BRPI0806265A2 - ciclosporina não-imunossupressora para tratamento de distrofia muscular congênita de ullrich - Google Patents
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Abstract
CICLOSPORINA NãO-IMUNOSSUPRESSORA PARA TRATAMENTO DE DISTROFIA MUSCULAR CONGêNITA DE ULLRI-CH. A presente invenção refere-se ao uso de um derivado de ciclos-porina A não-imunossupressora para reduzir a disfunção mitocondrial e a taxa de apoptose de células musculares de pacientes diagnosticados com distrofia muscular congênita de Ullrich ou miopatia de Bethlem.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CICLOSPO- RINA NÃO-IMUNOSSUPRESSORA PARA TRATAMENTO DE DISTROFIA MUSCULAR CONGÊNITA DE ULLRICH".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao uso de um derivado de ciclos- porina A não-imunossupressora para a redução de disfunção mitocondrial e da taxa de apoptose de células musculares de pacientes diagnosticados com distrofia muscular congênita de Ullrich ou com miopatia de Bethlem.
Antecedentes da Invenção
As mutações herdadas de genes de colágeno Vl causam duas doenças principais no músculo esquelético, miopatia de Bethlem (BM, Online Mendelian Inheritance in Man [OMIM] 158810) e distrofia muscular congênita de Ullrich (UCMD, OMIM 254090).
A BM é um distúrbio autossômico dominante caracterizado por fraqueza muscular lentamente progressiva axial e próxima com contratura em flexão dos dedos. (Bethlem e Wijngaarden. Brain 1976; 99: 91-100; Mer- lini e outros, Neuromuscul Disord 1994; 4: 503-11). Ela apresenta variabili- dade intrafamiliar e início clínico diferente desde a idade pré-natal até a meia-idade. O início pré-natal é caracterizado pela diminuição dos movimen- tos fetais; o início neonatal por hipotonia ou torcicolo; o início na pré-infância por atraso de eventos motores importantes, fraqueza muscular e contraturas e o início em adultos por fraqueza proximal, contraturas do tendão de Aqui- les e nos dedos. O estado é usualmente moderado e lentamente progressivo com alguns indivíduos afetados acima dos 50 anos de idade necessitando auxílio para mobilidade fora de casa. (Pepe e outros, Biochem Biophys Res Commun 1999; 258: 802-07. De Visser e outros, Muscle Nerve 1992; 15: 591-96). A função cardíaca é usualmente normal.
A UCMD é um distúrbio autossômico recessivo caracterizado por fraqueza muscular congênita com contraturas nas juntas e hiperlaxidade co- existente na junta distai. (Ullrich. Z. Ges. Neurol. Psychiatr. 1930; 126: 171- 201. Camacho Vanegas e outros, Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 7516- 21). A apresentação é usualmente no nascimento com hipotonia, desloca- mento congênito do quadril, ossos calcâneos proeminentes e uma deformi- dade cifótica transiente. Os eventos motores importantes são retardados e a maioria das crianças nunca adquire a capacidade de andar independente- mente. São comuns hiperceratose folicular sobre as superfícies do extensor dos membros superiores e inferiores e formação de cicatriz queloide e de cicatriz em "papel de cigarro". O envolvimento muscular axial é grave resul- tando em escoliose progressiva com rigidez espinhal. O envolvimento respi- ratório inicial e grave pode requerer suporte de ventilação artificial na primei- ra e na segunda década de vida. Os sujeitos afetados por UCMD apresen- tam uma inteligência normal e MRI apresentam um desenvolvimento normal no cérebro. Os pacientes com mutações heterozigóticas recessivas ou de novo usualmente têm um fenótipo grave clássico, embora eles possam oca- sionalmente apresentar uma doença do tipo de Bethlem mais branda. (Pan e outros, Am J Hum Genet 2003; 73: 355-69. Baker e outros, Hum Mol Genet 2005; 14: 279-93. Demir e outros, Am J Hum Genet 2002; 70: 1446-58.) Em alguns pacientes com o fenótipo de UCMD, foram excluídas as mutações de genes de colágeno VI, sugerindo a heterogeneidade genética mesmo para este estado. (Pan e outros, Am J Hum Genet 2003; 73: 355-69).
Recentemente, foi demonstrado que camundongos em que há falta de colágeno Vl devido à inativação direcionada do gene Col6a1 têm um defeito mitocondrial latente causado por uma abertura inapropriada do poro de transição da permeabilidade (PTP), um canal de membrana interna que representa um papel em diversas formas de morte da célula e pode ser des- sensibilizado por ciclosporina A. (Irwin e outros, Nat Genet 2003; 35: 267-71. Bernardi e outros, FEBS J 2006; 273: 2077-99.) Esta descoberta foi também explorada in vivo e conduziu a uma intervenção terapêutica bem sucedida no modelo de camundongo. O estabelecimento se as mitocôndrias estão envol- vidas na patogênese da UCMD geneticamente e clinicamente heterogênea representou um desafio importante, que foi o principal obstáculo à aplicação terapêutica em seres humanos do regime definido no modelo de camundon- go. Este desafio foi agora vencido. Além disso, os presentes inventores fo- ram capazes de demonstrar que se apresentam defeitos mitocondriais Iaten- tes em células de pacientes com UCMD e as taxas elevadas resultantes de apoptose podem ser inibidas por derivados de ciclosporina A não- imunossupressora tal como [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA. Consequentemente, a presente invenção fornece um novo método para a inibição da apoptose de células musculares de pacientes que sofrem de UCMD e um novo método de tratamento desta doenças nestes pacientes que usam um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora, de preferência [D-MeAla]3-[EtVal]4- CsA. Nenhum método eficaz para tratamento de UCMD é presentemente disponível. Portanto, há uma necessidade de novas abordagens terapêuticas tal como a abordagem descrita neste caso. Os presentes inventores também foram capazes de descobrir um defeito mitocondrial similar em pacientes com BM que fosse sensível à ciclosporina A. Portanto, o novo método de tratamento aqui divulgado para os pacientes com UCMD também pode ser aplicado para o tratamento de pacientes com BM.
Sumário da Invenção
A presente invenção deriva da descoberta de que um problema fundamental em UCMD é uma taxa elevada de apoptose de células de mús- culos esqueléticos. Esta taxa elevada podia ser demonstrada pelos invento- res como sendo um resultado de uma disfunção mitocondrial latente que podia ser corrigida por exposição das células a ciclosporina A. Significativa- mente, o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D-MeAIa]3- [EtVal]4-CsA era tão eficaz na redução da disfunção mitocondrial como na supressão da apoptose excessiva como o composto parental. Portanto, a presente invenção refere-se ao uso de um derivado de ciclosporina A não- imunossupressora (CsA) de fórmula I, mais preferivelmente de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula II e mais preferivelmen- te ainda de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D- MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III, para a redução da disfunção mitocondri- al e taxas apoptóticas em células de pacientes que sofrem de UCMD. Os derivados de ciclosporina A não-imunossupressora adequados para uso com a presente invenção foram descritos no Pedido de Patente Internacional PCT/EP2004/009804 por Novartis AG (WO 2005/021028), nas páginas 3-6. «· O [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA foi divulgado na Patente US N0 6.927.208. Fórmula I
<formula>formula see original document page 5</formula>
em que
W é MeBmt1 di-hidro-MeBmt, 8'-hidróxi-MeBmt ou O-acetil- MeBmt,
X é aAbu, Val1 Thr1 Nva ou O-metil treonina (MeOThr)1
R é Pro1 Sar, (D)-MeSer1 (D)-MeAIa ou (D)-MeSer(OacetiIa)1
Y é MeLeu, tioMeLeu, γ-hidróxi-MeLeu, Melle, MeVaI1 MeThr1
MeAIa, Mealle ou MeaThr; N-etilVal (EtVaI), N-etillle, N-etilThr, N-etilPhe, N-
etilTyr ou N-etilThr(Oacetila), em que Y não pode ser MeLeu quando R é Sar,
Z é Vai, Leu, MeVaI ou MeLeu,
Q é MeLeu, γ-hidróxi-MeLeu, MeAIa ou Pro,
T1 é (D)AIa ou Lys1
T2 é MeLeu ou γ-hidróxi-MeLeu e
T3 é MeLeu ou MeAIa.
Fórmula Il
<formula>formula see original document page 5</formula>
em que
W' é MeBmt1 di-hidro-MeBmt ou 8'-hidróxi-MeBmt,
X é aAbu, Val1 Thr, Nva ou O-metil treonina (MeOThr),
R' é Sar, (D)-MeSer1 (D)-MeAIa ou (D)-MeSer(OacetiIa)1
Y' é MeLeu1 γ-hidróxi-MeLeu, Melle1 MeVaI1 MeThr, MeAIa1 Me- alle ou MeaThr; N-etilVal (EtVaI)1 N-etillle, N-etilThr, N-etilPhe, N-etilTyr ou N-etilThr(Oacetila), em que Y não pode ser MeLeu quando R é Sar1
Zé Val1 Leu, MeVaI ou MeLeu,
Q' é MeLeu1 γ-hidróxi-MeLeu, ou MeAIa. Fórmula Ill
<table>table see original document page 6</column></row><table>
em que MeBmt é N-metil-(4R)-4-but-2E-en-1-il-4-metil-(L)treonina, aAbu é o ácido L-a-aminobutírico, D-MeAIa é N-metil-D-alanina, EtVaI é N-etil-L- valina, Val é L-valina, MeLeu é N-metil-L-leucina, Ala é L-alanina, (D)AIa é D-alanina e MeVaI é N-metil-L-valina.
Em uma outra modalidade, a invenção refere-se ao uso de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, mais preferi- velmente de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmu- la Il e mais preferivelmente ainda de um derivado de ciclosporina A não- imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III, para a fabricação de um medicamento que se pretende usar para o tratamento de UCMD.
Em uma outra modalidade também, a invenção refere-se a um método para o tratamento de UCMD em um paciente que compreende ad- ministrar ao paciente uma quantidade eficaz de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, mais preferivelmente a de um deriva- do de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula Il e mais preferivel- mente ainda de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D- MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III. Entende-se que uma quantidade eficaz de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora seja uma quantida- de que quando administrada repetidamente durante um regime terapêutico a um paciente com UCMD resulta em uma resposta clínica objetiva tal como uma melhoria, uma estabilização ou o retardamento na progressão da doen- ça. Quando administrado oralmente, uma quantidade eficaz para administra- ção duas ou três vezes por semana estará entre aproximadamente 1 mg/kg e aproximadamente 100 mg/kg, de preferência desde aproximadamente 1 mg/kg até aproximadamente 20 mg/kg. Pela via intravenosa, a dosagem in- dicada correspondente pode ser de desde aproximadamente 1 mg/kg até aproximadamente 50 mg/kg, de preferência de desde aproximadamente 1 mg/kg até aproximadamente 25 mg/kg.
Além disso, a invenção refere-se a composições farmacêuticas para o tratamento de UCMD que compreendem uma quantidade eficaz de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, mais pre- ferivelmente de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula Il e mais preferível mente ainda de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III, um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um excipiente e um diluente. O diluente tipicamente é a água. Os excipientes que são tipicamente adicio- nados a formulações parenterais incluem um agente isotônico, um tampão ou outro agente para controle do pH e um conservante. As composições po- dem compreender outros ingredientes ativos tal como um antibiótico.
A presente invenção refere-se ainda ao uso de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, mais preferivelmente a um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula Il e mais preferivelmente ainda a um derivado de ciclosporina A não-imunossupres- sora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III, para a redução de disfunção mitocondrial e de taxas apoptóticas em células de pacientes que sofrem de miopatia de Bethlem. Além disso, a invenção também refere-se a um método para o tratamento de BM em paciente que compreende administrar ao paci- ente uma quantidade eficaz de um derivado de ciclosporina A não-imunossu- pressora de fórmula I, mais preferivelmente de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula II e mais preferivelmente ainda de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III. Além disso, a invenção também refere-se ao uso de um deri- vado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, II ou III para a fabricação de um medicamento que se pretende seja usado para o tratamen- to de BM. Finalmente, a invenção refere-se a composições farmacêuticas para o tratamento de BM que compreendem uma quantidade eficaz de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, II ou III, um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um excipiente e um diluente.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 apresenta nos painéis AeB potenciais de membrana mitocondrial de mioblastos obtidos de biópsias de músculo de pacientes com UCMD que foram expostos a oligomicina e em taxas de painel C de apopto- se de mioblastos de pacientes com UCMD e de indivíduos saudáveis.
A Figura 2 apresenta o experimento representativo que testa o efeito de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA sobre a capacidade de retenção de cálcio (CRC) de mitoçôndrias de fígado e de músculo isolados de camundongos Col6a(1)Onde indicado por setas, foram adicionados pulsos de Ca2+ a 10 μΜ. As mitoçôndrias examinadas nos painéis Al e Bl foram isoladas, 5 horas depois do seu último tratamento, de camundongos tratados com placebo e aqueles nos painéis All e Bll provenientes de camundongos tratados com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA. Traços a-d: sem adição; traços a'-d': O [D-MeAIa]3- [EtVal]4-CsA (0,8 μΜ) foi adicionado ao meio de incubação. Os dados são representativos de 4 réplicas de experimentos.
A Figura 3 apresenta o sumário de determinações de CRC em mitoçôndrias isoladas de fígado e de músculo de camundongos Coiealv' depois do tratamento com placebo ou com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA. Foram realizados experimentos como descrito na Figura 2. CRCmax refere-se à CRC observada depois da adição de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA a 0,8 μΜ ao meio de incubação. Painel A: cada ponto representa um único camundongo.
Os camundongos 24-27 foram tratados com [D-MeAla]3-[EtVal]4- CsA e os camundongos 28-31 com uma formulação de placebo.
A Figura 4 apresenta o efeito sobre a fluorescência mitocondrial de TMRM de oligomicina em fibras de FDB isoladas de camundongos Coiealv' tratados com placebo ou com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA. Foram rea- lizados ensaios para TMRM como descrito no Exemplo 4 (Métodos). Quando indicado, foi adicionada oligomicina 5 μΜ (OIigo) ou carbonilcianeto-p- trifluorometoxifenil hidrazona(FCCP) a 4 μΜ. Cada traço representa os valo- res de fluorescência para uma única fibra. A Figura também apresenta o número de fibras que se despolarizam depois da adição de oligomicina em relação a um valor limite ajustado arbitrariamente a 90% de fluorescência.
A Figura 5 apresenta a incidência de apoptose sem seções de diafragma de camundongos Coiealv' tratados com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA ou placebo. São indicados números de núcleos apoptóticos por mm2 nas seções de diafragma de camundongo ColQaV1' tratado com [D-MeAIa]3- [EtVaIJ4-CsA (grupo 1, camundongos N0 24-27) ou placebo (grupo 2, camun- dongos N0 28-31). As barras referem-se a médias de 20-30 seções por ca- mundongo +/- SD. Dados para animais não-tratados (basais) e tratados com CsA (ciclosporina A) provenientes de amostras com histórico.
A Figura 6 apresenta a avaliação de fibras com mitocôndrias al- teradas em diafragmas provenientes de camundongos CoteaVf' tratados com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA ou placebo. O painel A apresenta percenta- gens de fibras musculares com mitocôndrias alteradas detectadas por mi- croscopia eletrônica em amostras provenientes de animais individuais. O painel B apresenta valores médios para dois grupos de tratamento. As bar- ras referem-se a percentagens médias +/- SD. O significado foi calculado usando-se o teste de Mann-Whitney.
Descrição Detalhada da Invenção
Para avaliar se podia ser revelada uma maior incidência de a- poptose e uma disfunção mitocondrial latente em pacientes com UCMD, fo- ram estudados cinco pacientes afetados por UCMD com referência a indiví- duos saudáveis. Os pacientes 1 e 5 tinham UCMD provada geneticamente. (Demir e outros, Mutations in COL6A3 cause severe and mild phenotypes of Ullrich congenital muscular dystrophy. Am J Hum Genet 2002; 70: 1446-58. Giusti e outros, Dominant and recessive COL6A1 mutations in Ullrich sclero- atonic muscular dystrophy. Ann Neurol 2005; 58: 400-10.) No paciente 2, a análise de seqüência do éxon 9 COL6A1 revelou a presença de uma elimi- nação de 15 nucleotídeos (que abrange os nucleotídeos 35.374-35.388 de número de acesso AJ011932, correspondente a um clone genômico que inclui éxons 1-20 do gene COL6A1; nt 921-936 de número de acesso NM_001848, correspondente a transcrito COL6A1) que ocorre em heterozi- gosidade. No paciente 4, a análise de seqüência do éxon 9 de COL6A1 re- velou a presença de uma variação de G->A que ocorre em heterozigosidade (nucleotídeo 35.400 de número de acesso AJ011932; nucleotídeo 850 de número de acesso NM_001848). A análise genética não estava disponível para o paciente 3, que apresentou aspectos clínicos e imuno-histoquímicos típicos de UCMD.
Os cinco pacientes foram representativos do espectro de gravi- dade de UCMD: todos tinham um início congênito; três (os pacientes 2, 3 e 5) nunca conseguiram a capacidade de ficar em pé e de caminhar; um (pa- ciente 4) foi capaz de ficar em pé apenas com suporte; e um (paciente 1) atingiu a capacidade de andar. A diminuição de colágeno Vl estava na faixa de fracos (pacientes 1 e 4), a acentuados (pacientes 2 e 3), até ausência completa (paciente 5). A mutação afetou o gene do COL6A1 nos três casos (pacientes 2, 4 e 5), o gene COL6A3 em um caso (paciente 1) e ficou indefi- nido em um caso (paciente 3).
Foram obtidas biópsias de músculo quadríceps dos cinco paci- entes e de um voluntário saudável subsequente ao consentimento informado do paciente e da aprovação do comitê de ética. A taxa de apoptose foi avali- ada usando-se o método de marcação terminal de extremidades com pe- quenos cortes com dUTP mediada pela desoxinucleotidil transferase (TÚ- NEL). Foram preparadas seções congeladas com sete μιτι de espessura de biópsias de músculo e fixadas em 50% de acetona-50% de metanol. Foi rea- lizado o TUNEL usando-se o kit de detecção de apoptose Apoptag in situ (Chemicon). As amostras foram coradas com peroxidase-diaminobenzidina para revelar os núcleos positivos em relação ao TUNEL e contracoradas com Hoechst 33258 (Sigma) para marcar todos os núcleos. O número de núcleos totais e positivos em relação ao TUNEL foi determinado em campos selecionados aleatoriamente usando um microscópio Zeiss Axioplan (com um aumento de 40 x) equipado com câmera digital. Os dados foram expres- sos como média ± SD. Os dados foram analisados com o teste t de Student não-pareado e os valores com P < 0,01 foram considerados como significati- vos. Os resultados revelaram que a freqüência de núcleos apoptóticos era muito mais alta em todas as amostras quando comparadas ao doador sau- dável, com valores na faixa de desde um aumento aproximado de 10 vezes para os pacientes 1, 2 e 3 até um aumento de mais do que 200 vezes para os pacientes 4 e 5. A maior apoptose correspondia a uma expressão signifi- cativamente menor de colágeno Vl nas biópsias de músculo de todos os pa- cientes, como documentado através da coloração com um anticorpo seletivo contra o colágeno VI.
Foram realizados experimentos para testar experimentalmente a existência de uma ligação causai entre a falta de colágeno Vl e a apoptose. Foram preparadas culturas de mioblasto partindo de biópsias de músculo de dois controles inafetados e dos pacientes 1, 2, 3 e 4 por tratamento enzimá- tico e mecânico e plaqueamento em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bezerro a 20%, penicilina, estrep- tomicina e anfotericina B (Sigma). Para testar para apoptose, as células fo- ram fixadas em 50% de acetona-50% de metanol e processadas para análi- se de TUNEL que usa o Dead End Fluorescence TUNEL System (Promega).
A visualização de todos os núcleos foi realizada por aplicação de corante com Hoechst 33258. Culturas de todos os pacientes apresentaram uma maior incidência de apoptose comparada a doadores saudáveis. O plaque- amento sobre colágeno Vl ou o tratamento com ciclosporina A normalizou totalmente a ocorrência de apoptose nas amostras do paciente. Culturas de célula muscular dos pacientes 2, 3 e 4 esperadamente apresentaram níveis baixos até quase ausentes níveis de colágeno VI, como já tinham sido apre- sentados anteriormente para os pacientes 1 e 5. Demir e outros, 2002. Giusti e outros, 2005.
Para avaliar se os efeitos antiapoptóticos do colágeno Vl e da CsA podiam ser localizados nas mitocôndrias, a função mitocondrial foi es- tudada em culturas de célula muscular viva. Como esperado, a adição de oligomicina a culturas estabelecidas provenientes de doadores saudáveis não provocou despolarização mitocondrial, que foi prontamente provocada pela adição da protonóforo carbonilcianeto-p-trifluorometóxi fenil hidrazona. A adição de oligomicina foi em vez disso seguida por despolarização mito- condrial nas células de todos os pacientes com UCMD. Excepcionalmente, a resposta à oligomicina foi completamente normalizada por tratamento com ciclosporina A ou com quelante intracelular Ca2+ BAPTA-AM ou pelo plaque- amento de células sobre colágeno VI, sugerindo um envolvimento do PTP na patogênese de UCMD. O potencial da membrana mitocondrial foi avaliado baseado no acúmulo de tetrametilrodamina metil éster (TMRM). É observado que se espera que a oligomicina cause hiperpolarização em células saudá- veis, que respiram em que o potencial da membrana mitocondrial é mantido por bombeamento de próton pela cadeia respiratória e é usado o gradiente eletroquímico de próton para dirigir a síntese de ATP. A despolarização mi- tocondrial induzida por oligomicina em culturas de mioblasto de UCMD foi, portanto, uma resposta anômala, que indicou que o potencial da membrana não era mantido por respiração, mas sim pela ATP sintase mitocondrial que trabalha "de modo inverso" para bombear prótons da matriz para o espaço intermembrana, consumindo desse modo ATP glicolítica.
As culturas de célula muscular estabelecidas de doadores sau- dáveis e dos pacientes 1, 2 e 3 foram estudadas por microscopia eletrônica. Nas amostras de UCMD, a proporção de área/perímetro mitocondrial foi au- mentada significativamente para atingir valores 62,5, 75 e 50% mais altos do que aqueles de doadores saudáveis para os pacientes 1, 2 e 3, respectiva- mente (p < 0,05). Esta descoberta indica que em células musculares da UCMD, as mitocôndrias estavam significativamente menos alongadas do que em amostras normais. Também foi observado que 4 a 8% de mitocôn- drias de pacientes tinham um maior valor do eixo curto (> 400 nm) compara- do com o controle (< 300 nm). Consideradas juntas, estas descobertas suge- riram a presença de uma fração de mitocôndrias com um tamanho maior nas células da UCMD. Uma pequena percentagem de células provenientes de pacientes com UCMD (entre 4 e 5%, comparadas a 1% para células prove- nientes de doadores saudáveis) também apresentaram mitocôndrias incha- das, com matriz hipodensa e ausência de cristais. Extraordinariamente, quando as células da UCMD foram plaqueadas sobre colágeno VI, a propor- ção de área/perímetro e os valores do eixo curto se tornaram similares aos dos doadores saudáveis e plaqueamento sobre colágeno Vl ou tratamento com ciclosporina A diminuíram o número de células com mitocôndrias incha- das até os valores observados em culturas provenientes de doadores sau- dáveis. O tratamento de culturas com a oligomicina inibidora da F1FO ATP sintase aumentou a percentagem de células com mitocôndrias inchadas até 4% em controle e acima de 40% em pacientes com UCMD, uma desco- berta que sugere a presença de uma disfunção mitocondrial latente que po- dia ser amplificada seletivamente pela oligomicina, como apresentado ante- riormente para o modelo de camundongo para deficiência de colágeno VI. O efeito da oligomicina podia ser evitado por tratamento com ciclosporina A, a percentagem de células que contém mitocôndrias inchadas sendo restaura- da até valores similares aos basais em todas as culturas de células. O deri- vado de ciclosporina A não-imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA era tão eficaz quanto a ciclosporina A para prevenir a despolarização mitocon- drial dependente de oligomicina em células provenientes de pacientes com UCMD e restaurava a ocorrência de apoptose até o nível apresentado por células provenientes de doadores saudáveis. Os experimentos que resulta- ram destas descobertas estão discutidos no Exemplo 1.
É notável que o defeito mitocondrial possa ser revelado em cul- turas primárias provenientes de pacientes com sinais clínicos de UCMD sem levar em conta se o defeito genético primário está no gene COL6A1 ou COL6A3 e que a anormalidade mitocondrial latente não serve de fator de previsão da gravidade da síndrome clínica. Estas descobertas sugerem que as mitocôndrias estão envolvidas na patogênese de todos os casos de UCMD e que os fatores genéticos e/ou ambientais adicionais representam um papel na suscetibilidade individual à morte e à regeneração das fibras musculares. Todas as anormalidades mitocondriais e a apoptose resultante podiam ser curadas por plaqueamento de células da UCMD sobre colágeno Vl ou exposição das mesmas a ciclosporina A. Estas descobertas demons- tram que, em princípio, a cadeia patogênica de eventos a jusante da lesão genética pode ser interrompida por fármacos apropriados, pelo menos nos estágios anteriores. É bem sabido que a ciclosporina A causa imunossu- pressão, o que podia ser um inconveniente principal no tratamento a longo prazo dos pacientes. Uma observação fundamental feita pelos presentes inventores é que o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D- MeAla]3-[EtVaIJ4-CsA é tão eficaz quanto a ciclosporina A na redução da dis- função mitocondrial e nas taxas apoptóticas em células da UCMD. Esta des- coberta demonstra que a atividade imunossupressora da ciclosporina não está envolvida em seus efeitos citoprotetores e é responsável por um novo tratamento farmacológico de pacientes afetados por distúrbios do colágeno VI.
Baseado nestas descobertas, a presente invenção refere-se ao uso de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, mais preferivelmente de um derivado de ciclosporina A não-imunossupres- sora de fórmula Il e mais preferivelmente ainda de um derivado de ciclospo- rina A não-imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III, para a redução da disfunção mitocondrial e das taxas apoptóticas em células de pacientes que sofrem de UCMD.
Fórmula I
<formula>formula see original document page 14</formula>
W é MeBmt, di-hidro-MeBmt, 8'-hidróxi-MeBmt ou O-acetil- MeBmt,
X é aAbu, Vai, Thr, Nva ou O-metil treonina (MeOThr)1
R é Pro, Sar, (D)-MeSer, (D)-MeAIa ou (D)-MeSer(OatetiIa),
Y é MeLeu, tioMeLeu, γ-hidróxi-MeLeu, Melle, MeVaI, MeThr,
MeAIa, Mealle ou MeaThr; N-etilVal (EtVaI), N-etillle, N-etilThr, N-etilPhe, N- etilTyr ou N-etilThr(Oacetila), em que Y não pode ser MeLeu quando R for Sar,
Z é Vai, Leu, MeVaI ou MeLeu,
Q é MeLeu, γ-hidróxi-MeLeu, MeAIa ou Pro,
Ti é (D)AIa ou Lys,
T2 é MeLeu ou γ-hidróxi-MeLeu e
T3 é MeLeu ou MeAIa. Fórmula Il
<formula>formula see original document page 15</formula>
em que
W é MeBmt1 di-hidro-MeBmt, ou 8'-hidróxi-MeBmt, X é aAbu, Val1 Thr, Nva ou O-metil treonina (MeOThr)1 R' é Sar1 (D)-MeSer1 (D)-MeAIa1 ou (D)-MeSer(OacetiIa)1
Y' é MeLeu, γ-hidróxi-MeLeu, Melle, MeVaI1 MeThr1 MeAIa1 Me- alle ou MeaThr1 N-etilVal (EtVaI)1 N-etillle, N-etilThr, N-etilPhe, N-etilTyr ou N-etilThr(Oacetila), em que Y não pode ser MeLeu quando R for Sar1
Z é Val1 Leu, MeVaI ou MeLeu1 Q' é MeLeu1 γ-hidróxi-MeLeu, ou MeAIa.
Fórmula Ill
<formula>formula see original document page 15</formula>
em que
MeBmt é N-metil-(4R)-4-but-2E-en-1-il-4-metil-(L) treonina, aAbu é ácido L-a-aminobutírico, D-MeAIa é N-metil-D-alinina, EtVaI é N-etil-L- valina, Val é L-valina, MeLeu é N-metil-L-leucina, Ala é L-alanina, (D)AIa é D-alanina e MeVaI é N-metil-L-valina.
Pode ser usado um derivado de ciclosporina A não-imunossu- pressora para inibir apoptose in vitro em células derivadas de músculo pre- paradas partindo de biópsias retiradas de pacientes com UCMD. Uma des- coberta de inibição de apoptose irá servir como um indicador que, tratando dos pacientes com o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora será eficaz na redução da gravidade da doença.
A invenção também refere-se ao uso de um derivado de ciclos- porina A não-imunossupressora de fórmula I, mais preferivelmente de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula II e mais prefe- rivelmente ainda de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III, para o tratamento de pacientes que sofrem de UCMD. O composto ativo, isto é, o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora, pode ser administrado por qualquer via convencio- nal. Ele pode ser administrado de forma parenteral, por exemplo, na forma de soluções ou de suspensões injetáveis ou na forma de formulações injetá- veis com depósito. De preferência, ele será administrado oralmente na forma de soluções ou de suspensões para beber, de comprimidos ou de cápsulas. As composições farmacêuticas para administração oral que compreendem derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA são descritas nos Exemplos. Como é demonstrado pelos exemplos, tais composições farmacêuticas tipicamente compreendem o derivado de ciclos- porina A não-imunossupressora preferido e um ou mais substâncias veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos farmacêuticos aceitáveis são descritos, por exemplo, em Remington1S Pharmaceutical Sciences, 17a. ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990), que é um texto padrão de referência neste campo. Às vezes estas composições estão concentradas e precisam ser combinadas com um diluente apropriado, por exemplo, água, antes da administração. As composições farmacêuticas para administração parenteral tipicamente também incluem um ou mais excipientes. Os excipi- entes opcionais incluem um agente isotônico, um tampão ou outro agente de controle do pH e um conservante. Estes excipientes podem ser adicionados para manutenção da composição e para atingir faixas preferidas de pH (em torno de 6,5-7,5) e osmolaridade (em torno de 300 mosm/L).
Exemplos adicionais de formulações de ciclosporina para admi- nistração oral podem ser encontrados nas Patentes U.S. N°s 5.525.590 e 5.639.724 e no Pedido de Patente U.S. 2003/0104992. Pela via oral, a dosa- gem indicada de derivado de ciclosporina A não-imunossupressora para a administração duas a três vezes por semana pode ser de desde aproxima- damente 1 mg/kg até aproximadamente 100 mg/kg, de preferência de desde aproximadamente 1 mg/kg até aproximadamente 20 mg/kg. Pela via intrave- nosa, a dosagem correspondente indicada pode ser de desde aproximada- mente 1 mg/kg até aproximadamente 50 mg/kg, de preferência de desde aproximadamente 1 mg/kg até aproximadamente 25 mg/kg. Entende-se que uma quantidade eficaz de derivado de ciclosporina A não-imunossupressora seja uma quantidade que quando administrada repetidamente durante um regime terapêutico a um paciente com UCMD resulta em uma resposta clíni- ca objetiva tal como uma melhoria, uma estabilização ou um retardamento na progressão da doença. Tal resposta clínica pode ser avaliada, por exem- plo, por testagem de Resistência Isométrica Quantitativa ("Quantitative Iso- metric Strength" (QIS)). A QIS permite a avaliação da resistência muscular de uma maneira objetiva com o auxílio de um equipamento de transdução de pressão e de gravação. Alternativamente, a normalização das taxas de a- poptose pode ser avaliada por biópsias de músculo por métodos bioquímicos e imuno-histoquímicos conhecidos da pessoa versada na técnica. Finalmen- te, pode ser utilizada uma eletromiografia que apresenta um padrão muscu- lar em vez de neurogênico, que pode ser avaliado quantitativamente.
Foram realizados estudos clínicos na fase inicial I para avaliar a segurança de doses orais de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA e para determinar o perfil farmacocinético e o perfil de segurança da substância do fármaco. Es- tudos demonstraram que as doses de 50 a 1600 mg em uma microemulsão em água eram bem toleradas. Foram observados efeitos colaterais fracos e de vida curta inclusive náusea, vômitos, dor abdominal e cefaleias brandas. Estes efeitos colaterais não estavam relacionados à dose.
Numerosos fatores serão levados em consideração por um clíni- co quando se determinam doses experimentais para testagem da eficiência de uma composição farmacêutica da invenção que compreende um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, Il ou III. Os principais entre estes são a toxicidade e a meia-vida do derivado de ciclosporina A não-imunossupressora. Fatores adicionais incluem o tamanho do paciente, a idade do paciente, o estado de saúde geral do paciente (inclusive ventilação mecânica, o estado clínico da doença, a gravidade dos sintomas), a presen- ça de outros fármacos no paciente e similares. Um período de tratamento irá requerer administração repetida da composição farmacêutica da invenção. Tipicamente, será administrado uma dose de fármaco adequado em torno de uma vez ao dia. Por causa da natureza genética da doença, o tratamento pode precisar ser contínuo durante um extenso período de tempo, possivel- mente pelo resto da vida do paciente.
Nenhum tratamento farmacológico eficaz de UCMD é conhecido atualmente. Os pacientes são mantidos por vacinação contra influenza e infecção pneumocócica e qualquer infecção é tratada agressivamente com antibióticos. Portanto, a composição farmacêutica da presente invenção po- de compreender um ou mais outros ingredientes ativos além de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora tais como, por exemplo, um ou mais antibióticos. O derivado de ciclosporina A e um tal outro ingrediente ativo podem ser administrados juntos como parte da mesma composição farmacêutica ou podem ser administrados separadamente como parte de um regime com uma dose apropriada projetado para obter os benefícios de to- dos os ingredientes ativos. O regime de dose apropriada, a quantidade de cada dose administrada e os intervalos específicos entre as doses de cada agente ativo irá depender da combinação específica de agentes ativos em- pregados, do estado do paciente que está sendo tratado e de outros fatores discutidos na seção anterior. Tais ingredientes ativos adicionais serão ge- ralmente administrados em quantidades iguais àquelas para as quais sabe- se que são eficazes como agentes terapêuticos únicos. As dosagens apro- vadas de FDA para tais agentes ativos que receberam a aprovação da FDA para a administração a seres humanos são publicamente disponíveis.
A presente invenção também refere-se ao uso de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, mais preferivelmente de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D-MeAIa]3- [EtVaIJ4-CsA de fórmula Il e mais preferivelmente ainda de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula III, para a redução da dis- função mitocondrial e das taxas apoptóticas em células de pacientes que sofrem de BM. Além disso, a invenção também refere-se a um método para o tratamento de BM em um paciente que compreende administrar ao pacien- te uma quantidade eficaz de um derivado de ciclosporina A não-imunossu- pressora de fórmula I, mais preferivelmente de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula Il e mais preferivelmente ainda de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III. Além disso, a invenção também refere-se ao uso de um deri- vado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, Il ou Ill para a fabricação de um medicamento que se pretende seja usado para o tratamen- to de BM. Finalmente, a invenção refere-se a composições farmacêuticas para o tratamento de BM que compreendem uma quantidade eficaz de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I, Il ou III, de um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, de um excipiente e de um diluente.
Todas as patentes, os pedidos de patente e publicações aqui citadas deverão ser considerados como tenso sido incorporados como refe- rência em sua totalidade.
A invenção é ainda elaborada pelos seguintes exemplos. Os e- xemplos são fornecidos para fins de ilustração para uma pessoa versada na técnica e não se pretende limitar o escopo da invenção como descrito nas reivindicações. Desse modo, a invenção não devia ser considerada como limitada aos exemplos fornecidos, porém devia ser considerada como a- brangendo qualquer uma e todas as variações que se tornam evidentes co- mo um resultado do ensinamento fornecido neste caso.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Efeitos da ciclosporina A e do derivado da ciclosporina A não- imunossupressora [D-MeAla13-rEtVall4-CsA sobre a fluorescência TMRM mi- tocondrial (medida do potencial da membrana mitocondrial) e incidência de apoptose em culturas de mioblastos provenientes de pacientes com UCMD.
Os painéis A e B da Figura 1 apresentam potenciais de mem- brana mitocondrial em mioblastos de pacientes 1 (A) e 4 (B) a partir de UCMD como uma função do tempo. O potencial de membrana mitocondrial foi medido baseado no acúmulo de tetrametilrodamina metil éster (TMRM).
Os mioblastos foram semeados sobre lamínulas redondas de vidro de 24 mm e cultivados por dois dias em DMEM suplementados com FCS a 20%. A extensão da célula e, consequentemente, o carregamento mitocondrial com sondas potenciométricas é afetado pela atividade da bomba de resistência multifármaco de membrana de plasma que é inibida por ciclosporina A. O tratamento com ciclosporinas pode portanto causar uma maior fluorescência mitocondrial que pode ser interpretada erroneamente como um aumento do potencial de membrana mitocondrial. Para evitar um tal instrumento e nor- malizar as condições de carregamento, foram realizados experimentos na presença de ciclosporina H a 1,6 μΜ, que inibe a bomba de resistência multi- fármaco, porém não afeta PTP. Para medidas do potencial de membrana mitocondrial, as células foram enxaguadas uma vez e incubadas em DMEM livre de soro suplementado com ciclosporina H a 1,6 μΜ e carregada com TMRM a 10 nM durante 30 minutos. No final de cada experimento, as mito- côndrias foram completamente despolarizadas pela adição de protonóforo carbonilcianeto-p-trifluorometoxifenil hidrazona (FCCP) a 4 μΜ. Foram ad- quiridas imagens de fluorescência celular com um microscópio invertido Olympus 1X71/1X51 equipado com uma fonte de luz de xenônio (75 W) para iluminação com epifluorescência e uma câmera digital de 12-bit resfriada com CCD (Micromax, Princeton Instruments). Para detecção da fluorescên- cia, foram usados excitação em faixa de passagem de 568 +/- 25 nm e ajus- tes de filtro de emissão "longpass" de 585 nm. As imagens foram coletadas com um tempo de exposição de 100 msegundos usando-se uma objetiva de imersão em óleo a 40 X, 1,3 NA (Nikon). Os dados foram adquiridos e anali- sados usando-se programa de computador Cell R (Olympus). Aglomerados de diversas mitocôndrias (10-30) foram identificados como regiões de inte- resse e os campos que não contêm células foram considerados como o fun- do. Foram adquiridas imagens digitais seqüenciais a cada 2 minutos e a in- tensidade média da fluorescência foi gravada e armazenada para análise subsequente. Nos experimentos apresentados nos painéis A e B, as células sobre vidro foram carregadas com TMRM como discutido e quando indica- das por setas, foram adicionados a 6 μΜ de oligomicina (oligo) e a 4 μΜ de FCCP na ausência de outros tratamentos (símbolos abertos) ou depois do tratamento durante 30 minutos com ciclosporina A a 1,6 μΜ (quadrados fe- chados) ou [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA a 1,6 μΜ (triângulos fechados). Painel C da Figura 1: Mioblastos dos pacientes 1 (P1) e 4 (P4) foram cultivados sobre pratos de plástico e armazenados para a presença de núcleos positivos em relação ao TUNEL seja na ausência de outros tratamentos (basal) ou depois de incubação durante 2 horas com ciclosporina Aa 1,6 μΜ ou [D-MeAIa]3- [EtVaIJ4-CsA a 1,6 μΜ. Os dados são a média de pelo menos quatro experi- mentos independentes + S.D. (*), P < 0,01 comparado à condição basal. A apoptose foi avaliada como descrito antes.
Os resultados apresentados na Figura 1 demonstram que o deri- vado de ciclosporina A não-imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA era tão eficaz quanto a ciclosporina A na prevenção da despolarização mitocon- drial dependente da oligomicina em células provenientes de pacientes com UCMD e restauração da ocorrência de apoptose até o nível apresentado pelas células provenientes de doadores saudáveis. Exemplo 2: Síntese de rD-MeAlalVEtValf-CsA
(Traduzido de uma tese de Ph.D. por Jean François Guichou intitulado "De nouveaux analogues de Cyclosporin A comme agent anti-VIH- 1", Faculdade de Ciências, Universidade de Lausanne, CH-1015 Lausanne, Suíça (2001)).
Exemplo A: Síntese de H-MeLeu-VaI-MeLeu-AIa-D-AIa-MeLeu-MeLeu- MeVaI-MeBmt(Oac)-Abu-Sar-OMe:
4-Dimetilaminopiridina (DMAP) (41,5 mmoles; 5,8 g) foi adicio- nada a uma solução de ciclosporina A (CsA) (8,3 mmoles; 10 g) em 100 mL de anidrido acético. A solução foi agitada durante 18 horas à temperatura ambiente. A mistura da reação foi então diluída com 600 mL de acetato de etila e lavada duas vezes com água e quatro vezes com uma solução aquo- sa saturada de bicarbonato de sódio. A fase orgânica foi seca sobre Na2S04 anidro, filtrada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo amarelo obtido foi cromatografado sobre sílica-gel (eluente: 98:2 diclorome- tano/metanol) e recristalizado em éter. Foram recuperados 9,5 g de MeBmt(OAc)-CsA, um pó branco, representando um rendimento de 92%.
Tetrafluoroborato de trimetiloxônio (22,5 mmoles; 3,3 g) foi adi- cionado a uma solução de MeBmt(OAc)-Cs (7,5 mmoles; 9,4 g) em 60 mL de diclorometano. Depois de 16 horas à temperatura ambiente, foram adi- cionados 35 mL de metanolato de sódio 0,26 M em metanol. Depois de 1 hora, foram adicionados 35 mL de metanol e 35 mL de ácido sulfúrico 2 N e a mistura da reação foi agitada durante mais 15 minutos, neutralizada até pH 6,0 com KHCO3 saturado (28 ml) e extraída duas vezes com acetato de etila.
A fase orgânica foi lavada 2 vezes com NaCI saturado, seca sobre Na2SO4 anidro e filtrada. Subseqüentemente, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi cromatografado sobre sílica-gel (eluente: 5:1 acetato de etila/metanol). Foram obtidos 7,3 g de H-MeLeu-VaI-MeLeu-AIa-D-Ala- MeLeu-MeLeu-MeVaI-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (rendimento: 76%).
HPLC tr = 268,23 mn (98%)
ES/MS: m/z: 1277,5 [M+H+], 639,2 [M+2H+]
Exemplo B: Síntese de H-Val-MeLeu-AIa-D-AIa-MeLeu-MeLeu-MeVaI- MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe:
DMAP (2,3 mmoles; 334 mg) e isotiocianato de fenila (6,9 mmo- les; 0,75 ml) foram adicionados a uma solução de H-MeLeu-VaI-MeLeu-AIa- D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVaI-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (4,6 mmoles; 7 g) em 48 mL de tetra-hidrofurano. Depois de 2 horas, o solvente foi evaporado e o produto bruto foi cromatografado sobre sílica-gel (eluentes: 9:1 terc-butil metil éter (MTBE)/acetato de etila (1); 9:1 MTBE/metanol (2)). Foram obtidos 5,8 g de Ph-NH-C(S)- MeLeu-Val-MeLeu-AIa-D-AIa-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (90% de rendimento).
Foram adicionados 13,8 mL de ácido trifluoroacético a uma solu- ção deste último composto (4 mmoles; 5,6 g) em 290 mL de diclorometano. Depois de 1 hora de reação, a mistura foi neutralizada utilizando-se KHCO3 e diluída com 500 mL de diclorometano. A fase orgânica foi lavada 2 vezes com NaCI saturado, seca sobre Na2S04 anidro e filtrada. Subseqüentemen- te, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi cromatogra- fado sobre sílica-gel (eluentes: 9:1 MTBE/acetato de etila (1); 3:1 MT- BE/metanol (2)). Foram obtidos 2,8 g de H-Val-MeLeu-AIa-D-Ala-MeLeu- MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (61% de rendimento).
HPLC tr = 25,80 mn (99%) ES/MS: m/z: 1050,5 [M+H+], 547,7 [M+2H+] Exemplo C: Síntese de Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu- MeLeu-MeVaI-MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CHrCHp-OH:
Foi adicionado hexafluorofosfato de fluoro-N,N,N'-tetrametilfor- mamidínio (TFFH) (0,96 mmol; 0,25 g), sob uma atmosfera inerte, a uma solução de H-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVaI-MeBmt(OAc)-Abu- Sar-OMe (0,87 mmol; 1,00 g), DIPEA (2,78 mmoles; 0,48 ml) e Boc-D- MeAIa-EtVaI-OH (0,96 mmol; 0,32 g) em 15 mL de diclorometano. Depois de 15 minutos, o diclorometano foi evaporado e o resíduo foi retirado com ace- tato de etila. A fase orgânica foi lavada sucessivamente com uma solução saturada de NaHCO3, uma solução de ácido cítrico a 10% e uma solução saturada de NaCI e foi então seca sobre Na2S04 anidro e concentrada. Cromatografia sobre sílica-gel (em 98:2 acetato de etila/metanol) forneceu 1,14 g (90%) de Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu- MeVaI-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe.
Este último produto (0,64 mmol; 0.93 g) foi retirado com 45 mL de metanol anidro e boro-hidreto de sódio (25,5 mmoles; 0,96 g) foi adicio- nado em pequenas porções a intervalos de 15 minutos durante um período de 3 horas e 30 minutos. A 4 horas, a mistura da reação foi resfriada até 0°C, hidrolisada por adição de ácido cítrico a 10% e concentrada. O resíduo foi retirado com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com uma solução de ácido cítrico a 10% e uma solução saturada de NaCI e foi então seca so- bre Na2S04 anidro e concentrada. Depois de cromatografia sobre sílica-gel (em 95:5 de acetato de etila/metanol) foi obtido 0,63 g (81%) de Boc-D- MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu- NMe-CH2-CH2-OH.
ES/MS: m/z: 1434,9 [M+H+], 717,9 [M+2H+] Exemplo D: Síntese de H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu- MeLeu-MeVaI-MeBmt-Abu-OH:
Ácido metanossulfônico (3,18 mmoles; 2,060 ml) foi adicionado a uma solução de Boc-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu- MeVaI-MeBmt(OAc)-Abu-NMe-CH2-CH2-OH (0,425 mmol; 610 mg) em 42,5 mL de metanol e a mistura foi aquecida até e mantida a 50°C. O progresso da reação foi monitorado por HPLC e espectrometria de massa. Depois de 80 horas, a mistura foi resfriada até 0°C e hidrolisada por adição de NaHCC>3 a 1 M. Foi eliminado o metanol e o resíduo foi retirado com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com NaHCOa a 1 M e então com uma solução saturada de NaCI, seca sobre Na2SO4 anidro e concentrada. O produto (557 mg), H-D-MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal- MeBmt(0Ac)-Abu-0-CH2-CH2-NHMe, foi usado para a próxima etapa sem purificação.
O produto (0,42 mmol; 557 mg) foi dissolvido em 20 mL de me- tanol e combinado, sob uma atmosfera inerte, com uma solução de metano- ato de sódio (1,26 mmol) em 1,26 mL de metanol. Depois de 18 horas à temperatura ambiente, a mistura da reação foi resfriada até 0°C e hidróxido de sódio (4,2 mmoles; 168 mg) em 5 mL de água foi adicionado gota a gota. Depois de 21 horas à temperatura ambiente, a mistura da reação foi de novo resfriada até 0°C e neutralizada com KHSO4 a 1 Μ. O metanol foi eliminado e o resíduo foi dissolvido em acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com uma solução semissaturada de NaCI, seca sobre Na2SO4 anidro e concen- trada. O produto (335 mg; 64%), H-D-MeAla-EtVaI-VaI-MeLeu-AIa-D-AIa- MeLeu-MeLeu-MeVaI-MeBmt-Abu-OH, foi usado na próxima etapa sem puri- ficação.
HPLC tr = 26,27 mn (86%)
ES/MS: m/z: 1235,5 [M+H+], 618,2 [M+2H+]
Exemplo E: Síntese de rD-MeAlal3-ÍEtVan4-CsA:
Sob uma atmosfera inerte, foi adicionada uma solução de H-D- MeAla-EtVal-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-OH (0,162 mmol; 200 mg) e foi adicionada sym.colidina(1,78 mmol; 0,24 ml) em 50 mL de diclorometano gota a gota a uma solução de hexafluoro-fosfato de (7-azabenzotriazol-1-ilóxi)tripirrolidinofosfônio (PyAOP, 0,486 mmol; 254 mg) em 3,2 litros de diclorometano. 72 horas mais tarde, a mistura da reação foi hidrolisada pela adição de uma solução de Na2COa a 10%. O diclorometano foi evaporado e o resíduo retirado em acetato de etila. A fase orgânica foi lavada sucessivamente com uma solução de HCI a 0,1 Ne com uma solu- ção saturada de NaCI, seca sobre Na2SC^ anidro e concentrada. O produto bruto foi purificado sobre sílica-gel, fornecendo 110 mg (59%) de [D-MeAIa]3- [EtVal]4-CsA
HPLCtr = 30,54 mn (100%)
ES/MS: m/z: 1217,6 [M+H+], 609,3 [M+2H+]
Exemplo 3: Formulações orais de [D-MeAla13-[EtVal14-CsA
As quantidades estão expressas como % em peso/peso.
Exemplo A: <table>table see original document page 25</column></row><table>
Exemplo B: <table>table see original document page 25</column></row><table>
Exemplo C: <table>table see original document page 25</column></row><table>
Exemplo D: <table>table see original document page 25</column></row><table> Exemplo Ε:
<table>table see original document page 26</column></row><table>
Para os componentes individuais das formulações A-D e para os métodos de preparação vide Pedido de Patente Britânica N0 2.222.770. Exemplo 4: Eficiência terapêutica de fD-MeAla13-[EtVan4-CsA em camun- dongos nocauteados em relação ao colágeno Vl
A um grupo de quatro camundongos nocauteados em relação ao colágeno Vl (Col6a15-6 meses de idade; equilibrados em relação ao gê- nero) foi administrada i.p. duas vezes ao dia durante 5 dias uma dose de 5 mg/kg de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA. Um grupo de controle de quatro animais foi sujeito a um regime similar de uma formulação de placebo. Após o sacri- fício, foi coletada uma amostra de sangue de cada animal, então foram iso- lados o fígado e os músculos das patas traseiras e processados para prepa- rar mitocôndrias para dosagens de capacidade de retenção de cálcio (CRC). Ao mesmo tempo, o diafragma e os músculos flexores digitorum brevis (FDB) foram isolados e processados para histopatologia e avaliação in situ da função mitocondrial (potencial da transmembrana mitocondrial). Todos os experimentos in vivo foram aprovados pelas agências apropriadas e foram realizados de acordo com as diretrizes da entidade.
Métodos
Preparação de mitocôndrias e ensaios de CRC
Foram preparadas mitocôndrias do fígado e dos homogenados musculares por centrifugação diferencial como descrito em Fontaine e ou- tros, 1998. J. Biol. Chem. 273: 25734-25740 e em Fontaine e Bernardi. 1999. J. Bioenerg. Biomembr. 31: 335-345. A CRC de preparações mitocondriais foi avaliada fluorimetricamente na presença de indicador de Ca2+ Calcium Green-5N (Sondas Moleculares; excitação: 505 nm; emissão: 535 nm) que usa um espectrofluorímetro PerkinEImer LS50B equipado com agitação magnética e controle termostático. O meio de incubação continha sacarose a 0,25 M, Tris-MOPS a 10 mM, glutamato a 5 mM, malato a 2,5 mM, Pi-Tris a 1 (fígado) ou 10 (músculo) mM, EGTA-Tris a 20 μΜ e Calcium Green-5N a 1 μΜ (pH 7,4).
Isolamento e cultura de miofibras esqueléticas e ensaio TMRM
Fibras FDB foram isoladas como descrito em Irwin e outros, 2003. Nat. Genet. 35: 267-271. Miofibras intactas foram aplicadas sobre Ia- mínulas de vidro revestidas com Iaminina (3 pg/cm2) e cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco que contém 10% de soro fetal de bezerro.
Para o experimento, fibras de FDB foram colocadas em 1 ml_ de tampão de Tyrode e carregadas com TMRM a 20 nM (Sondas Moleculares) como des- crito em Irwin e outros. Imagens de fluorescência mitocondrial de TMRM fo- ram conseguidas usando-se um microscópio invertido Olympus 1X71/1X51.
Ensaio de TUNEL
Depois da fixação em paraformaldeído a 4% e incrustação em parafina, foram preparadas seções de 7 pm de diafragma muscular. TUNEL foi realizado usando-se o kit de detecção de apoptose ApopTag in situ (In- tergen). As amostras foram coradas com peroxidase/diaminobenzidina para detectar núcleos positivos em relação ao TUNEL e contracoradas com Hoe- chst 33258 (Sigma) para marcar todos os núcleos como descrito em Irwin e outros. Os números de total e de núcleos positivos em relação ao TUNEL em fibras selecionadas aleatoriamente foram determinados usando-se um microscópio Zeiss Axioplan equipado com uma câmera Leica DC 500.
Resultados
Efeito de [D-MeAIaf-[EtValf-CsA sobre o poro de transição de permeabili- dade (PTP) ex vivo
Mitocôndrias energizadas de fígado e de membro posterior iso- lados de camundongos Cole6a1 após o tratamento com [D-MeAla]3-[EtVal]4- CsA ou com uma formulação de placebo foram incubadas na presença de Calcium Green-5N que monitora o Ca2+ extra mitocondrial. Foi então adminis- trada uma série de pulsos de Ca2+, cada pulso sendo considerado até que fosse atingida uma concentração limite que causasse a abertura do PTP. Este protocolo permitiu uma análise detalhada de efeitos tanto de sensibili- zadores como de dessensibilizadores de PTP. (Fontaine e outros, 1998.) Os resultados apresentaram uma dessensibilização significativa do PTP a Ca2+ e Pi tanto em mitocôndrias do fígado como de músculos de camundongos tratados com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, como apresentado por um maior limi- te de Ca2+ para a abertura do PTP (Figura 2). Este efeito foi particularmente impressionante para mitocôndrias musculares, a CRC chegando próximo ao nível máximo que pode ser atingido por adição direta de [D-MeAla]3-[EtVal]4- CsA ao meio de incubação. Vide painel Bll1 traço d versus traço d'. É apre- sentado na Figura 3 um resumo dos resultados obtidos pelas análises de mitocôndrias provenientes de quatro camundongos tratados com [D-MeAIa]3- [EtVal]4-CsA (camundongos N0 24-27) e de quatro camundongos tratados com placebo (camundongos N0 28-31).
Efeito de ΓΡ-MeAlaf-[EtValf-CsA sobre o potencial da transmembrana mito- condrial em fibras de FDB
O potencial da transmembrana mitocondrial foi avaliado por vari- ações de fluorescência mitocondrial de tetrametilrodamina metiléster (T- MRM), uma sonda de fluorescência que se acumula em mitocôndrias polari- zadas e é liberada quando diminui o potencial da transmembrana. Foi de- monstrado anteriormente que uma disfunção mitocondrial em fibras muscu- lares de Col6a1'A é desmascarada por oligomicina, que é um inibidor da F1FO-ATP sintase mitocondrial. A adição de oligomicina a fibras isoladas de camundongos Col6aTA tratados com placebo resultou na diminuição espe- rada em fluorescência TMRM na maioria das fibras (Figura 4A). O tratamen- to in vivo com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA diminuiu significativamente o número de fibras em que podia ser observada a despolarização mitocondrial (Figura 4B). A Tabela 1 resume os resultados para cada camundongo individual tra- tado com placebo ou com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, respectivamente. Tabela 1: Fibras despolarizantes após a adição de oligomicina
<table>table see original document page 29</column></row><table>
Efeito de [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA sobre apoptose do diafragma
O diafragma de cada um dos camundongos tratados com [D- MeAla]3-[EtVal]4-CsA- (N° 24-27) ou com placebo Col6arA (N° 28-31) foi seccionado. Foram examinadas vinte a trinta seções por animal por ensaio de TÚNEL. Fibras de diafragma provenientes de camundongos tratados com [D-MeAla]3-[EtVal]4 -CsA apresentaram uma diminuição drástica de núcleos apoptóticos comparados aos tratados com placebo (Figura 5). O tratamento in vivo com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA foi tão eficaz quanto aquele com CsA.
Avaliação ultraestrutural
Amostras de músculos do diafragma de camundongos tratados com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA- (N° 24-27) ou com placebo camundongos Col6a1-/- (N° 28-31) foram cuidadosamente esticados sobre um suporte de cera dental para evitar a contração durante a fixação. Para a fixação, as a- mostras foram incubadas em tampão de fosfato a 0,1 M (pH 7,4) que contém 2,5% de glutaraldeído durante 3 horas a 4°C, lavadas durante toda a noite em tampão de fosfato a 0,15 M, pós fixado em tetróxido de ósmio a 1% em veronal, desidratado e incrustado em resina epóxi Epon 812. Uma seção ultra fina foi corada com acetato de uranila e citrato de chumbo e observada em um microscópio eletrônico de transmissão Philips EM 400 que opera a 100 quilo volts. Para análise estatística, foram estudas 300 fibras musculares provenientes de três blocos diferentes de cada amostra (Figura 6). Um nú- mero significativamente menor de fibras com mitocôndrias alteradas que a- presenta uma aparência inchada ou que exibe inclusões eletrodensas foi contado em camundongos tratados com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA (N0 24-27) quando comparados aos camundongos de controle (N0 28-31).
Foram realizados experimentos análogos em camundongos Col6a1~tratados p.o. (por via oral) com uma formulação que compreende [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA ou com uma formulação de placebo. Foram obser- vados aumentos evidentes em CRC em mitocôndrias de músculos proveni- entes de animais tratados com [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA, indicando a des- sensibilização do PTP pela ciclosporina. Além disso, os ensaios de TUNEL em seções de diafragma indicaram que o tratamento in vivo com [D-MeAIa]3- [EtVal]4-CsA resultou em uma incidência de apoptose drasticamente reduzida.
Exemplo 5: Experimento clínico preliminar de [D-MeAIaI3-FEtVan4-CsA em pacientes com UCMD e com BM
Cinco pacientes foram inscritos, dos quais quatro sofriam de UCMD e um de BM. Os pacientes apresentavam mutação em seus genes COL6A1, COL6A2 ou COL6A3, respectivamente. O experimento foi projeta- do para testar se o tratamento com CsA era eficaz para reduzir a disfunção mitocondrial como avaliada pela capacidade de a oligomicina causar despo- larização mitocondrial em fibras musculares. A despolarização foi detectada como uma variação na fluorescência de TMRM. Os pacientes foram tratados com uma dose oral diária de 5 mg/kg CsA durante um período de trinta dias. Foram retiradas imediatamente biópsias de músculo antes e depois do perí- odo de tratamento e foram processadas para ensaio TMRM. A média dos resultados de cinco pacientes revelou que a oligomicina induziu 90% de cé- lulas musculares a se despolarizarem antes do tratamento, porém apenas 37% subsequente ao tratamento. Desse modo, o tratamento a curto prazo com CsA foi capaz de reduzir substancialmente a disfunção mitocondrial como dosada por despolarização induzida por oligomicina.
Claims (13)
1. Uso de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I para a redução da disfunção mitocondrial e das taxas apoptóti- cas em células de pacientes que sofrem de distrofia muscular congênita de Ullrich ou de miopatia de Bethlem.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora é um derivado de ciclosporina de fór- mula II.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora é a ciclosporina não-imunossupres- sora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III.
4. Uso de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I para a fabricação de um medicamento que se pretende usar para o tratamento de distrofia muscular congênita de Ullrich ou de miopatia de Bethlem.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, em que o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora é um derivado de ciclosporina de fór- mula II.
6. Uso de acordo com a reivindicação 4, em que o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora é a ciclosporina não-imunossupres- sora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III.
7. Método para o tratamento de distrofia muscular congênita de Ullrich ou de miopatia de Bethlem em um paciente que compreende adminis- trar ao paciente uma quantidade eficaz de um derivado de ciclosporina A não-imunossupressora de fórmula I.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora é um derivado de ciclosporina de fórmula II.
9. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora é a ciclosporina não-imunossupres- sora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III.
10. Composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular congênita de Ullrich ou de miopatia de Bethlem que compreende uma quantidade eficaz de um derivado de ciclosporina A não-imunossupres- sora de fórmula I, um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um excipiente e um diluente.
11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora é uma ciclospo- rina de fórmula II.
12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que o derivado de ciclosporina A não-imunossupressora é a ciclosporina não-imunossupressora [D-MeAla]3-[EtVal]4-CsA de fórmula III.
13. Composições farmacêuticas de açodo com as reivindicações -10 a 12, que compreendem adicionalmente um outro ingrediente ativo.
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