome choisi dans le groupe comportant l'oxygène, l'azote ou un soufre ;
- R7 et R8 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en C 1 à C4 ;
- n" varie de 10 à 1000, de préférence de 50 à 300.
En pratique, le polyalkylèneglycol est par exemple un polyéthylène glycol.
Il est souhaitable, conformément à l'invention, que le pourcentage molaire de greffage du polyalkylène glycol varie de 1 à 30 %.
Les polyaminoacides PO sont en outre extrêmement intéressants, du fait qu'à un taux de greffage ajustable, ils se dispersent dans l'eau à pH = 7,4 (par exemple avec un tampon phosphate) pour donner des suspensions colloïdales.
De plus, des principes actifs PA tels que des protéines, des peptides ou des petites molécules peuvent s'associer spontanément à des nanoparticules de polyaminoacides PO.
Il convient de comprendre que les PO contiennent des groupes ionisables qui sont, selon le pH et la composition, soit neutres (par exemple -COOH), soit ionisés (par exemple -COM,. Pour cette raison, la solubilité dans une phase aqueuse est directement fonction de la fraction de fonctions ionisées et donc du pH. En solution aqueuse, dans le cas de fonctions carboxyliques, le contre-ion peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que les formes protonées de la triéthanolamine, du tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou d'une polyamine telle que la polyéthylèneimine.
Les PO de type polyaminoacide sont obtenus, par exemple, par des méthodes connues de l'homme de l'art. Les polyaminoacides statistiques peuvent être obtenus par greffage du greffon hydrophobe, préalablement fonctionnalisé par l'espaceur, directement sur le polymère par une réaction classique de couplage. Les PO polyaminoacides blocs ou multiblocs peuvent être obtenus par polymérisation séquentielle des anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA) correspondants.
On prépare par exemple un polyaminoacide, homopolyglutamate, homopolyaspartate ou un copolymère glutamate/aspartate, bloc, multibloc ou aléatoire selon des méthodes classiques.

Pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA), décrite, par exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R.
Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-Carboxy-Anhydrides and related Heterocycles" Springer-Verlag (1987). Lorsque la chaine latérale possède une fonction acide carboxylique, les dérivés de NCA sont de préférence des esters NCA-O-Me, NCA-O-Et ou NCA-O-Bz (Me = méthyl, Et = éthyl et Bz = benzyl). Les polymères sont ensuite hydrolysés dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans la demande FR-A-2 801 226 de la demanderesse. Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L-aspartique), poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique) et poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement. Le polyaspartique de type alpha-bêta est obtenu par condensation de l'acide aspartique (pour obtenir un polysuccinimide) suivie d'une hydrolyse basique (cf. Tomida et al. Polymer, 1997, 38:
4733-36).
Le couplage du greffon avec une fonction acide du polymère est réalisé
aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbo-diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Le taux de greffage est contrôlé
chimiquement par la stoechiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons hydrophobes fonctionnalisés par un espaceur sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art.
Pour la synthèse de copolymère bloc ou multibloc, on utilise des dérivés NCA
préalablement synthétisés avec le greffon hydrophobe. Par exemple, le dérivé
NCA-hydrophobe est copolymérisé avec le NCA-O-Bz puis on enlève par hydrolyse sélectivement les groupes benzyles.
Le(s) principe(s) actif(s) PA
Concernant le PA, il est de préférence choisi dans le groupe comprenant: les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG) : "protéines-PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe de érythropoïétine, ocytocine, vasopressine, hormone adrénocorticotrope, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance plaquettaire (PDGF), facteurs de croissance hématopoïétiques et leurs mélanges, facteurs VIII et IX, hémoglobines, cytochromes, albumines, prolactine, 5 hormone de libération de l'hormone lutéinisante (LHRH), antagonistes de la LHRH, agonistes de la LHRH, hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, hormone de libération de l'hormone de croissance, insuline, somatostatine, glucagon, interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-11, IL-12), interférons-a, f3 ou y, gastrine, tétragastrine, pentagastrine, urogastrone, sécrétine, calcitonine, enképhalines, endorphines, 10 angiotensines, hormone de libération de la thyrotropine (TRH), facteurs de nécrose tumorale (TNF), facteurs neurotrophiques (NGF), facteur de croissance granulocytaire (G-CSF), facteur de croissance des granulocytes et macrophages (GM-CSF), facteur de croissance des macrophages (M-CSF), héparinase, protéine morphogénique osseuse (BMP), peptide auriculaire natriurétique (hANP), glucagon-like peptide 1 (GLP-1), facteur 15 de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), antigène recombinant de l'hépatite B
(rHBs), rénine, cytokines, bradykinine, bacitracines, polymyxines, colistines, tyrocidine, gramicidines, cyclosporines et analogues synthétiques, modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins.
Selon une variante, le PA est une petite molécule organique hydrophobe,

20 hydrophile ou amphiphile du type de celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ou du type de celles appartenant à la famille des peptides telles que la leuprolide ou la cyclosporine et leurs mélanges Au sens du présent exposé, une petite molécule est notamment une petite molécule non protéinique, par exemple exempte d'acides aminés.
25 Selon une autre variante, le PA est avantageusement choisi parmi au moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les agents de traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les anticoagulants et antithrombotiques, les anticonvulsivants, les antiépileptiques, les antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les anti-infectieux, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, les agents cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les vasodilatateurs, les antiangineux, les antihypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de cholinestérase, les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les stimulants du système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les inducteurs et inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose, les agonistes des récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les agents de traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la fertilité, les agents de traitements des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et les immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les antimigraineux, les relaxants des muscles, les analogues de nucléosides, les agents de traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les neuroleptiques, les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de traitements dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les anorexiques, les antidouleurs non analgésiques, les antiépileptiques, les barbituriques, les benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de ces produits.
Sur le plan quantitatif, il est particulièrement intéressant que la fraction massique en PA non associé aux particules micrométriques [PA non associé] en % en poids soit telle que:
o [PA non associé] < 1 o de préférence [PA non associé] < 0,5.
2ème aspect de l'invention : le procédé d'obtention des microparticules par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO contenant du PA.
Selon une modalité préférée du procédé selon l'invention, le PO contenu dans la solution ou la suspension colloïdale destinée à être atomisée est au moins en partie sous forme de nanoparticules de PO ayant une taille, mesurée dans le test Ti, inférieure à
500 nm, de préférence comprise entre 10 et 300 nm , et plus préférentiellement encore comprise entre 10 et 100 nm.
Avantageusement, la concentration en PO dans la solution ou la suspension colloïdale à atomiser est, par exemple, comprise entre 5 mg/m1 et 100 mg/ml de préférence entre 10 mg/ml et 40 mg/ml.
Dans le cadre de l'invention, l'association PA/P0 est réalisée avant ou pendant l'étape d'atomisation.
Pour cette association le PO ou le PA peut être sous forme solide (de préférence une poudre) ou sous forme de suspension liquide.
Des techniques d'association d'un ou de plusieurs PA à PO avant l'étape d'atomisation sont décrites notamment dans la demande de brevet WO-A-00/30618.
Elles consistent par exemple à mélanger une suspension colloïdale de PO à une solution ou une suspension de PA. Selon une variante, le PA sous forme poudre est mélangé à la suspension de PO.
Suivant une variante intéressante de ce procédé d'obtention, les microparticules de polymère PO associé avec au moins un principe actif (PA) sont dispersées dans un milieu liquide essentiellement aqueux, ledit milieu contenant de préférence un moyen Ml de dispersion, et la dispersion obtenue est lyophilisée.
Le lyophilisat ainsi obtenu a pour avantage de faciliter la préparation des formulations liquides à base des microparticules (3ème aspect de l'invention décrit ci-après), car ce lyophilisat se disperse rapidement dans le liquide de reconstitution utile pour prépare les susdites formulations liquides.
Avantageusement, le moyen de dispersion M1 est choisi dans le groupe constitué
par:
i- des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des groupements ionisables du polymère PO et qui sont contenus dans la phase continue aqueuse;

ii- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc contenus dans les microparticules PO/PA atomisées;
iii- au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable);
iv- le changement de pH;
v- et les combinaisons d'au moins deux des moyens (i) à (iv);
le moyen (i) étant particulièrement préféré.
Pour plus de détails sur des exemples de possibilités d'exécution des moyens Ml (i) à (iv), on se reportera à la description qui suit des moyens de dispersion M2.
De même, s'agissant du milieu liquide de dispersion, celui-ci peut contenir les mêmes additifs que ceux décrits pour le liquide de reconstitution défini infra 3ème aspect de l'invention: Formulations liquides à base des microparticules obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO
contenant du PA.
La formulation suivant l'invention peut être une forme pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA comprenant une suspension colloïdale, de basse viscosité, à base de microparticules de PO associées à au moins un PA, ces microparticules étant celles telles que définies ci-dessus ou celles obtenues par le procédé
lui aussi tel que défini ci-dessus et dans les exemples infra.
Cette formulation a pour avantage d'être injectable par voie parentérale et d'être liquide dans les conditions d'injection.
Suivant l'invention, les qualificatifs "basse" ou "très faible viscosité"
correspondent, avantageusement, à une viscosité dynamique à 20 C inférieure ou égale à
1000 mPa.s. De préférence, la viscosité dynamique de la formulation, mesurée à
20 C, pour un gradient de cisaillement de 1000 s-1, est préférablement inférieure ou égale à
500 mPa.s., de préférence comprise entre 2 et 200 mPa.s. par exemple, comprise entre 1,0 et 100 mPa.s, voire entre 1,0 et 50 mPa.s.
Mesure de la viscosité dynamique La mesure de référence pour la viscosité dynamique peut être réalisée, par exemple, à
C à l'aide d'un rhéomètre AR1000 (TA Instruments) équipé d'une géométrie cône-plan (4 cm, 2 ). La viscosité y est mesurée pour un gradient de cisaillement de 10 s-1.
15 Cette faible viscosité rend les formulations de l'invention aisément injectables par voie parentérale, en particulier par voie muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur. La formulation selon l'invention peut aussi être administrée par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, entre autres.
20 La viscosité des formulations liquides de l'invention est faible aussi bien à des températures d'injection correspondant à des températures ambiantes, par exemple comprises entre 4 et 30 C, qu'à la température physiologique.
Les microparticules sèches formées par atomisation de PO (par ex. polyamino-acide) amphiphile peuvent de plus être aisément redispersées pour former des suspensions ou des solutions microparticulaires faiblement visqueuses.
Moyen M2 de dispersion S'agissant précisément de la dispersion ou mise en suspension des microparticules PO/PA atomisées dans un liquide de reconstitution pour préparer la formulation, il est prévu selon l'invention que ladite formulation comprenne un moyen M2 de dispersion des microparticules de PO/PA.
Ce moyen M2 de dispersion peut différer selon la nature de la phase continue (c'est-à-dire du liquide de reconstitution) de la suspension entrant dans la constitution de la formulation.
Ainsi, quatre possibilités sont notamment envisageables selon l'invention :
1. La phase continue de la suspension est essentiellement aqueuse 2. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique miscible à l'eau.

3. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique non miscible à l'eau.
4. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique miscible ou non à l'eau.
Par "phase continue essentiellement aqueuse", on entend, par exemple un liquide contenant au moins 60 % en masse d'eau.
Par "phase continue essentiellement organique", on entend, par exemple un liquide contenant au moins 60 % en masse de phase organique.
1. La phase continue de la suspension est essentiellement aqueuse Plusieurs types de moyens M2 de dispersion, éventuellement combinés entre eux, sont envisageables, à savoir que le moyen M2 de dispersion est par exemple choisi dans le groupe constitué par:
i- des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des groupements ionisables du polymère PO et qui sont contenus dans la phase continue aqueuse;
ii- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc contenus dans les microparticules PO/PA atomisées;
iii- au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable);
iv- le changement de pH;
v- et les combinaisons d'au moins deux des moyens (i) à (iv);
le moyen (i) étant particulièrement préféré.
(i). Moyen M2 de dispersion à base d'ions multivalents Dans le cas où PO présente des groupements GI ionisables, le moyen M2 de dispersion peut comprendre des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des groupements ionisables GI (au moins en partie ionisés) du polymère PO et qui sont introduits dans la phase continue aqueuse, lors de la reconstitution de la suspension/solution qui forme la suspension.
Au sens de l'invention, le terme "ions multivalents" désigne par exemple des ions divalents, des ions trivalents, des ions tétravalents et des mélanges de ces ions.
Dans le cas où PO présente des groupements GI anioniques, les ions multivalents sont des cations multivalents, de préférence des cations divalents, plus préférentiellement encore choisis dans le groupe comprenant : Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+ou leurs mélanges, ou des cations trivalents, plus préférentiellement encore choisis dans le groupe comprenant : Al3+, Fe3+ ou leurs mélanges.
Il est possible qu'outre des ions multivalents, la formulation selon l'invention contienne des ions (par ex. cations) monovalents, éventuellement actifs dans l'agrégation des nanoparticules en microparticules.
Ces ions multivalents sont amenés dans la formulation de l'invention, de préférence sous forme de solution saline (organique ou minérale) aqueuse, par exemple une solution de 5 sulfate, chlorure, acétate, gluconate ou glutamate (ou autre acide aminé
anionique) de cations multivalents.
Ce moyen M2 de dispersion à base d'ions multivalents convient plus préférentiellement dans le cas où PO amphiphile (par ex. un (co)polyaminoacide) est relativement hydrophile.
(ii) et (iii) Moyen M2 de dispersion à base de composé (s) hydrophile (s) ou comprenant au moins un enrobage à base de composé (s) hydrophile(s) Le moyen M2 de dispersion peut comprendre essentiellement :
- au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc contenu dans les microparticules PO/PA atomisées ;
- ou au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable).
Ces moyens M2 de dispersion peuvent être incorporés dans la formulation selon plusieurs modes.
Suivant un premier mode, on ajoute à la suspension/solution de PO à atomiser au moins un composé hydrophile choisi parmi ceux utilisables dans une préparation injectable, de préférence choisi dans le groupe comprenant :
--> les acides aminés (par ex. lysine, arginine, glycine) ;
---> les polyalkylène glycols, de préférence les polyéthylène glycols ;
---> les copolyalkylène glycols, de préférence les copolymères -éthylèneglycol-propylène-glycol (de type Poloxamer, Pluronic ou Lutrol);
¨> les polymères cellulosiques et leurs dérivés, de préférence les carboxyalkyl-celluloses (par ex. les carboxyméthylcelluloses) ou les alkylcelluloses (par ex. les méthylcelluloses) ;
---> les saccharides hydrogénés ou non, tels que le tréhalose, le sorbitol, le mannitol, le saccharose ;
--> les polyols tels que le propylène glycol ou le glycérol ;
---> les gélatines de préférence hydrolysées ;
---> les (co)polymères azotés, de préférence ceux contenus dans le groupe comprenant les polyacrylamides, les poly-N-vinylamides, les polyvinylpyrrolidones (PVP) et les poly-N-vinyl-lactames ;
---> les alcools polyvinyliques (APV);

--> le polyglutamate de sodium ;
---> et leurs mélanges ;
ledit composé hydrophile d'enrobage comprenant de préférence au moins un polymère hydrophile.
Suivant un deuxième mode, les microparticules sont enrobées par au moins une couche d'au moins un composé hydrophile tel que défini ci-dessus. Dans ce deuxième mode, le composé hydrophile comprend, de préférence, au moins un polymère hydrophile choisi parmi les composés hydrophiles tels que définis ci-dessus.
Le moyen M2 (ii) de dispersion à base d'au moins un composé hydrophile s'est avéré particulièrement adapté pour les PO amphiphiles présentant une hydrophobie suffisamment élevée, par exemple un taux de groupements GH supérieur ou égal à
10 %
molaire pour un PO constitué par au moins un polyaminoacide.
L'enrobage (moyen M2 (iii)) des microparticules par une telle couche de composé
hydrophile et biocompatible peut être, par exemple, réalisé par deux atomisations successives ; la deuxième atomisation, réalisée sur une suspension de particules dans un solvant non miscible avec lesdites microparticules, peut contribuer à
faciliter la dispersion de ces particules.
Ce moyen M2 (iii) de dispersion, par enrobage hydrophile des microparticules, permet à la suspension de microparticules de rester intègre et stable au moins pendant quelques jours, ce qui rend sa manipulation plus aisée.
Avantageusement, la combinaison d'un moyen M2 (ii) ou (iii) de dispersion des microparticules à base de composé(s) hydrophile(s) et d'un moyen M2 (i) de dispersion à
base d'ions divalents, contenus dans la phase aqueuse lors de la reconstitution de la formulation, permet une dispersion accélérée.
Suivant un autre mode particulier de réalisation, la phase continue aqueuse ou l'enrobage hydrophile peut aussi contenir au moins un tensioactif injectable tel que le Tween 80, une lécithine, phosphatidyléthanolamine, phosphatidylsérine ou un copolymère de polyoxypropylène-polyoxyéthylène (dénomination commerciale :
Poloxamer, Pluronic, Lutrol).
(iv) Moyen M2 de dispersion par changement de pH
Un autre moyen de dispersion envisageable selon l'invention consiste en un moyen de dispersion par changement de pH, de préférence avant atomisation. Ce type de moyen s'est avéré adapté notamment dans le cas où le PO amphiphile (par ex.
polyaminoacide) est un composé porteur de fonctions ionisables et est par ailleurs très hydrophile, c'est-à-dire comprenant par exemple moins de 10 % molaire de groupements hydrophobes GH.

En effet, la mise en oeuvre d'un tel moyen M2 (iv) permet d'augmenter l'hydrophobie du PO amphiphile, en amenant le pH à une valeur telle que les fonctions ionisables du PO (par ex. du polyaminoacide) deviennent non ionisées (par exemple acidification dans le cas où le PO est un polyaminoacide hydrophile du type polyGlu ou polyAsp).
De préférence, ce moyen M2 (iv) de dispersion par changement de pH avant atomisation est appliqué à la suspension/solution de PO juste avant l'atomisation.
Ce moyen M2 (iv) de dispersion par changement de pH avant atomisation peut être combiné ou non:
= avec le moyen M2 (i) de dispersion à base d'ions multivalents mis en uvre après atomi-sation, dans l'étape de reconstitution ; ou = avec le moyen M2 (ii) ou (iii) de dispersion à base de composé
hydrophile, de préférence par enrobage M2 (iii) des microparticules par au moins un polymère hydrophile.
2. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement ore.rAimig miscible à l'eau.
Le moyen de dispersion consiste dans cette phase organique miscible à l'eau.
Cette phase peut ainsi par exemple contenir éthanol, N-méthylpyrrolidone, diméthylsulfoxyde, isopropanol, glycérol, ou glycofurol (tétrahydrofurfuryl alcool polyéthylène glycol éther).
3. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique non miscible à l'eau Suivant une voie intéressante de mise en oeuvre, le moyen de dispersion comprend un liquide lipophile, dont la température de fusion est de préférence inférieure ou égale à
15 C, contenu dans la phase continue organique non miscible à l'eau.
De préférence, le liquide lipophile comprend au moins un mélange de triglycérides d'acides gras saturés ou au moins une huile végétale ou au moins un lipide ou au moins un dérivé de lipide ou au moins un acide gras ou au moins un dérivé d'acide gras.
Plus préférentiellement encore, le liquide lipophile comprend :
= un mélange de triglycérides d'acides gras saturés en Cg -C10 issu de l'huile de noix de coco, par exemple celui commercialisé sous la dénomination Miglyol 812 par Sasol) ;
= au moins une huile végétale, de préférence l'huile de soja, l'huile de palme, l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile de sésame, l'huile de tournesol, l'huile d'arachide, = au moins un lipide, de préférence une lécithine liquide, la vitamine E
synthétique ou naturelle ;
= au moins un dérivé de lipide, de préférence l'arachidoylphosphatidylcholine et la stéaroylphosphatidyl-choline, = au moins un acide gras, de préférence l'acide oléique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, et leurs sels ;
= au moins un dérivé d'acide gras, de préférence un dérivé de mono-, di- ou tri-glycéride, l'oléate d'éthyle, le lactate de lauryle, le stéarate de glycéryle, le palmitate de sorbitane, le stéarate de sorbitane, le monoléate de sorbitane, le polysorbate ;
= et leurs mélanges ;
avec la condition selon laquelle, dans le cas où certains des produits énumérés ci-dessus pris séparément ne sont pas liquides à une température inférieure ou égale par exemple à
C, alors ces produits sont en mélange avec d'autres, de sorte qu'ils soient liquides à
10 une température inférieure ou égale par exemple à 15 C.
Les dérivés de triglycérides d'acides gras sont particulièrement préférés, notam-ment un mélange de triglycérides d'acides gras saturés en Cg -C10 issu de l'huile de noix de coco, par exemple celui commercialisé sous la dénomination Miglyol 812 par Sasol).
D'autres triglycérides à chaînes longues d'acides gras utilisables sont notamment présents 15 dans des huiles végétales telles que l'huile de soja, l'huile de palme, l'huile de lin, l'huile de coton, l'huile de sésame, l'huile de tournesol ou l'huile d'arachide.
Les poudres de PO/PA atomisées se dispersent aisément dans cette phase organique non miscible à l'eau, pour donner des suspensions stables de microparticules qui conservent leur intégrité pendant plusieurs jours et sont donc, là encore, aisément manipulables. Cette dispersion est particulièrement rapide sans qu'il soit nécessaire d'ajouter d'autre(s) moyen(s) de dispersion, même si cette éventualité est envisageable.
4. La phase continue de la suspension est une phase essentiellement orenique miscible ou non à l'eau Suivant une alternative intéressante de mise en oeuvre compatible avec les 2ème &
3ème possibilités s'agissant de la nature de la phase continue de la suspension/solution constituant la formulation, le moyen de dispersion comprend un enrobage des microparticules par au moins un composé filmogène d'enrobage (de préférence utilisable pour une préparation injectable).
De préférence, le composé filmogène d'enrobage comprend au moins un polymère hydrophobe choisi dans le groupe comprenant les polylactides, les polyglycolides, les poly(lactide-co-glycolide), les polyorthoesters, les polyanhydrides, les acides poly-hydroxybutyriques, les polycaprolactones, les polyalkylcarbonates, les polymères PO
insolubles dans l'eau, leurs dérivés et leurs mélanges.
Suivant une variante, le composé filmogène d'enrobage est de nature lipidique et présente une température de fusion de préférence supérieure ou égale à 15 C et comprend au moins un mélange de triglycérides d'acides gras saturés ou au moins une huile végétale ou au moins un lipide ou au moins un dérivé de lipide ou au moins un acide gras ou au moins un dérivé d'acide gras ou un mélange de ces produits.
Suivant un autre mode intéressant de réalisation, la phase continue organique, par exemple hydrophobe, ou l'enrobage hydrophobe peu(ven)t aussi contenir au moins un tensioactif injectable tel que le Tween 80, une lécithine, une phosphatidyléthanolamine, une phosphatidylsérine ou un copolymère de polyoxypropylène-polyoxyéthylène (dénomination commerciale : Poloxamer, Pluronic, Lutrol).
Excipients/stabilisants Il peut également être avantageux, pour faciliter les propriétés de dispersion en phase aqueuse ou améliorer encore la stabilité des suspensions aqueuses, que la formulation injectable comporte d'autres additifs, d'une part ceux ci-après désignés "excipients/
stabilisants",et d'autre part des excipients classiques.
Les excipients/stabilisants peuvent être sélectionnés dans le groupe comprenant :
¨> les nanoparticules d'au moins un polymère PO, PO étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles ionisables (GT), au moins en partie ionisés, et formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH =
7,0, en condition isotonique ;
--> les acides aminés ;
¨> les polyalkylène glycols, de préférence les polyéthylène glycols ;
--> les copolyalkylène glycols, de préférence les copolymères -éthylèneglycol-propylène-glycol (de type Poloxamer, Pluronic ou Lutrol) ;
¨> les polymères cellulosiques et leurs dérivés, de préférence les carboxyalkyl-celluloses (par ex. les carboxyméthylcelluloses) ou les alkylcelluloses (par ex. les méthyl-celluloses) ;
¨> les esters de sorbitane et d'acide(s) gras, de préférence les esters de polyoxy-alkylène (par ex. éthylène) glycol et d'au moins un acide (par ex. l'acide oléique), de type Tween (ou polysorbate) ;
¨> les tensioactifs à base de phospholipides et de polyalkylène glycols, de préférence de polyéthylène glycols ;
¨> les saccharides hydrogénés ou non, tels que le tréhalose, le sorbitol, le mannitol, le saccharose ;
--> les polyols tels que le propylène glycol ou le glycérol ;
¨> les gélatines de préférence hydrolysées ;

les (co)polymères azotés, de préférence dans le groupe comprenant les polyacrylamides, les poly-N-vinylamides, les polyvinylpyrrolidones (PVP) et les poly-N-vinyl-lactames ;
---> les alcools polyvinyliques (APV) ;
5 --> et leurs mélanges.
L'un des excipients (stabilisants) préférés conformément à l'invention est formé par des nanoparticules d'au moins un polymère PO, identique ou différent (de préférence identique) de celui constituant les microparticules.
10 La quantité de d'excipient/stabilisant mis en oeuvre dans la formulation est de préférence comprise entre 0,01 et 10 % en poids, et plus préférentiellement encore entre 0,1 et 5 % en poids.
S'agissant des stabilisants comprenant des nanoparticules, ils sont avantageusement utilisés dans la formulation à raison de 1,5 à 3,5 % en poids, par exemple de 2,0 à 3,0 (=-===
15 2,5) % poids.
Le liquide de reconstitution Outre les moyens de dispersion décrits ci-dessus, le liquide de reconstitution mis en uvre dans la préparation de la formulation selon l'invention peut comprendre par 20 exemple :
- au moins un tampon ou au moins un sel injectable (tampon phosphate, tampon citrate, chlorure de sodium) en concentration par exemple entre 0,001 M et 0,1 M
de préférence entre 0,005 M et 0,02 M, ce tampon ou ce sel injectable permettant d'ajuster le pH de la solution ;
25 - au moins un tensioactif injectable, de préférence de type polysorbate tels le Tween 20 et le Tween 80 ou de type Poloxamer tels le Lutrol F38, le Lutrol F68 ou le Lutrol F127 dans des concentrations par exemple comprises entre 0,01 % et 2 %, de préférence entre 0,05 et 0,5 %.
Le liquide de reconstitution peut contenir de plus des agents densifiants tels que des 30 saccharides, à savoir par ex. le saccharose, le D-mannitol ou le tréhalose dans des concentrations comprises entre 0,1 % et 10 %, de préférence entre 0,5 et 5 %.
La solution de reconstitution peut également contenir un polymère viscosifiant injectable choisi dans le groupe comprenant les polysaccharides, les polymères synthétiques (par ex.
la carboxy-méthylcellulose sodique), l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, les poly-35 alkylène glycols (par ex. polyéthylène glycols) et leurs mélanges.
L'utilisation de microparticules sèches de PO (par ex. polyaminoacide) amphiphile et l'utilisation d'un moyen ad hoc de reconstitution permet donc de répondre au double objectif qui est de pouvoir obtenir des formulations pharmaceutiques à la fois stables et facilement dispersibles pour permettre leur injection par voie parentérale.
Outre les excipients/stabilisants susvisés pour l'amélioration de la dispersion et de la stabilité, les autres excipients classiques qui peuvent être ajoutés à la suspension/
solution à atomiser ou à la formulation selon l'invention, sont, par exemple, des antimicrobiens, des tampons, des antioxydants ou des agents permettant d'ajuster l'isotonicité, qui sont connus de l'homme de l'art. On pourra par exemple se référer à
l'ouvrage : Injectable Drug Development, P.K. Gupta et al., Interpharm Press, Denver, Colorado 1999.
Cet ajout d'excipients classiques peut être réalisé soit dans la phase aqueuse de dispersion, soit dans la solution/suspension avant atomisation.
Application de la formulation liquide selon l'invention Bien que la formulation selon l'invention soit de préférence pharmaceutique, cela n'exclut pas pour autant les formulations cosmétiques, diététiques ou phytosanitaires comprenant au moins un PO tel que défini ci-dessus et au moins un PA.
zlème aspect de l'invention : Nécessaire de reconstitution de la formulation selon l'invention Les microparticules de PO/PA et les liquides de reconstitution essentiellement aqueux, les liquides de reconstitution essentiellement organiques et miscibles à l'eau et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau sont définis ci-dessus.
Sème aspect de l'invention : Procédé de reconstitution, en particulier de la formulation selon l'invention Les microparticules de PO/PA et les liquides de reconstitution essentiellement aqueux, les liquides de reconstitution essentiellement organiques et miscibles à l'eau et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau sont définis ci-dessus.
Conformément à l'invention, il est envisageable de prévoir une filtration stérilisante, sur des filtres de porosité égale, par exemple, à 0,2 p,m, de la suspension liquide de nanoparticules de laquelle sont issues les particules micrométriques de la formulation selon l'invention. L'agrégation en conditions stériles selon les modes de préparation décrits ci-dessus permet ainsi d'injecter directement la formulation à un patient.
6èrne aspect de l'invention : Formulation pharmaceutique solide Cette formulation pour la libération prolongée de PA comprend une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire à base de microparticules PO/PA ci-dessus définies.
Autres aspects de l'invention La présente invention vise également des produits solides, dérivés des micro-particules de PO selon l'invention.
En pratique, ces produits dérivés peuvent notamment être constitués par des poudres, des gels, des implants ou des films, entre autres.
Ainsi, l'invention vise des produits dérivés de la formulation selon l'invention, pris en tant que tels, quel que soit leur procédé d'obtention.
L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique consistant essentiellement à administrer une quantité efficace au plan thérapeutique de la formulation telle que décrite dans le présent exposé, par voie parentérale, en particulier par voie muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intra-cérébrale ou dans une tumeur. La formulation selon l'invention peut aussi être administrée par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, entre autres.
Suivant une variante particulière de l'invention, cette méthode de traitement thérapeutique consiste à administrer la formulation telle que décrite supra par injection parentérale : sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, de préférence de manière à ce qu'elle forme un dépôt au site d'injection.
L'invention sera mieux comprise et ses avantages et variantes de mise en uvre ressortiront bien des exemples qui suivent et qui décrivent la synthèse des PO
formés par des polyaminoacides greffés par un groupement hydrophobe, leur transformation en système de libération prolongée de PA, à savoir en formulation selon l'invention (poudre de microparticules sèches) et les caractéristiques de stabilité et de redispersibilité de tels systèmes.
EXEMPLES :
EXEMPLE 1 : SYNTHESE D'UN POLYMERE AMPHIPHILE PO-A

Synthèse d'un polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique On solubilise 15 g d'un acide alpha-L-polyglutamique (de masse équivalente à
environ 16 900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène, et obtenu par polymérisation de NCAG1u0Me suivie d'une hydrolyse, comme décrit dans la demande FR-A-2 801 226) dans 288 ml de diméthylformamide (DMF) en chauffant à 80 C jusqu'à
solubilisation du polymère. On refroidit la solution à 15 C et on ajoute successivement 2,5 g de D,L-alpha-tocophérol (> 98 % obtenu de Fluka ) préalablement solubilisé dans 8 ml de DMF, 280 mg de 4-diméthylaminopyridine préalablement solubilisée dans 1 ml de DMF
et 1,6 g de diisopropylcarbodiimide préalablement solubilisé dans 6 ml de DMF. Après 3 h sous agitation, le milieu réactionnel est versé dans 1200 ml d'eau contenant 15 %
de chlorure de sodium et d'acide chlorhydrique (pH = 2). Le polymère précipité est ensuite récupéré par filtration, lavé par de l'acide chlorhydrique 0,1 N, de l'eau et par de l'éther diisopropylique.
Le polymère est ensuite séché à l'étuve sous vide à 40 C. On obtient un rendement de l'ordre de 90 %. La masse molaire mesurée par la chromatographie d'exclusion stérique est de 15 500 par rapport à un standard polyoxyéthylène. Le taux de tocophérol greffé, estimé par spectroscopie RMN du proton, est de 5,1 % molaire. Une suspension de nanoparticules du polymère dans l'eau est obtenue en le solubilisant dans l'eau et en ajustant le pH à 7 1 (neutralisation des carboxylates).
EXEMPLE 2 : SYNTHESE D'UN POLYMERE AMPHIPHILE PO-B
L'exemple 2 est adapté de l'exemple 1 en visant un taux de greffage de 20%
EXEMPLE 3: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L' IFN-a-2b Préparation d'une solution contenant 20 mg/g de polymère et 0,25 mg/g d'IFN
200 g de solution de polymère PO-A à 30 mg/g sont introduits dans un flacon de 500 ml.
68 g d'eau sont ensuite introduits dans le flacon contenant le polymère. Une solution congelée d'IFN-a-2b concentrée à 2,8 mg/g est décongelée à 25 C pendant 1 h et 26,8 g de cette solution congelée sont introduits dans le flacon contenant la solution de polymère.
Le mélange est laissé pendant 14 h à température ambiante.
La solution est filtrée sur un filtre stérilisant 0,2 m.
Atomisation de la solution polymère-IFN

La solution est atomisée sur un appareil de spray-chying de type Büchi B290.
La solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à travers une buse de pulvérisation alimentée en azote (700 kPa ¨ 900 1/h). Le débit d'aspiration (air de séchage) est de 40 m3/h. La température d'entrée est maintenue à 90 C, ce qui induit dans ces conditions une température en sortie de 45 C.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 4: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L' IFN-a-2b ET DU POLYSORBATE 80 La solution de polymère PO et d'interféron est préparée à l'identique de l'exemple 3.
0,9 g de polysorbate 80 sont ajoutés à la solution avant atomisation.
Atomisation de la solution polymère-IFN en présence de polysorbate La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est: D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 5: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES
ACIDIFIÉES DE POLYMERE PO-A CONTENANT DE L' IFN-a-2b La solution de polymère PO-A et d'IFN est préparée à l'identique de l'exemple 3. Elle est ensuite diluée par ajout d'eau de façon à ce que la concentration en polymère PO-A soit de 15 mg/g (la concentration en IFN étant alors de 0,188 mg/g). Après filtration sur 0,2 !am, la solution est acidifiée par ajout de HC1 1 N jusqu'à obtention d'un pH = 4.
La solution ainsi obtenue est opalescente.
Atomisation de la solution polymère-IFN acidifiée La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3.

Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de 5 l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation.
Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 6: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A ENROBÉES DE PVP ET CONTENANT DE L' IFN-a-2b Une poudre de microparticules sèches de polymère PO-A et d'IFN est obtenue à
partir d'un mélange PO-A/IFN selon le protocole utilisé à l'exemple 3.
A l'issue de l'étape d'atomisation, 1,5 g de cette poudre sont remis en suspension dans une solution éthanolique contenant 7 g/1 de polyvinylpyrrolidone (PVP) de grade injectable de type PVP K30. La suspension éthanolique est agitée 2 h puis elle est atomisée une deuxième fois sur l'appareil de spray-drying de type Büchi B290 muni d'un piège d'extraction pour solvant organique (boucle d'inertage à ¨20 C) et fonctionnant en circuit fermé sous azote. La solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à
travers une buse de pulvérisation alimentée en azote (700 kPa ¨ 670 1/11). Le débit d'aspiration (air de séchage) est de 40 m3/h. La température d'entrée est maintenue à
80 C, ce qui induit dans ces conditions une température en sortie de 55 C.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 6 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 7: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-B CONTENANT DE L' IFN-a-2b Le protocole de préparation de la solution polymère-IFN et d'atomisation est identique à
celui décrit dans l'exemple 3, mais en remplaçant le polymère PO-A par le polymère PO-B.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est: D50 = 4 m.

Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 8: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'hGH
Préparation de la solution d'hGH concentrée :
60 g d'une solution d'hormone de croissance humaine recombinante (concentration 3,9 mg/g) sont décongelés pendant 90 min à 25 C et concentrés environ 6 fois par ultrafiltration frontale sur membrane à limite d'exclusion de 10 kD jusqu'à
obtention d'une concentration de 24 mg/g (contrôlée par HPLC).
Mélange avec la solution de polymère 52 g d'une solution concentrée de polymère PO-A à 30 mg/g sont dilués à 19,5 mg/g par ajout de 28 g d'eau. 8 g de la solution d'hGH à 24 mg/g sont versés lentement sur la solution de polymère ainsi diluée. Le mélange est laissé pendant une nuit à
température ambiante puis filtré sur filtre stérilisant (taille des pores : 0,2 m).
Atomisation de la solution polymère-hGH
La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'hGH par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 9: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'IL-2 Préparation de la solution d'IL-2 concentrée :
100 g d'une solution congelée d'IL-2 à la concentration de 2 g/1 stabilisée par du SDS sont décongelés à température ambiante puis la solution est refroidie à une température comprise entre 0 et 2 C. 100 g d'éthanol absolu sont ajoutés lentement à
cette solution de façon à précipiter la protéine. Le précipité est récupéré par filtration sur une membrane de 0,65/0,45 m dans une cellule de diafiltration frontale et lavé avec 200 g d'eau. Le précipité est séché par application d'un flux d'azote. Le précipité est alors dissous dans 10 g de soude 0,02 N préalablement refroidie (<5 C) de façon à obtenir une solution limpide de protéine à 20 mg/g et pH = 12 exempte de SDS. Le titre exact de la solution est déterminé par une méthode HPLC.
Mélange avec la solution de polymère 96 g d'une solution concentrée de polymère PO de l'exemple 1 (à 30 mg/g) sont dilués par ajout de 39 g d'eau. 9 g de la solution d'IL-2 concentrée précédente à 20 mg/g sont lentement versés sur la solution de polymère ainsi diluée.
Le mélange contenant 20 mg/g de polymère PO et 1,25 mg/g d'IL-2 est laissé
pendant une nuit à température ambiante puis filtré sur filtre stérilisant 0,2 m.
Atomisation de la solution polymère-IL-2 La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 m.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IL-2 par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation. Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 10 : PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'INSULINE
Préparation de 40 g d'une solution d'insuline concentrée à 20,3 mg/g :
0,83 g d'insuline humaine recombinante (poudre) d'activité 28,7 Ul/g et contenant 2,5 %
d'humidité sont introduits dans un flacon en verre. 23,62 g d'eau sont ajoutés et l'insuline est dispersée sous agitation magnétique lente. 6,22 g d'HC1 0,1 N sont ajoutés jusqu'à
obtention d'une solution limpide d'insuline acide. 9,32 g de soude 0,1 N sont alors ajoutés de façon à obtenir une solution finale limpide ayant un pH compris entre 7 et 8. La solution d'insuline est filtrée sur un filtre stérilisant 0,2 m.
Mélange avec la solution de polymère 37,66 g de la solution d'insuline concentrée précédente sont lentement versés (sous agitation magnétique) sur 220 g de solution de polymère PO à 30 mg/g. 72,34 g d'eau sont ajoutés à la solution. Le mélange est laissé pendant 4 h à température ambiante puis filtré
sur 0,2 m.
Atomisation de la solution polymère-insuline La solution est ensuite atomisée sur un appareil de spray-drying de type Büchi B290. La solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à travers une buse de pulvérisation alimentée en azote (700 kPa ¨ 900 1/h). Le débit d'aspiration (air de séchage) est de 40 m3/h. La température d'entrée est maintenue à 120 C, ce qui induit dans ces conditions une température en sortie de 70 C.
Atomisation de la solution polymère-insuline La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3.
Caractérisation des microparticules obtenues :
La taille des particules obtenues (selon test TO) est : D50 = 5 lam.
Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'insuline par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation.
Aucune forme dégradée n'est détectée.
EXEMPLE 11: CARACTÉRISTIQUES DES MICROPARTICULES OBTENUES
SELON L'INVENTION : TAILLE ET STABILITÉ
La taille des microparticules est mesurée selon le test TO et la stabilité
selon la test Si.
L'évaluation de la dégradation de la protéine est réalisée par HPLC en comparant un chromatogramme de la formulation avant et après atomisation.
Exemples Taille Taille D50 après mise Dégradation de la D50 selon TO en stabilité selon ST1 protéine générée par (11m) (1-tm) l'atomisation*
3 5 5 aucune 4 5 5 aucune 5 5 5 aucune 6 6 5 aucune 7 4 5 aucune 8 5 5 aucune 9 5 5 aucune 10 5 5 aucune * aucune signifie qu'aucune forme dégradée n'a été observée.

Les résultats démontrent que l'atomisation des protéines en présence d'un polyaminoacide amphiphile permet de préserver la stabilité de la protéine. Sous forme solide la poudre est stable selon le protocole décrit. Il s'agit d'une condition forcée et il est anticipé que la stabilité des poudres est d'au moins 2 ans à 5 C.
L'atomisation est une méthode susceptible de dégrader la protéine. L'analyse par HPLC
montrent qu'aucune forme de dégradation est observée en comparant les chromatogrammes avant et après atomisation.
L'atomisation d'une protéine en présence d'un polyaminoacide amphiphile conduit à des microparticules stables dans le temps et n'induit pas de dégradation de la protéine.
Ces poudres peuvent être utilisés sous forme solide (inhalation, injection sans aiguille par un pistolet sous pression par exemple) ou sous forme d'une suspension injectable après reconstitution dans un milieu approprié.
EXEMPLE 12: RECONSTITUTION DE SUSPENSION A PARTIR DES POUDRES
DES EXEMPLES 3 A 10.
Le reconstitution des poudres est réalisé dans trois milieux différents selon le protocole décrit pour réaliser le test DP1 :
A. Une solution aqueuse de tampon phosphate salin à pH 7.4 B. Une solution aqueuse de chlorure de magnésium à 0,1 M
C. Une solution de triglycéride d'acide caprique (Miglyol 812) Les échantillons sont ensuite évalués en réalisant les étapes suivants :
- dispersion dans un des milieux cités ci-dessus -transfert dans une seringue puis injection à travers une seringue de 25G
La suspension est considérée avoir des bonnes propriétés si au moins 80 % est récupérer par aspiration/injection à travers une aiguille de 25G.
Résultats :
Milieu A Milieu B Milieu C
Exemple Stabilité Stabilité
Stabilité
Test DP1 Test DP1 Test DP1 3 non conforme conforme conforme conforme conforme _ 4 non conforme conforme conforme conforme conforme _ . _ .
5 non conforme non conforme conforme conforme 6 non conforme conforme conforme conforme conforme conforme conforme conforme conforme conforme conforme 8 non conforme - conforme conforme conforme conforme 9 non conforme - conforme conforme conforme conforme 10 non conforme - conforme conforme conforme conforme Il a été mesuré également que la protéine n'est pas dégradée après reconstitution dans les milieux A, B et C lors du test de stabilité.
5 Ces résultats montrent que l'obtention d'une suspension stable et injectable des microparticules dans l'eau tamponnée par du PBS à pH = 7,4 n'est possible qu'avec la composition de l'exemple 7. Pour la plupart des exemples (sauf la 5), le milieu de reconstitution comportant un sel divalent permet l'améliorer ces propriétés.
En milieu Miglyol, toutes les formulations sont facilement dispersibles, injectables et stables.
L'ensemble de ces propriétés n'est pas obtenu aisément selon le polymère utilisé. Il est du mérite des inventeurs d'avoir trouvé après de nombreux essais que certains excipients et milieux de reconstitution permettent d' obtenir ces propriétés.
EXEMPLE 13 : MESURE DE VISCOSITÉ DES FORMULATIONS RECONSTITUÉES
Une dispersion des poudres à 30 mg/mL dans les milieux B et C des exemples précédents (sauf la 5 dans le milieu B) donnent des suspension stables peu visqueuses ;
dans le milieu B, les viscosités mesurées sont tous inférieures à 10 mPa.s et dans le milieu C, les viscosités sont tous de l'ordre de 30 à 40 mPa.s.
A titre de comparaison, une composition des mêmes polymères sous forme nanoparticulaire selon l'art antérieure, ne peux pas être obtenue à cette concentration (30 mg/mL) dans les valeurs de viscosités acceptables (< 100 mPa.$).
EXEMPLE 14: PRÉPARATION DE PARTICULES MICROMÉTRIQUES SECHES DE
POLYMERE PO-A CONTENANT DE L' IFN-a-2b OBTENUES SOUS FORME DE
POUDRE LYOPHILISÉE
Les particules sont tout d'abord préparées comme décrit à l'exemple 3. L'étape d'atomisation est réalisée dans des conditions aseptiques et les particules sont récupérées dans un récipient stérile.
Redispersion des particules en présence d'ions Mg2+ :
Tout de suite après la phase d'atomisation les particules sont récupérées et redispersées en conditions aseptiques dans une solution aqueuse de MgCl2 à 0,10 M. La quantité
de solution de MgC12 ajoutée est ajustée de façon à ce que la concentration en polymère PO-A dans la suspension soit environ de 40 mg/ml. Le pH est ajusté à 6,5 par ajout de soude 1 N.
Lyophilisation La suspension est répartie en récipients de type Lyoguard permettant de garder la suspension stérile lors de la lyophilisation : les récipients sont ensuite lyophilisés stérilement pendant un cycle de 72 h sur un lyophilisateur de laboratoire (module de paillasse Christ, Osterode, Allemagne). La poudre est répartie stérilement en flacons avant utilisation.
EXEMPLE 15: COMPARAISON DE LA RECONSTITUTION DES POUDRES DE
MICROPARTICULES OBTENUES A PARTIR DE L'EXEMPLE 3 ET CELLES DE
L'EXEMPLE 14 Pour cette comparaison, les volumes de suspension reconstituée sont identiques dans les deux cas (environ 1 ml) et les flacons de reconstitution sont identiques (flacons en verre de 3 m1). Les quantités de poudre sont ajustées de façon à ce que les deux suspensions contiennent au final 40 mg/mi de polymère et 0,5 mg/m1 d'IFN-a-2b. La poudre de l'exemple 3 est reconstituée dans une solution aqueuse de MgC12 0,1 M alors que la poudre de l'exemple 14 (qui contient déjà des ions Mg2+) est reconstituée dans l'eau pure.
Dans un premier temps, les flacons sont agités manuellement. Alors que la poudre de l'exemple 3 requiert au moins 15 min pour se redisperser, la dispersion est plus rapide pour la poudre de l'exemple 14 et en moins de 5 min, on obtient une suspension homogène. Un barreau magnétique est alors inséré dans les flacons et les deux flacons sont agités de façon identique pendant 1 h.
A l'issue de cette agitation, les caractéristiques des deux suspensions sont comparées : la taille des particules et la viscosité des deux suspensions sont semblables.
Caractéristiques après 1 h d'agitation Vitesse de redispersion magnétique sous agitation manuelle viscosité
D50 (test Ti) (20 C, 1000 s-i) Poudre exemple 3 environ 15 min 12 iam 54 mPa.s Poudre exemple 14 <5 min 10 lm 53 mPa.s EXEMPLE 16 : PHARMACOCINÉTIQUE DE L'IFN CHEZ LE CHIEN APRES INJEC-TION SOUS-CUTANÉE D'UNE FORMULATION A BASE DE POLYAMINOACIDES
AMPHIPHILES SOUS FORME MICROPARTICULAIRE

Huit chiens Beagle naïfs (poids de 9 0,6 kg) ont été traités avec les formulations suivantes :
Nombre (IFN] [PO] pH/ Dose Dose Volume Formulation de chiens (mg/mi) (mg/mi) mOsm (pg/kg) (mUkg) 6,5/
IFN IR 4 0,5 0 60 0,12 6,5/
Formulation 1 4 0,5 40 60 0,12 L'IFN IR (IR pour immediate release, c'est-à-dire libération immédiate) correspond à une solution d'interféron humain recombinant (PCGen, lot IB05.0516) ajustée en concentra-tion, pH et osmolarité ([IFN] = 0,5 mg/ml, pH = 6,5, et 354 mOsm).
Les particules de la formulation 1 sont préparées selon l'exemple 14 à partir du même lot d'interféron PCGen : la poudre lyophilisée est remise en suspension dans l'eau stérilement (sous hotte à flux laminaire) selon un procédé analogue à celui décrit dans l'exemple 15.
Les résultats pharmacocinétiques sont regroupés dans le tableau suivant :
Formulation Cm. SD T> 50 pg/mL SD AUCO-all SD RBA Tso%auc SD
(ng/mL) (h) (ng.h/m1) ( /0) (h) IFN IR 25,2 0,4 22,6 0,6 162,5 27,2 100 5,1 0,7 Formulation 1 0,5 0,2 225,0 15,3 54,7 7,5 34 99,5 11,9 où:
- C. est la concentration sérique maximale en IFN;
- T > 50 pg/ml est le temps où la concentration sérique en IFN est supérieure à
50 pg/ml ;
- AUC représente l'aire sous la courbe concentration sérique en IFN en fonction du temps ;
- RBA représente la biodisponibilité par rapport à une formulation Immediate Release;
- T50%auc représente le temps nécessaire pour relarguer 50% de l'IFN
relargué au total.
L'IFN IR présente un profil de libération rapide avec une concentration sérique maximale de 25,2 0,4 ng/mL, atteinte après un temps médian de 5 h (étendue : 3 - 5 h). L'IFN
circulant n'est plus quantifiable au-delà de 24 h.
La formulation 1 offre une modification majeure du profil pharmacocinétique de l'IFN, avec une libération très lente, et une concentration sérique maximale de 0,5 0,2 ng/mL

(50 fois inférieure à celle de la forme IR) atteinte après un temps médian de 60 h (étendue : 48 - 96 h). L'allure générale de la pharmacocinétique est un profil plat en pseudo-plateau. Le niveau d'IFN circulant retourne à une concentration non quantifiable entre 192 h et 240 h (8 et 10 jours). Cette formulation présente une AUC plus basse :
perte de biodisponibilité relative de 66 % (RBA = 34%). Le T50%aue est environ 20 fois supérieur à
celui de l'IFN IR.
EXEMPLE 17: PHARMACODYNAMIE DE L'INSULINE CHEZ LE CHIEN APRES
INJECTION SOUS-CUTANÉE D'UNE FORMULATION A BASE DE POLYAMINO-ACIDES AMPHIPHILES SOUS FORME MICROPARTICULAIRE
La référence de cet exemple, le Lantus , est un analogue d'insuline modifiée (insuline glargine - Sanofi-Aventis). La modification de deux aminoacides sur la structure primaire de l'insuline humaine confère au Lantus des propriétés de libération prolongée sur une période de 24 h via une précipitation in situ.
Un groupe de 6 chiens Beagle sains (poids de 11,4 1 kg) a été traité avec la formulation Lantus au cours d'un essai croisé à 2 périodes et un groupe de 8 chiens Beagle sains (poids de 11,8 1 kg) a été traité par la formulation 2, deux par deux, au cours d'un essai croisé à 4 périodes. Le tableau récapitulatif des traitements est résumé ci-dessous :
Nombre [insuline] [PO] Dose Dose Volume de chiens (UI/g) (mg/g) (UI/kg) (p,L/kg) Lantus (lot 40N300) Formulation 2 8 100 30 1 1 10 Les particules de la formulation 2 sont préparées selon l'exemple 10 en visant un ratio de mg de polymère PO pour 3,5 mg (100 UI) d'insuline. La formulation est préparée par dispersion de la poudre atomisée dans MgC12 0,1 M et agitation magnétique de la 25 suspension pendant 1 h. Le pH de la formulation est de 6,2 et l'osmolalité de 348 mOsm.
La taille des particules correspondantes, mesurée dans un test TI, est : D50 =
12 pm et la viscosité de la formulation est d'environ 5 mPa.s à 20 C.
La glycémie est dosée par méthode enzymatique (hexokinase) sur un automate d'analyses 30 biochimiques du sang (Advia 1650, Bayer Diagnostics).
L'analyse des résultats de pharmacodynamie est réalisée sur le pourcentage de la glycémie basale en fonction du temps.

Les données pharmacodynamiques sont regroupées dans le tableau suivant :
n I/
Cmin SD APGCo-36h APGCformuiatio SD T50%APGc SD
APGCLantus (A) (%.h) SD (h) (%) Lantus 40 6 1250 342 13,3 3,1 Formulation 2 50 17 948 491 76 39 16,5 6,2 où:
- Cmin est le pourcentage minimum observé de la glycémie basale ;
- APGCo-36h ("Area Percent Glycemia Curve") représente la surface entre la glycémie basale (100%) et la courbe représentant l'évolution de la glycémie (exprimée en % de la glycémie basale) au cours du temps entre 0 et 36 h post-dose;
- T50%ApGc représente le temps nécessaire pour obtenir 50 % de l'APGC0-36h.
L'administration de la référence Lantus conduit à une baisse rapide de la glycémie dès la première heure. L'action hypoglycémiante de l'insuline glargine est ensuite maintenue sur une période comprise entre 18 et 36 h (retour de la glycémie à son niveau basal après 30 h en moyenne).
En comparaison, l'administration de la formulation 2 conduit également à une baisse rapide de la glycémie dès la l' heure. Le pourcentage de la glycémie basale est ensuite maintenu en plateau jusqu'à 36 h en moyenne. La Cmir, obtenue avec la formulation 1 est en moyenne plus haute que celle de la référence Lantus , ce qui devrait permettre de réduire considérablement les phénomènes d'hypoglycémie sévère chez les patients diabétiques.
La durée d'action de la formulation 2 est nettement supérieure à celle de la référence longue action Lantus . Ceci est illustré par une valeur moyenne de T50%APGc plus élevée pour la formulation 2.
Une perte d'APGC0-36h de seulement 24 % a été observée pour la formulation 2 par rapport à la référence Lantus .

Claims

REVENDICATIONS
- 1 - Formulation pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA
caractérisée en ce qu'elle comprend :
- des microparticules de polymère (PO), ayant un diamètre D50 compris entre 1 et 70 µm, D50 étant le diamètre en dessous duquel se trouvent 50 % des objets analysés, obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale aqueuse de PO
associé de façon non covalente avec au moins un principe actif (PA), le polymère PO étant un (co)polyaminoacide dont la chaîne principale est formée par des acides aminés choisis parmi l'acide aspartique et l'acide glutamique, entre 1 et 25 % molaire de ces acides aminés étant porteurs de groupements hydrophobes (GH) choisis dans le groupe constitué
par : ¨OCH2(CH2-CH2)3-8¨CH3, oléyle, tocophéryle et cholestéryle, et - un liquide aqueux comprenant des cations multivalents choisis dans le groupe constitué
par : Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Al3+, Fe3+ et leurs mélanges.
- 2 - Formulation pharmaceutique liquide selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient un moyen pour disperser les rnicroparticules de PO choisi dans le groupe constitué par :
- au moins un composé hydrophile ajouté dans la suspension/solution de PO à
atomiser et - au rnoins un film d'au moins un composé hydrophile enrobant les microparticules.
- 3 - Formulation pharmaceutique liquide selon la revendication 2, caractérisée en ce que le cornposé hydrophile est choisi dans le groupe comprenant :
.fwdarw. les acides aminés;
.fwdarw. les polyalkylène glycols ;
.fwdarw. les copolyalkylène glycols ;
.fwdarw. les polymères cellulosiques et leurs dérivés ;
.fwdarw. les saccharides hydrogénés ou non ;
.fwdarw. les polyols ;
.fwdarw. les gélatines ;
.fwdarw. les polyacrylarnides, les poly-N-vinylamides, les polyvinylpyrrolidones (PVP) ou les poly-N-vinyl-lactarnes ;
.fwdarw. les alcools polyvinyliques (APV);
.fwdarw. le polyglutamate de sodium ;
.fwdarw. et leurs mélanges.

- 4 - Formulation pharmaceutique liquide selon la revendication 3, caractérisée en ce que le composé hydrophile est choisi dans le groupe comprenant :
.fwdarw. les polyéthylène glycols ;
.fwdarw. les copolymères éthylèneglycol- propylèneglycol;
.fwdarw. les carboxyalkylcelluloses ou les alkylcelluloses;
.fwdarw. le tréhalose, le sorbitol, le mannitol ou le saccharose ;
.fwdarw. le propylène glycol ou le glycérol ;
.fwdarw. les gélatines hydrolysées ;
.fwdarw. et leurs mélanges.
- 5 - Formulation pharmaceutique liquide selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère PO est défini par la formule générale (I) suivante (le radical ¨COOR3 inclut les formes où la liaison entre le carboxyle et R3 est une liaison ionique ¨COO-+R3):
dans laquelle :
.cndot. R1 est choisi dans le groupe constitué par H, alkyle linéaire en C2 à C10, alkyle ramifié en C3 à C10, benzyle, et -R4-[GH], ou .cndot. NHR1 est un acide aminé terminal ;
.cndot. R2 est choisi dans le groupe constitué par H, acyle linéaire en C2 à C10, acyle ramifié en C3 à C10, et -R4-[GH] ou .cndot. R2 est un pyroglutamate terminal ;
.cndot. R3 est H, ou .cndot. +R3 est sélectionné dans le groupe comprenant :
- les cations rnétalliques choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium et le magnésium, - les cations organiques choisis dans le sous-groupe comprenant .cndot. les cations à base d'amine, .cndot. les cations à base d'oligoamine, .cndot. les cations à base de polyamine, et .cndot. les cations à base d'acide(s) aminé(s) choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine et les cations à base d'arginine, - ou les polyaminoacides cationiques choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine et l'oligolysine ;
.cndot. R4 représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 acides aminés ;
.cndot. A représente indépendamment un radical -CH2- ou -CH2-CH2- ;
.cndot. n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est comprise entre 1 et 25 % molaire ;
.cndot. n + m est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à

;
.cndot. GH représente un groupement hydrophobe choisi dans le groupe constitué par : ¨OCH2(CH2-CH2)3-8-CH3, oléyle, tocophéryle et cholestéryle.
- 6 - Forrnulation pharmaceutique liquide selon la revendication 5, caractérisée en ce que le taux de greffage molaire n/(n+m) est cornpris entre 10 et 25 %.
- 7 - Formulation pharmaceutique liquide selon la revendication 1, caractérisée en ce que le (ou les) PO répond à l'une des formules générales (II), (I II) et (IV) suivantes (le radical ¨COOR3' inclut les formes où la liaison entre le carboxyle et R3' est une liaison ionique ¨COO- +R3'):
dans lesquelles :
.cndot. GH représente un groupement hydrophobe choisi dans le groupe constitué
par : ¨OCH2(CH2-CH2)3-8¨CH3, oléyle, et tocophéryle ;
.cndot. R30 est une chaine alkylène linéaire bivalente en C2 à C6 ;
.cndot. R3' est H, ou .cndot. +R3' est sélectionné dans le groupe comprenant :
- les cations métalliques choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium et le magnésium, - les cations organiques choisis dans le sous-groupe comprenant :
.cndot. les cations à base d'amine, .cndot. les cations à base d'oligoamine, .cndot. les cations à base de polyamine, et .cndot. les cations à base d'acide(s) aminé(s) choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine et les cations à base d'arginine, - ou les polyaminoacicles cationiques choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine et l'oligolysine, .cndot. le est une chaine alkylène linéaire bivalente en C1 à C8 dans laquelle une ou deux unités méthylènes peuvent être indépendamment remplacées par ¨O¨
ou ¨NH¨ ;
.cndot. R4 représente une liaison directe ou un espaceur à base de 1 à 4 acides aminés .cndot. A représente indépendamment un radical -CH2- ou -CH2-CH2-;
.cndot. n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à
1000.
- 8 - Formulation pharmaceutique liquide selon la revendication 5 ou 7 caractérisée en ce que R4 représente une liaison de valence simple.

- 9 - Formulation pharmaceutique liquide selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, caractérisée en ce que le (ou les) PO comprend au moins une copolyhydroxyalkylglutamine essentiellement neutre comprenant une multiplicité
de groupements hydrophobes (GH) pendants, identiques ou différents entre eux.
- 10 - Formulation pharmaceutique liquide selon l'une quelconque des revendications 1 à
8, caractérisée en ce que la chaîne principale du polyaminoacide est un homopolymère d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique.
- 11 - Formulation pharmaceutique liquide selon l'une quelconque des revendications 1 à
8, caractérisée en ce que la chaîne principale du polyaminoacide est un homopolymère d'alpha-L-aspartate ou d'alpha-L-aspartique.
- 12 - Formulation pharmaceutique liquide selon l'une quelconque des revendications 1 à
8, caractérisée en ce que la chaîne principale du polyaminoacide est un copolymère d'alpha-L-aspartate/alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-aspartique/alpha-L-glutamique.
- 13 - Formulation pharmaceutique liquide selon l'une quelconque des revendications 1 à
12, caractérisée en ce que la masse molaire du PO se situe entre 2000 et 100 000 g/mol.
- 14 - Procédé de préparation d'une formulation pharmaceutique liquide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant les étapes suivantes :
.cndot. former spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules de PO
dans l'eau, à pH 7,0, en condition isotonique, ledit PO étant un (co)polyaminoacide dont la chaîne principale est formée par des acides aminés choisis parmi l'acide aspartique et l'acide glutamique, entre 1 et 25 %
molaire de ces acides aminés étant porteurs de groupements hydrophobes (GH) choisis dans le groupe constitué par : -OCH2(CH2-CH2)3-8-CH3, oléyle, tocophéryle et cholestéryle ;
.cndot. associer de façon non covalente lesdites nanoparticules de PO avec au moins un PA ;
.cndot. atomiser ladite suspension colloïdale pour obtenir des microparticules solides sèches ; et .cndot. disperser les microparticules obtenues dans un liquide aqueux comprenant des cations multivalents choisis dans le groupe constitué par : Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Al3+, Fe3+ et leurs mélanges.

- 15 - Procédé selon la revendication 14, comprenant l'étape additionnelle suivante :
.cndot. ajouter au moins un composé hydrophile dans la solution ou la suspension colloïdale de PO avant l'atomisation, ou .cndot. enrober les microparticules de PO par au moins un film de composé
hydrophile.
- 16 - Procédé de préparation d'une formulation pharmaceutique solide, comprenant la mise en oeuvre du procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 14 et 15, et l'étape additionnelle suivante :
.cndot. lyophiliser la dispersion obtenue.
- 17 - Procédé de préparation d'une formulation pharmaceutique liquide, comprenant la mise en oeuvre du procédé tel que défini dans la revendication 16 et l'étape additionnelle suivante :
.cndot. disperser le lyophilisat obtenu dans un liquide aqueux.
- 18 - Formulation pharmaceutique solide pour la libération de PA caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé selon la revendication 16.
- 19 - Formulation pharmaceutique solide selon la revendication 18 pour inhalation et administration pulmonaire.