BRPI0619325A2 - células hospedeiras microbianas recombinantes, métodos para produção de isobutanol e meio de fermentação que contém isobutanol - Google Patents

Abstract

CéLULAS HOSPEDEIRAS MICROBIANAS RECOMBINANTES, MéTODOS PARA PRODUçãO DE ISOBUTANOL E MEIO DE FERMENTAçãO QUE CONTéM ISOBUTANOL. A presente invenção se refere a métodos para produção fermentativa de alcoóis de quatro carbonos. Especificamente, butanol, preferencialmente isobutanol é produzido pelo crescimento fermentativo de uma bactéria recombinante que expressa uma via biossintética do isobutanol.

Description

"CÉLULAS HOSPEDEIRAS MICROBIANAS RECOMBINANTES, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL E MEIO DE FERMENTAÇÃO QUE

CONTÉM ISOBUTANOL"

Este pedido reivindica prioridade sobre 35 U.S.C § 119 do Pedido Provisório Série N0 60/730290, depositado em 26 de outubro de 2005.

Campo da Invenção

A invenção relaciona-se ao campo da microbiologia industrial e à produção de alcoóis. Mais especificamente, o isobutanol é produzido via fermentação industrial de um microorganismo recombinante.

Antecedentes da Invenção O butanol é um químico industrial importante, útil como aditivo de combustível, como matéria prima na indústria de plástico, e na extração de tinta alimentícia na indústria de alimentos e aromatizantes. A cada ano, 10 a 12 bilhões de libras de butanol são produzidos por meios petroquímicos e a necessidade para este produto de consumo químico provavelmente irá aumentar.

Métodos para a síntese química do isobutanol são conhecidos, tal como a síntese oxo, hidrogenação catalítica de monóxido de carbono (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a edição, 2003, Wiley- VCHVerIag GmbH and Co., Weinheim, Alemanha, Vol. 5 páginas 716-719) e condensação Guerbet de metanol com n-propanol (Carlini et al., J. Moi Catai. A:Chem. 220:215-220 (2004)). Estes processos utilizam como material inicial, derivados de petroquímicos, que geralmente são caros e não respeitam o meio ambiente. A produção de isobutanol a partir de matérias primas derivadas de plantas iria minimizar a emissão de gases de efeito estufa e representariam um avanço na técnica.

O isobutanol é produzido biologicamente como um subproduto de fermentação da levedura. É um componente do "óleo fúsel", que se forma como resultado do metabolismo incompleto de aminoácidos por este grupo de fungos. O isobutanol é especificamente produzido a partir do catabolismo da L- valina. Após a grupo amino da L-valina ser colhido como uma fonte de nitrogênio, o α-keto-ácido resultante é descarboxilado e reduzido a isobutanol por enzimas da, assim chamada, via Ehrlich (Dickinson et al., J. BioL Chem. 273(40):25752-25756 (1998)). A produção de óleo fúsel e/ou seus componentes, alcançada durante a fermentação de bebidas é tipicamente baixa. Por exemplo, a concentração de isobutanol produzido na fermentação da cerveja é relatada ser menor que 16 partes por milhão (Garcia et al., Process Biochemistry 29:303-309 (1994)). A adição de L-valina exógena na fermentação aumenta a produção de isobutanol, como descrito por Dickinson et al., acima, no qual é relatado que uma produção de isobutanol de 3 g/l é obtida pelo fornecimento de L-valina a uma concentração de 20 g/l na fermentação. No entanto, o uso de valina como uma matéria prima seria de custo proibitivo para produção de isobutanol em escala industrial. A biossíntese do isobutanol diretamente a partir de açúcares seria economicamente viável e iria representar um avanço na técnica. Não houve nenhum relato de um microorganismo recombinante projetado para produzir isobutanol.

Existe então a necessidade de um processo de custo efetivo, ambientalmente responsável, para a produção do isobutanol como um produto único. A presente invenção dirige-se a esta necessidade pelo fornecimento de uma produção microbiana recombinante que expresse uma via biossintética do isobutanol.

Descrição Resumida da Invenção

A invenção fornece um microorganismo recombinante que possui uma via biossintética do isobutanol engenheirada. O microorganismo engenheirado pode ser usado para produção comercial do isobutanol. Consequentemente, em uma realização a invenção fornece um hospedeiro microbiano recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de:

i) piruvato para acetolactato (etapa a da via)

ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato (etapa b da via)

iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato (etapa c da via)

iv) α-keto-isovalerato para isobutiraldeído, (etapa d da via), e

v) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via)

em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana e que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

Em outra realização, a invenção fornece uma célula hospedeira microbiana que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de:

i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via)

ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via)

iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato, (etapa c da via)

iv) α-keto-isovalerato para isobutiril-CoA, (etapa f da via)

v) isobutiríl-CoA para isobutiraldeído, (etapa g da via), e

vi) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via)

em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana e que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

Em outra realização, a invenção fornece uma célula hospedeira microbiana que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de:

i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via)

ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via)

iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato, (etapa c da via)

iv) α-keto-isovalerato para valina, (etapa h da via)

v) valina para isobutilamina, (etapa i da via)

vi) isobutilamina para isobutiraldeído, (etapa j da via), e

vii) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via)

em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana e que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

Em outra realização, a invenção fornece um método para a produção de isobutanol que compreende:

1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de:

i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via)

ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via)

iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato (etapa c da via)

iv) α-keto-isovalerato para isobutiraldeído, (etapa d da via), e

v) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via)

em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana; e

2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

Em outra realização, a invenção fornece um método para a produção de isobutanol que compreende:

1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de:

1) piruvato para acetolactato, (etapa a da via)

ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via)

iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovaIerato (etapa c da via)

iv) α-keto-isovalerato para isobutiril-CoA, (etapa f da via)

v) isobutiril-CoA para isobutiraldeído, (etapa g da via), e

vi) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via)

em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana; e

2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

Em outra realização, a invenção fornece um método para a produção de isobutanol que compreende:

1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de:

i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via)

ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via)

iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato (etapa c da via) iv) α-keto-isova Ierato para valina, (etapa h da via)

v) valina para isobutilamina, (etapa i da via), e

vi) isobutilamina para isobutiraldeído, (etapa j da via) e,

vii) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via)

em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana; e

2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

Em uma realização substituta, a invenção fornece um isobutanol limitando o meio de fermentação produzido pelos métodos da invenção.

Breve Descrição das Figuras ε Descrição das Seqüências

A invenção pode ser mais bem entendida a partir de descrições detalhadas, figuras, e descrição de seqüências associadas, as quais formam uma parte deste pedido.

A Figura 1 mostra quatro vias biossintéticas do i sobutanol diferentes. As etapas marcadas "a", "b", "c", "d", "e", "f "g", "h", "j" e "k" representam o substrato para conversão em produtos descritos abaixo.

As seqüência seguintes obedecem ao 37 C.F.R § 1.821-1.825 ("Requirements for Patent Application Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") e estão em consonância com a World Intellectual Property Organization (WIPO) Standard St.25 (1998) e a seqüência que lista exigências do EPO e PCT (normas 5.2 e 49.5 (a-bis), e a Seção 208 e Anexo C das Instruções Administrativas). Os símbolos e formatos usados para os dados de seqüência de aminoácido e nucleotídeo cumprem as normas estabelecidas no 37 C.F.R. § 1.822. Tabela 1

Resumo dos Genes E Números de SEQID das Proteínas

<table>table see original document page 8</column></row><table> <table>table see original document page 9</column></row><table> <table>table see original document page 10</column></row><table> <table>table see original document page 11</column></row><table> SEQ ID Nos: 11-38, 40-69, 72-75, 85-138, 144, 145, 147-157, 159- 176 são seqüências de nucleotídeos de oligonucleotídeos de clonagem, seleção ou primers de sequenciamento usadas nos Exemplos descritos no presente.

SEQ ID No:39 é a seqüência de nucleotídeos do grupamento de gene cscBKA descrito no Exemplo 16.

SEQ ID No:70 é a seqüência de nucleotídeos do promotor glicose isomerase 1.6GI descrito no Exemplo 13.

SEQ ID No:71 é a seqüência de nucleotídeos do promotor 1.5GI descrito no Exemplo 13.

SEQ ID No:76 é a seqüência de nucleotídeos do promotor GPD descrito no Exemplo 17.

SEQ ID No:77 é a seqüência de nucleotídeos do terminador GYC1 descrito no Exemplo 17.

SEQ ID No:79 é a seqüência de nucleotídeos do promotor FBA descrito no Exemplo 17

SEQ ID No:81 é a seqüência de nucleotídeos do promotor ADH1 descrito no Exemplo 17.

SEQ ID No:82 é a seqüência de nucleotídeos do terminador ADH1 descrito no Exemplo 17.

SEQ ID No:84 é a seqüência de nucleotídeos do promotor GPM descrito no Exemplo 17.

SEQ ID No: 139 é a seqüência de aminoácidos de sacarose hidrolase (CscA).

SEQ ID No: 140 é a seqüência de aminoácidos de D-frutoquinase (CscK).

SEQ ID No: 141 é a seqüência de sacarose permease (CscB).

SEQ ID No:142 é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pFP988DssPspac descrita no Exemplo 20.

SEQ ID No:143 é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pFP988DssPgroE descrito no Exemplo 20.

SEQ ID No:146 é a seqüência de nucleotídeos do fragmento do vetor pFP988Dss descrito no Exemplo 20.

SEQ ID No: 177 é a seqüência de nucleotídeos do vetor de integração descrito no exemplo 21.

SEQ ID No:267 é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pC194 descrito no Exemplo 21.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção relaciona-se aos métodos para a produção do isobutanol usando-se microorganismos recombinantes. A presente invenção vai de encontro com grandes necessidades comerciais e industriais. O butanol é um importante produto de consumo na indústria química com diversas aplicações, cujo potencial como combustível e aditivo de combustível é particularmente significante. Embora sendo somente um álcool com quatro carbonos, o butanol possui um conteúdo energético similar àquele da gasolina e pode ser misturado com qualquer combustível fóssil. O butanol é favorecido como combustível ou aditivo de combustível, já que produz somente CO2 e um pouco ou nada de SOx ou NOx1 quando queimado no motor de combustão interna padrão. Além disso, o butanol é menos corrosivo que o etanol, e é o aditivo de combustível mais preferido até esta data.

Além da sua utilidade como um biocombustível ou aditivo de combustível, o butanol tem o potencial de ir de encontro aos problemas de distribuição de hidrogênio na emergente indústria de células de combustível. As células de combustível hoje são importunadas pela preocupação com a segurança associada com o transporte e distribuição de hidrogênio. O butanol pode ser facilmente transformado para seu conteúdo de hidrogênio, e pode ser distribuído através das estações de gás existentes na pureza exigida, tanto para células de combustíveis como veículos.

Finalmente, a presente invenção produz isobutanol a partir de fontes de carbono derivadas de plantas, evitando o impacto ambiental negativo associado com processos petroquímicos padrão para a produção do butanol.

As seguintes definições e abreviações devem ser usadas para a interpretação das reivindicações e da especificação.

O termo "invenção" ou "presente invenção", como usado no presente, é um termo não Iimitante e não tem a intenção de se referir a qualquer realização individual da invenção particular, mas englobar todas as possíveis realizações como descritas na especificação e nas reivindicações.

O termo "via biossíntética do isobutanol" refere-se a vias enzimáticas para produzir isobutanol.

Os termos "acetolactato sintase" e "acetolactato sintetase" são usados alternadamente no presente para se referir a uma enzima que catalisa a conversão de piruvato para acetolactato e CO2. Acetolactato sintases preferidas são conhecidas pelo número EC 2.2.1.6.9 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego). Estas enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, seqüência de aminoácidos de Bacillus subtilis (GenBank Nos: CAB15618 (SEQ ID No:178), Z99122 (SEQ ID No: 78), NCBI (National Center for Biotechnology Information), seqüência de nucleotídeo NCBI, respectivamente), Klebsiella pneumoniae (GenBank Nos: AAA25079 (SEQ ID N0:2), M73842 (SEQ ID N0:1), e Lactococcus Iaetis (GenBank Nos: AAA25161 (SEQ ID NO:180), L16975 (SEQ ID NO:179)).

Os termos "ácido acetohidroxi isomeroredutase" e "ácido acetohidroxi redutoisomerase" são usados de forma alternada no presente para se referir a uma enzima que catalisa a conversão de acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato usando-se NADPH (nicotinamida adenina polinucleotídeo fosfato reduzida). Ácido acetohidroxi isomeroredutases são conhecidas pelo número EC 1.1.1.8.6 e as seqüências estão disponíveis a partir de um amplo arranjo de microorganismos, incluindo, mas não limitado a, Escherichia coli (GenBank Nos: NP_418222 (SEQ ID NO:4), NC_000913 (SEQ ID NO:3)), Saccharomyces cerevisiae (GenBank Nos: NP_013459 (SEQ ID NO:181), NC_001144 (SEQ ID NO: 80)), Methanococcus maripaludis (GenBank Nos: CAF30210 (SEQ ID NO: 183), BX957220 (SEQ ID NO:182)), e Bacillus subtilis (GenBank Nos: CAB14789 (SEQ ID NO: 185), Z99118 (SEQ ID NO:184)).

O termo "ácido acetohidroxi desidratase" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-keto-isovalerato. Ácido acetohidroxi desidratases preferidas são conhecidas pelo número EC 4.2.1.9. Estas enzimas estão disponíveis a partir de um amplo arranjo de microorganismos, incluindo, mas não limitado a, E. coli (GenBank Nos: YP_026248 (SEQ ID NO:6), NC_000913 (SEQ ID NO:5)), S. cerevisiae (GenBank Nos: NP_012550 (SEQ ID ΝΟ.Ί86), NC_001142 (SEQ ID NO: 83)), M. maripaludis (GenBank Nos: CAF29874 (SEQ ID NO: 188), BX957219 (SEQ ID NO: 187)), e B. subtilis (GenBank Nos: CAB14105 (SEQ ID NO: 190), Z99115 (SEQ ID NO: 189)).

O termo "α-keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de α-keto-isovalerato para isobutiraldeído e CO2. α-keto-ácido descarboxilases de cadeia ramificada preferidas são conhecidas pelo número EC 4.1.1.72 e estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, Lactococcus Iaetis (GenBank Nos: AAS49166 (SEQ ID NO:193), AY548760 (SEQ ID NO:192); CAG34226 (SEQ ID NO: 8), AJ746364 (SEQ ID NO: 192), Salmonella typhimurium (GenBank Nos: NP_461346 (SEQ ID NO:195), NC_003197 (SEQ ID NO:194», e Clostridium aeetobutylieum ( GenBank Nos:NP_149189 (SEQ ID NO:197), NC_001988 (SEQ ID NO: 196)).

O termo "álcool desidrogenase de cadeia ramificada" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de isobutiraldeído para isobutanol. Álcool desidrogenases de cadeia ramificada preferidas são conhecidas pelo número EC 1.1.1.265, mas podem ser classificadas como outras álcool desidrogenases (especificamente, EC 1.1.1.1 ou 1.1.1.2). Estas enzimas utilizam NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida) e/ou NADPH como doador de elétron e estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, S. cerevisiae (GenBank Nos: NP_010656 (SEQ ID NO: 199), NC_001145 (SEQ ID NO: 200)), E.coli (GenBank Nos: NP_417484 (SEQ ID NO: 10), NC_000913 (SEQ ID NO:9)), e C. Acetobutylicum (Genbank Nos: NP 349892 (SEQ ID N0:203), NC_003030 (SEQ ID N0:202); NP_349891 (SEQ ID NO: 204), NC_003030 (SEQ ID NO:158)).

O termo "keto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada" refere- se a uma enzima que catalisa a conversão de α-keto-isovalerato para isobutiril- CoA (isobutiral-coenzima A), usando-se NAD+ (nicotinamida adenina dinucleotídeo) como receptor de elétrons. Ácido keto desidrogenases de cadeia ramificada preferidas são conhecidas pelo número EC 1.2.4.4. Estas keto-ácido desidrogenases de cadeia ramificada são formadas por quatro subunidades e as seqüências de todas as subunidades estão disponíveis a partir de um amplo arranjo de microorganismos, incluindo, mas não limitado a, B. subtilis (GenBank Nos: CAB14336 (SEQ ID N0:206), Z99116 (SEQ ID N0:205), CAB14335 (SEQ ID N0:208), Z99116 (SEQ ID N0:207), CAB14334 (SEQ ID N0:210), Z99116 (SEQ ID N0:209); e CAB14337 (SEQID NO:212), Z99116 (SEQ ID NO:211) e Pseudomonas putida (GenBank Nos: AAA65614 (SEQ ID NO:214), M57613 (SEQ ID NO:213); AAA65615 (SEQ ID NO:216), M57613 (SEQ ID NO:215); AAA65617 (SEQ ID NO:218), M57613 (SEQ ID NO:217); e AAA65618 (SEQ ID N0:220), M57613 (SEQ ID NO:219)). O termo "aldeído desidrogenase acilante" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de isobutiril-CoA para isobutiraldeído, que utiliza NADH e NADPH como doadores de elétrons. Aldeído desidrogenases adiantes preferidas são conhecidas pelos números EC 1.2.1.10 e 1.2.1.57. Estas enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, Clostridium beijerinckii (GenBank Nos: AAD31841 (SEQ ID NO:222), AF157306 (SEQ ID NO:221)), C. acetobutylicum (GenBank Nos:NP_149325 (SEQ ID NO:224), NC_001988 (SEQ ID NO:223); NP_149199 (SEQ ID NO:226), NC_001988 (SEQ ID NO:225)), P. putida (GenBank Nos: AAA89106 (SEQ ID NO:228), U13232 (SEQ ID NO:227)), e Thermus thermophilus (GenBank Nos: YP_145486 (SEQ ID N0:230), NC_006461 (SEQ ID NO:229)).

O termo "transaminase" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de α-keto-isovalerato para L-valina, usando-se tanto alanina como glutamato como doadores de amina. Transaminases preferidas são conhecidas pelos números EC 2.6.1.42 e 2.6.1.66. Estas enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, E.coli (GenBank Nos: YP 026231 (SEQ ID NO:232), NC_000913 (SEQ ID NO:231)), e Bacillus licheniformis (GenBank Nos:YP_093743 (SEQ ID NO:234), NC_006322 (SEQ ID NO:223)). Exemplos de fontes de enzimas dependentes de glutamato incluem, mas não estão limitadas a, E.coli (GenBank Nos: YP_026247 (SEQ ID NO:236), NC_000913 (SEQ ID NO:235)), S. cerevisiae (GenBank Nos:NP_012682 (SEQ ID NO:238), NC_001142 (SEQ ID NO:237)) e Methanobacterium thermoautotrophicum (GenBank Nos: NP_276546 (SEQ ID N0:240), NC_000916 (SEQ ID NO:239)).

O termo "valina desidrogenase" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de α-keto-isovalerato para L-valina, usando-se NAD(P)H como doador de elétron e amônia como doador de amina. As valinas desidrogenases preferidas são conhecidas pelos números EC 1.4.1.8 e 1.4.1.9 estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, Streptomyces coelicolor (GenBank Nos: NP_628270 (SEQ ID No:242), NC_003888 (SEQ ID NO:241)), e B. subtilis (GenBank Nos:CAB14339 (SEQ ID NO:244), Z99116 (SEQ ID NO:243)).

O termo "valina descarboxilase" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de L-valina para isobutilamina e CO2. Valina descarboxilases preferidas são conhecidas pelos números EC 4.1.1.14. Estas enzimas são encontradas em Estreptomicetos, tais como, por exemplo, Streptomyces viridifaciens (GenBank Nos: AAN10242 (SEQ ID NO:246), AY116644 (SEQ ID NO:245)).

O termo "ômega transaminase" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de isobutilamina para isobutiraldeído usando-se um aminoácido adequado como doador de amina. Omega transaminases são conhecidas pelo número EC 2.6.1.18 e estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, Alcaligenes denitrificans (AAP92672 (SEQ ID NO: 248), AY330220 (SEQ ID NO:247), Ralstonia eutropha (GenBank Nos: YP 294474 (SEQ ID N0:250), NC_007347 (SEQ ID NO:249)), e Shewanella oneidensis (GenBank Nos: NP_719046 (SEQ ID NO: 252), NC O04347 (SEQ ID NO:251)), e P. putida (GenBank Nos: AAN66223 (SEQ ID NO: 254), AE016776 (SEQ ID NO:253)).

O termo "isobutiril-CoA mutase" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de butiril-CoA para isobutiril-CoA. Esta enzima usa coenzima B12 como cofator. Isobutiril-CoA mutases são conhecidas pelo número EC 5.4.99.13. Estas enzimas são encontradas em diversos estreptomicetos, incluindo, mas não limitado a, Streptomyces cinnamonensis (GenBank Nos: AAC08713 (SEQ ID NO: 256), U67612 (SEQ ID NO:255), CAB59633 (SEQ ID NO:258), AJ246005 (SEQ ID NO:257)), S. coelicolor (GenBank Nos: CAB70645 (SEQ ID N0:260), AL939123 (SEQ ID NO:259); CAB92663 (SEQ ID NO: 262), AL939121 (SEQ ID NO:261)), e Streptomyces avermitilis (GenBank Nos: NP_824008 (SEQ ID NO:264), NC_003155 (SEQ ID NO:263); NP_824637 (SEQ ID NO:266), NC_003155 (SEQ ID NO:265)).

O termo "anaeróbico facultativo" refere-se a um microorganismo que pode crescer tanto em meios aeróbicos como anaeróbicos.

O termo "substrato de carbono" ou "substrato de carbono fermentável" refere-se a uma fonte de carbono capaz de ser metabolizada pelos organismos hospedeiros da presente invenção e, particularmente, fontes selecionadas do grupo que consiste de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos e substratos de carbono único ou misturas destes.

O termo gene "refere-se" a um fragmento de ácido nucléico que é capaz de ser expressado como uma proteína específica, opcionalmente que incluem seqüências reguladoras anteriores (seqüências não codificadoras 5') e posteriores (seqüências não codificadoras 3') da seqüência codificadora. "Gene nativo" refere-se a um gene como é encontrado na natureza com suas próprias seqüências reguladoras. "Gene quimérico" refere-se a qualquer gene que não é nativo, que compreende seqüências reguladoras e codificadoras que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender seqüências reguladoras e seqüências codificadoras que são derivadas de diferentes fontes, ou seqüências reguladoras e seqüências codificadoras derivadas da mesma fonte, mas organizadas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo em seu local natural no genoma de um organismo. Um gene "estranho" ou "heterólogo" refere-se a um gene não encontrado normalmente no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um processo de transformação. Como usado no presente "seqüência codificadora" refere-se a uma seqüência de DNA que codifica uma seqüência de aminoácido. "Seqüências reguladoras adequadas" referem-se às seqüências de nucleotídeos localizadas a montante (seqüências não codificadoras 5'), dentro, ou a jusante (seqüências não codificadoras 3') de uma seqüência codificadora, e que influencia a transcrição, processo ou estabilidade do RNA, ou tradução da seqüência codificadora associada. Seqüências reguladoras podem incluir promotores, seqüências líder de tradução, íntrons, seqüências de reconhecimento de poliadenilação, sítio de processo do RNA, sítio de ligação efetora e estrutura de Ioop derivada do Ioop.

O termo "promotor" refere-se a uma seqüência de DNA capaz de controlar a expressão de uma seqüência codificadora ou funcional de RNA. Em geral, uma seqüência codificadora está localizada 3' de uma seqüência promotora. Promotores podem ser totalmente derivados de um gene nativo, ou podem ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou até compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por esses técnicos no assunto que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estágios do desenvolvimento, ou em resposta a diferentes ambientes ou condições fisiológicas. Promotores que. induzem um gene a se expressar na maioria dos tipos celulares são comumente denominados "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que, já que em muitos casos os limites exatos das seqüências reguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade idêntica à do promotor.

O termo "operacionalmente ligado" refere-se à associação de seqüências de ácido nucléico com um fragmento único de ácido nucléico. De forma que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora quando é capaz de influenciar a expressão desta seqüência codificadora (isto é, que a seqüência codificadora está sob o controle de transcrição do promotor). Seqüências codificadoras podem estar operacionalmente ligadas às seqüências reguladoras na orientação sense e antisense.

O termo "expressão", como usado no presente, refere-se à transcrição e acumulação estável do RNA sense (mRNA) ou antisense derivado de um fragmento de ácido nucléico da invenção. Expressão pode também se referir à tradução do mRNA em um polipeptídeo.

Como usado no presente, o termo "transformação", refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucléico para um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucléico transformados são denominados "transgênicos", "recombinantes" ou organismos "transformados".

Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassette" referem-se a um elemento extra-cromossômico que freqüentemente carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula, e usualmente na forma de moléculas de DNA circular dupla fita. Tais elementos podem ser seqüências de replicação autônomas, seqüências de integração de genoma, seqüências de nucleotídeos ou de fago, linear ou circular, de DNA dupla fita ou simples ou RNA, derivadas de qualquer fonte, em que várias seqüências de nucleotídeos foram recombinadas ou unidas em uma única construção capaz de introduzir um fragmento promotor e uma seqüência de DNA em um produto do gene selecionado junto com a seqüência não traduzida 3' em uma célula. uCassette de transformação" refere-se a um vetor específico que contém um gene estranho e que possui elementos além do gene estranho, que facilitam a transformação de uma célula hospedeira específica. "Expressão cassette" refere-se a um vetor específico que contém um gene estranho e possui elementos, além do gene estranho, que permitem aumentar a expressão desse gene em um hospedeiro estranho.

Como usado no presente, o termo "degeneração de códon" refere-se à natureza do código genético que permite variação da seqüência de nucleotídeo sem afetar a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo codificado. O técnico no assunto é bem consciente das "tendências dos códons" exibidas por uma célula hospedeira específica no uso dos nucleotídeos dos códons para especificar um dado aminoácido. Dessa forma, quando sintetizando um gene para melhorar a expressão em uma célula hospedeira, é desejável que se projete o gene de modo que sua freqüência de uso do códon aproxime-se da freqüência de uso do códon preferido da célula hospedeira.

O termo "códon otimizado" refere-se a genes ou regiões codificadoras de moléculas de ácido nucléico para transformação de vários hospedeiros, refere-se à alteração dos códons no gene ou regiões codificadoras das moléculas de ácido nucléico para refletir o uso típico do códon do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo DNA.

Técnicas padrão de DNA recombinante e técnicas de clonagem molecular usadas no presente são bem conhecidas na técnica e estão descritas por Sambrook1 J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) (a seguir "Maniatis"); e por Silhavy, T.J., Bennan1 M.L. e Enquist, L.W., Experiments with Gene Fusions, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 NY (1984); e por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience (1987). Vias Biossintéticas do Isobutanol

Microorganismos que utilizam carboidratos empregam a via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), e o ciclo pentose fosfato como central, rotas metabólicas para fornecer energia, e precursores celulares para o crescimento e manutenção. Estas vias têm em comum o intermediário gliceraldeído-3- fosfato e, basicamente, o piruvato é formado diretamente ou em combinação com a via EMP. Subseqüentemente, o piruvato é transformado em acetil- coenzima A (acetil-CoA) por diversos meios. A acetil-CoA serve como uma chave intermediária, por exemplo, na geração de ácidos graxos, aminoácidos e metabólitos secundários. As reações combinadas de conversão de açúcar para piruvato que produz energia (por exemplo, adenosina-5'-trifosfato, ATP) e que reduzem equivalentes (por exemplo, nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida, NADH, e nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida, NADPH). NADH e NADPH devem ser reciclados para as suas formas oxidativas (NAD+ e NADP+, respectivamente). Na presença de aceptores de elétrons inorgânicos (por exemplo, O2, NO3" e SO4"), a redução de equivalentes pode ser usada para aumentar o pool de energia; alternativamente, pode ser formado um subproduto de carbono reduzido.

A invenção possibilita a produção de isobutanol a partir de fontes de carboidratos com microorganismos recombinantes pelo fornecimento de quatro vias de reação completas, como mostrado na Figura 1. Três das vias compreendem conversão de piruvato para isobutanol via uma série de etapas enzimáticas. A via do isobutanol preferida (Figura 1, etapas a até e), compreende as seguintes conversões de substrato para produto.

a) piruvato para acetolactato, como catalisado, por exemplo, por acetolactato sintase,

b) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi isomeroredutase, c) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi desidratase,

d) α-keto-isovalerato para isobutiraldeído, como catalisado, por exemplo, por keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada, e

e) isobutiraldeído para isobutanol, como catalisado, por exemplo, por álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

Esta via combina enzimas conhecidas por estar envolvidas em vias bem caracterizadas para biossíntese da valina (piruvato para a- ketoisovalerato) e catabolismo da valina (α-ketoisovalerato para isobutanol). Visto que muitas enzimas biossintéticas da valina também catalisam reações análogas na via biossintética da isoleucina, a especificidade do substrato é a principal consideração na seleção de fontes de genes. Por esta razão, os genes de interesse primário para a enzima acetolactato sintase são aqueles de Bacillus (alsS) e Klebsiella (budB). Estas acetolactato sintases específicas são conhecidas por participar na fermentação do butanediol nestes organismos e mostram aumento de afinidade para piruvato superior ao ketobutirato (Gollop et al., J. Bacterioi 172(6):3444-3449 (1990); Holtzclaw et al„ J. Bacterioi 121 (3):917-922 (1975)). As etapas da segunda e terceira via são catalisadas por ácido acetohidroxi redutoisomerase e desidratase, respectivamente. Estas enzimas foram caracterizadas a partir de uma variedade de fontes, tais como, por exemplo, E. coli (Chunduru et al., Biochemistry 28(2):486-493 (1989); Flint et al., J. Bioi Chem. 268(29): 14732-14742 (1993)). As duas etapas finais da via preferida do isobutanol são conhecidas por ocorrer em leveduras, que podem usar valina como uma fonte de nitrogênio e, no processo, secretar isobutanol. O α-keto-isovalerato pode ser convertido para isobutiraldeído por uma variedade de enzimas keto-ácido descarboxilase, tal como, por exemplo, piruvato descarboxilase. Para prevenir direção errada do piruvato para longe da produção do isobutanol, uma descarboxilase com afinidade diminuída para piruvato é desejável. Até agora existem duas tais enzimas conhecidas na técnica (Smit et al., AppL Environ. MicrobioL 71(1):303-311 (2005); de Ia Plaza et al., FEMS MicrobioL Lett. 238(2):367-374 (2004)). Ambas as enzimas são de linhagens de Lactococcus Iaetis e têm preferência 50 a 200 vezes superior para keto-isovalerato do que para piruvato. Finalmente, uma variedade de aldeído redutases foi identificada em leveduras, muitas com sobreposição de especificidade de substrato. Aquelas conhecidas por preferir substratos de cadeia ramificada sobre acetaldeído incluem, mas não estão limitadas a, álcool desidrogenase Vl (ADH6) e Yprlp (Larroy et al., Bioehem. J. 361 (PT 1):163- 172 (2002); Ford et al., Yeast 19(12): 1087-1096 (2002)), ambas utilizam NADPH como doador de elétron. Uma redutase dependente de NADPH1 YqhD1 ativa com substratos de cadeia ramificada foi também recentemente identificada em E. eoli (Suizenbacher et al., J. MoL Biol. 342(2):489-502 (2004)).

Outra via para conversão de piruvato para isobutanol compreende os seguintes substratos para conversões em produtos (Figura 1, etapas a, b, c, f, 9, e):

a) piruvato para acetolactato, como catalisado, por exemplo, por acetolactato sintase,

b) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi isomeroredutase,

c) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi desidratase,

f) α-keto-isovalerato para isobutiril-CoA, como catalisado, por exemplo, por ácido keto desidrogenase de cadeia ramificada.

g) isobutiril-CoA para isobutiraldeído, como catalisado, por exemplo, por acetaldeído desidrogenase, e

e) isobutiraldeído para isobutanol, como catalisado, por exemplo, por um álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

As primeiras três etapas nesta via (a, b, c) são as mesmas daquelas descritas acima. A α-keto-isovalerato é convertida para isobutiril-CoA pela ação de uma keto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada. Enquanto leveduras podem usar somente valina como fonte de nitrogênio, muitos outros organismos (tanto eucariontes como procariontes) podem também usar valina como fonte de carbono. Estes organismos possuem keto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada (Sokatch et al., J. Bacteriol. 148(2):647-652 (1981)), que geram isobutiril- CoA. Isobutiril-CoA pode ser convertido em isobutiraldeído por uma aldeído desidrogenase acilante. Desidrogenases que atuam em substrato de cadeia ramificada foram descritas, mas não clonadas, em Leuconostoc e Propionibacterium (Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972); Hosoi et al., J. Ferment. Technol. 57:418-427 (1979)). No entanto, também é possível que aldeído desidrogenases acilantes que funcionam em cadeia linear de acil-CoAs (isto é, butiril-CoA), possam também trabalhar com isobutiril-CoA. O isobutiraldeído é então convertido para isobutanol por uma álcool desidrogenase de cadeia ramificada, como descrito acima para a primeira via.

Outra via para conversão de piruvato para isobutanol compreende os seguintes substratos para conversões em produtos (Figura 1, etapas a, b, c, h, i, j, e):

a) piruvato para acetolactato, como catalisado, por exemplo, por acetolactato sintase,

b) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi isomeroredutase,

c) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi desidratase, h) α-keto-isovalerato para valina, como catalisado, por exemplo, por valina desidrogenase ou transaminase,

i) valina para isobutilamina, como catalisado, por exemplo, por valina descarboxilase,

j) isobutilamina para isobutiraldeído, como catalisado, por exemplo, por ômega transaminase, e

e) isobutiraldeído para isobutanol, como catalisado, por exemplo, por álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

As primeiras três etapas desta via (a, b, c) são as mesmas daquelas descritas acima. Esta via requer a adição de uma valina desidrogenase ou uma transaminase adequada. Valina (e/ou leucina) desidrogenase catalisa a aminação de redução e utiliza amônia; valores Kn para amônia estão em variação milimolar (Priestly et a!., Biochem J. 261(3):853-861 (1989); Vancura et al., J. Gen. Microbiol. 134(12):3213- 3219 (1988) Zink et al., Arch. Biochem. Biophys. 99:72-77 (1962); Sekimoto et al., J. Biochem (Japan) 116(1): 176-182 (1994)). Transaminases tipicamente utilizam tanto glutamato como alanina, como doadores de amina e foram caracterizados a partir de diversos organismos (Lee-Peng et al., J. Bacteriol. 139(2):339-345 (1979); Berg et al., J. Bacteriol. 155(30;1009-1014(1983)). Uma enzima específica para alanina pode ser desejável, desde que a geração de piruvato a partir desta etapa possa ser posteriormente acoplada ao consumo de piruvato na via quando o grupo amina for removido (veja abaixo). A próxima etapa é a descarboxilação da valina, uma reação que ocorre na biossíntese de valinimicina em Streptomyces (Garg et al., Mol. Microbiol. 46(2):505-517 (2002)). A isobultilamina resultante pode ser convertida para isobutiraldeído em uma reação dependente de piridoxal 5'-fosfato, por exemplo, por uma enzima da família aminotransferase. Tal enzima do Vibrio fiuvialis demonstrou atividade com isobutilamina (Shin et al., Biotechnol. Bioeng. 65(2):206-211 (1999)). Outra aminotransferase de Alcaligenes denitrificans foi clonada e possui alguma atividade com butilamina (Yun et al., Appi Environ. MicrobioL 70(4):2529-2534 (2004)).

Nesta direção, estas enzimas usam piruvato como grupo aceptor de amina, produzindo alanina. Como mencionado acima, efeitos adversos no pool de piruvato podem ser compensados usando-se uma transaminase que produz piruvato no início da via. O isobutiraldeído é então convertido para isobutanol por álcool desidrogenase de cadeia ramificada, como descrito acima para a primeira via.

A quarta via biossintética do isobutanol compreende o substrato para conversão em produto mostrado nas etapas k, g, e na Figura 1. Uma variedade de organismos é conhecida por produzir butiraío e/ou butanol via um Intermediário butiril-CoA (Dürre et al., FEMS Microbiol. Ver. 17(3);251-262 (1995); Abbad-Andaloussi et al., Microbiology 142(5):1149-1158 (1996)). A produção de isobutanol pode ser engenheirada nestes organismos pela adição de uma mutase capaz de converter butiril-CoA para isobutiril-CoA (Figura 1, etapa k). Os genes para ambas as subunidades de isobutiril-CoA mutase, uma enzima dependente de coenzima Bi2, foi clonada a partir de Estreptomiceto (Ratnatilleke et al., J.Bioi Chem. 274(44):31679-31685 (1999). O isobutiril-CoA é convertido para isobutiraldeído (etapa g na Figura 1), que é convertido para isobutanol (etapa e na Figura 1).

Dessa forma, com o fornecimento de múltiplas vias recombinantes a partir de piruvato para isobutanol, existem várias escolhas para completar as etapas de conversão individuais, e o técnico no assunto será capaz de utilizar seqüências publicamente disponíveis para construir as vias relevantes. Uma listagem de um número representativo de genes conhecidos na técnica e úteis na construção de vias sintéticas de isobutanol está listada abaixo na Tabela 2. Tabela 2

Fontes de Genes da Via Biossintética do Isobutanol

<table>table see original document page 29</column></row><table> <table>table see original document page 30</column></row><table> <table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table>

Hospedeiros Microbianos para Produção de Isobutanol

Hospedeiros microbianos para produção de isobutanol podem ser selecionados de bactérias, cianobactérias, fungos filamentosos e leveduras. O hospedeiro microbiano usado para produção de isobutanol é preferivelmente tolerante ao isobutanol, de forma que a produção não seja limitada pela toxicidade do isobutanol. Micróbios que são metabolicamente ativos a níveis de alta titulação de isobutanol não são bem conhecidos na técnica. Embora os mutantes tolerantes ao isobutanol tenham sido isolados a partir de Clostridia soiventogênico, poucas informações relacionadas à tolerância ao butanol de outras linhagens de bactérias potencialmente úteis, estão disponíveis. A maioria dos estudos de comparação de tolerância ao álcool em bactérias sugere que o butanol é mais tóxico do que o etanol (de Carvalho et al., Microsc. Res. Tech. 64:215-22 (2004) e Kabelitz et ai., FEMS Microbiol. Lett. 220:223-227 (2003)). Tomas et al. (J. Bacteriol. 186:2006-2018 (2004)) relatam que a produção de 1-butanol durante a fermentação em Clostridium acetobutylicum pode ser limitada pela toxicidade de 1-butanol. O efeito primário de 1-butanol em Clostridium acetobutylicum é a ruptura das funções da membrana (Hermann et al., Appi Environ. Microbiol. 50:1238-1243 (1985)). Os hospedeiros microbianos selecionados para a produção de isobutanol são preferivelmente tolerantes ao isobutanol e devem ter a capacidade de converter carboidratos em isobutanol. O critério para seleção de hospedeiros microbianos adequados inclui o seguinte: tolerância intrínseca ao isobutanol, alta taxa de utilização de glicose, disponibilidade de ferramentas genéticas para manipulação gênica, e a habilidade para gerar alterações cromossômicas estáveis.

Linhagens hospedeiras adequadas com tolerância para o isobutanol podem ser identificadas pela seleção baseada na tolerância intrínseca da linhagem. A tolerância intrínseca de micróbios para o isobutanol pode ser medida pela determinação da concentração de isobutanol que é responsável por 50% de inibição da taxa de crescimento (IC50) quando em crescimento em um meio mínimo. Os valores IC50 podem ser determinados usando-se métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os micróbios de interesse podem ser cultivados na presença de várias quantidades de isobutanol e a taxa de crescimento monitorada por medições de densidade ótica a 600 nanômetros. A duplicação de tempo pode ser calculada a partir da parte logarítmica da curva de crescimento e usada como uma medida da taxa de crescimento. A concentração de isobutanol que produz 50% de inibição de crescimento pode ser determinada a partir de um gráfico da porcentagem de inibição do crescimento versus a concentração de isobutanol. Preferivelmente, a linhagem hospedeira deve ter um IC50 para isobutanol maior que aproximadamente 0,5%.

O hospedeiro microbiano para produção de isobutanol deve também utilizar glicose a uma taxa alta. A maioria dos micróbios é capaz de utilizar carboidratos. No entanto, certos micróbios do meio ambiente não podem utilizar carboidratos com alta eficiência, e dessa forma, não seriam adequados como hospedeiros.

A habilidade para modificação genética do hospedeiro é essencial para a produção de qualquer microorganismo recombinante. A forma de tecnologia de transferência de genes pode ser eletroporação, conjugação, transdução ou transformação natural. Uma ampla variedade de plasmídeos hospedeiros de conjugação e marcadores de resistência à droga está disponível. Os vetores de clonagem são confeccionados para os organismos hospedeiros baseados na natureza dos marcadores de resistência ao antibiótico que podem funcionar naquele hospedeiro.

O hospedeiro microbiano deve também ser manipulado com o objetivo de inativar as vias competitivas para o fluxo de carbono pela deleção de vários genes. Isto requer a disponibilidade tanto de transposons para dirigir a inativação, como vetores de integração cromossômica. Além disso, a produção do hospedeiro deve ser facilmente influenciável para mutagênese química, de modo que as mutações que melhoram a tolerância intrínseca ao isobutanol possam ser obtidas.

Baseados nos critérios descritos acima, hospedeiros microbianos adequados para a produção de isobutanol incluem, mas não estão limitados a, membros do gênero Clostridiuml Zymomonas, Escheríchia, Salmonella, Rodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacilus, Anthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Piehia, Candida, Hansenula e Saccharomyees. Hospedeiros preferidos incluem: Escheríchia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus lincheniformis, Paenibacilus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterecoccos gallinarium, Enterecoccus faecalis, Bacillus subtilis e Saccharomyces cerevisiae.

Construção de Hospedeiros de Produção

Organismos recombinantes contendo os genes necessários que irão codificar as vias enzimáticas para a conversão de um substrato de carbono fermentável para isobutanol, podem ser construídos usando-se técnicas bem conhecidas. Na presente invenção, genes que codificam as enzimas de uma das vias biossintéticas do isobutanol da invenção, por exemplo, acetolactato sintase, ácido acetohidroxi isomeroredutase, ácido acetohidroxi desidratase, a- keto-ácido descarboxilase, e álcool desidrogenase de cadeia ramificada, podem ser isolados de várias fontes, como descrito acima.

Métodos de obtenção dos genes desejados a partir de um genoma de bactéria são bem conhecidos na técnica da Biologia Molecular. Por exemplo, se a seqüência do gene é conhecida, bibliotecas genômicas podem ser criadas pela digestão da endonuclease de restrição e pode ser classificada com sondas complementares à seqüência de gene desejada. Uma vez que a seqüência é isolada, o DNA pode ser amplificado usando-se métodos padrão de amplificação dirigida ao primer, tal como reação em cadeia da polimerase (Patente US 4.683.202) para se obter quantidades adequadas de DNA para transformação usando-se vetores apropriados. Ferramentas para otimização do códon para expressão em um hospedeiro heterólogo estão facilmente disponíveis. Algumas ferramentas para otimização do códon estão disponíveis baseadas no conteúdo GC do organismo hospedeiro. O conteúdo GC de alguns hospedeiros mícrobianos exemplares é dado na Tabela 3.

Tabela 3

Conteúdo GC de Hospedeiros Mícrobianos

<table>table see original document page 36</column></row><table> Uma vez que os genes da via relevante são identificados e isolados, eles podem ser transformados em hospedeiros de expressão adequados por meios bem conhecidos na técnica. Vetores ou cassettes úteis para a transformação de uma variedade de células hospedeiras são comuns e comercialmente disponíveis por meio de empresas tais como EPICENTRE® (Madison, Wl), Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Tipicamente, o vetor ou cassette contém seqüências que dirigem transcrição e tradução do gene relevante, um marcador selecionável, e seqüências seguindo replicação autônoma ou integração cromossômica. Vetores adequados compreendem uma região 5' do gene que ancora controles de iniciação da tradução. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para a célula hospedeira transformada, embora se deva entender que tais regiões de controle podem ser também derivadas de genes que não são nativos para as espécies específicas escolhidas como hospedeiro de produção.

Regiões de iniciação controle ou promotores, que são úteis para dirigir expressão de regiões codificadoras da via relevante na célula hospedeira desejada são numerosas e familiares para aqueles técnicos no assunto. Na prática, qualquer promotor capaz de dirigir estes elementos genéticos é adequado para a presente invenção, que inclui, mas não está limitado a, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK1 PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1 TPI, CUP1, FBA, GPD E GPM (úteis para expressão em Saccharomyces); AOX1 (úteis para expressão em Pichia); e lac, ara, tet, trp, IPL1 IPR, T7, tae e tre (úteis para expressão em Escheriehia eoli, Alealigenes e Pseudomonas); os promotores amy, apr, npre vários promotores de fago úteis para expressão em Bacillus subtilis, Bacillus Iieheniformis e Paenibacillus maeerans; nisA (úteis para expressão em bactéria Gram-positiva, Eichenbaum et ai., Appi Environ. MierobioL 64(8):2763-2769 (1998)); e o promotor sintético Ρ11 (útil para expressão em Lactobacillus plantarum, Rud et al., Microbiology 152:1011-1019 (2006)).

Regiões de terminação controle podem também ser derivadas de vários genes nativos para os hospedeiros preferidos. Opcionalmente, um sítio de terminação pode não ser necessário, no entanto, é preferido que seja incluído.

Certos vetores são capazes de replicação em uma ampla variedade de bactérias hospedeiras e podem ser transferidos por conjugação. A seqüência completa e apontada de pRK404 e três vetores pRK437, pRK442 e PRK442(H) estão disponíveis. Estes derivados provaram ser ferrramentas valiosas para manipulação genética em bactérias Gram-negativas (Scott et al., Plasmid 50(1):74-79(2003)). Diversos plasmídeos derivados de lncP4 de variedade ampla de hospedeiros do plasmídeo RSF1010 estão também disponíveis com promotores que podem funcionar em uma ampla variedade de bactérias Gram-negativas. Os plasmídeos pAYC36 e pAYC37, têm promotores ativos junto com sítios múltiplos de clonagem para permitir a expressão de gene heterólogo em bactéria Gram-negativa.

Ferramentas de reposição de gene cromossômico estão também amplamente disponíveis. Por exemplo, um variante termosensível do replicon de variedade ampla de hospedeiro pWV101 foi modificado para construir um plasmídeo pVE6002 que pode ser usado para efetuar reposição de gene em uma variedade de bactéria Gram-positiva (Maguin et al., J. Bacteriol. 147(17):5633-5638 (1992)). Adicionalmente, transpossomos in vitro estão disponíveis para criar mutações randômicas em uma variedade de genomas por meio de fontes comerciais tal como EPICENTRE®.

A expressão de uma via biossintética do isobutanol em vários hospedeiros microbianos preferidos está descrita em maiores detalhes abaixo.

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em e. cou

Vetores e cassettes úteis para a transformação de E.coli são comuns e estão comercialmente disponíveis por meio de empresas listadas acima. Por exemplo, os genes de uma via biossintética do isobutanol podem ser isolados a partir de várias fontes, clonados em um vetor pUC19 modificado e transformado no interior de E. coli NM522, como descrito nos Exemplos 6 e 7.

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Rhodococcus erythropous

Uma série de vetores do tipo ponte de E.coli-Rhodococcus estão disponíveis para expressão em R. erythropolis, incluindo mas não limitados a, pRHBR17 e pDA71 (Kostichka et al., Appl. Microbio. Biotechno!. 62:61-68 (2003)). Adicionalmente, uma série de promotores está disponível para expressão de gene heterólogo em R. erythropolis (ver, por exemplo, Nakashima et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:5557-5568 92004), e Tao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 2005, DOI 10.1007/s00253-005-0064). O rompimento do gene atingido dos genes cromossômicos em R. erythropolis pode ser criado usando-se o método descrito por Tao et al., acima, e Brans et al., (Appl. Environ. Microbiol. 66;2029-2036 (2000)).

Os genes heterólogos requeridos para a produção do isobutanol, como descrito acima, podem ser clonados inicialmente em pDA71 ou pRhBR71 e transformados no interior de E.coli. Os vetores podem então ser transformados em R. erythropolis por eletroporação, como descrito por Kostichka et al., acima. Os recombinantes podem ser cultivados em meio sintético contendo glicose e a produção do isobutanol pode ser seguida usando-se métodos conhecidos na técnica.

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em b. subtius

Métodos para expressão gênica e criação de mutações em B. subtilis são também bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os genes de uma via biossintética do isobutanol podem ser isolados de várias fontes, clonados no interior de um vetor pUC19 modificado e transformados no interior de Bacillus subtilis BE1010, como descrito no Exemplo 8. Adicionalmente, os cinco genes de uma via biossintética do isobutanol podem ser divididos no interior de dois operons para expressão, como descrito no Exemplo 20. Os três genes da via (bubB, HvD e kivD) foram integrados no interior de cromossomos de Bacillus subtilis BE1010 (Payne e Jackson1 J.Bacteriol. 173:2278-2282 (1991)). Os dois genes remanescentes (ilvC e bdhB) foram clonados em um vetor de expressão e transformados dentro de linhagem da Bacillus que transmite genes do isobutanol integrados.

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em b. licheniformis

A maioria dos plasmídeos e vetores tipo ponte que replicam em B. subtilis podem ser usados para transformar B. licheniformis, tanto por transformação protoplástica como por eletroporação. Os genes necessários para a produção do isobutanol podem ser clonados em plasmídeos derivados pBE20 ou pBE60 (Nagarajan et al., Gene 114;121-126 (1992)). Métodos para transformar B. licheniformis são bem conhecidos na técnica (por exemplo, ver Fleming et al, Appi Environ. Microbiol., 61(11):3775-3780 91995)). Os plasmídeos construídos para expressão em B. subtilis podem ser transformados no interior de B. licheniformis para produzir um hospedeiro microbiano que produz isobutanol.

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Paenibacillus macerans

Plasmídeos podem ser construídos como descrito acima para expressão em B. subtilis e usados para transformar Paenibacillus macerans por transformação protoplástica para produzir um hospedeiro microbiano recombinante que produz isobutanol.

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Alcaligenes (Ralstonia) eutrophus

Métodos para expressão gênica e criação de mutações em Alcaligenes eutrophus são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Taghavi et al., Appi Environ. Microbiol., 60(10):3585-3591 (1994)). Os genes para a via biossintética do isobutanol podem ser clonados em qualquer um de uma ampla variedade de vetores, e eletroporados para gerar recombinantes que produzem isobutanol. A via do poli(hidroxibutirato) em Alcaligenes foi descrita em detalhes, uma variedade de técnicas genéticas para modificar o genoma de Alcaligenes eutrophus é conhecida, e essas ferramentas podem ser aplicadas para engenheirar uma via biossintética do isobutanol. Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Pseudomonas putida Métodos para expressão gênica em Pseudomonas putida são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ben-Basset et al., Patente US 6.586.229, que é incorporada ao presente como referência). Os genes para a via biossintética do isobutanol podem ser inseridos no interior de pPCU18 e este DNA ligado pode ser eletroporado em células eletrocompetentes de Pseudomonas putida DOT-T1 C5aAR1 para gerar recombinantes que produzem isobutanol.

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Saccharomyces cerevisiae

Métodos para expressão gênica em Saccharomyces cerevisiae são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (part A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego1 CA). A expressão gênica em levedura tipicamente requer um promotor, seguido pelo gene de interesse, e um terminador transcricional. Uma variedade de promotores de levedura pode ser usada na construção de cassettes de expressão para genes que codificam uma via biossintética do isobutanol, incluindo, mas não limitado a promotores constitutivos FBA, GPD, ADH1 e GPM1 e promotores induzíveis GAL1, GAL10 e CUP1. Por exemplo, promotores adequados, terminadores transcricionais e os genes de uma via biossintética do isobutanol podem ser clonados no interior de vetores tipo ponte de E. coli-leveduras, como descrito no Exemplo 17.

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Lactobacillus plantarum

O gênero Lactobacillus pertence à família Lactobacillales e muitos plasmídeos e vetores usados na transformação de Bacillus subtilis e Streptococcus podem ser usados para Laetobaeillus. Exemplos não Iimitantes de vetores adequados incluem ρΑΜβΙ e derivados deste (Renault et al., Gene 183;175-182 (1996); e O'Sullivan et al., Gene 137:227-231 (1993)); pMBB1 e pHW800, um derivado de pMBB1 (Wyckoff et al., AppL Environ. MierobioL 62:1481-1486 (1996)); pMG1, um plasmídeo conjugado (Tanimoto et al., J. Baeteriol. 184:5800-5804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem et al., AppL Environ. Mierobiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al., AppL Environ. Mierobiol. 67:1262-1267 (2001)); e pAT392 (Arthur et al., Antimierob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994)). Diversos plasmídeos de Laetobaeillus plantarum forma também reportados (por exemplo, van Kranenburg R, Golic N, Bongers R, Leer RJ, de Vos WM, Siezen RJ, Kleerebezem M. Appl. Environ. Mierobiol. 2005 Mar; 71(3): 1223-1230). Por exemplo, a expressão de uma via biossintética do isobutanol em Laetobaeillus plantarum está descrita no Exemplo 21.

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium ε Enterococcus faecalis

O gênero Enterococcus pertence à família Lactobacillales e muitos plasmídeos e vetores usados na transformação de Laetobaeillus, Bacillus subtilis e Streptococcus podem ser usados para Enterococcus. Exemplos não Iimitantes de vetores adequados incluem pΑΜβΙ e derivados deste (Renault et al., Gene 183; 175-182 (1996); e O'SuIIivan et al., Gene 137:227-231 (1993)); pMBB1 e pHW800, um derivado de pMBB1, um plasmídeo conjugado (Tanimoto et al., J. Bacteríol. 184:5800-5804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al., Appi Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001)); e pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994)). A expressão de vetores para E. faecalis que usam o gene nisA de Lactococcus pode também ser usado (Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:2763- 2769 (1998). Adicionalmente, vetores para reposição de gene no cromossomo E. faecium podem ser usados (Nallaapareddy et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:334-345 (2006)). Por exemplo, a expressão de uma via biossintética do isobutanol em Enterococcus faecalis está descrita no Exemplo 22.

Meio de Fermentação

O meio de fermentação na presente invenção contém substratos de carbono adequados. Substratos de carbono adequados podem incluir, mas não estão limitados a, monossacarídeos, tais como glicose e frutose; oligossacarídeos, tais como lactose e sacarose; polissacarídeos, tais como amido ou celulose, ou misturas destes e misturas não purificadas de matérias primas renováveis, tal como soro de queijo saturado, água de maceração de milho, melaço de cana-de-açúcar e malte de cevada. Adicionalmente, o substrato de carbono pode também ser substrato de um carbono, tal como dióxido de carbono ou metanol, para os quais a conversão metabólica em intermediários bioquímicos chave foi demonstrada. Além disso, para substratos de um e dois carbonos, organismos metilotróficos são conhecidos por utilizar uma variedade de outros carbonos contendo compostos tais como metilamina, glicosamina e uma variedade de aminoácidos para atividade metabólica. Por exemplo, leveduras metilotróficas são conhecidas por utilizar o carbono a partir de metilamina para formar trealose ou glicerol (Bellion et al., Mierob. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7a (1993), 415-32. Editores: Murrell, J. Colli; Kelly, Don P.Publisher: Intercept1 Andover1 UK). De maneira similar, diversas espécies de Candida irão metabolizar alanina ou ácido oléico (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990)). Então é contemplado que a fonte de carbono utilizada na presente invenção pode englobar uma ampla variedade de substratos contendo carbono e somente será limitada pela escolha do organismo.

Embora esteja contemplado que todos os substratos de carbono mencionados acima e misturas destes sejam adequados na presente invenção, substratos de carbono preferidos são glicose, frutose e sacarose.

Além disso, para uma fonte de carbono apropriada, o meio de fermentação deve conter minerais adequados, sais, cofatores, tampões e outros componentes, conhecidos por aqueles técnicos no assunto, adequados para o crescimento de culturas e promoção da via enzimática necessária para a produção do isobutanol.

Condições de Cultura

Tipicamente células são cultivadas em temperaturas na faixa de 25°C a aproximadamente 40°C em meio apropriado. Meios de cultura adequados na presente invenção são meios comuns comercialmente, preparados como caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouraud Dextrose (SD) ou caldo de meio de levedura (YM). Outros meios de cultura definidos ou sintéticos podem também ser usados, e o meio apropriado para cultura de um microorganismo específico será bem conhecido para aquele técnico no assunto da ciência de microbiologia e fermentação. O uso de agentes conhecidos para modular repressão catabólica diretamente ou indiretamente, por exemplo, adenosina cíclica 2':3'-monofosfato, pode também ser incorporado no meio de reação.

Variações de pH adequadas para a fermentação estão entre pH 5,0 a pH 9,0, onde pH 6,0 a pH 8,0 é preferido como uma condição inicial.

Fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbicas ou anaeróbicas, onde condição anaeróbica ou microaeróbica são preferidas

A quantidade de isobutanol produzida no meio de fermentação pode ser determinada usando-se uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia gasosa (GC).

Fermentação Industrial em Batelada ε Contínua O presente processo emprega um método de fermentação em batelada. A fermentação em batelada clássica é um sistema fechado onde a composição do meio é estabelecida no início da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Dessa forma, no início da fermentação, o meio é inoculado com o microorganismo ou microorganismos desejados e permite-se que a fermentação ocorra sem que se adicione nada ao sistema. Tipicamente, no entanto, a fermentação em "batelada" é de batelada relativa à adição de fonte de carbono, e tenta ser produzida freqüentemente com fatores de controle, t ais como pH e concentração de oxigênio. Nos sistemas em batelada, o metabólito e composições da biomassa do sistema mudam constantemente até que o período de fermentação seja interrompido. Dentro das culturas em batelada, as células variam de uma fase estática lag e uma fase de crescimento log e finalmente para uma fase estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou parada. Se não tratadas, as células na fase estacionária irão eventualmente morrer. As células na fase log geralmente são responsáveis pelo volume de produção do produto final ou intermediário.

Uma variação no sistema de batelada padrão é o sistema em batelada alimentada. Os processos de fermentação em batelada alimentada são também adequados na presente invenção e compreendem um sistema em batelada típico, com exceção de que o substrato é adicionado em incrementos à medida que a fermentação progride. Os sistemas em batelada alimentada são úteis quando a repressão catabólica é capaz de inibir o metabolismo das células e onde é desejável ter quantidades limitadas de substrato no meio. Medições da concentração de substrato atual nos sistemas em batelada alimentada são difíceis, então é estimado com base nas mudanças de fatores mensuráveis como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de perda de gases, tal como CO2. Fermentações em batelada e em batelada alimentada são comuns e bem conhecidas na técnica e os exemplos podem ser encontrados em D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, ou Deshpande1 Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992), incorporado ao presente como referência.

Embora a presente invenção seja realizada em batelada, é contemplado que o método seria adaptável para métodos de fermentação contínua. A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um bioreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removido simultaneamente para processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade alta constante onde as células estão principalmente na fase log de crescimento.

A fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou a concentração do produto final. Por exemplo, um método irá manter um nutriente Iimitante tal como o nível da fonte de carbono ou nitrogênio em uma taxa fixa e permite todos os outros parâmetros regularem. Em outros sistemas, uma série de fatores que afetam o crescimento pode ser continuamente alterada enquanto a concentração celular, medida pela turbidez do meio, é mantida constante. Os sistemas contínuos tentam manter condições de crescimento em estado uniforme, e então a perda celular devido ao meio ser esgotado deve ser equilibrada em relação à taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos que modulam nutrientes e fatores de crescimento para os processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bem conhecidas na técnica de microbiologia industrial, e uma variedade de métodos é detalhada por Brock, acima.

É contemplado que a presente invenção pode ser praticada usando-se processos de batelada, b atelada alimentada ou contínua e que qualquer forma de fermentação seria adequada. Adicionalmente, é contemplado que as células podem ser imobilizadas em um substrato como catalisador celular completo e sujeitas a condições de fermentação para produção do isobutanol.

Métodos para Isolamento do Isobutanol do Meio de Fermentação

O isobutanol bioproduzido pode ser isolado do meio de fermentação usando-se métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os sólidos podem ser removidos do meio de fermentação por centrifugação, filtração, decantação ou similares. Então, o isobutanol pode ser isolado do meio de fermentação que foi tratado para remover sólidos como descritos acima, usando-se métodos tais como destilação, extração líquido-líquido, ou separação baseada em membrana. Devido ao isobutanol ter um ponto de ebulição baixo, mistura azeotrópica com água, a destilação pode somente ser usada para separar a mistura acima de sua .composição azeotrópica. A destilação pode ser usada em combinação com outros métodos de separação para obter separação do azeótropo. Métodos que podem ser usados em combinação com a destilação para isolar e purificar o isobutanol, incluem mas não estão limitados a, decantação, extração líquido-líquido, adsorção e técnicas baseadas em membrana. Adicionalmente, o isobutanol pode ser isolado usando-se destilação azeotrópica com utilização de um transmissor (ver, por exemplo, Doherty e Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGrawHill, Nova York, 2001). A mistura de isobutanol-água forma um azeótropo de forma que a destilação pode ser usada em combinação com a decantação para isolar e purificar o isobutanol. Neste método, o isobutanol que contém caldo de fermentação é destilado para próximo da composição azeotrópica. Então, a mistura azeotrópica é condensada, e o isobutanol é separado do meio de fermentação por decantação. A fase de decantação aquosa pode ser devolvida para a primeira coluna de destilação como refluxo. A fase orgânica decantada rica em isobutanol pode ser também purificada por destilação em uma segunda coluna de destilação.

O isobutanol pode também ser isolado do meio de fermentação usando-se extração líquido-líquido em combinação com a destilação. Neste método, o isobutanol é extraído do caldo de fermentação usando-se extração líquido-líquido com um solvente adequado. A fase orgânica contendo isobutanol é então destilada para separar o isobutanol do solvente.

A destilação em combinação com a adsorção pode ser também usada para isolar o isobutanol do meio de fermentação. Neste método, o caldo de fermentação contendo o isobutanol é destilado para próximo da composição azeotrópica e então a água remanescente é removida pelo uso de um adsorvente, tal como coador molecular (Aden et al., Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Aeid Prehydrolysis and Enzymatie Hydrolysis for Corn Stover, Relatório NREL/TP- 510-32438, National Renewable Energy Laboratory, June 2002).

Adicionalmente, a destilação em combinação com a pervaporação pode ser usada para isolar e purificar o isobutanol do meio de fermentação.

Neste método, o caldo de fermentação contendo o isobutanol é destilado para próximo da composição azeotrópica e então a água remanescente é removida por pervaporação através de uma membrana hidrofílica (Guo et al., J. Membr. Sei. 245, 199-210 (2004)). Exemplos

A presente invenção é também definida nos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que estes Exemplos, enquanto indicando realizações preferidas da invenção, são fornecidos somente a título ilustrativo. A partir das discussões acima e destes Exemplos, um técnico no assunto pode averiguar as características essenciais desta invenção, e sem se afastar do espírito e escopo desta, pode fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-la para vários usos e condições.

Métodos Gerais

Técnicas de DNA recombinante e de clonagem molecular usadas nos Exemplos são bem conhecidas na técnica e estão descritas por Sambrook, J. Fristsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) (Maniatis) e por T.J. Silhavy, M. L. Bennan, e L. W. Enquist, Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY (1984) e por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience (1987).

Materiais e métodos adequados para a manutenção e crescimento de culturas de bactérias são bem conhecidos na técnica. Técnicas adequadas para uso nos seguintes exemplos podem ser encontradas no Manual of Methods for General Bacteriology (Phillip Gerhardt, R.G.E. Muray, Ralph N. Costlow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg e G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) ou Thomas D. Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. Todos os reagentes e materiais usados para o crescimento e manutenção de células baterianas foram obtidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Life Technologies (Rockville, MD) ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que especificado de outra forma.

Linhagens microbianas forma obtidas da Coleção Americana de Tipos de Culturas (ATCC)1 Manassas1 VA1 a menos que apontado de outra forma.

Os primers de oligonucleotídeos para uso nos Exemplos seguintes são fornecidos na tabela 4. Todos os primers de oligonucleotídeos são sintetizados por Sigma-Genosys (Woodlands1 TX).

Tabela 4

<table>table see original document page 50</column></row><table> <table>table see original document page 51</column></row><table> <table>table see original document page 52</column></row><table> <table>table see original document page 53</column></row><table> <table>table see original document page 54</column></row><table> <table>table see original document page 55</column></row><table> <table>table see original document page 56</column></row><table> <table>table see original document page 57</column></row><table> <table>table see original document page 58</column></row><table>

Métodos para Determinação da Concentração de Isobutanol no Meio de

Cultura

A concentração de isobutanol no meio de cultura pode ser determinada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o método específico de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizou uma coluna uma coluna Shodex SH-1011 com uma coluna de controle Shodex SH-G1 ambas adquiridas da Waters Corporation (Milford, MA), com detecção de índice de refração (RI). A separação cromatográfica foi alcançada usando-se 0,01 M de H2SO4 como fase móvel em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e uma temperatura de coluna de 50°C. O isobutanol teve um tempo de retenção de 46,6 min sob condições usadas. Alternativamente, os métodos de cromatografia gasosa (GC) estão disponíveis. Por exemplo, um método GC específico utilizou uma coluna HP-INNOWax (30 m χ 0,53 mm id, filme de 1 pm de densidade, Agilent Technologies, Wilmington, DE), com um detector por ionização em chama (FID). O gás veículo foi o hélio a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/min, medido a 150°C com pressão de descarga constante, a fenda do injetor era 1:25 a 200°C, temperatura do forno era de 45°C por 1 min, 45 a 220°C a 10°C/min, e 220°C por 15 min; e a detecção FID foi empregada a 240°C com 26 mL/min de conjunto de gás hélio. O tempo de retenção do isobutanol foi de 4,5 min.

O significado das abreviações é como segue: "sec" significa segundo(s), "min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "psi" significa libras por polegada quadrada, "nm" significa nanômetro, "d" significa dia(s), "μι" significa microlitro(s), "mL" significa mililitro(s), "L" significa litro(s), "mm" significa milímetros, "nm" significa nanômetros, "nM" significa milimolar, "μΜ" significa micromolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "μιτιοΓ significa micromol(es), "g" significa grama(s), 'Vg" significa micrograma(s) e "ng" nanograma(s), "PCR" significa reação em cadeia da polimerase, "OD" significa densidade ótica, Όϋβοο" significa densidade ótica medida a um comprimento de onda de 600 nm, "kDa" significa kilodaltons, "g" significa constante de gravitação, "bp" significa pares de bases, "kbp" significa pares de kilobase, "% w/v" significa percentual de peso/volume, "% v/v" significa percentual de volume/volume, "IPTG" significa isopropil-P-D- tiogalactopiranoisídeo, "RBS" significa sítio de ligação de ribossomo, "HPLC" significa cromatografia líquida de alta eficiência, "GC" significa cromatografia gasosa. O termo "seletividade molar" é o número de moles do produto produzido por mol de substrato açúcar consumido e é reportado como um percentual.

Exemplo 1

Clonagem ε Expressão de Acetolactato Sintase

O propósito deste Exemplo foi clonar o gene budB de Klebsiella pneumoniae e expressá-lo em E. coli BL21-AI. O gene budB foi amplificado a partir do DNA genômico linhagem ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae usando-se PCR1 resultando em um produto de 1,8 kbp.

O DNA genômico foi preparado usando-se o kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). O gene budB foi amplificado a partir do DNA genômico de Klebsiella pneumoniae por PCR usando-se os primers N80 e N81 (ver Tabela 2), fornecido como SEQ ID Nos: 11 e 12, respectivamente. Outros reagentes para amplificação de PCR foram fornecidos em kits de fabricantes, por exemplo, Finnzymes Phusio™ Master Mix PCR de Alta Fidelidade (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; catalog no. F-531) e usados de acordo com o protocolo do fabricante. A amplificaçâo foi realizada em um DNA Thermocycler GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

Para estudos da expressão a tecnologia de clonagem Gateway (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) foi usada. O vetor de entrada pENTRSDD- TOPO permitiu clonagem direcional e forneceu uma seqüência Shine-Dalgarno para o gene de interesse. O vetor de destino pDEST14 usou um promotor T7 para expressão do gene sem tag. O primer forward incorporou quatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitir clonagem direcional no interior de pENTRSDD-TOPO (Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPObudB. A construção pENTR foi transformada no interior de células E. coli TopIO (Invitrogen) e plaqueadas de acordo com as recomendações do fabricante. Os transformantes foram cultivados durante a noite e o plasmídeo de DNA foi preparado usando-se o kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, CA; catalog n° 27106) de acordo com as recomendações do fabricante. Os clones foram sequenciados para confirmar se os genes foram inseridos na orientação correta e para confirmar a seqüência. A seqüência de nucleotídeos do quadro aberto de leitura (OFR) para este gene e a seqüência de aminoácido prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0:1, respectivamente.

Para criar um clone de expressão, o gene budB foi transferido para o vetor pDEST4 por recombinação para gerar pDEST14budB. O vetor pDEST14budB foi transformado no interior de células E. coli BL21-AI (Invitrogen). Os transformantes foram inoculados em meio Luria Bertani (LB) suplementado com 50 pg/ml de ampicilina. A cultura foi incubada a 37°C com agitação até que a OD6oo atingisse 0,6-0,8. A cultura foi separada em duas culturas de 25 ml e foi adicionado arabinose a um dos frascos até uma concentração final de 0,2% w/v. O frasco controle negativo não foi induzido com arabinose. Os frascos foram incubados por 4 h a 37°C.com agitação. As células foram colhidas por centrifugação e os pellets de células foram ressuspensos em 50 nM MOPS, tampão pH 7,0. As células foram rompidas tanto por sonicação como por passagem através de uma Célula de Pressão Francesa. O Iisado total de células foi centrifugado produzindo o sobrenadante, ou extrato livre de células e o pellet, ou a fração insolúvel. Uma alíquota de cada fração (lisado total de células, extrato livre de células ou a fração insolúvel) foi ressuspensa em SDS (MES) tampão de carga (Invitrogen), aquecido a 85°C por 10 min e sujeitos a análise SDS-PAGE (NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel, catálogo n° NP0322Box, Invitrogen). Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 60 kDa, como deduzido a partir da seqüência de ácido nucléico, estava presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido.

A atividade de acetolactato sintase nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Bauerle et al. (Biochim. Biophys. Acta 92(1):142-149 (1964)).

Exemplo 2 (Profético) Clonagem ε Expressão de Ácido Acetohidroxi Redutoisomerase

O propósito deste Exemplo é descrever como clonar o gene HvC de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli BL21-AI. O gene ilvC é amplificado a partir do DNA genômico de E.coli usando-se PCR.

O gene HvC é clonado e expressado da mesma maneira que o gene budB descrito no Exemplo 1. O DNA genômico de E. coli é preparado usando-se o kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). O gene ilvC é amplificado por PCR usando-se os primers N100 e N101 (ver Tabela 2), fornecido como SEQ ID Nos:13 e 14, respectivamente, criando um produto de 1,5 kbp. O primer forward incorporou quatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitir clonagem direcional no interior do pENTRSDD-TOPO (Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPOilvC. Os clones são sequenciados para confirmar se os genes são inseridos na orientação correta e para confirmar a seqüência. A seqüência de nucleotídeos do quadro aberto de leitura (OFR) para este gene e a seqüência de aminoácido prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID N0:3 e SEQ ID NO:4, respectivamente.

Para criar um clone de expressão, o gene HvC é transferido para o vetor pDEST 14 (Invitrogen) por recombinação para gerar pDEST14ilvC. O vetor pDEST14ilvC é transformado no interior de células E. coli BL21-AI e a expressão a partir do promotor T7 é induzida pela adição de arabinose. Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 54 kDa, como deduzido a partir da seqüência de ácido nucléico, está presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido.

A atividade de ácido acetohidroxi redutoisomerase nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Arfin e Umbarger. (J. Biol. Chem. 244(5): 1118-1127 (1969)).

Exemplo 3

Clonagem ε Expressão de Ácido Acetohidroxi Desidratase

O propósito deste Exemplo é descrever como clonar o gene ilvD de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli BL21-AI. O gene HvD é amplificado a partir do DNA genômico de E.coli usando-se PCR.

O gene ilvD é clonado e expressado da mesma maneira que o gene budB descrito no Exemplo 1. O DNA genômico de E. coli é preparado usando-se o kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). O gene ilvD é amplificado por PCR usando-se os primers N102 e N103 (ver Tabela 2), fornecido como SEQ ID Nos:15 e 16, respectivamente, criando um produto de 1,9 kbp. O primer forward incorporou quatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitir clonagem direcional no interior do pENTRSDD-TOPO (Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPOilvD. Os clones são submetidos ao sequenciamento para confirmar se os genes são inseridos na orientação correta e para confirmar a seqüência. A seqüência de nucleotídeos do quadro aberto de leitura (OFR) para este gene e a seqüência de aminoácido prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, respectivamente.

Para criar um clone de expressão, o gene ilvD é transferido para o vetor pDEST 14 (Invitrogen) por recombinação para gerar pDEST14ilvD. O vetor pDEST14ilvD é transformado no interior de células E. coli BL21-AI e a expressão a partir do promotor T7 é induzida pela adição de arabinose. Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 66 kDa, como deduzido a partir da seqüência de ácido nucléico, está presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido.

A atividade de ácido acetohidroxi desidratase nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Flint et al. (J. Biol. Chem. 268(20): 14732-14742 (1993)).

Exemplo 4 (Profético)

Clonagem ε Expressão de Keto-ácido Descarboxilase de Cadeia Ramificada

O propósito deste Exemplo é descrever como clonar o gene kivD de Lactococcus Iactis e expressá-lo em E. coli BL21-AI.

A seqüência de DNA que codifica keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada (kivD) de L. Iaetis é obtido pela GenScript (Piscataway, NJ).

A seqüência obtida é de códon otimizado para expressão tanto em E. coli como B. subtilis e é clonada no interior de pUC57, para formar pUC57-kivD. A seqüência de nucleotídeo de códon otimizado do quadro aberto de leitura (ORF) para este gene e a seqüência de aminoácidos prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, respectivamente.

Para criar um clone de expressão, sítios de restrição Ndel e BamHI são usados para clonar o fragmento 1,7 kbp kivD de pUC57-kivD no interior do vetor pET-3a (Novagen, Madison, Wl). Isto cria o clone de expressão pET-3a-kivD. O vetor pET-3a-kivD é transformado no interior de células E. coli BL21-AI e a expressão a partir do promotor T7 é induzida pela adição de arabinose. Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 61 kDa, como deduzido a partir da seqüência de ácido nucléico, está presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido.

A atividade de keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Smit et al. (Appl.Microbiol. Biotechnol 64:396-402 (2003)).

Exemplo 5 (Profético)

Clonagem E Expressão de Ácool Desidrogenase de Cadeia Ramificada

O propósito deste Exemplo profético é descrever como clonar o gene yqhD de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli BL21-AI. O gene yqhD é amplificado a partir do DNA genômico de E.coli usando-se PCR.

O gene yqhD é clonado e expressado da mesma maneira que o gene budB descrito no Exemplo 1. O DNA genômico de E. coli é preparado usando-se o kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). O gene yqhD é amplificado por PCR usando-se os primers N104 e N105 (ver Tabela 2), fornecidos como SEQ ID Nos:17 e 18, respectivamente, criando um produto de 1,2 kbp. O primer forward incorpora quatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitir clonagem direcional no interior do pENTRSDD-TOPO (Invitrogen) para gerar o plasmídeo ρENTRSDD-TOPOyqArD. Os clones são submetidos ao sequenciamento para confirmar se os genes são inseridos na orientação correta e para confirmar a seqüência. A seqüência de nucleotídeos do quadro aberto de leitura (OFR) para este gene e a seqüência de aminoácido prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente.

Para criar um clone de expressão, o gene yqhD é transferido para o vetor pDEST 14 (Invitrogen) por recombinação para gerar pDEST14yq/7D. O vetor pDEST14yqfrD é transformado no interior de células E. coli BL21-AI e a expressão a partir do promotor T7 é induzida pela adição de arabinose. Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 42 kDa, como deduzido a partir da seqüência de ácido nucléico, está presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido. A atividade de álcool desidrogenase de cadeia ramificada nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Sulzenbacher et al. (J. Mol. Biol. 342(2):489-502 (2004)).

Exemplo 6 (Profético) Construção de um Vetor de Transformação para os Genes em uma Via

Biossintética do Isobutanol

O propósito deste Exemplo profético é descrever como construir um vetor de transformação que compreende os genes que codificam as cinco etapas de uma via biossintética do isobutanol. Todos os genes são colocados em um único operon sob o controle de um único promotor. Os genes individuais são amplificados por PCR com primers que incorporam sítios de restrição para posterior clonagem e os primers forward contém um sítio de ligação de ribossomo de E. coli otimizado (AAAGGAGG). Os produtos de PCR são clonados TOPO no interior do vetor pCR4Blunt-TOPO e transformados no interior de células E. coli TopIO (Invitrogen). O plasmídeo de DNA é preparado a partir de clones TOPO e a seqüência dos genes é verificada. Enzimas de restrição e T4 DNAIigase (New England Biolabs, Beverly1 MA) são usadas de acordo com as recomendações do fabricante. Para experimentos de clonagem, fragmentos de restrição são purificados em gel usando-se kit de Extração em Gel QIAquick (Qiagen). Após confirmação da seqüência, os genes são subclonados no interior de um vetor pUC19 modificado como uma plataforma de clonagem. O vetor pUC19 é modificado por digestão HindIII/Sapl, criando pUC19dHS. A digestão remove o promotor Iac adjacente ao MCD (sítio de clonagem múltiplo), prevenindo transcrição dos operons no vetor.

O gene budB é amplificado a partir do DNA genômico de K. pneumoniae ATCC 25955 por PCR usando-se os primers N110 e N111 (ver Tabela 2), fornecidos como SEQ ID Nos:19 e 20, respectivamente, criando um produto de 1,8 kbp. O primer forward incorpora sítios de restrição Sphl e Aflll e um sítio de ligação de ribossomo (RBS). O primer reverso incorpora sítios de restrição Pacl e Nsil. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 Blunt- TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-budB. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a seqüência do gene é verificada.

O gene ilvC é amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12 por PCR usando-se o par de primer N112 e N113 (ver Tabela 2) fornecidos como SEQ ID NOs: 21 e 22, respectivamente, criando um produto de 1,5 kbp. O primer forward incorpora sítios de restrição Sall e Nhel e um RBS. O primer reverso incorpora um sítio de restrição Xbal. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 BIunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-ilvC. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a seqüência do gene é verificada.

O gene ilvD é amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12 por PCR usando-se o par de primer N114 e N115 (ver Tabela 2) fornecidos como SEQ ID NOs: 23 e 24, respectivamente, criando um produto de 1,9 kbp. O primer forward incorpora um sítio de restrição Xbal e um RBS. O primer reverso incorpora um sítio de restrição BamHI. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 BIunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-ilvD. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a seqüência do gene é verificada.

O gene kivD é amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12 por PCR usando-se o par de primer N116 e N117 (ver Tabela 2) fornecidos como SEQ ID NOs: 25 e 26, respectivamente, criando um produto de 1,7 kbp. O primer forward incorpora um sítio de restrição BamHI e um RBS. O primer reverso incorpora um sítio de restrição Saci. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 BIunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-/c/VD. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a seqüência do gene é verificada. O gene yqhD é amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12 por PCR usando-se o par de primer N118 e N119 (ver Tabela 2) fornecidos como SEQ ID NOs: 27 e 28, respectivamente, criando um produto de 1,2 kbp. O primer forward incorpora um sítio de restrição Saci. O primer reverso incorpora sítios de restrição Spel e EcoRI. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 BIunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-ygftD. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a seqüência do gene é verificada.

Para construir o operon da via do isobutanol, o gene yqhD é removido do pCR4 Blunt-TOPO-ygftD com Sacl e EcoRI, liberando um fragmento de 1,2 kbp. Este é ligado ao pUC19dHS, que foi previamente digerido com Sacl e EcoRI. O clone resultante, pUC19dHS-yqhD é confirmado por digestão de restrição. Em seguida, o gene HvC é removido do pCR4 Blunt- TOPO-HvC com Sall e Xbal, liberando um fragmento de 1,5 kbp. Este é ligado ao pUC19dHS-yqhD, que foi previamente digerido com Sall e Xbal. O clone resultante, pUC19dHS-ilvC-yqhD é confirmado por digestão de restrição. O gene budB é então removido do pCR4 Blunt-TOPO-òudS com Sphl e Nsil, liberando um fragmento de 1,8 kbp. pUC19dHS-ilvC-yqhD é digerido com o fragmento Sphl/Nsil budB (Nsil e Pstl geram terminações compatíveis), formando pUC19dHS-budB-ilvC-yqhD. Um fragmento de 1,9 kbp contendo o gene ilvD é removido é removido do pCR4 Blunt-TOPO-/'/vD com Xbal e BamHI e ligado ao pUC19dHS-budB-ilvC-yqhD, que é digerido com estas mesmas enzimas, formando pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-yqhD. Finalmente, kivD é removido é removido do pCR4 Blunt-TOPO-/c/VD com BamHI e Saci, liberando um fragmento de 1,7 kbp. Este fragmento é ligado ao pUC19dHS-budB-ilvC- ilvD-yqhD, que foi previamente digerido com BamHI e Saci, formando pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD.

O vetor pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD é digerido com Aflll e Spel para liberar um fragmento de operon de 8,2 kbp que é clonado no interior de pBenAS, um vetor tipo ponte de E. coli-B. subtilis. O plasmídeo pBenAS é criado por modificação do vetor pBE93, que é descrito por Nagarajan, (documento WO 93/24631, Exemplo 4). Para fazer pBenAS o promotor de protease neutro (NPR) de Bacillus amyloliquefaciens, seqüência sinal e o gene phoA são removidos com um Ncol/Hindlll de digestão de pBE93. O promotor NPR é amplificado por PCR a partir de pBE93 pelos primers BenNF e BenASR, fornecidos como SEQ ID NOs: 29 e 30, respectivamente. O primer incorpora os sítios Aflll, Spel e Hindlll a jusante do promotor. O produto PCR é digerido com Ncol e Hindlll e o fragmento é clonado nos sítios correspondentes no vetor, criando pBenAS. O fragmento do operon é subclonado no interior dos sítios Aflll e Spel em pBenAS, criando pBen-budB- ilvC-ilvD-kivD-yqhD.

Exemplo 7 (Profético)

Expressão da Via Biossintética do Isobutanol em £. coli

O propósito deste Exemplo profético é descrever como expressar uma via biossintética do isobutanol em E. coli.

O plasmídeo pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD, construído como descrito no Exemplo 6, é transformado no interior de E.coli NM522 (ATCC No 47000) para fornecer a linhagem E.coli NM522/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD e a expressão dos genes no operon é monitorada por análise SDS-PAGE, teste de enzima e análise Western blot. Para Western blots, os anticorpos são construídos para peptídeos sintéticos por Sigma-Genosys (The Woodlands, TX).

A linhagem E. coli NM522/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD é inoculada em um frasco de agitação de 250 ml contendo 50 ml de meio e agitado a 250 rpm e 35°C. O meio é composto de: glicose (5 g/l), MOPS (0,05 M), sulfato de amônio (0,01 M), fosfato de potássio, monobásico (0,005 M), mistura de metal S10 (1% (v/v)), extrato de levedura (0,1% (w/v)), ácido casamino (0,1% (w/v), tiamina (0,1 mg/L), prolina (0,05 mg/L) e biotina (0,002 mg/L), e é titulado a pH 7,0 com KOH. A mistura de metal S10 contém: MgCb (200 mM), CaCI2 (70 mM), MnCI2 (5 mM), FeCI3 (0,1 mM), ZnCI2 (0,1 mM), hidrocloreto de tiamina (0,2 mM), CuSO4 (172 μΜ), CoCI2 (253 μΜ) e Na2MoO4 (242 μΜ). Após 18h, o isobutanol é detectado por HPLC ou análise GC, usando-se métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na seção de Métodos Gerais acima.

Exemplo 8 (Profético)

Expressão da Via Biossintética do Isobutanol em Bacillus subtius

O propósito deste Exemplo profético é descrever como expressar uma via biossintética do isobutanol em Bacillus subtilis. A mesma abordagem, como descrito no Exemplo 7, é usada.

O plasmídeo pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD, construído como descrito no Exemplo 6, é usado. Este plasmídeo é transformado no interior de Bacillus subtilis BE1010 (J. Bacterioi 173:2278-2282 (1991)) para fornecer a linhagem B. subtilis BE1010/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD e a expressão dos genes no operon é monitorada como descrito no Exemplo 7.

A linhagem B. subtilis BE1010/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD- yqhD é inoculada em um frasco de agitação de 250 mL contendo 50 mL de meio e agitado a 250 rpm e 35°C por 18h. O meio é composto de: dextrose (5 g/L), MOPS (0,05 M), ácido glutâmico (0,02 M), sulfato de amônia (0,01 M), fosfato de potássio, tampão monobásico (0,005 M), mistura de metal S10 (como descrito no exemplo 11, 1% (v/v)), extrato de levedura (0,1% (w/v)), ácido casamino (0,1% (w/v), triptofano (50 mg/L), metionina (50 mg/L) e Iisina (50 mg/L), e é titulado a pH 7,0 com KOH.

Após 18h, o isobutanol é detectado por HPLC ou análise GC, usando-se métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na seção de Métodos Gerais acima. Exemplo 9

Clonagem ε Expressão de Acetolactato Sintase Para criar outro clone de expressão de acetolactato sintase, o gene budB foi clonado no interior do vetor pTrc99A. O gene budB foi inicialmente amplificado a partir de pENTRSDD-TOPObudB (descrito no Exemplo 1) usando-se primers (N110.2 e N111.2, fornecidos como SEQ ID Nos:31 e 32, respectivamente, que introduzem sítios Sac/, Spel e Mfel na terminação 5' e sítios BbvCI, Aflll e BamHI na terminação 3'. O produto de PCR resultante de 1,75 kbp foi clonado no interior de pCR4-Blunt TOPO (Invitrogen) e a seqüência de DNA foi confirmada (usando-se primers de sequenciamento N130Seq F1-F4 e R1-R4, fornecidos como SEQ ID Nos: 40-47, respectivamente). O gene budB foi então removido deste vetor usando-se Sacl e BamHI e clonado no interior de pTrc99A (Amann et al. Gene 69(2):301-315 (1988)), gerando pTrc99A::budB. O vetor pTrc99A::budB foi transformado no interior de células E. coli TOP10 e os transformantes foram inoculados em meio LB suplementado com 50 pg/mL de ampicilina e cultivados durante a noite a 37°C. Uma alíquota desta cultura foi usada para inocular 50 mL do meio LB suplementado com 50 pg/mL de ampicilina. A cultura foi incubada a 37°C com agitação até que a ΟD6οο atingisse 0,6-0,8. A expressão de budB do promotor Trc foi então induzida pela adição de 0,4 mM de IPTG. Os frascos controle negativo f oram também preparados de forma não induzida com IPTG. Os frascos foram incubados por 4 h a 37°C com agitação. Os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1.

A atividade de acetolactato sintase nos extratos livres de células foi medida como descrito no Exemplo 1. Três horas após a indução com IPTG, a atividade de acetolactato sintase de 8 unidades/mg foi detectada. A linhagem controle carregando somente o plasmídeo pTrc99A exibiu 0,33 unidades/mg de atividade de acetolactato sintase. Exemplo 10

Clonagem ε Expressão de Ácido Acetohidroxi Redutoisomerase

O propósito deste Exemplo foi cionar o gene HvC de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli TOP10. 0 gene HvC foi amplificado a partir do DNA genômico da linhagem FM5 (ATCC 53911) de E. coli K12 usando- se PCR.

O gene HvC foi clonado e expressado de uma maneira similar como descrito para a clonagem e expressão de HvC no Exemplo 2 acima. PCR foi usado para amplificar ilvC do genoma de E. coli FM5 usando-se os primers N112.2 e N113.2 (SEQ ID Nos:33 e 34, respectivamente). Os primers criaram sítios Sac/ e AfIIW e um RBS otimizado na terminação 5' e sítios BamHI na terminação 3' de ilvC. O produto de PCR de 1,5 kbp foi clonado no interior de pCR4-Blunt TOPO de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen) gerando pCR4BluntTOPO::ilvC. A seqüência do produto de PCR foi confirmada usando-se primers de sequenciamento (N131SeqF1-F3, e N131SeqR1-R3, fornecidos como SEQ ID NOs:48-53, respectivamente). Para criar um clone de expressão, o gene ilvC foi removido do pCR4BluntTOPO::ilvC usando-se Sacl e BamHI e clonado no interior de pTrc99A. O vetor pTrc99A::ilvC foi transformado no interior de células E. coli TOPIO e a expressão do promotor Tcr foi induzida pela adição de IPTG1 como descrito no Exemplo 9. Os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1.

A atividade de ácido acetohidroxi redutoisomerase nos extratos livres de células foi medida como descrito no Exemplo 2. Três horas após a indução com IPTG, a atividade de ácido acetohidroxi redutoisomerase de 0,026 unidades/mg foi detectada. A linhagem controle carregando somente o plasmídeo pTrc99A exibiu 0,001 unidades/mg de atividade de ácido acetohidroxi redutoisomerase. Exemplo 11

Clonagem ε Expressão de Ácido Acetohidroxi Desidratase

O propósito deste Exemplo foi clonar o gene ilvD de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli TOP10. O gene ilvD foi amplificado a partir do DNA genômico da linhagem FM5 (ATCC 53911) de E. coli K12 usando-se PCR.

O gene ilvD foi clonado e expressado de uma maneira similar como descrito para a clonagem e expressão de ilvC no Exemplo 10. PCR foi usado para amplificar HvD do genoma de E. coli FM5 usando-se os primers N114.2 e N115.2 (SEQ ID Nos:35 e 36, respectivamente). Os primers criaram sítios Sacl e Nhel e um RBS otimizado na terminação 5' e sítios Bsu361, Pacl e BamHI na terminação 3' de ilvD. O produto de PCR de 1,9 kbp foi clonado no interior de pCR4-Blunt TOPO de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen) gerando pCR4BluntTOPO::ilvD. A seqüência do produto de PCR foi confirmada usando-se primers de sequenciamento (N132SeqF1-F4, e N132SeqR1-R4, fornecidos como SEQ ID NOs:54-61, respectivamente). Para criar um clone de expressão, o gene ilvD foi removido do pCR4BluntTOPO::ilvD usando-se Sacl e BamHI e clonado no interior de pTrc99A. O vetor pTrc99A::ilvD foi transformado no interior de células E. coli TOPIO e a expressão do promotor Tcr foi induzida pela adição de IPTG, como descrito no Exemplo 9. Os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1.

A atividade de ácido acetohidroxi d esidratase η os extratos livres de células foi medida como descrito no Exemplo 3. Três horas após a indução com IPTG, a atividade de ácido acetohidroxi desidratase de 46 unidades/mg foi medida. A linhagem controle carregando somente o plasmídeo pTrc99A exibiu atividade não detectável de ácido acetohidroxi desidratase. Exemplo 12

Clonagem ε Expressão de Keto-ácido Descarboxilase de Cadeia

Ramificada

O propósito deste Exemplo foi clonar o gene kivD de Lactococcus Iactis e expressá-lo em E. coli TOPIO.

O gene kivD foi clonado e expressado de uma maneira similar como descrito para a clonagem e expressão de HvC no Exemplo 10 acima. PCR foi usado para amplificar kivD do plasmídeo pUC57-kicD (ver Exemplo 4, acima) usando-se os primers N116.2 e N117.2 (SEQ ID Nos:37 e 38, respectivamente). Os primers criaram sítios Sac/ e Pael e um RBS otimizado na terminação 5' e sítios Peil, Avrll, BgIW e BamHI na terminação 3' de kivD. O produto de PCR de 1,7 kbp foi clonado no interior de pCR4-Blunt TOPO de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen) gerando pCR4BluntTOPO::/c/VD. A seqüência do produto de PCR foi confirmada usando-se primers N132SeqF1-F4, e N132SeqR1-R4 (fornecidos como SEQ ID NOs:62-69, respectivamente). Para criar um clone de expressão, o gene kivD foi removido do plasmídeo pCR4BluntTOPO::/(/VD usando-se Sacie BamHI, e clonado no interior de pTrc99A. O vetor pTrc99A::/aVD foi transformado no interior de células E. coli TOPIO e a expressão do promotor Tcr foi induzida pela adição de IPTG, como descrito no Exemplo 9. Os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1.

A atividade de keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada nos extratos livres de células foi medida como descrito no Exemplo 4, exceto que o reagente Purplap® (Aldrich, número de catálogo 162892) foi usado para detectar e quantificar os produtos da reação de aldeído. Três horas após a indução com IPTG, a atividade de keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada de mais de 3,7 unidades/mg foi detectada. A linhagem controle carregando somente o plasmídeo pTrc99A exibiu atividade não detectável de keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada. EXEMPLO 13 EXPRESSAO DE ALCOOL DESIDRATASE DE CADEIA RAMIFICADA

E. coli contém um gene nativo {yqhD) que foi identificado como uma propanodiol desidrogenase (Patente US 6.514.733). A proteína Yqhd tem 40% de identidade com AdhB (codificada pelo adhB) de Clostridium1 uma suposta butanol desidrogenase dependente de NADH. O gene yqhD foi colocado sob expressão constitutiva de um variante do promotor glicose isomerase 1.6GI (SEQ ID N0:70) em linhagem de E. coli MG1655 1.6yqhD::Cm (documento WO 2004/-33646) usando-se tecnologia λ Vermelho (Datsenko e Wanner, Proc. Nati Acad. Sei. USA. 97:6640 (2000)). MG1655 1.6yqhD::Cm contém um cassette FRT-CmR-FRT1 de forma que o antibiótico marcador pode ser removido. De maneira similar, o promotor nativo foi substituído pelo promotor 1.5GI (documento WO 2033/089621) (SEQ ID NO.71), criando a linhagem MG1655 1.5GI-yqhD::Cm, então, substituindo o promotor de MG1655 1.6yqhD::Cm pelo promotor 1.5GI.

A linhagem MG1655 1.5GI-yqhD::Cm foi cultivada em meio LB até o meio da fase Iog e os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1. Revelou-se que esta linhagem possui atividade de isobutiraldeído redutase dependente de NADPH quando os extratos de células foram analisados seguindo a diminuição na absorbância a 340 nm em pH 7,5 e 35°C.

Para gerar uma segunda linhagem de expressão contendo. 1.5GI- yqhD::Cm, uma fase P1 foi preparada a partir de MG1655 1.5GI yqhD::Cm e o cassette foi transferido para BL21 (DE3) (Invitrogen) por transdução, criando BL21 (DE3) 1.5GI yqhD::Cm.

EXEMPLO 14 CONSTRUCAO DE UM VETOR DE TRANSFORMACAO PARA OS PRIMEIROS QUATRO GENES EM UMA VIA BIOSSINTETICA DO ISOBUTANOL

O propósito deste Exemplo foi construir um vetor de transformação que compreende os primeiros quatro genes (isto é, budB, HvCl HvD e kivD) em uma via biossintética do isobutanol.

Para construir o vetor de transformação, primeiro, o gene HvC foi obtido a partir de Trc99::ilvC (descrito no Exemplo 10) por digestão com AfIW e BamHI e clonado no interior de pTrc99A::budB (descrito no exemplo 9), que foi digerido com AfIW e BamH\ para produzir o plasmídeo pTrc99A::budB-ilvC. Depois, os genes ilvD e kivD foram obtidos a partir de pTrc99A::budB-ilvD (descrito no Exemplo 11) e pTrc99A::kivD (descrito no Exemplo 12), respectivamente, por digestão com Nhel e Pacl (ilvD) e Pacl e BamHI (kivD). Estes genes foram introduzidos no interior de pTrc99A::budB-ilvC, que primeiro foi digerido com Nhel e BamHI, por três formas de ligação. A presença de todos os quatro genes no plasmídeo final, pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD, foi confirmada por seleção PCR e digestão de restrição.

Exemplo 15

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol no Cultivo de e. coli em Glicose

Para criar as linhagens de E. coli de produção de isobutanol, pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD (descrito no Exemplo 14) foi transformado no interior de E. coli MG1655 1.5GI yqhD::Cm e E. coli (DE3) 1.5GI yqhD::Cm (descrito no Exemplol3). Os transformantes foram inicialmente cultivados em meio LB contendo 50 pg/mL de kanamicina e 100 pg/mL de carbenicilina. As células destas culturas foram usadas para inocular frascos com agitação (aproximadamente 175 mL de volume total), contendo 50 a 170 mL de meio TM3a/glicose (com antibióticos apropriados) para representar condições de oxigênio alta e baixa, respectivamente. O meio TM3a/glicose continha (por litro): glicose (10 g), KH2PO4 (13,6 g), ácido cítrico monohidrato (2,0 g), (NH4)2SO4 (3,0 g), MgSO4 7H20 (2.0 g), CaCI2 2H20 (0,2 g), citrato de amônia férrico (0,33 g), diamina HCI (1,0 mg), extrato de levedura (0,50 g) e 10 mL de solução de elementos traço. O pH foi ajustado para 6,8 com NH4OH. A solução de elementos traço continha: ácido cítrico H2O (4,0 g/l), MnSO4 H2O (3,0 g/L), NaCI (1,0 g/L), FeSO4 7H20 (0,10 g/L), CoCI2 6 H2O (0,10 g/L), ZnSO4 7H20 (0,10 g/L), CuSO4 5H20 (0,010 g/L), H3BO3 (0,010 g/L) e Na2MoO4 2H20 (0,010 g/L).

Os frascos foram inoculados até um início de Οϋβοο □ 0,01 unidades e incubados a 34° C com agitação a 300 rpm. Os frascos contendo 50 mL do meio foram fechados com tampas de filtro 0,2 pm; os frascos contendo 150 mL de meio foram fechados com tampas lacradas. IPTG foi adicionado até uma concentração final de 0,04 mM quando as células atingiram uma OD6OO Π 0,4 unidades. Aproximadamente após 18 h de indução, uma alíquota do caldo foi analisada por HOLC (coluna Shodex Sugar SH1011 (Showa Denko America, Inc. NY) com detecção do índice de refração (RI)) e GC (Va ria η CP-WAX 58(FFAP) CB1 0,25 mm χ 0,2 pm χ 25 m (Varian, Inc., Palo Alto, CA) com detecção por ionização em chama (FID)) para o conteúdo de isobutanol, como descrito na seção de Métodos Gerais. Não foi detectado isobutanol nas linhagens controle que carregam somente o vetor pTrc99A (resultados não mostrados). Seletividades molares e titulações de isobutanol produzidas por linhagens que carregam pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD estão mostradas na Tabela 5. Titulações significantemente altas de isobutanol foram obtidas nas culturas de crescimento sob baixas condições de oxigênio.

Tabela 5

Produção de Isobutanol por Linhagens de E.Coli Cultivadas em Glicose

<table>table see original document page 77</column></row><table> <table>table see original document page 78</column></row><table>

* Determinado por HPLC.

Exemplo 16

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol no Cultivo de e. coli em Sacarose

Já que as linhagens descritas no Exemplo 15 não foram capazes de crescer em sacarose, um plasmídeo adicional foi construído para permitir a utilização da sacarose para a produção do isobutanol. O grupamento de gene de utilização da sacarose cscBKA, fornecido como SEQ ID NO:39, foi isolado do DNA genômico de uma linhagem de E.coli que utililiza sacarose derivada da linhagem ATCC 13281. Os genes de utilização da sacarose (cscA, cscK e cscB) codificam uma hidrolase sacarose (CscA)1 fornecidos como SEQ ID NO:39, D-frutoquinase (CscK), fornecido como SEQ ID NO:140, e sacarosepermease (CscB), fornecido como SEQ ID NO:141. O gene repressor específico para sacarose cscR não foi incluído, de forma que os três genes cscBKA foram expressados constitutivamente a partir de seus promotores nativos em E.coli.

O DNA genômico da linhagem de E. coli que utiliza sacarose foi digerido por completo com BamHI e EcoR\. Fragmentos com uma média de tamanho de aproximadamente 4 kbp foram idolados a partir de um gel agarose e foram ligados ao plasmídeo pLitmus28 (New England Biolabs), digeridos com BamHL e EcoR\ e transformados no interior de células E.coli TOP10F'ultra competentes (Invitrogen). Os transformantes foram corridos em placas de ágar MacConkey contendo 1% de sacarose e ampicilina (100 pg/mL) e selecionados para o aparecimento de colônias roxas. O plasmídeo de DNA foi isolado dos transformantes roxos, e seqüenciados com primers M13 forward e reverso (Invitrogen)1 e Scr1-4 (fornecido como SEQ ID NOs:72-75, respectivamente). O plasmídeo contendo os genes cscB, cscK e cscA (cscBKA) foi designado pScrl.

Para criar um plasmídeo de utilização de sacarose que era compatível com o plasmídeo da via do isobutanol (Exemplo 14), o operon de pScrl foi subclonado no interior de pBHR1 (MoBiTec, Goettingrn, Alemanha). Os genes cscBKA foram isolados por digestão de pScrl com Xhol (seguido por incubação com enzima Klenow para gerar terminações abruptas) e então por digestão com Agei O fragmento resultante de 4,2 kbp foi ligado no interior de pBHR1 que foi digerido com NaeIeAge/, resultando no plasmídeo pBHR1 ..cscBKA.

O plasmídeo pBHR1::cscBKA sacarose foi transformado no interior de E. coli BL21 (DE3) 1.5yqhD/pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD e E. coli MG1655 1.5yqhD/pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD (descrito no exemplo 15) por eletroporação. Os transformantes foram inicialmente selecionados em meio LB contendo 100 pg/mL de ampicilina e 50 pg/ml_ de kanamicina e então selecionados em placas de sacarose MacConkey (1%) para confirmar a expressão funcional do operon sacarose. Para produção de isobutanol, as linhagens foram cultivadas em meio mínimo definido TM3a (descrito no Exemplo 15) contendo 1% de sacarose ao invés de glicose, e o meio de cultura foi analisado para a quantidade de isobutanol produzida, como descrito no Exemplo 15, exceto que as foram tiradas 14 horas após a indução. Novamente, não foi detectado isobutanol nas linhagens controle que carregam somente o vetor pTrc99A (resultados não mostrados). Seletividades molares e titulações de isobutanol produzidas por MG1655 1.5yqhD que carregam pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD estão mostradas na Tabela 6. Resultados similares foram obtidos com as linhagens análogas BL21 (DE3). Tabela 6

Produção de Isobutanol por Linhagem de E. Cou MG1655 1.5yqhD/pTrc99a::budBhlvC-»lvD-kivD/pBHR1:: cscBKA Cultivadas em Sacarose

<table>table see original document page 80</column></row><table>

*Determinado por HPLC

Exemplo 17

Expressão de Genes da Via do Isobutanol em Saccharomyces cerevisiae Para expressar os genes da via do isobutanol em Saccharomyces cerevisiae, uma variedade de vetores tipo ponte de E. coli- levedura forma construídos.Uma abordagem de PCR (Yu1 et al., Funga! Genet. Bioi 41:973-981 (2004) foi usada para unir genes com promotores de levedura e terminadores. Especificamente, o promotor GPD (SEQ ID NO:76) e terminador CYC1 (SEQ ID NO:77) foram unidos ao gene alsS de Bacillus subtilis (SEQ ID NO:78), o promotor FBA (SEQ ID NO:79) e o terminador CYC1 foram unidos ao gene ILV5 de S. cerevisiae (SEQ ID N0:80), o promotor ADH1 (SEQ ID NO:81) e o terminador ADH1 (SEQ ID NO:82) foram unidos ao gene ILV3 de S. cerevisiae (SEQ ID NO:83), e o promotor GPM (SEQ ID NO:84) e o terminador ADH1 foram unidos ao gene kivD de Lactococcus Iactis (SEQ ID NO:7). Os primers, fornecidos na tabela 7, foram designados para incluir sítios de restrição para clonagem dos produtos promotor/gene/terminador no interior de vetores tipo ponte de E. co//-levedura da série pRS400 (Christianson et al., Gene 110:119-122 (1992)) e para trocar promotores entre construções. Os primers para as terminações 5' de ILV5 e ILV3 (N138 e N155, respectivamente, fornecidos como SEQ ID NO:95 e 107, respectivamente) geraram novos códons de início para eliminar alvos mitocondriais destas enzimas.

Todos os produtos PCR unidos foram primeiro clonados no interior de pCR4-Blunt por reação de clonagem TOPO (Invitrogen) e as seqüências foram confirmadas (usando-se primers M13 forward e reverso (Invitrogen) e os primers de seqüenciamento são fornecidos na Tabela 7. Dois promotores adicionais (CUP1 e GAL1) foram clonados pela reação TOPO no interior de pCR4-Blunt e confirmados pelo seqüenciamento; as seqüências de primer estão indicadas na Tabela 7. Os plasmídeos foram transformados tanto no interior de Saccharomyces cerevisiae BY4743 (ATCC 201390) como YJR148w (ATCC 4036939) para avaliar as atividades enzimáticas específicas usando-se os testes enzimáticos descritos nos Exemplo 1-4 e Exemplos 9-12. Para a determinação das atividades enzimáticas, as culturas foram crescidas em uma Οϋβοο de 1,0 em meio sintético completo (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 201- 202) não faltando nenhum metabólito necessário para a seleção da expressão do(s) plasmídeo(s), foram colhidos por centrifugação (2600 χ g por 8 min a 4°C), lavados com tampão, centrifugados novamente e congelados a -80°C. As células foram descongeladas, ressuspensas em 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 até um volume final de 2 mL, e então rompidas usando-se um bead beater com 1,2 g de contas de vidro (0,5 mm de tamanho). Cada amostra foi processada em alta velocidade por um total de 3 minutos (com incubação em gelo após cada minuto de agitação). Os fragmentos celulares foram removidos dos extratos por centrifugação (20.000 χ g por 10 min a 4°C). Tabela 7

Seqüências de Primer para Clonagem ε Seqüenciamento de Vetores de Expressão de S. cerevisiae

<table>table see original document page 82</column></row><table> <table>table see original document page 83</column></row><table> <table>table see original document page 84</column></row><table> <table>table see original document page 85</column></row><table> <table>table see original document page 86</column></row><table> <table>table see original document page 87</column></row><table>

Tabela 8

Vetores Tipo Ponte de E.coli-Levedura que Carregam Genes da Via do

Isobutanol

<table>table see original document page 87</column></row><table> <table>table see original document page 88</column></row><table> Exemplo 18

Produção de Isobutanol por Saccharomyces cerevisiae Recombinante

Os plasmídeos pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3 e pHR81::FBA- ILV5+GPM-kivD (descritos no Exemplo 17) foram transformados no interior de Saccharomyces cerevisiae YJR148w para produzir linhagens YJR148w/pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD. Uma linhagem controle foi preparada por vetores de transformação pRS423 e pHR81 (descrita no Exemplo 17) no interior de Saccharomyces cerevisiae YJR148w (linhagem YJR148w/pRS423/pHR81). As linhagens foram mantidas em meio completo sintético padrão para S. cerevisiae (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 NY1 páginas 201-202) contendo 2% de glicose ou sacarose, mas faltando uracila e histidina, para assegurar a manutenção dos plasmídeos.

Para a produção do isobutanol, as células foram transferidas para meio completo sintético, faltando uracila, histidina e leucina. A remoção da Ieucina do meio teve a intenção de acionar um aumento no número de cópias do plasmídeo baseado em pHR81 devido à pouca transcrição do alelo Ieu2-d (Erhart e Hollenberg1 J. Bacteriol. 156:625-635 (1993)). Culturas aeróbicas foram cultivadas em frascos com 175 ml_ de capacidade contendo 50 ml_ de meio em um incubador Innova4000 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 30°C e 200 rpm. Culturas com oxigênio baixo foram preparadas pela adição de 45 ml de meio a frascos de soro de 60 ml que foram fechados com tampas onduladas após inoculação, e mantidos a 30°C. Seringas estéreis foram usadas para amostragem e adição de indutores, quando necessário. Aproximadamente 24 h após inoculação, o indutor CuSO4 foi adicionado a uma concentração final de 0,03 mM. Culturas controle para cada linhagem sem adição de CuSO4 foram também preparadas. Os sobrenadantes da cultura foram analisados 18 ou 19he35h após adição de CuSO4 por GC ou HPLC para o conteúdo de isobutanol, como descrito acima no Exemplo 15. Os resultados para Saccharomyces cerevisiae YJR148w/pRS423::CUP1- alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD cultivados em glicose estão apresentados naTabela 9. Para os resultados fornecidos na Tabela 9, as amostras das culturas aeróbicas foram tiradas em 35h e as amostras das culturas com baixo oxigênio foram tiradas em 19h e medidas por HPLC.

Os resultados para Saccharomyces cerevisiae YJR148w/pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD cultivados em sacarose estão apresentados naTabela 10. Os resultados nesta tabela foram obtidos com amostras tiradas em 18h e medidos por HPLC.

Tabela 9

PRODUCAO DE ISOBUTANOL POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE YJR148w/pRS423::CUP1-ALSS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-KIVD

Cultivado em Glicose

<table>table see original document page 90</column></row><table> <table>table see original document page 91</column></row><table>

Tabela 10

Produção de Isobutanol por Saccharomyces cerevisiae YJR148w/PRS423::CUP1-alsS+FB A-ILV3/PH R81:: FBA-IL V5+G PM-kivD

Cultivado em Sacarose

<table>table see original document page 91</column></row><table> Linhagens com sufixos "a", "b" e "c" indicam isolados separados.

Os resultados indicam que, quando cultivados em glicose ou sacarose, sob condições aeróbicas ou baixo oxigênio, a linhagem YJR148w/pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD produziu níveis consistentemente mais altos de isobutanol, do que a linhagem controle.

Exemplo 19

Produção de Isobutanol por Saccharomyces cerevisiae Recombinante

Os plasmídeos pRS425::CUP1-alsS+FBA-ILV3 e pRS426::GAL1- ILV5+GPM-kivD (descritos no Exemplo 17) foram transformados no interior de

Saccharomyces cerevisiae YJR148w para produzir linhagens YJR148w/pRS425::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pRS426::GAL1-ILV5+GPM-kivD. Uma linhagem controle foi preparada por vetores de transformação pRS425 e pRS426 (descrita no Exemplo 17) no interior de Saccharomyces cerevisiae YJR148w (linhagem YJR148w/pRS425/pRS426). As linhagens foram mantidas em meio completo sintético, como descrito no Exemplo 18.

Para a produção do isobutanol, as células foram transferidas para meio completo sintético, contendo 2% de galactose e 1% de rafinose, e faltando e leucina. Culturas aeróbicas e com baixo oxigênio foram preparadas como descrito no exemplo 18. Aproximadamente 12 h após inoculação, o indutor CuSO4 foi adicionado a uma concentração final de 0,5 mM. Culturas controle para cada linhagem sem adição de CuSO4 foram também preparadas. Os sobrenadantes da cultura foram analisados 23 h após adição de CuSO4 para determinação de isobutanol por HPLC, como descrito acima no Exemplo 18. Os resultados estão apresentados na Tabela 11. Devido à ampla diferença final na densidade ótica observada e associada com a quantificação da fonte de carbono residual, a concentração de isobutanol por unidade OD6oo (ao invés de seletividades molares) está fornecida na tabela para permitir uma comparação das linhagens contendo os genes da via biossintética do isobutanol com os controles. Tabela 11

Produção de Isobutanol por S. cerevisiae YJR148w/pRS425::CUP1- alsS+FBA-ILV3/pRS426::GAL1-ILV5+GPM-kivD Cultivado em Galactose ε Rafinose

<table>table see original document page 93</column></row><table> <table>table see original document page 94</column></row><table>

Linhagens com sufixos "a", "b", "c", "d" e "e" indicam isolados separados.

Os resultados indicam que, em geral, níveis altos de isobutanol para unidade de densidade ótica foram produzidos pela linhagem YJR148w/pRS425::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pRS426::GAL1-ILV5+GPM-kivD comparado à linhagem controle, tanto sob condições aeróbicas como de baixo oxigênio.

Exemplo 20

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Bacillus subtilis

O propósito deste Exemplo foi expressar uma via biossintética do isobutanol em Bacillus subtilis. Os cinco genes da via do isobutanol (etapas da via (a) até (e) na Figura 1) foram unidos em dois operons para expressão. Os três genes BudB1 ilvD e kivD, que codificam acetolactato sintase, ácido acetohidroxi desidratase e keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada, respectivamente, foram integrados no cromossomo de B. subtilis BE1010 (Payne e Jackson, J. Bacteriol. 173:2278-2282 (1991)). Os dois genes ilvC e bdhB, que codificam ácido acetohidroxi isomeroredutase e butanol desidrogenase, respectivamente, foram clonados em um vetor de expressão e transformados no interior da linhagem Bacillus que carrega os genes isobutanol integrados.

Integração dos Três Genes. budB. ilvD E kivD no Cromossomo de b.

subtilis be1010 Os vetores de integração Bacillus pFP988DssPspac e pFP988DssPgroE foram usados para a integração cromossômica dos três genes, budB (SEQ ID NO:1), ilvD (SEQ ID NO:5) e kivD (SEQ ID N0:7). Ambos os plasmídeos contêm um replicon de E.coli de pBR322, um marcador antibiótico ampicilina para seleção de E.coli e duas seções de homologia para o gene sacB no cromossomo de Bacillus que dirigem integração do vetor e a seqüência que interfere por recombinação homóloga. Entre as regiões de homologia sacB está um promotor spac (PgroE) no pFP988DssPsapc ou em um promotor groEL (PgroE) no pFP988DssPgroE, e um marcador selecionável para Bacillus, eritromicina. A região do promotor também contém a seqüência IacO para regulação da expressão por uma proteína repressora lacl. As seqüências de pFP988DssPspac (6,341 bp) e pFP988DssPgroE (6,221 bp) são dadas como SEQ ID NO:142 e SEQ ID NO:143, respectivamente.

O cassette com três genes budB-ilvD-kivD foi construído por delação do gene HvC a partir do plasmídeo pTrc99a budB-ilvC-ilvD-kivD. A construção do plasmídeo pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD está descrita no Exemplo 14. O plasmídeo pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD foi digerido com Aflll e Nhel1 tratado com o fragmento Klenow de DNA polimerase para produzir terminações abruptas, e que resulta no fragmento de 9,4 kbp que contém o vetor pTrc99a, budB, HvD e kivD foi purificado em gel. O fragmento do vetor de 9,4 kbp foi auto-ligado para criar pTrc99A::budB-ilvD-kivD e transformado em células competentes DH5a (Invitrogen). Um clone de pTrc99A::budB-ilvD-kivD foi confirmado para a deleção do gene ilvC por mapeamento por restrição. O plasmídeo resultante pTrc99A::budB-ilvD-kivD foi digerido com Sacl e tratado com o fragmento Klenow de DNA polimerase para produzir terminações abruptas. O plasmídeo foi então digerido com BamHI o fragmento resultante de 5,297 bp budB-ilvD-kivD foi purificado em gel. O fragmento de 5,297 bp budB- ilvD-kivD foi ligado nos sítios Smal e BamHI do vetor de integração pFP988DssPspac. A mistura de ligação foi transformada em células competentes DH5α. Os transformantes foram selecionados por amplificação PCR do fragmento 5,3 kbp budB-ilvD-kivD com os primers T-budB (bamHI) (SEQ ID NO:144) e B-kivD (BamHI) (SEQ ID NO:145). O clone correto foi denominado pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD.

O plasmídeo pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD foi preparado a partir de transformantes E. coli, e transformados no interior de células competentes B. subtilis BE1010, que foram preparadas como descrito por Doyle et al. (J. Bacteriol. 144:957 (1980)). Células competentes foram colhidas por centrifugação e os pellets de células foram ressuspensos em um volume pequeno do sobrenadante. Para um volume de células competentes, dois volumes do meio SPII-EGTA (Methods for General and Molecular Bacteriology, P. Gerhardt et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)) foram adicionados. Alíquotas (0,3 ml) de células foram distribuídas em tubos de ensaio e então 2 a 3 pg do plasmídeo pFP988DssPspac-budB-ilvD- kivD foi adicionado aos tubos. Os tubos foram incubados por 30 min a 37°C com agitação, depois disso, 0,1 mL de 10% de extrato de levedura foi adicionado a cada tubo e eles foram mais adiante incubados por 60 min. Os transformantes foram cultivados para seleção em placas LB contendo eritromicina (1,0 pg/mL) usando-se o método de duplo revestimento com ágar (Methods for General and Molecular Bacteríology, acima). Os transformantes forma selecionados por amplificação PCR com os primers N130SeqF1 (SEQ ID NO:40) e N130SeqR1 (SEQ ID NO:44) para budB e N133SeqF1 (SEQ ID NO:62) e N130SeqR1 (SEQ ID NO:66) para kivD. Integrantes positivos mostraram os produtos PCR esperados 1,7 kbp budB e 1,7 kbp kivD. Dois integrantes positivos foram identificados e denominados B. subtilis BE1010 ΔsacB::Psapc-budB-ilvD-kivD#2-3-2 e B. subtilis BE1010 ΔsacB::Psapc-budB- ilvD-kivD#6-12-7.

O teste das atividades enzimáticas nos integrantes B. subtilis BE1010 AsacB::Psapc-budB-ilvD-kivD#2-3-2 e B. subtilis BE1010 ΔsacB::Psapc-budB-ilvD-kivD#6-12-7 indicaram que as atividades de BudB, ilvD e kivD foram baixas sob o controle do promotor spac (Pspac). Para melhorar a expressão de enzimas funcionais, o promotor Pspac foi substituído por um promotor PgroE a partir do plasmídeo pHT01 (MoBitec, Goettingen, Alemanha).

Um fragmento do vetor de 6,039bp FP988Dss, fornecido como SEQ ID NO:146, foi removido de um plasmídeo não relacionado por digestão por restrição com Xhol e BamHI1 e foi purificado em gel. O promotor PgroE foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pHT01 com primers T-groE(Xhol) (SEQ ID NO:147) e B-groEL (Spel, BamHI) (SEQ ID NO:148). O produto PCR foi digerido com Xhol e BamHI, ligado ao fragmento do vetor 6,039 bp pFP988Dss, e transformado no interior de células DH5a competentes. Os transformantes foram selecionados por amplificação PCR com os primers T- groE (Xhol) e B-groEL (Spel, BamHI). Os clones positivos mostraram os produtos esperados 174 bp PgroEPCR e foram denominados pFP988DssPgroE. O plasmídeo pFP988DssPgroE foi também confirmado pela seqüência de DNA.

O plasmídeo pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD foi digerido com Spel e Pmel e o fragmento resultante 5,313 budB-ilvD-kivD foi purificado em gel. O fragmento budB-ilvD-kivD foi ligado nos sítios Spel e Pmel de pFP988DssPgroE e transformados no interior de células DH5a competentes. Os clones positivos foram selecionados para um produto PCR 1,690 por amplificação por PCR com os primers T-groEL (SEQ ID ΝΟ.Ί49) e N111 (SEQ ID N0:20). Os clones positivos foram denominados pFP988DssPgroE-budB- ilvD-kivD.

O plasmídeo pFP988DssPgroE-budB-ilvD-kivD foi preparado a partir do transformante E. coli, e transformado no interior de células competentes Bacillus subtilis BE1010 como descrito acima. Transformantes foram selecionados por amplificação por PCR com os primers N130seqF 1 (SEQ ID N0:40) e N130SeqR1 (SEQ ID NO:44) para budB, e N133SeqF1 (SEQ ID NO:62) e N133SeqR1 (SEQ ID NO:66) para kivD. Integrantes positivos mostraram os produtos esperados 1,7 kbp budB e 1,7 kbp kivD budB. Dois integrantes positivos foram isolados e denominados B. subtilis BE1010 AsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7 e B. subtilis BE1010 AsacB::PgroE-budB- ilvD-kivD#8-16.

Plasmídeo de Expressão dos Genes ilvC ε bdhB

Dois genes remanescentes de isobútanol, ilvC e bdhB, foram expressados a partir de um palsmídeo. Plasmídeo pHT01 (MoBitec), um vetor tipo ponte de Bacillus-E.coli, foi usado para unir um gene HvC de B. subtilis a um promotor PgroE, de forma que o gene HvC foi expressado a partir do promotor PgroE que contém uma seqüência laco. O gene ilvC, fornecido como SEQ ID NO:186, foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de B. subtilis BR151 (ATCC 33677) com primers T-ilvCB.s. (BamHI) (SEQ ID NO:150) e B-ilvCB.s (Spel BamHI) (SEQ ID NO:151). O produto PCR 1,067 bp ilvc foi digerido com BamHI e ligado ao sítio BamHI de pHT01. A mistura de ligação foi transformada em células competentes DH5a. Os clones positivos foram selecionados para um produto PCR 1,188 bp por amplificação por PCR com os primers T-groEL e B-ilvB.s. (Spel BamHI). O clone positivos foi denominado pHTOI-ilvC(B.s). O plasmídeo pHTOI-ilvC(B.s) foi usado como um modelo para amplificação por PCR do fragmento unido PgroE-Z/vC.

O plasmídeo pBD64 (Minton et ai., Nucleic Acids Res. 18:1651 (1990)) é um vetor pouco estável para expressão de genes estranhos em B. subtilis e contém um gene repB e genes de resistência para cloranfenicol e kanamicina para seleção em B. subtilis. Este plasmídeo foi usado para expressão de ilvC e bdhB sob o controle de um promotor PgroE. Para clonar PgroE-Z/vC, bdhB e um gene repressor Iacl no plasmídeo pBD64, um método de montagem de uma etapa foi usado (Tsuge et al., Nucleie Aeids Res. 31: e133 (2003)). Um fragmento de 3,588 bp pBD64 contendo um gene repB, que incluiu a função de replicação, e o marcador antibiótico kanamicina foi amplificado por PCR a partir de pBD64 com primers T-BD64 (DraII) (SEQ ID NO: 152), que introduziu uma seqüência Dralll (CACCGAGTG), e B-BD64 (DraIII) (SEQ ID NO:153), que introduziu uma seqüência Dralll (CACCTGGTG). Um gene repressor 1,327 bp Iael foi amplificado por PCR a partir de pMUTIN4 (Vagner et al., Micnobiol. 144.3097- 3104 (1998)) com T-Iaclq (DraIII) (SEQ ID NO: 154), que introduziu uma seqüência Dralll (CACCAGGTG) e B-Iaclq (DraIII) (SEQ ID NO: 155), que introduziu uma seqüência Dralll (CACGGGGTG). Um eassette unido de 1,224 bp PgroE-HvC foi amplificado por PCR a partir de pHT01-ilvC(B.s) com T-groE (DraIII) (SEQ ID NO: 156), que introduziu uma seqüência Dralll (CACCCCGTG) e B.s.ilvC (DraIII) (SEQ ID NO: 157), que introduziu uma seqüência Dralll (CACÇGTGTG). Um gene de 1,2 kbp bdhB (SEQ ID NO: 158) foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de Clostridium aeetobutylieum (ATCC 824) com primers T-bdhB(Dralll) (SEQ ID NO:159), que introduziu uma seqüência Dralll (CACACGGTG) e B-bdhB (rmBT1 Dralll) (SEQ ID NO: 160), que introduziu uma seqüência Dralll (CACTCGGTG). As três letras sublinhadas na região variável das seqüências de reconhecimento Dralll foram designadas para pareamento de base específico para montar quatro fragmentos com uma ordem de pBD64-/ac/-PgroE//vC-òc//7fí. Cada produto PCR com sítios Dralll em ambas as terminações foi digerido separadamente com Dralll, e os fragmentos Dralll resultantes, 3,588 bp pBD64, lacl, PgroEilvC e bdhB foram purificados em gel usando-se um kit de extração em gel QIAGEN (QIAGEN). Uma mistura contendo uma concentração equimolar de cada fragmento com uma concentração total de DNA de 30 a 50 μg/100 μΙ_ foi preparada para ligação. A solução de ligação foi então incubada a 16°C durante a noite. A ligação gerou arranjos repetidos de DNA de alto peso molecular. A mistura de DNA linear longo ligado, foi diretamente transformada em B. subtilis competentes BE1010, preparada como descrito acima. B. subtilis preferencialmente assume formas repetidas de DNA linear longo, ao invés de DNA circular, para construir um plasmídeo. Após a transformação, a cultura foi espalhada em uma placa LB contendo 10 pg/mL de kanamicina para seleção. Plasmideos recombinantes positivos foram selecionados por digestão Dralll1 fornecendo quatro fragmentos com um tamanho esperado de 3,588 bp (pBD640, 1,327 bp (lacl), 1,224 bp (PgorE-ilvC), e 1,194 bp (bdhB). O plasmídeo positivo foi denominado pBDPgroE-ilvC(B.s)-bdhB.

Demonstração de Produção de Isobutanol a Partir de Glicose ou Sacarose por b. subtilis BE1010 AsacB::PgroE-budB-ilvD- kivD/pBDPgroE-ilvC(B.s)-bdhB

Para construir o B. subtilis recombinante que expressa os cinco genes da via biossintética do isobutanol, células competentes de dois integrantes B. subtilis BE1010 AsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7 e B.subtilis BE1010 AsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16 foram preparadas como descrito acima e transformadas com o plasmídeo pBVPgroE-ilvC (B.s)-bdhB produzindo B. subtilis BE1010 AsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7/pBDPgroE-ilvC(B.s)-bdhB e B. subtilis BE1010 AsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB.

As duas linhagens recombinantes foram inoculadas tanto em 25 ml como 100 ml de glicose contendo kanamicina (10 pg/mL) em frascos de 125 ml para simular condições de oxigênio alta e baixa, respectivamente, e cultivadas a 37°C com agitação a 200 rpm. O meio consistia de 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,0), 100 mM de tampão MOPS/KOH (pH 7,0), 20 mM de ácido glutâmico/KOH (pH 7,0), 2% de mistura de metal S10, 1% de glicose, 0,01% de extrato de levedura, 0,01% de ácido casamino e 50 pg/mL cada um de, L-triptofano, L-metionina e L-lisina. A mistura de metal S10 consistia 200 mM de MgCI2, 70 mM de CaCI2, 5 mM de MnCI2, 0,1 mM de FeCI3, 0,1 mM de ZnCI2, 0,2 mM de hidrocloreto de tiamina, 0,172 mM de CuSO4 (), 0,253 mM de CoCI2 () e 0,242 mM de Na2MoO4. As células foram induzidas com 1,0 mM de isopropil-P-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) na fase log inicial (OD6oo de aproximadamente 0,2). Após 24h de inoculação, uma alíquota do caldo foi analisada por HPLC (coluna Shodex Sugar SH1011) com detecção de índice de refração (RI) para o conteúdo de isobutanol, como descrito na seção de Métodos Gerais acima. Os resultados de HPLC estão mostrados na Tabela 12.

Tabela 12

Produção de Isobutanol a Partir de Glicose por Linhagens de b. subtilis BE 1010∆sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB

<table>table see original document page 101</column></row><table> Β. subtilis a é Β. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7/pBDPgroE- ilvC(B.s)-bdhB

B. subtilis b é B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8- 16/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB.

O isolado de B. subtilis BE1010 ΔsacB:: PgroE-budB-ilvD-kivD#1- 7/pBDPgroE-ilvC(B.s)-bdhB foi também examinado para produção de isobutanol a partir de sacarose, essencialmente como descrito acima. A linhagem recombinante foi inoculada em 25 mL ou 75 mL de meio de sacarose contendo kanamicina (10 Mg/mL) em frascos de 125 mL para simular níveis de oxigênio alto e médio, respectivamente, e cultivadas a 37°C com agitação a 200 rpm. O meio de sacarose era idêntico ao meio de glicose, exceto que a glicose (10 g/L) foi substituída por 10 g/L de sacarose. As células foram induzidas ou não induzidas com 1,0 mM de isopropil-p-D- tiogalactopiranosídeo (IPTG) na fase Iog inicial (OD6oo de aproximadamente 0,2). Após 24h de inoculação, uma alíquota do caldo foi analisada por HPLC (coluna Shodex Sugar SH1011) com detecção de índice de refração (RI) para o conteúdo de isobutanol, como descrito na seção de Métodos Gerais acima. Os resultados de HPLC estão fornecidos na Tabela 13.

Tabela 13

Produção de Isobutanol a Partir de Sacarose por Linhagem de b. subtilis

BE 1010ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB

<table>table see original document page 102</column></row><table> Β. subtiíis a é Β. subtilis BE1010 AsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7/pBDPgroE- ilvC(B.s)-bdhB.

Exemplo 21 (Profético) Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Lactobacillus plantarum

O propósito deste Exemplo é descrever como expressar uma via biossintética do isobutanol em Lactobacillus plantarum. Os cinco genes da via do isobutanol, que codificam cinco atividades enzimáticas estão divididos no interior de cinco operons para expressão. Os três genes BudB, ilvD e kivD, que codificam as enzimas acetolactato sintase, ácido acetohidroxi desidratase e keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada, respectivamente, estão integrados no cromossomo de Lactobacillus plantarum por recombinação homóloga usando-se o método descrito por Hols et al. (Appl. Environ. Microbiol. 60:1401-1413 (1994)). Os dois genes remanescentes (ilvC e bdhB, que codificam as enzimas ácido acetohidroxi redutoisomerase e butanol desidrogenase, respectivamente) são clonados no interior de um plasmídeo de expressão e transformados no interior da linhagem Lactobacillus que carrega os genes integrados do isobutanol. Lactobacillus plantarum é cultivado em meio MRS (Difco Laboratories, Detroit1 Ml) a 37°C e o DNA cromossômico é isolado como descrito por Moreira et al. (BMC Microbiol 5:15 (2005)).

Integração

O cassette budB-ilvD-kivD sob o controle do promotor sintético P11 (rud et al., Microbiology 152:1011-1019 (2006)) é integrado no cromossomo Lactobacillus plantarum ATCC BAA-793 (NCIMD 8826) no Ioeus idhll por recombinação homóloga. Para construir o vetor de direcionamento de integração IdhL, um fragmento de DNA de Lactobacillus plantarum (Genbank NC_004567) com homologia para IdhL é amplificado por PCR com os primers LDH EcoRV F (SEQ ID ΝΟ.Ί61) e LDH AatIIR (SEQ ID NO:162). O fragmento de PCR de 1986 bp é clonado no interior de pCR4Blunt-TOPO e seqüenciado. O clone pCR4Blunt-TOPO-idhl1 é digerido com EcoRV e aatll liberando um fragemento de 1982 bp IdhM que é purificado em gel. O vetor de integração pFP988, fornecido como SEQ ID NO:177 é digerido com Hindlll e tratado com Klenow de DNA polimerase para produzir terminações abruptas. O plasmídeo Iinearizado é então digerido com Aatll e o fragmento do vetor de 2931 bp é purificado em gel. O fragmento EcoRV/Aatll Idhl é ligado ao fragmento do vetor pFP988 e transformado no interior de células E. coli Top10. Os transformantes são selecionados em placas ágar LB contendo ampicilina (100 pg/mL) e são selecionados por amplificação por PCR de colônia para confirmar a construção de pF988-ldhL.

Para adicionar um marcador selecionável ao DNA de integração, o gene Cm com seu promotor é amplificado por PCR a partir de pC194 (genBank NC_002013, SEQ ID NO:267) com os primers Cm F (SEQ ID NO: 163) e Cm R (SEQ ID NO: 164), que amplifica um produto de PCR de 836 bp. Este produto de PCR é clonado no interior de pCR4Blunt-TOPO e transformado no interior de células E. coli TopIO1 criando pCR4Blunt-TOPO- Cm. Após o seqüenciamento para confirmar se não há erros, são introduzidos por PCR1 o cassette Cm é digerido a partir de pCR4Blunt-TOPO-Cm como um fragmento de 828 bp Mlul/Swal e é purificado em gel. O vetor de integração pFP988-ldhL contendo homologia com IdhL é digerido com Mlul e Swal e o fragmento do vetor é purificado em gel. O fragmento do cassette Cm é ligado ao vetor pFP988-ldhL criando pFP988-DldhL::Cm.

Finalmente o cassette budB-ilvD-kivD de pFP988DssPspac-budB- ilvD-kivD, descrito no Exemplo 20, é modificado para repor o promotor amilase com o promotor sintético P11. Então, o operon completo é transferido para pFP988-DldhL::Cm. O promotor P11 é construído por anelamento de oligonucleotídeo com o primer P11 F-Stul (SEQ ID NO:165) e P11 F-Stul (SEQ ID NO: 166). O oligonucleotídeo anelado é purificado em um gel 6% Ultra PAGE (Embi Tec., San Diego, CA). O plasmídeo pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD, contendo o promotor amilase, é digerido com Stul e Spel e o fragmento do vetor resultante de 10,9 kbp é purificado em gel. O fragmento P11 isolado é ligado ao pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD digerido para criar pFP988-P11-budB-ilvD-kivD. O plasmídeo pFP988-P11-budB-ilvD-kivD é então digerido com Stul e BamHI e o fragmento resultante de 5,4 kbp P11-budB-ilvD-kivD é purificado em gel. pFP988- DldhL::Cm é digerido com Hpal e BamHI e o fragmento do vetor de 5,5 kbp isolado. O operon budB-ilvD-kivD é ligado com o vetor de integração pFP988- DldhL::Cm para criar pFP988-DldhL-P11-budB-ilvD-kivD::Cm.

Integração de pFP988-DlphL-P11-budB-ilvD-kivD::Cm em L. plantarum baa-793 para Formar L. plantarum AldhLI ::budB-ilvD-kivD::Cm que Compreende os Genes Exògenos budB, ilvDekivD. Células eletrocompetentes de L. plantarum são preparadas como descrito por Aukrust, T.W., et al. (Em: Electroporation Protocols for Microorganisms1 Nickoloff, J.A., Ed.; Methods in Molecular Biology, Vol. 47; Humana Press, Inc., Totowa, NJ, 1995, PP 201-208). Após eletroporação as células foram superadas em crescimento meio MRSSM (meio MRS suplementado com 0,5 M de sacarose e 0,1 M de MgCh) como descrito por Aukrust et al., acima por 2 horas a 37°C sem agitação. As células eletroporadas são plaqueadas para seleção em placas MRS contendo cloranfenicol (10 pg/ml) e incubadas a 37°C. Os transformantes são inicialmente selecionados por amplificação por PCR de colônia para confirmar integração, e os clones positivos iniciais são então selecionados de forma mais rigorosa por amplificação por PCR com uma bateria de primers.

Plasmídeo de Expressão dos Genes jlvC ε bdhB

Dois genes remanescentes de isobutanol são expressados a partir do plasmídeo pTRKH3 (0'Sullivan DJ e Klaenhammer TR1 Gene 137:227-231 (1993)) sob o controle do promotor Idhl de L. plantarum (Ferain et al., J. Bacteriol. 176:596-601 (1994)). O promotor IdhL é amplificado por PCR a partir do genoma de L. plantarum ATCC BAA-793 usando-se os primers PIdhL F-Hindlll (SEQ ID NO:167). e PIdhL R-BamHI (SEQ ID NO:168). O produto PCR de 411 bp é clonado em pCR4Blunt-TOPO e seqüenciado. O plasmídeo resultante, pCR4Blunt-TOPO-PldhL é digerido com Hindlll e BamHI liberando o fragmento PldhL.

O plasmídeo pTRKH3 é digerido com Hindlll e Sphl e o fragmento do vetor purificado em gel é ligado ao fragmento Pldhl e o fragmento de 2,4 kbp BamHI/Sphl purificado em gel contendo ilvC(B.s.)-bdhB do plasmídeo de expressão de Bacillus pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB (Exemplo 20) em uma ligação de três tipos. A mistura de ligação é transformada no interior de células E. coli Top 10 e os transformantes são cultivados em placas de Infusão de Cérebro e Coração (BHI, Difco Laboratories, Detroit, Ml) contendo eritromicina (150 mg/L). Os transformantes são selecionados por amplificação por PCR para confirmar construção. O plasmídeo de expressão resultante, pTRKH3-ilvC(B.s.)-bdhB é transformado no interior de AIdhLI ::budB-ilvD-kivD::Cm por eletroporação, como descrito acima.

L. plantarum AIdhLI::budB-ilvD-kivD::Cm contendo pTRKH3- ilvC(B.s.)-bdhB é inoculado em um frasco de agitação de 250 mL contendo 50 ml de meio MRS mais eritromicina (10 pg/mL) e cultivados a 37°C por 18 a 24 h sem agiração, após isto o isobutanol é detectado por análise HPLC ou GC, como descrito na seção de Métodos Gerais.

Exemplo 22

Expressão de uma Via Biossintética do Isobutanol em Enterococcus faecaus

O propósito deste Exemplo é descrever como expressar uma via biossintética do isobutanol em Enterococcus faecalis. A seqüência completa do genoma de Enterococcus faecalis linhagem V583, que é usada como linhagem hospedeira para expressão de uma via biossintética do isobutanol neste Exemplo, foi publicada (Paulsen et al., Science 299:2071-2074 (2003)). Um vetor tipo ponte de E.co//7Gram-positivo, plasmídeo pTRKH3 (0'Sullivan DJ e Klaenhammer TR1 Gene 137:227-231 (1993)), é usado para expressão dos cinco genes (budB, ilvC, ilvD, kivD, bdhB) da via do isobutanol em um operon. pTRKH3 contém um plasmídeo de origem de replicação p15A de E. coli, o replicon ρΑΜβΙ, e dois marcadores de seleção para resistência a antibióticos para tetraciclina e eritromicina. A resistência à tetraciclina é expressada somente em E.coli, e a resistência à eritromicina é expressada tanto em E.coli como em bactéria Gram-positiva. Os derivados do plasmídeo ρΑΜβΙ podem se replicar em E. faecalis (Poyart et al., FEMS Microbiol. Lett. 156:193-198 (1997)). O promotor induzível nisA (PnisA), que foi usado para controle eficiente da expressão gênica por nisina em uma variedade de bactérias Gram- positivas incluindo Enterococcus faecalis (Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:2763-2769 (1998)), é usado para controlar expressão dos cinco genes desejados que codificam as enzimas da via biossintética do isobutanol.

O plasmídeo pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD (descrito no Exemplo 14), que contém o operon da via biossintética do isobutanol, é modificado para substituir o gene ilvC de E.coli (SEQ ID NO:3) com o gene ilvC de B. subtilis (SEQ ID NO:??). Adicionalmente, o gene bdhB (SEQ ID NO: 158) de Clostridium acetobutylicum é adicionado na terminação do operon. Primeiro, o gene bdhB de pBDPgroE-ilvC (B.s)-bhB (descrito no exemplo 20) é amplificado usando-se os primers F-bdhB-AvrlI (SEQ ID NO: 169) e R-bdhB-BamHI (SEQ ID NO: 170), e então clonado TOPO e seqüenciado. O fragmento de 1194 bp bdhB é isolado por digestão com Avrll e BamHI, seguido por purificação em gel. Este fragmento é ligado ao pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD que foi previamente digerido com Avrll e BamHI e o fragmento resultante é purificado em gel. A mistura de ligação é transformada no interior de células E. coli Top 10 por eletroporação e os transformantes são selecionados seguindo cultivo durante a noite a 37°C em placas ágar LB contendo ampícilina (100 pg/mL). Os transformantes são então selecionados por PCR de colônia para confirmar o clone correto contendo pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD-bdhB

Depois, ilvC(B.s.) é amplificado a partir de pBDPgroE-ilvC(B.s.)- bdhB (descrito no Exemplo 20) usando-se primers F-ilvC(B.s.)-AfIII (SEQ ID NO: 171) e R-ilvC(B.s.)-Notl (SEQ ID NO: 172). O produto de PCR é clonado TOPO e seqüenciado. O fragmento de 1051 bp ilvC(B.s.) é isolado por digestão com AfIII e Notl seguido por purificação em gel. Este fragmento é ligado ao pTrc99A::budB- ilvC-ilvD-kivD-bdhB que foi cortado com AfIII e Notl para liberar ilvC de E.coli (a banda do vetor de 10,7 kbpp é purificada em gel antes da ligação com ilvC(B.s.)). A mistura de ligação é transformada no interior de células E. coli Top 10 por eletroporação e os transformantes são selecionados seguindo cultivo durante a noite a 37°C em placas ágar LB contendo ampicilina (100 pg/mL). Os transformantes são então selecionados por PCR de colônia para confirmar o clone correto contendo pTrc99A::budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB

Para fornecer um vetor tipo ponte pTRKH3 para E. coli Gram- positiva, o promotor nisA (Chandrapati et ai., Moi Microbiol. 46(2):467-477 (2002)) é amplificado por PCR a partir do DNA genômico de Lactococcus Iactis com primers F-PnisA(HindIII) (SEQ ID NO:173) e R-PnisA(Spel BamHI) (SEQ ID NO: 174) e então clonado TOPO. Após seqüenciamento, o fragmento do promotor nisA de 312 bp é isolado por digestão com HindIII e BamHI seguido por purificação em gel. O plasmídeo pTRKH3 é digerido com HindIII e BamHI e o fragmento do vetor é purificado em gel. pTRKH3 Iinearizado é ligado ao fragmento PnisA e transformado no interior de células E. coli TopIO por eletroporação. Os transformantes são selecionados seguindo cultivo durante a noite a 37°C em placas ágar LB contendo eritromicina (25 pg/mL). Os transformantes são então selecionados por PCR de colônia para confirmar o clone correto de pTRKH3-PnisA.

O plamídeo pTRKH3-PnisA é digerido com Spel e BamHI1 e o vetor é purificado em gel. O plasmídeo pTrc99A::budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD- bdhB, descrito acima, é digerido com Spel e BamHI1 e o fragmento de 7,5 kbp purificado em gel. O fragmento de 7,5 kbp budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB é ligado no vetor pTRKH3-PnisA nos sítios Spel e BamHI. A mistura de ligação é transformada no interior de células E. coli Top 10 por eletroporação e os transformantes são selecionados seguindo cultivo durante a noite a 37°C em placas ágar LB contendo eritromicina (25 pg/mL). O plasmídeo resultante é denominado pTRKH3-PnisA-budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB. O plasmídeo é preparado a partir de transformantes E. coli e transformados no interior de células E. faecalis V583 por eletroporação usando-se métodos conhecidos na técnica (Aukrust, T.W., et al., Em: Eletroporation Protocols for Microorganisms] Nickoloff, J.A., Ed.; Methods in Molecular Biology, Vol. 47; Humana Press, Inc., Totowa, NJ., 1995, páginas 217-226), resultando em E. faecalis V583/pTRKH3- PnisA-budB-ilvC(B.s)-ilvD-kivD-bdhB.

O segundo plasmídeo contendo genes reguladores nisA, nisR e nisK, o gene add9 de resistência à espectromicina, e a origem de replicação pSH71 é transformado no interior de E. faecalis V583/pTRKH3-PnisA-budB- ilvC(B.s)-ilvD-kivD-bdhB por eletroporação. O plasmídeo contendo a origem de replicação pSH71 é compatível com derivados ρΑΜβΙ em E. faecalis (Eichenbaum et al, acima). Transformantes resistentes às duas drogas são selecionados em placas em placas ágar LB contendo eritromicina (25 pg/mL) e espectromicina (100 pg/mL), cultivados a 37°C.

As linhagens resultantes V583B de E. faecalis contendo os dois plasmídeos, isto é, um plasmídeo de expressão (pTRKH3-PnisA-budB- ilvC(B.s)-ilvD-kivD-bdhB) e um plasmídeo regulaor (pSH71-nisRK), é inoculado em um frasco de agitação contendo 50 ml de caldo Todd-Hewitt suplementado com extrato de levedura (0,2%) (Fischetti et al., J. Exp. Med. 161 ;1384-1401 (1985)), nisina (20 g/mL) (Eichenbaum et al., acima), eritromicina (25 pg/mL), e espectromicina (100 pg/mL). O frasco é incubado sem agitação a 37°C por 18- 5 24 h, após esse tempo, a produção de isobutanol é medida por análise HPLC ou GC, como descrito na seção de Métodos Gerais. Listagem de Seqüências

<110> E.I. du Pont de Nemours and Co.

<120> Produção Fermentativa de alcoóis de 4 carbonos

<130> CL3243 PCT

<160> 267

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1680

<212> DNA

<213> K. pneumoniae

<400> 1

atggacaaac agtatccggt acgccagtgg gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagtcag 60 ctggaagctc agggagtacg ccaggtgttc ggcatccccg gcgccaaaat cgacaaggtc 120 tttgattcac tgctggattc ctccattcgc attattccgg tacgccacga agccaacgcc 180 gcatttatgg ccgccgccgt cggacgcatt accggcaaag cgggcgtggc gctggtcacc 240 tccggtccgg gctgttccaa cctgatcacc ggcatggcca ccgcgaacag cgaaggcgac 300 ccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtaaaa cgcgccgata aagcgaagca ggtccaccag 360 agtatggata cggtggcgat gttcagcccg gtcaccaaat acgccatcga ggtgacggcg 420 ccggatgcgc tggcggaagt ggtctccaac gccttccgcg ccgccgagca gggccggccg 480 ggcagcgcgt tcgttagcct gccgcaggat gtggtcgatg gcccggtcag cggcaaagtg 540 ctgccggcca gcggggcccc gcagatgggc gccgcgccgg atgatgccat cgaccaggtg 600 gcgaagctta tcgcccaggc gaagaacccg atcttcctgc tcggcctgat ggccagccag 660 ccggaaaaca gcaaggcgct gcgccgtttg ctggagacca gccatattcc agtcaccagc 720 acctatcagg ccgccggagc ggtgaatcag gataacttct ctcgcttcgc cggccgggtt 780 gggctgttta acaaccaggc cggggaccgt ctgctgcagc tcgccgacct ggtgatctgc 840 atcggctaca gcccggtgga atacgaaccg gcgatgtgga acagcggcaa cgcgacgctg 900 gtgcacatcg acgtgctgcc cgcctatgaa gagcgcaact acaccccgga tgtcgagctg 960 gtgggcgata tcgccggcac tctcaacaag ctggcgcaaa atatcgatca tcggctggtg 1020 ctctccccgc aggcggcgga gatcctccgc gaccgccagc accagcgcga gctgctggac 1080 cgccgcggcg cgcagctcaa ccagtttgcc ctgcatcccc tgcgcatcgt tcgcgccatg 1140 caggatatcg tcaacagcga cgtcacgttg accgtggaca tgggcagctt ccatatctgg 1200 attgcccgct acctgtacac gttccgcgcc cgtcaggtga tgatctccaa cggccagcag 1260 accatgggcg tcgccctgcc ctgggctatc ggcgcctggc tggtcaatcc tgagcgcaaa 1320 gtggtctccg tctccggcga cggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggagaccgcc 1380 gtccgcctga aagccaacgt gctgcatctt atctgggtcg ataacggcta caacatggtc 1440 gctatccagg aagagaaaaa atatcagcgc ctgtccggcg tcgagtttgg gccgatggat 1500 tttaaagcct atgccgaatc cttcggcgcg aaagggtttg ccgtggaaag cgccgaggcg 1560 ctggagccga ccctgcgcgc ggcgatggac gtcgacggcc cggcggtagt ggccatcccg 1620 gtggattatc gcgataaccc gctgctgatg ggccagctgc atctgagtca gattctgtaa 1680 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> Κ. pneumoniae <4 00> 2 Met Asp Lys 1 Gln Tyr 5 Pro Val Arg Gln Trp 10 Ala His Gly Ala Asp Leu 15 Val Val Ser Gln 20 Leu Glu Ala Gln Gly 25 Val Arg Gln Val Phe 30 Gly Ile Pro Gly Ala 35 Lys Ile Asp Lys Val 40 Phe Asp Ser Leu Leu 45 Asp Ser Ser Ile Arg Ile 50 Ile Pro Val Arg 55 His Glu Ala Asn Ala Ala 60 Phe Met Ala Ala Ala Val 65 Gly Arg Ile Thr 70 Gly Lys Ala Gly 75 Val Ala Leu Val Thr 80 Ser Gly Pro Gly Cys 85 Ser Asn Leu Ile Thr 90 Gly Met Ala Thr Ala Asn 95 Ser Glu Gly Asp 100 Pro Val Val Ala Leu 105 Gly Gly Ala Val Lys 110 Arg Ala Asp Lys Ala 115 Lys Gln Val His Gln 120 Ser Met Asp Thr Val 125 Ala Met Phe Ser Pro Val 130 Thr Lys Tyr Ala 135 Ile Glu Val Thr Ala Pro 140 Asp Ala Leu Ala Glu Val 145 Val Ser Asn Ala 150 Phe Arg Ala Ala 155 Glu Gln Gly Arg Pro 160 Gly Ser Ala Phe Val 165 Ser Leu Pro Gln Asp 170 Val Val Asp Gly Pro Val 175 Ser Gly Lys Val 180 Leu Pro Ala Ser Gly 185 Ala Pro Gln Met Gly 190 Ala Ala Pro Asp Asp Ala 195

Asn Pro Ile Phe 210

Lys Ala Leu Arg 225

Thr Tyr Gln Ala

Ala Gly Arg Val 260

Gln Leu Ala Asp 275

Glu Pro Ala Met 290

Val Leu Pro Ala 305

Val Gly Asp Ile

His Arg Leu Val 340

Gln His Gln Arg 355

Phe Ala Leu His 370

Asn Ser Asp Val 385

Ile Ala Arg Tyr

Asn Gly Gln Gln 420

Trp Leu Val Asn 435

Gly Phe Leu Gln 450

Ala Asn Val Leu 465

Ala Ile Gln Glu

Gly Pro Met Asp 500

Ile Asp Gln Val 200

Leu Leu Gly Leu 215

Arg Leu Leu Glu 230

Ala Gly Ala Val 245

Gly Leu Phe Asn

Leu Val Ile Cys 280

Trp Asn Ser Gly 295

Tyr Glu Glu Arg 310

Ala Gly Thr Leu 325

Leu Ser Pro Gln

Glu Leu Leu Asp 360

Pro Leu Arg Ile 375

Thr Leu Thr Val 390

Leu Tyr Thr Phe 405

Thr Met Gly Val

Pro Glu Arg Lys 440

Ser Ser Met Glu 455

His Leu Ile Trp 470

Glu Lys Lys Tyr 485

Phe Lys Ala Tyr

Ala Lys Leu Ile

Met Ala Ser Gln 220

Thr Ser His Ile 235

Asn Gln Asp Asn 250

Asn Gln Ala Gly 265

Ile Gly Tyr Ser

Asn Ala Thr Leu 300

Asn Tyr Thr Pro 315

Asn Lys Leu Ala 330

Ala Ala Glu Ile 345

Arg Arg Gly Ala

Val Arg Ala Met 380

Asp Met Gly Ser 395

Arg Ala Arg Gln 410

Ala Leu Pro Trp 425

Val Val Ser Val

Leu Glu Thr Ala 460

Val Asp Asn Gly 475

Gln Arg Leu Ser 490

Ala Glu Ser Phe 505

Ala Gln Ala Lys 205

Pro Glu Asn Ser

Pro Val Thr Ser 240

Phe Ser Arg Phe 255

Asp Arg Leu Leu 270

Pro Val Glu Tyr 285

Val His Ile Asp

Asp Val Glu Leu 320

Gln Asn Ile Asp 335

Leu Arg Asp Arg 350

Gln Leu Asn Gln 365

Gln Asp Ile Val

Phe His Ile Trp 400

Val Met Ile Ser 415

Ala Ile Gly Ala 430

Ser Gly Asp Gly 445

Val Arg Leu Lys

Tyr Asn Met Val 480

Gly Val Glu Phe 495

Gly Ala Lys Gly 510 Phe Ala Val Glu Ser Ala Glu Ala Leu Glu Pro Thr Leu Arg Ala Ala 515 520 525

Met Asp Val Asp Gly Pro Ala Val Val Ala Ile Pro Val Asp Tyr Arg 530 535 540

Asp Asn Pro Leu Leu Met Gly Gln Leu His Leu Ser Gln Ile Leu 545 550 555

<210> 3

<211> 1476

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 3

atggctaact acttcaatac actgaatctg cgccagcagc tggcacagct gggcaaatgt 60 cgctttatgg gccgcgatga attcgccgat ggcgcgagct accttcaggg taaaaaagta 120 gtcatcgtcg gctgtggcgc acagggtctg aaccagggcc tgaacatgcg tgattctggt 180 ctcgatatct cctacgctct gcgtaaagaa gcgattgccg agaagcgcgc gtcctggcgt 240 aaagcgaccg aaaatggttt taaagtgggt acttacgaag aactgatccc acaggcggat 300 ctggtgatta acctgacgcc ggacaagcag cactctgatg tagtgcgcac cgtacagcca 360 ctgatgaaag acggcgcggc gctgggctac tcgcacggtt tcaacatcgt cgaagtgggc 420 gagcagatcc gtaaagatat caccgtagtg atggttgcgc cgaaatgccc aggcaccgaa 480 gtgcgtgaag agtacaaacg tgggttcggc gtaccgacgc tgattgccgt tcacccggaa 540 aacgatccga aaggcgaagg catggcgatt gccaaagcct gggcggctgc aaccggtggt 600 caccgtgcgg gtgtgctgga atcgtccttc gttgcggaag tgaaatctga cctgatgggc 660 gagcaaacca tcctgtgcgg tatgttgcag gctggctctc tgctgtgctt cgacaagctg 720 gtggaagaag gtaccgatcc agcatacgca gaaaaactga ttcagttcgg ttgggaaacc 780 atcaccgaag cactgaaaca gggcggcatc accctgatga tggaccgtct ctctaacccg 840 gcgaaactgc gtgcttatgc gctttctgaa cagctgaaag agatcatggc acccctgttc 900 cagaaacata tggacgacat catctccggc gaattctctt ccggtatgat ggcggactgg 960 gccaacgatg ataagaaact gctgacctgg cgtgaagaga ccggcaaaac cgcgtttgaa 1020 accgcgccgc agtatgaagg caaaatcggc gagcaggagt acttcgataa aggcgtactg 1080 atgattgcga tggtgaaagc gggcgttgaa ctggcgttcg aaaccatggt cgattccggc 1140 atcattgaag agtctgcata ttatgaatca ctgcacgagc tgccgctgat tgccaacacc 1200 atcgcccgta agcgtctgta cgaaatgaac gtggttatct ctgataccgc tgagtacggt 1260 aactatctgt tctcttacgc ttgtgtgccg ttgctgaaac cgtttatggc agagctgcaa 1320 ccgggcgacc tgggtaaagc tattccggaa ggcgcggtag ataacgggca actgcgtgat 1380

gtgaacgaag cgattcgcag ccatgcgatt gagcaggtag gtaagaaact gcgcggctat 1440

atgacagata tgaaacgtat tgctgttgcg ggttaa 1476

<210> 4

<211> 491

<212> PRT

<213> Ε. coli

<400> 4

Met Ala Asn Tyr Phe Asn Thr Leu Asn Leu Arg Gln Gln Leu Ala Gln 15 10 15

Leu Gly Lys Cys Arg Phe Met Gly Arg Asp Glu Phe Ala Asp Gly Ala 20 25 30

Ser Tyr Leu Gln Gly Lys Lys Val Val Ile Val Gly Cys Gly Ala Gln 35 40 45

Gly Leu Asn Gln Gly Leu Asn Met Arg Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ser 50 55 60

Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ile Ala Glu Lys Arg Ala Ser Trp Arg 65 70 75 80

Lys Ala Thr Glu Asn Gly Phe Lys Val Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Ile 85 90 95

Pro Gln Ala Asp Leu Val Ile Asn Leu Thr Pro Asp Lys Gln His Ser 100 105 110

Asp Val Val Arg Thr Val Gln Pro Leu Met Lys Asp Gly Ala Ala Leu 115 120 125

Gly Tyr Ser His Gly Phe Asn Ile Val Glu Val Gly Glu Gln Ile Arg 130 135 140

Lys Asp Ile Thr Val Val Met Val Ala Pro Lys Cys Pro Gly Thr Glu 145 . 150 155 160

Val Arg Glu Glu Tyr Lys Arg Gly Phe Gly Val Pro Thr Leu Ile Ala 165 170 175

Val His Pro Glu Asn Asp Pro Lys Gly Glu Gly Met Ala Ile Ala Lys 180 185 190

Ala Trp Ala Ala Ala Thr Gly Gly His Arg Ala Gly Val Leu Glu Ser 195 200 205

Ser Phe Val Ala Glu Val Lys Ser Asp Leu Met Gly Glu Gln Thr Ile 210 215 220

Leu Cys Gly Met Leu Gln Ala Gly Ser Leu Leu Cys Phe Asp Lys Leu 225 230 235 240 Val Glu Glu Gly Thr Asp Pro Ala Tyr Ala Glu Lys Leu Ile Gln Phe 245 250 255

Gly Trp Glu Thr Ile Thr Glu Ala Leu Lys Gln Gly Gly Ile Thr Leu 260 265 270

Met Met Asp Arg Leu Ser Asn Pro Ala Lys Leu Arg Ala Tyr Ala Leu 275 280 285

Ser Glu Gln Leu Lys Glu Ile Met Ala Pro Leu Phe Gln Lys His Met 290 295 300

Asp Asp Ile Ile Ser Gly Glu Phe Ser Ser Gly Met Met Ala Asp Trp 305 310 315 320

Ala Asn Asp Asp Lys Lys Leu Leu Thr Trp Arg Glu Glu Thr Gly Lys 325 330 335

Thr Ala Phe Glu Thr Ala Pro Gln Tyr Glu Gly Lys Ile Gly Glu Gln 340 345 350

Glu Tyr Phe Asp Lys Gly Val Leu Met Ile Ala Met Val Lys Ala Gly 355 360 365

Val Glu Leu Ala Phe Glu Thr Met Val Asp Ser Gly Ile Ile Glu Glu 370 375 380

Ser Ala Tyr Tyr Glu Ser Leu His Glu Leu Pro Leu Ile Ala Asn Thr 385 390 395 400

Ile Ala Arg Lys Arg Leu Tyr Glu Met Asn Val Val Ile Ser Asp Thr 405 410 415

Ala Glu Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Ser Tyr Ala Cys Val Pro Leu Leu 420 425 430

Lys Pro Phe MetAla Glu Leu Gln Pro Gly Asp Leu Gly Lys Ala Ile 435 440 445

Pro Glu Gly Ala Val Asp Asn Gly Gln Leu Arg Asp Val Asn Glu Ala

450 455 460

Ile Arg Ser His Ala Ile Glu Gln Val Gly Lys Lys Leu Arg Gly Tyr

465 470 475 480

Met Thr Asp Met Lys Arg Ile Ala Val Ala Gly 485 490

<210> 5 <211> 1851 <212> DNA <213> E. colí

<400> 5

atgcctaagt accgttccgc caccaccact ctgtggcgcg ccaccggaat gaccgacgcc aactcgttca cccaatttgt accgggtcac

catggtcgta atatggcggg tgctcgtgcg 60 gatttcggta agccgattat cgcggttgtg 120 gtccatctgc gcgatctcgg taaactggtc 180 gccgaacaaa ttgaagcggc tggcggcgtt

gatgggattg ccatgggcca cggggggatg

gctgattccg ttgagtatat ggtcaacgcc

aactgcgaca aaatcacccc ggggatgctg

atctttgttt ccggcggccc gatggaggcc

aagctcgatc tggttgatgc gatgatccag

agcgatcagg ttgaacgttc cgcgtgtccg

gctaactcaa tgaactgcct gaccgaagcg

ctgctggcaa cccacgccga ccgtaagcag

gaattgacca aacgttatta cgagcaaaac

agtaaggcgg cgtttgaaaa cgccatgacg

accgtacttc acctgctggc ggcggcgcag

atcgataagc tttcccgcaa ggttccacag

taccatatgg aagatgttca ccgtgctggt

cgcgcggggt tactgaaccg tgatgtgaaa

ctggaacaat acgacgttat gctgacccag

ggtcctgcag gcattcgtac cacacaggca

gacgacgatc gcgccaatgg ctgtatccgc

ggcctggcgg tgctctacgg taactttgcg

gtcgatgaca gcatcctcaa attcaccggc

gcggtagaag cgattctcgg cggtaaagtt

gaaggcccga aaggcggtcc ggggatgcag

tcaatgggtc tcggcaaagc ctgtgcgctg

tctggtcttt ccatcggcca cgtctcaccg

attgaagatg gtgacctgat cgctatcgac

agcgatgccg aactggcggc gcgtcgtgaa

acgccgaaaa atcgtgaacg tcaggtctcc

accagcgccg acaaaggcgc ggtgcgcgat

<210> 6 <211> 616 <212> PRT

gccaaagagt tcaacaccat tgcggtggat 240 ctttattcac tgccatctcg cgaactgatc 300 cactgcgccg acgccatggt ctgcatctct 360 atggcttccc tgcgcctgaa tattccggtg 420 gggaaaacca aactttccga tcagatcatc 480 ggcgcagacc cgaaagtatc tgactcccag 540 acctgcggtt cctgctccgg gatgtttacc 600 ctgggcctgt cgcagccggg caacggctcg 660 ctgttcctta atgctggtaa acgcattgtt 720 gacgaaagtg cactgccgcg taatatcgcc 780 ctggatatcg cgatgggtgg atcgactaac 840 gaagcggaaa tcgacttcac catgagtgat 900 ctgtgtaaag ttgcgccgag cacccagaaa 960 ggtgttatcg gtattctcgg cgaactggat 1020 aacgtacttg gcctgacgtt gccgcaaacg 1080 gatgacgcgg taaaaaatat gttccgcgca 1140 ttctcgcaag attgccgttg ggatacgctg 1200 tcgctggaac acgcctacag caaagacggc 1260 gaaaacggct gcatcgtgaa aacggcaggc 1320 ccggcgaaag tgtacgaaag ccaggacgat 1380 gtcgccggag atgtggtagt aattcgctat 1440 gaaatgctct acccaaccag cttcctgaaa 1500 atcaccgacg gtcgtttctc tggtggcacc 1560 gaagcggcaa gcggcggcag cattggcctg 1620 atcccgaacc gtggcattca gttacaggta 1680 gcgcaggacg ctcgaggtga caaagcctgg 1740 tttgccctgc gtgcttatgc cagcctggca 1800 aaatcgaaac tggggggtta a 1851 <213> Ε. coli <400> 6

Met Pro Lys Tyr Arg Ser Ala Thr Thr Thr His Gly Arg Asn Met Ala 15 10 15

Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Met Thr Asp Ala Asp Phe 20 25 30

Gly Lys Pro Ile Ile Ala Val Val Asn Ser Phe Thr Gln Phe Val Pro 35 40 45

Gly His Val His Leu Arg Asp Leu Gly Lys Leu Val Ala Glu Gln Ile 50 55 60

Glu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Glu Phe Asn Thr Ile Ala Val Asp 65 70 75 80

Asp Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser 85 90 95

Arg Glu Leu Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Cys 100 105 110

Ala Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly 115 120 125

Met Leu Met Ala Ser Leu Arg Leu Asn Ile Pro Val Ile Phe Val Ser 130 135 140

Gly Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Thr Lys Leu Ser Asp Gln Ile Ile 145 150 155 160

Lys Leu Asp Leu Val Asp Ala Met Ile Gln Gly Ala Asp Pro Lys Val 165 170 175

Ser Asp Ser Gln Ser Asp Gln Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr Cys 180 185 190

Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu Thr 195 . . 200 . . . 205

Glu Ala Leu Gly Leu Ser Gln Pro Gly Asn Gly Ser Leu Leu Ala Thr 210 215 220

His Ala Asp Arg Lys Gln Leu Phe Leu Asn Ala Gly Lys Arg Ile Val 225 230 235 240

Glu Leu Thr Lys Arg Tyr Tyr Glu Gln Asn Asp Glu Ser Ala Leu Pro 245 250 255

Arg Asn Ile Ala Ser Lys Ala Ala Phe Glu Asn Ala Met Thr Leu Asp 260 265 270

Ile Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Val Leu His Leu Leu Ala Ala 275 280 285 Ala Gln Glu Ala Glu Ile Asp Phe Thr Met Ser Asp Ile Asp Lys Leu 290 295 300

Ser Arg Lys Val Pro Gln Leu Cys Lys Val Ala Pro Ser Thr Gln Lys

305 310 315 320

Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Gly Val Ile Gly Ile Leu

325 330 335

Gly Glu Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Asn Arg Asp Val Lys Asn Val 340 345 350

Leu Gly Leu Thr 355

Thr Gln Asp Asp 370

Ile Arg Thr Thr 385

Asp Asp Asp Arg

Ser Lys Asp Gly 420

Leu Pro Gln Thr 360

Ala Val Lys Asn 375

Gln Ala Phe Ser 390

Ala Asn Gly Cys 405

Gly Leu Ala Val

Leu Glu Gln Tyr

Met Phe Arg Ala 380

Gln Asp Cys Arg 395

Ile Arg Ser Leu 410

Leu Tyr Gly Asn 425

Asp Val Met Leu 365

Gly Pro Ala Gly

Trp Asp Thr Leu 400

Glu His Ala Tyr 415

Phe Ala Glu Asn 430

Gly Cys Ile Val Lys Thr Ala Gly Val Asp Asp Ser Ile Leu Lys Phe 435 440 445

Thr Gly Pro Ala Lys Val Tyr Glu Ser Gln Asp Asp Ala Val Glu Ala 450 455 460

Ile Leu Gly Gly Lys Val Val Ala Gly Asp Val Val Val Ile Arg Tyr 465 470 475 480

Glu Gly Pro Lys Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu Tyr Pro Thr 485 490 495

Ser Phe Leu Lys Ser Met Gly Leu 500

Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Thr 515 520

Ser Pro Glu Ala Ala Ser Gly Gly 530 535

Asp Leu Ile Ala Ile Asp Ile Pro 545 550

Gly Lys Ala Cys Ala Leu Ile Thr 505 510

Ser Gly Leu Ser Ile Gly His Val 525

Ser Ile Gly Leu Ile Glu Asp Gly 540

Asn Arg Gly Ile Gln Leu Gln Val 555 560

Ser Asp Ala Glu Leu Ala Ala Arg Arg Glu Ala Gln Asp Ala Arg Gly 565 570 575

Asp Lys Ala Trp Thr Pro Lys Asn Arg Glu Arg Gln Val Ser Phe Ala 580 585 590

Leu Arg Ala Tyr Ala Ser Leu Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val 595 600 605 Arg Asp Lys Ser Lys Leu Gly Gly 610 615

<210> 7 <211> 1662 <212> DNA

<213> Lactococcus lactis <400> 7

tctagacata tgtatactgt gggggattac gaagaaattt tcggtgtgcc aggcgattat cacaaagata tgaagtgggt cggtaacgcc ggttatgccc gtaccaaaaa agctgctgcg agcgccgtca acggactggc aggaagctac gggtcgccta cttctaaggt tcagaatgaa ggggatttta aacattttat gaaaatgcat acagcagaga atgctacggt tgagatcgac aagccggtat atatcaatct gcctgtcgat ctgccactga aaaaagaaaa cagcacctcc atccaggaat cactgaagaa tgcgaagaaa tcttttggcc tggaaaaaac ggtcacgcag accctgaact tcggcaaatc tagcgtcgat aatggtaccc tgtccgaacc gaacctgaaa atgctgggcg tgaaactgac ggatagctcc aataaaatga tttccctgaa tatcgacgaa ttcgattttg aatctctgat tagttcgctg aaatatattg ataaaaaaca ggaggatttt cgtctgtggc aagccgtaga aaacctgaca ggaacttcat ttttcggcgc ctcatccatt caaccgctgt gggggagtat tggttatacc gataaggaat cacgccatct gctgtttatt gaactggggc tggcgatccg tgaaaaaatc ggctacaccg tcgaacgcga aattcatgga tggaactata gcaaactgcc ggaatccttt

ctgctggatc gcctgcacga actggggatt 60 aacctgcagt tcctggacca gattatctcg 120 aacgaactga acgcgagcta tatggcagat 180 tttctgacga cctttggcgt tggcgaactg 240 gccgagaacc tgccagttgt cgaaattgtt 300 ggcaaatttg tgcaccatac tctggctgat 360 gaaccggtta ctgcggcccg cacgctgctg 420 cgcgtcctgt ctgcgctgct gaaagagcgc 480 gttgccgcag cgaaagccga aaagccgtcg 540 aatacatcgg accaggaaat tctgaataaa 600 ccgatcgtca tcaccggaca tgagatcatc 660 ttcatttcta agaccaaact gcctatcacc 720 gaagcgctgc cgagttttct gggtatctat 780 gaattcgtcg aaagcgcgga ctttatcctg 840 acaggcgcat ttacccacca tctgaacgag 900 ggcaaaatct ttaacgagcg catccagaac 960 ctggatctgt ccgaaattga gtataaaggt 1020 gtgccgtcta atgcgctgct gagtcaggat 1080 cagtctaatg aaacgattgt tgcggaacag 1140 tttctgaaat ccaaaagcca tttcattggc 1200 tttccggcgg cgctgggttc acagattgca 1260 ggtgacggca gcctgcagct gactgtccag 1320 aatccgattt gctttatcat caataacgac 1380 ccgaatcaaa gttacaatga catcccgatg 1440 ggcgcgacag aggatcgcgt ggtgagtaaa 1500 attgtgcgta cggaaaacga atttgtgtcg gttatgaaag aagcgcaggc tgacccgaat 1560

cgcatgtatt ggattgaact gatcctggca aaagaaggcg caccgaaagt tctgaaaaag 1620

atggggaaac tgtttgcgga gcaaaataaa agctaaggat cc 1662

<210> 8 <211> 548 <212> PRT

<213> Lactococcus Iactis <400> 8

Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly 1 5 10 15

Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu 20 25 30

Asp Gln Ile Ile Ser His Lys Asp Met Lys Trp Val Gly Asn Ala Asn 35 40 45

Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys 50 55 60

Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Val 65 70 75 80

Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile 85 90 95

Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Glu Gly Lys Phe Val His 100 105 110

His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys His Phe Met Lys Met His Glu 115 120 125

Pro Val Thr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Thr Ala Glu Asn Ala Thr Val 130 135 140

Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Lys Pro Val 145 150 155 160

Tyr Ile Asn Leu Pro Val Asp Val Ala Ala Ala Lys Ala Glu Lys Pro 165 170 175

Ser Leu Pro Leu Lys Lys Glu Asn Ser Thr Ser Asn Thr Ser Asp Gln 180 185 190

Glu Ile Leu Asn Lys Ile Gln Glu Ser Leu Lys Asn Ala Lys Lys Pro 195 200 205

Ile Val Ile Thr Gly His Glu Ile Ile Ser Phe Gly Leu Glu Lys Thr 210 215 220

Val Thr Gln Phe Ile Ser Lys Thr Lys Leu Pro Ile Thr Thr Leu Asn 225 230 235 240 Phe Gly Lys Ser Ser Val Asp Glu Ala Leu Pro Ser Phe Leu Gly Ile 245 250 255

Tyr Asn Gly Thr Leu Ser Glu Pro Asn Leu Lys Glu Phe Val Glu Ser 260 265 270

Ala Asp Phe Ile Leu Met Leu Gly Val Lys Leu Thr Asp Ser Ser Thr 275 280 285

Gly Ala Phe Thr His His Leu Asn Glu Asn Lys Met Ile Ser Leu Asn 290 295 300

Ile Asp Glu Gly Lys Ile Phe Asn Glu Arg Ile Gln Asn Phe Asp Phe 305 310 315 320

Glu Ser Leu Ile Ser Ser Leu Leu Asp Leu Ser Glu Ile Glu Tyr Lys 325 330 335

Gly Lys Tyr Ile Asp Lys Lys Gln Glu Asp Phe Val Pro Ser Asn Ala 340 345 350

Leu Leu Ser Gln Asp Arg Leu Trp Gln Ala Val Glu Asn Leu Thr Gln 355 360 365

Ser Asn Glu Thr Ile Val Ala Glu Gln Gly Thr Ser Phe Phe Gly Ala 370 375 380

Ser Ser Ile Phe Leu Lys Ser Lys Ser His Phe Ile Gly Gln Pro Leu 385 390 395 400

Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Thr Phe Pro Ala Ala Leu Gly Ser Gln Ile 405 410 415

Ala Asp Lys Glu Ser Arg His Leu Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu 420 425 430

Gln Leu Thr Val Gln Glu Leu Gly Leu Ala Ile Arg Glu Lys Ile Asn 435 440 445

Pro Ile Cys Phe Ile Ile Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Val Glu Arg Glu 450 455 460

Ile His Gly Pro Asn Gln Ser Tyr Asn Asp Ile Pro Met Trp Asn Tyr 465 470 475 480

Ser Lys Leu Pro Glu Ser Phe Gly Ala Thr Glu Asp Arg Val Val Ser 485 490 495

Lys Ile Val Arg Thr Glu Asn Glu Phe Val Ser Val Met Lys Glu Ala 500 505 510

Gln Ala Asp Pro Asn Arg Met Tyr Trp Ile Glu Leu Ile Leu Ala Lys 515 520 525

Glu Gly Ala Pro Lys Val Leu Lys Lys Met Gly Lys Leu Phe Ala Glu 530 535 540

Gln Asn Lys Ser 545 <210> 9

<211> 1164 <212> DNA <213> Ε. coli

<400> 9

atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60

ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120

gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180

gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240

gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300

accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360

caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420

gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480

caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540

tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600

gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660

ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720

cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780

ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840

cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900

cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960

gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020

acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080

gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140

cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164

<210> 10

<211> 387

<212> PRT

<213> Ε. coli

<4 00> 10

Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys 15 10 15

Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val 20 25 30 Leu Ile Thr Tyr 35

Gln Val Leu Asp 50

Ile Glu Pro Asn 65

Val Arg Glu Gln

Val Leu Asp Gly 100

Asn Ile Asp Pro 115

Ser Ala Ile Pro 130

Glu Ser Asn Ala 145

Gln Ala Phe His

Pro Val Tyr Thr 180

Val Asp Ala Phe 195

Asp Ala Lys Ile 210

Ile Glu Asp Gly 225

Arg Ala Asn Val

Gly Ala Gly Val 260

Leu Thr Ala Met 275

Leu Pro Ala Leu 290

Leu Gln Tyr Ala 305

Glu Arg Ile Asp

Leu Gly Val Pro 340

Gly Gly Gly Ser 40

Ala Leu Lys Gly 55

Pro Ala Tyr Glu 70

Lys Val Thr Phe 85

Thr Lys Phe Ile

Trp His Ile Leu 120

Met Gly Cys Val 135

Gly Ala Val Ile 150

Ser Ala His Val 165

Tyr Thr Leu Pro

Val His Thr Val 200

Gln Asp Arg Phe 215

Pro Lys Ala Leu 230

Met Trp Ala Ala 245

Pro Gln Asp Trp

His Gly Leu Asp 280

Trp Asn Glu Lys 295

Glu Arg Val Trp 310

Ala Ala Ile Ala 325

Thr His Leu Ser

Val Lys Lys Thr

Met Asp Val Leu 60

Thr Leu Met Asn 75

Leu Leu Ala Val 90

Ala Ala Ala Ala 105

Gln Thr Gly Gly

Leu Thr Leu Pro 140

Ser Arg Lys Thr 155

Gln Pro Val Phe 170

Pro Arg Gln Val 185

Glu Gln Tyr Val

Ala Glu Gly Ile 220

Lys Glu Pro Glu 235

Thr Gln Ala Leu 250

Ala Thr His Met 265

His Ala Gln Thr

Arg Asp Thr Lys 300

Asn Ile Thr Glu 315

Ala Thr Arg Asn 330

Asp Tyr Gly Leu 345

Gly Val Leu Asp 45

Glu Phe Gly Gly

Ala Val Lys Leu 80

Gly Gly Gly Ser 95

Asn Tyr Pro Glu 110

Lys Glu Ile Lys 125

Ala Thr Gly Ser

Thr Gly Asp Lys 160

Ala Val Leu Asp 175

Ala Asn Gly Val 190

Thr Lys Pro Val 205

Leu Leu Thr Leu

Asn Tyr Asp Val 240

Asn Gly Leu Ile 255

Leu Gly His Glu 270

Leu Ala Ile Val 285

Arg Ala Lys Leu

Gly Ser Asp Asp 320

Phe Phe Glu Gln 335

Asp Gly Ser Ser 350 Ile Pro Ala Leu Leu Lys Lys Leu Glu 355 360

Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp 370 375

Ala Ala Arg 385

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 11

caccatggac aaacagtatc cggtacgcc

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 12

cgaagggcga tagctttacc aatcc

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<4 00> 13

caccatggct aactacttca atacactga

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 14

ccaggagaag gccttgagtg ttttctcc

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

Glu His Gly Met Thr Gln Leu 365

Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu 380

29

25

29

<220> <223> Primer

<4 00> 15

caccatgcct aagtaccgtt ccgccacca

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 16

cgcagcactg ctcttaaata ttcggc

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<22 3> Primer

<4 00> 17

caccatgaac aactttaatc tgcacaccc

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<4 00> 18

caccatgaac aactttaatc tgcacaccc

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<4 00> 19

gcatgcctta agaaaggagg ggggtcacat ggacaaacag

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer <400> 20

atgcatttaa ttaattacag aatctgactc agatgcagc 39

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 21

gtcgacgcta gcaaaggagg gaatcaccat ggctaactac ttcaa 45

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 22

tctagattaa cccgcaacag caatacgttt c 31

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 23

tctagaaaag gaggaataaa gtatgcctaa gtaccgttc 39

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 24

ggatccttat taacccccca gtttcgattt a 31

<210> 25

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 25

ggatccaaag gaggctagac atatgtatac tgtggggga

39 <210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 26

gagctcttag cttttatttt gctccgcaaa c

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

31

<220>

<223> Primer

<4 00> 27

gagctcaaag gaggagcaag taatgaacaa ctttaatct 39

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<4 00> 28

gaattcacta gtcctaggtt agcgggcggc ttcgtatata cgg 43

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<400> 29

caacattagc gattttcttt tctct 25

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer

<4 00> 30

catgaagctt actagtgggc ttaagttttg aaaataatga aaact 45

<210> 31

<211> 61

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν110.2

<400> 31

gagctcacta gtcaattgta agtaagtaaa aggaggtggg tcacatggac aaacagtatc 60

c 61

<210> 32

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν111.2

<4 00> 32

ggatccgatc gacttaagcc tcagcttaca gaatctgact cagatgcagc 50

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N112.2

<4 00> 33

gagctcctta agaaggaggt aatcaccatg gctaactact tcaa 44

<210> 34

<211> 51

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N113.2

<4 00> 34

ggatccgatc gagctagcgc ggccgcttaa cccgcaacag caatacgttt c 51

<210> 35

<211> 44

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N114.2

<4 00> 35

gagctcgcta gcaaggaggt ataaagtatg cctaagtacc gttc 44

<210> 36

<211> 52

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν115.2 <400> 36

ggatccgatc gattaattaa cctaaggtta ttaacccccc agtttcgatt ta 52

<210> 37

<211> 46

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν116.2

<400> 37

gagctcttaa ttaaaaggag gttagacata tgtatactgt ggggga 46

<210> 38

<211> 49

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer 117.2

<400> 38

ggatccagat ctcctaggac atgtttagct tttattttgc tccgcaaac 49

<210> 39 <211> 3883 <212> DNA

<213> Escherichia coli <400> 39

ctatattgct gaaggtacag gcgtttccat aactatttgc tcgcgttttt tactcaagaa 60

gaaaatgcca aatagcaaca tcaggcagac aatacccgaa attgcgaaga aaactgtctg 120

gtagcctgcg tggtcaaaga gtatcccagt cggcgttgaa agcagcacaa tcccaagcga 180

actggcaatt tgaaaaccaa tcagaaagat cgtcgacgac aggcgcttat caaagtttgc 240

cacgctgtat ttgaagacgg atatgacaca aagtggaacc tcaatggcat gtaacaactt 300

cactaatgaa ataatccagg ggttaacgaa cagcgcgcag gaaaggatac gcaacgccat 360

aatcacaact ccgataagta atgcattttt tggccctacc cgattcacaa agaaaggaat 420

aatcgccatg cacagcgctt cgagtaccac ctggaatgag ttgagataac catacaggcg 480

cgttcctaca tcgtgtgatt cgaataaacc tgaataaaag acaggaaaaa gttgttgatc 540

aaaaatgtta tagaaagacc acgtccccac aataaatatg acgaaaaccc agaagtttcg 600

atccttgaaa actgcgataa aatcctcttt ttttacccct cccgcatctg ccgctacgca 660

ctggtgatcc ttatctttaa aacgcatgtt gatcatcata aatacagcgc caaatagcga 720

gaccaaccag aagttgatat ggggactgat actaaaaaat atgccggcaa agaacgcgcc 780 aatagcatag ccaaaagatc cccaggcgcg cgccattttt tcggtgaagc tatcaagcaa aaatagcgcc cccagaatta gacctacaga gtaaatcata aacggtccgg tcaagaccag cttcagaccg agtttatcct gaacgatgcc ctggttgacc gaataaagtg tacctaattc ccaaatagcg tataacgacc accacagcga ggatgcaaaa cgatagtacg catttctgaa gtcgttaaaa aattcacgtc ctatttagag tattccagtt cttgtcgaca tggcagcgct gctccgcaac gttgagcgag atcgataatt cccgtagagg acagacctgt gagtaacccg tcgacacaat tcacagacat tccagcaaaa accccttctg cacctttagt caccaacagc catatatcct gatcgttctg tgtttttcca ttgacgacat ccgccagttg tagcgcctgc tgccatagat cttcacgaat attaggatcg gccgtcatcg cagtaaatgc gctggtacgc agatgtaacc attcgccatg tcgccagcag gcactggggc ggaccataaa cgtaaatgaa accgtggatg tccggtgcca ttcatcttgc agcagcgttc tttgcattaa cgcaccaaaa cttgttccgc ctaatctggc gattcccacc ggcagtaggc gcccgtctga ttctggcaag actttggctg acattttttt cccttaaatt ttttcgcaaa atcgtcatgg atttactaaa ttaacgttaa catttgtgat attcatcgca aaagttaacg ttaacaattc accaaatttg tcgattgcat gcggcgcaaa acgccctagc ctatccccat tttcacctcg cgcctcctgc

cgctgttcca tattcgaaat gaaaatttcg 840 accgcatccc gccagatacc ccaagccaaa 900 aaaattgctt tgcagtaacg gttcataaac 960 gatgaaactc atacaccaga tgagcggttt 1020 gtagaacatc ataaatagaa tgctggtaaa 1080 cgtccctgtc aaccctagat gtcctttcag 1140 ccaggaaata aaaaagagaa atgagtaact 1200 tggaatattc agtgccataa ttacctgcct 1260 ataagagcga cttcgccgtt tacttctcac 1320 gtcattgccc ctttcgccgt tactgcaagc 1380 cgtcgcattt ctctctcatc tgtagataat 1440 gcaacgaacg catctcccgc ccccgtgcta 1500 tggtgaactt gtcctcgata acagaccacc 1560 atggcgatct catactcttt tgccagggcg 1620 ctgataagtc gccattcttc ttccgagagc 1680 cgcaaacaca agcggagcaa atgctcgtct 1740 aagctgacaa aacctccggc atgccggatc 1800 gaaggctcgg cagacaacgc aattgaacag 1860 ggcaagtctg tcgtctctaa aaaaagatcg 1920 cgttcccctt gatcgttcag atcgacaagc 1980 ttcagatacg tgatatcgac tccctcagtt 2040 ggatcatccc ccacccgacc tataaaccca 2100 gcaacgttag ctggcgcgcc gccaggacaa 2160 agatctacga ccgcatcccc taaaacccat 2220 catctgagtt acgcatagtg ataaacctct 2280 acatgcatat tcgatcacaa aacgtcatag 2340 tttatgaaag taagggactt tatttttata 2400 cttaaccagg atgattaaaa tgacgcaatc 2460 aaaacttcat gagcaccggg gtaacacttt 2520 cgggtggatg aacgatccaa acggcctgat 2580 ctggtttaac gatcgttatc acgcgtttta

gccaatgcac tggggacatg ccaccagcga

tgcgctagcg ccaggagacg ataatgacaa

tgacaatggt gtcctctcac ttatctacac

tgacgatgca attcgcgaag tacaatgtct

gaaacagggt gtgatcctca ctccaccaga

gtggcgtgaa gccgacacat ggtggatggt

gcagatcctg ctttatcgcg gcagttcgtt

ccacgctgat gcgggtgaaa gctatatgtg

tcagcattat ctgatgtttt ccccgcaggg

tcgctttcaa agtggcgtaa tacccggaat

cgggcatttt actgaacttg ataacgggca

gaaggatggt cggcgtattg ttatcggctg

aaaacgtgaa ggatgggcag gctgcatgac

caaacttcta caacgcccgg tacacgaagc

ctctccccgc acaatcagca ataaatatgt

tcagttgcag tgggcgctga agaacagtga

tggaatgcgg ctgtatattg ataaccaatc

acacgagaat ttagacggct accgtagtat

aaggatattt atcgatacat catccgtgga

gagtagtcga atctatccgc agccagaaga

agtggctgtg ctgcaacatg gagcactctg

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N130SeqFl

<4 00> 40

tgttccaacc tgatcaccg

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

tcaacatcat ccgatgagcg aacactgggg 2640 cgatatgatc cactggcagc atgagcctat 2700 agacgggtgt ttttcaggta gtgctgtcga 2760 cggacacgtc tggctcgatg gtgcaggtaa 2820 ggctaccagt cgggatggta ttcatttcga 2880 aggaatcatg cacttccgcg atcctaaagt 2940 agtcggggcg aaagatccag gcaacacggg 3000 gcgtgaatgg accttcgatc gcgtactggc 3060 ggaatgtccg gactttttca gccttggcga 3120 aatgaatgcc gagggataca gttaccgaaa 3180 gtggtcgcca ggacgacttt ttgcacaatc 3240 tgacttttat gcaccacaaa gctttttagc 3300 gatggatatg tgggaatcgc caatgccctc 3360 gctggcgcgc gagctatcag agagcaatgg 3420 tgagtcgtta cgccagcagc atcaatctgt 3480 tttgcaggaa aacgcgcaag cagttgagat 3540 tgccgaacat tacggattac agctcggcac 3600 tgagcgactt gttttgtggc ggtattaccc 3660 tcccctcccg cagcgtgaca cgctcgccct 3720 agtatttatt aacgacgggg aagcggtgat 3780 acgggaactg tcgctttatg cctcccacgg 3840 gctactgggt taa 3883

19 <220>

<223> Primer N130SeqF2

<400> 41

ggaaaacagc aaggcgct

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N130SeqF3

<400> 42

cagctgaacc agtttgcc

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N130SeqF4

<400> 43

aaaataccag cgcctgtcc

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N130SeqRl

<400> 44

tgaatggcca ccatgttg

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N130SeqR2

<400> 45

gaggatctcc gccgcctg

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N130SeqR3 <400> 46

aggccgagca ggaagatc

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N130SeqR4

<4 00> 47

tgatcaggtt ggaacagcc

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N131SeqFl

<4 00> 48

aagaactgat cccacaggc

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N131SeqF2

<4 00> 49

atcctgtgcg gtatgttgc

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N131Seqf3

<4 00> 50

attgcgatgg tgaaagcg

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N131SeqRl

<400> 51

atggtgttgg caatcagcg <210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N131SeqR2

<400> 52

gtgcttcggt gatggttt

<210> 53

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Priraer N131SeqR3

<400> 53

ttgaaaccgt gcgagtagc

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N132SeqFl

<400> 54

tattcactgc catctcgcg

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N132SeqF2

<400> 55

ccgtaagcag ctgttcct

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N132SeqF3

<400> 56

gctggaacaa tacgacgtta

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N132SeqF4

<400> 57

tgctctaccc aaccagcttc

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N132SeqRl

<400> 58

atggaaagac cagaggtgcc

<210> 59

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N132SeqR2

<4 00> 59

tgcctgtgtg gtacgaat

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <2 20>

<223> Primer N132SeqR3

<4 00> 60

tattacgcgg cagtgcact

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N132SeqR4

<4 00> 61

ggtgattttg tcgcagttag ag

<210> 62

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N133SeqFl <4 00> 62

tcgaaattgt tgggtcgc

18

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

Primer N133SeqF2

<4 00> 63

ggtcacgcag ttcatttcta ag

22

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

Primer N133SeqF3

<4 00> 64

tgtggcaagc cgtagaaa

<210> <211> <212>

65 19 DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

Primer N133SeqF4

<4 00> 65

aggatcgcgt ggtgagtaa

19

<210> <211> <212>

66 20 DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

Primer N133SeqRl

<4 00> 66

gtagccgtcg ttattgatga

20

<210> 67

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

Primer N133SeqR2

<4 00> 67

gcagcgaact aatcagagat tc

22 <210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer N133SeqR3

<400> 68

tggtccgatg tattggagg

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer N133SeqR4

<400> 69

tctgccatat agctcgcgt

<210> 70

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Variante do Promotor 1.6 GI

<400> 70

gcccttgaca atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca

<210> 71

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Promotor 1.5GI

<400> 71

gcccttgact atgccacatc ctgagcaaat aattcaacca

<210> 72

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Scrl

<400> 72

cctttctttg tgaatcgg

<210> 73

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Scr2 <400> 73

agaaacaggg tgtgatcc 18

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Scr3

<4 00> 74

agtgatcatc acctgttgcc 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Scr4

<4 00> 75

agcacggcga gagtcgacgg 20

<210> 76 <211> 672 <212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae <4 00> 76

agttcgagtt tatcattatc aatactgcca tttcaaagaa tacgtaaata attaatagta 60

gtgattttcc taactttatt tagtcaaaaa attagccttt taattctgct gtaacccgta 120

catgcccaaa atagggggcg ggttacacag aatatataac atcgtaggtg tctgggtgaa 180

cagtttattc ctggcatcca ctaaatataa tggagcccgc tttttaagct ggcatccaga 240

aaaaaaaaga atcccagcac caaaatattg ttttcttcac caaccatcag ttcataggtc 300

cattctctta gcgcaactac agagaacagg ggcacaaaca ggcaaaaaac gggcacaacc 360

tcaatggagt gatgcaacct gcctggagta aatgatgaca caaggcaatt gacccacgca 420

tgtatctatc tcattttctt acaccttcta ttaccttctg ctctctctga tttggaaaaa 480

gctgaaaaaa aaggttgaaa ccagttccct gaaattattc ccctacttga ctaataagta 540

tataaagacg gtaggtattg attgtaattc tgtaaatcta tttcttaaac ttcttaaatt 600

ctacttttat agttagtctt ttttttagtt ttaaaacacc aagaacttag tttcgaataa 660

acacacataa ac 672 <210> 77 <211> 270 <212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae <400> 77

gacctcgagt catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc cccacatccg 60

ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta 120

tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca 180

gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct 240

cgaaggcttt aatttgcggc cggtacccaa 270

<210> 78 <211> 1716 <212> DNA

<213> Bacillus subtilis <400> 78

atgttgacaa aagcaacaaa agaacaaaaa tcccttgtga aaaacagagg ggcggagctt 60

gttgttgatt gcttagtgga gcaaggtgtc acacatgtat ttggcattcc aggtgcaaaa 120

attgatgcgg tatttgacgc tttacaagat aaaggacctg aaattatcgt tgcccggcac 180

gaacaaaacg cagcattcat ggcccaagca gtcggccgtt taactggaaa accgggagtc 240

gtgttagtca catcaggacc gggtgcctct aacttggcaa caggcctgct gacagcgaac 300

actgaaggag accctgtcgt tgcgcttgct ggaaacgtga tccgtgcaga tcgtttaaaa 360

cggacacatc aatctttgga taatgcggcg ctattccagc cgattacaaa atacagtgta 420

gaagttcaag atgtaaaaaa tataccggaa gctgttacaa atgcatttag gatagcgtca 480

gcagggcagg ctggggccgc ttttgtgagc tttccgcaag atgttgtgaa tgaagtcaca 540

aatacgaaaa acgtgcgtgc tgttgcagcg ccaaaactcg gtcctgcagc agatgatgca 600

atcagtgcgg ccatagcaaa aatccaaaca gcaaaacttc ctgtcgtttt ggtcggcatg 660

aaaggcggaa gaccggaagc aattaaagcg gttcgcaagc ttttgaaaaa ggttcagctt 720

ccatttgttg aaacatatca agctgccggt accctttcta gagatttaga ggatcaatat 780

tttggccgta tcggtttgtt ccgcaaccag cctggcgatt tactgctaga gcaggcagat 840

gttgttctga cgatcggcta tgacccgatt gaatatgatc cgaaattctg gaatatcaat 900

ggagaccgga caattatcca tttagacgag attatcgctg acattgatca tgcttaccag 960

cctgatcttg aattgatcgg tgacattccg tccacgatca atcatatcga acacgatgct 1020

gtgaaagtgg aatttgcaga gcgtgagcag aaaatccttt ctgatttaaa acaatatatg 1080

catgaaggtg agcaggtgcc tgcagattgg aaatcagaca gagcgcaccc tcttgaaatc 1140 gttaaagagt tgcgtaatgc agtcgatgat catgttacag taacttgcga tatcggttcg 1200

cacgccattt ggatgtcacg ttatttccgc agctacgagc cgttaacatt aatgatcagt 1260

aacggtatgc aaacactcgg cgttgcgctt ccttgggcaa tcggcgcttc attggtgaaa 1320

ccgggagaaa aagtggtttc tgtctctggt gacggcggtt tcttattctc agcaatggaa 1380

ttagagacag cagttcgact aaaagcacca attgtacaca ttgtatggaa cgacagcaca 1440

tatgacatgg ttgcattcca gcaattgaaa aaatataacc gtacatctgc ggtcgatttc 1500

ggaaatatcg atatcgtgaa atatgcggaa agcttcggag caactggctt gcgcgtagaa 1560

tcaccagacc agctggcaga tgttctgcgt caaggcatga acgctgaagg tcctgtcatc 1620

atcgatgtcc cggttgacta cagtgataac attaatttag caagtgacaa gcttccgaaa 1680

gaattcgggg aactcatgaa aacgaaagct ctctag 1716

<210> 79 <211> 643 <212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae <4 00> 79

gaaatgaata acaatactga cagtactaaa taattgccta cttggcttca catacgttgc 60

atacgtcgat atagataata atgataatga cagcaggatt atcgtaatac gtaatagttg 120

aaaatctcaa aaatgtgtgg gtcattacgt aaataatgat aggaatggga ttcttctatt 180

tttccttttt ccattctagc agccgtcggg aaaacgtggc atcctctctt tcgggctcaa 240

ttggagtcac gctgccgtga gcatcctctc tttccatatc taacaactga gcacgtaacc 300

aatggaaaag catgagctta gcgttgctcc aaaaaagtat tggatggtta ataccatttg 360

tctgttctct tctgactttg actcctcaaa aaaaaaaaat ctacaatcaa cagatcgctt 420

caattacgcc ctcacaaaaa cttttttcct tcttcttcgc ccacgttaaa ttttatccct 480

catgttgtct aacggatttc tgcacttgat ttattataaa aagacaaaga cataatactt 540

ctctatcaat ttcagttatt gttcttcctt gcgttattct tctgttcttc tttttctttt 600

gtcatatata accataacca agtaatacat attcaaatct aga 643

<210> 80 <211> 1188 <212> DNA

<213> Saccharomyces eerevisiae <4 00> 80

atgttgagaa ctcaagccgc cagattgatc tgcaactccc gtgtcatcac tgctaagaga 60

acctttgctt tggccacccg tgctgctgct tacagcagac cagctgcccg tttcgttaag 120 ccaatgatca ctacccgtgg tttgaagcaa tacgaaagag ctgactggcc aagagaaaag gctttgatcg gttacggttc ccaaggttac ttgaacgtta tcattggtgt ccgtaaagat ggttgggttc caggcaagaa cttgttcact gttatgaact tgttgtccga tgccgctcaa ttgaccaagg gtaagacttt gtacttctcc actcacgttg aaccaccaaa ggacttagat agaactgtca gatctttgtt caaggaaggt aacgatgtca ccggtaaggc tcacgaaaag ggttacgttt accaaaccac tttcgaaaga ggttgtttaa tgggtggtat ccacggtatg aacggtcact ccccatctga agctttcaac tacccattga tcggtaagta cggtatggat agaagaggtg ctttggactg gtacccaatc gacttgtacg aatctaccaa gaacggtacc caacctgact acagagaaaa gctagaaaag tggaaggttg gtaaggaagt cagaaagttg

<210> 81 <211> 760 <212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae <400> 81

tcttttccga tttttttcta aaccgtggaa tgtacaatat ggacttcctc ttttctggca accttcgttg gtctccctaa catgtaggtg ccagacaaga cataatgggc taaacaagac gtacataacg aactaatact gtagccctag actacccttt ttccatttgc catctattga tttttttttc ttttctctct cccccgttgt tgatggaaga cactaaagga aaaaattaac tccagagctg atgaggggta tctcgaagca

atcaacttcg gtggtactgt tgaaaccgtc 180 ttgttggact acttcaagaa cgacactttt 240 ggtcaaggtt tgaacttgag agacaacggt 300 ggtgcttctt ggaaggctgc catcgaagac 360 gttgaagatg ctatcaagag aggtagttac 420 tcagaaacct ggcctgctat caagccattg 480 cacggtttct ccccagtctt caaggacttg 540 gttatcttgg ttgctccaaa gggttccggt 600 cgtggtatta actcttctta cgccgtctgg 660 gcccaagctt tggccgttgc cattggttcc 720 gaagtcaact ctgacttgta cggtgaaaga 780 ttcttggctc aatacgacgt cttgagagaa 840 gaaaccgtcg aagaagctac ccaatctcta 900 tacatgtacg atgcttgttc caccaccgcc 960 ttcaagaatg ctttgaagcc tgttttccaa 1020 gaaaccaaga gatctttgga attcaactct 1080 gaattagaca ccatcagaaa catggaaatc 1140 agaccagaaa accaataa 1188

tatttcggat atccttttgt tgtttccggg 60

accaaaccca tacatcggga ttcctataat 120

gcggagggga gatatacaat agaacagata 180

tacaccaatt acactgcctc attgatggtg 240

acttgatagc catcatcata tcgaagtttc 300

agtaataata ggcgcatgca acttcttttc 360

tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa 420

gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt 480

cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc 540 acactactct ctaatgagca acggtatacg gccttccttc cagttacttg aatttgaaat 600

aaaaaaaagt ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac ctgcaattat taatcttttg 660

tttcctcgtc attgttctcg ttccctttct tccttgtttc tttttctgca caatatttca 720

agctatacca agcatacaat caactatctc atatacaatg 760

<210> 82 <211> 316 <212> DNA

<213> Saccharomyces cerevísiae <400> 82

gagtaagcga atttcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat aaaaaaaata 60

agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt attcttgagt 120

aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc atgaggtcgc tcttattgac 180

cacacctcta ccggcatgcc gagcaaatgc ctgcaaatcg ctccccattt cacccaattg 240

tagatatgct aactccagca atgagttgat gaatctcggt gtgtatttta tgtcctcaga 300

ggacaacacc tgtggt 316

<210> 83 <211> 1758 <212> DNA

<213> Saccharomyces eerevisiae <4 00> 83

atgggcttgt taacgaaagt tgctacatct agacaattct ctacaacgag atgcgttgca 60

aagaagctca acaagtactc gtatatcatc actgaaccta agggccaagg tgcgtcccag 120

gccatgcttt atgccaccgg tttcaagaag gaagatttca agaagcctca agtcggggtt 180

ggttcctgtt ggtggtccgg taacccatgt aacatgcatc tattggactt gaataacaga 240

tgttctcaat ccattgaaaa agcgggtttg aaagctatgc agttcaacac catcggtgtt 300

tcagacggta tctctatggg tactaaaggt atgagatact cgttacaaag tagagaaatc 360

attgcagact cctttgaaac catcatgatg gcacaacact acgatgctaa catcgccatc 420

ccatcatgtg acaaaaacat gcccggtgtc atgatggcca tgggtagaca taacagacct 480

tccatcatgg tatatggtgg tactatcttg cccggtcatc caacatgtgg ttcttcgaag 540

atctctaaaa acatcgatat cgtctctgcg ttccaatcct acggtgaata tatttccaag 600

caattcactg aagaagaaag agaagatgtt gtggaacatg catgcccagg tcctggttct 660

tgtggtggta tgtatactgc caacacaatg gcttctgccg ctgaagtgct aggtttgacc 720

attccaaact cctcttcctt cccagccgtt tccaaggaga agttagctga gtgtgacaac 780

attggtgaat acatcaagaa gacaatggaa ttgggtattt tacctcgtga tatcctcaca 840 aaagaggctt ttgaaaacgc cattacttat gttttgcatt tggtggctgt tgctcactct caaagaatca gtgatactac accattgatc atggccgatt tgattaacgt tggtggtacc aacatgttgc acggtaacac aatgactgtt aaagcaccaa gcctacctga aggacaagag gccaacggtc acttgcaaat tctgtacggt attaccggta aggaaggtac ttacttcaag gcctttattg aagccttgga aagaggtgaa atcagatatg aaggtccaag aggtgcacca gctctgatgg gttacggttt gggtaaagat ggtggttctc acgggttctt aatcggccac atcgggttgg tcagagacgg cgatgagatt ctattagtct ctgataagga aatggctcaa cgttacacaa gaggtactct atccaagtat tgtgttttag atgcttga

<210> 84 <211> 753 <212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae <4 00> 84

gcatgcttgc atttagtcgt gcaatgtatg gagaatcttc taacgataaa cccttgaaaa acgcaggctg cacaattaca cgagaatgct caatgcagac gacagatcta aatgaccgtg aacacatgca gtgatgcacg cgcgatggtg gtgatgtcta agtaaccttt atggtatatt cccacacaca agcttcgtct tttcttgaag ctttccgttc cctgccagct gatggaaaaa agatccactg aggtgaaatt tcagctgaca aacgagttgt ggctgttgcc agggagggtg ctacttgggt ttgttatata acaaagaaga

gtcgttgcaa ccggtgggtc cactaatgct 900 gcgggtgtca agttgtcacc agatgatttc 960 ggtgacttca aaccttctgg taaatacgtc 1020 caatctgtga ttaagtatct atatgaaaac 1080 accggtgaca ctttggcaga acgtgcaaag 1140 attattaagc cactctccca cccaatcaag 1200 tcattggcac caggtggagc tgtgggtaaa 1260 ggtagagcac gtgtgttcga agaggaaggt 1320 atcaagaagg gtgaaaaaac cgttgttgtt 1380 ggtatgcctg aaatgctaaa gccttcctct 1440 gttgcattgt tgactgatgg tagattctct 1500 attgttcccg aagccgctga aggtggtcct 1560 atcattgatg ctgataataa caagattgac 1620 cgtaaacaaa gttgggttgc acctccacct 1680 gctaagttgg tttccaacgc ttccaacggt 1740

1758

actttaagat ttgtgagcag gaagaaaagg 60

actgggtaga ctacgctatg ttgagttgct 120

cccgcctagg atttaaggct aagggacgtg 180

tcggtgaagt gttcgccaaa cttttcggtt 240

ctaagttaca tatatatata tatagccata 300

tcttaatgtg gaaagatact agcgcgcgca 360

aaaagaggaa gctcgctaaa tgggattcca 420

ggttagtgga acgatgaaga ataaaaagag 480

gcgagtttca tgatcgtgat gaacaatggt 540

gttctcaact tttaatgtat ggccaaatcg 600

aataatgaac tgattctctt cctccttctt 660 gtcctttctt aattctgttg taattacctt cctttgtaat tttttttgta attattcttc 720 ttaataatcc aaacaaacac acatattaca ata 753

<210> <211> <212>

85 20 DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

Primer N98SeqFl

<4 00> 85

cgtgttagtc acatcaggac

<210> <211> <212>

86 24 DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N98SeqF2 <4 00> 86

ggccatagca aaaatccaaa cagc

<210> <211> <212>

87 24 DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

Primer N98SeqF3

<4 00> 87

ccacgatcaa tcatatcgaa cacg

<210> <211> <212>

20 DNA

<213> Seqüência Artificial

<220> <223>

Primer N98SeqF4

<4 00> 88

ggtttctgtc tctggtgacg

<210> <211> <212>

89 22 DNA

<213> Seqüência Artificial Primer N99SeqRl

<220> <223>

20

24

20

<4 00> 89

gtctggtgat tctacgcgca ag

22 <210> 90

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N99SeqR2

<400> 90

catcgactgc attacgcaac tc

<210> 91

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N99SeqR3

<400> 91

cgatcgtcag aacaacatct gc

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N99SeqR4

<400> 92

ccttcagtgt tcgctgtcag

<210> 93

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν136

<400> 93

ccgcggatag atctgaaatg aataacaata

<210> 94

<211> 65

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν137

<400> 94

taccaccgaa gttgatttgc ttcaacatcc gttat

22

20

ctgaca 36

tcagctctag atttgaatat gtattacttg 60

65

<210> 95 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer Ν138

<400> 95

atgttgaagc aaatcaactt cggtggta

<210> 96

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν139

<400> 96

ttattggttt tctggtctca ac

<210> 97

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer Ν140

<400> 97

aagttgagac cagaaaacca ataattaatt aatcatgtaa ttagttatgt cacgctt

<210> 98

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N141

<400> 98

gcggccgccc gcaaattaaa gccttcgagc

<210> 99

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer N142

<400> 99

ggatccgcat gcttgcattt agtcgtgc

<210> 100

<211> 56

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Ν143

<400> 100

caggtaatcc cccacagtat acatcctcag ctattgtaat atgtgtgttt gtttgg

<210> 101

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν144

<400> 101

atgtatactg tgggggatta cc

<210> 102

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν145

<400> 102

ttagctttta ttttgctccg ca

<210> 103

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν146

<4 00> 103

tttgcggagc aaaataaaag ctaattaatt aagagtaagc gaatttctta tgattta

<210> 104

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N147

<400> 104

actagtacca caggtgttgt cctctgag

<210> 105

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N151 <400> 105

ctagagagct ttcgttttca tg

<210> 106

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν152

<400> 106

ctcatgaaaa cgaaagctct ctagttaatt

<210> 107

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν155

<400> 107

atggcaaaga agctcaacaa gtact

<210> 108

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν156

<400> 108

tcaagcatct aaaacacaac cg

<210> 109

<211> 57

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν157

<400> 109

aacggttgtg ttttagatgc ttgattaatt

<210> 110

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν158

aatcatgtaa ttagttatgt cacgctt 57

25

22

aagagtaagc gaatttctta tgattta 57

<4 00> 110

ggatcctttt ctggcaacca aacccata

28 <210> 111

<211> 56

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν159

<4 00> 111

cgagtacttg ttgagcttct ttgccatcct cagcgagata gttgattgta tgcttg

56

<210> 112

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N160SeqFl

<4 00> 112

gaaaacgtgg catcctctc

19

<210> 113

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N160SeqF2

<400> 113

gctgactggc caagagaaa 19

<210> 114

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer N160SeqF3 <4 00> 114

tgtacttctc ccacggtttc 20

<210> 115

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N160SeqF4

<4 00> 115

agctacccaa tctctatacc ca 22

<210> 116

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <223> Primer N160SeqF5

<4 00> 116

cctgaagtct aggtccctat tt

<210> 117

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Nl60SeqRl

<4 00> 117

gcgtgaatgt aagcgtgac

<210> 118

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N160SeqR2

<4 00> 118

cgtcgtattg agccaagaac

<210> 119

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N160SeqR3

<4 00> 119

gcatcggaca acaagttcat

<210> 120

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N160SeqR4

<400> 120

tcgttcttga agtagtccaa ca

<210> 121

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N160SeqR5 <400> 121

tgagcccgaa agagaggat

<210> 122

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqFl

<4 00> 122

acggtatacg gccttcctt

<210> 123

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqF2

<4 00> 123

gggtttgaaa gctatgcagt

<210> 124

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqF3

<4 00> 124

ggtggtatgt atactgccaa ca

<210> 125

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqF4

<4 00> 125

ggtggtaccc aatctgtgat ta

<210> 126

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqF5

<4 00> 126

cggtttgggt aaagatgttg <210> 127

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqF6

<400> 127

aaacgaaaat tcttattctt ga

<210> 128

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqRl

<400> 128

tcgttttaaa acctaagagt ca

<210> 129

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqR2

<400> 129

ccaaaccgta acccatcag

<210> 130

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqR3

<400> 130

cacagattgg gtaccacca

<210> 131

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161Seqr4

<400> 131

accacaagaa ccaggacctg

<210> 132

<211> 19

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqR5 <4 00> 132

catagctttc aaacccgct

19

<210> 133

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N161SeqR6

<4 00> 133

cgtataccgt tgctcattag ag

<210> 134

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν162

<4 00> 134

atgttgacaa aagcaacaaa aga

<210> 135

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν189

<400> 135

atccgcggat agatctagtt cgagtttatc attatcaa

<210> 136

<211> 53

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N190.1

22

23

38

<4 00> 136

ttcttttgtt gcttttgtca acatcctcag cgtttatgtg tgtttattcg aaa

<210> 137

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

53

<220>

<223> Primer N176 <400> 137

atccgcggat agatctatta gaagccgccg agcgggcg

<210> 138

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Ν177

<400> 138

atcctcagct tttctccttg acgttaaagt a

<210> 139 <211> 477 <212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 139

Met Thr Gln Ser Arg Leu His Ala Ala Gln Asn Ala Leu Ala Lys Leu 1 5 10 15

His Glu His Arg Gly Asn Thr Phe Tyr Pro His Phe His Leu Ala Pro 20 25 30

Pro Ala Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Ile Trp Phe Asn Asp 35 40 45

Arg Tyr His Ala Phe Tyr Gln His His Pro Met Ser Glu His Trp Gly 50 55 60

Pro Met His Trp Gly His Ala Thr Ser Asp Asp Met Ile His Trp Gln 65 70 75 80

His Glu Pro Ile Ala Leu Ala Pro 85

Cys Phe Ser Gly Ser Ala Val Asp 100

Tyr Thr Gly His Val Trp Leu Asp 115 120

Arg Glu Val Gln Cys Leu Ala Thr 130 135

Lys Gln Gly Val Ile Leu Thr Pro 145 150

Asp Pro Lys Val Trp Arg Glu Ala 165

Ala Lys Asp Pro Gly Asn Thr Gly 180

Gly Asp Asp Asn Asp Lys Asp Gly 90 95

Asp Asn Gly Val Leu Ser Leu Ile 105 110

Gly Ala Gly Asn Asp Asp Ala Ile 125

Ser Arg Asp Gly Ile His Phe Glu 140

Pro Glu Gly Ile Met His Phe Arg 155 160

Asp Thr Trp Trp Met Val Val Gly 170 175

Gln Ile Leu Leu Tyr Arg Gly Ser 185 190

Ser Leu Arg Glu Trp Thr Phe Asp Arg Val Leu Ala His Ala Asp Ala 195 200 205 Gly Glu Ser Tyr Met Trp Glu Cys Pro Asp Phe Phe Ser Leu Gly Asp 210 215 220

Gln His Tyr Leu Met Phe Ser Pro Gln Gly Met Asn Ala Glu Gly Tyr 225 230 235 240

Ser Tyr Arg Asn Arg Phe Gln Ser Gly Val Ile Pro Gly Met Trp Ser 245 250 255

Pro Gly Arg Leu Phe Ala Gln Ser Gly His Phe Thr Glu Leu Asp Asn 260 265 270

Gly His

Arg Ile 290

Lys Arg 305

Glu Ser

Leu Arg

Tyr Val

Ala Leu 370

Gly Met 385

Arg Tyr

Asp Phe 275

Val Ile

Glu Gly

Asn Gly

Gln Gln 340

Leu Gln 355

Lys Asn Arg Leu Tyr Pro

Tyr Ala

Gly Trp

Trp Ala 310

Lys Leu 325

His Gln

Glu Asn

Ser Asp

Tyr Ile 390

His Glu 405

Pro Gln 280

Met Asp 295

Gly Cys

Leu Gln

Ser Val

Ala Gln 360

Ala Glu 375

Asp Asn Asn Leu

Ser Phe

Met Trp

Met Thr

Arg Pro 330

Ser Pro 345

Ala Val

His Tyr

Gln Ser

Asp Gly 410

Leu Ala

Glu Ser 300

Leu Ala 315

Val His

Arg Thr

Glu Ile

Gly Leu 380

Glu Arg 395

Tyr Arg

Lys Asp 285

Pro Met

Arg Glu

Glu Ala

Ile Ser 350

Gln Leu 365

Gln Leu Leu Val Ser Ile

Gly Arg

Pro Ser

Leu Ser 320

Glu Ser 335

Asn Lys

Gln Trp

Gly Thr

Leu Trp 400

Pro Leu 415

Pro Gln Arg Asp Thr Leu Ala Leu Arg Ile Phe Ile Asp Thr Ser Ser 420 425 430

Val Glu Val Phe Ile Asn Asp Gly Glu Ala Val Met Ser Ser Arg Ile 435 440 445

Tyr Pro Gln Pro Glu Glu Arg Glu Leu Ser Leu Tyr Ala Ser His Gly 450 455 460

Val Ala Val Leu Gln His Gly Ala Leu Trp Leu Leu Gly 465 470 475

<210> 140

<211> 304

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 140

Met Ser Ala Lys Val Trp Val Leu Gly Asp Ala Val Val Asp Leu Leu 15 10 15 Pro Glu Ser Asp Gly Arg Leu Leu Pro Cys Pro Gly Gly Ala Pro Ala 20 25 30

Asn Val Ala Val Gly Ile Ala Arg Leu Gly Gly Thr Ser Gly Phe Ile 35 40 45

Gly Arg Val Gly Asp Asp Pro Phe Gly Ala Leu Met Gln Arg Thr Leu 50 55 60

Leu Thr Glu Gly Val Asp Ile Thr Tyr Leu Lys Gln Asp Glu Trp His 65 70 75 80

Arg Thr Ser Thr Val Leu Val Asp Leu Asn Asp Gln Gly Glu Arg Ser 85 90 95

Phe Thr Phe Met Val Arg Pro Ser Ala Asp Leu Phe Leu Glu Thr Thr 100 105 110

Asp Leu Pro Cys Trp Arg His Gly Glu Trp Leu His Leu Cys Ser Ile 115 120 125

Ala Leu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Thr Ser Ala Phe Thr Ala Met Thr 130 135 140

Ala Ile Arg His Ala Gly Gly Phe Val Ser Phe Asp Pro Asn Ile Arg 145 150 155 160

Glu Asp Leu Trp Gln Asp Glu His Leu Leu Arg Leu Cys Leu Arg Gln 165 170 175

Ala Leu Gln Leu Ala Asp Val Val Lys Leu Ser Glu Glu Glu Trp Arg 180 185 190

Leu Ile Ser Gly Lys Thr Gln Asn Asp Gln Asp Ile Cys Ala Leu Ala 195 200 205

Lys Glu Tyr Glu Ile Ala Met Leu Leu Val Thr Lys Gly Ala Glu Gly 210 215 220

Val Val Val Cys Tyr Arg Gly Gln Val His His Phe Ala Gly Met Ser 225 230 235 240

Val Asn Cys Val Asp Ser Thr Gly Ala Gly Asp Ala Phe Val Ala Gly 245 250 255

Leu Leu Thr Gly Leu Ser Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp Glu Arg Glu 260 265 270

Met Arg Arg Ile Ile Asp Leu Ala Gln Arg Cys Gly Ala Leu Ala Val 275 280 285

Thr Ala Lys Gly Ala Met Thr Ala Leu Pro Cys Arg Gln Glu Leu Glu 290 295 300

<210> 141

<211> 415

<212> PRT

<213> Escherichia coli <400> 141

Met Ala Leu Asn Ile Pro Phe Arg Asn Ala Tyr Tyr Arg Phe Ala Ser 15 10 15

Ser Tyr Ser Phe Leu Phe Phe Ile Ser Trp Ser Leu Trp Trp Ser Leu 20 25 30

Tyr Ala Ile Trp Leu Lys Gly His Leu Gly Leu Thr Gly Thr Glu Leu 35 40 45

Gly Thr Leu Tyr Ser Val Asn Gln Phe Thr Ser Ile Leu Phe Met Met 50 55 60

Phe Tyr Gly Ile Val Gln Asp Lys Leu Gly Leu Lys Lys Pro Leu Ile 65 70 75 80

Trp Cys Met Ser Phe Ile Leu Val Leu Thr Gly Pro Phe Met Ile Tyr 85 90 95

Val Tyr Glu Pro Leu Leu Gln Ser Asn Phe Ser Val Gly Leu Ile Leu 100 105 110

Gly Ala Leu Phe Phe Gly Leu Gly Tyr Leu Ala Gly Cys Gly Leu Leu 115 120 125

Asp Ser Phe Thr Glu Lys Met Ala Arg Asn Phe His Phe Glu Tyr Gly 130 135 140

Thr Ala Arg Ala Trp Gly Ser Phe Gly Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Phe 145 150 155 160

Ala Gly Ile Phe Phe Ser Ile Ser Pro His Ile Asn Phe Trp Leu Val 165 170 175

Ser Leu Phe Gly Ala Val Phe Met Met Ile Asn Met Arg Phe Lys Asp 180 185 190

Lys Asp His Gln Cys Val Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val Lys Lys Glu 195 200 205

Asp Phe Ile Ala Val Phe Lys Asp Arg Asn Phe Trp Val Phe Val Ile 210 215 220

Phe Ile Val Gly Thr Trp Ser Phe Tyr Asn Ile Phe Asp Gln Gln Leu 225 230 235 240

Phe Pro Val Phe Tyr Ser Gly Leu Phe Glu Ser His Asp Val Gly Thr 245 250 255

Arg Leu Tyr Gly Tyr Leu Asn Ser Phe Gln Val Val Leu Glu Ala Leu 260 265 270

Cys Met Ala Ile Ile Pro Phe Phe Val Asn Arg Val Gly Pro Lys Asn 275 280 285

Ala Leu Leu Ile Gly Val Val Ile Met Ala Leu Arg Ile Leu Ser Cys 290 295 300 Ala Leu Phe Val Asn Pro Trp Ile Ile Ser Leu Val Lys Leu Leu His 305 310 315 320

Ala Ile Glu Val Pro Leu Cys Val Ile Ser Val Phe Lys Tyr Ser Val 325 330 335

Ala Asn Phe Asp Lys Arg Leu Ser Ser Thr Ile Phe Leu Ile Gly Phe 340 345 350

Gln Ile Ala Ser Ser Leu Gly Ile Val Leu Leu Ser Thr Pro Thr Gly 355 360 365

Ile Leu Phe Asp His Ala Gly Tyr Gln Thr Val Phe Phe Ala Ile Ser 370 375 380

Gly Ile Val Cys Leu Met Leu Leu Phe Gly Ile Phe Phe Leu Ser Lys 385 390 395 400

Lys Arg Glu Gln Ile Val Met Glu Thr Pro Val Pro Ser Ala Ile 405 410 415

<210> 142 <211> 6341 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo pFP988DssPspac <4 00> 142

gatccaagtt taaactgtac actagatatt tcttctccgc ttaaatcatc aaagaaatct 60 ttatcacttg taaccagtcc gtccacatgt cgaattgcat ctgaccgaat tttacgtttc 120 cctgaataat tctcatcaat cgtttcatca attttatctt tatactttat attttgtgcg 180 ttaatcaaat cataattttt atatgtttcc tcatgattta tgtctttatt attatagttt 240 ttattctctc tttgattatg tctttgtatc ccgtttgtat tacttgatcc tttaactctg 300 gcaaccctca aaattgaatg agacatgcta cacctccgga taataaatat atataaacgt 360 atatagattt cataaagtct aacacactag acttatttac ttcgtaatta agtcgttaaa 420 ccgtgtgctc tacgaccaaa actataaaac ctttaagaac tttctttttt tacaagaaaa 480 aagaaattag ataaatctct catatctttt attcaataat cgcatccgat tgcagtataa 540 atttaacgat cactcatcat gttcatattt atcagagctc gtgctataat tatactaatt 600 ttataaggag gaaaaaatat gggcattttt agtatttttg taatcagcac agttcattat 660 caaccaaaca aaaaataagt ggttataatg aatcgttaat aagcaaaatt catataacca 720 aattaaagag ggttataatg aacgagaaaa atataaaaca cagtcaaaac tttattactt 780 caaaacataa tatagataaa ataatgacaa atataagatt aaatgaacat gataatatct 840 ttgaaatcgg ctcaggaaaa ggccatttta cccttgaatt agtaaagagg tgtaatttcg 900 taactgccat tgaaatagac cataaattat acgataattt ccaagtttta aacaaggata cctataaaat atatggtaat ataccttata tttttgatag tatagctaat gagatttatt tattaaatac aaaacgctca ttggcattac taagtatggt tccaagagaa tattttcatc gattaagtag aaaaaaatca agaatatcac ttatgaaatg ggttaacaaa gaatacaaga ccttaaaaca tgcaggaatt gacgatttaa ttttcaatag ctataaatta tttaataagt caactacagc tcaggcgaca accatacgct ccacaaatac ttagtatttg aagcaaacac atctttattt aacaaagcat actatggcaa aaaacttctg caaagcgata aaaaacgcac gattgagcta aacgatgatt acacactgaa cacagtaaca gatgaaattg aacgcgcgaa gttcactgac tcccgcggat caaaaatgac catgcttggt tatgtttcta attctttaac ccttgtgtta aaaatggatc ttgatcctaa tgtacctcaa gcgaaaggaa acaatgtcgt ctacgcagac aaacaatcaa cgtttgcgcc ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac agcagaaggc catcctgacg gatggccttt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg tatcattacc cccatgaaca gaaattcccc

gcaaaactac agaaaataaa cttgttgatc 960 tattgcagtt taaatttcct aaaaaccaat 1020 acataagtac ggatataata cgcaaaattg 1080 taatcgtgga atacgggttt gctaaaagat 1140 ttttaatggc agaagttgat atttctatat 1200 ctaaacctaa agtgaatagc tcacttatca 1260 acaaagataa acaaaagtat aattatttcg 1320 aaatatttac aaaaaatcaa tttaacaatt 1380 acaatattag ctttgaacaa ttcttatctc 1440 aagttaaggg atgcagttca tcgatgaagg 1500 gagagatcct cactacgtag aagataaagg 1560 tggaactgaa gatggctacc aaggcgaaga 1620 aagcacatca ttcttccgtc aagaaagtca 1680 ggctgagtta gcaaacggcg ctctcggtat 1740 aaaagtgatg aaaccgctga ttgcatctaa 1800 cgtctttaaa atgaacggca aatggtacct 1860 gattgacggc attacgtcta acgatattta 1920 tggcccatac aagccgctga acaaaactgg 1980 cgatgtaacc tttacttact cacacttcgc 2040 gattacaagc tatatgacaa acagaggatt 2100 aagcttgcat gcgagagtag ggaactgcca 2160 aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt 2220 atccgccggg agcggatttg aacgttgcga 2280 gcccgccata aactgccagg catcaaatta 2340 ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt 2400 catgctccgg atctgcatcg caggatgctg 24 60 attaacgaag cgctggcatt gaccctgagt 2520 cgccagttgt ttaccctcac aacgttccag 2580 tatcgtgagc atcctctctc gtttcatcgg 2640 cttacacgga ggcatcaagt gaccaaacag 2700 gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc cgtagcgata gcggagtgta tactggctta gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg ccactggtaa caggattagc agagcgaggt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ttttggtcat gagattatca aaaaggatct gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg taccgcgaga cccacgctca ccggctccag gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca

atcagaagcc agacattaac gcttctggag 2760 gcagacatct gtgaatcgct tcacgaccac 2820 cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 2880 tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 2940 gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca 3000 actatgcggc atcagagcag attgtactga 3060 acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 3120 cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 3180 ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 3240 aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 3300 acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 3360 gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 3420 ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 3480 gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 3540 cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 3600 taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 3660 atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 3720 cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 3780 cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 3840 ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 3900 ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 3960 tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 4020 aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 4080 tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 4140 gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 4200 atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 4260 tatccgcctc catccagtct attaattgtt 4320 ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 4380 ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 4440 tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 4500 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg cactgcataa ttctcttact gtcatgccat actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta caatacggga taataccgcg ccacatagca gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa tactcatact cttccttttt caatattatt gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg gacacatgca gctcccggag acggtcacag aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttc aggagggctg gaagaagcag accgctaaca aacatcaaaa agtttgcaaa acaagcaaca ggaggcgcaa ctcaagcgtt tgcgaaagaa ggcatttccc atattacacg ccatgatatg aaatatcaag ttcctgaatt cgattcgtcc ctggacgttt gggacagctg gccattacaa ggctaccaca tcgtctttgc attagccgga tacatgttct atcaaaaagt cggcgaaact gtctttaaag acagcgacaa attcgatgca gaatggtcag gttcagccac atttacatct ttctccggta aacattacgg caaacaaaca tcagacagct ctttgaacat caacggtgta ggaaaaacgt atcaaaatgt acagaattcg cagactattc ggcactgaaa ttatgggtga aatagcgcac cctgaagaag atttatttga agatatccta acagcacaag agcggaaaga ctaaaattcc tgaaaaattt tgcaaaaagt

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 4560 ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 4620 tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4680 gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4740 taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4800 cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 4860 agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 4 920 gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 4 980 ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 5040 ccattattat catgacatta acctataaaa 5100 cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 5160 cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 5220 atgtgcgtaa ctaacttgcc atcttcaaac 5280 cagtacataa aaaaggagac atgaacgatg 5340 gtattaacct ttactaccgc actgctggca 5400 acgaaccaaa agccatataa ggaaacatac 5460 ctgcaaatcc ctgaacagca aaaaaatgaa 5520 acaattaaaa atatctcttc tgcaaaaggc 5580 aacgctgacg gcactgtcgc aaactatcac 5640 gatcctaaaa atgcggatga cacatcgatt 5700 tctattgaca gctggaaaaa cgctggccgc 5760 aatgattcta tcctaaaaga ccaaacacaa 5820 gacggaaaaa tccgtttatt ctacactgat 5880 ctgacaactg cacaagttaa cgtatcagca 5940 gaggattata aatcaatctt tgacggtgac 6000 agctctcgag taattctaca cagcccagtc 6060 agtggtcaag acctcactag gcaccttaaa 6120 ggtagccctt gcctacctag cttccaagaa 6180 tgttttgttc tacatccaga acaacctctg 6240 tgttgacttt atctacaagg tgtggcataa 6300 tgtgtggaat tgtgagcgct cacaattaag

<210> 143 <211> 6221 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Plasmideo pFP988DssPgroE <400> 143

tcgagagcta ttgtaacata atcggtacgg aaaagaatga tgtaagcgtg aaaaattttt tctttattat aagaattgtg gaattgtgag ctagtggatc caagtttaaa ctgtacacta aaatctttat cacttgtaac cagtccgtcc cgtttccctg aataattctc atcaatcgtt tgtgcgttaa tcaaatcata atttttatat tagtttttat tctctctttg attatgtctt actctggcaa ccctcaaaat tgaatgagac aaacgtatat agatttcata aagtctaaca gttaaaccgt gtgctctacg accaaaacta agaaaaaaga aattagataa atctctcata gtataaattt aacgatcact catcatgttc ctaattttat aaggaggaaa aaatatgggc cattatcaac caaacaaaaa ataagtggtt taaccaaatt aaagagggtt ataatgaaag ttacttcaaa acataatata gataaaataa atatctttga aatcggctca ggaaaaggcc atttcgtaac tgccattgaa atagaccata ttgatcacga taatttccaa gttttaaaca accaatccta taaaatatat ggtaatatac aaattgtttt tgatagtata gctaatgaga aaagattatt aaatacaaaa cgctcattgg ctatattaag tatggttcca agagaatatt

cttgaattccc 6341

gggtgaaaaa gctaacggaa aagggagcgg 60 tatcttatca cttgaaattg gaagggagat 120 cggataacaa ttcccaatta aaggaggaaa 180 gatatttctt ctccgcttaa atcatcaaag 240 acatgtcgaa ttgcatctga ccgaatttta 300 tcatcaattt tatctttata ctttatattt 360 gtttcctcat gatttatgtc tttattatta 420 tgtatcccgt ttgtattact tgatccttta 480 atgctacacc tccggataat aaatatatat 540 cactagactt atttacttcg taattaagtc 600 taaaaccttt aagaactttc tttttttaca 660 tcttttattc aataatcgca tccgattgca 720 atatttatca gagctcgtgc tataattata 780 atttttagta tttttgtaat cagcacagtt 840 ataatgaatc gttaataagc aaaattcata 900 agaaaaatat aaaacacagt caaaacttta 960 tgacaaatat aagattaaat gaacatgata 1020 attttaccct tgaattagta aagaggtgta 1080 aattatgcaa aactacagaa aataaacttg 1140 aggatatatt gcagtttaaa tttcctaaaa 1200 cttataacat aagtacggat ataatacgca 1260 tttatttaat cgtggaatac gggtttgcta 1320 cattactttt aatggcagaa gttgatattt 1380 ttcatcctaa acctaaagtg aatagctcac 1440 ttatcagatt aagtagaaaa aaatcaagaa atttcgttat gaaatgggtt aacaaagaat acaattcctt aaaacatgca ggaattgacg tatctctttt caatagctat aaattattta tgaaggcaac tacagctcag gcgacaacca taaaggccac aaatacttag tatttgaagc cgaagaatct ttatttaaca aagcatacta aagtcaaaaa cttctgcaaa gcgataaaaa cggtatgatt gagctaaacg atgattacac atctaacaca gtaacagatg aaattgaacg gtacctgttc actgactccc gcggatcaaa tatttacatg cttggttatg tttctaattc aactggcctt gtgttaaaaa tggatcttga cttcgctgta cctcaagcga aaggaaacaa aggattctac gcagacaaac aatcaacgtt ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg tttatttttc taaatacatt caaatatgta atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact

tatcacacaa agataaacaa aagtataatt 1500 acaagaaaat atttacaaaa aatcaattta 1560 atttaaacaa tattagcttt gaacaattct 1620 ataagtaagt taagggatgc agttcatcga 1680 tacgctgaga gatcctcact acgtagaaga 1740 aaacactgga actgaagatg gctaccaagg 1800 tggcaaaagc acatcattct tccgtcaaga 1860 acgcacggct gagttagcaa acggcgctct 1920 actgaaaaaa gtgatgaaac cgctgattgc 1980 cgcgaacgtc tttaaaatga acggcaaatg 2040 aatgacgatt gacggcatta cgtctaacga 2100 tttaactggc ccatacaagc cgctgaacaa 2160 tcctaacgat gtaaccttta cttactcaca 2220 tgtcgtgatt acaagctata tgacaaacag 2280 tgcgccaagc ttgcatgcga gagtagggaa 2340 agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct 2400 ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg 2460 caggacgccc gccataaact gccaggcatc 2520 gcctttttgc gtttctacaa actctttttg 2580 tccgctcatg ctccggatct gcatcgcagg 2640 atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc 2700 ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg 2760 aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt 2820 ttccccctta cacggaggca tcaagtgacc 2880 cgctttatca gaagccagac attaacgctt 2940 gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac 3000 ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 3060 acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 3120 gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 3180 ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 3240 tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca cagcagccac tggtaacagg attagcagag tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga gactccccgt cgtgtagata actacgatac caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta tggcagcact gcataattct cttactgtca gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat cggcgtcaat acgggataat accgcgccac gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 3300 ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3360 taatacggtt atccacagaa tcaggggata 3420 agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3480 cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3540 tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 3600 tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 3660 gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 3720 acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 3780 acccggtaag acacgactta tcgccactgg 3840 cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 3900 gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3960 gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 4020 agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 4080 ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 4140 ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 4200 atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 4260 tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 4320 gggagggctt accatctggc cccagtgctg 4380 ctccagattt atcagcaata aaccagccag 4440 caactttatc cgcctccatc cagtctatta 4500 cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 4560 cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 4620 cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 4680 agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 4740 tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 4800 agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 4860 atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 4920 ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 4980 cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 5040 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg gttgaatact catactcttc ctttttcaat tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc acctctgaca catgcagctc ccggagacgg gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg tcaaacagga gggctggaag aagcagaccg acgatgaaca tcaaaaagtt tgcaaaacaa ctggcaggag gcgcaactca agcgtttgcg acatacggca tttcccatat tacacgccat aatgaaaaat atcaagttcc tgaattcgat aaaggcctgg acgtttggga cagctggcca tatcacggct accacatcgt ctttgcatta tcgatttaca tgttctatca aaaagtcggc ggccgcgtct ttaaagacag cgacaaattc acacaagaat ggtcaggttc agccacattt actgatttct ccggtaaaca ttacggcaaa tcagcatcag acagctcttt gaacatcaac ggtgacggaa aaacgtatca aaatgtacag <210> 144 <211> 40 <212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer T-budB (BamHI)

<400> 144

agatagatgg atccggaggt gggtcacatg

<210> 145

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer B-kivD (BamHI)

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 5100 attattgaag catttatcag ggttattgtc 5160 agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 5220 aagaaaccat tattatcatg acattaacct 5280 gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa 5340 tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga 5400 gtgttcatgt gcgtaactaa cttgccatct 5460 ctaacacagt acataaaaaa ggagacatga 5520 gcaacagtat taacctttac taccgcactg 5580 aaagaaacga accaaaagcc atataaggaa 5640 gatatgctgc aaatccctga acagcaaaaa 5700 tcgtccacaa ttaaaaatat ctcttctgca 5760 ttacaaaacg ctgacggcac tgtcgcaaac 5820 gccggagatc ctaaaaatgc ggatgacaca 5880 gaaacttcta ttgacagctg gaaaaacgct 5940 gatgcaaatg attctatcct aaaagaccaa 6000 acatctgacg gaaaaatccg tttattctac 6060 caaacactga caactgcaca agttaacgta 6120 ggtgtagagg attataaatc aatctttgac 6180 aattcgagct c 6221

gacaaacagt 40 <400> 145

ctctagagga tccagactcc taggacatg 29

<210> 146

<211> 6039

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Fragmento do vetor pFP988Dss

<400> 146

gatccaagtt taaactgtac actagatatt tcttctccgc ttaaatcatc aaagaaatct 60 ttatcacttg taaccagtcc gtccacatgt cgaattgcat ctgaccgaat tttacgtttc 120 cctgaataat tctcatcaat cgtttcatca attttatctt tatactttat attttgtgcg 180 ttaatcaaat cataattttt atatgtttcc tcatgattta tgtctttatt attatagttt 240 ttattctctc tttgattatg tctttgtatc ccgtttgtat tacttgatcc tttaactctg 300 gcaaccctca aaattgaatg agacatgcta cacctccgga taataaatat atataaacgt 360 atatagattt cataaagtct aacacactag acttatttac ttcgtaatta agtcgttaaa 420 ccgtgtgctc tacgaccaaa actataaaac ctttaagaac tttctttttt tacaagaaaa 480 aagaaattag ataaatctct catatctttt attcaataat cgcatccgat tgcagtataa 540 atttaacgat cactcatcat gttcatattt atcagagctc gtgctataat tatactaatt 600 ttataaggag gaaaaaatat gggcattttt agtatttttg taatcagcac agttcattat 660 caaccaaaca aaaaataagt ggttataatg aatcgttaat aagcaaaatt catataacca 720 aattaaagag ggttataatg aacgagaaaa atataaaaca cagtcaaaac tttattactt 780 caaaacataa tatagataaa ataatgacaa atataagatt aaatgaacat gataatatct 840 ttgaaatcgg ctcaggaaaa ggccatttta cccttgaatt agtaaagagg tgtaatttcg 900 taactgccat tgaaatagac cataaattat gcaaaactac agaaaataaa cttgttgatc 960 acgataattt ccaagtttta aacaaggata tattgcagtt taaatttcct aaaaaccaat 1020 cctataaaat atatggtaat ataccttata acataagtac ggatataata cgcaaaattg 1080 tttttgatag tatagctaat gagatttatt taatcgtgga atacgggttt gctaaaagat 1140 tattaaatac aaaacgctca ttggcattac ttttaatggc agaagttgat atttctatat 1200 taagtatggt tccaagagaa tattttcatc ctaaacctaa agtgaatagc tcacttatca 1260 gattaagtag aaaaaaatca agaatatcac acaaagataa acaaaagtat aattatttcg 1320 ttatgaaatg ggttaacaaa gaatacaaga aaatatttac aaaaaatcaa tttaacaatt 1380 ccttaaaaca tgcaggaatt gacgatttaa acaatattag ctttgaacaa ttcttatctc 1440 ttttcaatag ctataaatta tttaataagt caactacagc tcaggcgaca accatacgct ccacaaatac ttagtatttg aagcaaacac atctttattt aacaaagcat actatggcaa aaaacttctg caaagcgata aaaaacgcac gattgagcta aacgatgatt acacactgaa cacagtaaca gatgaaattg aacgcgcgaa gttcactgac tcccgcggat caaaaatgac catgcttggt tatgtttcta attctttaac ccttgtgtta aaaatggatc ttgatcctaa tgtacctcaa gcgaaaggaa acaatgtcgt ctacgcagac aaacaatcaa cgtttgcgcc ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac agcagaaggc catcctgacg gatggccttt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg tatcattacc cccatgaaca gaaattcccc gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag gctgatgagc tttaccgcag ctgcctcgcg cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc cgtagcgata gcggagtgta tactggctta gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac

aagttaaggg atgcagttca tcgatgaagg 1500 gagagatcct cactacgtag aagataaagg 1560 tggaactgaa gatggctacc aaggcgaaga 1620 aagcacatca ttcttccgtc aagaaagtca 1680 ggctgagtta gcaaacggcg ctctcggtat 1740 aaaagtgatg aaaccgctga ttgcatctaa 1800 cgtctttaaa atgaacggca aatggtacct 1860 gattgacggc attacgtcta acgatattta 1920 tggcccatac aagccgctga acaaaactgg 1980 cgatgtaacc tttacttact cacacttcgc 2040 gattacaagc tatatgacaa acagaggatt 2100 aagcttgcat gcgagagtag ggaactgcca 2160 aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt 2220 atccgccggg agcggatttg aacgttgcga 2280 gcccgccata aactgccagg catcaaatta 2340 ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt 2400 catgctccgg atctgcatcg caggatgctg 2460 attaacgaag cgctggcatt gaccctgagt 2520 cgccagttgt ttaccctcac aacgttccag 2580 tatcgtgagc atcctctctc gtttcatcgg 2640 cttacacgga ggcatcaagt gaccaaacag 2700 atcagaagcc agacattaac gcttctggag 2760 gcagacatct gtgaatcgct tcacgaccac 2820 cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 2880 tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa 2940 gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca 3000 actatgcggc atcagagcag attgtactga 3060 acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 3120 cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 3180 ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 3240 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg ccactggtaa caggattagc agagcgaggt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ttttggtcat gagattatca aaaaggatct gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg taccgcgaga cccacgctca ccggctccag gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg cactgcataa ttctcttact gtcatgccat actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta caatacggga taataccgcg ccacatagca gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa tactcatact cttccttttt caatattatt gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 3300 acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 3360 gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 3420 ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 3480 gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 3540 cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 3600 taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 3660 atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 3720 cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 3780 cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 3840 ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 3900 ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 3960 tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 4020 aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 4080 tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 4140 gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 4200 atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 4260 tatccgcctc catccagtct attaattgtt 4320 ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 4380 ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 4440 tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 4500 ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 4560 ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 4620 tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4 680 gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4740 taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4800 cttttacttt caccagcgtt tctgggtgaa 4860 agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 4 920 gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 4980 ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 5040 cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 5100

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 5160

gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 5220

aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttc atgtgcgtaa ctaacttgcc atcttcaaac 5280

aggagggctg gaagaagcag accgctaaca cagtacataa aaaaggagac atgaacgatg 5340

aacatcaaaa agtttgcaaa acaagcaaca gtattaacct ttactaccgc actgctggca 5400

ggaggcgcaa ctcaagcgtt tgcgaaagaa acgaaccaaa agccatataa ggaaacatac 54 60

ggcatttccc atattacacg ccatgatatg ctgcaaatcc ctgaacagca aaaaaatgaa 5520

aaatatcaag ttcctgaatt cgattcgtcc acaattaaaa atatctcttc tgcaaaaggc 5580

ctggacgttt gggacagctg gccattacaa aacgctgacg gcactgtcgc aaactatcac 5640

ggctaccaca tcgtctttgc attagccgga gatcctaaaa atgcggatga cacatcgatt 5700

tacatgttct atcaaaaagt cggcgaaact tctattgaca gctggaaaaa cgctggccgc 5760

gtctttaaag acagcgacaa attcgatgca aatgattcta tcctaaaaga ccaaacacaa 5820

gaatggtcag gttcagccac atttacatct gacggaaaaa tccgtttatt ctacactgat 5880

ttctccggta aacattacgg caaacaaaca ctgacaactg cacaagttaa cgtatcagca 5940

tcagacagct ctttgaacat caacggtgta gaggattata aatcaatctt tgacggtgac 6000

ggaaaaacgt atcaaaatgt acagaattcg agctctcga 6039

<210> 147

<211> 44

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer T-groE(XhoI)

<4 00> 147

agatagatct cgagagctat tgtaacataa tcggtacggg ggtg 44

<210> 148

<211> 51

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer B-groEL (SpeI BamHl)

<400> 148

attatgtcag gatccactag tttcctcctt taattgggaa ttgttatccg c 51

<210> 149 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer T-groEL

<400> 149

agctattgta acataatcgg tacgggggtg

<210> 150

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer T-ilvCB.s.(BamHI)

<400> 150

acattgatgg atcccataac aagggagaga ttgaaatggt aaaag

<210> 151

<211> 47

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer B-ilvCB.s.(SpeIBamHI)

<400> 151

tagacaacgg atccactagt ttaattttgc gcaacggaga ccaccgc

<210> 152

<211> 47

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer T-BD64 (DraIII)

<400> 152

ttaccgtgga ctcaccgagt gggtaactag cctcgccgga aagagcg

<210> 153

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer B-BD64 (DraIII)

<400> 153

tcacagttaa gacacctggt gccgttaatg cgccatgaca gccatgat

<210> 154

<211> 49

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer T-IacIq (DraIII) <400> 154

acagatagat caccaggtgc aagctaattc cggtggaaac gaggtcatc 4 9

<210> 155

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer B-IacIq (DraIII)

<400> 155

acagtacgat acacggggtg tcactgcccg ctttccagtc gggaaacc 48

<210> 156

<211> 49

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer T-groE (DraIII)

<400> 156

tcggattacg caccccgtga gctattgtaa cataatcggt acgggggtg 4 9

<210> 157

<211> 48

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer B-B.s.ilvC (DraIII)

<400> 157

ctgctgatct cacaccgtgt gttaattttg cgcaacggag accaccgc 48

<210> 158 <211> 1221 <212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum <400> 158

cacacggtgt aaataataat ctaaacagga ggggttaaaa tggttgattt cgaatattca 60 ataccaacta gaattttttt cggtaaagat aagataaatg tacttggaag agagcttaaa 120 aaatatggtt ctaaagtgct tatagtttat ggtggaggaa gtataaagag aaatggaata 180 tatgataaag ctgtaagtat acttgaaaaa aacagtatta aattttatga acttgcagga 240 gtagagccaa atccaagagt aactacagtt gaaaaaggag ttaaaatatg tagagaaaat 300 ggagttgaag tagtactagc tataggtgga ggaagtgcaa tagattgcgc aaaggttata 360 gcagcagcat gtgaatatga tggaaatcca tgggatattg tgttagatgg ctcaaaaata 420 aaaagggtgc ttcctatagc tagtatatta accattgctg caacaggatc agaaatggat 480 acgtgggcag taataaataa tatggataca aacgaaaaac taattgcggc acatccagat 540 atggctccta agttttctat attagatcca acgtatacgt ataccgtacc taccaatcaa 600 acagcagcag gaacagctga tattatgagt catatatttg aggtgtattt tagtaataca 660 aaaacagcat atttgcagga tagaatggca gaagcgttat taagaacttg tattaaatat 720 ggaggaatag ctcttgagaa gccggatgat tatgaggcaa gagccaatct aatgtgggct 780 tcaagtcttg cgataaatgg acttttaaca tatggtaaag acactaattg gagtgtacac 840 ttaatggaac atgaattaag tgcttattac gacataacac acggcgtagg gcttgcaatt 900 ttaacaccta attggatgga gtatatttta aataatgata cagtgtacaa gtttgttgaa 960 tatggtgtaa atgtttgggg aatagacaaa gaaaaaaatc actatgacat agcacatcaa 1020 gcaatacaaa aaacaagaga ttactttgta aatgtactag gtttaccatc tagactgaga 1080 gatgttggaa ttgaagaaga aaaattggac ataatggcaa aggaatcagt aaagcttaca 1140 ggaggaacca taggaaacct aagaccagta aacgcctccg aagtcctaca aatattcaaa 1200 aaatctgtgt aacaccgagt g 1221

<210> 159

<211> 54

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer T-bdhB (DraIII)

<400> 159

tcgatagcat acacacggtg gttaacaaag gaggggttaa aatggttgat ttcg 54

<210> 160 <211> 91 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer B-bdhB (rrnBTIDralII) <400> 160

atctacgcac tcggtgataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60

cttacacaga ttttttgaat atttgtagga c 91

<210> 161

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer LDH EcoRV F

<400> 161

gacgtcatga ccacccgccg atccctttt 29 <210> 162

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer LDH AatIIR

<4 00> 162

gatatccaac accagcgacc gacgtattac 30

<210> 163

<211> 47

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Cm F

<4 00> 163

atttaaatct cgagtagagg atcccaacaa acgaaaattg gataaag 47

<210> 164

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Cm R

<4 00> 164

acgcgttatt ataaaagcca gtcattagg 29

<210> 165

<211> 58

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Pll F-StuI

<4 00> 165

cctagcgcta tagttgttga cagaatggac atactatgat atattgttgc tatagcga 58

<210> 166

<211> 62

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer Pll R-SpeI

<4 00> 166

ctagtcgcta tagcaacaat atatcatagt atgtccattc tgtcaacaac tatagcgcta

gg

60 62 <210> 167

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer PldhL F-HindIII

<400> 167

aagcttgtcg acaaaccaac attatgacgt gtctgggc

<210> 168

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer PldhL R-BamHI

<4 00> 168

ggatcctcat cctctcgtag tgaaaatt

<210> 169

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer F-bdhB-AvrlI

<4 00> 169

ttcctaggaa ggaggtggtt aaaatggttg atttcg

<210> 170

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer R-bdhB-BamHI

<4 00> 170

ttggatcctt acacagattt tttgaatat

<210> 171

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer F-ilvC(B.s.)-AflII

<4 00> 171

aacttaagaa ggaggtgatt gaaatggtaa aagtatatt

<210> 172

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer R-ilvC(Β.s.)-NotI

<400> 172

aagcggccgc ttaattttgc gcaacggaga cc

<210> 173

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer F-PnisA(HindIII)

<400> 173

ttaagcttga catacttgaa tgacctagtc

<210> 174

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer R-PnisA(SpeI BamHI)

<400> 174

ttggatccaa actagtataa tttattttgt agttccttc

<210> 175

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N191

<400> 175

atccgcggat agatctccca ttaccgacat ttgggcgc

<210> 176

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer N192

<400> 176

atcctcagcg atgattgatt gattgattgt a

<210> 177

<211> 6509

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Vetor pFP988 <4 00> 177

tcgaggcccc gcacatacga aaagactggc tttggctgaa gaagtggatc gattgtttga ctgtcatcag acagggtatt ttttatgctg ataaaggggg gttgttatta ttttactgat gagcggataa caattcctac gaaaatgaga cggacagttt cgttcagact tgtgcttatg acaaaaacat cagccggatc ccaccatcac agctatcttt aaaaaatcta gtaaatgcac tttattttgt acactagata tttcttctcc tgtaaccagt ccgtccacat gtcgaattgc attctcatca atcgtttcat caattttatc atcataattt ttatatgttt cctcatgatt tctttgatta tgtctttgta tcccgtttgt caaaattgaa tgagacatgc tacacctccg ttcataaagt ctaacacact agacttattt tctacgacca aaactataaa acctttaaga agataaatct ctcatatctt ttattcaata atcactcatc atgttcatat ttatcagagc aggaaaaaat atgggcattt ttagtatttt caaaaaataa gtggttataa tgaatcgtta agggttataa tgaacgagaa aaatataaaa aatatagata aaataatgac aaatataaga ggctcaggaa aaggccattt tacccttgaa attgaaatag accataaatt atgcaaaact ttccaagttt taaacaagga tatattgcag atatatggta atatacctta taacataagt agtatagcta atgagattta tttaatcgtg acaaaacgct cattggcatt acttttaatg gttccaagag aatattttca tcctaaacct

tgaaaacatt gagcctttga tgactgatga 60 gaaaagaaga agaccataaa aataccttgt 120 tccagactgt ccgctgtgta aaaaatagga 180 atgtaaaata taatttgtat aaggaattgt 240 gggagaggaa acatgattca aaaacgaaag 300 tgcacgctgt tatttgtcag tttgccgatt 360 catcaccatt aagaattcct agaaactcca 420 gagcaacatc ttttgttgct cagtgcattt 480 gcttaaatca tcaaagaaat ctttatcact 540 atctgaccga attttacgtt tccctgaata 600 tttatacttt atattttgtg cgttaatcaa 660 tatgtcttta ttattatagt ttttattctc 720 attacttgat cctttaactc tggcaaccct 780 gataataaat atatataaac gtatatagat 840 acttcgtaat taagtcgtta aaccgtgtgc 900 actttctttt tttacaagaa aaaagaaatt 960 atcgcatccg attgcagtat aaatttaacg 1020 tcgtgctata attatactaa ttttataagg 1080 tgtaatcagc acagttcatt atcaaccaaa 1140 ataagcaaaa ttcatataac caaattaaag 1200 cacagtcaaa actttattac ttcaaaacat 1260 ttaaatgaac atgataatat ctttgaaatc 1320 ttagtaaaga ggtgtaattt cgtaactgcc 1380 acagaaaata aacttgttga tcacgataat 1440 tttaaatttc ctaaaaacca atcctataaa 1500 acggatataa tacgcaaaat tgtttttgat 1560 gaatacgggt ttgctaaaag attattaaat 1620 gcagaagttg atatttctat attaagtatg 1680 aaagtgaata gctcacttat cagattaagt 1740 agaaaaaaat caagaatatc acacaaagat tgggttaaca aagaatacaa gaaaatattt catgcaggaa ttgacgattt aaacaatatt agctataaat tatttaataa gtaagttaag gctcaggcga caaccatacg ctgagagatc acttagtatt tgaagcaaac actggaactg ttaacaaagc atactatggc aaaagcacat tgcaaagcga taaaaaacgc acggctgagt taaacgatga ttacacactg aaaaaagtga cagatgaaat tgaacgcgcg aacgtcttta actcccgcgg atcaaaaatg acgattgacg gttatgtttc taattcttta actggcccat taaaaatgga tcttgatcct aacgatgtaa aagcgaaagg aaacaatgtc gtgattacaa acaaacaatc aacgtttgcg ccaagcttgc ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt tacattcaaa tatgtatccg ctcatgctcc cctgtggaac acctacatct gtattaacga tctggtcccg ccgcatccat accgccagtt catgttcatc atcagtaacc cgtatcgtga cccccatgaa cagaaattcc cccttacacg cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag cgagctggac gcggatgaac aggcagacat gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg gctcccggag acggtcacag cttgtctgta gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg tagcggagtg tatactggct taactatgcg

aaacaaaagt ataattattt cgttatgaaa 1800 acaaaaaatc aatttaacaa ttccttaaaa 1860 agctttgaac aattcttatc tcttttcaat 1920 ggatgcagtt catcgatgaa ggcaactaca 1980 ctcactacgt agaagataaa ggccacaaat 2040 aagatggcta ccaaggcgaa gaatctttat 2100 cattcttccg tcaagaaagt caaaaacttc 2160 tagcaaacgg cgctctcggt atgattgagc 2220 tgaaaccgct gattgcatct aacacagtaa 2280 aaatgaacgg caaatggtac ctgttcactg 2340 gcattacgtc taacgatatt tacatgcttg 2400 acaagccgct gaacaaaact ggccttgtgt 2460 cctttactta ctcacacttc gctgtacctc 2520 gctatatgac aaacagagga ttctacgcag 2580 atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa 2640 gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg 2700 ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg 2760 taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag 2820 ctacaaactc tttttgttta tttttctaaa 2880 ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac 2940 agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc 3000 gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg 3060 gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta 3120 gaggcatcaa gtgaccaaac aggaaaaaac 3180 ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa 3240 ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga 3300 tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 3360 agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 3420 gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga 3480 gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 3540 catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cgaaacccga caggactata aagataccag tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc aactacggct acactagaag gacagtattt ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg atgagattat caaaaaggat cttcacctag tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tagataacta cgatacggga gggcttacca gacccacgct caccggctcc agatttatca cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga gataataccg cgccacatag cagaacttta gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg

gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct 3600 tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 3660 acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 3720 aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 3780 cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 3840 gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 3900 tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 3960 tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 4020 cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 4080 gacttatcgc cactggcagc agccactggt 4140 ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 4200 ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 4260 ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 4320 agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 4380 aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 4440 atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 4500 tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 4560 tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 4620 tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 4680 gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 4740 tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 4800 ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc 4860 gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 4920 aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 4980 ttatcactca tggttatggc agcactgcat 5040 tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 5100 ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 5160 aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 5220 ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 5280 gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 5340

ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 5400

ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 5460

atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 5520

gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt 5580

atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg 5640

cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt 5700

cagggcgcgt cagcgggtgt tcatgtgcgt aactaacttg ccatcttcaa acaggagggc 5760

tggaagaagc agaccgctaa cacagtacat aaaaaaggag acatgaacga tgaacatcaa 5820

aaagtttgca aaacaagcaa cagtattaac ctttactacc gcactgctgg caggaggcgc 5880

aactcaagcg tttgcgaaag aaacgaacca aaagccatat aaggaaacat acggcatttc 5940

ccatattaca cgccatgata tgctgcaaat ccctgaacag caaaaaaatg aaaaatatca 6000

agttcctgaa ttcgattcgt ccacaattaa aaatatctct tctgcaaaag gcctggacgt 6060

ttgggacagc tggccattac aaaacgctga cggcactgtc gcaaactatc acggctacca 6120

catcgtcttt gcattagccg gagatcctaa aaatgcggat gacacatcga tttacatgtt 6180

ctatcaaaaa gtcggcgaaa cttctattga cagctggaaa aacgctggcc gcgtctttaa 6240

agacagcgac aaattcgatg caaatgattc tatcctaaaa gaccaaacac aagaatggtc 6300

aggttcagcc acatttacat ctgacggaaa aatccgttta ttctacactg atttctccgg 6360

taaacattac ggcaaacaaa cactgacaac tgcacaagtt aacgtatcag catcagacag 6420

ctctttgaac atcaacggtg tagaggatta taaatcaatc tttgacggtg acggaaaaac 6480

gtatcaaaat gtacagcatg ccaogcgtc. 6509

<210> 178 <211> 571 <212> PRT

<213> Bacillus subtilis <400> 178

Met Leu Thr Lys Ala Thr Lys Glu Gln Lys Ser Leu Val Lys Asn Arg 15 10 15

Gly Ala Glu Leu Val Val Asp Cys Leu Val Glu Gln Gly Val Thr His 20 25 30

Val Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile Asp Ala Val Phe Asp Ala Leu 35 40 45 Gln Asp 50

Ala Phe 65

Val Leu

Leu Thr

Val Ile

Ala Ala 130

Val Lys 145

Ala Gly

Asn Glu

Leu Gly

Gln Thr 210

Pro Glu 225

Pro Phe

Glu Asp

Asp Leu

Pro Ile 290

Ile Ile 305

Pro Asp Glu His

Leu Ser

Lys Gly

Met Ala

Val Thr

Ala Asn 100

Arg Ala 115

Leu Phe

Asn Ile

Gln Ala

Val Thr 180

Pro Ala 195

Ala Lys

Ala Ile

Val Glu

Gln Tyr 260

Leu Leu 275

Glu Tyr

His Leu

Leu Glu

Asp Ala 340

Asp Leu 355

Pro Glu

Gln Ala 70

Ser Gly 85

Thr Glu

Asp Arg

Gln Pro

Pro Glu 150

Gly Ala 165

Asn Thr

Ala Asp

Leu Pro

Lys Ala 230

Thr Tyr 245

Phe Gly

Glu Gln

Asp Pro

Asp Glu 310

Leu Ile 325

Val Lys Lys Gln

Ile Ile 55

Val Gly

Pro Gly

Gly Asp

Leu Lys 120

Ile Thr 135

Ala Val

Ala Phe

Lys Asn

Asp Ala 200

Val Val 215

Val Arg

Gln Ala

Arg Ile

Ala Asp 280

Lys Phe 295

Ile Ile

Gly Asp

Val Glu

Tyr Met 360

Val Ala

Arg Leu

Ala Ser 90

Pro Val 105

Arg Thr

Lys Tyr

Thr Asn

Val Ser 170

Val Arg 185

Ile Ser

Leu Val

Lys Leu

Ala Gly 250

Gly Leu 265

Val Val

Trp Asn

Ala Asp

Ile Pro 330

Phe Ala 345

His Glu

Arg His 60

Thr Gly 75

Asn Leu

Val Ala

His Gln

Ser Val 140

Ala Phe 155

Phe Pro

Ala Val

Ala Ala

Gly Met 220

Leu Lys 235

Thr Leu

Phe Arg

Leu Thr

Ile Asn 300

Ile Asp 315

Ser Thr Glu Arg Gly Glu

Glu Gln

Lys Pro

Ala Thr

Leu Ala 110

Ser Leu 125

Glu Val

Arg Ile

Gln Asp

Ala Ala 190

Ile Ala 205

Lys Gly Lys Val

Ser Arg

Asn Gln 270

Ile Gly 285

Gly Asp

His Ala

Ile Asn

Glu Gln 350

Gln Val 365

Asn Ala

Gly Val 80

Gly Leu 95

Gly Asn Asp Asn

Gln Asp

Ala Ser 160

Val Val 175

Pro Lys

Lys Ile

Gly Arg

Gln Leu 240

Asp Leu 255

Pro Gly

Tyr Asp

Arg Thr

Tyr Gln 320

His Ile 335

Lys Ile Pro Ala Asp Trp Lys Ser Asp Arg Ala His Pro Leu Glu Ile Val Lys Glu Leu 370 375 380

Arg Asn Ala Val Asp Asp His Val Thr Val Thr Cys Asp Ile Gly Ser 385 390 395 400

His Ala Ile Trp Met Ser Arg Tyr Phe Arg Ser Tyr Glu Pro Leu Thr 405 410 415

Leu Met Ile Ser Asn Gly Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp 420 425 430

Ala Ile Gly Ala Ser Leu Val Lys Pro Gly Glu Lys Val Val Ser Val 435 440 445

Ser Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu Thr Ala 450 455 460

Val Arg Leu Lys Ala Pro Ile Val His Ile Val Trp Asn Asp Ser Thr 465 470 475 480

Tyr Asp Met Val Ala Phe Gln Gln Leu Lys Lys Tyr Asn Arg Thr Ser 485 490 495

Ala Val Asp Phe Gly Asn Ile Asp Ile Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe 500 505 510

Gly Ala Thr Gly Leu Arg Val Glu Ser Pro Asp Gln Leu Ala Asp Val 515 520 525

Leu Arg Gln Gly Met Asn Ala Glu Gly Pro Val Ile Ile Asp Val Pro 530 535 540

Val Asp Tyr Ser Asp Asn Ile Asn Leu Ala Ser Asp Lys Leu Pro Lys 545 550 555 560

Glu Phe Gly Glu Leu Met Lys Thr Lys Ala Leu 565 570

<210> 179 <211> 1665 <212> DNA

<213> Lactococcus lactis <400> 179

atgtctgaga aacaatttgg ggcgaacttg gttgtcgata gtttgattaa ccataaagtg 60 aagtatgtat ttgggattcc aggagcaaaa attgaccggg tttttgattt attagaaaat 120 gaagaaggcc ctcaaatggt cgtgactcgt catgagcaag gagctgcttt catggctcaa 180 gctgtcggtc gtttaactgg cgaacctggt gtagtagttg ttacgagtgg gcctggtgta 240 tcaaaccttg cgactccgct tttgaccgcg acatcagaag gtgatgctat tttggctatc 300 ggtggacaag ttaaacgaag tgaccgtctt aaacgtgcgc accaatcaat ggataatgct 360 ggaatgatgc aatcagcaac aaaatattca gcagaagttc ttgaccctaa tacactttct 420 gaatcaattg ccaacgctta tcgtattgca aaatcaggac atccaggtgc aactttctta 480 tcaatccccc aagatgtaac ggatgccgaa gtatcaatca aagccattca accactttca 540 gaccctaaaa tggggaatgc ctctattgat gacattaatt atttagcaca agcaattaaa 600 aatgctgtat tgccagtaat tttggttgga gctggtgctt cagatgctaa agtcgcttca 660 tccttgcgta atctattgac tcatgttaat attcctgtcg ttgaaacatt ccaaggtgca 720 ggggttattt cacatgattt agaacatact ttttatggac gtatcggtct tttccgcaat 780 caaccaggcg atatgcttct gaaacgttct gaccttgtta ttgctgttgg ttatgaccca 840 attgaatatg aagctcgtaa ctggaatgca gaaattgata gtcgaattat cgttattgat 900 aatgccattg ctgaaattga tacttactac caaccagagc gtgaattaat tggtgatatc 960 gcagcaacat tggataatct tttaccagct gttcgtggct acaaaattcc aaaaggaaca 1020 aaagattatc tcgatggcct tcatgaagtt gctgagcaac acgaatttga tactgaaaat 1080 actgaagaag gtagaatgca ccctcttgat ttggtcagca ctttccaaga aatcgtcaag 1140 gatgatgaaa cagtaaccgt tgacgtaggt tcactctaca tttggatggc acgtcatttc 1200 aaatcatacg aaccacgtca tctcctcttc tcaaacggaa tgcaaacact cggagttgca 1260 cttccttggg caattacagc cgcattgttg cgcccaggta aaaaagttta ttcacactct 1320 ggtgatggag gcttcctttt cacagggcaa gaattggaaa cagctgtacg tttgaatctt 1380 ccaatcgttc aaattatctg gaatgacggc cattatgata tggttaaatt ccaagaagaa 1440 atgaaatatg gtcgttcagc agccgttgat tttggctatg ttgattacgt aaaatatgct 1500 gaagcaatga gagcaaaagg ttaccgtgca cacagcaaag aagaacttgc tgaaattctc 1560 aaatcaatcc cagatactac tggaccggtg gtaattgacg ttcctttgga ctattctgat 1620 aacattaaat tagcagaaaa attattgcct gaagagtttt attga 1665 <210> 180 <211> 554 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <4 00> 180

Met Ser Glu Lys Gln Phe Gly Ala Asn Leu Val Val Asp Ser Leu Ile 15 10 15

Asn His Lys Val Lys Tyr Val Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile Asp 20 25 30

Arg Val Phe Asp Leu Leu Glu Asn Glu Glu Gly Pro Gln Met Val Val 35 40 45 Thr Arg His Glu Gln 50

Leu Thr Gly Glu Pro 65

Ser Asn Leu Ala Thr 85

Ile Leu Ala Ile Gly 100

Ala His Gln Ser Met 115

Tyr Ser Ala Glu Val 130

Asn Ala Tyr Arg Ile 145

Ser Ile Pro Gln Asp 165

Gly Ala Ala Phe Met Ala 55

Gly Val Val Val Val Thr 70 75

Pro Leu Leu Thr Ala Thr 90

Gly Gln Val Lys Arg Ser 105

Asp Asn Ala Gly Met Met 120

Leu Asp Pro Asn Thr Leu 135

Ala Lys Ser Gly His Pro 150 155

Val Thr Asp Ala Glu Val 170

Gln Ala Val Gly Arg 60

Ser Gly Pro Gly Val 80

Ser Glu Gly Asp Ala 95

Asp Arg Leu Lys Arg 110

Gln Ser Ala Thr Lys 125

Ser Glu Ser Ile Ala 140

Gly Ala Thr Phe Leu 160

Ser Ile Lys Ala Ile 175

Gln Pro Leu Ser 180

Asn Tyr Leu Ala 195

Val Gly Ala Gly 210

Leu Leu Thr His 225

Gly Val Ile Ser

Leu Phe Arg Asn 260

Val Ile Ala Val 275

Asn Ala Glu Ile 290

Glu Ile Asp Thr 305

Ala Ala Thr Leu

Asp Pro Lys Met

Gln Ala Ile Lys 200

Ala Ser Asp Ala 215

Val Asn Ile Pro 230

His Asp Leu Glu 245

Gln Pro Gly Asp

Gly Tyr Asp Pro 280

Asp Ser Arg Ile 295

Tyr Tyr Gln Pro 310

Asp Asn Leu Leu 325

Gly Asn Ala Ser 185

Asn Ala Val Leu

Lys Val Ala Ser 220

Val Val Glu Thr 235

His Thr Phe Tyr 250

Met Leu Leu Lys 265

Ile Glu Tyr Glu

Ile Val Ile Asp 300

Glu Arg Glu Leu 315

Pro Ala Val Arg 330

Ile Asp Asp Ile 190

Pro Val Ile Leu 205

Ser Leu Arg Asn

Phe Gln Gly Ala 240

Gly Arg Ile Gly 255

Arg Ser Asp Leu 270

Ala Arg Asn Trp 285

Asn Ala Ile Ala

Ile Gly Asp Ile 320

Gly Tyr Lys Ile 335

Pro Lys Gly Thr Lys Asp Tyr Leu Asp Gly Leu His Glu Val Ala Glu 340 345 350

Gln His Glu Phe Asp Thr Glu Asn Thr Glu Glu Gly Arg Met His Pro 355 360 365 Leu Asp Leu Val Ser Thr Phe Gln Glu Ile Val Lys Asp Asp Glu Thr 370 375 380

Val Thr 385 Val Asp Val Gly 390 Ser Leu Tyr Ile Trp 395 Met Ala Arg His Phe 400 Lys Ser Tyr Glu Pro 405 Arg His Leu Leu Phe 410 Ser Asn Gly Met Gln 415 Thr Leu Gly Val Ala 420 Leu Pro Trp Ala Ile 425 Thr Ala Ala Leu Leu 430 Arg Pro Gly Lys Lys 435 Val Tyr Ser His Ser 440 Gly Asp Gly Gly Phe 445 Leu Phe Thr Gly Gln 450 Glu Leu Glu Thr Ala 455 Val Arg Leu Asn Leu 460 Pro Ile Val Gln Ile Ile 465 Trp Asn Asp Gly 470 His Tyr Asp Met Val 475 Lys Phe Gln Glu Glu 480 Met Lys Tyr Gly Arg 485 Ser Ala Ala Val Asp 490 Phe Gly Tyr Val Asp 495 Tyr Val Lys Tyr Ala 500 Glu Ala Met Arg Ala 505 Lys Gly Tyr Arg Ala 510 His Ser Lys Glu Glu 515 Leu Ala Glu Ile Leu 520 Lys Ser Ile Pro Asp 525 Thr Thr Gly Pro Val 530 Val Ile Asp Val Pro 535 Leu Asp Tyr Ser Asp 540 Asn Ile Lys Leu Ala Glu 545 Lys Leu Leu Pro 550 Glu Glu Phe Tyr <210> 181 <211> 395 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 181 Met Leu 1 Arg Thr Gln 5 Ala Ala Arg Leu Ile 10 Cys Asn Ser Arg Val 15 Ile Thr Ala Lys Arg 20 Thr Phe Ala Leu Ala 25 Thr Arg Ala Ala Ala 30 Tyr Ser Arg Pro Ala 35 Ala Arg Phe Val Lys 40 Pro Met Ile Thr Thr 45 Arg Gly Leu Lys Gln 50 Ile Asn Phe Gly Gly 55 Thr Val Glu Thr Val 60 Tyr Glu Arg Ala Asp Trp 65 Pro Arg Glu Lys 70 Leu Leu Asp Tyr Phe 75 Lys Asn Asp Thr Phe 80 Ala Leu Ile Gly Tyr Gly Ser Gln 85

Arg Asp Asn Gly Leu Asn Val Ile 100

Ser Trp Lys Ala Ala Ile Glu Asp 115 120

Gly Tyr Gly Gln Gly Leu Asn Leu 90 95

Ile Gly Val Arg Lys Asp Gly Ala 105 110

Gly Trp Val Pro Gly Lys Asn Leu 125

Phe Thr Val Glu 130

Leu Ser Asp Ala 145

Leu Thr Lys Gly

Phe Lys Asp Leu 180

Leu Val Ala Pro 195

Glu Gly Arg Gly 210

Asp Ala Ile Lys 135

Ala Gln Ser Glu 150

Lys Thr Leu Tyr 165

Thr His Val Glu

Lys Gly Ser Gly 200

Ile Asn Ser Ser 215

Arg Gly Ser Tyr 140

Thr Trp Pro Ala 155

Phe Ser His Gly 170

Pro Pro Lys Asp 185

Arg Thr Val Arg

Tyr Ala Val Trp 220

Val Met Asn Leu

Ile Lys Pro Leu 160

Phe Ser Pro Val 175

Leu Asp Val Ile 190

Ser Leu Phe Lys 205

Asn Asp Val Thr

Gly Lys Ala His Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Val Ala Ile Gly Ser 225 230 235 240

Gly Tyr Val Tyr Gln Thr Thr Phe Glu Arg Glu Val Asn Ser Asp Leu 245 250 255

Tyr Gly Glu Arg Gly Cys Leu Met Gly Gly Ile His Gly Met Phe Leu 260 265 270

Ala Gln Tyr Asp Val Leu Arg Glu Asn Gly His Ser Pro Ser Glu Ala 275 280 285

Phe Asn Glu Thr Val Glu Glu Ala Thr Gln Ser Leu Tyr Pro Leu Ile 290 295 300

Gly Lys Tyr Gly Met Asp Tyr Met Tyr Asp Ala Cys Ser Thr Thr Ala 305 310 315 320

Arg Arg Gly Ala Leu Asp Trp Tyr Pro Ile Phe Lys Asn Ala Leu Lys 325 330 335

Pro Val Phe Gln Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Lys Asn Gly Thr Glu Thr 340 345 350

Lys Arg Ser Leu Glu Phe Asn Ser Gln Pro Asp Tyr Arg Glu Lys Leu 355 360 365

Glu Lys Glu Leu Asp Thr Ile Arg Asn Met Glu Ile Trp Lys Val Gly 370 375 380

Lys Glu Val Arg Lys Leu Arg Pro Glu Asn Gln 385 390 395 <210> 182

<211> 993

<212> DNA

<213> Methanococcus maripaludis

<4 00> 182 atgaaggtat tctatgactc agattttaaa ttagatgctt taaaagaaaa aacaattgca 60 gtaatcggtt atggaagtca aggtagggca cagtccttaa acatgaaaga cagcggatta 120 aacgttgttg ttggtttaag aaaaaacggt gcttcatgga acaacgctaa agcagacggt 180 cacaatgtaa tgaccattga agaagctgct gaaaaagcgg acatcatcca catcttaata 240 cctgatgaat tacaggcaga agtttatgaa agccagataa aaccatacct aaaagaagga 300 aaaacactaa gcttttcaca tggttttaac atccactatg gattcattgt tccaccaaaa 360 ggagttaacg tggttttagt tgctccaaaa tcacctggaa aaatggttag aagaacatac 420 gaagaaggtt tcggtgttcc aggtttaatc tgtattgaaa ttgatgcaac aaacaacgca 480 tttgatattg tttcagcaat ggcaaaagga atcggtttat caagagctgg agttatccag 540 acaactttca aagaagaaac agaaactgac cttttcggtg aacaagctgt tttatgcggt 600 ggagttaccg aattaatcaa ggcaggattt gaaacactcg ttgaagcagg atacgcacca 660 gaaatggcat actttgaaac ctgccacgaa ttgaaattaa tcgttgactt aatctaccaa 720 aaaggattca aaaacatgtg gaacgatgta agtaacactg cagaatacgg cggacttaca 780 agaagaagca gaatcgttac agctgattca aaagctgcaa tgaaagaaat cttaagagaa 840 atccaagatg gaagattcac aaaagaattc cttctcgaaa aacaggtaag ctatgctcat 900 ttaaaatcaa tgagaagact cgaaggagac ttacaaatcg aagaagtcgg cgcaaaatta 960 agaaaaatgt gcggtcttga aaaagaagaa taa 993

<210> 183 <211> 330 <212> PRT

<213> Methanococcus maripaludis <4 00> 183

Met Lys Val Phe Tyr Asp Ser Asp Phe Lys Leu Asp Ala Leu Lys Glu 15 10 15

Lys Thr Ile Ala Val Ile Gly Tyr Gly Ser Gln Gly Arg Ala Gln Ser 20 25 30

Leu Asn Met Lys Asp Ser Gly Leu Asn Val Val Val Gly Leu Arg Lys 35 40 45

Asn Gly Ala Ser Trp Asn Asn Ala Lys Ala Asp Gly His Asn Val Met 50 55 60 Thr Ile Glu Glu Ala 65

Pro Asp Glu Leu Gln 85

Leu Lys Glu Gly Lys 100

Tyr Gly Phe Ile Val 115

Pro Lys Ser Pro Gly 130

Ala Glu Lys Ala Asp Ile 70 75

Ala Glu Val Tyr Glu Ser 90

Thr Leu Ser Phe Ser His 105

Pro Pro Lys Gly Val Asn 120

Lys Met Val Arg Arg Thr 135

Ile His Ile Leu Ile 80

Gln Ile Lys Pro Tyr 95

Gly Phe Asn Ile His 110

Val Val Leu Val Ala 125

Tyr Glu Glu Gly Phe 140

Gly Val Pro Gly Leu Ile Cys Ile Glu Ile Asp Ala Thr Asn Asn Ala 145 150 155 160

Phe Asp Ile Val Ser Ala Met Ala Lys Gly Ile Gly Leu Ser Arg Ala 165 170 175

Gly Val Ile Gln Thr Thr Phe Lys Glu Glu Thr Glu Thr Asp Leu Phe 180 185 190

Gly Glu Gln Ala Val Leu Cys Gly Gly Val Thr Glu Leu Ile Lys Ala 195 200 205

Gly Phe Glu Thr Leu Val Glu Ala Gly Tyr Ala Pro Glu Met Ala Tyr 210 215 220

Phe Glu Thr Cys His Glu Leu Lys Leu Ile Val Asp Leu Ile Tyr Gln 225 230 235 240

Lys Gly Phe Lys Asn Met Trp Asn Asp Val Ser Asn Thr Ala Glu Tyr 245 250 255

Gly Gly Leu Thr Arg Arg Ser Arg Ile Val Thr Ala Asp Ser Lys Ala 260 265 270

Ala Met Lys Glu Ile Leu Arg Glu Ile Gln Asp Gly Arg Phe Thr Lys 275 280 285

Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gln Val Ser Tyr Ala His Leu Lys Ser Met 290 295 300

Arg Arg Leu Glu Gly Asp Leu Gln Ile Glu Glu Val Gly Ala Lys Leu 305 310 315 320

Arg Lys Met Cys Gly Leu Glu Lys Glu Glu 325 330

<210> 184 <211> 1476 <212> DNA

<213> Bacillus subtilis <400> 184

atggctaact acttcaatac actgaatctg cgccagcagc tggcacagct gggcaaatgt cgctttatgg gccgcgatga attcgccgat ggcgcgagct accttcaggg taaaaaagta 120

gtcatcgtcg gctgtggcgc acagggtctg aaccagggcc tgaacatgcg tgattctggt 180

ctcgatatct cctacgctct gcgtaaagaa gcgattgccg agaagcgcgc gtcctggcgt 240

aaagcgaccg aaaatggttt taaagtgggt acttacgaag aactgatccc acaggcggat 300

ctggtgatta acctgacgcc ggacaagcag cactctgatg tagtgcgcac cgtacagcca 360

ctgatgaaag acggcgcggc gctgggctac tcgcacggtt tcaacatcgt cgaagtgggc 420

gagcagatcc gtaaagatat caccgtagtg atggttgcgc cgaaatgccc aggcaccgaa 480

gtgcgtgaag agtacaaacg tgggttcggc gtaccgacgc tgattgccgt tcacccggaa 540

aacgatccga aaggcgaagg catggcgatt gccaaagcct gggcggctgc aaccggtggt 600

caccgtgcgg gtgtgctgga atcgtccttc gttgcggaag tgaaatctga cctgatgggc 660

gagcaaacca tcctgtgcgg tatgttgcag gctggctctc tgctgtgctt cgacaagctg 720

gtggaagaag gtaccgatcc agcatacgca gaaaaactga ttcagttcgg ttgggaaacc 780

atcaccgaag cactgaaaca gggcggcatc accctgatga tggaccgtct ctctaacccg 840

gcgaaactgc gtgcttatgc gctttctgaa cagctgaaag agatcatggc acccctgttc 900

cagaaacata tggacgacat catctccggc gaattctctt ccggtatgat ggcggactgg 960

gccaacgatg ataagaaact gctgacctgg cgtgaagaga ccggcaaaac cgcgtttgaa 1020

accgcgccgc agtatgaagg caaaatcggc gagcaggagt acttcgataa aggcgtactg 1080

atgattgcga tggtgaaagc gggcgttgaa ctggcgttcg aaaccatggt cgattccggc 1140

atcattgaag agtctgcata ttatgaatca ctgcacgagc tgccgctgat tgccaacacc 1200

atcgcccgta agcgtctgta cgaaatgaac gtggttatct ctgataccgc tgagtacggt 1260

aactatctgt tctcttacgc ttgtgtgccg ttgctgaaac cgtttatggc agagctgcaa 1320

ccgggcgacc tgggtaaagc tattccggaa ggcgcggtag ataacgggca actgcgtgat 1380

gtgaacgaag cgattcgcag ccatgcgatt gagcaggtag gtaagaaact gcgcggctat 1440

atgacagata tgaaacgtat tgctgttgcg ggttaa 1476

<210> 185 <211> 342 <212> PRT

<213> Bacillus subtilis <400> 185

Met Val Lys Val Tyr Tyr Asn Gly Asp Ile Lys Glu Asn Val Leu Ala 1 5 10 15 Gly Lys Thr Val 20

Ala Leu Asn Leu 35

Gln Gly Lys Ser 50

Ser Val Lys Glu 65

Pro Asp Glu Gln

Leu Thr Ala Gly 100

Phe His Gln Ile 115

Pro Lys Gly Pro 130

Gly Val Pro Ala 145

Arg Asp Lys Ala

Gly Val Leu Glu 180

Gly Glu Gln Ala 195

Gly Phe Glu Thr 210

Phe Glu Cys Leu 225

Glu Gly Leu Ala

Gly Asp Phe Val 260

Ser Met Lys Glu 275

Glu Trp Ile Val 290

Asn Ala Ser Glu 305

Arg Glu Met Met

Ala Val Ile Gly

Lys Glu Ser Gly 40

Phe Thr Gln Ala 55

Ala Ala Ala Gln 70

Gln Gln Lys Val 85

Lys Ser Leu Val

Val Pro Pro Ala 120

Gly His Leu Val 135

Leu Phe Ala Ile 150

Leu Ala Tyr Ala 165

Thr Thr Phe Lys

Val Leu Cys Gly 200

Leu Thr Glu Ala 215

His Glu Leu Lys 230

Gly Met Arg Tyr 245

Ser Gly Pro Arg

Val Leu Lys Asp 280

Glu Asn Gln Val 295

Asn Glu His Gln 310

Pro Phe Val Lys 325

Tyr Gly Ser Gln 25

Val Asp Val Ile

Gln Glu Asp Gly 60

Ala Glu Ile Ile 75

Tyr Glu Ala Glu 90

Phe Ala His Gly 105

Asp Val Asp Val

Arg Arg Thr Tyr 140

Tyr Gln Asp Val 155

Lys Gly Ile Gly 170

Glu Glu Thr Glu 185

Gly Leu Ser Ala

Gly Tyr Gln Pro 220

Leu Ile Val Asp 235

Ser Ile Ser Asp 250

Val Val Asp Ala 265

Ile Gln Asn Gly

Asn Arg Pro Arg 300

Ile Glu Val Val 315

Gln Gly Lys Lys 330

Gly His Ala His 30

Val Gly Val Arg 45

His Lys Val Phe

Met Val Leu Leu 80

Ile Lys Asp Glu 95

Phe Asn Val His 110

Phe Leu Val Ala 125

Glu Gln Gly Ala

Thr Gly Glu Ala 160

Gly Ala Arg Ala 175

Thr Asp Leu Phe 190

Leu Val Lys Ala 205

Glu Leu Ala Tyr

Leu Met Tyr Glu 240

Thr Ala Gln Trp 255

Lys Val Lys Glu 270

Thr Phe Ala Lys 285

Phe Asn Ala Ile

Gly Arg Lys Leu 320

Lys Glu Ala Val 335 Val Ser Val Ala Gln Asn 340

<210> 186 <211> 585 <212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae <4 00> 186

Met Gly Leu Leu Thr Lys Val Ala Thr Ser Arg Gln Phe Ser Thr Thr 15 10 15

Arg Cys Val Ala Lys Lys Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Ile Ile Thr Glu 20 25 30

Pro Lys Gly Gln Gly Ala Ser Gln Ala Met Leu Tyr Ala Thr Gly Phe 35 40 45

Lys Lys Glu Asp Phe Lys Lys Pro Gln Val Gly Val Gly Ser Cys Trp 50 55 60

Trp Ser Gly Asn Pro Cys Asn Met His Leu Leu Asp Leu Asn Asn Arg 65 70 75 80

Cys Ser Gln Ser Ile Glu Lys Ala Gly Leu Lys Ala Met Gln Phe Asn 85 90 95

Thr Ile Gly Val Ser Asp Gly Ile Ser Met Gly Thr Lys Gly Met Arg 100 105 110

Tyr Ser Leu Gln Ser Arg Glu Ile Ile Ala Asp Ser Phe Glu Thr Ile 115 120 125

Met Met Ala Gln His Tyr Asp Ala Asn Ile Ala Ile Pro Ser Cys Asp 130 135 140

Lys Asn Met Pro Gly Val Met Met Ala Met Gly Arg His Asn Arg Pro 145 150 155 160

Ser Ile Met Val Tyr Gly Gly Thr Ile Leu Pro Gly His Pro Thr Cys 165 170 175

Gly Ser Ser Lys Ile Ser Lys Asn Ile Asp Ile Val Ser Ala Phe Gln 180 185 190

Ser Tyr Gly Glu Tyr Ile Ser Lys Gln Phe Thr Glu Glu Glu Arg Glu 195 200 205

Asp Val Val Glu His Ala Cys Pro Gly Pro Gly Ser Cys Gly Gly Met 210 215 220

Tyr Thr Ala Asn Thr Met Ala Ser Ala Ala Glu Val Leu Gly Leu Thr 225 230 235 240

Ile Pro Asn Ser Ser Ser Phe Pro Ala Val Ser Lys Glu Lys Leu Ala 245 250 255 Glu Cys Asp Asn 260

Ile Leu Pro Arg 275

Thr Tyr Val Val 290

Val Ala Val Ala 305

Gln Arg Ile Ser

Gly Lys Tyr Val 340

Val Ile Lys Tyr 355

Thr Val Thr Gly 370

Leu Pro Glu Gly 385

Ala Asn Gly His

Ala Val Gly Lys 420

Ala Arg Val Phe 435

Gly Glu Ile Lys 450

Gly Pro Arg Gly 465

Ala Leu Met Gly

Gly Arg Phe Ser 500

Pro Glu Ala Ala 515

Glu Ile Ile Ile 530

Asp Lys Glu Met 545

Arg Tyr Thr Arg

Ile Gly Glu Tyr

Asp Ile Leu Thr 280

Ala Thr Gly Gly 295

His Ser Ala Gly 310

Asp Thr Thr Pro 325

Met Ala Asp Leu

Leu Tyr Glu Asn 360

Asp Thr Leu Ala 375

Gln Glu Ile Ile 390

Leu Gln Ile Leu 405

Ile Thr Gly Lys

Glu Glu Glu Gly 440

Lys Gly Glu Lys 455

Ala Pro Gly Met 470

Tyr Gly Leu Gly 485

Gly Gly Ser His

Glu Gly Gly Pro 520

Asp Ala Asp Asn 535

Ala Gln Arg Lys 550

Gly Thr Leu Ser 565

Ile Lys Lys Thr 265

Lys Glu Ala Phe

Ser Thr Asn Ala 300

Val Lys Leu Ser 315

Leu Ile Gly Asp 330

Ile Asn Val Gly 345

Asn Met Leu His

Glu Arg Ala Lys 380

Lys Pro Leu Ser 395

Tyr Gly Ser Leu 410

Glu Gly Thr Tyr 425

Ala Phe Ile Glu

Thr Val Val Val 460

Pro Glu Met Leu 475

Lys Asp Val Ala 490

Gly Phe Leu Ile 505

Ile Gly Leu Val

Asn Lys Ile Asp 540

Gln Ser Trp Val 555

Lys Tyr Ala Lys 570

Met Glu Leu Gly 270

Glu Asn Ala Ile 285

Val Leu His Leu

Pro Asp Asp Phe 320

Phe Lys Pro Ser 335

Gly Thr Gln Ser 350

Gly Asn Thr Met 365

Lys Ala Pro Ser

His Pro Ile Lys 400

Ala Pro Gly Gly 415

Phe Lys Gly Arg 430

Ala Leu Glu Arg 445

Ile Arg Tyr Glu

Lys Pro Ser Ser 480

Leu Leu Thr Asp 495

Gly His Ile Val 510

Arg Asp Gly Asp 525

Leu Leu Val Ser

Ala Pro Pro Pro 560

Leu Val Ser Asn 575 Ala Ser Asn Gly Cys Val Leu Asp Ala 580 585

<210> 187 <211> 1653 <212> DNA

<213> Methanococcus maripaludis <400> 187

atgataagtg ataacgtcaa aaagggagtt ataagaactc caaaccgagc tcttttaaag 60 gcttgcggat atacagacga agacatggaa aaaccattta ttggaattgt aaacagcttt 120 acagaagttg ttcccggcca cattcactta agaacattat cagaagcggc taaacatggt 180 gtttatgcaa acggtggaac accatttgaa tttaatacca ttggaatttg cgacggtatt 240 gcaatgggcc acgaaggtat gaaatactct ttaccttcaa gagaaattat tgcagacgct 300 gttgaatcaa tggcaagagc acatggattt gatggtcttg ttttaattcc tacgtgtgat 360 aaaatcgttc ctggaatgat aatgggtgct ttaagactaa acattccatt tattgtagtt 420 actggaggac caatgcttcc cggagaattc caaggtaaaa aatacgaact tatcagcctt 480 tttgaaggtg tcggagaata ccaagttgga aaaattactg aagaagagtt aaagtgcatt 540 gaagactgtg catgttcagg tgctggaagt tgtgcagggc tttacactgc aaacagtatg 600 gcctgcctta cagaagcttt gggactctct cttccaatgt gtgcaacaac gcatgcagtt 660 gatgcccaaa aagttaggct tgctaaaaaa agtggctcaa aaattgttga tatggtaaaa 720 gaagacctaa aaccaacaga catattaaca aaagaagctt ttgaaaatgc tattttagtt 780 gaccttgcac ttggtggatc aacaaacaca acattacaca ttcctgcaat tgcaaatgaa 840 attgaaaata aattcataac tctcgatgac tttgacaggt taagcgatga agttccacac 900 attgcatcaa tcaaaccagg tggagaacac tacatgattg atttacacaa tgctggaggt 960 attcctgcgg tattgaacgt tttaaaagaa aaaattagag atacaaaaac agttgatgga 1020 agaagcattt tggaaatcgc agaatctgtt aaatacataa attacgacgt tataagaaaa 1080 gtggaagctc cggttcacga aactgctggt ttaagggttt taaagggaaa tcttgctcca 1140 aacggttgcg ttgtaaaaat cggtgcagta catccgaaaa tgtacaaaca cgatggacct 1200 gcaaaagttt acaattccga agatgaagca atttctgcga tacttggcgg aaaaattgta 1260 gaaggggacg ttatagtaat cagatacgaa ggaccatcag gaggccctgg aatgagagaa 1320 atgctctccc caacttcagc aatctgtgga atgggtcttg atgacagcgt tgcattgatt 1380 actgatggaa gattcagtgg tggaagtagg ggcccatgta tcggacacgt ttctccagaa 1440 gctgcagctg gcggagtaat tgctgcaatt gaaaacgggg atatcatcaa aatcgacatg 1500 attgaaaaag aaataaatgt tgatttagat gaatcagtca ttaaagaaag actctcaaaa ctgggagaat ttgagcctaa aatcaaaaaa ggctatttat caagatactc aaaacttgtc tcatctgctg acgaaggggc agttttaaaa taa <210> 188 <211> 550 <212> PRT <213> Methanococcus maripaludis <400> 188

1653

Met Ile Ser Asp Asn Val Lys Lys Gly Val Ile Arg Thr Pro Asn Arg 15 10 15

Ala Leu Leu Lys Ala Cys Gly Tyr Thr Asp Glu Asp Met Glu Lys Pro 20 25 30

Phe Ile Gly Ile Val Asn Ser Phe Thr Glu Val Val Pro Gly His Ile 35 40 45

His Leu Arg Thr Leu Ser Glu Ala Ala Lys His Gly Val Tyr Ala Asn 50 55 60

Gly Gly Thr Pro Phe Glu Phe Asn Thr Ile Gly Ile Cys Asp Gly Ile 65 70 75 80

Ala Met Gly His Glu Gly Met Lys Tyr Ser Leu Pro Ser Arg Glu Ile 85 90 95

Ile Ala Asp Ala Val Glu Ser Met Ala Arg Ala His Gly Phe Asp Gly 100 105 110

Leu Val Leu Ile Pro Thr Cys Asp Lys Ile Val Pro Gly Met Ile Met 115 120 125

Gly Ala Leu Arg Leu Asn Ile Pro Phe Ile Val Val Thr Gly Gly Pro 130 135 140

Met Leu Pro Gly Glu Phe Gln Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Ile Ser Leu 145 150 155 160

Phe Glu Gly Val Gly Glu Tyr Gln Val Gly Lys Ile Thr Glu Glu Glu 165 170 175

Leu Lys Cys Ile Glu Asp Cys Ala Cys Ser Gly Ala Gly Ser Cys Ala 180 185 190

Gly Leu Tyr Thr Ala Asn Ser Met Ala Cys Leu Thr Glu Ala Leu Gly 195 200 205

Leu Ser Leu Pro Met Cys Ala Thr Thr His Ala Val Asp Ala Gln Lys 210 215 220

Val Arg Leu Ala Lys Lys Ser Gly Ser Lys Ile Val Asp Met Val Lys 225 230 235 240 Glu Asp Leu Lys

Ala Ile Leu Val 260

His Ile Pro Ala 275

Asp Asp Phe Asp 290

Lys Pro Gly Gly 305

Ile Pro Ala Val

Thr Val Asp Gly 340

Pro Thr Asp Ile 245

Asp Leu Ala Leu

Ile Ala Asn Glu 280

Arg Leu Ser Asp 295

Glu His Tyr Met 310

Leu Asn Val Leu 325

Arg Ser Ile Leu

Leu Thr Lys Glu 250

Gly Gly Ser Thr 265

Ile Glu Asn Lys

Glu Val Pro His 300

Ile Asp Leu His 315

Lys Glu Lys Ile 330

Glu Ile Ala Glu 345

Ala Phe Glu Asn 255

Asn Thr Thr Leu 270

Phe Ile Thr Leu 285

Ile Ala Ser Ile

Asn Ala Gly Gly

320

Arg Asp Thr Lys 335

Ser Val Lys Tyr 350

Ile Asn Tyr Asp 355

Ala Gly Leu Arg 370

Val Lys Ile Gly 385

Ala Lys Val Tyr

Gly Lys Ile Val 420

Ser Gly Gly Pro 435

Cys Gly Met Gly 450

Phe Ser Gly Gly 465

Val Ile Arg Lys 360

Val Leu Lys Gly 375

Ala Val His Pro 390

Asn Ser Glu Asp 405

Glu Gly Asp Val

Gly Met Arg Glu 440

Leu Asp Asp Ser 455

Ser Arg Gly Pro 470

Val Glu Ala Pro

Asn Leu Ala Pro 380

Lys Met Tyr Lys 395

Glu Ala Ile Ser 410

Ile Val Ile Arg 425

Met Leu Ser Pro

Val Ala Leu Ile 460

Cys Ile Gly His 475

Val His Glu Thr 365

Asn Gly Cys Val

His Asp Gly Pro 400

Ala Ile Leu Gly 415

Tyr Glu Gly Pro 430

Thr Ser Ala Ile 445

Thr Asp Gly Arg

Val Ser Pro Glu 480

Ala Ala Ala Gly Gly Val Ile Ala Ala Ile Glu Asn Gly Asp Ile Ile 485 490 495

Lys Ile Asp Met Ile Glu Lys Glu Ile Asn Val Asp Leu Asp Glu Ser 500 505 510

Val Ile Lys Glu Arg Leu Ser Lys Leu Gly Glu Phe Glu Pro Lys Ile 515 520 525

Lys Lys Gly Tyr Leu Ser Arg Tyr Ser Lys Leu Val Ser Ser Ala Asp 530 535 540

Glu Gly Ala Val Leu Lys 545 550 <210> 189 <211> 1677 <212> DNA

<213> Bacillus subtilis <400> 189

atggcagaat tacgcagtaa tatgatcaca ttgcttcgtg cagcaggggt aaaagaagag aattcataca ttgatatcgt tcccggtcat aaagaagcaa tcagagaagc agggggcgtt gatggcatcg caatggggca tatcggtatg gcagactctg tggaaacggt tgtatccgca aactgcgaca aaatcacacc gggaatgctt atttttgtca gcggcggacc gatggcggca ctttcctcag tattcgaagg ggtaggcgcc cttcaagaac tagagcagtt cggatgccca gcgaactcaa tgaactgtct gtcagaagca attctggcaa catctccgga acgcaaagag gaaacgattc gcaaagatat caaaccgcgt gcgtttgcac tcgatatggc gctcggaggt cttgcaaacg aagccggcgt tgaatactct gtgccgcact tggctaagct ggcgcctgca gcgggcggcg tttcagcggc tctgaatgag gatgcgctga ctgttacagg aaaaactctt gattatgacg tcattcaccc gctggatcaa ttattcggta atctagctcc ggacggcgct attacaagac acgaagggcc ggctgtcgta attatcaacc gaaaagtaaa agaaggcgac ggcggacctg gcatgccgga aatgctggcg gggccaaaag tggcattgat tacggacgga atcggccacg tatcacctga ggccgctgag gaccatatta tcgttgatat tgaaaaacgc

caaggaatcg atagagctcc gcaccgcagt 60 gatttcggca agccgtttat tgcggtgtgt 120 gttcacttgc aggagtttgg gaaaatcgta 180 ccgtttgaat ttaataccat tggggtagat 240 agatattcgc tgccaagccg tgaaattatc 300 cactggtttg acggaatggt ctgtattccg 360 atggcggcaa tgcgcatcaa cattccgacg 420 ggaagaacaa gttacgggcg aaaaatctcc 480 taccaagcag ggaaaatcaa cgaaaacgag 540 acgtgcgggt cttgctcagg catgtttacg 600 cttggtcttg ctttgccggg taatggaacc 660 tttgtgagaa aatcggctgc gcaattaatg 720 gatattgtta cagtaaaagc gattgataac 780 tctacaaata ccgttcttca tacccttgcc 840 ttagaacgca ttaacgaagt cgctgagcgc 900 tcggatgtgt ttattgaaga tcttcacgaa 960 ctttcgaaga aagaaggagc gcttcattta 1020 ggagaaacca ttgccggaca tgaagtaaag 1080 ccattcactg aaaagggagg ccttgctgtt 1140 atcattaaaa caggcggcgt acagaatggg 1200 ttcgattctc aggacgaggc gcttgacggc 1260 gttgtcatca tcagatacga agggccaaaa 1320 ccaacatccc aaatcgttgg aatgggactc 1380 cgtttttccg gagcctcccg tggcctctca 1440 ggcgggccgc ttgcctttgt tgaaaacgga 1500 atcttggatg tacaagtgcc agaagaagag 1560 tgggaaaaac gaaaagcgaa ctggaaaggt tttgaaccga aagtgaaaac cggctacctg 1620

gcacgttatt ctaaacttgt gacaagtgcc aacaccggcg gtattatgaa aatctag 1677

<210> 190 <211> 558 <212> PRT

<213> Bacillus subtilis <400> 190

Met Ala Glu Leu Arg Ser Asn Met Ile Thr Gln Gly Ile Asp Arg Ala 1 5 10 15

Pro His Arg Ser Leu Leu Arg Ala Ala Gly Val Lys Glu Glu Asp Phe 20 25 30

Gly Lys Pro Phe Ile Ala Val Cys Asn Ser Tyr Ile Asp Ile Val Pro 35 40 45

Gly His Val His Leu Gln Glu Phe Gly Lys Ile Val Lys Glu Ala Ile 50 55 60

Arg Glu Ala Gly Gly Val Pro Phe Glu Phe Asn Thr Ile Gly Val Asp 65 70 75 80

Asp Gly Ile Ala Met Gly His Ile Gly Met Arg Tyr Ser Leu Pro Ser 85 90 95

Arg Glu Ile Ile Ala Asp Ser Val Glu Thr Val Val Ser Ala His Trp 100 105 110

Phe Asp Gly Met Val Cys Ile Pro Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly 115 120 125

Met Leu Met Ala Ala Met Arg Ile Asn Ile Pro Thr Ile Phe Val Ser 130 135 140

Gly Gly Pro Met Ala Ala Gly Arg Thr Ser Tyr Gly Arg Lys Ile Ser 145 150 155 160

Leu Ser Ser Val Phe Glu Gly Val Gly Ala Tyr Gln Ala Gly Lys Ile 165 170 175

Asn Glu Asn Glu Leu Gln Glu Leu Glu Gln Phe Gly Cys Pro Thr Cys 180 185 190

Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu Ser 195 200 205

Glu Ala Leu Gly Leu Ala Leu Pro Gly Asn Gly Thr Ile Leu Ala Thr 210 215 220

Ser Pro Glu Arg Lys Glu Phe Val Arg Lys Ser Ala Ala Gln Leu Met 225 230 235 240

Glu Thr Ile Arg Lys Asp Ile Lys Pro Arg Asp Ile Val Thr Val Lys 245 250 255 Ala Ile Asp Asn 260

Asn Thr Val Leu 275

Tyr Ser Leu Glu 290

Ala Lys Leu Ala 305

Ala Gly Gly Val

Ala Leu His Leu 340

Thr Ile Ala Gly 355

Asp Gln Pro Phe 370

Leu Ala Pro Asp 385

Ile Thr Arg His

Ala Phe Ala Leu

His Thr Leu Ala 280

Arg Ile Asn Glu 295

Pro Ala Ser Asp 310

Ser Ala Ala Leu 325

Asp Ala Leu Thr

His Glu Val Lys 360

Thr Glu Lys Gly 375

Gly Ala Ile Ile 390

Glu Gly Pro Ala 405

Asp Met Ala Leu 265

Leu Ala Asn Glu

Val Ala Glu Arg 300

Val Phe Ile Glu 315

Asn Glu Leu Ser 330

Val Thr Gly Lys 345

Asp Tyr Asp Val

Gly Leu Ala Val 380

Lys Thr Gly Gly 395

Val Val Phe Asp 410

Gly Gly Ser Thr 270

Ala Gly Val Glu 285

Val Pro His Leu

Asp Leu His Glu 320

Lys Lys Glu Gly 335

Thr Leu Gly Glu 350

Ile His Pro Leu 365

Leu Phe Gly Asn

Val Gln Asn Gly 400

Ser Gln Asp Glu 415

Ala Leu Asp Gly Ile Ile Asn Arg Lys Val Lys Glu Gly Asp Val Val 420 425 430

Ile Ile Arg Tyr Glu 435

Leu Ala Pro Thr Ser 450

Ala Leu Ile Thr Asp 465

Ile Gly His Val Ser 485

Val Glu Asn Gly Asp 500

Asp Val Gln Val Pro 515

Lys Gly Phe Glu Pro 530

Lys Leu Val Thr Ser 545

Gly Pro Lys Gly Gly Pro 440

Gln Ile Val Gly Met Gly 455

Gly Arg Phe Ser Gly Ala 470 475

Pro Glu Ala Ala Glu Gly 490

His Ile Ile Val Asp Ile 505

Glu Glu Glu Trp Glu Lys 520

Lys Val Lys Thr Gly Tyr 535

Ala Asn Thr Gly Gly Ile 550 555

Gly Met Pro Glu Met 445

Leu Gly Pro Lys Val 460

Ser Arg Gly Leu Ser 480

Gly Pro Leu Ala Phe 495

Glu Lys Arg Ile Leu 510

Arg Lys Ala Asn Trp 525

Leu Ala Arg Tyr Ser 540

Met Lys Ile <210> 191 <211> 1647 <212> DNA

<213> Lactococcus Iactis <400> 191

atgtatacag taggagatta cctattagac tttggagtcc ctggagacta taacttacaa atgaaatggg tcggaaatgc taatgaatta cgtactaaaa aagctgccgc atttcttaca aatggattag caggaagtta cgccgaaaat acatcaaaag ttcaaaatga aggaaaattt aaacacttta tgaaaatgca cgaacctgtt aatgcaaccg ttgaaattga ccgagtactt tatatcaact taccagttga tgttgctgct aaaaaggaaa actcaacttc aaatacaagt agcttgaaaa atgccaaaaa accaatcgtg ttagaaaaaa cagtcactca atttatttca tttggtaaaa gttcagttga tgaagccctc ctctcagagc ctaatcttaa agaattcgtg gttaaactca cagactcttc aacaggagcc atttcactga atatagatga aggaaaaata gaatccctca tctcctctct cttagaccta gataaaaagc aagaagactt tgttccatca caagcagttg aaaacctaac tcaaagcaat ttctttggcg cttcatcaat tttcttaaaa tggggatcaa ttggatatac attcccagca agcagacacc ttttatttat tggtgatggt ttagcaatca gagaaaaaat taatccaatt gtcgaaagag aaattcatgg accaaatcaa tcaaaattac cagaatcgtt tggagcaaca actgaaaatg aatttgtgtc tgtcatgaaa tggattgagt taattttggc aaaagaaggt

cgattacacg agttaggaat tgaagaaatt 60 tttttagatc aaattatttc ccacaaggat 120 aatgcttcat atatggctga tggctatgct 180 acctttggag taggtgaatt gagtgcagtt 240

ttaccagtag tagaaatagt gggatcacct 300

gttcatcata cgctggctga cggtgatttt 360

acagcagctc gaactttact gacagcagaa 420

tctgcactat taaaagaaag aaaacctgtc 480

gcaaaagcag agaaaccctc actccctttg 540

gaccaagaaa ttttgaacaa aattcaagaa 600

attacaggac atgaaataat tagttttggc 660

aagacaaaac tacctattac gacattaaac 720

ccttcatttt taggaatcta taatggtaca 780

gaatcagccg acttcatctt gatgcttgga 840

ttcactcatc atttaaatga aaataaaatg 900

tttaacgaaa gaatccaaaa ttttgatttt 960

agcgaaatag aatacaaagg aaaatatatc 1020

aatgcgcttt tatcacaaga ccgcctatgg 1080

gaaacaatcg ttgctgaaca agggacatca 1140

tcaaagagtc attttattgg tcaaccctta 1200

gcattaggaa gccaaattgc agataaagaa 1260

tcacttcaac ttacagtgca agaattagga 1320

tgctttatta tcaataatga tggttataca 1380

agctacaatg atattccaat gtggaattac 1440

gaagatcgag tagtctcaaa aatcgttaga 1500

gaagctcaag cagatccaaa tagaatgtac 1560

gcaccaaaag tactgaaaaa aatgggcaaa 1620 ctatttgctg aacaaaataa atcataa

<210> 192 <211> 1644 <212> DNA

<213> Lactococcus Iactis <400> 192

atgtatacag taggagatta cctgttagac tttggagttc ctggtgacta taacttacaa atgaaatgga ttggaaatgc taatgaatta cgtactaaaa aagctgccgc atttctcacc aatggactgg caggaagtta tgccgaaaat acttcaaaag tacaaaatga cggaaaattt aaacacttta tgaagatgca tgaacctgtt aatgccacat atgaaattga ccgagtactt tatattaact taccagtcga tgttgctgca gaaaaagaaa gctctacaac aaatacaact agtttgaaaa atgcccaaaa accagtagtg ttagaaaaaa cggtaactca gtttgtttca tttggtaaaa gtgctgttga tgaatctttg ctttcagaaa tcagtcttaa aaattttgtg gtgaagctta cggactcctc aacaggtgca atttcactaa acatagatga aggaataatt agagcagtgg tttcttcttt atcagaatta gataagcaat atgaagaatt tattccatca caggcagttg aaagtttgac tcaaagcaat ttttttggag cttcaacaat tttcttaaaa tggggttcta ttggatatac ttttccagcg agcagacacc ttttatttat tggtgatggt ctatcaatca gagaaaaact caatccaatt gttgaaagag aaatccacgg acctactcaa tcgaaattac cagaaacatt tggagcaaca acagagaatg aatttgtgtc tgtcatgaaa

1647

cgattacacg agttgggaat tgaagaaatt 60 tttttagatc aaattatttc acgcgaagat 120 aatgcttctt atatggctga tggttatgct 180 acatttggag tcggcgaatt gagtgcgatc 240 ttaccagtag tagaaattgt tggttcacca 300 gtccatcata cactagcaga tggtgatttt 360 acagcagcgc ggactttact gacagcagaa 420 tctcaattac taaaagaaag aaaaccagtc 480 gcaaaagcag agaagcctgc attatcttta 540 gaacaagtga ttttgagtaa gattgaagaa 600 attgcaggac acgaagtaat tagttttggt 660 gaaacaaaac taccgattac gacactaaat 720 ccctcatttt taggaatata taacgggaaa 780 gagtccgcag actttatcct aatgcttgga 840 ttcacacatc atttagatga aaataaaatg 900 ttcaataaag tggtagaaga ttttgatttt 960 aaaggaatag aatatgaagg acaatatatt 1020 agtgctccct tatcacaaga ccgtctatgg 1080 gaaacaatcg ttgctgaaca aggaacctca 1140 tcaaatagtc gttttattgg acaaccttta 1200 gctttaggaa gccaaattgc ggataaagag 1260 tcacttcaac ttaccgtaca agaattagga 1320 tgttttatca taaataatga tggttataca 1380 agttataacg acattccaat gtggaattac 1440 gaagatcgtg tagtatcaaa aattgttaga 1500 gaagcccaag cagatgtcaa tagaatgtat 1560 tggatagaac tagttttgga aaaagaagat gcgccaaaat tactgaaaaa aatgggtaaa 1620

ttatttgctg agcaaaataa atag 1644

<210> 193 <211> 547 <212> PRT

<213> Lactococcus Iactis <4 00> 193

Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly 15 10 15

Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu 20 25 30

Asp Gln Ile Ile Ser Arg Glu Asp Met Lys Trp Ile Gly Asn Ala Asn 35 40 45

Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys 50 55 60

Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Ile 65 70 75 80

Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile 85 90 95

Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Asp Gly Lys Phe Val His 100 105 110

His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys His Phe Met Lys Met His Glu 115 120 125

Pro Val Thr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Thr Ala Glu Asn Ala Thr Tyr 130 135 140

Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Gln Leu Leu Lys Glu Arg Lys Pro Val 145 150 155 160

Tyr Ile Asn Leu Pro Val Asp Val Ala Ala Ala Lys Ala Glu Lys Pro 165 170 175

Ala Leu Ser Leu Glu Lys Glu Ser Ser Thr Thr Asn Thr Thr Glu Gln 180 185 190

Val Ile Leu Ser Lys Ile Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ala Gln Lys Pro 195 200 205

Val Val Ile Ala Gly His Glu Val Ile Ser Phe Gly Leu Glu Lys Thr 210 215 220

Val Thr Gln Phe Val Ser Glu Thr Lys Leu Pro Ile Thr Thr Leu Asn 225 230 235 240

Phe Gly Lys Ser Ala Val Asp Glu Ser Leu Pro Ser Phe Leu Gly Ile 245 250 255 Tyr Asn Gly Lys Leu Ser Glu Ile Ser Leu Lys Asn Phe Val Glu Ser 260 265 270

Ala Asp Phe Ile Leu Met Leu Gly Val Lys Leu Thr Asp Ser Ser Thr 275 280 285

Gly Ala Phe Thr His His Leu Asp Glu Asn Lys Met Ile Ser Leu Asn 290 295 300

Ile Asp Glu Gly Ile Ile Phe Asn Lys Val Val Glu Asp Phe Asp Phe 305 310 315 320

Arg Ala Val Val Ser Ser Leu Ser Glu Leu Lys Gly Ile Glu Tyr Glu 325 330 335

Gly Gln Tyr Ile Asp Lys Gln Tyr Glu Glu Phe Ile Pro Ser Ser Ala 340 345 350

Pro Leu Ser Gln Asp Arg Leu Trp Gln Ala Val Glu Ser Leu Thr Gln 355 360 365

Ser Asn Glu Thr Ile Val Ala Glu Gln Gly Thr Ser Phe Phe Gly Ala 370 375 380

Ser Thr Ile Phe Leu Lys Ser Asn Ser Arg Phe Ile Gly Gln Pro Leu 385 390 395 400

Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Thr Phe Pro Ala Ala Leu Gly Ser Gln Ile 405 410 415

Ala Asp Lys Glu Ser Arg His Leu Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu 420 425 430

Gln Leu Thr Val Gln Glu Leu Gly Leu Ser Ile Arg Glu Lys Leu Asn 435 440 445

Pro Ile Cys Phe Ile Ile Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Val Glu Arg Glu 450 455 460

Ile His Gly Pro Thr Gln Ser Tyr Asn Asp Ile Pro Met Trp Asn Tyr 465 470 475 480

Ser Lys Leu Pro Glu Thr Phe Gly Ala Thr Glu Asp Arg Val Val Ser 485 490 495

Lys Ile Val Arg Thr Glu Asn Glu Phe Val Ser Val Met Lys Glu Ala 500 505 510

Gln Ala Asp Val Asn Arg Met Tyr Trp Ile Glu Leu Val Leu Glu Lys 515 520 525

Glu Asp Ala Pro Lys Leu Leu Lys Lys Met Gly Lys Leu Phe Ala Glu 530 535 540

Gln Asn Lys 545

<210> 194 <211> 1653 <212> DNA

<213> Salmonella typhimurium

<400> 194 ttatcccccg ttgcgggctt ccagcgcccg ggcttttggc aacatcactt caataaatga gacctctgcc agttggatag cctgcgtcac tagcgccggt ggtatctgcg tccagttcca gccgtgaatg gcgcgctcta cggtatagcc ctgcccgtcg cgtaacatcg agcccatctc gataatcaga atcacccgcc gatcgggaca ggaatagccg atagaccccc acagcggctg cagcgcggca gcgccaaaag ctgctgtccc gagatactgc tgtaaggttt gccagaagct cactggctgt ccggcggaac gcgtcggcgg gcgcagcgta gacaccgcct gcgccatcgg cgcgtaaggc tgaatctcca gcgtgcgttc aagggtatcg acaaaacggg tgccgacgca acgcacttct ttgctgctgg cgccagcgct atcaaaaagc cccttcccca tcagtagtgt gcgctgcaac agtggtcgta aaccaaaacg gcgccgactg ttcatcaggc actgacgggc ttgcgcttca tgcacgggca acgccagcgc cacatcggcg ggcaacatga tgtatcctgg gcggtcaatc tcgaaacagg cgttctgttc ctgactcatg cgataaaaat gacgaaaatc gccacgctgc tgcgcagcgc tacagggcgc cgcgtaactg cccgcgatac cgttaatagc tagcgctcca gcgcccgaca tgcgcgcata attggcgcat cccacccaac gcagggtcgg gttataatcg cccggtacgc caaaaagatg caaatagtcg gccacggtat aggggttttg

ggtcacggta cgcagtaatt ccggcagatc 60 cagacgttgt gggcgcgcca accgttcgag 120 ccgccagcac tccgcctgtt gcgccgcgtt 180 gctcgcgatg tcgttatacc gctgggccgc 240 gtcattgttg agcagcagga tgaccggcgc 300 ctgaatcgtg agctgcgccg cgccatcgcc 360 ggcggtttgc gcgccaaacg cggcgggcaa 420 taacacaact tccgcgccgt caggaagcga 480 ctggtcgaca aggataatat ctccgggttt 540 ttcctgggtc agttctcctt tatcaatccg 600 cggcgcaaaa gcgcattcca ggcacagttc 660 gaggttgaac caggtttcgc cgatgcgcga 720 cgccggtaat tgttgggtaa atccggccgt 780 gataacccta tcggcgtcct ctatggcctg 840 ataggtgcca acgaagttcg ggtgctgttc 900 cgcatgagcg atgggcgttt ccgccatcca 960 cccggcaaga aagtcggcca atagcgcaat 1020 gtgataacga aaggccgtct ccacgccgct 1080 ctgcgtaggt gggatggccg tttttttcgc 1140 cctgcgtgcg gcaagcattt cacccaacac 1200 atctaatatt gcgctggcag cggatatcgc 1260 gccgtcaccg agggtatggt gcatcaattc 1320 gccgacgata tgcaagaccg ggacatattc 1380 gctaagttct cccacgccaa aggtggtgag 1440 gccgtccgcg gcataagcgg cgttcagctc 1500 gtggtcaatc acatggtcaa gaaactgcaa 1560 gccaatgccg catcctgcca gtctgtccag 1620 cat 1653 <210> 195 <211> 550 <212> PRT

<213> Salmonella typhimurium <400> 195

Met Gln Asn Pro Tyr Thr Val Ala Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu Ala 1 5 10 15

Gly Cys Gly Ile Gly His Leu Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu 20 25 30

Gln Phe Leu Asp His Val Ile Asp His Pro Thr Leu Arg Trp Val Gly 35 40 45

Cys Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg 50 55 60

Met Ser Gly Ala Gly Ala Leu Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ile Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Tyr Val Pro Val 85 90 95

Leu His Ile Val Gly Ala Pro Cys Ser Ala Ala Gln Gln Arg Gly Glu 100 105 110

Leu Met His His Thr Leu Gly Asp Gly Asp Phe Arg His Phe Tyr Arg 115 120 125

Met Ser Gln Ala Ile Ser Ala Ala Ser Ala Ile Leu Asp Glu Gln Asn 130 135 140

Ala Cys Phe Glu Ile Asp Arg Val Leu Gly Glu Met Leu Ala Ala Arg 145 150 155 160

Arg Pro Gly Tyr Ile Met Leu Pro Ala Asp Val Ala Lys Lys Thr Ala 165 170 175

Ile Pro Pro Thr Gln Ala Leu Ala Leu Pro Val His Glu Ala Gln Ser 180 185 190

Gly Val Glu Thr Ala Phe Arg Tyr His Ala Arg Gln Cys Leu Met Asn 195 200 205

Ser Arg Arg Ile Ala Leu Leu Ala Asp Phe Leu Ala Gly Arg Phe Gly 210 215 220

Leu Arg Pro Leu Leu Gln Arg Trp Met Ala Glu Thr Pro Ile Ala His 225 230 235 240

Ala Thr Leu Leu Met Gly Lys Gly Leu Phe Asp Glu Gln His Pro Asn 245 250 255

Phe Val Gly Thr Tyr Ser Ala Gly Ala Ser Ser Lys Glu Val Arg Gln 260 265 270

Ala Ile Glu Asp Ala Asp Arg Val Ile Cys Val Gly Thr Arg Phe Val 275 280 285 Asp Thr Leu Thr Ala Gly Phe Thr Gln Gln Leu Pro Ala Glu Arg Thr 290 295 300

Leu Glu Ile Gln Pro Tyr Ala Ser Arg Ile Gly Glu Thr Trp Phe Asn 305 310 315 320

Leu Pro Met Ala Gln Ala Val Ser Thr Leu Arg Glu Leu Cys Leu Glu 325 330 335

Cys Ala Phe Ala Pro Pro Pro Thr Arg Ser Ala Gly Gln Pro Val Arg 340 345 350

Ile Asp Lys Gly Glu Leu Thr Gln Glu Ser Phe Trp Gln Thr Leu Gln 355 360 365

Gln Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ile Ile Leu Val Asp Gln Gly Thr Ala 370 375 380

Ala Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Leu Pro Asp Gly Ala Glu Val Val 385 390 395 400

Leu Gln Pro Leu Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Ser Leu Pro Ala Ala Phe 405 410 415

Gly Ala

Asp Gly

Asp Gly 450

Gln Thr 420

Ala Ala 435

Gln Ala

Ala Cys Gln Leu Pro Val

Pro Asp

Thr Ile 440

Ile Leu 455

Arg Arg 425

Gln Glu Leu Leu

Val Ile

Met Gly

Asn Asn 460

Leu Ile 430

Ser Met 445

Asp Gly

Ile Gly Leu Arg Tyr Thr

Val Glu Arg Ala Ile His Gly Ala Ala Gln Arg Tyr Asn Asp Ile Ala 465 470 475 480

Ser Trp Asn Trp Thr Gln Ile Pro Pro Ala Leu Asn Ala Ala Gln Gln 485 490 495

Ala Glu Cys Trp Arg Val Thr Gln Ala Ile Gln Leu Ala Glu Val Leu 500 505 510

Glu Arg Leu Ala Arg Pro Gln Arg Leu Ser Phe Ile Glu Val Met Leu 515 520 525

Pro Lys Ala Asp Leu Pro Glu Leu Leu Arg Thr Val Thr Arg Ala Leu 530 535 540

Glu Ala Arg Asn Gly Gly 545 550

<210> 196 <211> 1665 <212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum <400> 196

ttgaagagtg aatacacaat tggaagatat ttgttagacc gtttatcaga gttgggtatt cggcatatct ttggtgtacc tggagattac aatctatcct ttttagacta tataatggag 120

tacaaaggga tagattgggt tggaaattgc aatgaattga atgctgggta tgctgctgat 180

ggatatgcaa gaataaatgg aattggagcc atacttacaa catttggtgt tggagaatta 240

agtgccatta acgcaattgc tggggcatac gctgagcaag ttccagttgt taaaattaca 300

ggtatcccca cagcaaaagt tagggacaat ggattatatg tacaccacac attaggtgac 360

ggaaggtttg atcacttttt tgaaatgttt agagaagtaa cagttgctga ggcattacta 420

agcgaagaaa atgcagcaca agaaattgat cgtgttctta tttcatgctg gagacaaaaa 480

cgtcctgttc ttataaattt accgattgat gtatatgata aaccaattaa caaaccatta 540

aagccattac tcgattatac tatttcaagt aacaaagagg ctgcatgtga atttgttaca 600

gaaatagtac ctataataaa tagggcaaaa aagcctgtta ttcttgcaga ttatggagta 660

tatcgttacc aagttcaaca tgtgcttaaa aacttggccg aaaaaaccgg atttcctgtg 720

gctacactaa gtatgggaaa aggtgttttc aatgaagcac accctcaatt tattggtgtt 780

tataatggtg atgtaagttc tccttattta aggcagcgag ttgatgaagc agactgcatt 840

attagcgttg gtgtaaaatt gacggattca accacagggg gattttctca tggattttct 900

aaaaggaatg taattcacat tgatcctttt tcaataaagg caaaaggtaa aaaatatgca 960

cctattacga tgaaagatgc tttaacagaa ttaacaagta aaattgagca tagaaacttt 1020

gaggatttag atataaagcc ttacaaatca gataatcaaa agtattttgc aaaagagaag 1080

ccaattacac aaaaacgttt ttttgagcgt attgctcact ttataaaaga aaaagatgta 1140

ttattagcag aacagggtac atgctttttt ggtgcgtcaa ccatacaact acccaaagat 1200

gcaactttta ttggtcaacc tttatgggga tctattggat acacacttcc tgctttatta 1260

ggttcacaat tagctgatca aaaaaggcgt aatattcttt taattgggga tggtgcattt 1320

caaatgacag cacaagaaat ttcaacaatg cttcgtttac aaatcaaacc tattattttt 1380

ttaattaata acgatggtta tacaattgaa cgtgctattc atggtagaga acaagtatat 1440

aacaatattc aaatgtggcg atatcataat gttccaaagg ttttaggtcc taaagaatgc 1500

agcttaacct ttaaagtaca aagtgaaact gaacttgaaa aggctctttt agtggcagat 1560

aaggattgtg aacatttgat ttttatagaa gttgttatgg atcgttatga taaacccgag 1620

cctttagaac gtctttcgaa acgttttgca aatcaaaata attag 1665

<210> 197 <211> 554

<212> PRT

<213> Clostridium acetobutyIicum <400> 197

Met Lys Ser Glu Tyr Thr Ile Gly Arg Tyr Leu Leu Asp Arg Leu Ser 1 5 10 15

Glu Leu Gly Ile Arg His Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu 20 25 30

Ser Phe Leu Asp Tyr Ile Met Glu Tyr Lys Gly Ile Asp Trp Val Gly 35 40 45

Asn Cys Asn Glu Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg 50 55 60

Ile Asn Gly Ile Gly Ala Ile Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu 65 70 75 80

Ser Ala Ile Asn Ala Ile Ala Gly Ala Tyr Ala Glu Gln Val Pro Val 85 90 95

Val Lys Ile Thr Gly Ile Pro Thr Ala Lys Val Arg Asp Asn Gly Leu 100 105 110

Tyr Val His His Thr Leu Gly Asp Gly Arg Phe Asp His Phe Phe Glu 115 120 125

Met Phe Arg Glu Val Thr Val Ala Glu Ala Leu Leu Ser Glu Glu Asn 130 135 140

Ala Ala Gln Glu Ile Asp Arg Val Leu Ile Ser Cys Trp Arg Gln Lys 145 150 155 160

Arg Pro Val Leu Ile Asn Leu Pro Ile Asp Val Tyr Asp Lys Pro Ile 165 170 175

Asn Lys Pro Leu Lys Pro Leu Leu Asp Tyr Thr Ile Ser Ser Asn Lys 180 185 190

Glu Ala Ala Cys Glu Phe Val Thr Glu Ile Val Pro Ile Ile Asn Arg 195 200 205

Ala Lys Lys Pro Val Ile Leu Ala Asp Tyr Gly Vai. Tyr Arg Tyr ,Gln 210 215 220

Val Gln His Val Leu Lys Asn Leu Ala Glu Lys Thr Gly Phe Pro Val 225 230 235 240

Ala Thr Leu Ser Met Gly Lys Gly Val Phe Asn Glu Ala His Pro Gln 245 250 255

Phe Ile Gly Val Tyr Asn Gly Asp Val Ser Ser Pro Tyr Leu Arg Gln 260 265 270

Arg Val Asp Glu Ala Asp Cys Ile Ile Ser Val Gly Val Lys Leu Thr 275 280 285

Asp Ser Thr Thr Gly Gly Phe Ser His Gly Phe Ser Lys Arg Asn Val 290 295 300 Ile His Ile Asp Pro Phe Ser Ile Lys Ala Lys Gly Lys Lys Tyr Ala 305 310 315 320

Pro Ile Thr Met Lys Asp Ala Leu Thr Glu Leu Thr Ser Lys Ile Glu 325 330 335

His Arg Asn Phe Glu Asp Leu Asp Ile Lys Pro Tyr Lys Ser Asp Asn 340 345 350

Gln Lys Tyr Phe Ala Lys Glu Lys Pro Ile Thr Gln Lys Arg Phe Phe 355 360 365

Glu Arg Ile Ala His Phe Ile Lys Glu Lys Asp Val Leu Leu Ala Glu 370 375 380

Gln Gly Thr Cys Phe Phe Gly Ala Ser Thr Ile Gln Leu Pro Lys Asp 385 390 395 400

Ala Thr Phe Ile Gly Gln Pro Leu Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Thr Leu 405 410 415

Pro Ala Leu Leu Gly Ser Gln Leu Ala Asp Gln Lys Arg Arg Asn Ile 420 425 430

Leu Leu Ile Gly Asp Gly Ala Phe Gln Met Thr Ala Gln Glu Ile Ser 435 440 445

Thr Met Leu Arg Leu Gln Ile Lys Pro Ile Ile Phe Leu Ile Asn Asn 450 455 460

Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Arg Ala Ile His Gly Arg Glu Gln Val Tyr 465 470 475 480

Asn Asn Ile Gln Met Trp Arg Tyr His Asn Val Pro Lys Val Leu Gly 485 490 495

Pro Lys Glu Cys Ser Leu Thr Phe Lys Val Gln Ser Glu Thr Glu Leu 500 505 510

Glu Lys Ala Leu Leu Val Ala Asp Lys Asp Cys Glu His Leu Ile Phe 515 520 525

Ile Glu Val Val Met Asp Arg Tyr Asp Lys Pro Glu Pro Leu Glu Arg 530 535 540

Leu Ser Lys Arg Phe Ala Asn Gln Asn Asn

545 550 <210> 198 <211> 939 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 198

atgcctgcta cgttaaagaa ttcttctgct acattaaaac taaatactgg tgcctccatt 60 ccagtgttgg gtttcggcac ttggcgttcc gttgacaata acggttacca ttctgtaatt 120

gcagctttga aagctggata cagacacatt gatgctgcgg ctatctattt gaatgaagaa 180 gaagttggca gggctattaa agattccgga gtccctcgtg aggaaatttt tattactact 240

aagctttggg gtacggaaca acgtgatccg gaagctgctc taaacaagtc tttgaaaaga 300

ctaggcttgg attatgttga cctatatctg atgcattggc cagtgccttt gaaaaccgac 360

agagttactg atggtaacgt tctgtgcatt ccaacattag aagatggcac tgttgacatc 420

gatactaagg aatggaattt tatcaagacg tgggagttga tgcaagagtt gccaaagacg 480

ggcaaaacta aagccgttgg tgtctctaat ttttctatta acaacattaa agaattatta 540

gaatctccaa ataacaaggt ggtaccagct actaatcaaa ttgaaattca tccattgcta 600

ccacaagacg aattgattgc cttttgtaag gaaaagggta ttgttgttga agcctactca 660

ccatttggga gtgctaatgc tcctttacta aaagagcaag caattattga tatggctaaa 720

aagcacggcg ttgagccagc acagcttatt atcagttgga gtattcaaag aggctacgtt 780

gttctggcca aatcggttaa tcctgaaaga attgtatcca attttaagat tttcactctg 840

cctgaggatg atttcaagac tattagtaac ctatccaaag tgcatggtac aaagagagtc 900

gttgatatga agtggggatc cttcccaatt ttccaatga 939

<210> 199 <211> 312 <212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae <400> 199

Met Pro Ala Thr Leu Lys Asn Ser Ser Ala Thr Leu Lys Leu Asn Thr 1 5 10 15

Gly Ala Ser Ile Pro Val Leu Gly Phe Gly Thr Trp Arg Ser Val Asp 20 25 30

Asn Asn Gly Tyr His Ser Val Ile Ala Ala Leu Lys Ala Gly Tyr Arg 35 40 45

His Ile Asp Ala Ala Ala Ile Tyr Leu Asn Glu Glu Glu Val Gly Arg 50 55 60

Ala Ile Lys Asp Ser Gly Val Pro Arg Glu Glu Ile Phe Ile Thr Thr 65 70 75 80

Lys Leu Trp Gly Thr Glu Gln Arg Asp Pro Glu Ala Ala Leu Asn Lys 85 90 95

Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Met His 100 105 110

Trp Pro Val Pro Leu Lys Thr Asp Arg Val Thr Asp Gly Asn Val Leu 115 120 125

Cys Ile Pro Thr Leu Glu Asp Gly Thr Val Asp Ile Asp Thr Lys Glu 130 135 140 Trp Asn Phe Ile Lys Thr Trp Glu Leu Met Gln Glu Leu Pro Lys Thr 145 150 155 160

Gly Lys Thr Lys Ala Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asn Ile 165 170 175

Lys Glu Leu Leu Glu Ser Pro Asn Asn Lys Val Val Pro Ala Thr Asn 180 185 190

Gln Ile Glu Ile His Pro Leu Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ile Ala Phe 195 200 205

Cys Lys Glu Lys Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Ser Pro Phe Gly Ser 210 215 220

Ala Asn Ala Pro Leu Leu Lys Glu Gln Ala Ile Ile Asp Met Ala Lys 225 230 235 240

Lys His Gly Val Glu Pro Ala Gln Leu Ile Ile Ser Trp Ser Ile Gln 245 250 255

Arg Gly Tyr Val Val Leu Ala Lys Ser Val Asn Pro Glu Arg Ile Val 260 265 270

Ser Asn Phe Lys Ile Phe Thr Leu Pro Glu Asp Asp Phe Lys Thr Ile 275 280 285

Ser Asn Leu Ser Lys Val His Gly Thr Lys Arg Val Val Asp Met Lys 290 295 300

Trp Gly Ser Phe Pro Ile Phe Gln 305 310

<210> 200 <211> 1083 <212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae <400> 200

ctagtctgaa aattctttgt cgtagccgac taaggtaaat ctatatctaa cgtcaccctt 60

ttccatcctt tcgaaggctt catggacgcc -ggcttcacca acaggtaatg tttccaccca 120

aattttgata tctttttcag agactaattt caagagttgg ttcaattctt tgatggaacc 180

taaagcactg taagaaatgg agacagcctt taagccatat ggctttagcg ataacatttc 240

gtgttgttct ggtatagaga ttgagacaat tctaccacca accttcatag cctttggcat 300

aatgttgaag tcaatgtcgg taagggagga agcacagact acaatcaggt cgaaggtgtc 360

aaagtacttt tcaccccaat caccttcttc taatgtagca atgtagtgat cggcgcccat 420

cttcattgca tcttctcttt ttctcgaaga acgagaaata acatacgtct ctgcccccat 480

ggctttggaa atcaatgtac ccatactgcc gataccacca agaccaacta taccaacttt 540

tttacctgga ccgcaaccgt tacgaaccaa tggagagtac acagtcaaac caccacataa 600 tagtggagca gccaaatgtg atggaatatt ctctgggata ggcaccacaa aatgttcatg 660

aactctgacg tagtttgcat agccaccctg cgacacatag ccgtcttcat aaggctgact 720

gtatgtggta acaaacttgg tgcagtatgg ttcattatca ttcttacaac ggtcacattc 780

caagcatgaa aagacttgag cacctacacc aacacgttga ccgactttca acccactgtt 840

tgacttgggc cctagcttga caactttacc aacgatttca tgaccaacga ctagcggcat 900

cttcatattg ccccaatgac cagctgcaca atgaatatca ctaccgcaga caccacatgc 960

ttcgatctta atgtcaatgt catgatcgta aaatggtttt gggtcatact ttgtcttctt 1020

tgggtttttc caatcttcgt gtgattgaat agcgatacct tcaaatttct caggataaga 1080

cat 1083

<210> 201

<211> 360

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 201

Met Ser Tyr Pro Glu Lys Phe Glu Gly Ile Ala Ile Gln Ser His Glu 1 5 10 15

Asp Trp Lys Asn Pro Lys Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Pro Phe Tyr 20 25 30

Asp His Asp Ile Asp Ile Lys Ile Glu Ala Cys Gly Val Cys Gly Ser 35 40 45

Asp Ile His Cys Ala Ala Gly His Trp Gly Asn Met Lys Met Pro Leu 50 55 60

Val Val Gly His Glu Ile Val Gly Lys Val Val Lys Leu Gly Pro Lys 65 70 75 80

Ser Asn Ser Gly Leu Lys Val Gly Gln Arg Val Gly Val Gly Ala Gln 85 90 95

Val Phe Ser Cys Leu Glu Cys Asp Arg Cys Lys Asn Asp Asn Glu Pro 100 105 110

Tyr Cys Thr Lys Phe Val Thr Thr Tyr Ser Gln Pro Tyr Glu Asp Gly 115 120 125

Tyr Val Ser Gln Gly Gly Tyr Ala Asn Tyr Val Arg Val His Glu His 130 135 140

Phe Val Val Pro Ile Pro Glu Asn Ile Pro Ser His Leu Ala Ala Pro 145 150 155 160

Leu Leu Cys Gly Gly Leu Thr Val Tyr Ser Pro Leu Val Arg Asn Gly 165 170 175 Cys Gly Pro Gly Lys Lys Val Gly Ile Val Gly Leu Gly Gly Ile Gly 180 185 190

Ser Met Gly Thr Leu Ile Ser Lys Ala Met Gly Ala Glu Thr Tyr Val 195 200 205

Ile Ser Arg Ser Ser Arg Lys Arg Glu Asp Ala Met Lys Met Gly Ala 210 215 220

Asp His Tyr Ile Ala Thr Leu Glu Glu Gly Asp Trp Gly Glu Lys Tyr 225 230 235 240

Phe Asp Thr Phe Asp Leu Ile Val Val Cys Ala Ser Ser Leu Thr Asp 245 250 255

Ile Asp Phe Asn Ile Met Pro Lys Ala Met Lys Val Gly Gly Arg Ile 260 265 270

Val Ser Ile Ser Ile Pro Glu Gln His Glu Met Leu Ser Leu Lys Pro 275 280 285

Tyr Gly Leu Lys Ala Val Ser Ile Ser Tyr Ser Ala Leu Gly Ser Ile 290 295 300

Lys Glu Leu Asn Gln Leu Leu Lys Leu Val Ser Glu Lys Asp Ile Lys 305 310 315 320

Ile Trp Val Glu Thr Leu Pro Val Gly Glu Ala Gly Val His Glu Ala 325 330 335

Phe Glu Arg Met Glu Lys Gly Asp Val Arg Tyr Arg Phe Thr Leu Val 340 345 350

Gly Tyr Asp Lys Glu Phe Ser Asp 355 360

<210> 202

<211> 1170

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 202

ttaataagat tttttaaata tctcaagaac atcctctgca tttattggtc ttaaacttcc 60

tattgttcct ccagaatttc taacagcttg ctttgccatt agttctagtt tatcttttcc 120

tattccaact tctctaagct ttgaaggaat acccaatgaa ttaaagtatt ctctcgtatt 180

tttaatagcc tctcgtgcta tttcatagtt atctttgttc ttgtctattc c.ccaaacatt 240

tattccataa gaaacaaatt tatgaagtgt atcgtcattt agaatatatt ccatccaatt 300

aggtgttaaa attgcaagtc ctacaccatg tgttatatca taatatgcac ttaactcgtg 360

ttccatagga tgacaactcc attttctatc cttaccaagt gataatagac catttatagc 420

taaacttgaa gcccacatca aattagctct agcctcgtaa tcatcagtct tctccattgc 480

tatttttcca tactttatac atgttcttaa gattgcttct gctataccgt cctgcacata 540 agcaccttca acaccactaa agtaagattc aaaggtgtga ctcataatgt cagctgttcc 600 cgctgctgtt tgatttttag gtactgtaaa agtatatgta ggatctaaca ctgaaaattt 660 aggtctcata tcatcatgtc ctactccaag cttttcatta gtctccatat ttgaaattac 720 tgcaatttga tccatttcag accctgttgc tgaaagagta agtatacttg caattggaag 780 aactttagtt attttagatg gatctttaac catgtcccat gtatcgccat cataataaac 840 tccagctgca attaccttag aacagtctat tgcacttcct ccccctattg ctaatactaa 900 atccacatta ttttctctac atatttctat gccttttttt actgttgtta tcctaggatt 960 tggctctact cctgaaagtt catagaaagc tatattgttt tcttttaata tagctgttgc 1020 tctatcatat ataccgttcc tttttatact tcctccgcca taaactataa gcactcttga 1080 gccatatttc ttaatttctt ctccaattac gtctattttt ccttttccaa aaaaaacttt 1140 agttggtatt gaataatcaa aacttagcat 1170

<210> 203 <211> 389 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum <4 00> 203

Met Leu Ser Phe Asp Tyr Ser Ile Pro Thr Lys Val Phe Phe Gly Lys 15 10 15

Gly Lys Ile Asp Val Ile Gly Glu Glu Ile Lys Lys Tyr Gly Ser Arg 20 25 30

Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr 35 40 45

Asp Arg Ala Thr Ala Ile Leu Lys Glu Asn Asn Ile Ala Phe Tyr Glu 50 55 60

Leu Ser Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Ile Thr Thr Val Lys Lys Gly 65 ' 70 75 80

Ile Glu Ile Cys Arg Glu Asn Asn Val Asp Leu Val Leu Ala Ile Gly 85 90 95

Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ser Lys Val Ile Ala Ala Gly Val Tyr 100 105 110

Tyr Asp Gly Asp Thr Trp Asp Met Val Lys Asp Pro Ser Lys Ile Thr 115 120 125

Lys Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Leu Ser Ala Thr Gly Ser 130 135 140

Glu Met Asp Gln Ile Ala Val Ile Ser Asn Met Glu Thr Asn Glu Lys 145 150 155 160 Leu Gly Val Gly His Asp Asp Met Arg Pro Lys Phe Ser Val Leu Asp 165 170 175

Pro Thr Tyr Thr Phe Thr Val Pro Lys Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr 180 185 190

Ala Asp Ile Met Ser His Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Ser Gly Val Glu 195 200 205

Gly Ala Tyr Val Gln Asp Gly Ile Ala Glu Ala Ile Leu Arg Thr Cys 210 215 220

Ile Lys Tyr Gly Lys Ile Ala Met Glu Lys Thr Asp Asp Tyr Glu Ala 225 230 235 240

Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu 245 250 255

Ser Leu Gly Lys Asp Arg Lys Trp Ser Cys His Pro Met Glu His Glu 260 265 270

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu 275 280 285

Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asp Asp Thr Leu His Lys 290 295 300

Phe Val Ser Tyr Gly Ile Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Asn Lys Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Glu Ile Ala Arg Glu Ala Ile Lys Asn Thr Arg Glu Tyr Phe 325 330 335

Asn Ser Leu Gly Ile Pro Ser Lys Leu Arg Glu Val Gly Ile Gly Lys 340 345 350

Asp Lys Leu Glu Leu Met Ala Lys Gln Ala Val Arg Asn Ser Gly Gly 355 360 365

Thr Ile Gly Ser Leu Arg Pro Ile Asn Ala Glu Asp Val Leu Glu Ile 370 375 380

Phe Lys Lys Ser Tyr 385

<210> 204 <211> 390 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum <4 00> 204

Met Val Asp Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Thr Arg Ile Phe Phe Gly Lys 15 10 15

Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Arg Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Lys 20 25 30

Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr 35 40 45 Asp Lys Ala Val Ser Ile Leu Glu Lys Asn Ser Ile Lys Phe Tyr Glu 50 55 60

Leu Ala Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Val Thr Thr Val Glu Lys Gly 65 70 75 80

Val Lys Ile Cys Arg Glu Asn Gly Val Glu Val Val Leu Ala Ile Gly 85 90 95

Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ala Lys Val Ile Ala Ala Ala Cys Glu 100 105 110

Tyr Asp Gly Asn Pro Trp Asp Ile Val Leu Asp Gly Ser Lys Ile Lys 115 120 125

Arg Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Ile Ala Ala Thr Gly Ser 130 135 140

Glu Met Asp Thr Trp Ala Val Ile Asn Asn Met Asp Thr Asn Glu Lys 145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala His Pro Asp Met Ala Pro Lys Phe Ser Ile Leu Asp 165 170 175

Pro Thr Tyr Thr Tyr Thr Val Pro Thr Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr 180 185 190

Ala Asp Ile Met Ser His Ile Phe Glu Val Tyr Phe Ser Asn Thr Lys 195 200 205

Thr Ala Tyr Leu Gln Asp Arg Met Ala Glu Ala Leu Leu Arg Thr Cys 210 215 220

Ile Lys Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Glu Lys Pro Asp Asp Tyr Glu Ala 225 230 235 240

Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu 245 250 255

Thr Tyr Gly Lys Asp Thr Asn Trp Ser Val His Leu Met Glu His Glu 260 265 270

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu 275 280 285

Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asn Asp Thr Val Tyr Lys 290 295 300

Phe Val Glu Tyr Gly Val Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Glu Lys Asn 305 310 315 320

His Tyr Asp Ile Ala His Gln Ala Ile Gln Lys Thr Arg Asp Tyr Phe 325 330 335

Val Asn Val Leu Gly Leu Pro Ser Arg Leu Arg Asp Val Gly Ile Glu 340 345 350

Glu Glu Lys Leu Asp Ile Met Ala Lys Glu Ser Val Lys Leu Thr Gly 355 360 365 Gly Thr Ile Gly Asn Leu Arg Pro Val Asn Ala Ser Glu Val Leu Gln 370 375 380

Ile Phe Lys Lys Ser Val 385 390

<210> 205

<211> 993

<212> DNA

<213> Bacillus subtilís

<4 00> 205

atgagtacaa accgacatca agcactaggg ctgactgatc aggaagccgt tgatatgtat 60 agaaccatgc tgttagcaag aaaaatcgat gaaagaatgt ggctgttaaa ccgttctggc 120 aaaattccat ttgtaatctc ttgtcaagga caggaagcag cacaggtagg agcggctttc 180 gcacttgacc gtgaaatgga ttatgtattg ccgtactaca gagacatggg tgtcgtgctc 240 gcgtttggca tgacagcaaa ggacttaatg atgtccgggt ttgcaaaagc agcagatccg 300 aactcaggag gccgccagat gccgggacat ttcggacaaa agaaaaaccg cattgtgacg 360 ggatcatctc cggttacaac gcaagtgccg cacgcagtcg gtattgcgct tgcgggacgt 420 atggagaaaa aggatatcgc agcctttgtt acattcgggg aagggtcttc aaaccaaggc 480 gatttccatg aaggggcaaa ctttgccgct gtccataagc tgccggttat tttcatgtgt 540 gaaaacaaca aatacgcaat ctcagtgcct tacgataagc aagtcgcatg tgagaacatt 600 tccgaccgtg ccataggcta tgggatgcct ggcgtaactg tgaatggaaa tgatccgctg 660 gaagtttatc aagcggttaa agaagcacgc gaaagggcac gcagaggaga aggcccgaca 720 ttaattgaaa cgatttctta ccgccttaca ccacattcca gtgatgacga tgacagcagc 780 tacagaggcc gtgaagaagt agaggaagcg aaaaaaagtg atcccctgct tacttatcaa 840 gcttacttaa aggaaacagg cctgctgtcc ■gatgagatag aacaaaccat gctggatgaa 900 attatggcaa tcgtaaatga agcgacggat gaagcggaga acgccccata tgcagctcct 960 gagtcagcgc ttgattatgt ttatgcgaag tag 993

<210> 206 <211> 330 <212> PRT

<213> Bacillus subtilís <4 00> 206

Met Ser Thr Asn Arg His Gln Ala Leu Gly Leu Thr Asp Gln Glu Ala 15 10 15

Val Asp Met Tyr Arg Thr Met Leu Leu Ala Arg Lys Ile Asp Glu Arg 20 25 30 Met Trp Leu Leu Asn Arg Ser Gly Lys Ile Pro Phe Val Ile Ser Cys 35 40 45

Gln Gly Gln Glu Ala Ala Gln Val Gly Ala Ala Phe Ala Leu Asp Arg 50 55 60

Glu Met Asp Tyr Val Leu Pro Tyr Tyr Arg Asp Met Gly Val Val Leu 65 70 75 80

Ala Phe Gly Met Thr Ala Lys Asp 85

Ala Ala Asp Pro Asn Ser Gly Gly 100

Gln Lys Lys Asn Arg Ile Val Thr 115 120

Leu Met Met Ser Gly Phe Ala Lys 90 95

Arg Gln Met Pro Gly His Phe Gly 105 110

Gly Ser Ser Pro Val Thr Thr Gln 125

Val Pro His Ala Val Gly Ile Ala Leu Ala Gly Arg Met Glu Lys Lys 130 135 140

Asp Ile Ala Ala Phe Val Thr Phe Gly Glu Gly Ser Ser Asn Gln Gly 145 150 155 160

Asp Phe His Glu Gly Ala Asn Phe Ala Ala Val His Lys Leu Pro Val 165 170 175

Ile Phe Met Cys 180

Lys Gln Val Ala 195

Met Pro Gly Val 210

Ala Val Lys Glu 225

Leu Ile Glu Thr

Asp Asp Ser Ser 260

Ser Asp Pro Leu 275

Leu Ser Asp Glu 290

Val Asn Glu Ala 305

Glu Asn Asn Lys

Cys Glu Asn Ile 200

Thr Val Asn Gly 215

Ala Arg Glu Arg 230

Ile Ser Tyr Arg 245

Tyr Arg Gly Arg

Leu Thr Tyr Gln 280

Ile Glu Gln Thr 295

Thr Asp Glu Ala 310

Tyr Ala Ile Ser 185

Ser Asp Arg Ala

Asn Asp Pro Leu 220

Ala Arg Arg Gly 235

Leu Thr Pro His 250

Glu Glu Val Glu 265

Ala Tyr Leu Lys

Met Leu Asp Glu 300

Glu Asn Ala Pro 315

Val Pro Tyr Asp 190

Ile Gly Tyr Gly 205

Glu Val Tyr Gln

Glu Gly Pro Thr 240

Ser Ser Asp Asp 255

Glu Ala Lys Lys 270

Glu Thr Gly Leu 285

Ile Met Ala Ile

Tyr Ala Ala Pro 320

Glu Ser Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ala Lys 325 330

<210> 207 <211> 984 <212> DNA

<213> Bacillus subtilis <400> 207

atgtcagtaa tgtcatatat tgatgcaatc aatttggcga tgaaagaaga aatggaacga 60 gattctcgcg ttttcgtcct tggggaagat gtaggaagaa aaggcggtgt gtttaaagcg 120 acagcgggac tctatgaaca atttggggaa gagcgcgtta tggatacgcc gcttgctgaa 180 tctgcaatcg caggagtcgg tatcggagcg gcaatgtacg gaatgagacc gattgctgaa 240 atgcagtttg ctgatttcat tatgccggca gtcaaccaaa ttatttctga agcggctaaa 300 atccgctacc gcagcaacaa tgactggagc tgtccgattg tcgtcagagc gccatacggc 360 ggaggcgtgc acggagccct gtatcattct caatcagtcg aagcaatttt cgccaaccag 420 cccggactga aaattgtcat gccatcaaca ccatatgacg cgaaagggct cttaaaagcc 480 gcagttcgtg acgaagaccc cgtgctgttt tttgagcaca agcgggcata ccgtctgata 540 aagggcgagg ttccggctga tgattatgtc ctgccaatcg gcaaggcgga cgtaaaaagg 600 gaaggcgacg acatcacagt gatcacatac ggcctgtgtg tccacttcgc cttacaagct 660 gcagaacgtc tcgaaaaaga tggcatttca gcgcatgtgg tggatttaag aacagtttac 720 ccgcttgata aagaagccat catcgaagct gcgtccaaaa ctggaaaggt tcttttggtc 780 acagaagata caaaagaagg cagcatcatg agcgaagtag ccgcaattat atccgagcat 840 tgtctgttcg acttagacgc gccgatcaaa cggcttgcag gtcctgatat tccggctatg 900 ccttatgcgc cgacaatgga aaaatacttt atggtcaacc ctgataaagt ggaagcggcg 960

atgagagaat tagcggagtt ttaa 984

<210> 208 <211> 327 <212> PRT

<213> Bacillus subtilis <4 00> 208

Met Ser Val Met Ser Tyr Ile Asp Ala Ile Asn Leu Ala Met Lys Glu 15 10 15

Glu Met Glu Arg Asp Ser Arg Val Phe Val Leu Gly Glu Asp Val Gly 20 25 30

Arg Lys Gly Gly Val Phe Lys Ala Thr Ala Gly Leu Tyr Glu Gln Phe 35 40 45

Gly Glu Glu Arg Val Met Asp Thr Pro Leu Ala Glu Ser Ala Ile Ala 50 55 60

Gly Val Gly Ile Gly Ala Ala Met Tyr Gly Met Arg Pro Ile Ala Glu 65 70 75 80 Met Gln Phe Ala Asp Phe Ile Met Pro Ala Val Asn Gln Ile Ile Ser 85 90 95

Glu Ala Ala Lys Ile Arg Tyr Arg Ser Asn Asn Asp Trp Ser Cys Pro 100 105 110

Ile Val Val Arg Ala Pro Tyr Gly Gly Gly Val His Gly Ala Leu Tyr 115 120 125

His Ser Gln Ser Val Glu Ala Ile Phe Ala Asn Gln Pro Gly Leu Lys 130 135 140

Ile Val Met Pro Ser Thr Pro Tyr Asp Ala Lys Gly Leu Leu Lys Ala 145 150 155 160

Ala Val Arg Asp Glu Asp Pro Val Leu Phe Phe Glu His Lys Arg Ala 165 170 175

Tyr Arg Leu Ile Lys Gly Glu Val Pro Ala Asp Asp Tyr Val Leu Pro 180 185 190

Ile Gly Lys Ala Asp Val Lys Arg Glu Gly Asp Asp Ile Thr Val Ile 195 200 205

Thr Tyr Gly Leu Cys Val His Phe Ala Leu Gln Ala Ala Glu Arg Leu 210 215 220

Glu Lys Asp Gly Ile Ser Ala His Val Val Asp Leu Arg Thr Val Tyr 225 230 235 240

Pro Leu Asp Lys Glu Ala Ile Ile Glu Ala Ala Ser Lys Thr Gly Lys 245 250 255

Val Leu Leu Val Thr Glu Asp Thr Lys Glu Gly Ser Ile Met Ser Glu 260 265 270

Val Ala Ala Ile Ile Ser Glu His Cys Leu Phe Asp Leu Asp Ala Pro 275 280 285

Ile Lys Arg Leu Ala Gly Pro Asp Ile Pro Ala Met Pro Tyr Ala Pro 290 295 300

Thr Met Glu Lys Tyr Phe Met Val Asn Pro Asp Lys Val Glu Ala Ala 305 310 315 320

Met Arg Glu Leu Ala Glu Phe 325

<210> 209 <211> 1275 <212> DNA

<213> Bacillus subtilis <400> 209

atggcaattg aacaaatgac gatgccgcag cttggagaaa gcgtaacaga ggggacgatc 60 agcaaatggc ttgtcgcccc cggtgataaa gtgaacaaat acgatccgat cgcggaagtc 120

atgacagata aggtaaatgc agaggttccg tcttctttta ctggtacgat aacagagctt 180 gtgggagaag aaggccaaac cctgcaagtc ggagaaatga tttgcaaaat tgaaacagaa 240

ggcgcgaatc cggctgaaca aaaacaagaa cagccagcag catcagaagc cgctgagaac 300

cctgttgcaa aaagtgctgg agcagccgat cagcccaata aaaagcgcta ctcgccagct 360

gttctccgtt tggccggaga gcacggcatt gacctcgatc aagtgacagg aactggtgcc 420

ggcgggcgca tcacacgaaa agatattcag cgcttaattg aaacaggcgg cgtgcaagaa 480

cagaatcctg aggagctgaa aacagcagct cctgcaccga agtctgcatc aaaacctgag 540

ccaaaagaag agacgtcata tcctgcgtct gcagccggtg ataaagaaat ccctgtcaca 600

ggtgtaagaa aagcaattgc ttccaatatg aagcgaagca aaacagaaat tccgcatgct 660

tggacgatga tggaagtcga cgtcacaaat atggttgcat atcgcaacag tataaaagat 720

tcttttaaga agacagaagg ctttaattta acgttcttcg ccttttttgt aaaagcggtc 780

gctcaggcgt taaaagaatt cccgcaaatg aatagcatgt gggcggggga caaaattatt 840

cagaaaaagg atatcaatat ttcaattgca gttgccacag aggattcttt atttgttccg 900

gtgattaaaa acgctgatga aaaaacaatt aaaggcattg cgaaagacat taccggccta 960

gctaaaaaag taagagacgg aaaactcact gcagatgaca tgcagggagg cacgtttacc 1020

gtcaacaaca caggttcgtt cgggtctgtt cagtcgatgg gcattatcaa ctaccctcag 1080

gctgcgattc ttcaagtaga atccatcgtc aaacgcccgg ttgtcatgga caatggcatg 1140

attgctgtca gagacatggt taatctgtgc ctgtcattag atcacagagt gcttgacggt 1200

ctcgtgtgcg gacgattcct cggacgagtg aaacaaattt tagaatcgat tgacgagaag 1260

acatctgttt actaa 1275

<210> 210

<211> 424

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 210

Met Ala Ile Glu Gln Met Thr Met 1 5

Glu Gly Thr Ile Ser Lys Trp Leu 20

Lys Tyr Asp Pro Ile Ala Glu Val 35 40

Val Pro Ser Ser Phe Thr Gly Thr 50 55

Gly Gln Thr Leu Gln Val Gly Glu 65 70

Pro Gln Leu Gly Glu Ser Val Thr 10 15

Val Ala Pro Gly Asp Lys Val Asn 25 30

Met Thr Asp Lys Val Asn Ala Glu 45

Ile Thr Glu Leu Val Gly Glu Glu 60

Met Ile Cys Lys Ile Glu Thr Glu 75 80 Gly Ala Asn Pro

Ala Ala Glu Asn 100

Asn Lys Lys Arg 115

Gly Ile Asp Leu 130

Thr Arg Lys Asp 145

Gln Asn Pro Glu

Ser Lys Pro Glu 180

Gly Asp Lys Glu 195

Asn Met Lys Arg 210

Glu Val Asp Val 225

Ser Phe Lys Lys

Val Lys Ala Val 260

Met Trp Ala Gly 275

Ile Ala Val Ala 290

Ala Asp Glu Lys 305

Ala Lys Lys Val

Gly Thr Phe Thr 340

Met Gly Ile Ile 355

Ile Val Lys Arg 370

Asp Met Val Asn 385

Ala Glu Gln Lys 85

Pro Val Ala Lys

Tyr Ser Pro Ala 120

Asp Gln Val Thr 135

Ile Gln Arg Leu 150

Glu Leu Lys Thr 165

Pro Lys Glu Glu

Ile Pro Val Thr 200

Ser Lys Thr Glu 215

Thr Asn Met Val 230

Thr Glu Gly Phe 245

Ala Gln Ala Leu

Asp Lys Ile Ile 280

Thr Glu Asp Ser 295

Thr Ile Lys Gly 310

Arg Asp Gly Lys 325

Val Asn Asn Thr

Asn Tyr Pro Gln 360

Pro Val Val Met 375

Leu Cys Leu Ser 390

Gln Glu Gln Pro 90

Ser Ala Gly Ala 105

Val Leu Arg Leu

Gly Thr Gly Ala 140

Ile Glu Thr Gly 155

Ala Ala Pro Ala 170

Thr Ser Tyr Pro 185

Gly Val Arg Lys

Ile Pro His Ala 220

Ala Tyr Arg Asn 235

Asn Leu Thr Phe 250

Lys Glu Phe Pro 265

Gln Lys Lys Asp

Leu Phe Val Pro 300

Ile Ala Lys Asp 315

Leu Thr Ala Asp 330

Gly Ser Phe Gly 345

Ala Ala Ile Leu

Asp Asn Gly Met 380

Leu Asp His Arg 395

Ala Ala Ser Glu 95

Ala Asp Gln Pro 110

Ala Gly Glu His 125

Gly Gly Arg Ile

Gly Val Gln Glu 160

Pro Lys Ser Ala 175

Ala Ser Ala Ala 190

Ala Ile Ala Ser 205

Trp Thr Met Met

Ser Ile Lys Asp 240

Phe Ala Phe Phe 255

Gln Met Asn Ser 270

Ile Asn Ile Ser 285

Val Ile Lys Asn

Ile Thr Gly Leu 320

Asp Met Gln Gly 335

Ser Val Gln Ser 350

Gln Val Glu Ser 365

Ile Ala Val Arg

Val Leu Asp Gly 400 Leu Val Cys Gly Arg Phe Leu Gly Arg Val Lys Gln Ile Leu Glu Ser 405 410 415

Ile Asp Glu Lys Thr Ser Val Tyr 420

<210> 211 <211> 1374 <212> DNA

<213> Bacillus subtilis <400> 211

atggcaactg agtatgacgt agtcattctg ggcggcggta ccggcggtta tgttgcggcc 60 atcagagccg ctcagctcgg cttaaaaaca gccgttgtgg aaaaggaaaa actcggggga 120 acatgtctgc ataaaggctg tatcccgagt aaagcgctgc ttagaagcgc agaggtatac 180 cggacagctc gtgaagccga tcaattcgga gtggaaacgg ctggcgtgtc cctcaacttt 240 gaaaaagtgc agcagcgtaa gcaagccgtt gttgataagc ttgcagcggg tgtaaatcat 300 ttaatgaaaa aaggaaaaat tgacgtgtac accggatatg gacgtatcct tggaccgtca 360 atcttctctc cgctgccggg aacaatttct gttgagcggg gaaatggcga agaaaatgac 420 atgctgatcc cgaaacaagt gatcattgca acaggatcaa gaccgagaat gcttccgggt 480 cttgaagtgg acggtaagtc tgtactgact tcagatgagg cgctccaaat ggaggagctg 540 ccacagtcaa tcatcattgt cggcggaggg gttatcggta tcgaatgggc gtctatgctt 600 catgattttg gcgttaaggt aacggttatt gaatacgcgg atcgcatatt gccgactgaa 660 gatctagaga tttcaaaaga aatggaaagt cttcttaaga aaaaaggcat ccagttcata 720 acaggggcaa aagtgctgcc tgacacaatg acaaaaacat cagacgatat cagcatacaa 780 gcggaaaaag acggagaaac cgttacctat tctgctgaga aaatgcttgt ttccatcggc 840 agacaggcaa atatcgaagg catcggccta gagaacaccg atattgttac tgaaaatggc 900 atgatttcag tcaatgaaag ctgccaaacg aaggaatctc atatttatgc aatcggagac 960 gtaatcggtg gcctgcagtt agctcacgtt gcttcacatg agggaattat tgctgttgag 1020 cattttgcag gtctcaatcc gcatccgctt gatccgacgc ttgtgccgaa gtgcatttac 1080 tcaagccctg aagctgccag tgtcggctta accgaagacg aagcaaaggc gaacgggcat 1140 aatgtcaaaa tcggcaagtt cccatttatg gcgattggaa aagcgcttgt atacggtgaa 1200 agcgacggtt ttgtcaaaat cgtggctgac cgagatacag atgatattct cggcgttcat 1260 atgattggcc cgcatgtcac cgacatgatt tctgaagcgg gtcttgccaa agtgctggac 1320 gcaacaccgt gggaggtcgg gcaaacgatt tcacccgcat ccaacgcttt ctga 1374 <210> 212 <211> 457 <212> PRT

<213> Bacillus subtilis <400> 212

Met Ala Thr Glu Tyr Asp Val Val Ile Leu Gly Gly Gly Thr Gly Gly 15 10 15

Tyr Val Ala Ala Ile Arg Ala Ala Gln Leu Gly Leu Lys Thr Ala Val 20 25 30

Val Glu Lys Glu Lys Leu Gly Gly Thr Cys Leu His Lys Gly Cys Ile 35 40 45

Pro Ser Lys Ala Leu Leu Arg Ser Ala Glu Val Tyr Arg Thr Ala Arg 50 55 60

Glu Ala Asp Gln Phe Gly Val Glu Thr Ala Gly Val Ser Leu Asn Phe 65 70 75 80

Glu Lys Val Gln Gln Arg Lys Gln Ala Val Val Asp Lys Leu Ala Ala 85 90 95

Gly Val Asn His Leu Met Lys Lys Gly Lys Ile Asp Val Tyr Thr Gly 100 105 110

Tyr Gly Arg Ile Leu Gly Pro Ser Ile Phe Ser Pro Leu Pro Gly Thr 115 120 125

Ile Ser Val Glu Arg Gly Asn Gly Glu Glu Asn Asp Met Leu Ile Pro 130 135 140

Lys Gln Val Ile Ile Ala Thr Gly Ser Arg Pro Arg Met Leu Pro Gly 145 150 155 160

Leu Glu Val Asp Gly Lys Ser Val Leu Thr Ser Asp Glu Ala Leu Gln 165 170 175

Met Glu Glu Leu Pro Gln Ser Ile Ile Ile Val Gly Gly Gly Val Ile 180 185 190

Gly Ile Glu Trp Ala Ser Met Leu His Asp Phe Gly Val Lys Val Thr 195 200 205

Val Ile Glu Tyr Ala Asp Arg Ile Leu Pro Thr Glu Asp Leu Glu Ile 210 215 220

Ser Lys Glu Met Glu Ser Leu Leu Lys Lys Lys Gly Ile Gln Phe Ile 225 230 235 240

Thr Gly Ala Lys Val Leu Pro Asp Thr Met Thr Lys Thr Ser Asp Asp 245 250 255

Ile Ser Ile Gln Ala Glu Lys Asp Gly Glu Thr Val Thr Tyr Ser Ala 260 265 270

Glu Lys Met Leu Val Ser Ile Gly Arg Gln Ala Asn Ile Glu Gly Ile 275 280 285 Gly Leu Glu Asn Thr Asp Ile Val Thr Glu Asn Gly Met Ile Ser Val 290 295 300

Asn Glu Ser Cys Gln Thr Lys Glu Ser His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp 305 310 315 320

Val Ile Gly Gly Leu Gln Leu Ala His Val Ala Ser His Glu Gly Ile 325 330 335

Ile Ala Val Glu His Phe Ala Gly Leu Asn Pro His Pro Leu Asp Pro 340 345 350

Thr Leu Val Pro Lys Cys Ile Tyr Ser Ser Pro Glu Ala Ala Ser Val 355 360 365

Gly Leu Thr Glu Asp Glu Ala Lys Ala Asn Gly His Asn Val Lys Ile 370 375 380

Gly Lys Phe Pro Phe Met Ala Ile Gly Lys Ala Leu Val Tyr Gly Glu 385 390 395 400

Ser Asp Gly Phe Val Lys Ile Val Ala Asp Arg Asp Thr Asp Asp Ile 405 410 415

Leu Gly Val His Met Ile Gly Pro His Val Thr Asp Met Ile Ser Glu 420 425 430

Ala Gly Leu Ala Lys Val Leu Asp Ala Thr Pro Trp Glu Val Gly Gln 435 440 445

Thr Ile Ser Pro Ala Ser Asn Ala Phe 450 455

<210> 213 <211> 1233 <212> DNA

<213> Pseudomonas putida <4 00> 213

atgaacgagt acgcccccct gcgtttgcat gtgcccgagc ccaccggccg gccaggctgc 60

cagaccgatt tttcctacct gcgcctgaac gatgcaggtc aagcccgtaa accccctgtc 120

gatgtcgacg ctgccgacac cgccgacctg tcctacagcc tggtccgcgt gctcgacgag 180

caaggcgacg cccaaggccc gtgggctgaa gacatcgacc cgcagatcct gcgccaaggc 240

atgcgcgcca tgctcaagac gcggatcttc gacagccgca tggtggttgc ccagcgccag 300

aagaagatgt ccttctacat gcagagcctg ggcgaagaag ccatcggcag cggccaggcg 360

ctggcgctta accgcaccga catgtgcttc cccacctacc gtcagcaaag catcctgatg 420

gcccgcgacg tgtcgctggt ggagatgatc tgccagttgc tgtccaacga acgcgacccc 480

ctcaagggcc gccagctgcc gatcatgtac tcggtacgcg aggccggctt cttcaccatc 540

agcggcaacc tggcgaccca gttcgtgcag gcggtcggct gggccatggc ctcggcgatc 600 aagggcgata ccaagattgc ctcggcctgg atcggcgacg gcgccactgc cgaatcggac 660

ttccacaccg ccctcacctt tgcccacgtt taccgcgccc cggtgatcct caacgtggtc 720

aacaaccagt gggccatctc aaccttccag gccatcgccg gtggcgagtc gaccaccttc 780

gccggccgtg gcgtgggctg cggcatcgct tcgctgcggg tggacggcaa cgacttcgtc 840

gccgtttacg ccgcttcgcg ctgggctgcc gaacgtgccc gccgtggttt gggcccgagc 900

ctgatcgagt gggtcaccta ccgtgccggc ccgcactcga cctcggacga cccgtccaag 960

taccgccctg ccgatgactg gagccacttc ccgctgggtg acccgatcgc ccgcctgaag 1020

cagcacctga tcaagatcgg ccactggtcc gaagaagaac accaggccac cacggccgag 1080

ttcgaagcgg ccgtgattgc tgcgcaaaaa gaagccgagc agtacggcac cctggccaac 1140

ggtcacatcc cgagcgccgc ctcgatgttc gaggacgtgt acaaggagat gcccgaccac 1200

ctgcgccgcc aacgccagga actgggggtt tga 1233

<210> 214 <211> 410 <212> PRT

<213> Pseudomonas putida <400> 214

Met Asn Glu Tyr Ala Pro Leu Arg Leu His Val Pro Glu Pro Thr Gly 1 5 10 15

Arg Pro Gly Cys Gln Thr Asp Phe Ser Tyr Leu Arg Leu Asn Asp Ala 20 25 30

Gly Gln Ala Arg Lys Pro Pro Val Asp Val Asp Ala Ala Asp Thr Ala 35 40 45

Asp Leu Ser Tyr Ser Leu Val Arg Val Leu Asp Glu Gln Gly Asp Ala 50 55 60

Gln Gly Pro Trp Ala Glu Asp Ile Asp Pro Gln Ile Leu Arg Gln Gly 65 70 75 80

Met Arg Ala Met Leu Lys Thr Arg Ile Phe Asp Ser Arg Met Val Val 85 90 95

Ala Gln Arg Gln Lys Lys Met Ser Phe Tyr Met Gln Ser Leu Gly Glu 100 105 110

Glu Ala Ile Gly Ser Gly Gln Ala Leu Ala Leu Asn Arg Thr Asp Met 115 120 125

Cys Phe Pro Thr Tyr Arg Gln Gln Ser Ile Leu Met Ala Arg Asp Val 130 135 140

Ser Leu Val Glu Met Ile Cys Gln Leu Leu 145 150

Ser Asn Glu Arg Asp Pro 155 160 Leu Lys Gly Arg Gln Leu Pro Ile Met Tyr Ser Val Arg Glu Ala Gly 165 170 175

Phe Phe Thr Ile Ser Gly Asn Leu Ala Thr Gln Phe Val Gln Ala Val 180 185 190

Gly Trp Ala Met Ala Ser Ala Ile Lys Gly Asp Thr Lys Ile Ala Ser 195 200 205

Ala Trp Ile Gly Asp Gly Ala Thr Ala Glu Ser Asp Phe His Thr Ala 210 215 220

Leu Thr Phe Ala His Val Tyr Arg Ala Pro Val Ile Leu Asn Val Val 225 230 235 240

Asn Asn Gln Trp Ala Ile Ser Thr Phe Gln Ala Ile Ala Gly Gly Glu 245 250 255

Ser Thr Thr Phe Ala Gly Arg Gly Val Gly Cys Gly Ile Ala Ser Leu 260 265 270

Arg Val Asp Gly Asn Asp Phe Val Ala Val Tyr Ala Ala Ser Arg Trp 275 280 285

Ala Ala Glu Arg Ala Arg Arg Gly Leu Gly Pro Ser Leu Ile Glu Trp 290 295 300

Val Thr Tyr Arg Ala Gly Pro His Ser Thr Ser Asp Asp Pro Ser Lys 305 310 315 320

Tyr Arg Pro Ala Asp Asp Trp Ser His Phe Pro Leu Gly Asp Pro Ile 325 330 335

Ala Arg Leu Lys Gln His Leu Ile Lys Ile Gly His Trp Ser Glu Glu 340 345 350

Glu His Gln Ala Thr Thr Ala Glu Phe Glu Ala Ala Val Ile Ala Ala 355 360 365

Gln Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Gly Thr Leu Ala Asn Gly His Ile Pro 370 375 380

Ser Ala Ala Ser Met Phe Glu Asp Val Tyr Lys Glu Met Pro Asp His 385 390 395 400

Leu Arg Arg Gln Arg Gln Glu Leu Gly Val 405 410

<210> 215 <211> 1059 <212> DNA

<213> Pseudomonas putida <400> 215

atgaacgacc acaacaacag catcaacccg gaaaccgcca tggccaccac taccatgacc 60 atgatccagg ccctgcgctc ggccatggat gtcatgcttg agcgcgacga caatgtggtg 120

gtgtacggcc aggacgtcgg ctacttcggc ggcgtgttcc gctgcaccga aggcctgcag 180 accaagtacg gcaagtcccg cgtgttcgac gcgcccatct ctgaaagcgg catcgtcggc 240

accgccgtgg gcatgggtgc ctacggcctg cgcccggtgg tggaaatcca gttcgctgac 300

tacttctacc cggcctccga ccagatcgtt tctgaaatgg cccgcctgcg ctaccgttcg 360

gccggcgagt tcatcgcccc gctgaccctg cgtatgccct gcggtggcgg tatctatggc 420

ggccagacac acagccagag cccggaagcg atgttcactc aggtgtgcgg cctgcgcacc 480

gtaatgccat ccaacccgta cgacgccaaa ggcctgctga ttgcctcgat cgaatgcgac 540

gacccggtga tcttcctgga gcccaagcgc ctgtacaacg gcccgttcga cggccaccat 600

gaccgcccgg ttacgccgtg gtcgaaacac ccgcacagcg ccgtgcccga tggctactac 660

accgtgccac tggacaaggc cgccatcacc cgccccggca atgacgtgag cgtgctcacc 720

tatggcacca ccgtgtacgt ggcccaggtg gccgccgaag aaagtggcgt ggatgccgaa 780

gtgatcgacc tgcgcagcct gtggccgcta gacctggaca ccatcgtcga gtcggtgaaa 840

aagaccggcc gttgcgtggt agtacacgag gccacccgta cttgtggctt tggcgcagaa 900

ctggtgtcgc tggtgcagga gcactgcttc caccacctgg aggcgccgat cgagcgcgtc 960

accggttggg acacccccta ccctcacgcg caggaatggg cttacttccc agggccttcg 1020

cgggtaggtg cggcattgaa aaaggtcatg gaggtctga 1059

<210> 216 <211> 352 <212> PRT

<213> Pseudomonas putida <4 00> 216

Met Asn Asp His Asn Asn Ser Ile Asn Pro Glu Thr Ala Met Ala Thr 15 10 15

Thr Thr Met Thr Met Ile Gln Ala Leu Arg Ser Ala Met Asp Val Met 20 25 30

Leu Glu Arg Asp Asp Asn Val Val Val Tyr Gly Gln Asp Val Gly Tyr 35 40 45

Phe Gly Gly Val Phe Arg Cys Thr Glu Gly Leu Gln Thr Lys Tyr Gly 50 55 60

Lys Ser Arg Val Phe Asp Ala Pro Ile Ser Glu Ser Gly Ile Val Gly 65 70 75 80

Thr Ala Val Gly Met Gly Ala Tyr Gly Leu Arg Pro Val Val Glu Ile 85 90 95

Gln Phe Ala Asp Tyr Phe Tyr Pro Ala Ser Asp Gln Ile Val Ser Glu 100 105 110 Met Ala Arg Leu Arg 115

Thr Leu Arg Met Pro 130

Ser Gln Ser Pro Glu 145

Val Met Pro Ser Asn 165

Tyr Arg Ser Ala Gly Glu 120

Cys Gly Gly Gly Ile Tyr 135

Ala Met Phe Thr Gln Val 150 155

Pro Tyr Asp Ala Lys Gly 170

Phe Ile Ala Pro Leu 125

Gly Gly Gln Thr His 140

Cys Gly Leu Arg Thr 160

Leu Leu Ile Ala Ser 175

Ile Glu Cys Asp 180

Asn Gly Pro Phe 195

Lys His Pro His 210

Asp Lys Ala Ala 225

Tyr Gly Thr Thr

Val Asp Ala Glu 260

Asp Pro Val Ile

Asp Gly His His 200

Ser Ala Val Pro 215

Ile Thr Arg Pro 230

Val Tyr Val Ala 245

Val Ile Asp Leu

Phe Leu Glu Pro 185

Asp Arg Pro Val

Asp Gly Tyr Tyr 220

Gly Asn Asp Val 235

Gln Val Ala Ala 250

Arg Ser Leu Trp 265

Lys Arg Leu Tyr 190

Thr Pro Trp Ser 205

Thr Val Pro Leu

Ser Val Leu Thr 240

Glu Glu Ser Gly 255

Pro Leu Asp Leu 270

Asp Thr Ile Val Glu 275

His Glu Ala Thr Arg 290

Val Gln Glu His Cys 305

Thr Gly Trp Asp Thr 325

Pro Gly Pro Ser Arg 340

Ser Val Lys Lys Thr Gly 280

Thr Cys Gly Phe Gly Ala 295

Phe His His Leu Glu Ala 310 315

Pro Tyr Pro His Ala Gln 330

Val Gly Ala Ala Leu Lys 345

Arg Cys Val Val Val 285

Glu Leu Val Ser Leu 300

Pro Ile Glu Arg Val 320

Glu Trp Ala Tyr Phe 335

Lys Val Met Glu Val 350

<210> 217

<211> 1272

<212> DNA

<213> Pseudomonas putida

<400> 217

atgggcacgc acgtcatcaa gatgccggac attggcgaag gcatcgcgca ggtcgaattg 60

gtggaatggt tcgtcaaggt gggcgacatc atcgccgagg accaagtggt agccgacgtc 120

atgaccgaca aggccaccgt ggaaatcccg tcgccggtca gcggcaaggt gctggccctg 180

ggtggccagc caggtgaagt gatggcggtc ggcagtgagc tgatccgcat cgaagtggaa 240 ggcagcggca accatgtgga tgtgccgcaa

gtagccgcta aacctgaacc acagaaagac

agccacgagg cagcgcccat cgtgccgcgc

gcggtgcgca aacgcgccct cgatgccggc

ccggccgggc gcatcctgca cgaagacctc

gccgggcaaa cccccaatgg ctatgccagg

ggcctgcgcc gcaagatcgc ccagcgcatg

agctatgtgg aagaaatcga cgtcaccgcc

aagcacggcg acagccgcgg caagctgaca

gtggcactgc gtgacttccc gcagataaac

acccgccatg gcgcggtgca tgtgggcatc

cccgtgctgc gccacgccga agcgggcagc

ctggccaacg ctgcgcgcaa caacaaggcc

accctgacca gcctcggcgc cctgggcggc

gaagtggcga tcgtcggtgt caaccgcatg

atcgtcgtgc gcaagatgat gaacctgtcc

atggacgccg ccctgttcat ccaggccgtg

ttcgtggagt ga

<210> 218

<211> 423

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<4 00> 218

Met Gly Thr His Val Ile Lys Met 1 5

Gln Val Glu Leu Val Glu Trp Phe 20

Glu Asp Gln Val Val Ala Asp Val 35 40

Ile Pro Ser Pro Val Ser Gly Lys 50 55

gccaagccgg ccgaagtgcc tgcggcaccg 300 gttaaaccgg cggcgtacca ggcgtcagcc 360 cagccgggcg acaagccgct ggcctcgccg 420 atcgaattgc gttatgtgca cggcagcggc 480 gacgcgttca tgagcaaacc gcaaagcgct 540 cgcaccgaca gcgagcaggt gccggtgatc 600 caggacgcca agcgccgggt cgcgcacttc 660 ctggaagccc tgcgccagca gctcaacagc 720 ctgctgccgt tcctggtgcg cgccctggtc 780 gccacctacg atgacgaagc gcagatcatc 840 gccacccaag gtgacaacgg cctgatggta 900 ctgtgggcca atgccggtga gatttcacgc 960 agccgcgaag agctgtccgg ttcgaccatt 1020 atcgtcagca cgccggtggt caacaccccg 1080 gttgagcggc ccgtggtgat cgacggccag 1140 agctcgttcg accaccgcgt ggtcgatggc 1200 cgtggcctgc tcgaacaacc cgcctgcctg 1260

1272

Pro Asp Ile Gly Glu Gly Ile Ala 10 15

Val Lys Val Gly Asp Ile Ile Ala 25 30

Met Thr Asp Lys Ala Thr Val Glu 45

Val Leu Ala Leu Gly Gly Gln Pro 60

Gly Glu Val Met Ala Val Gly Ser Glu Leu Ile Arg Ile Glu Val Glu 65 70 75 80 Gly Ser Gly Asn His Val Asp Val Pro Gln Ala Lys Pro Ala Glu Val 85 90 95

Pro Ala Ala Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Pro Gln Lys Asp Val Lys 100 105 110

Pro Ala Ala Tyr Gln Ala Ser Ala Ser His Glu Ala Ala Pro Ile Val 115 120 125

Pro Arg Gln Pro Gly Asp Lys Pro Leu Ala Ser Pro Ala Val Arg Lys 130 135 140

Arg Ala Leu Asp Ala Gly Ile Glu Leu Arg Tyr Val His Gly Ser Gly 145 150 155 160

Pro Ala Gly Arg Ile Leu His Glu Asp Leu Asp Ala Phe Met Ser Lys 165 170 175

Pro Gln Ser Ala Ala Gly Gln Thr Pro Asn Gly Tyr Ala Arg Arg Thr 180 185 190

Asp Ser Glu Gln Val Pro Val Ile Gly Leu Arg Arg Lys Ile Ala Gln 195 200 205

Arg Met Gln Asp Ala Lys Arg Arg Val Ala His Phe Ser Tyr Val Glu 210 215 220

Glu Ile Asp Val Thr Ala Leu Glu Ala Leu Arg Gln Gln Leu Asn Ser 225 230 235 240

Lys His Gly Asp Ser Arg Gly Lys Leu Thr Leu Leu Pro Phe Leu Val 245 250 255

Arg Ala Leu Val Val Ala Leu Arg Asp Phe Pro Gln Ile Asn Ala Thr 260 265 270

Tyr Asp Asp Glu Ala Gln Ile Ile Thr Arg His Gly Ala Val His Val 275 280 285

Gly Ile Ala Thr Gln Gly Asp Asn Gly Leu Met Val Pro Val Leu Arg 290 295 300

His Ala Glu Ala Gly Ser Leu Trp Ala Asn Ala Gly Glu Ile Ser Arg 305 310 315 320

Leu Ala Asn Ala Ala Arg Asn Asn Lys Ala Ser Arg Glu Glu Leu Ser 325 330 335

Gly Ser Thr Ile Thr Leu Thr Ser Leu Gly Ala Leu Gly Gly Ile Val 340 345 350

Ser Thr Pro Val Val Asn Thr Pro Glu Val Ala Ile Val Gly Val Asn 355 360 365

Arg Met Val Glu Arg Pro Val Val Ile Asp Gly Gln Ile Val Val Arg 370 375 380

Lys Met Met Asn Leu Ser Ser Ser Phe Asp His Arg Val Val Asp Gly 385 390 395 400 Met Asp Ala Ala Leu Phe Ile Gln Ala Val Arg Gly Leu Leu Glu Gln 405 410 415

Pro Ala Cys Leu Phe Val Glu 420

<210> 219 <211> 1380 <212> DNA

<213> Pseudomonas putida <400> 219

atgcaacaga ctatccagac aaccctgttg atcatcggcg gcggccctgg cggctatgtg 60 gcggccatcc gcgccgggca actgggcatc cctaccgtgc tggtggaagg ccaggcgctg 120 ggcggtacct gcctgaacat cggctgcatt ccgtccaagg cgctgatcca tgtggccgag 180 cagttccacc aggcctcgcg ctttaccgaa ccctcgccgc tgggcatcag cgtggcttcg 240 ccacgcctgg acatcggcca gagcgtggcc tggaaagacg gcatcgtcga tcgcctgacc 300 actggtgtcg ccgccctgct gaaaaagcac ggggtgaagg tggtgcacgg ctgggccaag 360 gtgcttgatg gcaagcaggt cgaggtggat ggccagcgca tccagtgcga gcacctgttg 420 ctggccacgg gctccagcag tgtcgaactg ccgatgctgc cgttgggtgg gccggtgatt 480 tcctcgaccg aggccctggc accgaaagcc ctgccgcaac acctggtggt ggtgggcggt 540 ggctacatcg gcctggagct gggtatcgcc taccgcaagc tcggcgcgca ggtcagcgtg 600 gtggaagcgc gcgagcgcat cctgccgact tacgacagcg aactgaccgc cccggtggcc 660 gagtcgctga aaaagctggg tatcgccctg caccttggcc acagcgtcga aggttacgaa 720 aatggctgcc tgctggccaa cgatggcaag ggcggacaac tgcgcctgga agccgaccgg 780 gtgctggtgg ccgtgggccg ccgcccacgc accaagggct tcaacctgga atgcctggac 840 ctgaagatga atggtgccgc gattgccatc gacgagcgct gccagaccag catgcacaac 900 gtctgggcca tcggcgacgt ggccggcgaa ccgatgctgg cgcaccgggc catggcccag 960 ggcgagatgg tggccgagat catcgccggc aaggcacgcc gcttcgaacc cgctgcgata 1020 gccgccgtgt gcttcaccga cccggaagtg gtcgtggtcg gcaagacgcc ggaacaggcc 1080 agtcagcaag gcctggactg catcgtcgcg cagttcccgt tcgccgccaa cggccgggcc 1140 atgagcctgg agtcgaaaag cggtttcgtg cgcgtggtcg cgcggcgtga caaccacctg 1200 atcctgggct ggcaagcggt tggcgtggcg gtttccgagc tgtccacggc gtttgcccag 1260 tcgctggaga tgggtgcctg cctggaggat gtggccggta ccatccatgc ccacccgacc 1320 ctgggtgaag cggtacagga agcggcactg cgtgccctgg gccacgccct gcatatctga 1380 <210> 220 <211> 459 <212> PRT

<213> Pseudomonas putida <4 00> 220

Met Gln Gln Thr Ile Gln Thr Thr Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Pro 15 10 15

Gly Gly Tyr Val Ala Ala Ile Arg Ala Gly Gln Leu Gly Ile Pro Thr 20 25 30

Val Leu Val Glu Gly Gln Ala Leu Gly Gly Thr Cys Leu Asn Ile Gly 35 40 45

Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Ile His Val Ala Glu Gln Phe His Gln 50 55 60

Ala Ser Arg Phe Thr Glu Pro Ser Pro Leu Gly Ile Ser Val Ala Ser 65 70 75 80

Pro Arg Leu Asp Ile Gly Gln Ser Val Ala Trp Lys Asp Gly Ile Val 85 90 95

Asp Arg Leu Thr Thr Gly Val Ala Ala Leu Leu Lys Lys His Gly Val 100 105 110

Lys Val Val His Gly Trp Ala Lys Val Leu Asp Gly Lys Gln Val Glu 115 120 125

Val Asp Gly Gln Arg Ile Gln Cys Glu His Leu Leu Leu Ala Thr Gly 130 135 140

Ser Ser Ser Val Glu Leu Pro Met Leu Pro Leu Gly Gly Pro Val Ile 145 150 155 160

Ser Ser Thr Glu Ala Leu Ala Pro Lys Ala Leu Pro Gln His Leu Val 165 170 175

Val Val Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Leu Glu Leu Gly Ile Ala Tyr Arg 180 185 190

Lys Leu Gly Ala Gln Val Ser Val Val Glu Ala Arg Glu Arg Ile Leu 195 200 205

Pro Thr Tyr Asp Ser Glu Leu Thr Ala Pro Val Ala Glu Ser Leu Lys 210 215 220

Lys Leu Gly Ile Ala Leu His Leu Gly His Ser Val Glu Gly Tyr Glu 225 230 235 240

Asn Gly Cys Leu Leu Ala Asn Asp Gly Lys Gly Gly Gln Leu Arg Leu 245 250 255

Glu Ala Asp Arg Val Leu Val Ala Val Gly Arg Arg Pro Arg Thr Lys 260 265 270

Gly Phe Asn Leu Glu Cys Leu Asp Leu Lys Met Asn Gly Ala Ala Ile 275 280 285 Ala Ile Asp Glu Arg Cys Gln Thr Ser Met His Asn Val Trp Ala Ile 290 295 300

Gly Asp Val Ala Gly Glu Pro Met Leu Ala His Arg Ala Met Ala Gln 305 310 315 320

Gly Glu Met Val Ala Glu Ile Ile Ala Gly Lys Ala Arg Arg Phe Glu 325 330 335

Pro Ala Ala Ile Ala Ala Val Cys Phe Thr Asp Pro Glu Val Val Val 340 345 350

Val Gly Lys Thr Pro Glu Gln Ala Ser Gln Gln Gly Leu Asp Cys Ile 355 360 365

Val Ala Gln Phe Pro Phe Ala Ala Asn Gly Arg Ala Met Ser Leu Glu 370 375 380

Ser Lys Ser Gly Phe Val Arg Val Val Ala Arg Arg Asp Asn His Leu 385 390 395 400

Ile Leu Gly Trp Gln Ala Val Gly Val Ala Val Ser Glu Leu Ser Thr 405 410 415

Ala Phe Ala Gln Ser Leu Glu Met Gly Ala Cys Leu Glu Asp Val Ala 420 425 430

Gly Thr Ile His Ala His Pro Thr Leu Gly Glu Ala Val Gln Glu Ala 435 440 445

Ala Leu Arg Ala Leu Gly His Ala Leu His Ile 450 455

<210> 221 <211> 1407 <212> DNA

<213> Clostridium beijerinckii <400> 221

atgaataaag acacactaat acctacaact aaagatttaa aattaaaaac aaatgttgaa 60

aacattaatt taaagaacta caaggataat tcttcatgtt tcggagtatt cgaaaatgtt 120

gaaaatgcta taaacagcgc tgtacacgcg caaaagatat tatcccttca ttatacaaaa 180

gaacaaagag aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattagaaaa taaagaggtt 240

ttagctacca tgattctgga agaaacacat atgggaaggt atgaagataa aatattaaag 300

catgaattag tagctaaata tactcctggt acagaagatt taactactac tgcttggtca 360

ggtgataatg gtcttacagt tgtagaaatg tctccatatg gcgttatagg tgcaataact 420

ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagca tcggcatgat agctgctgga 480

aatgctgtag tatttaacgg acacccaggc gctaaaaaat gtgttgcttt tgctattgaa 540

atgataaata aagcaattat ttcatgtggc ggtcctgaga atttagtaac aactataaaa 600 aatccaacta tggaatccct agatgcaatt attaagcatc ctttaataaa acttctttgc 660

ggaactggag gtccaggaat ggtaaaaacc ctcttaaatt ctggcaagaa agctataggt 720

gctggtgctg gaaatccacc agttattgta gatgataccg ctgatataga aaaggctggt 780

aagagtatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840

gtatttgttt ttgagaatgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctaaa aaataatgct 900

gtaattataa atgaagatca agtatcaaaa ttaatagatt tagtattaca aaaaaataat 960

gaaactcaag aatactttat aaacaaaaaa tgggtaggaa aagatgcaaa attattctca 1020

gatgaaatag atgttgagtc tccttcaaat attaaatgca tagtctgcga agtaaatgca 1080

aatcatccat ttgtcatgac agaactcatg atgccaatat taccaattgt aagagttaaa 1140

gatatagatg aagctgttaa atatacaaag atagcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1200

tatatttatt ctaaaaatat agacaaccta aatagatttg aaagagaaat tgatactact 1260

atttttgtaa agaatgctaa atcttttgct ggtgttggtt atgaagctga aggatttaca 1320

actttcacta ttgctggatc tactggtgaa ggcataacct ctgcaagaaa ttttacaaga 1380

caaagaagat gtgtacttgc cggctaa 1407

<210> 222 <211> 468 <212> PRT

<213> Clostridium beijerinckií <400> 222

Met Asn Lys Asp Thr Leu Ile Pro Thr Thr Lys Asp Leu Lys Leu Lys 15 10 15

Thr Asn Val Glu Asn Ile Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asn Ser Ser 20 25 30

Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala He. Asn Ser Ala Val 35 40 45

His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu 50 55 60

Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Glu Asn Lys Glu Val 65 70 75 80

Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp 85 90 95

Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu 100 105 110

Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val 115 120 125 Glu Met Ser Pro 130

Pro Thr Glu Thr 145

Asn Ala Val Val

Phe Ala Ile Glu 180

Glu Asn Leu Val 195

Ala Ile Ile Lys 210

Pro Gly Met Val 225

Ala Gly Ala Gly

Glu Lys Ala Gly 260

Leu Pro Cys Ile 275

Asp Asp Leu Ile 290

Glu Asp Gln Val 305

Glu Thr Gln Glu

Lys Leu Phe Ser 340

Cys Ile Val Cys 355

Leu Met Met Pro 370

Ala Val Lys Tyr 385

Tyr Ile Tyr Ser

Ile Asp Thr Thr 420

Gly Tyr Glu Ala 435

Tyr Gly Val Ile 135

Val Ile Cys Asn 150

Phe Asn Gly His 165

Met Ile Asn Lys

Thr Thr Ile Lys 200

His Pro Leu Ile 215

Lys Thr Leu Leu 230

Asn Pro Pro Val 245

Lys Ser Ile Ile

Ala Glu Lys Glu 280

Ser Asn Met Leu 295

Ser Lys Leu Ile 310

Tyr Phe Ile Asn 325

Asp Glu Ile Asp

Glu Val Asn Ala 360

Ile Leu Pro Ile 375

Thr Lys Ile Ala 390

Lys Asn Ile Asp 405

Ile Phe Val Lys

Glu Gly Phe Thr 440

Gly Ala Ile Thr 140

Ser Ile Gly Met 155

Pro Gly Ala Lys 170

Ala Ile Ile Ser 185

Asn Pro Thr Met

Lys Leu Leu Cys 220

Asn Ser Gly Lys 235

Ile Val Asp Asp 250

Glu Gly Cys Ser 265

Val Phe Val Phe

Lys Asn Asn Ala 300

Asp Leu Val Leu 315

Lys Lys Trp Val 330

Val Glu Ser Pro 345

Asn His Pro Phe

Val Arg Val Lys 380

Glu Gln Asn Arg 395

Asn Leu Asn Arg 410

Asn Ala Lys Ser 425

Thr Phe Thr Ile

Pro Ser Thr Asn

Ile Ala Ala Gly 160

Lys Cys Val Ala 175

Cys Gly Gly Pro 190

Glu Ser Leu Asp 205

Gly Thr Gly Gly

Lys Ala Ile Gly 240

Thr Ala Asp Ile 255

Phe Asp Asn Asn 270

Glu Asn Val Ala 285

Val Ile Ile Asn

Gln Lys Asn Asn 320

Gly Lys Asp Ala 335

Ser Asn Ile Lys 350

Val Met Thr Glu 365

Asp Ile Asp Glu

Lys His Ser Ala 400

Phe Glu Arg Glu 415

Phe Ala Gly Val 430

Ala Gly Ser Thr 445 Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys 450 455 460

Val Leu Ala Gly 465

<210> 223

<211> 2589

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<4 00> 223

atgaaagtca caacagtaaa ggaattagat gaaaaactca aggtaattaa agaagctcaa 60 aaaaaattct cttgttactc gcaagaaatg gttgatgaaa tctttagaaa tgcagcaatg 120 gcagcaatcg acgcaaggat agagctagca aaagcagctg ttttggaaac cggtatgggc 180 ttagttgaag acaaggttat aaaaaatcat tttgcaggcg aatacatcta taacaaatat 240 aaggatgaaa aaacctgcgg tataattgaa cgaaatgaac cctacggaat tacaaaaata 300 gcagaaccta taggagttgt agctgctata atccctgtaa caaaccccac atcaacaaca 360 atatttaaat ccttaatatc ccttaaaact agaaatggaa ttttcttttc gcctcaccca 420 agggcaaaaa aatccacaat actagcagct aaaacaatac ttgatgcagc cgttaagagt 480 ggtgccccgg aaaatataat aggttggata gatgaacctt caattgaact aactcaatat 540 ttaatgcaaa aagcagatat aacccttgca actggtggtc cctcactagt taaatctgct 600 tattcttccg gaaaaccagc aataggtgtt ggtccgggta acaccccagt aataattgat 660 gaatctgctc atataaaaat ggcagtaagt tcaattatat tatccaaaac ctatgataat 720 ggtgttatat gtgcttctga acaatctgta atagtcttaa aatccatata taacaaggta 780 aaagatgagt tccaagaaag aggagcttat ataataaaga aaaacgaatt ggataaagtc 840 cgtgaagtga tttttaaaga tggatccgta aaccctaaaa tagtcggaca gtcagcttat 900 actatagcag ctatggctgg cataaaagta cctaaaacca caagaatatt aataggagaa 960 gttacctcct taggtgaaga agaacctttt gcccacgaaa aactatctcc tgttttggct 1020 atgtatgagg ctgacaattt tgatgatgct ttaaaaaaag cagtaactct aataaactta 1080 ggaggcctcg gccatacctc aggaatatat gcagatgaaa taaaagcacg agataaaata 1140 gatagattta gtagtgccat gaaaaccgta agaacctttg taaatatccc aacctcacaa 1200 ggtgcaagtg gagatctata taattttaga ataccacctt ctttcacgct tggctgcgga 1260 ttttggggag gaaattctgt ttccgagaat gttggtccaa aacatctttt gaatattaaa 1320 accgtagctg aaaggagaga aaacatgctt tggtttagag ttccacataa agtatatttt 1380 aagttcggtt gtcttcaatt tgctttaaaa gatttaaaag atctaaagaa aaaaagagcc 1440 tttatagtta ctgatagtga cccctataat ttaaactatg ttgattcaat aataaaaata 1500 cttgagcacc tagatattga ttttaaagta tttaataagg ttggaagaga agctgatctt 1560 aaaaccataa aaaaagcaac tgaagaaatg tcctccttta tgccagacac tataatagct 1620 ttaggtggta cccctgaaat gagctctgca aagctaatgt gggtactata tgaacatcca 1680 gaagtaaaat ttgaagatct tgcaataaaa tttatggaca taagaaagag aatatatact 1740 ttcccaaaac tcggtaaaaa ggctatgtta gttgcaatta caacttctgc tggttccggt 1800 tctgaggtta ctccttttgc tttagtaact gacaataaca ctggaaataa gtacatgtta 1860 gcagattatg aaatgacacc aaatatggca attgtagatg cagaacttat gatgaaaatg 1920 ccaaagggat taaccgctta ttcaggtata gatgcactag taaatagtat agaagcatac 1980 acatccgtat atgcttcaga atacacaaac ggactagcac tagaggcaat acgattaata 2040 tttaaatatt tgcctgaggc ttacaaaaac ggaagaacca atgaaaaagc aagagagaaa 2100 atggctcacg cttcaactat ggcaggtatg gcatccgcta atgcatttct aggtctatgt 2160 cattccatgg caataaaatt aagttcagaa cacaatattc ctagtggcat tgccaatgca 2220 ttactaatag aagaagtaat aaaatttaac gcagttgata atcctgtaaa acaagcccct 2280 tgcccacaat ataagtatcc aaacaccata tttagatatg ctcgaattgc agattatata 2340 aagcttggag gaaatactga tgaggaaaag gtagatctct taattaacaa aatacatgaa 2400 ctaaaaaaag ctttaaatat accaacttca ataaaggatg caggtgtttt ggaggaaaac 2460 ttctattcct cccttgatag aatatctgaa cttgcactag atgatcaatg cacaggcgct 2520 aatcctagat ttcctcttac aagtgagata aaagaaatgt atataaattg ttttaaaaaa 2580 caaccttaa 2589

<210> 224 <211> 862 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum <4 00> 224

Met Lys Val Thr Thr Val Lys Glu Leu Asp Glu Lys Leu Lys Val Ile 15 10 15

Lys Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Glu Met Val Asp 20 25 30

Glu Ile Phe Arg Asn Ala Ala Met Ala Ala Ile Asp Ala Arg Ile Glu 35 40 45 Leu Ala Lys Ala 50

Lys Val Ile Lys 65

Lys Asp Glu Lys

Ile Thr Lys Ile 100

Val Thr Asn Pro 115

Lys Thr Arg Asn 130

Ser Thr Ile Leu 145

Gly Ala Pro Glu

Leu Thr Gln Tyr 180

Gly Pro Ser Leu 195

Gly Val Gly Pro 210

Ile Lys Met Ala 225

Gly Val Ile Cys

Tyr Asn Lys Val 260

Lys Lys Asn Glu 275

Ser Val Asn Pro 290

Met Ala Gly Ile 305

Val Thr Ser Leu

Pro Val Leu Ala 340

Lys Ala Val Thr 355

Ala Val Leu Glu 55

Asn His Phe Ala 70

Thr Cys Gly Ile 85

Ala Glu Pro Ile

Thr Ser Thr Thr 120

Gly Ile Phe Phe 135

Ala Ala Lys Thr 150

Asn Ile Ile Gly 165

Leu Met Gln Lys

Val Lys Ser Ala 200

Gly Asn Thr Pro 215

Val Ser Ser Ile 230

Ala Ser Glu Gln 245

Lys Asp Glu Phe

Leu Asp Lys Val 280

Lys Ile Val Gly 295

Lys Val Pro Lys 310

Gly Glu Glu Glu 325

Met Tyr Glu Ala

Leu Ile Asn Leu 360

Thr Gly Met Gly 60

Gly Glu Tyr Ile 75

Ile Glu Arg Asn 90

Gly Val Val Ala 105

Ile Phe Lys Ser

Ser Pro His Pro 140

Ile Leu Asp Ala 155

Trp Ile Asp Glu 170

Ala Asp Ile Thr 185

Tyr Ser Ser Gly

Val Ile Ile Asp 220

Ile Leu Ser Lys 235

Ser Val Ile Val 250

Gln Glu Arg Gly 265

Arg Glu Val Ile

Gln Ser Ala Tyr 300

Thr Thr Arg Ile 315

Pro Phe Ala His 330

Asp Asn Phe Asp 345

Gly Gly Leu Gly

Leu Val Glu Asp

Tyr Asn Lys Tyr 80

Glu Pro Tyr Gly 95

Ala Ile Ile Pro 110

Leu Ile Ser Leu 125

Arg Ala Lys Lys

Ala Val Lys Ser 160

Pro Ser Ile Glu 175

Leu Ala Thr Gly 190

Lys Pro Ala Ile 205

Glu Ser Ala His

Thr Tyr Asp Asn 240

Leu Lys Ser Ile 255

Ala Tyr Ile Ile 270

Phe Lys Asp Gly 285

Thr Ile Ala Ala

Leu Ile Gly Glu 320

Glu Lys Leu Ser 335

Asp Ala Leu Lys 350

His Thr Ser Gly 365 Ile Tyr Ala Asp Glu Ile Lys Ala Arg Asp Lys Ile Asp Arg Phe Ser 370 375 380

Ser Ala Met Lys Thr Val Arg Thr Phe Val Asn Ile Pro Thr Ser Gln 385 390 395 400

Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Arg Ile Pro Pro Ser Phe Thr 405 410 415

Leu Gly Cys Gly Phe Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Glu Asn Val Gly 420 425 430

Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Thr Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn 435 440 445

Met Leu Trp Phe Arg Val Pro His Lys Val Tyr Phe Lys Phe Gly Cys 450 455 460

Leu Gln Phe Ala Leu Lys Asp Leu Lys Asp Leu Lys Lys Lys Arg Ala 465 470 475 480

Phe Ile Val Thr Asp Ser Asp Pro Tyr Asn Leu Asn Tyr Val Asp Ser 485 490 495

Ile Ile Lys Ile Leu Glu His Leu Asp Ile Asp Phe Lys Val Phe Asn 500 505 510

Lys Val Gly Arg Glu Ala Asp Leu Lys Thr Ile Lys Lys Ala Thr Glu 515 520 525

Glu Met Ser Ser Phe Met Pro Asp Thr Ile Ile Ala Leu Gly Gly Thr 530 535 540

Pro Glu Met Ser Ser Ala Lys Leu Met Trp Val Leu Tyr Glu His Pro 545 550 555 560

Glu Val Lys Phe Glu Asp Leu Ala Ile Lys Phe Met Asp Ile Arg Lys 565 570 575

Arg Ile Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Gly Lys Lys Ala Met Leu Val Ala 580 585 590

Ile Thr Thr Ser Ala Gly Ser Gly Ser Glu Val Thr Pro Phe Ala Leu 595 600 605

Val Thr Asp Asn Asn Thr Gly Asn Lys Tyr Met Leu Ala Asp Tyr Glu 610 615 620

Met Thr Pro Asn Met Ala Ile Val Asp Ala Glu Leu Met Met Lys Met 625 630 635 640

Pro Lys Gly Leu Thr Ala Tyr Ser Gly Ile Asp Ala Leu Val Asn Ser 645 650 655

Ile Glu Ala Tyr Thr Ser Val Tyr Ala Ser Glu Tyr Thr Asn Gly Leu 660 665 670 Ala Leu Glu Ala Ile Arg Leu Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr 675 680 685 Lys Asn Gly Arg Thr Asn Glu Lys Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala 690 695 700

Ser Thr Met Ala Gly Met Ala Ser Ala Asn Ala Phe Leu Gly Leu Cys 705 710 715 720

His Ser Met Ala Ile Lys Leu Ser Ser Glu His Asn Ile Pro Ser Gly 725 730 735

Ile Ala Asn Ala Leu Leu Ile Glu Glu Val Ile Lys Phe Asn Ala Val 740 745 750

Asp Asn Pro Val Lys Gln Ala Pro Cys Pro Gln Tyr Lys Tyr Pro Asn 755 760 765

Thr Ile Phe Arg Tyr Ala Arg Ile Ala Asp Tyr Ile Lys Leu Gly Gly 770 775 780

Asn Thr Asp Glu Glu Lys Val Asp Leu Leu Ile Asn Lys Ile His Glu 785 790 795 800

Leu Lys Lys Ala Leu Asn Ile Pro Thr Ser Ile Lys Asp Ala Gly Val 805 810 815

Leu Glu Glu Asn Phe Tyr Ser Ser Leu Asp Arg Ile Ser Glu Leu Ala 820 825 830

Leu Asp Asp Gln Cys Thr Gly Ala Asn Pro Arg Phe Pro Leu Thr Ser 835 840 845

Glu Ile Lys Glu Met Tyr Ile Asn Cys Phe Lys Lys Gln Pro 850 855 860

<210> 225 <211> 2577 <212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum <4 00> 225

atgaaagtta caaatcaaaa agaactaaaa caaaagctaa atgaattgag agaagcgcaa 60

aagaagtttg caacctatac tcaagagcaa gttgataaaa tttttaaaca atgtgccata 120

gccgcagcta aagaaagaat aaacttagct aaattagcag tagaagaaac aggaataggt 180

cttgtagaag ataaaattat aaaaaatcat tttgcagcag aatatatata caataaatat 240

aaaaatgaaa aaacttgtgg cataatagac catgacgatt ctttaggcat aacaaaggtt 300

gctgaaccaa ttggaattgt tgcagccata gttcctacta ctaatccaac ttccacagca 360

attttcaaat cattaatttc tttaaaaaca agaaacgcaa tattcttttc accacatcca 420

cgtgcaaaaa aatctacaat tgctgcagca aaattaattt tagatgcagc tgttaaagca 480

ggagcaccta aaaatataat aggctggata gatgagccat caatagaact ttctcaagat 540

ttgatgagtg aagctgatat aatattagca acaggaggtc cttcaatggt taaagcggcc 600 tattcatctg gaaaacctgc aattggtgtt gagagtgcag atatagatat ggcagtaagc ggagtaatat gcgcttctga acaatcaata aaagaggaat ttgtaaaacg aggatcatat aaagaaacta tgtttaaaaa tggagctatt ataattgcta aaatggcagg aattgaagtt gtacaatctg ttgaaaaaag cgagctgttc atgtataaag ttaaggattt tgatgaagct ggtggaagtg gacacacgtc atctttatat aaagaatttg gattagcaat gaaaacttca ggagcaagcg gagatttata caattttgcg acttggggag gaaactctgt atcgcaaaat agtgttgctg aaagaaggga aaatatgctt aaatatggat gtcttagatt tgcattaaaa tttatagtaa cagataaaga tctttttaaa ctagatgaga tagatattaa atacagtata gattcagtaa aaaaaggtgc taaagaaatg attggtggtg gatcgccaat ggatgcagca gaagcagaaa ttgaaaatct agctataaac ttccctaaat taggtacaaa ggcgatttca tcagaggcaa caccttttgc agttataact acttcttatg aattgacccc aaacatggca cctagaaaat taacagcagc aactggaata gtttcggtta tggctacgga ttatactgat tttaaatatt tgcctagagc ctataaaaat atggcacatg cctctaatat tgcggggatg cattcaatgg ctcataaact tggggcaatg gtattaatag aagaagttat taaatataac ttccctcaat ataaatctcc taatgctaag aatttaaagg gtactagcga taccgaaaag

ggagcaggaa atacaccagc aataatagat 660 tccataattt tatcaaagac ttatgacaat 720 ttagttatga attcaatata cgaaaaagtt 780 atactcaatc aaaatgaaat agctaaaata 840 aatgctgaca tagttggaaa atctgcttat 900 cctcaaacta caaagatact tataggcgaa 960 tcacatgaaa aactatcacc agtacttgca 1020 ctaaaaaagg cacaaaggct aatagaatta 1080 atagattcac aaaacaataa ggataaagtt 1140 aggacattta ttaacatgcc ttcttcacag 1200 atagcaccat catttactct tggatgcggc 1260 gtagagccta aacatttatt aaatattaaa 1320 tggtttaaag tgccacaaaa aatatatttt 1380 gaattaaaag atatgaataa gaaaagagcc 1440 cttggatatg ttaataaaat aacaaaggta 1500 tttacagata ttaaatctga tccaactatt 1560 cttaactttg aacctgatac tataatctct 1620 aaggttatgc acttgttata tgaatatcca 1680 tttatggata taagaaagag aatatgcaat 1740 gtagctattc ctacaactgc tggtaccggt 1800 aatgatgaaa caggaatgaa atacccttta 1860 ataatagata ctgaattaat gttaaatatg 1920 gatgcattag ttcatgctat agaagcatat 1980 gaattagcct taagagcaat aaaaatgata 2040 gggactaacg acattgaagc aagagaaaaa 2100 gcatttgcaa atgctttctt aggtgtatgc 2160 catcacgttc cacatggaat tgcttgtgct 2220 gctacagact gtccaacaaa gcaaacagca 2280 agaaaatatg ctgaaattgc agagtatttg 2340 gtaacagcct taatagaagc tatttcaaag 2400 ttaaagatag atttgagtat tccacaaaat ataagtgccg ctggaataaa taaaaaagat 2460

ttttataata cgctagataa aatgtcagag cttgcttttg atgaccaatg tacaacagct 2520

aatcctaggt atccacttat aagtgaactt aaggatatct atataaaatc attttaa 2577

<210> 226 <211> 800 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutyIicum <400> 226

Met Lys Val Thr Asn Gln Lys Glu Leu Lys Gln Lys Leu Asn Glu Leu 15 10 15

Arg Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ala Thr Tyr Thr Gln Glu Gln Val Asp 20 25 30

Lys Ile Phe Lys Gln Cys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Glu Arg Ile Asn 35 40 45

Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu Thr Gly Ile Gly Leu Val Glu Asp 50 55 60

Lys Ile Ile Lys Asn His Phe Ala Ala Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr 65 70 75 80

Lys Asn Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Asp His Asp Asp Ser Leu Gly 85 90 95

Ile Thr Lys Val Ala Glu Pro Ile Gly Ile Val Ala Ala Ile Val Pro 100 105 110

Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu 115 120 125

Lys Thr Arg Asn Ala Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys 130 135 140

Ser Thr Ile Ala Ala Ala Lys Leu Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ala 145 150 155 160

Gly Ala Pro Lys Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu 165 170 175

Leu Ser Gln Asp Leu Met Ser Glu Ala Asp Ile Ile Leu Ala Thr Gly 180 185 190

Gly Pro Ser Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile 195 200 205

Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ile Ile Asp Glu Ser Ala Asp 210 215 220

Ile Asp Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn 225 230 235 240

Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Ile Leu Val Met Asn Ser Ile 245 250 255 Tyr Glu Lys Val Lys Glu Glu Phe Val Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Leu 260 265 270

Asn Gln Asn Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Thr Met Phe Lys Asn Gly 275 280 285

Ala Ile Asn Ala Asp Ile Val Gly Lys Ser Ala Tyr Ile Ile Ala Lys 290 295 300

Met Ala Gly Ile Glu Val Pro Gln Thr Thr Lys Ile Leu Ile Gly Glu 305 310 315 320

Val Gln Ser Val Glu Lys Ser Glu Leu Phe Ser His Glu Lys Leu Ser 325 330 335

Pro Val Leu Ala Met Tyr Lys Val Lys Asp Phe Asp Glu Ala Leu Lys 340 345 350

Lys Ala Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Gly Ser Gly His Thr Ser Ser 355 360 365

Leu Tyr Ile Asp Ser Gln Asn Asn Lys Asp Lys Val Lys Glu Phe Gly 370 375 380

Leu Ala Met Lys Thr Ser Arg Thr Phe Ile Asn Met Pro Ser Ser Gln 385 390 395 400

Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Thr 405 410 415

Leu Gly Cys Gly Thr Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Gln Asn Val Glu 420 425 430

Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Ser Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn 4.35 4 40 4 45

Met Leu Trp Phe Lys Val Pro Gln Lys Ile Tyr Phe Lys Tyr Gly Cys 450 455 460

Leu Arg Phe Ala Leu Lys Glu Leu Lys Asp Met Asn Lys Lys Arg Ala 465 470 475 480

Phe Ile Val Thr Asp Lys Asp Leu Phe Lys Leu Gly Tyr Val Asn Lys 485 490 495

Ile Thr Lys Val Leu Asp Glu Ile Asp Ile Lys Tyr Ser Ile Phe Thr 500 505 510

Asp Ile Lys Ser Asp Pro Thr Ile Asp Ser Val Lys Lys Gly Ala Lys 515 520 525

Glu Met Leu Asn Phe Glu Pro Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gly Gly Gly 530 535 540

Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Val Met His Leu Leu Tyr Glu Tyr Pro 545 550 555 560

Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Ala Ile Asn Phe Met Asp Ile Arg Lys 565 570 575 Arg Ile Cys Asn Phe Pro Lys Leu Gly Thr Lys Ala Ile Ser Val Ala 580 585 590

Ile Pro Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Ala Thr Pro Phe Ala Val 595 600 605

Ile Thr Asn Asp Glu Thr Gly Met Lys Tyr Pro Leu Thr Ser Tyr Glu 610 615 620

Leu Thr Pro Asn Met Ala Ile Ile Asp Thr Glu Leu Met Leu Asn Met 625 630 635 640

Pro Arg Lys Leu Thr Ala Ala Thr Gly Ile Asp Ala Leu Val His Ala 645 650 655

Ile Glu Ala Tyr Val Ser Val Met Ala Thr Asp Tyr Thr Asp Glu Leu 660 665 670

Ala Leu Arg Ala Ile 675

Lys Asn Gly Thr Asn 690

Ser Asn Ile Ala Gly 705

His Ser Met Ala His 725

Ile Ala Cys Ala Val 740

Asp Cys Pro Thr Lys 755

Lys Met Ile Phe Lys 680

Asp Ile Glu Ala Arg 695

Met Ala Phe Ala Asn 710

Lys Leu Gly Ala Met 730

Leu Ile Glu Glu Val 745

Gln Thr Ala Phe Pro 760

Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr 685

Glu Lys Met Ala His Ala 700

Ala Phe Leu Gly Val Cys 715 720

His His Val Pro His Gly 735

Ile Lys Tyr Asn Ala Thr 750

Gln Tyr Lys Ser Pro Asn 765

Ala Lys Arg Lys Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu Asn Leu Lys Gly 770 775 780

Thr Ser Asp Thr Glu Lys Val Thr Ala Leu Ile Glu Ala Ile Ser Lys 785 790 795 800

<210> 227

<211> 924

<212> DNA

<213> Pseudomonas putída

<4 00> 227

atgagcaaga aactcaaggc ggccatcata atgaagatgc tccgttccga gtggattgag tccgacggcc tcaaacgcgc ccgcgatttc ggcctgctcc cgcacgtgct ggacgacgac tatgtgcatg ccgagaatag ccgcaagctc

ggccccggca atatcggtac cgatctggtg 60

ccggtgtgga tggtcggcat cgaccccaac 120

ggcatgaaga ccacagccga aggcgtcgac 180

atccgcatcg ccttcgacgc cacctcggcc 240

aacgcgcttg gcgtgctgat ggtcgacctg 300

accccggcgg ccatcggccc ctactgcgtg ccgccggtca acctcaagca gcatgtcggc 360 cgcctggaaa tgaacgtcaa catggtcacc tgcggcggcc aggccaccat ccccatggtc 420

gccgcggtgt cccgcgtgca gccggtggcc tacgccgaga tcgtcgccac cgtctcctcg 480

cgctcggtcg gcccgggcac gcgcaagaac atcgacgagt tcacccgcac caccgccggc 540

gccatcgagc aggtcggcgg cgccagggaa ggcaaggcga tcatcgtcat caacccggcc 600

gagccgccgc tgatgatgcg cgacaccatc cactgcctga ccgacagcga gccggaccag 660

gctgcgatca ccgcttcggt tcacgcgatg atcgccgagg tgcagaaata cgtgcccggc 720

taccgcctga agaacggccc ggtgttcgac ggcaaccgcg tgtcgatctt catggaagtc 780

gaaggcctgg gcgactacct gcccaagtac gccggcaacc tcgacatcat gaccgccgcc 840

gcgctgcgta ccggcgagat gttcgccgag gaaatcgccg ccggcaccat tcaactgccg 900

cgtcgcgaca tcgcgctggc ttga 924

<210> -228 <211> 307 <212> PRT

<213> Pseudomonas putida <400> 228

Met Ser Lys Lys Leu Lys Ala Ala Ile Ile Gly Pro Gly Asn Ile Gly 15 10 15

Thr Asp Leu Val Met Lys Met Leu Arg Ser Glu Trp Ile Glu Pro Val 20 25 30

Trp Met Val Gly Ile Asp Pro Asn Ser Asp Gly Leu Lys Arg Ala Arg 35 40 45

Asp Phe Gly Met Lys Thr Thr Ala Glu Gly Val Asp Gly Leu Leu Pro 50 55 60

His Val Leu Asp Asp Asp Ile Arg Ile Ala Phe Asp Ala Thr Ser Ala 65 70 75 80

Tyr Val His Ala Glu Asn Ser Arg Lys Leu Asn Ala Leu Gly Val Leu 85 90 95

Met Val Asp Leu Thr Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Cys Val Pro Pro 100 105 110

Val Asn Leu Lys Gln His Val Gly Arg Leu Glu Met Asn Val Asn Met 115 120 125

Val Thr Cys Gly Gly Gln Ala Thr Ile Pro Met Val Ala Ala Val Ser 130 135 140

Arg Val Gln Pro Val Ala Tyr Ala Glu Ile Val Ala Thr Val Ser Ser 145 150 155 160

Arg Ser Val Gly Pro Gly Thr Arg Lys Asn Ile Asp Glu Phe Thr Arg 165 170 175 Thr Thr Ala Gly Ala Ile Glu Gln Val Gly Gly Ala Arg Glu Gly Lys 180 185 190

Ala Ile Ile Val Ile Asn Pro Ala Glu Pro Pro Leu Met Met Arg Asp 195 200 205

Thr Ile His Cys Leu Thr Asp Ser Glu Pro Asp Gln Ala Ala Ile Thr 210 215 220

Ala Ser Val His Ala Met Ile Ala Glu Val Gln Lys Tyr Val Pro Gly 225 230 235 240

Tyr Arg Leu Lys Asn Gly Pro Val Phe Asp Gly Asn Arg Val Ser Ile 245 250 255

Phe Met Glu Val Glu Gly Leu Gly Asp Tyr Leu Pro Lys Tyr Ala Gly 260 265 270

Asn Leu Asp Ile Met Thr Ala Ala Ala Leu Arg Thr Gly Glu Met Phe 275 280 285

Ala Glu Glu Ile Ala Ala Gly Thr Ile Gln Leu Pro Arg Arg Asp Ile 290 295 300

Ala Leu Ala 305

<210> 229 <211> 924 <212> DNA

<213> Thermus thermophilus <4 00> 229

atgtccgaaa gggttaaggt agccatcctg ggctccggca acatcgggac ggacctgatg 60 tacaagctcc tgaagaaccc gggccacatg gagcttgtgg cggtggtggg gatagacccc 120 aagtccgagg gcctggcccg ggcgcgggcc ttagggttag aggcgagcca cgaagggatc 180 gcctacatcc tggagaggcc ggagatcaag atcgtctttg acgccaccag cgccaaggcc 240 cacgtgcgcc acgccaagct cctgagggag gcggggaaga tcgccataga cctcacgccg 300 gcggcccggg gcccttacgt ggtgcccccg gtgaacctga aggaacacct ggacaaggac 360 aacgtgaacc tcatcacctg cggggggcag gccaccatcc ccctggtcta cgcggtgcac 420 cgggtggccc ccgtgctcta cgcggagatg gtctccacgg tggcctcccg ctccgcgggc 4 80 cccggcaccc ggcagaacat cgacgagttc accttcacca ccgcccgggg cctggaggcc 540 atcggggggg ccaagaaggg gaaggccatc atcatcctga acccggcgga accccccatc 600 ctcatgacca acaccgtgcg ctgcatcccc gaggacgagg gctttgaccg ggaggccgtg 660 gtggcgagcg tccgggccat ggagcgggag gtccaggcct acgtgcccgg ctaccgcctg 720 aaggcggacc cggtgtttga gaggcttccc accccctggg gggagcgcac cgtggtctcc 780 atgctcctgg aggtggaggg ggcgggggac tatttgccca aatacgccgg caacctggac 840

atcatgacgg cttctgcccg gagggtgggg gaggtcttcg cccagcacct cctggggaag 900

cccgtggagg aggtggtggc gtga 924

<210> 230 <211> 307 <212> PRT

<213> Thermus thermophilus <400> 230

Met Ser Glu Arg Val Lys Val Ala Ile Leu Gly Ser Gly Asn Ile Gly 15 10 15

Thr Asp Leu Met Tyr Lys Leu Leu Lys Asn Pro Gly His Met Glu Leu 20 25 30

Val Ala Val Val Gly Ile Asp Pro Lys Ser Glu Gly Leu Ala Arg Ala 35 40 45

Arg Ala Leu Gly Leu Glu Ala Ser His Glu Gly Ile Ala Tyr Ile Leu 50 55 60

Glu Arg Pro Glu Ile Lys Ile Val Phe Asp Ala Thr Ser Ala Lys Ala 65 70 75 80

His Val Arg His Ala Lys Leu Leu Arg Glu Ala Gly Lys Ile Ala Ile 85 90 95

Asp Leu Thr Pro Ala Ala Arg Gly Pro Tyr Val Val Pro Pro Val Asn 100 105 110

Leu Lys Glu His Leu Asp Lys Asp Asn Val Asn Leu Ile Thr Cys Gly 115 120 125

Gly Gln Ala Thr Ile Pro Leu Val Tyr Ala Val His Arg Val Ala Pro 130 135 140

Val Leu Tyr Ala Glu Met Val Ser Thr Val Ala Ser Arg Ser Ala Gly 145 150 155 160

Pro Gly Thr Arg Gln Asn Ile Asp Glu Phe Thr Phe Thr Thr Ala Arg 165 170 175

Gly Leu Glu Ala Ile Gly Gly Ala Lys Lys Gly Lys Ala Ile Ile Ile 180 185 190

Leu Asn Pro Ala Glu Pro Pro Ile Leu Met Thr Asn Thr Val Arg Cys 195 200 205

Ile Pro Glu Asp Glu Gly Phe Asp Arg Glu Ala Val Val Ala Ser Val 210 215 220

Arg Ala Met Glu Arg Glu Val Gln Ala Tyr Val Pro Gly Tyr Arg Leu 225 230 235 240

Lys Ala Asp Pro Val Phe Glu Arg Leu Pro Thr Pro Trp Gly Glu Arg 245 250 255 Thr Val Val Ser Met Leu Leu Glu Val Glu Gly Ala Gly Asp Tyr Leu 260 265 270

Pro Lys Tyr Ala Gly Asn Leu Asp Ile Met Thr Ala Ser Ala Arg Arg 275 280 285

Val Gly Glu Val Phe Ala Gln His Leu Leu Gly Lys Pro Val Glu Glu 290 295 300

Val Val Ala 305

<210> 231 <211> 1254 <212> DNA

<213> Escherichia coli <400> 231

atgacattct ccctttttgg tgacaaattt acccgccact ccggcattac gctgttgatg 60 gaagatctga acgacggttt acgcacgcct ggcgcgatta tgctcggcgg cggtaatccg 120 gcgcagatcc cggaaatgca ggactacttc cagacgctac tgaccgacat gctggaaagt 180 ggcaaagcga ctgatgcact gtgtaactac gacggtccac aggggaaaac ggagctactc 240 acactgcttg ccggaatgct gcgcgagaag ttgggttggg atatcgaacc acagaatatt 300 gcactaacaa acggcagcca gagcgcgttt ttctacttat ttaacctgtt tgccggacgc 360 cgtgccgatg gtcgggtcaa aaaagtgctg ttcccgcttg caccggaata cattggctat 420 gctgacgccg gactggaaga agatctgttt gtctctgcgc gtccgaatat tgaactgctg 480 ccggaaggcc agtttaaata ccacgtcgat tttgagcatc tgcatattgg cgaagaaacc 540 gggatgattt gcgtctcccg gccgacgaat ccaacaggca atgtgattac tgacgaagag 600 ttgctgaagc ttgacgcgct ggcgaatcaa cacggcattc cgctggtgat tgataacgct 660 tatggcgtcc cgttcccggg tatcatcttc agtgaagcgc gcccgctatg gaatccgaat 720 atcgtgctgt gcatgagtct ttccaagctg ggtctacctg gctcccgctg cggcattatc 780 atcgccaatg aaaaaatcat caccgccatc accaatatga acggcattat cagcctggca 840 cctggcggta ttggtccggc gatgatgtgt gaaatgatta agcgtaacga tctgctgcgc 900 ctgtctgaaa cagtcatcaa accgttttac taccagcgtg ttcaggaaac tatcgccatc 960 attcgccgct atttaccgga aaatcgctgc ctgattcata aaccggaagg agccattttc 1020 ctctggctat ggtttaagga tttgcccatt acgaccaagc agctctatca gcgcctgaaa 1080 gcacgcggcg tgctgatggt gccggggcac aacttcttcc cagggctgga taaaccgtgg 1140 ccgcatacgc atcaatgtat gcgcatgaac tacgtaccag agccggagaa aattgaggcg 1200 ggggtgaaga ttctggcgga agagatagaa agagcctggg ctgaaagtca ctaa 1254 <210> 232

<211> 417

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<4 00> 232

Met Thr Phe Ser Leu Phe Gly Asp Lys Phe Thr Arg His Ser Gly Ile 15 10 15

Thr Leu Leu Met Glu Asp Leu Asn Asp Gly Leu Arg Thr Pro Gly Ala 20 25 30

Ile Met Leu Gly Gly Gly Asn Pro Ala Gln Ile Pro Glu Met Gln Asp 35 40 45

Tyr Phe Gln Thr Leu Leu Thr Asp Met Leu Glu Ser Gly Lys Ala Thr 50 55 60

Asp Ala Leu Cys Asn Tyr Asp Gly Pro Gln Gly Lys Thr Glu Leu Leu 65 70 75 80

Thr Leu Leu Ala Gly Met Leu Arg Glu Lys Leu Gly Trp Asp Ile Glu 85 90 95

Pro Gln Asn Ile Ala Leu Thr Asn Gly Ser Gln Ser Ala Phe Phe Tyr 100 105 110

Leu Phe Asn Leu Phe Ala Gly Arg Arg Ala Asp Gly Arg Val Lys Lys 115 120 125

Val Leu Phe Pro 130

Leu Glu Glu Asp 145

Pro Glu Gly Gln

Gly Glu Glu Thr 180

Gly Asn Val Ile 195

Asn Gln His Gly 210

Phe Pro Gly Ile 225

Ile Val Leu Cys

Cys Gly Ile Ile 260

Met Asn Gly Ile 275

Leu Ala Pro Glu 135

Leu Phe Val Ser 150

Phe Lys Tyr His 165

Gly Met Ile Cys

Thr Asp Glu Glu 200

Ile Pro Leu Val 215

Ile Phe Ser Glu 230

Met Ser Leu Ser 245

Ile Ala Asn Glu

Ile Ser Leu Ala 280

Tyr Ile Gly Tyr 140

Ala Arg Pro Asn 155

Val Asp Phe Glu 170

Val Ser Arg Pro 185

Leu Leu Lys Leu

Ile Asp Asn Ala 220

Ala Arg Pro Leu 235

Lys Leu Gly Leu 250

Lys Ile Ile Thr 265

Pro Gly Gly Ile

Ala Asp Ala Gly

Ile Glu Leu Leu 160

His Leu His Ile 175

Thr Asn Pro Thr 190

Asp Ala Leu Ala 205

Tyr Gly Val Pro

Trp Asn Pro Asn 240

Pro Gly Ser Arg 255

Ala Ile Thr Asn 270

Gly Pro Ala Met 285 Met Cys Glu Met Ile Lys Arg Asn Asp Leu Leu Arg Leu Ser Glu Thr 290 295 300

Val Ile Lys Pro Phe Tyr Tyr Gln Arg Val Gln Glu Thr Ile Ala Ile 305 310 315 320

Ile Arg Arg Tyr Leu Pro Glu Asn Arg Cys Leu Ile His Lys Pro Glu 325 330 335

Gly Ala Ile Phe Leu Trp Leu Trp Phe Lys Asp Leu Pro Ile Thr Thr 340 345 350

Lys Gln Leu Tyr Gln Arg Leu Lys Ala Arg Gly Val Leu Met Val Pro 355 360 365

Gly His Asn Phe Phe Pro Gly Leu Asp Lys Pro Trp Pro His Thr His 370 375 380

Gln Cys Met Arg Met Asn Tyr Val Pro Glu Pro Glu Lys Ile Glu Ala 385 390 395 400

Gly Val Lys Ile Leu Ala Glu Glu Ile Glu Arg Ala Trp Ala Glu Ser 405 410 415

His

<210> 233 <211> 1278 <212> DNA

<213> Bacillus 1icheniformis <4 00> 233

ttataagtat tcaacctgtt tctcatatac acccttcgca attttagcta aaacatcgat 60

tccccttata atatcttcat ccgccgcggt taggctgatt cgtatacact ggtgtgaatg 120

cgccaggcgc cgggattgac ggtgaaagaa agatgatccg ggaacgataa tgactccatc 180

cgctttcata tactcataca gcgctgcatc ggtcaccggc aggtcttcaa accacagcca 240

tccgaaaagc gatccttccc cttgatgcag ataccatttg atgtcttcag gcatcttgca 300

taaaagcgtt tccttgagca gcatgaattt attgcggtaa tatggcctga cttcattcag 360

cgacacgtcg gcgaggcgcc cgtcattcaa tactgatgca gccatatact gccccagcct 420

tgaagaatgg atcgccgcat tcgactgaaa agcttccatt gcctgaatat accgggacgg 480

cccgatggcg attccgatcc tttcgccagg caggccggct tttgaaaggc tcatacagtg 540

aatgatctgc tcgttgaaaa tcggttccat gtcgataaag tgaatcgccg gaaaaggcgg 600

agcatatgcg gaatcaatga acagcggaac attcgcttct cggcatgcgt ctgaaatgaa 660

tgctacatct tctttaggca agatgtttcc gcaaggattg ttcgggcgcg atagcaagac 720

agcaccgatg cgcatcctct ctaaaaaccc cttacggtcg agctcatatc gaaacgtatg 780

atcatccaat ttcgatatga gcggagggat cccctcaatc atctcccgct ccagtgccgc 840 cccgctgtat cccgaatagt caggcagcat cgggatcaag gcttttttca tcacagatcc 900

gcttcccatt ccgcaaaacg aattgatcgc cagaaaaaac agctgctggc ttccggctgt 960

aatcaacacg ttctcttttc gaatgccggc gctataccgc tctgaaaaga agcggacaac 1020

acttgcaatc agttcatcgg ttccatagct cgatccgtat tggccgatca ccgaagaaaa 1080

cctgtcatcg tcaaggagat cggcaagagc cgacttccac atggctgaca cgccgggcaa 1140

aatcatcgga ttgcccgcac ttaaattaat gtatgaccgt tcaccgccgg ccaggacttc 1200

ctgaatatcg ctcatcacag ccctgacccc tgttttctca atcattttct ctccgatttt 1260

gcttaatggc ggcttcac 1278

<210> 234 <211> 425 <212> PRT

<213> Bacillus Iicheniformis <4 00> 234

Met Lys Pro Pro Leu Ser Lys Ile Gly Glu Lys Met Ile Glu Lys Thr 15 10 15

Gly Val Arg Ala Val Met Ser Asp Ile Gln Glu Val Leu Ala Gly Gly 20 25 30

Glu Arg Ser Tyr Ile Asn Leu Ser Ala Gly Asn Pro Met Ile Leu Pro 35 40 45

Gly Val Ser Ala Met Trp Lys Ser Ala Leu Ala Asp Leu Leu Asp Asp 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Val Ile Gly Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr Gly Thr 65 70 75 80

Asp Glu Leu Ile Ala Ser Val Val Arg Phe Phe Ser Glu Arg Tyr Ser 85 90 95

Ala Gly Ile Arg Lys Glu Asn Val Leu Ile Thr Ala Gly Ser Gln Gln 100 105 110

Leu Phe Phe Leu Ala Ile Asn Ser Phe Cys Gly Met Gly Ser Gly Ser 115 120 125

Val Met Lys Lys Ala Leu Ile Pro Met Leu Pro Asp Tyr Ser Gly Tyr 130 135 140

Ser Gly Ala Ala Leu Glu Arg Glu Met Ile Glu Gly Ile Pro Pro Leu 145 150 155 160

Ile Ser Lys Leu Asp Asp His Thr Phe Arg Tyr Glu Leu Asp Arg Lys 165 170 175

Gly Phe Leu Glu Arg Met Arg Ile Gly Ala Val Leu Leu Ser Arg Pro 180 185 190 Asn Asn Pro Cys Gly Asn Ile Leu Pro Lys Glu Asp Val Ala Phe Ile 195 200 205

Ser Asp Ala Cys Arg Glu Ala Asn Val Pro Leu Phe Ile Asp Ser Ala 210 215 220

Tyr Ala Pro Pro Phe Pro Ala Ile His Phe Ile Asp Met Glu Pro Ile 225 230 235 240

Phe Asn Glu Gln Ile Ile His Cys Met Ser Leu Ser Lys Ala Gly Leu 245 250 255

Pro Gly Glu Arg Ile Gly Ile Ala Ile Gly Pro Ser Arg Tyr Ile Gln 260 265 270

Ala Met Glu Ala Phe Gln Ser Asn Ala Ala Ile His Ser Ser Arg Leu 275 280 285

Gly Gln Tyr Met Ala Ala Ser Val Leu Asn Asp Gly Arg Leu Ala Asp 290 295 300

Val Ser Leu Asn Glu Val Arg Pro Tyr Tyr Arg Asn Lys Phe Met Leu 305 310 315 320

Leu Lys Glu Thr Leu Leu Cys Lys Met Pro Glu Asp Ile Lys Trp Tyr 325 330 335

Leu His Gln Gly Glu Gly Ser Leu Phe Gly Trp Leu Trp Phe Glu Asp 340 345 350

Leu Pro Val Thr Asp Ala Ala Leu Tyr Glu Tyr Met Lys Ala Asp Gly 355 360 365

Val Ile Ile Val Pro Gly Ser Ser Phe Phe His Arg Gln Ser Arg Arg 370 375 380

Leu Ala His Ser His Gln Cys Ile Arg Ile Ser Leu Thr Ala Ala Asp 385 390 395 400

Glu Asp Ile Ile Arg Gly Ile Asp Val Leu Ala Lys Ile Ala Lys Gly 405 410 415

Val Tyr Glu Lys Gln Val Glu Tyr Leu 420 425

<210> 235 <211> 930 <212> DNA

<213> Escherichia coli <4 00> 235

atgaccacga agaaagctga ttacatttgg ttcaatgggg agatggttcg ctgggaagac 60 gcgaaggtgc atgtgatgtc gcacgcgctg cactatggca cttcggtttt tgaaggcatc 120 cgttgctacg actcgcacaa aggaccggtt gtattccgcc atcgtgagca tatgcagcgt 180

ctgcatgact ccgccaaaat ctatcgcttc ccggtttcgc agagcattga tgagctgatg 240 gaagcttgtc gtgacgtgat ccgcaaaaac aatctcacca gcgcctatat ccgtccgctg 300

atcttcgtcg gtgatgttgg catgggagta aacccgccag cgggatactc aaccgacgtg 360

attatcgctg ctttcccgtg gggagcgtat ctgggcgcag aagcgctgga gcaggggatc 420

gatgcgatgg tttcctcctg gaaccgcgca gcaccaaaca ccatcccgac ggcggcaaaa 480

gccggtggta actacctctc ttccctgctg gtgggtagcg aagcgcgccg ccacggttat 540

caggaaggta tcgcgctgga tgtgaacggt tatatctctg aaggcgcagg cgaaaacctg 600

tttgaagtga aagatggtgt gctgttcacc ccaccgttca cctcctccgc gctgccgggt 660

attacccgtg atgccatcat caaactggcg aaagagctgg gaattgaagt acgtgagcag 720

gtgctgtcgc gcgaatccct gtacctggcg gatgaagtgt ttatgtccgg tacggcggca 780

gaaatcacgc cagtgcgcag cgtagacggt attcaggttg gcgaaggccg ttgtggcccg 840

gttaccaaac gcattcagca agccttcttc ggcctcttca ctggcgaaac cgaagataaa 900

tggggctggt tagatcaagt taatcaataa 930

<210> 236 <211> 309 <212> PRT

<213> Escherichia coli <400> 236

Met Thr Thr Lys Lys Ala Asp Tyr Ile Trp Phe Asn Gly Glu Met Val 1 5 10 15

Arg Trp Glu Asp Ala Lys Val His Val Met Ser His Ala Leu His Tyr 20 25 30

Gly Thr Ser Val Phe Glu Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Ser His Lys Gly 35 40 45

Pro Val Val Phe Arg His Arg Glu His Met Gln Arg Leu His Asp Ser 50 55 60

Ala Lys Ile Tyr Arg Phe Pro Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Leu Met 65 70 75 80

Glu Ala Cys Arg Asp Val Ile Arg Lys Asn Asn Leu Thr Ser Ala Tyr 85 90 95

Ile Arg Pro Leu Ile Phe Val Gly Asp Val Gly Met Gly Val Asn Pro 100 105 110

Pro Ala Gly Tyr Ser Thr Asp Val Ile Ile Ala Ala Phe Pro Trp Gly 115 120 125

Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu Gln Gly Ile Asp Ala Met Val 130 135 140

Ser Ser Trp Asn Arg Ala Ala Pro Asn Thr Ile Pro Thr Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Leu Val Gly Ser Glu Ala Arg 165 170 175

Arg His Gly Tyr Gln Glu Gly Ile Ala Leu Asp Val Asn Gly Tyr Ile 180 185 190

Ser Glu Gly Ala Gly Glu Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Gly Val Leu 195 200 205

Phe Thr Pro Pro Phe Thr Ser Ser Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Asp 210 215 220

Ala Ile Ile Lys Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ile Glu Val Arg Glu Gln 225 230 235 240

Val Leu Ser Arg Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Asp Glu Val Phe Met Ser 245 250 255

Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Val Arg Ser Val Asp Gly Ile Gln 260 265 270

Val Gly Glu Gly Arg Cys Gly Pro Val Thr Lys Arg Ile Gln Gln Ala 275 280 285

Phe Phe Gly Leu Phe Thr Gly Glu Thr Glu Asp Lys Trp Gly Trp Leu 290 295 300

Asp Gln Val Asn Gln 305

<210> 237 <211> 1131 <212> DNA

<213> Saccharomyces cerevísíae

<400> 237

atgaccttgg cacccctaga cgcctccaaa gttaagataa ctaccacaca acatgcatct 60 aagccaaaac cgaacagtga gttagtgttt ggcaagagct tcacggacca catgttaact 120 gcggaatgga cagctgaaaa agggtggggt accccagaga ttaaacctta tcaaaatctg 180 tctttagacc cttccgcggt ggttttccat tatgcttttg agctattcga agggatgaag 240 gcttacagaa cggtggacaa caaaattaca atgtttcgtc cagatatgaa tatgaagcgc 300 atgaataagt ctgctcagag aatctgtttg ccaacgttcg acccagaaga gttgattacc 360 ctaattggga aactgatcca gcaagataag tgcttagttc ctgaaggaaa aggttactct 420 ttatatatca ggcctacatt aatcggcact acggccggtt taggggtttc cacgcctgat 480 agagccttgc tatatgtcat ttgctgccct gtgggtcctt attacaaaac tggatttaag 540 gcggtcagac tggaagccac tgattatgcc acaagagctt ggccaggagg ctgtggtgac 600 aagaaactag gtgcaaacta cgccccctgc gtcctgccac aattgcaagc tgcttcaagg 660 ggttaccaac aaaatttatg gctatttggt ccaaataaca acattactga agtcggcacc 720 atgaatgctt ttttcgtgtt taaagatagt aaaacgggca agaaggaact agttactgct 780

ccactagacg gtaccatttt ggaaggtgtt actagggatt ccattttaaa tcttgctaaa 840

gaaagactcg aaccaagtga atggaccatt agtgaacgct acttcactat aggcgaagtt 900

actgagagat ccaagaacgg tgaactactt gaagcctttg gttctggtac tgctgcgatt 960

gtttctccca ttaaggaaat cggctggaaa ggcgaacaaa ttaatattcc gttgttgccc 1020

ggcgaacaaa ccggtccatt ggccaaagaa gttgcacaat ggattaatgg aatccaatat 1080

ggcgagactg agcatggcaa ttggtcaagg gttgttactg atttgaactg a 1131

<210> 238 <211> 376 <212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae <4 00> 238

Met Thr Leu Ala Pro Leu Asp Ala Ser Lys Val Lys Ile Thr Thr Thr 15 10 15

Gln His Ala Ser Lys Pro Lys Pro Asn Ser Glu Leu Val Phe Gly Lys 20 25 30

Ser Phe Thr Asp His Met Leu Thr Ala Glu Trp Thr Ala Glu Lys Gly 35 40 45

Trp Gly Thr Pro Glu Ile Lys Pro Tyr Gln Asn Leu Ser Leu Asp Pro 50 55 60

Ser Ala Val Val Phe His Tyr Ala Phe Glu Leu Phe Glu Gly Met Lys 65 70 75 80

Ala Tyr Arg Thr Val Asp Asn Lys Ile Thr Met Phe Arg Pro Asp Met 85 90 95

Asn Met Lys Arg Met Asn Lys Ser Ala Gln Arg Ile Cys Leu Pro Thr 100 105 110

Phe Asp Pro Glu Glu Leu Ile Thr Leu Ile Gly Lys Leu Ile Gln Gln 115 ' 120 125

Asp Lys Cys Leu Val Pro Glu Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Tyr Ile Arg 130 135 140

Pro Thr Leu Ile Gly Thr Thr Ala Gly Leu Gly Val Ser Thr Pro Asp 145 150 155 160

Arg Ala Leu Leu Tyr Val Ile Cys Cys Pro Val Gly Pro Tyr Tyr Lys 165 170 175

Thr Gly Phe Lys Ala Val Arg Leu Glu Ala Thr Asp Tyr Ala Thr Arg 180 185 190

Ala Trp Pro Gly Gly Cys Gly Asp Lys Lys Leu Gly Ala Asn Tyr Ala 195 200 205 Pro Cys Val Leu Pro Gln Leu Gln Ala Ala Ser Arg Gly Tyr Gln Gln 210 215 220

Asn Leu Trp Leu Phe Gly Pro Asn Asn Asn Ile Thr Glu Val Gly Thr 225 230 235 240

Met Asn Ala Phe Phe Val Phe Lys Asp Ser Lys Thr Gly Lys Lys Glu 245 250 255

Leu Val Thr Ala Pro Leu Asp Gly Thr Ile Leu Glu Gly Val Thr Arg 260 265 270

Asp Ser Ile Leu Asn Leu Ala Lys Glu Arg Leu Glu Pro Ser Glu Trp 275 280 285

Thr Ile Ser Glu Arg Tyr Phe Thr Ile Gly Glu Val Thr Glu Arg Ser 290 295 300

Lys Asn Gly Glu Leu Leu Glu Ala Phe Gly Ser Gly Thr Ala Ala Ile 305 310 315 320

Val Ser Pro Ile Lys Glu Ile Gly Trp Lys Gly Glu Gln Ile Asn Ile 325 330 335

Pro Leu Leu Pro Gly Glu Gln Thr Gly Pro Leu Ala Lys Glu Val Ala 340 345 350

Gln Trp Ile Asn Gly Ile Gln Tyr Gly Glu Thr Glu His Gly Asn Trp 355 360 365

Ser Arg Val Val Thr Asp Leu Asn 370 375

<210> 239 <211> 993 <212> DNA

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum <4 00> 239

tcagatgtag gtgagccatc cgaagctgtc ctctgtctct gccctgatta tcctgaagaa 60

ctcatcctgc agcagctttg taacgggacc ccttcgcccg gcacctatct ctataccatc 120

aactgatctg atgggtgtta tctctgcggc tgtacctgtg aagaaggcct catctgcgat 180

gtagagcatc tccctggtta tgggttcctc atgcacggta acaccctcgg tcctggctat 240

ctttattacg gagtcccttg ttatccccct cagaagggat gatgaaacag ggggggtgta 300

aatttcaccc tcactgacga ggaatatgtt ctccccgcta ccctcactta tgtagccatg 360

gtagtccagc attatggcct catcatagcc gtgtctcaca gcctccatct tggcaagctg 420

tgagttgagg tagttaccgc cggcctttgc catgttgggc attgtgtttg gtgccatcct 480

ccgccaggtt gaaacaccag catcgacacc aacctcaagg gcctctgcac ccagataggc 540

cccccattcc caggcagcca cagcgacgtc cactgggcag ttcaccgggt gaacacccat 600 ctcaccgtat cccctgaata ccacgggtct tatatagcac tcctcaagtc cgttctccct 660 gacggtctca actatggcat cacatatctg ctcctgggtg tagggtatgt ccatccggta 720 tatctttgca gaatcaaaaa ggcgtttaac atgctcccgc aaacggaaga tggctgaccc 780 cttactgttc ctgtagcacc ttattccctc aaagacagat gatccataat gcacaacatg 840 tgagagtacg tggacggtgg cttcttccca ttcaaccatt tcaccgttta accatatctt 900 tccactggct tcgcatgaca tgataataac ctcaggtgat ttactaggat aggttatggt 960 tggaggccta tataatgctc tccataaccg caa 993

<210> 240 <211> 330 <212> PRT <213> Methanobacterium thermoaut .otrophicum

<400> 240

Met Arg Leu Trp Arg Ala Leu Tyr Arg Pro Pro Thr Ile Thr Tyr Pro 15 10 15

Ser Lys Ser Pro Glu Val Ile Ile Met Ser Cys Glu Ala Ser Gly Lys 20 25 30

Ile Trp Leu Asn Gly Glu Met Val Glu Trp Glu Glu Ala Thr Val His 35 40 45

Val Leu Ser His Val Val His Tyr Gly Ser Ser Val Phe Glu Gly Ile 50 55 60

Arg Cys Tyr Arg Asn Ser Lys Gly Ser Ala Ile Phe Arg Leu Arg Glu 65 70 75 80

His Val Lys Arg Leu Phe Asp Ser Ala Lys Ile Tyr Arg Met Asp Ile 85 90 95

Pro Tyr Thr Gln Glu Gln Ile Cys Asp Ala Ile Val Glu Thr Val Arg 100 105 110

Glu Asn Gly Leu Glu Glu Cys Tyr Ile Arg Pro Val Val Phe Arg Gly 115 120 125

Tyr Gly Glu Met Gly Val His Pro Val Asn Cys Pro Val Asp Val Ala 130 135 140

Val Ala Ala Trp Glu Trp Gly Ala Tyr Leu Gly Ala Glu Ala Leu Glu 145 150 155 160

Val Gly Val Asp Ala Gly Val Ser Thr Trp Arg Arg Met Ala Pro Asn 165 170 175

Thr Met Pro Asn Met Ala Lys Ala Gly Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gln 180 185 190

Leu Ala Lys Met Glu Ala Val Arg His Gly Tyr Asp Glu Ala Ile Met 195 200 205 Leu Asp Tyr His Gly Tyr Ile Ser Glu Gly Ser Gly Glu Asn Ile Phe 210 215 220

Leu Val Ser Glu Gly Glu Ile Tyr Thr Pro Pro Val Ser Ser Ser Leu 225 230 235 240

Leu Arg Gly Ile Thr Arg Asp Ser Val Ile Lys Ile Ala Arg Thr Glu 245 250 255

Gly Val Thr Val His Glu Glu Pro Ile Thr Arg Glu Met Leu Tyr Ile 260 265 270

Ala Asp Glu Ala Phe Phe Thr Gly Thr Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ile 275 280 285

Arg Ser Val Asp Gly Ile Glu Ile Gly Ala Gly Arg Arg Gly Pro Val 290 295 300

Thr Lys Leu Leu Gln Asp Glu Phe Phe Arg Ile Ile Arg Ala Glu Thr 305 310 315 320

Glu Asp Ser Phe Gly Trp Leu Thr Tyr Ile 325 330

<210> 241 <211> 1095 <212> DNA

<213> Streptomyces coelicolor <4 00> 241

tcacggccgg ggacgggcct ccgccatccg ctgctcggcg atccggtcgg ccgccgcggc 60 cggcggaata ccgtcctcct tcgcacgtgc gaatatggcc agcgtggtgt cgtagatctt 120 cgaggccttc gccttgcacc ggtcgaagtc gaacccgtgc agctcgtcgg cgacctggat 180 gacaccgccg gcgttcacca catagtccgg cgcgtagagg atcccgcggt cggcgaggtc 240 cttctcgacg cccgggtggg cgagctggtt gttggccgcg ccgcacacca ccttggcggt 300 cagcaccggc acggtgtcgt cgttcagcgc gccgccgagc gcgcagggcg cgtagatgtc 360 caggttctcc acccggatca gcgcgtcggt gtcggcgacg gcgaccaccg acgggtgccg 420 ctccgtgatc ccgcgcacca cgtccttgcg cacgtccgtg acgacgacgt gggcgccctc 480 ggcgagcagg tgctcgacca ggtggtggcc gaccttgccg acgcccgcga tgccgacggt 540 gcggtcgcgc agcgtcgggt cgccccacag gtgctgggcg gcggcccgca tgccctggta 600 gacgccgaag gaggtgagca cggaggagtc gcccgcgccg ccgttctccg gggaacgccc 660 ggtcgtccag cggcactcgc gggccacgac gtccatgtcg gcgacgtagg tgccgacgtc 720 gcacgcggtg acgtagcggc cgcccagcga ggcgacgaac cggccgtagg cgaggagcag 780 ctcctcgctc ttgatctgct ccggatcgcc gatgatcacg gccttgccgc caccgtggtc 840 cagaccggcc atggcgttct tgtacgacat cccgcgggcg aggttcagcg cgtcggcgac 900 ggcctccgcc tcgctcgcgt acgggtagaa gcgggtaccg ccgagcgccg ggcccagggc 960

ggtggagtgg agggcgatca cggccttgag gccgctggca cggtcctggc agagcacgac 1020

ttgctcatgt cccccctgat ccgagtggaa cagggtgtgc agtacatcag caggtgcgcc 1080

gtttacgtcg gtcac 1095

<210> 242 <211> 364 <212> PRT

<213> Streptomyces coelicolor <4 00> 242

Met Thr Asp Val Asn Gly Ala Pro Ala Asp Val Leu His Thr Leu Phe 15 10 15

His Ser Asp Gln Gly Gly His Glu Gln Val Val Leu Cys Gln Asp Arg 20 25 30

Ala Ser Gly Leu Lys Ala Val Ile Ala Leu His Ser Thr Ala Leu Gly 35 40 45

Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Phe Tyr Pro Tyr Ala Ser Glu Ala Glu 50 55 60

Ala Val Ala Asp Ala Leu Asn Leu Ala Arg Gly Met Ser Tyr Lys Asn 65 70 75 80

Ala Met Ala Gly Leu Asp His Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly 85 90 95

Asp Pro Glu Gln Ile Lys Ser Glu Glu Leu Leu Leu Ala Tyr Gly Arg 100 105 110

Phe Val Ala Ser Leu Gly Gly Arg Tyr Val Thr Ala Cys Asp Val Gly 115 120 125

Thr Tyr Val Ala Asp Met Asp Val Val Ala Arg Glu Cys Arg Trp Thr 130 135 140

Thr Gly Arg Ser Pro Glu Asn Gly Gly Ala Gly Asp Ser Ser Val Leu 145 150 155 160

Thr Ser Phe Gly Val Tyr Gln Gly Met Arg Ala Ala Ala Gln His Leu 165 170 175

Trp Gly Asp Pro Thr Leu Arg Asp Arg Thr Val Gly Ile Ala Gly Val 180 185 190

Gly Lys Val Gly His His Leu Val Glu His Leu Leu Ala Glu Gly Ala 195 200 205

His Val Val Val Thr Asp Val Arg Lys Asp Val Val Arg Gly Ile Thr 210 215 220

Glu Arg His Pro Ser Val Val Ala Val Ala Asp Thr Asp Ala Leu Ile 225 230 235 240 Arg Val Glu Asn Leu Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala Leu Gly Gly Ala 245 250 255

Leu Asn Asp Asp Thr Val Pro Val Leu Thr Ala Lys Val Val Cys Gly 260 265 270

Ala Ala Asn Asn Gln Leu Ala His Pro Gly Val Glu Lys Asp Leu Ala 275 280 285

Asp Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Val Asn Ala Gly Gly 290 295 300

Val Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu His Gly Phe Asp Phe Asp Arg Cys 305 310 315 320

Lys Ala Lys Ala Ser Lys Ile Tyr Asp Thr Thr Leu Ala Ile Phe Ala 325 330 335

Arg Ala Lys Glu Asp Gly Ile Pro Pro Ala Ala Ala Ala Asp Arg Ile 340 345 350

Ala Glu Gln Arg Met Ala Glu Ala Arg Pro Arg Pro 355 360

<210> 243 <211> 1095 <212> DNA

<213> Bacillus subtilis <4 00> 243

atggaacttt ttaaatatat ggagaaatac gattacgaac aattggtatt ctgccaggat 60

gaacaatctg gattaaaagc gattatcgcc attcatgata caacgcttgg tccggcgctt 120

ggcggaacga gaatgtggac atatgaaaat gaagaagcgg caattgaaga tgcgctcaga 180

ttggcaagag gcatgaccta taagaacgcg gcggcaggct taaaccttgg cggcggaaaa 240

acagtcatta tcggcgatcc gcgcaaagac aaaaatgagg aaatgttccg cgcgtttggc 300

cgctatattc aaggactgaa tggcagatac atcacggctg aagatgtggg cacaacggtc 360

gaggatatgg atatcattca tgatgagaca gactatgtca cagggatttc tcctgctttc 420

ggctcttctg gaaatccgtc cccagtcaca gcgtacgggg tgtacagagg aatgaaggca 480

gcagctaaag ctgctttcgg aaccgattct cttgaaggaa aaaccattgc tgtacagggt 540

gttgggaacg tagcctataa cctttgccgc cacctgcatg aagaaggagc aaacttaatc 600

gttacggata tcaacaaaca atctgtacag cgtgcagttg aagattttgg cgcccgtgcg 660

gtagatcctg atgacattta ttcacaagac tgcgatattt atgcgccgtg tgcccttggt 720

gcgactatta acgacgacac cattaaacag ctgaaggcga aagtgatcgc aggtgcggct 780

aacaaccaat taaaagagac acgccatggt gatcaaattc acgaaatggg catcgtttat 840

gcaccggatt acgtgattaa cgcgggcggt gtcatcaacg tggcagatga gctttacggc 900 tataatgcag aacgtgcatt gaaaaaagtt gaaggcattt acggcaatat cgagcgtgta 960

cttgagattt ctcagcgtga cggcattcct gcatatttag cggctgaccg cttagcagag 1020

gaacggattg aacgcatgcg ccgctcaaga agccagtttt tgcaaaacgg ccacagtgta 1080

ttaagcagac gttaa 1095

<210> 244 <211> 364 <212> PRT

<213> Bacillus subtilis <400> 244

Met Glu Leu Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val 15 10 15

Phe Cys Gln Asp Glu Gln Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His 20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Thr Tyr 35 40 45

Glu Asn Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly 50 55 60

Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys 65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe 85 90 95

Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr 100 105 110

Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Glu Asp Met Asp Ile Ile His Asp 115 120 125

Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly 130 135 140

Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala 145 150 155 160

Ala Ala Lys Ala Ala Phe Gly Thr Asp Ser Leu Glu Gly Lys Thr Ile 165 170 175

Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr Asn Leu Cys Arg His Leu 180 185 190

His Glu Glu Gly Ala Asn Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys Gln Ser 195 200 205

Val Gln Arg Ala Val Glu Asp Phe Gly Ala Arg Ala Val Asp Pro Asp 210 215 220

Asp Ile Tyr Ser Gln Asp Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala Leu Gly 225 230 235 240 Ala Thr Ile Asn Asp Asp Thr Ile Lys Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile 245 250 255

Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Thr Arg His Gly Asp Gln 260 265 270

Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala 275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Ala Glu 290 295 300

Arg Ala Leu Lys Lys Val Glu Gly Ile Tyr Gly Asn Ile Glu Arg Val 305 310 315 320

Leu Glu Ile Ser Gln Arg Asp Gly Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Ala Asp 325 330 335

Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Glu Arg Met Arg Arg Ser Arg Ser Gln 340 345 350

Phe Leu Gln Asn Gly His Ser Val Leu Ser Arg Arg 355 360

<210> 245 <211> 1785 <212> DNA

<213> Streptomyces viridifaciens <400> 245

gtgtcaactt cctccgcttc ttccgggccg gacctcccct tcgggcccga ggacacgcca 60

tggcagaagg ccttcagcag gctgcgggcg gtggatggcg tgccgcgcgt caccgcgccg 120

tccagtgatc cgcgtgaggt ctacatggac atcccggaga tccccttctc caaggtccag 180

atccccccgg acggaatgga cgagcagcag tacgcagagg ccgagagcct cttccgccgc 240

tacgtagacg cccagacccg caacttcgcg ggataccagg tcaccagcga cctcgactac 300

cagcacctca gtcactatct caaccggcat ctgaacaacg tcggcgatcc ctatgagtcc 360

agctcctaca cgctgaactc caaggtcctt gagcgagccg ttctcgacta cttcgcctcc 420

ctgtggaacg ccaagtggcc ccatgacgca agcgatccgg aaacgtactg gggttacgtg 480

ctgaccatgg gctccagcga aggcaacctg tacgggttgt ggaacgcacg ggactatctg 540

tcgggcaagc tgctgcggcg ccagcaccgg gaggccggcg gcgacaaggc ctcggtcgtc 600

tacacgcaag cgctgcgaca cgaagggcag agtccgcatg cctacgagcc ggtggcgttc 660

ttctcgcagg acacgcacta ctcgctcacg aaggccgtgc gggttctggg catcgacacc 720

ttccacagca tcggcagcag tcggtatccg gacgagaacc cgctgggccc cggcactccg 780

tggccgaccg aagtgccctc ggttgacggt gccatcgatg tcgacaaact cgcctcgttg 840

gtccgcttct tcgccagcaa gggctacccg atactggtca gcctcaacta cgggtcaacg 900 ttcaagggcg cctacgacga cgtcccggcc gtggcacagg ccgtgcggga catctgcacg 960 gaatacggtc tggatcggcg gcgggtatac cacgaccgca gtaaggacag tgacttcgac 1020 gagcgcagcg gcttctggat ccacatcgat gccgccctgg gggcgggcta cgctccctac 1080 ctgcagatgg cccgggatgc cggcatggtc gaggaggcgc cgcccgtttt cgacttccgg 1140 ctcccggagg tgcactcgct gaccatgagc ggccacaagt ggatgggaac accgtgggca 1200 tgcggtgtct acatgacacg gaccgggctg cagatgaccc cgccgaagtc gtccgagtac 1260 atcggggcgg ccgacaccac cttcgcgggc tcccgcaacg gcttctcgtc actgctgctg 1320 tgggactacc tgtcccggca ttcgtatgac gatctggtgc gcctggccgc cgactgcgac 1380 cggctggccg gctacgccca cgaccggttg ctgaccttgc aggacaaact cggcatggat 1440 ctgtgggtcg cccgcagccc gcagtccctc acggtgcgct tccgtcagcc atgtgcagac 1500 atcgtccgca agtactcgct gtcgtgtgag acggtctacg aagacaacga gcaacggacc 1560 tacgtacatc tctacgccgt tccccacctc actcgggaac tcgtggatga gctcgtgcgc 1620 gatctgcgcc agcccggagc cttcaccaac gctggtgcac tggaggggga ggcctgggcc 1680 ggggtgatcg atgccctcgg ccgcccggac cccgacggaa cctatgccgg cgccttgagc 1740 gctccggctt ccggcccccg ctccgaggac ggcggcggga gctga 1785 <210> 246 <211> 594 <212> PRT <213> Streptomyces viridifaciens <400> 246

Met Ser Thr Ser Ser Ala Ser Ser Gly Pro Asp Leu Pro Phe Gly Pro

1 5 10 15

Glu Asp Thr Pro Trp Gln Lys Ala Phe Ser Arg Leu Arg Ala Val Asp 20 25 30

Gly Val Pro Arg Val Thr Ala Pro Ser Ser Asp Pro Arg Glu Val Tyr 35 40 45

Met Asp Ile Pro Glu Ile Pro Phe Ser Lys Val Gln Ile Pro Pro Asp 50 55 60

Gly Met Asp Glu Gln Gln Tyr Ala Glu Ala Glu Ser Leu Phe Arg Arg 65 70 75 80

Tyr Val Asp Ala Gln Thr Arg Asn Phe Ala Gly Tyr Gln Val Thr Ser 85 90 95

Asp Leu Asp Tyr Gln His Leu Ser His Tyr Leu Asn Arg His Leu Asn 100 105 110

Asn Val Gly Asp Pro Tyr Glu Ser Ser Ser Tyr Thr Leu Asn Ser Lys 115 120 125 Val Leu Glu Arg Ala Val Leu Asp Tyr Phe Ala Ser Leu Trp Asn Ala 130 135 140

Lys Trp Pro His Asp Ala Ser Asp Pro Glu Thr Tyr Trp Gly Tyr Val 145 150 155 160

Leu Thr Met Gly Ser Ser Glu Gly Asn Leu Tyr Gly Leu Trp Asn Ala 165 170 175

Arg Asp Tyr Leu Ser Gly Lys Leu Leu Arg Arg Gln His Arg Glu Ala 180 185 190

Gly Gly Asp Lys Ala Ser Val Val Tyr Thr Gln Ala Leu Arg His Glu 195 200 205

Gly Gln Ser Pro His Ala Tyr Glu Pro Val Ala Phe Phe Ser Gln Asp 210 215 220

Thr His Tyr Ser Leu Thr Lys Ala Val Arg Val Leu Gly Ile Asp Thr 225 230 235 240

Phe His Ser Ile Gly Ser Ser Arg Tyr Pro Asp Glu Asn Pro Leu Gly 245 250 255

Pro Gly Thr Pro Trp Pro Thr Glu Val Pro Ser Val Asp Gly Ala Ile 260 265 270

Asp Val Asp Lys Leu Ala Ser Leu Val Arg Phe Phe Ala Ser Lys Gly 275 280 285

Tyr Pro Ile Leu Val Ser Leu Asn Tyr Gly Ser Thr Phe Lys Gly Ala 290 295 300

Tyr Asp Asp Val Pro Ala Val Ala Gln Ala Val Arg Asp Ile Cys Thr 305 310 315 320

Glu Tyr Gly Leu Asp Arg Arg Arg Val Tyr His Asp Arg Ser Lys Asp 325 330 335

Ser Asp Phe Asp Glu Arg Ser Gly Phe Trp Ile His Ile Asp Ala Ala 340 345 350

Leu Gly Ala Gly Tyr Ala Pro Tyr Leu Gln Met Ala Arg Asp Ala Gly 355 360 365

Met Val Glu Glu Ala Pro Pro Val Phe Asp Phe Arg Leu Pro Glu Val 370 375 380

His Ser Leu Thr Met Ser Gly His Lys Trp Met Gly Thr Pro Trp Ala 385 390 395 400

Cys Gly Val Tyr Met Thr Arg Thr Gly Leu Gln Met Thr Pro Pro Lys 405 410 415

Ser Ser Glu Tyr Ile Gly Ala Ala Asp Thr Thr Phe Ala Gly Ser Arg 420 425 430

Asn Gly Phe Ser Ser Leu Leu Leu Trp Asp Tyr Leu Ser Arg His Ser 435 440 445 Tyr Asp Asp Leu Val Arg Leu Ala Ala Asp Cys Asp Arg Leu Ala Gly 450 455 460

Tyr Ala His Asp Arg Leu Leu Thr Leu Gln Asp Lys Leu Gly Met Asp 465 470 475 480

Leu Trp Val Ala Arg Ser Pro Gln Ser Leu Thr Val Arg Phe Arg Gln 485 490 495

Pro Cys Ala Asp Ile Val Arg Lys Tyr Ser Leu Ser Cys Glu Thr Val 500 505 510

Tyr Glu Asp Asn Glu Gln Arg Thr Tyr Val His Leu Tyr Ala Val Pro 515 520 525

His Leu Thr Arg Glu Leu Val Asp Glu Leu Val Arg Asp Leu Arg Gln 530 535 540

Pro Gly Ala Phe Thr Asn Ala Gly Ala Leu Glu Gly Glu Ala Trp Ala 545 550 555 560

Gly Val Ile Asp Ala Leu Gly Arg Pro Asp Pro Asp Gly Thr Tyr Ala 565 570 575

Gly Ala Leu Ser Ala Pro Ala Ser Gly Pro Arg Ser Glu Asp Gly Gly 580 585 590

Gly Ser

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720

<210> 247

<211> 1323

<212> DNA

<213> Alcaligenes denitrificans

<400> 247 atgagcgctg ccaaactgcc cgacctgtcc cacctctgga tgccctttac cgccaaccgg cagttcaagg cgaacccccg cctgctggcc tcggccaagg gcatgtacta cacgtctttc gacggccgcc agatcctgga cggcacggcc ggcctgtggt gcgtgaacgc cggccactgc cgcgaagaaa tcgtctccgc catcgccagc caggccggcg tcatggacta cgcgccgggg ttccagctcg gccacccgct ggccttcgag gccgccaccg ccgtggccgg cctgatgccg cagggcctgg accgcgtgtt cttcaccaat tcgggctccg aatcggtgga caccgcgctg aagatcgccc tggcctacca ccgcgcgcgc ggcgaggcgc agcgcacccg cctcatcggg cgcgagcgcg gctaccacgg cgtgggcttc ggcggcattt ccgtgggcgg catctcgccc aaccgcaaga ccttctccgg cgcgctgctg ccggccgtgg accacctgcc gcacacccac agcctggaac acaacgcctt cacgcgcggc cagcccgagt ggggcgcgca cctggccgac gagttggaac gcatcatcgc cctgcacgac gcctccacca tcgcggccgt gatcgtcgag cccatggccg gctccaccgg cgtgctcgtc ccgcccaagg gctatctcga aaaactgcgc gaaatcaccg cccgccacgg cattctgctg atcttcgacg aagtcatcac cgcgtacggc 780

cgcctgggcg aggccaccgc cgcggcctat ttcggcgtaa cgcccgacct catcaccatg 840

gccaagggcg tgagcaacgc cgccgttccg gccggcgccg tcgcggtgcg ccgcgaagtg 900

catgacgcca tcgtcaacgg accgcaaggc ggcatcgagt tcttccacgg ctacacctac 960

tcggcccacc cgctggccgc cgccgccgtg ctcgccacgc tggacatcta ccgccgcgaa 1020

gacctgttcg cccgcgcccg caagctgtcg gccgcgttcg aggaagccgc ccacagcctc 1080

aagggcgcgc cgcacgtcat cgacgtgcgc aacatcggcc tggtggccgg catcgagctg 1140

tcgccgcgcg aaggcgcccc gggcgcgcgc gccgccgaag ccttccagaa atgcttcgac 1200

accggcctca tggtgcgcta cacgggcgac atcctcgcgg tgtcgcctcc gctcatcgtc 1260

gacgaaaacc agatcggcca gatcttcgag ggcatcggca aggtgctcaa ggaagtggct 1320

tag 1323

<210> 248 <211> 440 <212> PRT

<213> ômega aminoácido: piruvato-transaminase <4 00> 248

Met Ser Ala Ala Lys Leu Pro Asp Leu Ser His Leu Trp Met Pro Phe 15 10 15

Thr Ala Asn Arg Gln Phe Lys Ala Asn Pro Arg Leu Leu Ala Ser Ala 20 25 30

Lys Gly Met Tyr Tyr Thr Ser Phe Asp Gly Arg Gln Ile Leu Asp Gly 35 40 45

Thr Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Ala Gly His Cys Arg Glu Glu Ile 50 55 60

Val Ser Ala Ile Ala Ser Gln Ala Gly Val Met Asp Tyr Ala Pro Gly 65 70 75 80

Phe Gln Leu Gly His Pro Leu Ala Phe Glu Ala Ala Thr Ala Val Ala 85 90 95

Gly Leu Met Pro Gln Gly Leu Asp Arg Val Phe Phe Thr Asn Ser Gly 100 105 110

Ser Glu Ser Val Asp Thr Ala Leu Lys Ile Ala Leu Ala Tyr His Arg 115 120 125

Ala Arg Gly Glu Ala Gln Arg Thr Arg Leu Ile Gly Arg Glu Arg Gly 130 135 140

Tyr His Gly Val Gly Phe Gly Gly Ile Ser Val Gly Gly Ile Ser Pro 145 150 155 160 Asn Arg Lys Thr Phe Ser Gly Ala Leu Leu Pro Ala Val Asp His Leu

165 170 175

Pro His Thr His Ser Leu Glu His Asn Ala Phe Thr Arg Gly Gln Pro

180 185 190

Glu Trp Gly Ala His Leu Ala Asp Glu Leu Glu Arg Ile Ile Ala Leu 195 200 205

His Asp Ala Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Met Ala Gly 210 215 220

Ser Thr Gly Val Leu Val Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Glu Lys Leu Arg 225 230 235 240

Glu Ile Thr Ala Arg His Gly Ile Leu Leu Ile Phe Asp Glu Val Ile 245 250 255

Thr Ala Tyr Gly Arg Leu Gly Glu 260

Val Thr Pro Asp Leu Ile Thr Met 275 280

Val Pro Ala Gly Ala Val Ala Val 290 295

Val Asn Gly Pro Gln Gly Gly Ile 305 310

Ala Thr Ala Ala Ala Tyr Phe Gly 265 270

Ala Lys Gly Val Ser Asn Ala Ala 285

Arg Arg Glu Val His Asp Ala Ile 300

Glu Phe Phe His Gly Tyr Thr Tyr 315 320

Ser Ala His Pro Leu Ala Ala Ala Ala Val Leu Ala Thr Leu Asp Ile 325 330 335

Tyr Arg Arg Glu Asp Leu Phe Ala Arg Ala Arg Lys Leu Ser Ala Ala 340 345 350

Phe Glu Glu Ala Ala His Ser Leu Lys Gly Ala Pro His Val Ile Asp 355 360 365

Val Arg Asn Ile Gly Leu Val Ala Gly Ile Glu Leu Ser Pro Arg Glu 370 375 380

Gly Ala Pro Gly Ala Arg Ala Ala Glu Ala Phe Gln Lys Cys Phe Asp 385 390 395 400

Thr Gly Leu Met Val Arg Tyr Thr Gly Asp Ile Leu Ala Val Ser Pro 405 410 415

Pro Leu Ile Val Asp Glu Asn Gln Ile Gly Gln Ile Phe Glu Gly Ile 420 425 430

Gly Lys Val Leu Lys Glu Val Ala 435 440

<210> 249

<211> 1332

<212> DNA

<213> Ralstonia eutropha <400> 249

atggacgccg cgaagaccgt gattcccgat ctcgatgccc tgtggatgcc ctttaccgcg 60

aaccgccagt acaaggcggc gccgcgcctg ctggcctcgg ccagcggcat gtactacacc 120

acccacgacg gacgccagat cctcgacggt tgcgcgggcc tctggtgcgt agcggccggc 180

cactgccgca aggagattgc cgaggccgtg gcccgccagg ccgccacgct cgactacgcg 24 0

ccgccgttcc agatgggcca tccgctgtcg ttcgaagccg ccaccaaggt ggccgcgatc 300

atgccgcagg gactggaccg catcttcttc acgaattccg gttcggaatc ggtggacacc 360

gcgctgaaga ttgcgctggc ctaccaccgt gcgcgcggcg agggccagcg cacccgcttc 420

atcgggcgcg aacgcggtta ccacggcgtg ggctttggcg gcatggctgt cggtggcatc 480

gggccgaacc gcaaggcgtt ctcggccaac ctgatgccgg gcaccgacca tctgccggcg 540

acgctgaata tcgccgaagc ggcgttctcc aagggtcagc cgacatgggg cgcgcacctt 600

gccgacgaac tcgagcgcat cgtcgcgctg catgatccgt ccacgattgc cgccgtcatc 660

gtggaaccgc tggcgggctc cgccggggtg ctggtgccgc cggtcggcta cctcgacaag 720

ctgcgcgaga tcacgaccaa gcacggcatc ctgctgatct tcgacgaggt catcacggcc 780

tttggtcgcc tgggtaccgc caccgcggcg gaacgcttca aggtcacgcc ggacctgatc 840

accatggcca aggccatcaa caacgccgcc gtgccgatgg gtgccgtggc cgtgcgccgc 900

gaagtccatg acaccgtggt caactcggcc gcgccgggcg cgatcgaact cgcgcatggc 960

tacacctact cgggccaccc gctggccgcc gccgctgcca tcgccacgct ggacctgtat 1020

cagcgcgaga acctgttcgg ccgtgccgcg gagctgtcgc cggtgttcga agcggccgtt 1080

cacagcgtac gcagcgcgcc gcatgtgaag gacatccgca acctcggcat ggtggccggc 1140

atcgagctgg agccgcgtcc gggccagccc ggcgcacgcg cctacgaagc cttcctcaaa 1200

tgccttgagc gtggcgtgct ggtgcgctac accggcgata tcctcgcgtt ctcgccgccg 1260

ctgatcatca gcgaggcgca gattgccgag ctgttcgata cggtcaagca ggccttgcag 1320

gaagtgcagt aa 1332

<210> 250 <211> 443 <212> PRT

<213> Ralstonia eutropha <4 00> 250

Met Asp Ala Ala Lys Thr Val Ile Pro Asp Leu Asp Ala Leu Trp Met 15 10 15

Pro Phe Thr Ala Asn Arg Gln Tyr Lys Ala Ala Pro Arg Leu Leu Ala 20 25 30 Ser Ala Ser Gly Met Tyr Tyr Thr Thr His Asp Gly Arg Gln Ile Leu 35 40 45

Asp Gly Cys Ala Gly Leu Trp Cys Val Ala Ala Gly His Cys Arg Lys 50 55 60

Glu Ile Ala Glu Ala Val Ala Arg Gln Ala Ala Thr Leu Asp Tyr Ala 65 70 75 80

Pro Pro Phe Gln Met Gly His Pro Leu Ser Phe Glu Ala Ala Thr Lys 85 90 95

Val Ala Ala Ile Met Pro Gln Gly Leu Asp Arg Ile Phe Phe Thr Asn 100 105 110

Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Ala Leu Lys Ile Ala Leu Ala Tyr 115 120 125

His Arg Ala Arg Gly Glu Gly Gln Arg Thr Arg Phe Ile Gly Arg Glu 130 135 140

Arg Gly Tyr His Gly Val Gly Phe Gly Gly Met Ala Val Gly Gly Ile 145 150 155 160

Gly Pro Asn Arg Lys Ala Phe Ser Ala Asn Leu Met Pro Gly Thr Asp 165 170 175

His Leu Pro Ala Thr Leu Asn Ile Ala Glu Ala Ala Phe Ser Lys Gly 180 185 190

Gln Pro Thr Trp Gly Ala His Leu Ala Asp Glu Leu Glu Arg Ile Val 195 200 205

Ala Leu His Asp Pro Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Leu 210 215 220

Ala Gly Ser Ala Gly Val Leu Val Pro Pro Val Gly Tyr Leu Asp Lys 225 230 235 240

Leu Arg Glu Ile Thr Thr Lys His Gly Ile Leu Leu Ile Phe Asp Glu 245 250 255

Val Ile Thr Ala Phe Gly Arg Leu Gly Thr Ala Thr Ala Ala Glu Arg 260 265 270

Phe Lys Val Thr Pro Asp Leu Ile Thr Met Ala Lys Ala Ile Asn Asn 275 280 285

Ala Ala Val Pro Met Gly Ala Val Ala Val Arg Arg Glu Val His Asp 290 295 300

Thr Val Val Asn Ser Ala Ala Pro Gly Ala Ile Glu Leu Ala His Gly 305 310 315 320

Tyr Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Thr 325 330 335

Leu Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Asn Leu Phe Gly Arg Ala Ala Glu Leu 340 345 350 Ser Pro Val Phe Glu Ala Ala Val His Ser Val Arg Ser Ala Pro His 355 360 365

Val Lys Asp Ile Arg Asn Leu Gly Met Val Ala Gly Ile Glu Leu Glu 370 375 380

Pro Arg Pro Gly Gln Pro Gly Ala Arg Ala Tyr Glu Ala Phe Leu Lys 385 390 395 400

Cys Leu Glu Arg Gly Val Leu Val Arg Tyr Thr Gly Asp Ile Leu Ala 405 410 415

Phe Ser Pro Pro Leu Ile Ile Ser Glu Ala Gln Ile Ala Glu Leu Phe 420 425 430

Asp Thr Val Lys Gln Ala Leu Gln Glu Val Gln 435 440

<210> 251

<211> 1341

<212> DNA

<213> ShewanelIa oneidensis

<4 00> 251

atggccgact cacccaacaa cctcgctcac gaacatcctt cacttgaaca ctattggatg 60 ccttttaccg ccaatcgcca attcaaagcg agccctcgtt tactcgccca agctgaaggt 120 atgtattaca cagatatcaa tggcaacaag gtattagact ctacagcggg cttatggtgt 180 tgtaatgctg gccatggtcg ccgtgagatc agtgaagccg tcagcaaaca aattcggcag 240 atggattacg ctccctcctt ccaaatgggc catcccatcg cttttgaact ggccgaacgt 300 ttaaccgaac tcagcccaga aggactcaac aaagtattct ttaccaactc aggctctgag 360 tcggttgata ccgcgctaaa aatggctctt tgctaccata gagccaatgg ccaagcgtca 420 cgcacccgct ttattggccg tgaaatgggt taccatggcg taggatttgg tgggatctcg 480 gtgggtggtt taagcaataa ccgtaaagcc ttcagcggcc agctattgca aggcgtggat 540 cacctgcccc acaccttaga cattcaacat gccgccttta gtcgtggctt accgagcctc 600 ggtgctgaaa aagctgaggt attagaacaa ttagtcacac tccatggcgc cgaaaatatt 660 gccgccgtta ttgttgaacc catgtcaggt tctgcagggg taattttacc acctcaaggc 720 tacttaaaac gcttacgtga aatcactaaa aaacacggca tcttattgat tttcgatgaa 780 gtcattaccg catttggccg tgtaggtgca gcattcgcca gccaacgttg gggcgttatt 840 ccagacataa tcaccacggc taaagccatt aataatggcg ccatccccat gggcgcagtg 900 tttgtacagg attatatcca cgatacttgc atgcaagggc caaccgaact gattgaattt 960 ttccacggtt atacctattc gggccaccca gtcgccgcag cagcagcact cgccacgctc 1020 tccatctacc aaaacgagca actgtttgag cgcagttttg agcttgagcg gtatttcgaa 1080 gaagccgttc atagcctcaa agggttaccg aatgtgattg atattcgcaa caccggatta 1140

gtcgcgggtt tccagctagc accgaatagc caaggtgttg gtaaacgcgg atacagcgtg 1200

ttcgagcatt gtttccatca aggcacactc gtgcgggcaa cgggcgatat tatcgccatg 1260

tccccaccac tcattgttga gaaacatcag attgaccaaa tggtaaatag ccttagcgat 1320

gcaattcacg ccgttggatg a 1341

210> 252 <211> 446 <212> PRT

<213> beta-alanina piruvato transaminase <400> 252

Met Ala Asp Ser Pro Asn Asn Leu Ala His Glu His Pro Ser Leu Glu 1 5 10 15

His Tyr Trp Met Pro Phe Thr Ala Asn Arg Gln Phe Lys Ala Ser Pro 20 25 30

Arg Leu Leu Ala Gln Ala Glu Gly Met Tyr Tyr Thr Asp Ile Asn Gly 35 40 45

Asn Lys Val Leu Asp Ser Thr Ala Gly Leu Trp Cys Cys Asn Ala Gly 50 55 60

His Gly Arg Arg Glu Ile Ser Glu Ala Val Ser Lys Gln Ile Arg Gln 65 70 75 80

Met Asp Tyr Ala Pro Ser Phe Gln Met Gly His Pro Ile Ala Phe Glu 85 90 95

Leu Ala Glu Arg Leu Thr Glu Leu Ser Pro Glu Gly Leu Asn Lys Val 100 105 110

Phe Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Ala Leu Lys Met 115 120 125

Ala Leu Cys Tyr His Arg Ala Asn Gly Gln Ala Ser Arg Thr Arg Phe 130 135 140

Ile Gly Arg Glu Met Gly Tyr His Gly Val Gly Phe Gly Gly Ile Ser 145 150 155 160

Val Gly Gly Leu Ser Asn Asn Arg Lys Ala Phe Ser Gly Gln Leu Leu 165 170 175

Gln Gly Val Asp His Leu Pro His Thr Leu Asp Ile Gln His Ala Ala 180 185 190

Phe Ser Arg Gly Leu Pro Ser Leu Gly Ala Glu Lys Ala Glu Val Leu 195 200 205

Glu Gln Leu Val Thr Leu His Gly Ala Glu Asn Ile Ala Ala Val Ile 210 215 220 162

Val Glu Pro Met Ser Gly Ser Ala Gly Val Ile Leu Pro Pro Gln Gly 225 230 235 240

Tyr Leu Lys Arg Leu Arg Glu Ile Thr Lys Lys His Gly Ile Leu Leu 245 250 255

Ile Phe Asp Glu Val Ile Thr Ala Phe Gly Arg Val Gly Ala Ala Phe 260 265 270

Ala Ser Gln Arg Trp Gly Val Ile Pro Asp Ile Ile Thr Thr Ala Lys 275 280 285

Ala Ile Asn Asn Gly Ala Ile Pro Met Gly Ala Val Phe Val Gln Asp 290 295 300

Tyr Ile His Asp Thr Cys Met Gln Gly Pro Thr Glu Leu Ile Glu Phe 305 310 315 320

Phe His Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Ala Ala 325 330 335

Leu Ala Thr Leu Ser Ile Tyr Gln Asn Glu Gln Leu Phe Glu Arg Ser 340 345 350

Phe Glu Leu Glu Arg Tyr Phe Glu Glu Ala Val His Ser Leu Lys Gly 355 360 365

Leu Pro Asn Val Ile Asp Ile Arg Asn Thr Gly Leu Val Ala Gly Phe 370 375 380

Gln Leu Ala Pro Asn Ser Gln Gly Val Gly Lys Arg Gly Tyr Ser Val 385 390 395 400

Phe Glu His Cys Phe His Gln Gly Thr Leu Val Arg Ala Thr Gly Asp 405 410 415

Ile Ile Ala Met Ser Pro Pro Leu Ile Val Glu Lys His Gln Ile Asp 420 425 430

Gln Met Val Asn Ser Leu Ser Asp Ala Ile His Ala Val Gly 435 440 445

<210> 253 <211> 1347 <212> DNA

<213> Pseudomonas putida <400> 253

atgaacatgc ccgaaactgg tcctgccggt atcgccagcc agctcaagct ggacgcccac 60 tggatgccct acaccgccaa ccgcaacttc cagcgcgacc cacgcctgat cgtggcggcc 120 gaaggcaact acctggtcga tgaccacggg cgcaagatct tcgacgccct gtccggcctg 180 tggacctgcg gcgcagggca cactcgcaag gaaatcgctg acgcggtgac ccgtcaactg 240 agtacgctgg actactcccc agcgttccag ttcggccacc cgctgtcgtt ccagctggcg 300 gaaaagatcg ccgagctggt tccgggcaat ctgaatcacg tcttctatac caactccggt 360 tccgagtgcg ccgataccgc actgaagatg gtgcgtgcct actggcgcct gaaaggccag 420 gcaaccaaga ccaagatcat cggccgtgcc cgtggttacc atggcgtgaa catcgccggt 480 accagcctgg gtggcgtcaa cggtaaccgc aagatgtttg gccagctgct ggacgtcgac 540 cacctgcctc acactgtatt gccggtgaac gccttctcga aaggcttgcc ggaagagggc 600 ggtatcgcgc tggctgacga aatgctcaag ctgatcgagc tgcacgatgc ctccaacatc 660 gcagcagtca tcgtcgagcc gctggccggt tcggccggtg tgctgccgcc gccaaagggt 720 tacctgaagc gcctgcgtga aatctgcacc cagcacaaca ttctgctgat cttcgacgaa 780 gtgatcacag gcttcggccg catgggcgcg atgaccggct cggaagcctt cggcgttacc 840 ccggacctga tgtgcatcgc caagcaggtg accaacggcg ccatcccgat gggcgcagtg 900 attgccagca gcgagatcta ccagaccttc atgaaccagc cgaccccgga atacgccgtg 960 gaattcccac acggctacac ctattcggcg cacccggtag cctgtgccgc cggtctcgcc 1020 gcgctggacc tgctgcagaa ggaaaacctg gtgcagtccg cggctgaact ggcgccgcat 1080 ttcgagaagc tgctgcacgg cgtgaagggc accaagaata tcgtcgatat ccgcaactac 1140 ggcctggccg gcgccatcca gatcgccgcc cgtgacggtg atgccatcgt tcgcccttac 1200 gaagcggcca tgaagctgtg gaaagcgggc ttctatgtac gctttggtgg cgacaccctg 1260 cagttcggcc caaccttcaa taccaagccg caggaactgg accgcttgtt cgatgctgtt 1320 ggcgaaaccc tgaacctgat cgactga 1347

<210> 254

<211> 448

<212> PRT

<213> Pseudomonas putida

<400> 254

Met Asn Met Pro Glu Thr Gly Pro Ala Gly Ile Ala Ser Gln Leu Lys 1 5 10 15

Leu Asp Ala His Trp Met Pro Tyr Thr Ala Asn Arg Asn Phe Gln Arg 20 25 30

Asp Pro Arg Leu Ile Val Ala Ala Glu Gly Asn Tyr Leu Val Asp Asp 35 40 45

His Gly Arg Lys Ile Phe Asp Ala Leu Ser Gly Leu Trp Thr Cys Gly 50 55 60

Ala Gly His Thr Arg Lys Glu Ile Ala Asp Ala Val Thr Arg Gln Leu 65 70 75 80

Ser Thr Leu Asp Tyr Ser Pro Ala Phe Gln Phe Gly His Pro Leu Ser 85 90 95 Phe Gln Leu Ala 100

His Val Phe Tyr 115

Lys Met Val Arg 130

Lys Ile Ile Gly 145

Thr Ser Leu Gly

Leu Asp Val Asp 180

Ser Lys Gly Leu 195

Leu Lys Leu Ile 210

Val Glu Pro Leu 225

Tyr Leu Lys Arg

Ile Phe Asp Glu 260

Gly Ser Glu Ala 275

Gln Val Thr Asn 290

Glu Ile Tyr Gln 305

Glu Phe Pro His

Ala Gly Leu Ala 340

Ser Ala Ala Glu 355

Lys Gly Thr Lys 370

Ala Ile Gln Ile 385

Glu Ala Ala Met

Glu Lys Ile Ala

Thr Asn Ser Gly 120

Ala Tyr Trp Arg 135

Arg Ala Arg Gly 150

Gly Val Asn Gly 165

His Leu Pro His

Pro Glu Glu Gly 200

Glu Leu His Asp 215

Ala Gly Ser Ala 230

Leu Arg Glu Ile 245

Val Ile Thr Gly

Phe Gly Val Thr 280

Gly Ala Ile Pro 295

Thr Phe Met Asn 310

Gly Tyr Thr Tyr 325

Ala Leu Asp Leu

Leu Ala Pro His 360

Asn Ile Val Asp 375

Ala Ala Arg Asp 390

Lys Leu Trp Lys 405

Glu Leu Val Pro 105

Ser Glu Cys Ala

Leu Lys Gly Gln 140

Tyr His Gly Val 155

Asn Arg Lys Met 170

Thr Val Leu Pro 185

Gly Ile Ala Leu

Ala Ser Asn Ile 220

Gly Val Leu Pro 235

Cys Thr Gln His 250

Phe Gly Arg Met 265

Pro Asp Leu Met

Met Gly Ala Val 300

Gln Pro Thr Pro 315

Ser Ala His Pro 330

Leu Gln Lys Glu 345

Phe Glu Lys Leu

Ile Arg Asn Tyr 380

Gly Asp Ala Ile 395

Ala Gly Phe Tyr 410

Gly Asn Leu Asn 110

Asp Thr Ala Leu 125

Ala Thr Lys Thr

Asn Ile Ala Gly 160

Phe Gly Gln Leu 175

Val Asn Ala Phe 190

Ala Asp Glu Met 205

Ala Ala Val Ile

Pro Pro Lys Gly 240

Asn Ile Leu Leu 255

Gly Ala Met Thr 270

Cys Ile Ala Lys 285

Ile Ala Ser Ser

Glu Tyr Ala Val 320

Val Ala Cys Ala 335

Asn Leu Val Gln 350

Leu His Gly Val 365

Gly Leu Ala Gly

Val Arg Pro Tyr 400

Val Arg Phe Gly 415 Gly Asp Thr Leu Gln Phe Gly Pro Thr Phe Asn Thr Lys Pro Gln Glu 420 425 430

Leu Asp Arg Leu Phe Asp Ala Val Gly Glu Thr Leu Asn Leu Ile Asp 435 440 445

<210> 255 <211> 1701 <212> DNA

<213> Streptomyces cinnamonensis <400> 255

atggacgctg acgcgatcga ggaaggccgc cgacgctggc aggcccgtta cgacaaggcc 60 cgcaagcgcg acgcggactt caccacgctc tccggggacc ccgtcgaccc cgtctacggc 120 ccccggcccg gggacacgta cgacgggttc gagcggatcg gctggccggg ggagtacccc 180 ttcacccgcg ggctctacgc caccgggtac cgcggccgca cctggaccat ccgccagttc 240 gccggcttcg gcaacgccga gcagacgaac gagcgctaca agatgatcct ggccaacggc 300 ggcggcggcc tctccgtcgc cttcgacatg ccgaccctca tgggccgcga ctccgacgac 360 ccgcgctcgc tcggcgaggt cggccactgc ggtgtcgcca tcgactccgc cgccgacatg 420 gaggtcctct tcaaggacat cccgctcggc gacgtcacga cgtccatgac catcagcggg 480 cccgccgtgc ccgtcttctg catgtacctc gtcgcggccg agcgccaggg cgtcgacccg 540 gccgtcctca acggcacgct gcagaccgac atcttcaagg agtacatcgc ccagaaggag 600 tggctcttcc agcccgagcc gcacctgcgc ctcatcggcg acctgatgga gcactgcgcg 660 cgcgacatcc ccgcgtacaa gccgctctcg gtctccggct accacatccg cgaggccggg 720 gcgacggccg cgcaggagct cgcgtacacc ctcgcggacg gcttcgggta cgtggaactg 780 ggcctctcgc gcggcctgga cgtggacgtc ttcgcgcccg gcctctcctt cttcttcgac 840 gcgcacgtcg acttcttcga ggagatcgcg aagttccgcg ccgcacgccg catctgggcg 900 cgctggctcc gggacgagta cggagcgaag accgagaagg cacagtggct gcgcttccac 960 acgcagaccg cgggggtctc gctcacggcc cagcagccgt acaacaacgt ggtgcggacg 1020 gcggtggagg ccctcgccgc ggtgctcggc ggcacgaact ccctgcacac caacgctctc 1080 gacgagaccc ttgccctccc cagcgagcag gccgcggaga tcgcgctgcg cacccagcag 1140 gtgctgatgg aggagaccgg cgtcgccaac gtcgcggacc cgctgggcgg ctcctggtac 1200 atcgagcagc tcaccgaccg catcgaggcc gacgccgaga agatcttcga gcagatcagg 1260 gagcgggggc ggcgggcctg ccccgacggg cagcacccga tcgggccgat cacctccggc 1320 atcctgcgcg gcatcgagga cggctggttc accggcgaga tcgccgagtc cgccttccag 1380 taccagcggt ccctggagaa gggcgacaag cgggtcgtcg gcgtcaactg cctcgaaggc 14 4 0 tccgtcaccg gcgacctgga gatcctgcgc gtcagccacg aggtcgagcg cgagcaggtg 1500

cgggagcttg cggggcgcaa ggggcggcgt gacgatgcgc gggtgcgggc ctcgctcgac 1560

gcgatgctcg ccgctgcgcg ggacgggtcg aacatgattg cccccatgct ggaggcggtg 1620

cgggccgagg cgaccctcgg ggagatctgc ggggtgcttc gcgatgagtg gggggtctac 1680

gtggagccgc ccgggttctg a 1701

<210> 256 <211> 566 <212> PRT

<213> Streptomyces cinnamonensis <400> 256

Met Asp Ala Asp Ala Ile Glu Glu Gly Arg Arg Arg Trp Gln Ala Arg 1 5 10 15

Tyr Asp Lys Ala Arg Lys Arg Asp Ala Asp Phe Thr Thr Leu Ser Gly 20 25 30

Asp Pro Val Asp Pro Val Tyr Gly Pro Arg Pro Gly Asp Thr Tyr Asp 35 40 45

Gly Phe Glu Arg Ile Gly Trp Pro Gly Glu Tyr Pro Phe Thr Arg Gly 50 55 60

Leu Tyr Ala Thr Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Trp Thr Ile Arg Gln Phe 65 70 75 80

Ala Gly Phe Gly Asn Ala Glu Gln Thr Asn Glu Arg Tyr Lys Met Ile 85 90 95

Leu Ala Asn Gly Gly Gly Gly Leu Ser Val Ala Phe Asp Met Pro Thr 100 105 110

Leu Met Gly Arg Asp Ser Asp Asp Pro Arg Ser Leu Gly Glu Val Gly 115 120 125

His Cys Gly Val Ala Ile Asp Ser Ala Ala Asp Met Glu Val Leu Phe 130 135 140

Lys Asp Ile Pro Leu Gly Asp Val Thr Thr Ser Met Thr Ile Ser Gly 145 150 155 160

Pro Ala Val Pro Val Phe Cys Met Tyr Leu Val Ala Ala Glu Arg Gln 165 170 175

Gly Val Asp Pro Ala Val Leu Asn Gly Thr Leu Gln Thr Asp Ile Phe 180 185 190

Lys Glu Tyr Ile Ala Gln Lys Glu Trp Leu Phe Gln Pro Glu Pro His 195 200 205

Leu Arg Leu Ile Gly Asp Leu Met Glu His Cys Ala Arg Asp Ile Pro 210 215 220 Ala Tyr Lys Pro Leu Ser Val Ser Gly Tyr His Ile Arg Glu Ala Gly 225 230 235 240

Ala Thr Ala Ala Gln Glu Leu Ala Tyr Thr Leu Ala Asp Gly Phe Gly 245 250 255

Tyr Val Glu Leu Gly Leu Ser Arg Gly Leu Asp Val Asp Val Phe Ala 260 265 270

Pro Gly Leu Ser Phe Phe Phe Asp Ala His Val Asp Phe Phe Glu Glu 275 280 285

Ile Ala Lys Phe Arg Ala Ala Arg Arg Ile Trp Ala Arg Trp Leu Arg 290 295 300

Asp Glu Tyr Gly Ala Lys Thr Glu Lys Ala Gln Trp Leu Arg Phe His 305 310 315 320

Thr Gln Thr Ala Gly 325

Val Val Arg Thr Ala 340

Asn Ser Leu His Thr 355

Glu Gln Ala Ala Glu 370

Glu Thr Gly Val Ala 385

Ile Glu Gln Leu Thr 405

Glu Gln Ile Arg Glu 420

Pro Ile Gly Pro Ile 435

Trp Phe Thr Gly Glu 450

Leu Glu Lys Gly Asp 465

Val Ser Leu Thr Ala Gln 330

Val Glu Ala Leu Ala Ala 345

Asn Ala Leu Asp Glu Thr 360

Ile Ala Leu Arg Thr Gln 375

Asn Val Ala Asp Pro Leu 390 395

Asp Arg Ile Glu Ala Asp 410

Arg Gly Arg Arg Ala Cys 425

Thr Ser Gly Ile Leu Arg 440

Ile Ala Glu Ser Ala Phe 455

Lys Arg Val Val Gly Val 470 475

Gln Pro Tyr Asn Asn 335

Val Leu Gly Gly Thr 350

Leu Ala Leu Pro Ser 365

Gln Val Leu Met Glu 380

Gly Gly Ser Trp Tyr 400

Ala Glu Lys Ile Phe 415

Pro Asp Gly Gln His 430

Gly Ile Glu Asp Gly 445

Gln Tyr Gln Arg Ser 460

Asn Cys Leu Glu Gly 480

Ser Val Thr Gly Asp Leu Glu Ile Leu Arg Val Ser His Glu Val Glu 485 490 495

Arg Glu Gln Val Arg Glu Leu Ala Gly Arg Lys Gly Arg Arg Asp Asp

500 505 510

Ala Arg Val Arg Ala Ser Leu Asp Ala Met Leu Ala Ala Ala Arg Asp 515 520 525

Gly Ser Asn Met Ile Ala Pro Met Leu Glu Ala Val Arg Ala Glu Ala

530 535 540 Thr Leu Gly Glu Ile Cys Gly Val Leu Arg Asp Glu Trp Gly Val Tyr 545 550 555 560

Val Glu Pro Pro Gly Phe 565

<210> 257 <211> 411 <212> DNA

<213> Streptomyces cinnamonensis <400> 257

atgggtgtgg cagccgggcc gatccgcgtg gtggtcgcca agccggggct cgacgggcac 60

gatcgcgggg ccaaggtgat cgcgcgggcg ttgcgtgacg cgggtatgga ggtcatctac 120

accgggctgc accagacgcc cgagcaggtg gtggacaccg cgatccagga ggacgccgac 180

gcgatcggcc tctccatcct ctccggagcg cacaacacgc tgttcgcgcg cgtgttggag 240

ctcttgaagg agcgggacgc ggaggacatc aaggtgtttg gtggcggcat catcccggag 300

gcggacatcg cgccgctgaa ggagaagggc gtcgcggaga tcttcacgcc cggggccacc 360

accacgtcga tcgtggagtg ggttcggggg aacgtgcgac aggccgtctg a 411

<210> 258

<211> 136

<212> PRT

<213> Streptomyces

<400> 258 Met Gly Val Ala Ala 1 5

Leu Asp Gly His Asp 20

Asp Ala Gly Met Glu 35

Gln Val Val Asp Thr 50

Ser Ile Leu Ser Gly 65

Leu Leu Lys Glu Arg 85

Ile Ile Pro Glu Ala 100

Glu Ile Phe Thr Pro 115

cinnamonens is

Gly Pro Ile Arg Val Val 10

Arg Gly Ala Lys Val Ile 25

Val Ile Tyr Thr Gly Leu 40

Ala Ile Gln Glu Asp Ala 55

Ala His Asn Thr Leu Phe 70 75

Asp Ala Glu Asp Ile Lys 90

Asp Ile Ala Pro Leu Lys 105

Gly Ala Thr Thr Thr Ser 120

Val Ala Lys Pro Gly 15

Ala Arg Ala Leu Arg 30

His Gln Thr Pro Glu 45

Asp Ala Ile Gly Leu 60

Ala Arg Val Leu Glu 80

Val Phe Gly Gly Gly 95

Glu Lys Gly Val Ala 110

Ile Val Glu Trp Val 125

Arg Gly Asn Val 130

Arg Gln Ala Val 135 <210> 259 <211> 1701 <212> DNA

<213> Streptomyces coelícolor <400> 259

atggacgctc atgccataga ggagggccgc cgcaagcgcg acgcggactt caccacgctc ccccgccccg gggacgagta cgagggcttc ttcacccgcg gcctgtatcc gaccgggtac gccgggttcg gcaacgccga gcagaccaac ggcggcgggc tctcggtcgc cttcgacatg ccgcgctcgc tgggcgaggt cgggcactgc gaagtgctgt tcaaggacat cccgctcggg cccgccgtgc ccgtgttctg catgtacctc tccgtgctca acggcacgct gcagaccgac tggctcttcc agcccgagcc ccacctccgg gccggcatcc ccgcctacaa gccgctctcc gcgacggccg cgcaggagct ggcgtacacg ggcctcagcc gcgggctcga cgtggacgtc gcgcacctcg acttcttcga ggagatcgcc cgctggatgc gcgacgtgta cggcgcgcgg acccagaccg ccggagtctc gctcaccgcg gcggtggagg cgctggcggc cgtgctcggc gacgagaccc tcgccctgcc cagcgagcag gtgctgatgg aggagaccgg cgtcgccaac atcgagcagc tgaccgaccg catcgaggcc gagcgggggc tgcgcgccca ccccgacggg ctgctgcgcg gcatcgagga cggctggttc taccagcagt ccttggagaa ggacgacaag tccgtcaccg gcgacctgga gatcctgcgg cgggtcctgg gcgagcgcaa ggacgcccgg gccatgctgg ccgcggcccg ctccggcggc

cttcgctggc aggcccggta cgacgcggcg 60 tccggagacc ccgtggagcc ggtgtacggg 120 gagcggatcg gctggccggg cgagtacccc 180 cgggggcgta cgtggaccat ccggcagttc 240 gagcgctaca agatgatcct ccgcaacggc 300 ccgaccctga tgggccgcga ctccgacgac 360 ggggtggcca tcgactcggc cgccgacatg 420 gacgtgacga cctccatgac gatcagcggg 480 gtcgccgccg agcgccaggg cgtcgacgca 540 atcttcaagg agtacatcgc ccagaaggag 600 ctcatcggcg acctcatgga gtactgcgcg 660 gtctccggct accacatccg cgaggcgggc 720 ctcgccgacg gcttcggata cgtggagctg 780 ttcgcgcccg gcctctcctt cttcttcgac 840 aagttccgcg cggcccgcag gatctgggcc 900 accgacaagg cccagtggct gcggttccac 960 cagcagccgt acaacaacgt cgtacgcacc 1020 ggcaccaact ccctgcacac caacgcgctc 1080 gccgccgaga tcgccctgcg cacccagcag 1140 gtcgccgacc cgctgggcgg ttcctggttc 1200 gacgccgaga agatcttcga gcagatcaag 1260 cagcaccccg tcggaccgat cacctccggc 1320 accggcgaga tcgccgagtc cgccttccgc 1380 aaggtggtcg gcgtcaacgt ccacaccggc 1440 gtcagccacg aggtcgagcg cgagcaggtg 1500 gacgacgccg ccgtgcgcgg cgccctggac 1560 aacatgatcg ggccgatgct ggacgcggtg 1620 cgcgcggagg cgacgctggg cgagatctgc ggtgtgctgc gcgacgagtg gggggtgtac 1680

acggaaccgg cggggttctg a 1701

<210> 260

<211> 566

<212> PRT

<213> Streptomyces coelicolor

<4 00> 260

Met Asp Ala His Ala Ile Glu Glu 1 5

Tyr Asp Ala Ala Arg Lys Arg Asp 20

Asp Pro Val Glu Pro Val Tyr Gly 35 40

Gly Arg Leu Arg Trp Gln Ala Arg 10 15

Ala Asp Phe Thr Thr Leu Ser Gly 25 30

Pro Arg Pro Gly Asp Glu Tyr Glu 45

Gly Phe Glu Arg Ile Gly Trp Pro Gly Glu Tyr Pro Phe Thr Arg Gly 50 55 60

Leu Tyr Pro Thr Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Trp Thr Ile Arg Gln Phe 65 70 75 80

Ala Gly Phe Gly Asn Ala Glu Gln Thr Asn Glu Arg Tyr Lys Met Ile 85 90 95

Leu Arg Asn Gly Gly Gly Gly Leu Ser Val Ala Phe Asp Met Pro Thr 100 105 110

Leu Met Gly Arg Asp Ser Asp Asp Pro Arg Ser Leu Gly Glu Val Gly 115 120 125

His Cys Gly Val Ala Ile Asp Ser Ala Ala Asp Met Glu Val Leu Phe 130 135 140

Lys Asp Ile Pro Leu Gly Asp Val Thr Thr Ser Met Thr Ile Ser Gly 145 150 155 160

Pro Ala Val Pro Val Phe Cys Met Tyr Leu Val Ala Ala Glu Arg Gln' 165 170 175

Gly Val Asp Ala Ser Val Leu Asn Gly Thr Leu Gln Thr Asp Ile Phe 180 185 190

Lys Glu Tyr Ile Ala Gln Lys Glu Trp Leu Phe Gln Pro Glu Pro His 195 200 205

Leu Arg Leu Ile Gly Asp Leu Met Glu Tyr Cys Ala Ala Gly Ile Pro 210 215 220

Ala Tyr Lys Pro Leu Ser Val Ser Gly Tyr His Ile Arg Glu Ala Gly

225 230 235 240

Ala Thr Ala Ala Gln Glu Leu Ala Tyr Thr Leu Ala Asp Gly Phe Gly 245 250 255 Tyr Val Glu Leu Gly Leu Ser Arg Gly Leu Asp Val Asp Val Phe Ala 260 265 270

Pro Gly Leu Ser Phe Phe Phe Asp Ala His Leu Asp Phe Phe Glu Glu 275 280 285

Ile Ala Lys Phe Arg Ala Ala Arg Arg Ile Trp Ala Arg Trp Met Arg 290 295 300

Asp Val Tyr Gly Ala Arg Thr Asp Lys Ala Gln Trp Leu Arg Phe His 305 310 315 320

Thr Gln Thr Ala Gly Val Ser Leu Thr Ala Gln Gln Pro Tyr Asn Asn 325 330 335

Val Val Arg Thr Ala Val Glu Ala Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly Thr 340 345 350

Asn Ser Leu His Thr Asn Ala Leu Asp Glu Thr Leu Ala Leu Pro Ser 355 360 365

Glu Gln Ala Ala Glu Ile Ala Leu Arg Thr Gln Gln Val Leu Met Glu 370 375 380

Glu Thr Gly Val Ala Asn Val Ala Asp Pro Leu Gly Gly Ser Trp Phe 385 390 395 400

Ile Glu Gln Leu Thr Asp Arg Ile Glu Ala Asp Ala Glu Lys Ile Phe 405 410 415

Glu Gln Ile Lys Glu Arg Gly Leu Arg Ala His Pro Asp Gly Gln His 420 425 430

Pro Val Gly Pro Ile Thr Ser Gly Leu Leu Arg Gly Ile Glu Asp Gly 435 440 445

Trp Phe Thr Gly Glu Ile Ala Glu Ser Ala Phe Arg Tyr Gln Gln Ser 450 455 460

Leu Glu Lys Asp Asp Lys Lys Val Val Gly Val Asn Val His Thr Gly 465 470 475 480

Ser Val Thr Gly Asp Leu Glu Ile Leu Arg Val Ser His Glu Val Glu 485 490 495

Arg Glu Gln Val Arg Val Leu Gly Glu Arg Lys Asp Ala Arg Asp Asp 500 505 510

Ala Ala Val Arg Gly Ala Leu Asp Ala Met Leu Ala Ala Ala Arg Ser 515 520 525

Gly Gly Asn Met Ile Gly Pro Met Leu Asp Ala Val Arg Ala Glu Ala 530 535 540

Thr Leu Gly Glu Ile Cys Gly Val Leu Arg Asp Glu Trp Gly Val Tyr 545 550 555 560

Thr Glu Pro Ala Gly Phe 565 <210> 261 <211> 417 <212> DNA

<213> Streptomyces coelicolor <4 00> 261

atgggtgtgg cagccggtcc gatccgcgtg gtggtggcca agccggggct cgacggccac 60

gatcgcgggg ccaaggtgat cgcgagggcc ctgcgtgacg ccggtatgga ggtgatctac 120

accgggctcc accagacgcc cgagcagatc gtcgacaccg cgatccagga ggacgccgac 180

gcgatcgggc tgtccatcct ctccggtgcg cacaacacgc tcttcgccgc cgtgatcgag 240

ctgctccggg agcgggacgc cgcggacatc ctggtcttcg gcggcgggat catccccgag 300

gcggacatcg ccccgctgaa ggagaagggc gtcgcggaga tcttcacgcc cggcgccacc 360

acggcgtcca tcgtggactg ggtccgggcg aacgtgcggg agcccgcggg agcatag 417

<210> 262 <211> 138 <212> PRT

<213> Streptomyces coelicolor <4 00> 262

Met Gly Val Ala Ala Gly Pro Ile Arg Val Val Val Ala Lys Pro Gly 15 10 15

Leu Asp Gly His Asp Arg Gly Ala Lys Val Ile Ala Arg Ala Leu Arg 20 25 30

Asp Ala Gly Met Glu Val Ile Tyr Thr Gly Leu His Gln Thr Pro Glu 35 40 45

Gln Ile Val Asp Thr Ala Ile Gln Glu Asp Ala Asp Ala Ile Gly Leu 50 55 60

Ser Ile Leu Ser Gly Ala His Asn Thr Leu Phe Ala Ala Val Ile Glu 65 70 75 80

Leu Leu Arg Glu Arg Asp Ala Ala Asp Ile Leu Val Phe Gly Gly Gly 85 90 95

Ile Ile Pro Glu Ala Asp Ile Ala Pro Leu Lys Glu Lys Gly Val Ala 100 105 110

Glu Ile Phe Thr Pro Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ile Val Asp Trp Val 115 120 125

Arg Ala Asn Val Arg Glu Pro Ala Gly Ala 130 135

<210> 263

<211> 1701

<212> DNA

<213> Streptomyces avermitilis <400> 263

tcagaaaccg gcgggctccg tgtagacccc gcccagcgtg gcctccgcgc ggaccgcgtc gcgcgcggcg gcgagcatcg cgtccagggc cttccgctcg cccagcaccc gcacctgctc ctccaggtcg cccgtcacgg acccgtggtg cttctccagc gcctgctggt actggaaggc gtcctcgatg ccgcgcagga tgccggaggt gtgggcccgc agcccgcgct ccctgatctg ccggtcggtc agctgctcca cgtaccagga gcccgtctcc tccatcagca cctgctgggt cggcagggcg agggtctcgt cgagggcgtt cgcggcgagg gcctccacgg ccgtccgtac cgagacgccc gcggtctggg tgtggaagcg gtacacgtcc cgcagccagc gcgcccagat ctcgaagaag tcgacgtgcg cgtcgaagaa gtccaggccg cggctcagcc ccagctccac cagctcctgg gcggccgtgg caccggcctc cttgtacgcg gggatcttcg aggcgcagtg gggctcgggc tggaagagcc actccttctg gagggtgccg ttgaggacgg aggggtcgac gcagaagacg ggcacggcgg gcccgctgat gatgtccttg aacaggacct ccatgtcggc gacctcgccg agcgcgcggc ggtcgtcgga ggccacggac agcccaccgc cgccgttggc ctcggcgttg ccgaacccgg cgaactgccg cggatacaga ccgcgcgtga aggggtactc gtacgcgtcc ccgggccggg gcccgtacgc gaaatcggcc tcgcgcttgc gtgaggcgtc ctcgatggcg tcagcgtcca t

ccactcctcc cggaggacat cgcagatctc 60 cagcatcggg gcgatcatgt tcgacccgtc 120 cgcggttacg gccgtgtcgt cgcgccccga 180 gcgctccacc tcgtggctga cgcgcaggat 240 gacgttgacg ccgacgaccc gcttgtcgcc 300 cgactcggcg atctccccgg tgaaccagcc 360 gatgggcccg atcgggtgcc gcccgtccgg 420 ttcgaagatc ttctcggcgt cggcctcgat 480 accgcccagc ggatcggcca cgttggcgac 540 gcgcagggcg atctcggccg cctgctcgga 600 ggtgtgcagc gagttcgtcc cgccgagcac 660 gacgttgttg tacggctgct gcgcggtgag 720 cagccactgc gccttctccg acttcgcccc 780 gcgccgcgcc gcacggaact tggcgatctc 840 gaaggagagc ccgggcgcga acacgtccac 900 gtatccgaaa ccgtcggcga gggtgtacgc 960 ccggatgtgg tacccggaga cggacagcgg 1020 ctccatcagg tcgccgatga gccgcagatg 1080 cgcgatgtac tccttgaaga tgtcggtctg 1140 gccctgccgc tcggccgcga ccaggtacat 1200 cgtcatcgac gtcgtcacgt cacccagcgg 1260 cgccgagtcg atcgcgaccc cgcagtgccc 1320 gtcgcgcccc atgagcgtcg gcatgtcgaa 1380 gaggatcttc ttgtagcgct cgttggtctg 1440 gatggtccag gtccggcccc ggtagccggt 1500 acccggccag ccgatccgct cgaaaccctc 1560 cggctccacg ggatcgccgg agagcgtggt 1620 gtagcgggcc tgccagcgtc ggcggccttc 1680

1701 <210> 264

<211> 566

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 264

Met Asp Ala Asp Ala Ile Glu Glu 1 5

Tyr Asp Ala Ser Arg Lys Arg Glu

Gly Arg Arg Arg Trp Gln Ala Arg 10 15

Ala Asp Phe Thr Thr Leu Ser Gly 25 30

Asp Pro Val Glu Pro Ala Tyr Gly Pro Arg Pro Gly Asp Ala Tyr Glu 35 40 45

Gly Phe Glu Arg Ile Gly Trp Pro 50 55

Leu Tyr Pro Thr Gly Tyr Arg Gly 65 70

Ala Gly Phe Gly Asn Ala Glu Gln 85

Leu Ala Asn Gly Gly Gly Gly Leu 100

Leu Met Gly Arg Asp Ser Asp Asp 115 120

Gly Glu Tyr Pro Phe Thr Arg Gly 60

Arg Thr Trp Thr Ile Arg Gln Phe 75 80

Thr Asn Glu Arg Tyr Lys Lys Ile 90 95

Ser Val Ala Phe Asp Met Pro Thr 105 110

Arg Arg Ala Leu Gly Glu Val Gly 125

His Cys Gly Val Ala Ile Asp Ser Ala Ala Asp Met Glu Val Leu Phe 130 135 140

Lys Asp Ile Pro Leu Gly Asp Val Thr Thr Ser Met Thr Ile Ser Gly 145 150 155 160

Pro Ala Val Pro Val Phe Cys Met Tyr Leu Val Ala Ala Glu Arg Gln 165 170 175

Gly Val Asp Pro Ser Val Leu Asn Gly Thr Leu Gln Thr Asp Ile Phe

180 185 190

Lys Glu Tyr Ile Ala Gln Lys Glu Trp Leu Phe Gln Pro Glu Pro His

195 200 205

Leu Arg Leu Ile Gly Asp Leu Met Glu His Cys Ala Ser Lys Ile Pro

210 215 220

Ala Tyr Lys Pro Leu Ser Val Ser Gly Tyr His Ile Arg Glu Ala Gly

225 230 235 240

Ala Thr Ala Ala Gln Glu Leu Ala Tyr Thr Leu Ala Asp Gly Phe Gly 245 250 255

Tyr Val Glu Leu Gly Leu Ser Arg Gly Leu Asp Val Asp Val Phe Ala 260 265 270 Pro Gly Leu Ser Phe Phe Phe Asp Ala His Val Asp Phe Phe Glu Glu 275 280 285

Ile Ala Lys Phe Arg Ala Ala Arg Arg Ile Trp Ala Arg Trp Leu Arg 290 295 300

Asp Val Tyr Gly Ala Lys Ser Glu Lys Ala Gln Trp Leu Arg Phe His 305 310 315 320

Thr Gln Thr Ala Gly Val Ser Leu Thr Ala Gln Gln Pro Tyr Asn Asn 325 330 335

Val Val Arg Thr Ala Val Glu Ala Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly Thr 340 345 350

Asn Ser Leu His Thr Asn Ala Leu Asp Glu Thr Leu Ala Leu Pro Ser 355 360 365

Glu Gln Ala Ala Glu Ile Ala Leu Arg Thr Gln Gln Val Leu Met Glu 370 375 380

Glu Thr Gly Val Ala Asn Val Ala Asp Pro Leu Gly Gly Ser Trp Tyr 385 390 395 400

Val Glu Gln Leu Thr Asp Arg Ile Glu Ala Asp Ala Glu Lys Ile Phe 405 410 415

Glu Gln Ile Arg Glu Arg Gly Leu Arg Ala His Pro Asp Gly Arg His 420 425 430

Pro Ile Gly Pro Ile Thr Ser Gly Ile Leu Arg Gly Ile Glu Asp Gly 435 440 445

Trp Phe Thr Gly Glu Ile Ala Glu Ser Ala Phe Gln Tyr Gln Gln Ala 450 455 460

Leu Glu Lys Gly Asp Lys Arg Val Val Gly Val Asn Val His His Gly 465 470 475 480

Ser Val Thr Gly Asp Leu Glu Ile Leu Arg Val Ser His Glu Val Glu 485 490 495

Arg Glu Gln Val Arg Val Leu Gly Glu Arg Lys Ser Gly Arg Asp Asp 500 505 510

Thr Ala Val Thr Ala Ala Leu Asp Ala Met Leu Ala Ala Ala Arg Asp 515 520 525

Gly Ser Asn Met Ile Ala Pro Met Leu Asp Ala Val Arg Ala Glu Ala 530 535 540

Thr Leu Gly Glu Ile Cys Asp Val Leu Arg Glu Glu Trp Gly Val Tyr 545 550 555 560

Thr Glu Pro Ala Gly Phe 565

<210> 265 <211> 417 <212> DNA

<213> Streptomyces avermitilis <400> 265

ctacgccccg gcaggctgcc gcacgttcgc ccgcacccac tccacgatcg acgccgtggt 60

cgcccccgga gtgaagatct ccgcgacacc cttctccttc agcggcgcga tgtccgcctc 120

ggggatgatg ccgccaccga acaccttgat gtcctcggca tcgcgctcct tgagcagatc 180

gatgaccgcc gcgaacaacg tgttgtgcgc cccggacagg atcgacagcc cgatcgcgtc 240

ggcgtcctcc tggatggccg tgcccacgat ctgctccggc gtctggtgca gccccgtgta 300

aatgacctcc ataccggcat cgcgcagcgc ccgcgcgatc accttggccc cgcgatcgtg 360

gccatcgagc cccggcttgg ccaccaccac gcggatcgga ccggctgcca cacccat 417

<210> 266

<211> 138

<212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis

<400> 266

Met Gly Val Ala Ala Gly Pro Ile Arg Val Val Val Ala Lys Pro Gly 1 5 10 15

Leu Asp Gly His Asp Arg Gly Ala Lys Val Ile Ala Arg Ala Leu Arg 20 25 30

Asp Ala Gly Met Glu Val Ile Tyr Thr Gly Leu His Gln Thr Pro Glu 35 40 45

Gln Ile Val Gly Thr Ala Ile Gln Glu Asp Ala Asp Ala Ile Gly Leu 50 55 60

Ser Ile Leu Ser Gly Ala His Asn Thr Leu Phe Ala Ala Val Ile Asp 65 70 75 80

Leu Leu Lys Glu Arg Asp Ala Glu Asp Ile Lys Val Phe Gly Gly Gly 85 90 95

Ile Ile Pro Glu Ala Asp Ile Ala Pro Leu Lys Glu Lys Gly Val Ala 100 105 110

Glu Ile Phe Thr Pro Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ile Val Glu Trp Val 115 120 125

Arg Ala Asn Val Arg Gln Pro Ala Gly Ala 130 135

<210> 267

<211> 2910

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 267

gatcaatttc ttttaagtaa tctaaatccc cattttttaa tttcttttta gcctctttaa 60 ataatcctga ataaactaat acctgtttac ctttttgatt tatttattaa ataatcacta aattctttat tattattttg tcttattttt cccgttacat cacgccataa atctaaccat gtgaaatacg atttatttac tgcaattaac tttttattat atgtaatctc taacttacga tttctcttta taagttttct aaaagaatta tcactcatta cattaggtgt agtcaaagtt ttaatatatt gcatcatcaa agataaaccc cagacaggac aaaatcgatt tttacaagaa gttttatcag ctacaaaaga cagaaatgta tctccaatat gacgtttaat aaatttctga tacttttcca tgttataaca cataaaaaca aaagttgctt tttccccttt ctatgtatgt ataggtacga aaaagcaact ttttttgcgc taactagcct cgccggcaat agttaccctt cgctacgctc aaatccttta aaaaaacaca tcttcaacta aagcacccat tagttcaaca aaaatatata tttatgttac agtaatattg aaagcagaca agtaagcctc ctaaattcac tgaactttaa taaaattgat ttagacaatt tgaaccaaca aacgactttt agtataacca acataaaaca agaaggatat aaattttacc taaactcaaa tacagctttt agaactggtt ataagttaga gccactttat acaatttttg ggactcctgt aaagaatgac ttcaaagagt aatataatgg ttcggggaaa ttgtttccca tttctattat tccatggact tcatttactg attaccttct acccattatt acagcaggaa

ctttaagtga tttataaaat gcatcaaaga 120 tctttaccag aatacttagc catttcatat 180 tgaacttgaa cttgtgttat ttctgaaatg 240 tcttgttggc taatataata tcttttatct 300 acatgaaaat gaggattata atcatctctt 360 acatatccct ttataacact acctactttt 420 ttataacgtt ttatttcatt ttctaattca 480 aaaaagataa actccttttt ctcttgctgc 540 aatgcatctt ttctagcttt tctccaagca 600 ttagctttat ataatttctg tttttctaaa 660 ttgcaatctt caactaaatc catttgattc 720 aatacttgat ttctttgttt tttctcagta 780 acttagtttt cacaaactat gacaataaaa 840 tttttactag tcatttaaaa cgatacatta 900 ttaaaaccag tcataccaat aacttaaggg 960 attatcaaga taagaaagaa aaggattttt 1020 aaagaccaca ttttttaatg tggtctttat 1080 aacgaaaatt ggataaagtg ggatattttt 1140 acttttaaaa aaggattgat tctaatgaag 1200 tttagataaa aatttaggag gcatatcaaa 1260 ggaagagaaa agagatattt aatcattatt 1320 cagaaattga tattagtgtt ttataccgaa 1380 ctgcatttat tttcttagtg acaagggtga 1440 acaatagcga cggagagtta ggttattggg 1500 atggtgtatc taaaacattc tctggtattt 1560 tttatgattt atacctttct gatgtagaga 1620 aaacacctat acctgaaaat gctttttctc 1680 ggtttaactt aaatatcaat aataatagta 1740 aattcattaa taaaggtaat tcaatatatt 1800 taccgctatc tttacaggta catcattctg tgaactctat tcaggaattg tcagataggc tgccgactgt actttttaca gtcggttttc gaaggttttt atattacagc tccagatcca ttttcgcttc tttattccaa ttgctttatt caaaacttgt cgaatggtcg gcttaatagc tagttaaggg ttcttctcaa cgcacaataa tttattttta ataaccttga tagcaaaaaa aatcgataac cacataacag tcataaaacc atatttaaat tttaaatgcc tttattttga taaatcatat agttttatgc ctaaaaacct aaataaatat attctaattc tacaaacaaa agacactgcc cagttacatg caaattaaaa gttaaaattt gtataacgaa agtataatgt aacattatac ttttgataat cgtttatcgt gcataattca cgctgacctc ccaataacta acttatattt tgttattgtt cttcctcgat tttttcttgt tctgttaagt cataaagttc ataaaaaatt tgatagatat attacggttg

tttgtgatgg ttatcatgca ggattgttta 1860 ctaatgactg gcttttataa tatgagataa 1920 taatgtcact aacctgcccc gttagttgaa 1980 tatccttctt tttctgaacc gacttctcct 2040 gacgttgagc ctcggaaccc ttaacaatcc 2100 tcacgctatg ccgacattcg tctgcaagtt 2160 attttctcgg cataaatgcg tggtctaatt 2220 tgccattcca atacaaaacc acatacctat 2280 actccttttt aacaaacttt atcacaagaa 2340 attttaaggg gcattttaaa gatttagggg 2400 acagaagctt ttaaaaagca aatatgagcc 2460 aatttgagca aattcagtgt cgatttttta 2520 ttttcatgat tttttatagt tcctaacagg 2580 ttatataacg ttagtataat aaagcatttt 2640 cgtcatcaca ataactttta aaatactcgt 2700 catggtgtta tcgggaggtc agctgttagc 2760 ttcgtctatc attttgtgat taatttctct 2820 actagctaaa tactcttttt gtttccaaat 2880 2910

Claims (82)

1. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA RECOMBINANTE, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto selecionado do grupo que consiste de: I) piruvato para acetolactato (etapa a da via) II) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato (etapa b da via) III) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato (etapa c da via) IV) α-keto-isovalerato para isobutiraldeído, (etapa d da via), e V) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana e que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

2. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA RECOMBINANTE, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto selecionado do grupo que consiste de: i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato, (etapa c da via) iv) α-keto-isovalerato para isobutiril-CoA, (etapa f da via) v) isobutiril-CoA para isobutiraldeído, (etapa g da via), e vi) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana e que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

3. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA RECOMBINANTE, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto selecionado do grupo que consiste de: i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato, (etapa c da via) iv) α-keto-isovalerato para valina, (etapa h da via) v) valina para isobutilamina, (etapa i da via) vi) isobutilamina para isobutiraldeído, (etapa j da via), e vii) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana e que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

4. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de piruvato para acetolactato é acetolactato sintase.

5. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato é ácido acetohidroxi isomeroredutase.

6. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato é ácido acetohidroxi desidratase.

7. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de isobutiraldeído para isobutanol é álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

8. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de α-keto-isovalerato para isobutiraldeído é α-keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada.

9. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de α-keto-isovalerato para isobutiril-CoA é keto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada.

10. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de isobutiril-CoA para isobutiraldeído é aldeído desidrogenase acilante.

11. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de α-keto-isovalerato para valina é transaminase.

12. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de α-keto-isovalerato para valina é valina desidrogenase.

13. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de valina para isobutilamina é valina descarboxilase.

14. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de isobutilamina para isobutiraldeído é ômega transaminase.

15. CÉLULA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a célula é selecionada do grupo que consiste de bactéria, cianobactéria, fungo filamentoso e levedura.

16. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é um membro de um gênero selecionado do grupo que consiste de Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonellal Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus1 Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium1 Pichia1 Candida1 Hansenula e Saccharomyces.

17. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é Escherichia coli.

18. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é Alcaligenes eutrophus.

19. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é Bacillus licheniformis.

20. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é Paenibacillus macerans.

21. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é Rhodococcus erythropolis.

22. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é Pseudomonas putida.

23. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é Bacillus subtilis.

24. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é Lactobacillus plantarum.

25. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é selecionada do grupo que consiste de Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium e Enterococcus faecalis.

26. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é Saccharomyces cerevisiae.

27. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a acetolactato sintase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 178 e SEQ ID NO:180.

28. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ácido acetohidroxi isomeroredutase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183 e SEQ ID NO:185.

29. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o ácido acetohidroxi desidratase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 e SEQ ID NO:190.

30. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o álcool desidrogenase de cadeia ramificada tem uma seqüência de aminoácidos selecio nada do grupo que consiste de SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:203 e SEQ ID NO:204.

31. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o α-keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada tem uma seqüência de aminoácidos selec ionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:195 e SEQ ID NO:197.

32. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a keto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada compreende quatro subunidades e as seqüências de aminoácidos de ditas subunidades são selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:206 e SEQ ID NO:212.

33. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o aldeído desidrogenase acilante tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:222, SEQ ID ΝΟ:224, SEQ ID ΝΟ:226, SEQ ID ΝΟ:228 e SEQ ID ΝO:230.

34. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a transaminase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:238 e SEQ ID N0:240.

35. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a valina desidrogenase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:242 e SEQ ID NO:244.

36. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a valina descarboxilase tem uma seqüência de aminoácidos como determinada na SEQ ID NO:246.

37. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o ômega transaminase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:248, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:252 e SEQ ID NO:254.

38. CÉLULA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é anaeróbica facultativa.

39. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL, caracterizado pelo fato de que compreende: -1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto selecionado do grupo que consiste de: i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato, (etapa c da via) iv) α-keto-isovalerato para isobutiraldeído, (etapa d da via), e ν) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana; e -2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

40. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL, caracterizado pelo fato de que compreende: -1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto selecionado do grupo que consiste de: -1) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato (etapa c da via) iv) α-keto-isovalerato para isobutiril-CoA, (etapa f da via) v) isobutiril-CoA para isobutiraldeído, (etapa g da via), e vi) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana; e -2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

41. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL, caracterizado pelo fato de que compreende: -1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto selecionado do grupo que consiste de: -1) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato (etapa c da via) iv) α-keto-isovalerato para valina, (etapa h da via) v) valina para isobutilamina, (etapa i da via), e vi) isobutilamina para isobutiraldeído, (etapa j da via) e, vii) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana; e -2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

42. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o substrato de carbono fermentável é selecionado do grupo que consiste de monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.

43. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o substrato de carbono é selecionado do grupo que consiste de glicose, sacarose e frutose.

44. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que as condições através das quais o isobutanol é produzido são aeróbicas.

45. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que as condições através das quais o isobutanol é produzido são microaeróbicas.

46. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é contatada com o substrato de carbono em um meio mínimo.

47. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de piruvato para acetolactato é actolactato sintase.

48. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato é ácido acetohidroxi isomeroredutase.

49. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-keto-isovalerato é ácido acetohidroxi desidratase.

50. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de isobutiraldeído para isobutanol é álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

51. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de α-keto-isovalerato para isobutiraldeído é a-keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada.

52. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de α-keto-isovalerato para isobutiril-CoA é α-keto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada.

53. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de isobutiril-CoA para isobutiraldeído é aldeído desidrogenase adiante.

54. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de α-keto-isovalerato para valina é transaminase.

55. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de α-keto-isovalerato para valina é valina desidrogenase.

56. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de valina para isobutilamina é valina descarboxilase.

57. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto de isobutilamina para isobutiraldeído é ômega transaminase.

58. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste de bactéria, cianobactéria, fungo filamentoso e levedura.

59. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a célula é um membro de um gênero selecionado do grupo que consiste de Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Piehia, Candida, Hansenula e Saccharomyees.

60. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Escherichia coli

61. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Alcaligenes eutrophus.

62. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Bacillus licheniformis.

63. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Paenibacillus macerans.

64. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Rhodococcus erythropolis.

65. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Pseudomonas putida.

66. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Bacillus subtilis.

67. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Lactobacillus plantarum.

68. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste de Enteroeoceus faeeium, Enteroeoceus gallinarium e Enteroeoeeus faeealis.

69. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é Saccharomyees eerevisiae.

70. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a acetolactato sintase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 178 e SEQ ID N0:180.

71. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o ácido acetohidroxi isomeroredutase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183 e SEQ ID NO:185.

72. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o ácido acetohidroxi desidratase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 e SEQ ID N0:190.

73. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a álcool desidrogenase de cadeia ramificada tem uma seqüência de aminoácidos selecio nada do grupo que consiste de SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:199, SEQ ID N0:201, SEQ ID N0:203 e SEQ ID N0:204.

74. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a α-keto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada tem uma seqüência de aminoácidos selecio nada do grupo que consiste de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:195 e SEQ ID NO:197.

75. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a keto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada compreende quatro subunidades e as seqüências de aminoácidos de ditas subunidades são selecionadas do grupo que consiste de SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID N0:220, SEQ ID N0:210, SEQ ID N0:208, SEQ ID N0:206 e SEQ ID NO:212.

76. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o aldeído desidrogenase acilante tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:228 e SEQ ID N0:230.

77. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a transaminase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:238 e SEQ ID N0:240.

78. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a valina desidrogenase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:242 e SEQ ID NO:244.

79. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a valina descarboxilase tem uma seqüência de aminoácidos como determinada na SEQ ID NO:246.

80. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a ômega transaminase tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:248, SEQ ID N0:250, SEQ ID NO:252 e SEQ ID NO:254.

81. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é anaeróbica facultativa.

82. MEIO DE FERMENTAÇÃO QUE CONTÉM ISOBUTANOL, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo método conforme descrito em uma das reivindicações 39 a 41.