BRPI0618085A2

BRPI0618085A2 - processos e kits para diagnóstico de espondilite ancilosante usando biomarcadores

Info

Publication number: BRPI0618085A2
Application number: BRPI0618085-0A
Authority: BR
Inventors: Walter P Maksymowych; Robert L Wong
Original assignee: Abbott Biotech Ltd
Priority date: 2005-11-01
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2011-08-16
Also published as: JP2014013241A; PL1948235T3; US9086418B2; TW201337266A; JP2015096856A; ES2431643T3; KR101468523B1; EP1948235A2; JP2009523226A; WO2007089303A9; RS53055B; TWI424161B; KR20140012160A; HRP20131112T1; WO2007089303A3; NZ595340A; SI1948235T1; DK1948235T3; PT1948235E; CN101663048A

Abstract

<b>PROCESSOS E KITS PARA DIAGNóSTICO DE ESPONDILITE ANCILOSANTE USANDO BIOMARCADORES<d> A invenção provê um processo para determinaçâo da eficácia de um inibidor de TNF-alfa, ou uma porção de ligagão de antigeno do mesmo, para tratamento de espondilite ancilosante (AS) , usando um biomarcador de degradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinovite.

Description

"PROCESSOS E KITS PARA DIAGNÓSTICO DE ESPONDILITEANCILOSANTE USANDO BIOMARCADORES"

Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente reivindica prioridade para U.S. Provisional Patent Appln. 60/732 444, depositado em 1de novembro de 2005, os conteúdos do qual são aqui incorpo-rados por referência.

Este pedido de patente é relacionado a patentes US6 090 382, 6 258 562, e 6 509 015, cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Este pedido de patente tambémestá relacionado ao pedido de patente US 09/801 185, depo-sitado em 7 de março de 2001; pedido de patente US 10/302356, depositado em 22 de novembro de 2002; patente US10/163657, depositado em 5 de junho de 2002; e pedido de pa- tente US 10/133715,.depositado em 26 de abril de 2002; pedi-do de patente US 10/222140, depositado de 16 de agosto de2002; pedido de patente 10/693233, depositado em 24 de outu-bro de 2003; pedido de patente US 10/622932, depositado em18 de julho de 2003; pedido de patente US 10/623039, deposi- tado em 18 de julho de 2003; pedido de patente US 10/623076,depositado em 18 de julho de 2003; pedido de patente US10/623065, depositado em 18 de julho de 2003; pedido de pa-tente US 10/622928, depositado em 18 de julho de 2003; pedi-do de patente US 10/623075, depositado em 18 de julho de 2003; pedido de patente US 10/623035, depositado em 18 dejulho de 2003; pedido de patente US 10/622683, depositado em18 de julho de 2003; pedido de patente US 10/622205, deposi-tado em 18 de julho de 2003; pedido de patente US 10/622210,depositado em 18 de julho de 2003; e pedido de patente US10/623318, depositado em 18 de julho de 2003. Este pedido depatente é também relacionado a pedido US 11/104117. Os in-teiros conteúdos de cada uma destas patentes e pedidos depatente são aqui incorporados por referência.

Antecedentes da Invenção

Elevados níveis de TNF desempenham um importantepapel em inflamação patológica. TNF também referido como(TNFalfa) foi implicado na patofisiologia de uma variedadede doenças e distúrbios humanos, incluindo sepsia, infec-ções, doenças autoimunes, rejeição de transplante e doençade enxerto-versus-hospedeiro (ver, por exemplo, Moeller etal. (1990) Cytokine 2:162; patente US 5 231 024 para Moelleret al.; patente EP 260 610 Bl por Moeller, A. et al.; Vasi-lli (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411; Tracey and Cerami(1994) Annu. Rev. Med. 45:491).

Espondilite ancilosante (AS) que foi associada comelevados níveis de TNF (Lange et al. (2000) Eur J Med Res.5(12):507), e é uma doença reumática inflamatória comum queproduz progressiva rigidez espinhal e restrição de mobilida-de. AS é uma forma de inflamação crônica da espinha e asjuntas sacroilíacas, que pode causar dor e rigidez na e aoredor da espinha. Com o tempo, inflamação espinhal crônica(espondilite) pode conduzir a uma completa cimentação junta(fusão) das vértebras, um processo referido como ancilose,que, por sua vez, pode conduzir a perda de mobilidade da es-pinha .

AS é freqüentemente diagnosticada usando uma com-binação de processos, incluindo sintomas de exame, exame fí-sico, e análises de raios-x. Um sintoma de paciente de ASpode incluir dor e rigidez matinal da espinha e áreas sa-crais com ou sem acompanhante inflamação de outras juntas,tendões, e órgãos. Sintomas iniciais de AS podem ser muitoenganadores, entretanto, quando rigidez e dor nas costas in-feriores podem ser vistos em muitas outras condições, e, co-mo um resultado, pode passar tempo antes de diagnóstico deAS ser mesmo considerado. Em adição, exame físico do pacien-te pode revelar sinais de inflamação e diminuída faixa demovimento de juntas, freqüentemente particularmente aparentena espinha. Flexibilidade das costas inferiores e/ou pescoçopode ser diminuída. Ainda indícios para o diagnóstico podemser sugeridos por anormalidades de raios-x da espinha, ou apresença do marcador genético de teste de sangue, o geneHLA-B27.

Dano estrutural está associado com AS, e resultada degradação e ressorção em cartilagem e osso da junta, re-sultando em destruição de junta. Terapeuticamente, é impor-tante endereçar tanto os sintomas do paciente tendo AS, as-sim como o dano estrutural causado por destruição de juntaassociada com a doença.

Tradicional tratamento de AS incluiu administraçãode drogas antiinflamatórias não-esteroidais (NSAIDs) ao pa-ciente para diminuir dor e rigidez da espinha e outras jun-tas. NSAIDs comumente usadas incluem indometacin (Indocin),tolmetin (Tolectin), sulindac (Clinoril), naproxeno (Napro-sin) e diclofenaco (Voltaren). Mais recentemente, agentesbiológicos anti-TNF, como etanercept, infliximabe, e adali-mumab, foram mostrados serem efetivos na redução de sintomasassociados com AS.

Resumo da Invenção

À despeito de aperfeiçoamentos no tratamento de ASusando agentes biológicos anti-TNF, testes diagnósticos eprognósticos são necessários para auxiliarem médicos prati-cantes no diagnóstico de sintomas do paciente e recomendaçãode apropriados regimes de tratamento. Em adição, testes di-agnósticos e prognósticos são necessários para melhores a-perfeiçoamentos de avaliação no status de doença do pacien-te, o que pode prover melhor cuidado médico para o pacienteassim como reduzido custo em tratamento.

A invenção provê biomarcadores que podem ser usa-dos para determinação de aperfeiçoamentos no status total dedoença AS de pacientes, particularmente com relação a danoestrutural associado com AS. A presente invenção descreve umprocesso para determinação de eficácia de um inibidor de TNFpara diminuição de degradação de cartilagem e/ou sinoviteque é relacionado a AS. A invenção também inclui um processopara identificação de pacientes AS que são candidatos paratratamento com inibidores de TNF, por exemplo, adalimumab,baseado em seu nivel de degradação de cartilagem e/ou bio-marcadores de sinovite.

A invenção descreve um processo para determinaçãode eficácia de um anticorpo TNFalfa humano, ou uma sua por-ção de ligação de antígeno, para tratamento de espondiliteancilosante (AS), o dito processo compreendendo comparaçãode um pré-determinado nivel de um biomarcador de degradaçãode colágeno e/ou um biomarcador de sinovite a partir de umpaciente tendo AS seguindo tratamento com o anticorpo TNFal-fa humano, com um nivel padrão conhecido do biomarcador dedegradação de colágeno e/ou o biomarcador de sinovite asso-ciado com o estado de doença; e avaliando se o nivel de bio-marcador de sinovite e/ou biomarcador de degradação de colá-geno após tratamento do paciente é menor que o nivel padrãoconhecido do biomarcador de degradação de colágeno e/ou bio-marcador de sinovite, onde um menor nivel de biomarcador dedegradação de colágeno e/ou biomarcador de sinovite a partirdo paciente seguindo tratamento com o anticorpo TNFalfa hu-mano em relação ao nivel padrão conhecido indica eficácia doanticorpo TNFalfa humano para o tratamento de AS. A invenção também provê um processo de monitoraçãode eficácia de um anticorpo TNFalfa humano, ou uma sua por-ção de ligação de antigeno, para diminuição de progresão dedano estrutural associado com espondilite ancilosante (AS)em um paciente, o processo compreendendo determinação de ni-vel de um biomarcador de degradação de colágeno e/ou um bio-marcador de sinovite em um paciente e comparando o nivel debiomarcador de degradação de colágeno e/ou um biomarcador desinovite com um nivel padrão conhecido do biomarcador de de-gradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinovite associ-ado com AS, onde uma diminuição no nivel do biomarcador in-dica que o anticorpo TNFalfa humano, ou uma sua porção deligação de antigeno, é eficaz para diminuição de taxa deprogressão de dano estrutural associado com AS no paciente.A invenção inclui um processo para prever a eficá-cia de um anticorpo TNFalfa humano, ou uma sua porção de li-gação de antigeno, para o tratamento de AS em um paciente, odito processo compreendendo comparação de um predeterminadonivel de um biomarcador de degradação de colágeno e/ou umbiomarcador de sinovite de um paciente seguindo tratamentocom o anticorpo TNFalfa humano, ou uma sua porção de ligaçãode antigeno, com um nivel padrão conhecido do biomarcador dedegradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinoviteasso-ciado com AS; e avaliando se o nivel de biomarcador de de-gradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinovite pós-tratamento do paciente é menor que o nivel padrão conhecidodo biomarcador de degradação de colágeno e/ou um biomarcadorde sinovite, onde um nivel de biomarcador de degradação decolágeno e/ou um biomarcador de sinovite menor a partir dopaciente em relação ao nivel padrão conhecido indica que oanticorpo TNFalfa humano, ou uma sua porção de ligação deantigeno, é previsto ser efetivo para o tratamento de AS nopaciente.

A invenção também descreve um processo para deter-minação de eficácia de um anticorpo TNFalfa humano, ou umasua porção de ligação de antigeno, para espondilite ancilo-sante (AS) compreendendo comparação de um nivel pré-tratamento de um biomarcador de degradação de colágeno e/ouum biomarcador de sinovite obtido de um paciente tendo AScom um nivel pós-tratamento do biomarcador de degradação decolágeno e/ou um biomarcador de sinovite obtido do dito pa-ciente, onde um menor nivel de biomarcador pós-tratamentoindica eficácia do anticorpo TNFalfa humano, ou uma sua por-ção de ligação de antigeno.

Em uma realização, o biomarcador de degradação decolágeno é colágeno C tipo II - telopeptideo (CTX-II) . Emuma outra realização, o biomarcador de degradação de coláge-no é colágeno C tipo II urinário - telopeptideo (CTX-II).

Em uma realização, o biomarcador de sinovite é ma-triz metalo protease 3 (MMP3). Em uma outra realização, obiomarcador de sinovite é soro metaloprotease 3 (MMP3).

Em uma realização, a eficácia do anticorpo TNFalfahumano, ou uma sua porção de ligação de antigeno, para aper-feiçoamento de dano estrutural associado com AS é determina-da .

Em uma realização, o processo da invenção aindacompreende comparação de nivel de proteína reativa-C de pa-ciente (CRP) com um nível de CRP padrão conhecido associadocom o estado de doença; e

avaliação de se o nível de CRP de paciente é maiorque o nível CRP padrão conhecido, onde um menor nível deproteína reativa C em relação ao padrão conhecido indica e-ficácia de tratamento.

Em uma realização, o anticorpo TNFalfa humano, ousua porção de ligação de antigeno, dissocia de TNFalfa huma-no com uma Kd de IxlO-8 M ou menos e uma constante de taxaKoff de IxlO-3 s-1 ou menos, ambas determinadas por ressonân-cia plasmon de superfície, e neutraliza citotoxidez de TN-Falfa humana em um ensaio L929 in vitro padrão com uma IC50de IxlO-7 M ou menos.Em uma .realização, o anticorpo TNFalfa humano, ousua porção de ligação de antigeno, tem as seguintes caracte-rísticas:

a) dissocia de TNFalfa humano com uma constante detaxa Koff de 1xl0-3 s-1 ou menos, como determinado por resso-nância de plasmon de superfície;

b) um domínio CDR3 de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3, ou modificada deSEQ ID NO: 3 por uma substituição alanina simples na posição1, 4, 5, 7, ou 8 ou através de uma a cinco substituições deaminoácidos conservativas em posições 1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ou9;

c) tem um domínio CDR3 de cadeia pesada compreen-dendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou modifi-cada de SEQ ID NO: 4 por uma substituição de alanina simplesna posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9,, 10 ou 11 ou por uma a cincosubstituições conservativas de aminoácidos nas posições 2,3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ou 12.

Em uma outra realização, o anticorpo TNFalfa huma-no, ou sua porção de ligação de antigeno, compreende uma re-gião variável de cadeia leve (LCVR) tendo um domínio CDR3compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, oumodificada a partir de SEQ ID NO: 3 através de uma substitu-ição alanina simples na posição 1, 4, 5, 7, ou 8, e compre-ende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendo umdomínio CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO: 4, ou modificada a partir de SEQ ID NO: 4 através deuma substituição alanina simples na posição 2,.3, 4, 5, 6,8, 9, 10 ou 11.

Ainda em uma outra realização da invenção, o anti-corpo TNFalfa humano, ou sua porção de ligação de antigeno,compreende uma região variável de caldeia leve (LCVR) com-preendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0:1 e umaregião variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo a se-qüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Ainda em uma outra realização, o anticorpo TNFalfahumano, ou sua porção de ligação de antigeno, é adalimumab.

Ainda em uma outra realização da invenção, o niveldo biomarcador é determinado usando ELISA.

A invenção também inclui um kit para realização dequalquer um dos processos mencionados acima compreendendo umagente detectável que reconhece especificamente o biomarca-dor de degradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinovi-te; instruções para uso; e opcionalmente, reagentes para i-solamento de uma amostra do paciente.

Em uma realização, o agente detectável reconheceCTX-II urinário ou MMP3 de soro.

A invenção também provê um processo para determi-nação de eficácia de um inibidor de TNFalfa para o tratamen-to de AS em um paciente, o dito processo compreendendo com-paração de um predeterminado nivel de CTX-II a partir de umpaciente seguindo tratamento com o inibidor de TNFalfa comum conhecido nivel padrão de CTX-II associado com o estadode doença; e avaliando se o nivel de CTX-II pós-tratamentode paciente é menor que o nivel padrão conhecido de CTX-II,onde um menor nivel de CTX-II do paciente em relação ao ni-vel padrão conhecido indica que o inibidor de TNFalfa é efe-tivo para o tratamento de AS no paciente.

A invenção ainda provê um processo para determina-ção de eficácia de um inibidor de TNFalfa para diminuição dedano estrutural associado com espondilite ancilosante (AS)em um paciente, o dito processo compreendendo comparação deum nivel predeterminado de CTX-II do paciente tendo AS se-guindo tratamento com o inibidor de TNFalfa com um nivel pa-drão conhecido de CTX-II associado com o estado de doença; eavaliando se o nivel de CTX-II pós-tratamento de paciente émenor que o nivel padrão conhecido de CTX-II, onde um menornivel de CTX-II do paciente seguindo tratamento com o inibi-dor de TNFalfa em relação a um nível padrão conhecido indicaque o inibidor de TNFalfa é efetivo na diminuição de danoestrutural associado com AS no paciente.

A invenção também provê um processo de determina-ção de eficácia de um inibidor de TNFalfa para o tratamentode AS em um paciente, o dito processo compreendendo compara-ção de um nível de CTX-II predeterminado, pós-tratamento,obtido do paciente com um nível de CTX-II predeterminado,pré-tratamento, obtido do paciente; e avaliando se o nívelde CTX-II pós-tratamento é menor que o nível de CTX-II pré-tratamento, onde um nível menor de CTX-II pós-tratamento dopaciente em relação ao nível de CTX-II pré-tratamento indicaque o inibidor de TNFalfa é efetivo para o tratamento de ASno paciente.

Em uma realização, o nível de CTX-II pós-tratamento é pelo menos cerca de 5-10% diminuído em relaçãoao nível de CTX-II pré-tratamento. Em uma outra realização,o nível de CTX-II pós-tratamento é pelo menos cerca de 9%diminuído em relação ao nível de CTX-II pré-tratamento. Emuma outra realização, o nível de CTX-II pós-tratamento é pe-lo menos cerca de 5-100%, cerca de 5-80%, cerca de 5-60%,cerca de 4-45%, cerca de 5-40%, cerca de 5-35%, cerca de 5-30%, cerca de 5-25%, cerca de 5-20%, cerca de 5-15%, cercade 5-10%, cerca de 6-9%, cerca de 7-8%, ou cerca de 9% emrelação à linha base ou nível padrão conhecido.

Em uma realização, o nível de MMP3 pós-tratamentoé pelo menos cerca de 5-50%, cerca de 5-45%, cerca de 5-40%,cerca de 5-35%, cerca de 5-30%, cerca de 5-25%, cerca de 5-20%, cerca de 5-15%, cerca de 5-13%, cerca de 6-12%, cercade 7-11%, ou cerca de 8% em relação à linha base ou nívelpadrão conhecido para um sujeito tendo AS. Ainda em uma rea-lização, eficácia do inibidor de TNF é mostrada quando ní-veis de MMP-3 diminuem pelo menos cerca de 12% em relação alinha base ou nível padrão conhecido para um sujeito tendoAS.

Em uma realização, o CTX-II é CTX-II urinário. Emuma realização, o MMP-3 é MMP-3 de soro.

Em uma realização, o nível de CTX-II ou o nível deMMP-3 é determinado usando ELISA.

A invenção também descreve um processo de determi-nação de se um paciente tendo AS é candidato para tratamentocom adalimumab, compreendendo comparação do nível de biomar-cador de degradação de colágeno do dito paciente com um ní-vel de biomarcador de degradação de colágeno padrão conheci-do a partir de um sujeito não-afetado, e avaliando se o ní-vel de biomarcador de degradação de colágeno do paciente émaior em relação ao nível de biomarcador de degradação decolágeno padrão conhecido, onde um maior nível de biomarca-dor indica que o dito paciente é um candidato para tratamen-to com adalimumab.

Em uma realização, o biomarcador de degradação decolágeno é colágeno C tipo II - telopeptídeo. Em uma reali-zação, o nível do biomarcador de degradação de colágeno édeterminado através de medição de concentração de colágeno Ctipo II - telopeptídeo na urina do paciente.

Em uma realização, a invenção ainda compreendecomparação de nível de biomarcador de sinovite do dito paci-ente com um nível de biomarcador de sinovite padrão conheci-do de um sujeito não-afetado; e avaliando se o nível de bio-marcador de sinovite do paciente é maior em relação ao nívelde biomarcador de sinovite padrão conhecido, onde um maiornível de biomarcador de sinovite de paciente indica que opaciente é um candidato para tratamento com adalimumab.

Em uma realização, o biomarcador de sinovite é ma-triz metaloprotease 3 (MMP3).

A invenção inclui um processo de determinação dese um paciente tendo AS é um candidato para tratamento comadalimumab, compreendendo comparação do dito nível de bio-marcador de sinovite do paciente com um nível de biomarcadorde sinovite padrão conhecido de um sujeito não-afetado, eavaliando se o nível de biomarcador de sinovite do pacienteé maior em relação ao nível de biomarcador de sinovite pa-drão conhecido, onde um maior nível de biomarcador de sino-vite indica que o dito paciente é um candidato para trata-mento com adalimumab.

Em uma realização, o nível do biomarcador de sino-vite é determinado através de medição de concentração em so-ro de MMP3 do paciente.

Em uma realização, a invenção ainda compreendecomparação do dito nível de biomarcador de degradação de co-lágeno do paciente com um nível de biomarcador de degradaçãode colágeno padrão conhecido de um sujeito não-afetado; eavaliando se o nível de biomarcador de degradação de coláge-no do paciente é maior em relação ao nível de biomarcador dedegradação de colágeno padrão conhecido, onde um maior nívelde biomarcador de degradação de colágeno do paciente indicaque o paciente é candidato para tratamento com adalimumab.

Em uma realização, o biomarcador de degradação decolágeno é telopeptídeo C colágeno tipo II

A invenção inclui um processo de monitoração deeficácia de um tratamento terapêutico para espondilite anci-losante (AS) compreendendo determinação de nível de biomar-cador de degradação de colágeno e/ou um biomarcador de sino-vite em um sujeito, onde uma diminuição ou mudança no níveldo biomarcador indica uma diminuição ou mudança na taxa deprogressão de dano estrutural em AS.

Em uma realização, o biomarcador de degradação decolágeno é telopeptídeo-C colágeno tipo II urinário.Em uma realização, o biomarcador de sinovite é ma-triz metaloprotease 3 de soro (MMP3).

Em uma realização, o tratamento terapêutico é ad-ministração de adalimumab.

A invenção também inclui um processo para determi-nação de dano estrutural em um paciente tendo AS compreen-dendo determinação de nivel de linha base de um biomarcadorde degradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinovite emum paciente para obter o dito nivel de biomarcador de linhabase do paciente; determinação de nivel do biomarcador dedegradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinovite nodito paciente após um período de tempo para obter o dito ní-vel de biomarcador de pós - linha base do paciente; compara-ção de dito nível de biomarcador de linha base do pacientecom o nível de biomarcador de pós-linha base; e avaliando seo o nível de biomarcador pós-linha base do paciente é menorque o nível de biomarcador de linha base do paciente, ondeum menor nível de biomarcador pós-linha base indica uma di-minuição em dano estrutural.

A invenção ainda inclui um processo para modulaçãode um biomarcador de degradação de colágeno e/ou um biomar-cador de sinovite em um paciente tendo AS, compreendendo ad-ministração de adalimumab para o dito paciente.

Em uma realização, o inibidor de TNFalfa é sele-cionado do grupo consistindo em um anticorpo TNFalfa, ou umasua porção de ligação de antígeno, uma proteína de fusãoTNF, ou uma proteína de ligação de TNF recombinante.

Em uma realização, a proteína de fusão TNF é eta-nercept.

Em uma realização, o anticorpo TNFalfa, ou suaporção de ligação de antigeno, é selecionado do grupo con-sistindo em um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado,um anticorpo humano, e um anticorpo multivalente.

Em uma realização, o anticorpo anti-TNFalfa, ousua porção de ligação de antigeno, é selecionado do grupoconsistindo em infliximab, golimumab, e adalimumab.

Em uma realização, o anticorpo humano, ou sua por-ção de ligação de antigeno, dissocia de TNFalfa humano comuma Kd de IxlO"8 M ou menos e uma constante de taxa de KQff deIxlO-3 s"1 ou menos, ambas determinadas por ressonância deplasmon de superfície, e neutraliza citotoxidez de TNFalfahumano em um ensaio L92 9 in vitro padrão com uma ICso deIxlO-7 M ou menos.

Em uma realização, o anticorpo humano, ou sua por-ção de ligação de antigeno, tem as seguintes característi-cas :

a) dissocia de TNFalfa humano com uma constante detaxa Koff de IxlO"3 s"1 ou menos, como determinada por resso-nância de plasmon de superfície;

b) tem um domínio CDR3 de cadeia leve compreenden-do a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou modificadaa partir de SEQ ID NO: 3 através de uma substituição alaninasimples na posição 1, 4, 5, 7 ou 8 ou através de uma a cincosubstituições conservativas de aminoácidos nas posições 1,3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9;

c) tem um domínio CDR3 de cadeia pesada compreen-dendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou modifi-cada a partir de SEQ ID NO: 4 através de uma substituiçãoalanina simples na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 ouatravés de uma a cinco substituições conservativas de amino-ácidos nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ou 12.

Em uma realização, o anticorpo humano, ou sua por-ção de ligação de antigeno, compreende uma região variávelde cadeia leve (LCVR) compreendendo a seqüência de aminoáci-dos de SEQ ID NO: Ie uma região variável de pesada (HCVR)compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Em uma realização, a invenção ainda compreendecomparação de um nivel predeterminado, pós-tratamento de umbiomarcador de sinovite obtido do paciente com um nivel pa-drão conhecido do biomarcador de sinovite associado com AS;e avaliação de se o nivel de biomarcador de sinovite pós-tratamento é menor que o nivel de biomarcador de sinovitepadrão conhecido, onde um menor nivel de biomarcador de si-novite pós-tratamento em relação ao nivel de biomarcador desinovite padrão conhecido indica que o inibidor de TNFalfa éefetivo para o tratamento de AS no paciente.

Em uma realização, o biomarcador de sinovite éMM P-3.

A invenção também descreve um kit para realizaçãode processos como descritos acima, onde o kit compreende umagente detectável que reconhece especificamente CTX-II; ins-truções para uso; e opcionalmente, reagentes para isolamentode uma amostra do paciente. Em uma realização, o kit aindacompreende um agente detectável que reconhece especificamen-te MMP-3.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o desenho de estudo do estudodescrito no Exemplo 1.

A Figura 2 mostra um gráfico que indica que paci-entes de alimumab experimentaram significantes reduções emníveis de CTX-II urinário versus placebo em semana 12 e se-mana 24.

A Figura 3 mostra um gráfico que indica que paci-entes de adalimumab experimentaram reduções estatisticamentesignificantes em níveis de MMP3 versus pacientes placebos em12 semanas e 24 semanas.

A Figura 4 mostra um gráfico que indica que níveisde CRP foram significantemente reduzidos em pacientes de a-dalimumab comparados a pacientes placebo em semana 12 e se-mana 24.

Descrição Detalhada da Invenção

I.Definições

De modo que a presente invenção possa ser mais fa-cilmente entendida, certos termos são primeiro definidos.

O termo "biomarcador", como aqui usado, refere-segenericamente a uma molécula, isto é, um gene (ou ácido nu-cléico codificando o. dito gene) , proteína, estrutura carboi-drato ou glicolipídeo, a expressão do qual em ou sobre umaamostra derivada de um tecido ou célula de mamífero pode serdetectada através de processos padrões na técnica (assim co-mo aqueles aqui mostrados), e é anunciador ou representa umacondição do sujeito do qual foi obtida. Onde o biomarcador éuma proteína, modulação ou alteração de expressão abrangemodulação através de diferentes modificações pós-tradução.

Um biomarcador pode ser usado para distinguir atividade dedoença, incluindo aperfeiçoamentos na condição e deteriora-ção da condição, baseado no nível do biomarcador. Da mesmamaneira, em uma realização, um biomarcador útil na presenteinvenção, é qualquer molécula a expressão da qual é regulada(para cima ou para baixo) em um paciente com uma condição dedoença, por exemplo, uma espondiloartropatia, quando compa-rado a um controle normal, isto é, um sujeito não-afetado.

Em uma realização, conjuntos selecionados de um, dois, três,e mais dos biomarcadores desta invenção podem ser usados co-mo pontos finais para rápido diagnóstico ou prognóstico paradeterminação de uma resposta de paciente a uma terapia anti-TNF.

O termo "biomarcador de degradação de colágeno"refere-se a uma molécula, isto é, um gene (ou ácido nucléicocodificando o dito gene), proteína, estrutura carboidrato,ou glicolipídeo, que é associada com a destruição de coláge-no.Um biomarcador de degradação de colágeno é usado paradistinguir a atividade de doença, isto é, destruição de co-lágeno, em um sujeito de quem a amostra ou tecido é obtida.Em uma realização, o biomarcador de degradação de colágeno éum fragmento de colágeno, por exemplo, um fragmento de colá-geno tipo II. Em uma realização, o biomarcador de degradaçãode colágeno é telopeptídeo-C colágeno tipo II (CTX-II).

O termo "biomarcador de sinovite" refere-se a umamolécula, isto é, um gene (ou um ácido nucléico codificandoo dito gene), portéina, estrutura carboidrato ou glicolipí-deo, que está associada com sinovite, ou inflamação do sino-vium. Um biomarcador de sinovite pode ser usado para indicarum aumento em quantidade processada, proliferação, degrada-ção, inflamação, destruição, decomposição, remodelagem pato-lógica, ou degradação da sinovia ou colágeno sinovial de umpaciente. Em uma realização, um biomarcador de sinovite éuma endopeptidase associada com degradação de matriz extra-celular (ECM), por exemplo, matrizes metaloproteinases. Emuma realização, o biomarcador de sinovite usado na invençãoé MMP-3.

O termo "nível padrão conhecido" ou "nível contro-le" refere-se a um nível aceito ou pré-determinado do bio-marcador que é usado para comparar o nível de biomarcadorderivado de uma amostra de um paciente. Em uma realização, onível padrão conhecido do biomarcador de degradação de colá-geno e/ou um biomarcador de sinovite é baseado em um sujeitoou sujeitos tendo AS, e, por isso, representa o estado dedoença. Em uma outra realização, o nível padrão conhecido dobiomarcador indica um estado não-doença, isto é, naão-afetado, de um sujeito que não tem AS.

Quando comparado ao nível padrão conhecido de umcerto biomarcador, desvio a partir do nível padrão conhecidogenericamente indica um aperfeiçoamento ou deterioração doestado de doença. Alternativamente, quando comparado ao co-nhecido nível padrão conhecido de um certo biomarcador, e-quivalência ao nível padrão conhecido genericamente indicaconfirmação da atividade de doença, confirmação de um estadonão-doença, ou, se o nível de biomarcador do paciente é ob-tido seguindo tratamento terapêutico para a doença, insufi-ciência de uma terapia para aperfeiçoar um estado de doençade paciente.

Como aqui usado, o termo "expressão", quando usadoem conexão com deteção de expressão de um biomarcador dapresente invenção, pode referir-se a detecção de transcriçãodo gene codificando uma proteína biomarcadora, para detecçãode tradução da proteína biomarcadora, e/ou detecção de pro-teína biomarcadora que resulta do metabolismo de uma proteí-na maior, por exemplo, degradação de colágeno tipo II querende o fragmento CTX-II. Para detectar expressão de um bio-marcador refere-se ao ato de determinação ativa de se um bi-omarcador é expresso ou não. Quantificar expressão refere-seao ato de determinação de nível do dado biomarcador, por e-xemplo, ng/mL. Detecção e/ou quantificação de expressão po-dem incluir determinação de se expressão de biomarcador éregulada ascendentemente comparada a um nível padrão conhe-cido, regulada descendentemente comparada a um nível padrãoconhecido, ou substancialmente inalterada comparada a um ní-vel padrão conhecido. Por isso, a etapa de quantificaçãoe/ou detecção de expressão não requer que expressão do bio-marcador seja realmente regulada ascendentemente ou reguladadescendentemente, mas antes, também pode incluir detecção denenhuma expressão do biomarcador ou detecção de que a ex-pressão do biomarcador não e alterou ou não é diferente (is-to é, detecção de nenhuma expressão significante do biomar-cador ou nenhuma mudança significante em expressão do bio-marcador comparado a um controle).

0 termo "nível" ou "quantidade" como aqui usado,refere-se à quantidade mensurável de um biomarcador. A quan-tidade pode ser tanto (a) uma quantidade absoluta como medi-da em moléculas, moles ou peso por volume unitário ou célu-las ou (b) uma quantidade relativa, por exemplo, medida poranálises densitométricas. Em uma realização preferida, ní-veis de ARN e/ou proteína do biomarcador são determinados.

O termo "sujeito" ou "paciente", como aqui usado,refere-se a um humano ou animal não-humano.

0 termo "amostra" como aqui usado refere-se a umacoleção de células similares ou tecido obtido de um sujeito.A fonte do tecido ou amostra de célula pode ser tecido sóli-do como a partir de um órgão fresco, congelado e/ou preser-vado ou amostra de tecido ou biópsia ou aspirado; sangue ouquaisquer constituintes de sangue; ou fluidos corpóreos, co-mo sangue, soro, plasma, urina, saliva, suor ou fluido sino-vial. Em uma realização, o biomarcador de sinovite é obtidode uma amostra de soro. Em uma realização, o biomarcador dedegradação de cartilagem é obtido de uma amostra de urina.

0 termo "TNFalfa humano" (aqui abreviado como hTN-Falfa, ou simplesmente hTNF), como aqui usado, é pretendidoreferir-se a uma citocina humana que existe como uma formasecretada de 17 kD e uma forma associada a membrana de 26kD, a forma biologicamente ativa da qual é composta por umtrímero de moléculas de 17 kD ligadas não-covalentemente. Aestrutura de hTNFalfa é ainda descrita em, por exemplo, Pen-nica, D., et al. (1984) Nature 312:724-729; Davis, J.M., etal. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; e Jones, Ε.Y., et al.,(1989) Nature 338:225-228. O termo TNFalfa humano é preten-dido incluir TNFalfa humano recombinante (rhTNFalfa), quepode ser preparado através de processos de expressão recom-binante padrões ou comercialmente adquiridos (R & D Systems,Catalog No. 210-TA, Minneapolis, MN). TNFalfa também referi-do como TNF.

O termo "inibidor de TNFalfa" inclui agentes queinterferem com atividade de TNFalfa. O termo também incluicada um dos anticorpos humanos anti-TNFalfa e porções de an-ticorpo aqui descritas assim como aqueles descritos nas pa-tentes US 6 090 382; 6 258 562; 6 509 015 e nos pedidos depatente US 09/801185 e 10/302356. Em uma realização, o ini-bidor de TNFalfa usado na invenção é um anticorpo anti-TNFalfa, ou um seu fragmento, incluindo infliximab (Remica-de, Johnson and Johnson; descrito na patente US 5 656 272,aqui incorporada por referência), CDP571 (um anticorpo IgG4anti-TNFalfa monoclonal humanizado) , CDP870 (um fragmento deanticorpo anti-TNFalfa monoclonal humanizado) , um dAb anti-TNF (Peptech), CNTO 148 (golimumab; Medarex e Centocor, verWO 02/12502), e adalimumab (Humira Abbott Laboratories, ummAb anti-TNF humano, descrito em US 6 090 382 como D2E7).Adicionais anticorpos TNF que podem ser usados na invençãosão descritos nas patente s US 6 593 458; 6 498 237; 6 451983 e 6 448 380, cada uma das quais é aqui incorporada porreferência. Em uma outra realização o inibidor de TNFalfa éuma proteína de fusão TNF, por exemplo, etanercept (Enbrel,Amgen; descrito em WO 91/03553 e WO 09/406476, aqui incorpo-radas por referência) . Em uma outra realização, o inibidorde TNFalfa é uma proteína de ligação de TNFalfa recombinante(r-TBP-I) (Serono).

O termo "anicorpo", como aqui usado, é pretendidoreferir-se a moléculas de imunoglobulina compreendidas porquatro cadeias de polipeptideos, duas cadeias pesadas (H) eduas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto.Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável decadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma regiãoconstante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pe-sada é compreendida por três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cadacadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeialeve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constantede cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compre-endida por um domínio, CL. As regiões VH e VL ainda podemser subdivididas em regiões de hiper-variabilidade, chamadasregiões determinantes de complementaridade (CDR), interespa-çadas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiõesde estrutura (FR) . Cada VH e VL é composta por três CDRs equatro FRs, dispostas a partir de terminus-amino para termi-nus-carboxi na seguinte ordem: FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3,CDR3, FR4. Os anticopos da invenção são descritos ainda emdetalhes nas patentes US 6 090 382; 6 258 562; e 6 509 015,cada uma das quais é aqui incorporada por referência em suatotalidade.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um an-ticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), como aquiusado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo queretem a habilidade de ligar-se especificamente a um antigeno(por exemplo, hTNFalfa). Foi mostrado que a função de liga-ção de antigeno de um anticorpo pode ser desempenhada porfragmentos de um anticorpo de inteiro comprimento. Exemplosde fragmentos ligantes abrangidos dentro do termo "porção deligação de antigeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmen-to Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domíniosVL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmentobivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por umaponte dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmen-to Fd consistindo nos domínios VH e CHI; (iv) um fragmentoFv consistindo nos domínios VL e VH de um braço simples deum anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Natu-re 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) umaregião determinante de complementaridade isolada (CDR). Alémdisso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, se-jam codificados por genes separados, eles podem ser ligados,usando processos recombinantes, através de um ligador sinté-tico que permite os mesmos serem feitos como uma cadeia deproteína simples na qual as regiões VL e VH emparelham paraformação de moléculas monovalentes (conhecidas como Fv decadeia simples (scFv) ; ver, por exemplo, Bird et al. (1988)Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 85:587 9-5883). Tais anticorpos de cadeia sim-pies também são pretendidos serem abrangidos dentro do termo"porção de ligação de antigeno" de um anticorpo. Outras for-mas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacorpostambém são abrangidas. Diacorpos são anticorpos biespecífi-cos, bivalentes, nos quais domínios VH e VL são expressossobre uma cadeia de polipeptídeo simples, mas usando um Ii-gador que é muito curto para permitir emparelhamento entreos dois domínios sobre a mesma cadeia, pelo que forçando osdomínios a emparelharem com domínios complementares de umaoutra cadeia e criando dois sítios de ligação de antígeno(ver, por exmeplo, Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure2:1121-1123). As porções de anticorpo da invenção são des-critas ainda em detalhes nas patentes US 6 090 382, 6 258562, 6 509 015, cada uma das quais é aqui incorporada porreferência em sua totalidade.

Fragmentos ligantes são produzidos através de téc-nicas de ADN recombinante, ou através de clivagem enzimáticaou química de imunoglobulinas intactas. Fragmentos ligantesincluem Fab, Fab', F(ab')?, Fabc, Fv, cadeias simples, e an-ticorpos de cadeia simples. Imunoglobulinas ou anticorposoutros que não "biespecíficos" ou "bifuncionais", uma imuno-globulina ou anticorpo é entendido ter cada um de seus sí-tios de ligação idênticos. Um "anticorpo bifuncional" ou"biespecífico" é um anticorpo híbrido artificial tendo doispares de cadeia pesada / leve diferentes e dois sítios deligação diferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser pro-duzidos através de uma variedade de processos incluindo fu-são de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab' . Ver, porexemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553(1992).Uma "substituição conservativa de aminoácido", co-mo aqui usada, é uma na qual um resíduo de aminoácido ésubstituído com um outro resíduo de aminoácido tendo uma ca-deia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidostendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica,incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, ar-ginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo á-cido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polaresnão-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina,serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina,prolina, fenil alanina, metionina, triptofano) , cadeias la-terais ramificadas - beta (por exemplo, treonina, valina,isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, ti-rosina, fenil alanina, triptofano, histidina).

"Anticorpos quiméricos" referem-se a anticorposonde uma porção de cada uma das seqüências de aminoácidos decadeias pesada e leve é homóloga a correspondentes seqüên-cias em anticorpos derivados de uma particular espécie oupertencendo a uma classe particular, enquanto o segmentorestante das cadeias é homólogo a correspondentes seqüênciasde outras espécies. Em uma realização, a invenção caracteri-za um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação de antíge-no, onde as regiões variáveis de ambas cadeias leve e pesadaimitam as regiões variáveis de anticorpos derivados de umaespécie de mamífero, enquanto as porções constantes são ho-mólogas às seqüências em anticorpos derivados de uma outraespécie. Em uma realização preferida da invenção, anticorposquiméricos são fabricados através de enxerto de CDRs de umanticorpo de camundongo sobre as regiões de estrutura de umanticorpo humano.

"Anticorpos humanizados" refere-se a anticorposque compreendem pelo menos uma cadeia compreendendo resíduosde estrutura de região variável substancialmente de uma ca-deia de anticorpo humano (referida como a imunoglobulina re-ceptora ou anticorpo) e pelo menos uma região determinantede complementaridade (CDR) substancialmente de um anticorponão-humano (por exemplo, camundongo) . Em adição ao enxertodas CDRs, anticorpos humanizados tipicamente ainda sofremalterações de modo a aperfeiçoar a afinidade e/ou imunogeni-cidade.

0 termo "anticorpo multivalente" refere-se a umanticorpo compreendendo mais de um sítio de reconhecimentode antígeno. Por exemplo, um anticorpo "bivalente" tem doissítios de reconhecimento de antígeno, enquanto um anticorpo"tetravalente" tem quatro sítios de reconhecimento de antí-geno. Os termos "monoespecífico", "biespecífico", "triespe-cífico", "tetraespecífico", etc. referem-se ao número de di-ferentes especificidades de sítio de reconhecimento de antí-geno (como oposto ao número de sítios de reconhecimento deantígeno) presentes em um anticorpo multivalente. Por exem-plo, sítios de reconhecimento de antígeno de anticorpo "mo-noespecífico" ligam-se todos ao mesmo epítopo. Um anticorpo"biespecífico" ou "específico dual" tem pelo menos um sítiode reconhecimento de antígeno que se liga a um primeiro epí-topo e pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno quese liga um segundo epítopo que é diferente do primeiro epí-topo. Um anticorpo "monoespecifico multivalente" tem múlti-plos sítios de reconhecimento de antígeno que ligam todos omesmo epítopo. Um anticorpo "biespecífico multivalente" temmúltiplos sítios de reconhecimento de antígeno, algum númerodos quais se ligam a um primeiro epítopo e algum número dosquais ligam um segundo epítopo que é diferente do primeiroepítopo.

O termo "anticorpo humano", como aqui usado, épretendido para incluir anticorpos tendo regiões variáveis econstantes derivadas de seqüências de imunoglobulina de li-nha germe humana. Os anticorpos humanos da invenção podemincluir resíduos de aminoácidos não codificados por seqüên-cias de imunoglobulina de linha germe humana (por exemplo,mutações introduzidas por mutagênese randômica ou específicade sítio in vitro ou através de mutação somática in vivo) ,por exemplo, nas CDRs e em particular CDR3. Entretanto, otermo "anticorpo humano", como aqui usado, não é pretendidoincluir anticorpos nos quais seqüências de CDR derivadas delinha germe de uma outra espécie de mamífero, tal como ca-mundongo, foram enxertadas sobre as seqüências de estruturahumana.

O termo "anticorpo humano recombinante", como aquiusado, é pretendido incluir todos os anticorpos humanos' quesão preparados, expressos, criados ou isolados por meios re-combinantes, tais como anticorpos expressos usando um vetorde expressão recombinante transfectado em uma célula hospe-deira (ainda descrito abaixo), anticorpos isolados de umabiblioteca de anticorpos humanos combinatorial, recombinante(ainda descrita abaixo), anticorpos isolados de um animal(por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes deimunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al., (1992) Nucl. Acis Res. 20:6287) ou anticorpos preparados,expressos, criados ou isolados através de quaisquer outrosmeios que envolveram união de seqüências de gene imunoglobu-lina humana a outras seqüências de ADN. Tais anticorpos hu-manos recombinantes têm regiões variáveis e constantes deri- vadas de seqüências de imunoglobulina de linha germe humana.Em certas realizações, entretanto, tais anticorpos humanosrecombinantes são sujeitos a mutagênese in vitro (ou, quandoum animal transgênico para seqüências de Ig humana é usado,mutagênese somática in vivo) e assim as seqüências de amino- ácidos da regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes sãoseqüências que, embora derivadas de e relacionadas a seqüên-cias VH e VL de linha germe humana, podem não existir natu-ralmente dentro de repertório de linha germe de anticorpohumano in vivo.

Tais anticorpos quiméricos, humanizados, humanos eespecíficos duais podem ser produzidos através de técnicasconhecidas de ADN recombinante, por exemplo, usando proces-sos descritos em PCT International Application No.PCT/US86/02269; pedido de patente EP 184 187; pedido de pa- tente EP 171 496; pedido de patente EP 173 494; publicaçãointernacional PCT WO 86/01533; patente US 4 816 567; pedidode patente EP 125 023; Better et al. (1988) Science240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526;Sun et al. 91987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:214-218;Nishimura et al., (1987) câncer Res. 47:999-1005; Wood etal. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl.

Câncer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; patenteUS 5 225 539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verho-eyan et al. (1988) Science 239:1534; e Beidler et al. (1988)J. Immunol. 141:4053-4060, Queen et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA 86:10029-10033 (1989), US 5 530 101, US 5 585 089,US 5 693 761, US 5 693 762, Selick et al. , WO 90/07861, eWinter US 5 225 539.

Um "anticorpo isolado", como aqui usado, é preten-dido referir-se a um anticorpo que é substancialmente livrede outros anticorpos tendo diferentes especificidades anti-gênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga espe-cificamente a hTNFalfa é substancialmente livre de anticor-pos que especificamente ligam antigenos outros que não hTN-Falfa) . Um anticorpo isolado que liga especificamente hTN-Falfa pode, entretanto, ter reatividade cruzada para outrosantigenos, tais como moléculas de TNFalfa de outras espécies(ainda discutido em detalhes abaixo) . Além disso, um anti-corpo isolado pode ser substancialmente livre de outro mate-rial celular e/ou compostos químicos.

Um "anticorpo neutralizante", como aqui usado (ouum "anticorpo que neutralizou atividade de hTNFalfa"), épretendido referir-se a um anticorpo cuja ligação a hTNFalfaresulta em inibição da atividade biológica de hTNFalfa. Estainibição da atividade biológica de hTNFalfa pode ser avalia-da através de medição de um ou mais indicadores de atividadebiológica, tal como citotoxidez induzida por hTNFalfa (invitro ou in vivo), ativação celular induzida por hTNFalfa eligação de hTNFalfa a receptores de hTNFalfa. Estes indica-dores de atividade biológica de hTNFalfa podem ser avaliadospor um ou mais de vários ensaios padrões in vitro ou in vivoconhecidos na técnica (ver patente US 6 090 382). Preferi-velmente, a habilidade de um anticorpo neutralizar atividadede hTNFalfa é avaliada através de inibição de citotoxidezinduzida por hTNFalfa de células L929. Como um parâmetro a-dicional ou alternativo de atividade de hTNFalfa, a habili-dade de um anticorpo inibir expressão induzida por hTNF alfade ELAM-I sobre HUVEC, como uma medida de ativação celularinduzida por hTNF alfa, pode ser avaliada.

O termo "ressonância plasmon de superfície", comoaqui usado, refere-se a um fenômeno ótico que permite a aná-lise de interações bioespecíficas de tempo real através dedetecção de alterações em concentrações de proteína dentrode uma matriz bio-sensora, por exemplo, usando um sistemaBIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Pisca-taway, NJ) . Para ainda descrições, ver Exemplo 1 de patenteUS 6 258 562 e Jõnsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19;Jõnsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson etal. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125; e Johnnson et al.(1991)Anal. Biochem. 198:268.

O termo "K^off", como aqui usado, é pretendido refe-rir-se à constante de taxa off para dissociação de um anti-corpo a partir do complexo de anticorpo / antigeno.

0 termo "Kd", como aqui usado, é pretendido refe-rir-se à constante de dissociação de uma particular intera-ção de anticorpo - antigeno.

"0 termo "IC50", como aqui usado, é pretendido re-ferir-se à concentração do inibidor requerida para inibir oponto final biológico de interesse, por exemplo, neutralizaratividade de citotoxidez.

0 termo "molécula de ácido nucléico", como aquiusado, é pretendido incluir moléculas de ADN e moléculas deARN. Uma molécula de ácido nucléico pode ser de fita simplesou fita dupla, más preferivelmente é ADN de fita dupla.

0 termo "molécula de ácido nucléico isolada", comoaqui usado em referência a ácidos nucléicos codificando an-ticorpos ou porções de anticorpos (por exemplo, VH, VL,CDR3) que ligam hTNF alfa, é pretendido referir-se a uma mo-lécula de ácido nucléico na qual as seqüências de nucleotí-deos o anticorpo ou porção de anticorpo são livres de outrasseqüências de nucleotideos codificando anticorpos ou porçõesde anticorpos que ligam antigenos outros que não hTNF alfa,cujas outras seqüências podem flanquear naturalmente o ácidonucléico em ADN genômico humano. Assim, por exemplo, um áci-do nucléico isolado da invenção codificando uma região VH deum anticorpo anti-hTNFalfa não contem outras seqüências co-dificando outras regiões VH que ligam antigenos outros quenão hTNF alfa.

0 termo "vetor", como aqui usado, é pretendido re-ferir-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transpor-tar um outro ácido nucléico ao qual ela foi ligada. Um tipode vetor é um "plasmídeo", que refere-se a um laço de ADN defita dupla circular no qual adicionais segmentos de ADN po-dem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral,onde adicionais segmentos de ADN podem ser ligados no genomaviral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma emuma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo,vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replica-ção e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (por e-xemplo, vetores mamíferos não-epissomais) podem ser integra-dos no genoma de uma célula hospedeira com introdução na cé-lula hospedeira, e pelo que são replicados junto com o geno-ma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de di-recionarem a expressão de genes aos quais eles estão ligadosoperativamente. Tais vetores são referidos aqui como "veto-res de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetoresde expressão"). Em geral, vetores de expressão de utilidadeem técnicas de ADN recombinante estão freqüentemente na for-ma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmí-deo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente na medi-da em que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de ve-tor. Entretanto, a invenção é pretendida incluir tais outrasformas de vetores de expressão, tais como vetores virais(por exemplo, retrovírus defeituoso em replicação, adenoví-rus e vírus associado-adeno), que servem funções equivalentes.

O termo "célula hospedeira recombinante" (ou sim-plesmente "célula hospdeira"), como aqui usado, é pretendidoreferir-se a uma célula na qual um vetor de expressão recom-binante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termossão pretendidos referirem-se não somente à particular célulaobjeto mas à progênie de uma tal célula. Devido certas modi-ficações poderem ocorrer em gerações sucessivas devido a mu-tação ou influências ambientais, tal progênie pode de fatonão ser idêntica à célula parente, mas ainda incluída no es-copo do termo "célula hospedeira" como aqui usado.

O termo "dose", como aqui usado, refere-se a umaquantidade de inibidor de TNF alfa que é administrada a umsujeito.

0 termo "dose variável múltipla" inclui doses di-ferentes de um inibidor de TNFalfa que são administradas aum sujeito para tratamento terapêutico. "Regime de dose va-riável múltipla" ou "terapia de dose variável múltipla" des-creve um esquema de tratamento que é baseado na administra-ção de diferentes quantidades de inibidor de TNF alfa em vá-rios pontos de tempo por todo o curso de tratamento. Regimesde dose variável múltipla são descritos no pedido PCTUS05/12007.

0 termo "dosagem", como aqui usado, refere-se àadministração de uma substância (por exemplo, um anticorpoanti-TNF alfa) para obter um objetivo terapêutico (por exem-plo, o tratamento de artrite reumatóide).

Os termos "regime de dosagem bi-semanalmente","dosagem bi-semanal", e "administração bi-semanal", como a-qui usados, referem-se ao curso de tempo de administração deuma substância (por exemplo, um anticorpo anti-TNF alfa) aum sujeito para obter um objetivo terapêutico. O regime dedosagem bi-semanal não é pretendido incluir um regime de do-sagem semanal. Preferivelmente, a substância é administradacada 9-19 dias, mais preferivelmente, cada 11-17 dias, mesmomais preferivelmente, cada 13-15 dias, e mais preferivelmen-te, cada 14 dias.

O termo "combinação" como na frase "um primeiroagente em combinação com um segundo agente" inclui co-administração de um primeiro agente e um segundo agente, quepor exemplo pode estar dissolvido ou inter-misturado no mes-mo carreador farmaceuticamente aceitável, ou administraçãode um primeiro agente, seguido pelo segundo agente, ou admi-nistração do segundo agente, seguido pelo primeiro agente. Apresente invenção, por isso, inclui processos de tratamentoterapêutico de combinação e composições farmacêuticas emcombinação.

O termo "concomitante" como na frase "tratamentoterapêutico concomitante" inclui administração de um agentena presença de um segundo agente. Um processo de tratamentoterapêutico concomitante inclui processos nos quais o pri-meiro, segundo, terceiro, ou adicionais agentes são co-administrados. Um processo de tratamento terapêutico conco-mitante também inclui processos nos quais o primeiro ou adi-cionais agentes são administrados na presença de um segundoou adicionais agentes, onde o segundo ou adicionais agentes,por exemplo, podem ter sido previamente administrados. Umprocesso de tratamento terapêutico concomitante pode ser e-xecutado em etapas através de diferentes atores. Por exem-plo, um ator pode administrar a um sujeito um primeiro agen-te e um segundo ator pode administrar ao sujeito um segundoagente, e as etapas de administração podem ser executadas aomesmo tempo, ou aproximadamente ao mesmo tempo, em temposdistantes, tanto quanto o primeiro agente (e agentes adicio-nais) estejam após administração na presença de um segundoagente (e agentes adicionais). 0 ator e o sujeito podem sera mesma entidade (por exemplo, humano).

0 termo "terapia de combinação", como aqui usado,refere-se à administração de duas ou mais substâncias tera-pêuticas, por exemplo, um anticorpo anti-TNF alfa e uma ou-tra droga. A outra droga pode ser administrada concomitantecom, antes de, ou seguindo a administração de um anticorpoanti-TNF alfa.

O termo "kit" como aqui usado refere-se a um pro-duto embalado compreendendo componentes com os quais admi-nistrar o anticorpo TNF alfa da invenção para tratamento deum distúrbio relacionado com TNF alfa. O kit preferivelmentecompreende uma caixa ou recipiente que retém os componentesdo kit. A caixa ou recipiente é afixada com um rótulo ou umprotocolo aprovado da Food and Drug Administration. A caixaou recipiente retém componentes da invenção que são preferi-velmente contidos em vasos de plástico, polietileno, poli-propileno, etileno, ou propileno. Os vasos podem ser tuboscapeados ou garrafas. 0 kit também pode incluir instruçõespara administração de anticorpo TNF alfa da invenção. Em umarealização o kit da invenção inclui a formulação compreen-dendo o anticorpo humano D2E7, como descrito emPCT/IB03/04 502 e pedido US 10/222140.

Vários aspectos da invenção são aqui ainda descri-tos em detalhes.

II.Degradação de Cartilagem e Biomarcadores de Es-pondilite

Há uma necessidade de estabelecer uma ferramentade avaliação significativa para espondilite ancilosante (AS)para ser capaz de determinar aperfeiçoamentos, especialmenteaperfeiçoamentos estruturais iniciais, em pacientes de ASsofrendo terapia inibidora de TNF. Atualmente, taxa de sedi-mentação de eritrócito (ESR) e o nivel de proteína reativa-C(CRP) são os mais amplamente usados processos para avaliaçãode atividade AS, entretanto estes marcadores sozinhos sãoinsuficientes para avaliação de atividade de doença AS (Ruofand Stucki (1999) J Rheumatol 26:966). A invenção provê bio-marcadores que foram identificados como sendo úteis na ava-liação da habilidade de uma terapia anti-TNF para prevenirdano estrutural associado com AS em um paciente. Em adição,a invenção provê um processo para determinação de uma res-posta de paciente para aperfeiçoamentos em destruição estru-tural de juntas associada com AS. Os processos aqui descri-tos identificam mudanças na progressão de dano estrutural emura paciente que pode não ser facilmente aparente usando mei-os mais tradicionais, tal como radiografia. Os processos dainvenção são vantajosos, na medida em que eles proporcionamum meio para o médico determinar a eficácia de um tratamentoanti-TNF em um paciente sem ter de esperar por resultadosclínicos, que podem tomar prolongados períodos de tempo.Genericamente, a invenção inclui comparação de ní-veis de biomarcador de um paciente tendo As, ou suspeito deter AS, com um nível padrão conhecido associado com ativida-de de doença, para determinar se o nível de biomarcador depaciente está aumentado, diminuído, ou o mesmo, em relaçãoao controle. Em determinação de eficácia de um inibidor deTNF para tratamento de AS em um paciente, particularmentecom relação a aperfeiçoamento de dano estrutural, níveis debiomarcadores podem ser predeterminados, ou, alternativamen-te, podem incluir obtenção de uma amostra do paciente e en-tão usando o nível de biomarcador determinado a partir daamostra na avaliação comparativa da invenção.

A invenção identifica certos biomarcadores associ-ados com destruição estrutural, incluindo degradação de car-tilagem e sinovite, que podem ser usados para determinar sea terapia anti-TNF eleita é adequada para tratamento ou seuma diferente terapia, incluindo uma diferente terapia anti-TNF, deve ser considerada. Tais meios anunciadores benefici-am a saúde total do sujeito, na medida em que respostas maisrápidas podem ser feitas para determinação de apropriada te-rapia. Os processos aqui descritos também diminuem o custototal do processo de tratamento através de eliminação maisrápida de terapias ienficazes.

A invenção provê um processo para determinação deeficácia de um inibidor de TNF para o tratamento de uma es-pondiloartropatia, por exemplo, espondilite ancilosante,compreendendo medição de biomarcadores para destruição decartilagem e sinovite. Eficácia é determinada de acordo coma habilidade do inibidor de TNF para diminuir biomarcadoresconhecidos refletirem atividade de doença com relação a de-gradação de cartilagem e/ou sinovite em um sujeito.

Em uma realização, a invenção inclui um processopara determinação de eficácia de um inibidor de TNFalfa, porexemplo, anticorpo TNF alfa humano, ou uma sua porção deligação de antigeno, para tratamento de espondilite ancilo-sante (AS), onde um nivel predeterminado de um biomarcadorde degradação de colágeno e/ou biomarcador de sinovite de umpaciente tendo AS seguindo tratamento com o inibidor de TNFalfa (nivel de biomarcador de pós-tratamento) é comparadocom um nivel padrão conhecido do biomarcador de degradaçãode colágeno e/ou biomarcador de sinovite associado com o es-tado de doença. Uma vez os dois níveis sejam comparados, édeterminado se o nível de biomarcador de degradação de colá-geno e/ou biomarcador de sinovite pós-tratamento do pacienteé menor que o nível padrão conhecido, onde um menor nível debiomarcador de degradação de colágeno e/ou biomarcador desinovite a partir do paciente seguindo tratamento com o ini-bidor de TNF alfa em relação ao nível padrão conhecido indi-ca eficácia do inibidor de TNF alfa para o tratamento de AS.

Em uma outra realização, a invenção provê um pro-cesso para determinação de eficácia de um inibidor de TNF,por exemplo, anticorpo TNFalfa humano, ou uma sua porção deligação de antigeno, para espondilite ancilosante (AS) com-preendendo comparação de um nível pr'determinado de um bio-marcador de degradação de colágeno e/ou biomarcador de sino-vite obtido de um paciente tendo AS com um nível pós-tratamento do biomarcador de degradação de colágeno e/ou bi-omarcador de sinovite obtido do dito paciente, onde um menornível de biomarcador pós-tratamento indica eficácia do ini-bidor de TNF para tratamento de AS no paciente.

Através de diminuição de nível de um biomarcadorassociado com degradação de cartilagem e/ou sinovite, um i-nibidor de TNF pode ser usado para diminuir ou prevenir danoestrutural associado com AS. Em um aspecto, a invenção provêum processo de monitoração de eficácia de um inibidor deTNF, por exemplo, um anticorpo TNF alfa humano, ou uma suaporção de ligação de antígeno, para diminuição de progressãode dano estrutural associado com espondilite ancilosante(AS) em um paciente compreendendo determinação de nível deum biomarcador de degradação de colágeno e/ou biomarcador desinovite em um paciente e comparando o nível do biomarcadorde degradação de colágeno e/ou biomarcador de sinovite comum nível padrão conhecido do biomarcador de degradação decolágeno e/ou biomarcador de sinovite associado com AS. Nes-te exemplo, uma diminuição no nível do biomarcador a partirdo paciente em relação ao nível padrão conhecido indica queo inibidor de TNF é eficaz para diminuição de taxa de pro-gressão de dano estrutural associado com AS no paciente.

Em um outro aspecto, a invenção provê um processopara previsão de eficácia de um inibidor de TNF, por exem-plo, anticorpo TNF alfa humano, ou uma sua porção de ligaçãode antígeno, para o tratamento de AS em um paciente compre-endendo comparação de um nível predeterminado de um biomar-cador de degradação de colágeno e/ou biomarcador de sinovitea partir do paciente seguindo tratamento com o anticorpo TNFalfa humano, ou uma sua porção de ligação de antigeno, comum nivel padrão conhecido do biomarcador de degradação decolágeno e/ou biomarcador de sinovite a partir de um pacien-te tendo AS. Baseado nos dois níveis de biomarcadores, éfeita uma avaliação com relação a se o nível de biomarcadorde degradação de colágeno e/ou biomarcador de sinovite pós-tratamento de paciente é menor que o nível padrão conhecidodo biomarcador de degradação de colágeno e/ou biomarcador desinovite. Neste exemplo, um menor nível de biomarcador dedegradação de colágeno e/ou biomarcador de sinovite a partirdo paciente em relação ao nível padrão conhecido indica queo anticorpo humano TNF alfa, ou uma sua porção de ligação deantigeno, é previsto ser efetivo para o tratamento de AS nopaciente.

Nas situações acima onde é determinado que inibi-dor de TNF é efetivo na redução de biomarcadores associadoscom destruição de cartilagem e/ou sinovite, que, por suavez, reflete uma diminuição em destruição estrutural, istoé, destruição de junta, continuação do tratamento inibidorde TNF pode ser considerada. Em uma realização, pode-se con-siderar administração de mesmo regime de dose para o pacien-te. Alternativamente, pode-se considerar redução de dose doinibidor de TNF mostrada ser efetiva no tratamento de AS nopaciente.

A invenção provê um processo de uso de um biomar-cador de degradação de cartilagem sozinho ou em combinaçãocom um biomarcador de sinovite, assim como um processo parauso de um biomarcador de sinovite sozinho ou em combinaçãocom um biomarcador de degradação de cartilagem, para deter-minação de eficácia de um tratamento inibidor de TNF para AS.

Em adição, análises de biomarcador de sinovitee/ou degradação de colágeno podem ser realizadas sobre umaamostra de um paciente que ainda não recebeu terapia com uminibidor de TNF. Uma análise de biomarcadores de sinovite edegradação de colágeno pode ser realizada para determinar seo paciente é provável de responder a tratamento com um anti-corpo anti-TNF alfa, por exemplo, adalimumab. Niveis compa-ráveis de biomarcadores de sinovite e degradação de colágenode uma amostra de um paciente em relação a um nivel padrãoconhecido caracterizado como um nivel indicativo de AS, podeindicar que o paciente tem AS e, por isso, pode ser um can-didato para tratamento com um inibidor de TNF. Da mesma ma-neira, um tal paciente pode ser selecionado para tratamentocom um anticorpo anti-TNF alfa, por exemplo, adalimumab, demodo a prevenir dano estrutural que pode ocorrer com a pro-gressão da doença.

Em uma realização, o nivel controle é baseado nonivel de linha base de próprio paciente do biomarcador dedegradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinovite, ondeo nivel de linha base é determinado antes de tratamento como inibidor de TNF. Em um tal exemplo, o nivel de biomarcadorde degradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinoviteque é determinado seguindo tratamento é comparado com o ni-vel de linha base do paciente. A seguir, é feita uma deter-minação de se o inibidor de TNF é eficaz baseado em se o ní-vel de biomarcador de degradação de colágeno e/ou um biomar-cador de sinovite diminuiu no paciente seguindo tratamento.Em uma outra realização, o nível de linha base que é usadocomo um controle é baseado no nível do próprio paciente dobiomarcador de degradação de colágeno e/o.u um biomarcador desinovite em um dado ponto durante tratamento com o inibidorde TNF, onde o nível de linha base no dado ponto de tempodurante tratamento é comparado a um nível de biomarcador emum dado tempo a seguir enquanto paciente permanece em trata-mento .

Em uma realização, o nível padrão conhecido é ba-seado em um nível aceito do biomarcador de degradação de co-lágeno e/ou um biomarcador de sinovite associado com o esta-do de doença, isto é, associado com paciente (s) tendo AS. Onível padrão conhecido do nível de biomarcador de degradaçãode colágeno e/ou um biomarcador de sinovite pode ser baseadoem um paciente de AS simples ou, alternativamente, em umamédia obtida de um grupo de pacientes de AS. Por exemplo, emuma realização, o nível padrão conhecido de MMP-3 em soropara um paciente de AS está entre cerca de 10-200, cerca de15-180, cerca de 20-140, cerca de 30-120, cerca de 40-100,cerca de 50-80, cerca de 25-57, ou cerca de 60-70 ng/mL. Emuma outra realização, o nível padrão conhecido de CTX-II u-rinário para um paciente de AS está entre cerca de 300-1000,cerca de 300-800, cerca de 300-600, cerca de 315-395, cercade 320-390, cerca de 325-385, cerca de 330-380, cerca de325-385, cerca de 324-388, cerca de 335-375, cerca de 340-370, cerca de 345-365, ou cerca de 350-360 ng/mL.

Alternativamente, em uma outra realização, o nívelpadrão conhecido pode ser baseado nos níveis de biomarcadorde degradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinovite deum sujeito(s) não-afetado, saudável. 0 nível padrão conheci-do do nível de biomarcador de degradação de colágeno e/ou umbiomarcador de sinovite pode ser baseado em um sujeito sau-dável, não-afetado simples ou, alternativamente, em uma mé-dia de um grupo de sujeitos saudáveis, não-afetados. Exem-pios de valores normais de CTX-II urinário, isto é, valoresde sujeitos não-AS, saudáveis, são descritos em Haima (2005)Osteo Medicai Group Clinicai and Technical Monograph andMouritzen et al. (2003) Annals of the Rheumatic Diseases62:332. Por exemplo, em uma realização o nível padrão conhe-cido de MMP-3 em soro em um sujeito saudável, não-afetadoestá entre cerca de 13 e 15 ng/mL (ver Chen et al. (2006)Rheumatology 45:414).

Faixas intermediárias para os níveis de biomarca-dor recitados acima, por exemplo, cerca de 323 a cerca de329 mg/mL de CTX-II urinário, também são pretendidas seremparte desta invenção. Em adição, faixas de valores usandouma combinação de qualquer um dos valores recitados acimacomo limites superiores e/ou inferiores são pretendidos se-rem incluídas. Em adição, os limites superiores descritosacima não são pretendidos serem limitantes com relação a ní-veis aumentados de MMP-3 e CTX-II em pacientes com AS.

O nível do biomarcador de degradação de colágenoe/ou um biomarcador de sinovite é considerado alterado apartir de controle, isto é, o nível de pré-tratamento dopróprio paciente ou nível padrão conhecido, se o nível émaior / aumentado ou menor / diminuído em relação ao contro-le. Em uma realização, o nível do biomarcador de degradaçãode colágeno e/ou um biomarcador de sinovite derivado de umpaciente de AS é considerado maior / aumentado em relação aonível controle se o nível de biomarcador de degradação decolágeno e/ou um biomarcador de sinovite é maior / aumentadoque o nível controle por uma quantidade que é maior que oerro padrão do ensaio empregado para avaliar o nível. Em umarealização, o nível de biomarcador de degradação de colágenoe/ou um biomarcador de sinovite derivado de um paciente deAS é considerado menor / diminuído em relação ao nível con-trole se o nível de biomarcador de degradação de colágenoe/ou um biomarcador de sinovite é menor / diminuído que onível controle por uma quantidade que é maior que o erro pa-drão do ensaio empregado para avaliar o nível. Em uma outrarealização, o nível do nível de biomarcador de degradação decolágeno e/ou um biomarcador de sinovite derivado de um pa-ciente adoentado pode ser considerado maior / aumentado oumenor / diminuído que o nível controle se a diferença no ní-vel controle e o nível de biomarcador de degradação de colá-geno e/ou um biomarcador de sinovite derivado de uma amostrade paciente que é pelo menos duas, três, quatro, ou cincovezes, maior ou menor que o erro padrão de medições de con-trole e amostra.

Em uma realização, eficácia do inibidor de TNF émostrada quando níveis de CTX-II para um sujeito tendo ASdiminuem pelo menos entre cerca de 5-100%, cerca de 5-80%,cerca de 5-60%, cerca de 5-45%, cerca de 5-40%, cerca de 5-35%, cerca de 5-30%, cerca de 5-25%, cerca de 5-20%, cercade 5-15%, cerca de 5-10%, cerca de 6-9%, cerca de 7-8%, oucerca de 9% em relação à linha base ou nivel padrão conheci-do. Em uma realização, eficácia do inibidor de TNF é mostra-da quando níveis de MMP-3 diminuem pelo menos cerca de 5-50%, cerca de 5-45%, cerca de 5-40%, cerca de 5-35%, cercade 5-30%, cerca de 5-25%, cerca de 5-20%, cerca de 5-15%,cerca de 5-13%, cerca de 6-12%, cerca de 7-11%, ou cerca de8% em relação a linha base ou nível padrão conhecido para umsujeito tendo AS. Ainda em uma realização, eficácia do ini-bidor de TNF é mostrada quando níveis de MMP-3 diminuem pelomenos cerca de 12% em relação a linha base ou nível padrãoconhecido para um sujeito tendo AS. .

Faixas intermediárias para os níveis de biomarca-dor recitados acima, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 10%,também são pretendidas serem parte desta invenção. Em adi-ção, faixas de valores usando uma combinação de quaisquerdos valores recitados acima como limites superiores e/ou in-feriores são pretendidos serem incluídos. Em adição, os li-mites de porcentagens superiores descritos acima não sãopretendidos serem limitantes com relação a níveis diminuídosde porcentagem de MMP-3 e CTX-II pacientes com AS, isto é,maiores diminuições de porcentagens também são contempladaspela invenção.

Biomarcadores de degradação de cartilagemCartilagem articular é composta largamente de redefibrilar baseada em colágeno tipo II complexada com o prote-oglicano agrecan (ver Poole AR, 2003. Rheum Dis Clin NorthAm 29:803-818 e Eyre (1991) Semin Arthritis Rheum. 21 (3Suppl 2):2-11). Em doença de junta, colágeno tipo II é pro-gressivamente clivado por colagenases. Colágeno tipo II édegradado de modo que os produtos do processo de degradaçãocaem em três grupos de acordo com a localização do particu-lar epitopo dentro de molécula de colágeno (para revisão verBirmingham et al. (2006) Biomarker Insights 2:61, aqui in-corporada por referência). Os diferentes tipos de epitopos,incluindo neoepitopos e telopeptideo epitopos, podem ser u-sados como indicadores de eventos degradantes associados comcolágeno.

Colágeno tipo II maduro consiste em uma estruturade hélice tripla com telopeptideos curtos em ambas extremi-dades. Os telopeptideos são reticulados covalentes a outrasfitas de colágeno servindo para conectar individuais molécu-las de colágeno em uma estrutura fibrilar rígida. Fragmentosde colágeno maduro são gerados quando a matriz extracelularde cartilagem é degradada. Tais fragmentos são encontradosem ambos, soro e urina e podem ser medidos como marcadorespara catabolismo de cartilagem. Telopeptideos incluemcol2CTx e CTX-II (W0 91/08478; Christgau et al. (2001) Boné29:209; Matyas et al. (2004) Arthritis Rheum 50:543; e Eyre(1989) "Peptide fragmentscontaining HP e LP cross-links, USP5702909, cada uma das quais é aqui incorporada por referên-cia).

Proteólise causa uma perda de epitopos de colágenotipo II para fluidos do corpo, por isso, através de exame deepitopos de colágeno tipo II em fluidos do corpo, a quanti-dade de degradação de colágeno pode ser determinada (verBirmingham et al. (2006) Biomarker Insights 2:61 e Christgauet al. (2001) Bone 29:209, cada uma das quais é aqui incor-porada por referência). A habilidade para monitorar e dimi-nuir ou reverter o processo de degradação de colágeno é im-portante a partir de um ponto de vista clinico, na medida emque extensiva degradação de fibras de colágeno tipo II reti-culadas maduras é considerado ser um estágio critico, mesmopossivelmente irreversível em destruição de junta (Billin-ghurst et al. (1997)).

A invenção aqui descrita usa biomarcadores de de-gradação de cartilagem para determinar a eficácia de um ini-bidor de TNF para o tratamento de AS, que tem um componentede doença que inclui dano estrutural, isto é, dano de junta.Em uma realização, CTX-II, que está localizado quase exclu-sivamente em cartilagem, é usado nos processos e composiçõesda invenção como um biomarcardor de colapso de cartilagem.

CTX-II

Em uma realização preferida, o biomarcador de de-gradação de colágeno é telopeptídeo-C colágeno tipo II (CTX-II) . CTX-II é um fragmento de colágeno, originando do colá-geno tipo II terminal-C. CTX-II é idêntico a neoepítopoCol2CTx, encontrado no terminus-C do fragmento de H de com-primento de colágeno tipo II clivado (para revisão, ver Bir-mingham et al. (2006), aqui incorporado por referência).

CTX-II é conhecido como um biomarcador para degra-dação de cartilagem. CTX-II foi primeiro associado com de-gradação de cartilagem em pacientes com osteoartrite de joe-lho (Garnero et al. (2001) Annals Rheum Dis 60:619), ondesubseqüente elevação de CTX-II em urina de pacientes com se-vera osteoartrite foi determinada (Jung et al. (2004) Patho-biol 71:70). CTX-II também foi mostrado correlacionar comgrau de destruição de junta (Christgau et al. (2001) Boné29:209; Garnero and Delmas (2003) Curr Op Rheumat 25:641).

Em um aspecto, a invenção provê um processo de de-terminação de eficácia de um inibidor de TNF alfa para otratamento de AS em um paciente compreendendo comparação deum predeterminado nivel de CTX-II a partir do paciente se-guindo tratamento com o inibidor de TNF alfa com um nivelpadrão conhecido de CTX-II associado com AS. Uma avaliação éentão feita referindo-se à relação entre os dois níveis deCTX-II para determinar se o nível de CTX-II pós-tratamentodo paciente é menor que o nível padrão conhecido de CTX-II.Um nível diminuído de CTX-II em relação a um padrão conheci-do representando o estado de doença AS indica que o inibidorde TNF alfa é efetivo para o tratamento de AS no paciente.Em um tal exemplo, o nível padrão conhecido pode representarum nível CTX-II de um sujeito tendo atividade de doença AS,isto é, um paciente afetado, não-tratado.

Em um outro aspecto, a invenção provê um processopara determinação de eficácia de um inibidor de TNF alfa pa-ra diminuição de dano estrutural associado com espondiliteancilosante (AS) em um paciente compreendendo comparação deum predeterminado nível de CTX-II a partir do paciente tendoAS seguindo tratamento com o inibidor de TNF alfa com um co-nhecido nivel padrão de CTX-II associado com AS. É feita en-tão uma avaliação com relação aos dois níveis de CTX-II paradeterminar se o nível de CTX-II pós-tratamento de paciente émenor que o nível padrão conhecido de CTX-II. Se o nível deCTX-II do paciente é menor que CTX-II em relação ao nívelpadrão conhecido, então um tal resultado indica que o inibi-dor de TNF alfa é efetivo na diminuição de dano estruturalassociado com AS no paciente.

Em uma realização, a invenção descreve um processopara determinação de eficácia de um inibidor de TNF alfa pa-ra o tratamento de AS em um paciente compreendendo compara-ção de um nível pós-tratamento, predeterminado, der CTX-IIobtido do paciente com um nível pré-tratamento, predetermi-nado, de CTX-II obtido do paciente. É então feita uma avali-ação com relação aos dois níveis de CTX-II para determinarse o nível de CTX-II pós-tratamento é menor que o nível deCTX-II pré-tratamento, onde um menor nível de CTX-II pós-tratamento do paciente em relação ao nível de CTX-II pré-tratamento indica que o inibidor de TNF alfa é efetivo parao tratamento de AS no paciente.

Biomarcadores de Sinovite

Sinovite (inflamação) agora conhecida ocorrer ini-cialmente em doenças inflamatórias, como osteoartrite, e éassociada com progressão radiológica da doença. 0 processoatravés do qual inflamação, incluindo inflamação subclínica,pode exacerbar dano de junta é provável de envolver mudançasem função de condrócito, aumentada angiogênese, e/ou acele-rada metabolização de osso (Bonnet and Walsh DA. (2005)Rheumaology 44:7-16). A invenção aqui descrita usa biomarca-dores sinoviais para determinar a eficácia de um inibidor deTNF para o tratamento de AS. Em uma realização, MMP-3 de so-ro, que provavelmente se origina na junta inflamada (Krui-thof et al. (2005) Arthritis Rheum 52:3898), é usado como umbiomarcador de sinovite para determinar a eficácia de um i-nibidor de TNF para o tratamento de AS.

MMP-3

A degradação de moléculas de matriz de cartilagemenvolve endopeptidases dependentes de zinco, por exemplo ma-triz metaloproteases (MMPs). MMPs, uma família de endopepti-dases dependentes de Zn2+, cliva constituintes de matriz ex-tracelular (ECM) como colágenos e proteoglicanos. MMPs medi-am diferentes processos fisiológicos através de digestão decomponentes da matriz extracelular.

MMP3 é uma enzima que degrada fibronectina, Iami-nina, colágenos III, IV, IX, e X, e proteoglicanos de carti-lagem. Existem atualmente pelo menos 20 tipos de MMPs huma-nas, que são agrupadas de acordo com a estrutura e específi-co substrato em: colagenase (MMP-1, -8, -13), estromelisina,gelatinase (MMP-2, -9) e metaloproteinases de ligação demembrana de plasma (ver, por exemplo, Nabeshima K et al.2002 Pathol Int 52:255-64).

Em uma realização preferida, o biomarcador de si-novite usado na invenção é MMP-3. Níveis em soro de MMP-3foram mostrados serem aumentados em doenças reumáticas in-flamatóriasd caracterizadas por sinovite de junta, tal comoRA, polimialgia reumática, artrite psoriática, e artritecristal aguda. Niveis em soro de MMP-3 são aceitos como re-fletindo inflamação sinovial (ver Ribbens et al. (2002) An-nals of the Rheumatic Diseases 61:161). Em adição, estudosanteriores correlacionaram matriz metaloproteinases (MMPs),especificamente MMP-3 (estromelisina 1) , com o valor de ín-dice de Atividade de Doença Espondilite Ancilosante Bath(BASDAI) em pacientes de AS (ver Yang, C. et al. (2004) Art-hritis Rheum 51:691-9).

A seqüência de aminoácidos de MMP-3 é conhecida epode ser encontrada em, por exemplo, GenBank Accession No.AAI07491. A seqüência de nucleotídeos de MMP-3 também é co-nhecida e pode ser encontrada em, por exemplo, GenBank Ac-cession No. NM002422.

A invenção ainda inclui uso do biomarcador de de-gradação de cartilagem, por exemplo, CTX-II e o biomarcadorde sinovite, por exemplo, MMP-3, tanto sozinhos como em com-binação um com outro, para obter os processos da invenção.Em adição, qualquer biomarcador pode ser usado em combinaçãocom proteína reativa-C para ainda determinar a eficácia doinibidor de TNF para o tratamento de AS.

Níveis de proteína reativa-C (CRP) podem ser usa-dos em combinação com um biomarcador de degradação de carti-lagem, por exemplo, CTX-II, e o biomarcador de sinovite, porexemplo, MMP-3, como um indicador de status de doença AS e aeficácia de uma dada terapia anti-TNF. CRP pertence à famí-lia pentraxina de proteínas, assim chamadas porque têm cincosubunidades idênticas, codificadas por um gene simples nocromossoma 1, que associam-se para formação de uma estávelestrutura pentamérica semelhante a disco. CRP é exclusiva-mente fabricada no figado e é secretada em quantidades au-mentadas dentro de 6 horas de um estimulo inflamatório agu-do. Elevados níveis de CRP proporcionam um índice sensívelde andamento de inflamação, e, por isso, provê um valiosoadjunto para uma cuidadosa avaliação clínica.

Ensaios para determinar nível de biomarcadores

0 nível de um biomarcador de degradação de carti-lagem e/ou sinovite em uma amostra pode ser analisado atra-vés de um número de metodologias conhecidas na técnica. Umavez a amostra seja obtida do paciente, qualquer processo co-nhecido na técnica apropriado para detecção e quantificaçãode um biomarcador de sinovite ou degradação de cartilagempara uso nos processos da invenção pode ser usado (tano nonível de ácido nucléico ou, preferivelmente, de proteína).

Tais processos são bem conhecidos na técnica mas não são li-mitados a Western blots, Northern blots, Southern blots, i-muno histoquímica, ELISA, por exemplo, ELISA amplificado,ensaios baseados em sangue quantitativos, por exemplo, ELISAde soro, ensaios baseados em urina quantitativos, por exem-plo, para examinar níveis de expressão de proteína ou degra-dação no caso de CTX-II, imunoprecipitação, imunofluorescên-cia, citometria de fluxo, imunocitoquímica, análises de es-pectrometria de massa, por exemplo, MALDI-TOF e SELDI-TOF,técnicas de hibridização de ácido nucléico, processos detranscrição reversa de ácido nucléico, e processos de ampli-ficação de ácido nucléico. Exemplos de tais ensaios são des-critos em mais detalhes abaixo:

Ensaios Baseados Em Proteínas

Os processos da invenção podem ser realizados u-sando ensaios baseados em proteínas para determinar o níveldo biomarcador dado. Exemplos de ensaios baseados em proteí-na incluem análises Western e/ou imuno histoquímicas, ensai-os baseados em sangue quantitativos, por exemplo, ELISA emsoro, e ensaios baseados em urina quantitativos, por exem-plo, ELISA em urina. Em uma realização, um ensaio imuno érealizado para prover uma avaliação quantitativa do dado bi-omarcador .

Proteínas de amostras de paciente podem ser isola-das usando-se técnicas que são bem conhecidas por aquelesversados. Os processos de isolamento de proteína empregadospodem ser, por exemplo, tais como aqueles descritos em Har-low and Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Labora-tory Manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold S-pring Harbor, New York).

A quantidade de biomarcador de degradação de car-tilagem ou sinovite pode ser determinada através de detecçãoou quantificação de correspondente polipeptídeo expresso. Opolipeptídeo pode ser detectado e quantificado através dequalquer um de um número de meios bem conhecidos por aquelesversados na técnica. Estes podem incluir processos bioquími-cos analíticos como eletroforese, eletroforese capilar, cro-matografia líquida de alta performance (HPLC), cromatografiade camada fina (TLC), cromatografia de hiper-difusão, e se-melhantes, ou vários processos imunológicos como reações deprecipitina gel ou fluido, imunodifusão (simples ou dupla),imunoeletroforese, ensaio rádio-imuno (RIA), ensaios imuno-sorventes ligados a enzima (ELISAs), ensaios imunofluores-centes, e Western blotting.

Em uma realização o nivel de biomarcador de degra-dação de cartilagem e/ou sinovite pode ser determinado usan-do um ensaio imune. O uso de anticorpos direcionados parabiomarcadores aqui descritos pode ser usado para selecionaramostras biológicas humanas, por exemplo, fluidos, para osníveis do específico antígeno de biomarcador, isto é, bio-marcador de degradação de colágeno e/ou sinovite. Por meiode ilustração, fluidos humanos, tais como soro de sangue ouurina, podem ser tomados de um paciente e ensaiados para umespecífico epítopo, tanto como antígeno liberado ou ligado amembrana sobre células no fluido de amostra, usando anticor-pos anti-biomarcador em RIAs ou ELISAs padrões, por exemplo,conhecidos na técnica. Os anticorpos usados em tais proces-sos são preferivelmente anticorpos monoclonais. Em uma rea-lização, avaliação imuno-sorológica in vitro de soros reti-rados de pacientes pelo que permite determinação não-invasiva da progressão ou redução de degeneração de cartila-gem, assim como um aumento ou diminuição em sinovite baseadoem níveis em soro de correspondentes biomarcadores. Em umarealização, um ensaio imuno para avaliação quantitativa dedegradação de cartilagem medindo o nível de CTX-II em urinahumana é realizado. Em uma realização, um ensaio imuno paraavaliação quantitativa de sinovite medindo os níveis de MMP-3 em soro humano é realizado.Em ensaios imuno, o agente para detecção de um po-lipeptideo biomarcador de degradação de cartilagem ou sino-vite pode ser um anticorpo capaz de ligação à proteína dobiomarcador de degradação de cartilagem e/ou sinovite. Anti-corpos podem ser policlonais, ou mais preferivelmente, mono-clonais. Um anticorpo intacto, ou um seu fragmento (por e-xemplo, Fab ou F(ab')2) pode ser usado.

Em uma realização, anticorpos direcionados paraCTX-II, incluindo CTX-II de urina, são usados em ensaios i-muno, por exemplo, ELISA, para determinar o nível de CTX-IIem uma amostra de um paciente tendo AS. Em uma realização,níveis de CTX-II podem ser medidos em amostras de urina ousoro de um paciente. Em uma realização, um anticorpo que po-de ser usado nos processos e composições da invenção paradetecção e quantificação de CTX-II em urina humana é anti-corpo monoclonal mAbF46 (ver Christgau et al. (2001) Boné29:209) e F4601 (ver Oestergaard et al. (2006) Osteoarthri-tis cartilage. 14 (7) :670) .

Em uma realização, anticorpos direcionados a MMP-3, incluindo MMP-3 de soro, são usados em ensaios imuno, porexemplo, ELISA, para determinar o nível de MMP-3 em uma a-mostra de um paciente tendo AS. Em uma realização, MMP-3 po-de ser medida em amostras de soro do paciente. Em uma reali-zação, um anticorpo para detecção e quantificação de MMP-3em soro humano é anticorpo monoclonal mAblB4 (Murray GI etal. Gut 43:791-7 (1998)).

Ensaios de ligação competitivos podem ser usadospara determinar o nível da proteína correspondendo ao bio-marcador de degradação de colágeno e/ou sinovite. Um exemplode um ensaio de ligação competitivo é um ensaio sanduícheimuno-sorvente ligado a enzima (ELISA). ELISA pode ser usadopara detectar a presença de biomarcador de degradação de co-lágeno e/ou sinovite em uma amostra. ELISA é um ensaio imunosensível que usa uma enzima ligada a um anticorpo ou antíge-no como um marcador para a detecção de uma específica prote-ína, especialmente um antígeno ou anticorpo. ELISA é um en-saio onde antígeno ou anticorpo ligado é detectado por umaenzima ligada que genericamente converte um substrato inco-lor em um produto colorido, ou um produto que pode ser de-tectado. Um dos tipos mais comuns de ELISA é "ELISA sanduí-che". Em uma realização, o nível do biomarcador de degrada-ção de cartilagem e/ou sinovite é determinado usando um en-saio ELISA.

Em adição, aqueles versados na técnica podem fa-cilmente adaptar conhecidos processos de detecção de proteí-na / anticorpo para uso em determinação de quantidade de ummarcador da presente invenção (isto é, CTX-II e/ou MMP-3).

Processos para avaliação de CTX-II como um biomar-cador para destruição de junta são conhecidos na técnica, esão descritos, por exemplo, em Oestergaard et al. (2006) Os-teoarthritis Cartilage. 14(7):670 e Mouritzen et al. (2003)Annals of the Rheumatic Diseases 62:332, aqui incorporadopor referência. Ensaios para determinação de níveis de CTX-II são comercialmente disponíveis, incluindo, por exemplo,Urine Cartilaps ans Serum Cartilaps (Nordisc Bioscience Di-agnostics). 0 ensaio Urine Cartilaps foi usado em estudosclínicos para avaliação quantitativa de degradação de carti-lagem em artrite reumatóide e osteoartrite. Por exemplo, U-rine CartiLaps ELISA é baseado na ligação competitiva de umanticorpo monoclonal a fragmentos urinários de colágeno tipoII, isto é, CTX-II ou a peptideos sintéticos, biotiniladosligados à superfície de placas de microtitulação revestidascom streptavidina. Inicialmente, peptideos sintéticos, bio-tinilados, são ligados à superfície de cavidades revestidascom streptavidina da placa de microtitulação. Após lavagem,padrões, controles, e amostras de urina são pipetadas nascavidades seguido pela adição de uma solução do anticorpomonoclonal. As cavidades são lavadas, e uma solução de imu-noglobulina anti-camundongo conjugada com peroxidase (coe-lho) é adicionada às cavidades. Seguindo a segunda etapa delavagem, um substrato cromogênico é adicionado a todas ascavidades e a reação de cor é interrompida com ácido sulfú-rico e a absorbância é medida. Adicionais exemplos com rela-ção a como ensaiar CTX-II usando ELISA são descritos em C-hristgau (2001) Boné 29:209, aqui incorporado por referên-cia.

Em uma realização, um ensaio imuno para determina-ção de nível de MMP-3 biomarcador de sinovite em soro humanoé realizado. Processos para ensaio der MMP-3 como um biomar-cador de sinovite são conhecidos na técnica, e são descri-tos, por exemplo, em Tamarat et al. (2003) PNAS 100:8555. Emadição, kits comerciais disponíveis para teste de níveis deproteína MMP-3 incluem o sistema ELISA Biotrak Metallopro-teinase-3 Matrix Human (Amersham) (ver também Yang et al.(2004) Arthritis and Rheumatism 51:691). Exemplos adicionaisdescrevendo como ensaiar proteína MMP-3 são descritos emChen et al.(2006) Rheumatology 45:414.

Em uma realização, anticorpos, ou fragmentos deanticorpos, são usados em processos tais como Western blotsou técnicas de imunofluorescência para detectar as proteínasexpressas. Em tais usos, é genericamente preferível imobili-zar o anticorpo ou proteínas sobre um suporte sólido. Apro-priados suportes de fase sólida ou carreadores incluem qual-quer suporte capaz de ligação de um antígeno ou um anticor-po. Suportes ou carreadores bem conhecidos incluem vidro,poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon,amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas,gabbros, e magnetita.

Aqueles versados na técnica conhecerão muitos ou-tros carreadores apropriados para ligação de anticorpo ouantígeno, e serão capazes de adaptar tal suporte para usocom a presente invenção. Por exemplo, proteína isolada decélulas podem ser corridas sobre uma eletroforese de gel depoliacrilamida e imobilizadas sobre um suporte de fase sóli-da tal como nitrocelulose. 0 suporte então pode ser lavadocom apropriados tampões seguido por tratamento com o anti-corpo detêctavelmente marcado. 0 suporte de fase sólida en-tão pode ser lavado com o tampão uma segunda vez para remo-ção de anticorpo não-ligado. A quantidade de marcador ligadosobre o suporte sólido então pode ser detectada através demeios convencionais. Meios de detecção de proteínas usandotécnicas eletroforéticas são bem conhecidos por aqueles ver-sados na técnica (ver, genericamente, R. Scopes (1982) Pro-tein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990)Methods in Enzyxnology Vol. 182: Guide to Protein Purif icati-on, Academic Press, Inc., N.Y.).

Outros processos padrões usando anticorpos paradetecção e quantificação de marcadores de sinovite e/ou de-gradação de colágeno incluem, mas não são limitados a, en-saios rádio-imunes ("RIA"), ensaios receptores, ensaios imu-no de enzimas ("EIA"), bioensaios citoquimicos, ensaios deligantes, ensaios imuno-radiométricos, ensaios flúor imuno,e ensaios imuno - sorventes ligados a enzima ("ELISA"). Ain-da um processo inclui, para facilidade de detecção, e suanatureza quantitativa, o ensaio de anticorpo duplo ou sandu-íche, do qual existe um número de variações, todas as quaissão pretendidas serem abrangidas pela presente invenção. Es-tes processos são bem conhecidos e serão entendidos por a-queles versados na técnica requererem uma razoável quantida-de de experimentação para otimização de interação entre an-ticorpos e antígenos e a detecção dos antigenos pelos anti-corpos. Estas e outras técnicas de ensaio imuno podem serencontradas em Principies And Practice Of Immunoassay, 2ndEdition, Price and Newman, eds., MacMillan (1997) and Anti-bodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold s-pring Harbor Laboratory, Ch. 9 (1988), cada um dos quais éaqui incorporado por referência em sua totalidade.

Anticorpos usados em ensaios imuno conhecidos natécnica e aqui descritos para determinação de níveis de bio-marcadores, podem ser marcados com um marcador detectável. 0termo "marcado", com relação à sonda ou anticorpo, é preten-dido abranger marcação direta da sonda ou anticorpo atravésde acoplamento (isto é, ligação física) de uma substânciadetectável à sonda ou anticorpo, assim como marcação indire-ta da sonda ou anticorpo através de reatividade com um outroreagente que é marcado diretamente. Exemplos de marcação in-direta incluem detecção de um anticorpo primário usando umanticorpo secundário fluorescentemente marcado e marcação deextremidade de uma sonda de ADN com biotina de modo que elepossa ser detectado com streptavidina fluorescentemente mar-cada .

Em uma realização, o anticorpo é marcado, por e-xemplo, um anticorpo marcado com enzima, ou marcado com flu-oróforo, marcado com cromóforo, marcado com rádio. Em umaoutra realização, um derivado de anticorpo (por exemplo umanticorpo conjugado com um substrato ou com a proteína ouligante de um par de proteína - ligante (por exemplo, bioti-na - streptavidina)), ou um fragmento de anticorpo (por e-xemplo, um anticorpo de cadeia simples, um domínio hiper-variável de anticorpo isolado, etc.) que se liga especifica-mente com uma proteína biomarcadora de sinovite ou degrada-ção de cartilagem.

Em uma realização da invenção, processos proteômi-cos, por exemplo, espectrometria de massa, são usados paradetecção e quantificação de biomarcador de sinovite ou de-gradação de cartilagem. Por exemplo, espectrometria de massade tempo-de-vôo de dessorção / ionização de laser associadocom matriz (MALDI-TOF MS) ou espectrometria de massa de tem-po-de-vôo dessorção / ionização de laser aperfeiçoada de su-perfície (SELDI-TOF MS) que envolve a aplicação de uma amos-tra biológica, tal como soro, a um chip de ligação de prote-ína (Wright, G. L. Jr., et al. (2002) Expert Ver Mol Diagn2:549; Li, J., et al. (1002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C.,et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al.(2002) 359:572; Adam, B.L., et al.(2002) Câncer Res 62:3609;Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., etal. (2001) Câncer Res 61:6029) pode ser usada para detectare quantificar biomarcador de sinovite ou degradação de car-tilagem. Processos espectrométricos de massa são descritosem, por exemplo, patentes US 5 622 824, 5 605 798 e 5 547835, os inteiros conteúdos de cada uma das quais são aquiincorporados por referência.

ARN

Em uma realização, o nível de um ARNm codificandoo dito biomarcador pode ser medido usando processos conheci-dos por aqueles versados na técnica, por exemplo análisesNorthern. Expressão de gene do biomarcador pode ser detecta-da no nível de ARN. ARN pode ser extraído de células usandotécnicas de extração de ARN incluindo, por exemplo, uso deextração com isotiocianato de guanidina / fenol ácido (RNA-zol B; Biogenesis), Rneasy RNA preparation kits (Qiagen) ouPAXgene (PreAnalytix, Switzerland). Formatos de ensaios tí-picos utilizando hibridização de ácido ribonucléico incluemensaios de corrida -sobre nucleares, RT-PCR, ensaios de pro-teção Rnase (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), Nor-thern blotting e hibridização in situ. Expressão de genetambém pode ser detectada através de análises de micro-arranjo como descrito abaixo.

Para Northern blotting, amostras de ARN são pri-meiro separadas por tamanho via eletroforese em um gel deagarose sob condições desnaturantes. 0 ARN é então transfe-rido para uma membrana, reticulado e hibridizado com umasonda marcada. Sondas rádio-marcadas de alta atividade espe-cifica ou não-isotópicas podem ser usadas incluindo sondasde ADN geradas por PCR ou traduzidas de corte, iniciadasrandômicas, sondas de ARN transcritas in vitro, e oligonu-cleotideos. Adicionalmente, seqüências com homologia somenteparcial (por exemplo, ADNc de uma espécie diferente ou frag-mentos de ADN genômico que podem conter um exon) podem serusada como sondas.

Ensaios de proteção de de nuclease (incluindo am-bos ensaios de proteção de ribonuclease e ensaios de Sl nu-clease) proporcionam um processo extremamente sensível paraa detecção e quantificação de específicos ARNms. As bases daNPA é hibridização de solução e uma sonda anti-sentido (rá-dio - marcada ou não-isotópica) para uma amostra de ADN. A-pós hibridização, sonda não-hibridizada, de fita simples eARN são degradados por nucleases. Os fragmentos protegidosrestantes são separados sobre um gel de acrilamida. NPAspermitem a simultânea detecção de várias espécies de ARN.

Hibridização in situ ' (ISH) é uma ferramenta pode-rosa e versátil para a localização de ARNms específicos emcélulas ou tecidos. Hibridização da sonda ocorre dentro dacélula ou tecido. Uma vez que estrutura celular é mantidapor todo o procedimento, ISH provê informação sobre a loca-lização de ARNm dentro de amostra de tecido.

O procedimento começa através de fixação de amos-tras em formalina tamponada neutra, e embutindo o tecido emparafina. As amostras são então fatiadas em seções finas emontadas sobre lâminas de microscópio. (Alternativamente,tecido pode ser seccionado congelado e pós-fixado em para-formaldeido). Após uma série de lavagens para retirar cera ereidratar as seções, uma digestão com proteinase K é reali-zada para aumentar acessabilidade de sonda, e uma sonda mar-cada é então hibridizada para as seções de amostra. Sondasmarcadas com rádio são visualizadas com filme liquido secadosobre as lâminas, enquanto sondas marcadas não-isotopicamente são convenientemente detectadas com reagentescolorimétricos ou fluorescentes. Este último processo de de-tecção é a base para hibridização in situ fluorescente(FISH).

Processos para detecção que podem ser empregadosincluem marcadores radioativos, marcadores enzima, marcado-res quimioluminescentes, marcadores luminescentes e outrosmarcadores apropriados.

Tipicamente, RT-PCR é usada para amplificar alvosARN. Neste processo, a enzima transcriptase reversa é usadapara converter ARN a DNA complementar (ADNc) que então podeser amplificado para facilitar detecção. RT-PCR quantitativarelativa envolve amplificação de um controle interno simul-taneamente com o gene de interesse. O controle interno é u-sado para normalizar as amostras. Uma vez normalizadas, com-parações diretas de relativa abundância de um especificoARNm podem ser feitas através de amostras. Controles inter-nos comumente usados incluem, por exemplo, GAPDH, HPRT, ac-tina e ciclofilina.

Muitos processos de amplificação de ADN são conhe-cidos, maior parte dos quais baseiam-se em uma reação de ca-deia enzimática (tal como reação de cadeia polimerase, umareação de cadeia ligase, ou uma replicação de seqüência auto- sustentada) ou a partir de replicação de todo ou parte dovetor no qual ele foi clonado.

Muitos processos de amplificação de sinal e alvo(TAS) foram descritos na literatura, por exemplo, revisõesgenéricas destes processos em Landegren, U. et ai., Science242:229-237 (1988) e Lewis, R., Genetic Engineering News10:1, 54-55 (1990). PCR é um processo de amplificação deácido nucléico comum na técnica e descrito inter alia naspatentes US 4 683 195 e 4 683 202. PCR pode ser usada paraamplificar qualquer ácido nucléico conhecido em um contextodiagnóstico (Mpk et al., 1994, Gynaecologi Oncology 52:247-252). Replicação de seqüência auto-sustentada (3SR) uma va-riação de TAS, que envolve a amplificação isotérmica de ummolde de ácido nucléico via ciclos seqüenciais de transcrip-tase reversa (RT), atividades dè polimerase e nucleasequesão mediadas por um coquetel de enzimas e apropriados inici-adores oligonucleotideos (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA 87:1874). Reação de amplificação de ligação ou sis-tema de amplificação de ligação usa DNA ligase e quatro oli-gonucleot ideos , dois por tira alvo. Esta técnica é descritapor Wu, D. Y. and Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560. Natécnica de Q.beta Replicase, ARN replicase para o bacterió-fago Q beta, que replica ARN de fita simples, é usada paraamplificar o ADN alvo, como descrito por Lizardi et al.,1988, Bio/TechnoIogy 6:1197. PCR quantitativa (Q-PCR) é umatécnica que permite que relativas quantidades de transcritosdentro de uma amostra sejam determinadas.

III.Inibidores de TNF

Esta invenção descreve um processo para determina-ção de eficácia de um inibidor de TNF alfa, por exemplo, umanticorpo TNF alfa humano, ou uma sua porção de ligação deantigeno, para tratamento de espondilite ancilosante (AS). Ainvenção também provê um processo de monitoração de eficáciade um inibidor de TNF alfa, por exemplo, um anticorpo TNFalfa humano, ou uma sua porção de ligação de antigeno, paradiminuição de progressão de dano estrutural associado comespondilite ancilosante (AS) em um paciente. A invenção ain-da inclui um processo para prever a eficácia de um inibidorde TNF alfa, por exemplo, um anticorpo TNF alfa humano, ouuma sua porção de ligação de antigeno, para o tratamento deAS em um paciente. Composições e kits para os processos rei-vindicados também são contemplados como parte da invenção.

Em uma realização, estes processos incluem deter-minação de eficácia de anticorpos humanos isolados, ou suasporções de ligação de antigeno, que ligam a TNF alfa humanocom alta afinidade e uma baixa taxa de saida , e têm uma al-ta capacidade neutralizante. Preferivelmente, os anticorposhumanos usados na invenção são anticorpos anti-hTNF alfa hu-manos neutralizantes, recombinantes. 0 anticorpo neutrali-zante, recombinante mais preferido da invenção é aqui refe-rido como D2E7, também referido como HUMIRA e adalimumab (aseqüência de aminoácidos da região VL de D2E7 é mostrada emSEQ ID NO: 1; a seqüência de aminoácidos da região VH deD2E& é mostrada em SEQ ID NO: 2) . As propriedades de D2E7(adalimumab / HUMIRA) foram descritas em Salfeld et al., pa-tentes US Nos. 6 090 382, 6 258 562, e 6 509 015, que sãoaqui incorporadas por referência. Os processos da invençãotambém podem ser realizados usando anticorpos anti-hTNF alfamurinos humanizados e quiméricos que sofreram testes clíni-cos para tratamento de artrite reumatóide (ver, por exemplo,Elliott, M.J., et al., (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliott,M.J., et al., (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin, E.C., etal. (1995) Br.J. Rheumatol. 34:334-342).

Em uma realização, o processo da invenção incluideterminação de eficácia de anticorpos D2E7 e porções de an-ticorpos, anticorpos relacionados com D2E7 e porções de an-ticorpos, e outros anticorpos humanos e porções de anticor-pos com propriedades equivalentes a D2E7, tal como alta afi-nidade de ligação a hTNF alfa com baixas cinéticas de disso-ciação e alta capacidade de neutralização, para o tratamentode AS. Em uma realização, a invenção provê tratamento com umanticorpo humano isolado, ou uma sua porção de ligação deantígeno, que dissocia de TNF alfa humano com uma Kd de 1 χ10-8 M ou menos e uma constante de taxa Koff de 1 χ 10-3 s-1 oumenos, ambas determinadas por ressonância plasmon de super-fície, e neutraliza citotoxidez de TNF alfa humano em um en-saio L929 in vitro padrão com uma IC50 de 1 xlO"7 M ou menos.Mais preferivelmente, o anticorpo humanoi isolado, ou suaporção de ligação de antigeno, dissocia de TNF alfa humanocom uma KQff de 5 χ 10"4 s"1 ou menos, ou mesmo mais preferi-velmente, com uma KDff de 1 χ 10~4 s"1 ou menos. Mais preferi-velmente, o anticorpo humano isolado, ou sua porção de liga-ção de antigeno, neutraliza citotoxidez de TNF alfa humanaem um ensaio L929 in vitro padrão com uma IC50 de 1 χ 10"8 Mou menos, mesmo mais preferivelmente com uma IC50 de 1 χ 10"9 M ou menos e ainda mais pref erivelmente com uma IC50 de 1 χ10"10 M ou menos. Em uma realização preferida, o anticorpo éum anticorpo recombinante humano isolado, ou uma sua porçãode ligação de antigeno.

É bem conhecido na técnica que domínios CDR3 decadeia leve e pesada de anticorpo desempenham um papel im-portante na especificidade / afinidade de ligação de um an-ticorpo para um antigeno. Da mesma maneira, em um outro as-pecto, a invenção pertence a processos prevendo uma respostade paciente a um tratamento para AS, onde o tratamento com-preende administração de anticorpos humanos que têm lentascinéticas de dissociação para associação com hTNF alfa e quetêm domínios CDR3 de cadeia pesada e leve que estruturalmen-te são idênticos a ou relacionados àqueles de D2E7. Posição9 de CDR3 VL de D2E7 pode ser ocupada por Ala ou Thr sem a-fetar substancialmente a Koff. Da mesma maneira, um motivoconsenso para a CDR3 VL de D2E7 compreende a seqüência deaminoácidos: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO: 3). Adicio-nalmente, a posição 12 da CDR3 VH de D2E& pode ser ocupadapor Tyr ou Asnf sem afetar substancialmente a Koff. Da mesmamaneira, um motivo consenso para a CDR3 VH de D2E7 compreen-de a seqüência de aminoácidos: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N)(SEQ ID NO: 4). Além disso, como demonstrado no Exemplo 2 depatente US 6090 382, o domínio CDR3 das cadeias pesada eleve de D2E7 é susceptível a substituição com um resíduo a-lanina simples (na posição 1, 4, 5, 7 ou 8 dentro de CDR3 VLou na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 dentro de CDR3VH) sem afetar substancialmente a KGff. Ainda, aqueles versa-dos na técnica apreciarão que, dada a suscetibilidade dosdomínios CDR3 VL e VH de D2E7 a substituições com alanina,substituição de outros aminoácidos dentro dos domínios CDR3pode ser possível enquanto ainda retendo a baixa constantede taxa fora do anticorpo, em particular substituições comaminoácidos conservativos. Preferivelmente, não mais que umaa cinco substituições conservativas são feitas dentro de do-mínios CDR3 VL e/ou VH de D2E7. Mais pref erivelmente, nãomais que uma a três substituições conservativas de aminoáci-dos são feitas dentro de domínios CDR3 VL e/ou VH de D2E7.

Adicionalmente, substituições conservativas de aminoácidosnão devem ser feitas em posições de aminoácido críticas paraligação a hTNF alfa. Posições 2 e 5 da CDR3 VL D2E7 e posi-ções 1 e 7 da CDR3 VH D2E7 parecem ser críticas para intera-ção com hTNF alfa e assim, substituições conservativas deaminoácidos preferivelmente não são feitas nestas posições(embora uma substituição alanina na posição 5 da CDR3 VLD2E7 seja aceitável, como descrito acima) (ver patente US 6090 382).Da mesma maneira, em uma outra realização, a in-venção provê processos de determinação de eficácia de umtratamento para AS compreendendo administração de um anti-corpo humano isolado, ou uma sua porção de ligação de antí- geno. O anticorpo ou sua porção de ligação de antigeno pre-ferivelmente contem as seguintes características:

a) dissocia de TNF alfa humana com uma constantede taxa Koff de 1 χ 10-3 s"1 ou menos, como determinada porressonância plasmon de superfície;

b) tem um domínio CDR3 de cadeia leve compreenden-do a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, ou modificadade SEQ ID NO: 3 por uma substituição alanina simples na po-sição 1, 4, 5, 7 ou 8 ou por uma a cinco substituições con-servativas de aminoácidos em posições 1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9;

c) tem um domínio CDR3 de cadeia pesada compreen-dendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou modifi-cada de SE ID NO: 4 por uma substituição alanina simples naposição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 ou por uma a cinco substituições conservativas de aminoácidos nas posições 2,3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ou 12.

Mais preferivelmente, o anticorpo, ou sua porçãode ligação de antigeno, dissocia de TNF alfa humano com umaKoff de 5 χ 10-4 s-1 ou menos. Mesmo mais preferivelmente, o anticorpo, ou sua porção de ligação de antigeno, dissocia deTNF alfa humano com uma Koff de 1 x 10-4 s-1 ou menos.

Ainda em uma outra realização, a invenção provêprocessos de determinação de eficácia de um tratamento paraAS compreendendo administração de um anticorpo humano isola-do, ou sua' porção de ligação de antigeno. O anticorpo ou suaporção de ligação de antigeno preferivelmente contem uma re-gião variável de cadeia leve (LCVR) tendo um domínio CDR3compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 oumodificada de SEQ ID NO: 3, por uma substituição alaninasimples na posição 1, 4, 5, 7 ou 8, e com uma região variá-vel de cadeia pesada (HCVR) tendo um domínio CDR3 compreen-dendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou modifi-cada a partir de SEQ ID NO: 4 por uma substituição alaninasimples na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11. Preferi-velmente, a LCVR ainda tem um domínio CDR2 compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (isto é, a CDR2 VLde D2E7) e a HCVR ainda tem um domínio CDR2 compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (isto é, a CDR2 VHde D2E7) . Mesmo mais preferivelmente, a LCVR ainda tem domí-nio CDRl compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO: 7 (isto é, a CDRl VL D2E7) e a HCVR tem um domínio CDRlcompreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8(isto é, a CDRl VH D2E7) . As regiões de estrutura para VLpreferivelmente são de família de linha germe humana VkI ,mais preferivelmente de gene Vk de linha germe A20 e maispreferivelmente das seqüências de estrutura VL de D2E7 mos-tradas nas Figuras IA e IB de patente US 6 090 382. As regi-ões de estrutura para VH preferivelmente são da família delinha germe humana VH3, mas preferivelmente do gene VH delinha germe humana DP-31 e mais preferivelmente das seqüên-cias de estrutura VH de D2E7 mostradas em Figuras 2A e 2B depatente US 6 090 382.

Da mesma maneira, em uma outra realização, a in-venção provê processos de determinação de eficácia de umtratamento de AS, onde o tratamento compreende a administra-ção de um anticorpo humano isolado, ou sua porção de ligaçãode antigeno. O anticorpo ou sua porção de ligação de antige-no preferivelmente contem uma região variável de cadeia leve(LCVR) compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO: 1 (isto é, a VL de D2E7) e uma região variável de cadeiapesada (HCVR) compreendendo a seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO: 2 (isto é, a VH de D2E7) . Em certas realizações,o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesa-da, tal como uma região constante IgGl, IgG2, IgG3, IgG4,IgA, IgE, IgM, ou IgD. Pref erivelmente, a região constantede cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesadaIgGl ou uma região constante de cadeia pesada IgG4. Alémdisso, o anticorpo pode compreender uma região constante decadeia leve, tanto uma região constante de cadeia leve kappacomo uma região constante de cadeia leve lambda. Preferivel-mente, o anticorpo compreende uma região constante de cadeialeve kappa. Alternativamente, a porção de anticorpo podeser, por exemplo, um fragmento Fab ou um fragmento Fv de ca-deia simples.

Ainda em outras realizações, a invenção provê pro-cessos de determinação de eficácia de tratamento para AS,onde o tratamento compreende administração de um anticorpohumano isolado, ou uma sua porção de ligação de antigeno,contendo domínios CDR3 VL e VH relacionados a D2E7. Por e-xemplo, anticorpos, ou suas porções de ligação de antigeno,com uma região variável de cadeia leve (LCVR) tendo um domí-nio CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidosselecio-nada do grupo consistindo em SE ID NOs: 3, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 ou com umaregião variável de cadeia pesada (HCVR) tendo um domínioCDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadado grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34 e 35.

Em uma outra realização, o processo da invençãoinclui determinação de eficácia de um tratamento para AS,onde o tratamento compreende administração de um inibidor deTNF alfa, incluindo, mas não limitado a, um anticorpo anti-TNF alfa, ou um seu fragmento, incluindo infliximab (Remica-de, Johnson and Johnson; descrito na patente US 5 656 272,aqui incorporada por referência), CDP571 (um anticorpo IgG4anti-TNF alfa monoclonal humanizado) , CDP 870 (um fragmentode anticorpo anti-TNF alfa monoclonal humanizado) , um dAbanti-TNF (Peptech), CNTO 148 (golimumab; Medarex and Cento-cor, ver WO 02/12502), e adalimumab (Humira Abbott Laborato-ries, um mAb anti-TNF humano, descrito em US 6 090 382 comoD2E7). Outros exemplos incluem etanercept (descrito em WO91/03553 e WO 09/406476), receptor de TNF tipo I solúvel,receptor de TNF Tipo I solúvel pegilado (PEGs TNF-Rl), oup55TNFRlgG (Lenercept). Em uma outra realização, o inibidorde TNF alfa é uma proteína de ligação de TNF recombinante(r-TBP-I) (Serono).

0 anticorpo TNF alfa usado nos processos e compo-sições da invenção pode ser modificado para tratamento aper-feiçoado de AS. Em algumas realizações, o anticorpo TNF alfaou seus fragmentos de ligação de antigeno, é quimicamentemodificado para prover um desejado efeito. Por exemplo, pe-gilação de anticorpos e fragmentos de anticorpos da invençãopode ser realizada através de qualquer uma das reações depegilação conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo,nas seguintes referências: Focus on Growth Factors 3:4-10(1992); EP O 154 316; e EP O 401 384 (cada uma das quais éaqui incorporada por referência em sua totalidade) . Preferi-velmente, a pegilação é realizada via uma reação de acilaçãoou uma reação de alquilação via uma molécula de polietilenoglicol reativa (ou um polimero solúvel em água reativo aná-logo) . Um polimero solúvel em água preferido para pegilaçãodos anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção é po-lietileno glicol (PEG). Como aqui usado, "polietileno gli-col" é pretendido abranger qualquer uma das formas de PEGquer têm sido usadas para derivar outras proteínas, como mo-no (Cl-ClO) alcoxi- ou ariloxi-polietileno glicol.

Processos para preparação de anticorpos pegiladose fragmentos de anticorpos da invenção genericamente compre-enderão as etapas de (a) reação de anticorpo ou fragmento deanticorpo com polietileno glicol, tal como um éster reativoou derivado aldeído de PEG, sob condições onde o anticorpoou fragmento de anticorpo torna-se ligado a um ou mais gru-pos PEG, e (b) obtenção de produtos de reação. Será aparentepara aqueles versados na técnica selecionar as condições dereação ótimas ou as reações de acilação baseadas em parâme-tros conhecidos e o desejado resultado.

Anticorpos pegilados e fragmentos de anticorpospodem ser genericamente usados para tratamento de AS atravésde administração dos anticorpos TNF alfa e fragmentos de an-ticorpos aqui descritos. Genericamente os anticorpos pegila-dos e fragmentos de anticorpos têm aumentada meia - vida,como comparado aos anticorpos não-pegilados e fragmentos deanticorpos. Os anticorpos e fragmentos de anticorpos pegila-dos podem ser empregados sozinhos, juntos, ou em combinaçãocom outras composições farmacêuticas.

Ainda em uma outra realização da invenção, anti-corpos TNF alfa ou seus fragmentos podem ser alterados ondea região constante do anticorpo é modificada para reduzirpelo menos uma função efetora biológica mediada por regiãoconstante em relação a um anticorpo não-modifiçado. Para mo-dificar um anticorpo da invenção de modo que ele exiba redu-zida ligação ao receptor de Fc, o segmento de região cons-tante de imunoglobulina do anticorpo pode sofrer mutação emparticulares regiões necessárias para interações de receptorde Fc (FcR) (ver, por exemplo, Canfield, S. M. e S.L. Morri-son (1991) J. Exp. Med. 17 3:14 83-14 91; e Lund, J. et al.(1991) J. of Immunol. 147:2657-2662). Redução em habilidadede ligação de FcR do anticorpo também pode reduzir outrasfunções efetoras que baseiam-se em interações FcR, tal comoopsonização e fagocitose e citotoxidez celular dependente deantigeno.

Um anticorpo ou porção de anticorpo usado nos pro-cessos da invenção pode ser derivado ou ligado a uma outramolécula funcional (por exemplo, um outro peptideo ou prote-ína). Da mesma maneira, os anticorpos e porções de anticor-pos da invenção são pretendidos incluírem formas derivadas ede outro modo modificadas dos anticorpos anti-hTNF alfa aquidescritos, incluindo moléculas de adesão imune. Por exemplo,um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser li-gado funcionalmente (por acoplamento químico, fusão genéti-ca, associação não-covalente ou de outro modo) a uma ou maisoutras entidades moleculares, tal como um outro anticorpo(por exemplo, um anticorpo bi-específico ou um diacorpo), umagente detectável, um agente citotóxico, um agente farmacêu-tico, e/ou uma proteína ou peptideo que possa mediar associ-ação do anticorpo ou porção de anticorpo com uma outra molé-cula (tal como uma região de núcleo de streptavidina ou umaetiqueta poli histidina).

Um tipo de anticorpo derivado é produzido atravésde reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo oude diferentes tipos, por exemplo, para criar anticorpos bi-específicos). Apropriados reticuladores incluem aqueles quesão hetero-bifuncionais, tendo dois grupos distintamente re-ativos separados por um apropriado espaçador (por exemplo,m-maleimido benzoil-N-hidroxi succinimida éster) ou homo-bifuncional (por exemplo, suberato de di-succinimidila).Tais ligadores são disponíveis de Pierce Chemical Company,Rocford, IL.

Agentes detectáveis úteis com os quais um anticor-po ou porção de anticorpo da invenção podem ser derivadosincluem compostos fluorescentes. Agentes detectáveis fluo-rescentes exemplares incluem fluoresceina, isotiocianato defluoresceina, rodamina, cloreto de 5-dimetil amina-1-naftaleno sulfonila, ficoeritrina e semelhantes. Um anticor-po também pode ser derivado com enzimas detectáveis, comofosfatase alcalina, peroxidase de raiz forte, glicose oxida-se e semelhantes. Quando um anticorpo é derivado com uma en-zima detectável, ele é detectado através de adição de rea-gentes adicionais que a enzima usa para produzir um produtode reação detectável. Por exemplo, quando o agente detectá-vel peroxidase de raiz forte está presente, a adição de pe-róxido de hidrogênio e diamino benzidina conduz a um produtode reação colorido, que é detectável. Um anticorpo tambémpode ser derivado com biotina, e detectado através de medi-ção indireta de ligação de avidina ou streptavidina.

Um anticorpo, ou porção de anticorpo, usado nosprocessos ou composições da invenção pode ser prpearado a-través de expressão recombinante de genes de cadeia leve epesada de imunoglobulina em uma célula hospedeira. Para ex-pressar recombinantemente um anticorpo, uma célula hospedei-ra é transfectada com um ou mais vetores de expressão recom-binantes carreando fragmentos de ADN codificando as cadeiasleve e pesada de imunoglobulina do anticorpo de modo que ascadeias leve e pesada são expressas na célula hospdeira e,preferivelmente, secretadas no meio no qual as células hos-pedeiras são cultivadas, de cujo meio os anticorpos podemser recuperados. Metodologias de ADN recombinante padrõessão usadas para obtenção de genes de cadeia leve e pesada deanticorpo, incorporar estes genes em vetores de expressãorecombinantes e introduzir os vetores em células hospedei-ras, tais como aquelas descritas em Sambrook, Fritsch andManiatis (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Se-cond Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel, F.M.

et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing Associates (1989) e patente US 4 816 397 por Bosset al.

Para expressar D2E7 ou um anticorpo relacionadocom D2E7, fragmentos de AND codificando as regiões variáveisde cadeia leve e pesada são primeiro obtidos. Estes ADNs po-dem ser obtidos através de amplificação e modificação de se-qüências variáveis de cadeia leve e pesada de linha germeusando a reação de cadeia polimerase (PCR). Seqüências deADN de linha germe para genes de região variável de cadeiapesada e leve humanos são conhecidos na técnica (ver, porexemplo, a base de dados de seqüência de linha germe humana"Vbase"; ver também Kabat, Ε. A., et al. (1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. De-partment of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; Tomlinson, I.M., et al. (1992) "The Repertoire ofHuman Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VhSegments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol.227:776-798; e Cox, J.P.L. et al. (1994) "A Directory òf Hu-man Germ-Line V78 Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; os conteúdos de cada umdos quais são aqui incorporados por referência) . Para obterum fragmento de ADN codificando a região variável de cadeiapesada de D2E7, um anticorpo relacionado com D2E7, um membroda família VH3 de genes VH de linha germe humana é amplifi-cado por PCR padrão. Mais preferivelmente, a seqüência delinha germe VH DP-31 é amplificada. Para obter um fragmentode ADN codificando a região variável de cadeia leve de D2E7,ou um anticorpo relacionado a D2E7, um membro da família VkIde genes VL de linha germe humana é amplificado através dePCR padrão. Mais preferivelmente, a seqüência de linha germeVL A20 é amplificada. Iniciadores de PCR apropriados parauso em amplificação de seqüências VL de linha germe A20 e VHde linha germe DP-31 podem ser desenhados baseado nas se-qüências de nucloeosídeos nas referências citadas supra, u-sando processos padrões.

Uma vez os fragmentos VL e VH de linha germe sejamobtidos, estas seqüências podem sofrer mutação para codifi-car D2E7 ou seqüências de aminoácidos relacionadas com D2E7aqui mostradas. As seqüências de aminoácidos codificadas pe-las seqüências de ADN VH e VL de linha germe são primeirocomparadas às seqüências de aminoácidos VH e VL relacionadasa D2E7 ou D2E7 para identificação de resíduos de aminoácidosno D2E7 ou seqüência relacionada a D2E7 que diferem da linhagerme. Então, os apropriados nucleotídeos das seqüências deADN de linha germe sofrem mutação de modo que a seqüência delinha germe de mutação codifica o D2E7 ou seqüência de ami-noácidos relacionadas a D2E7, usando o código genético paradeterminar quais mudanças de nucleotídeos devem ser feitas.Mutagênese das seqüências de linha germe é realizada atravésde processos padrões, como mutagênese mediada por PCR (naqual os nucleotídeos de mutação são incorporados nos inicia-dores de PCR de modo que o produto de PCR contenha as muta-ções) ou mutagênese direcionada de sitio.

Uma vez os fragmentos de ADN codificando D2E7 ousegmentos VH e VL relacionados com D2E7 sejam obtidos (atra-vés de amplificação e mutagênese de genes VH e VL de linhagerme, como descrito acima), estes fragmentos de ADN podemser ainda manipulados através de técnicas de ADN recombinan-te padrões, por exemplo, para converter os genes de regiãovariável a genes de cadeia de anticorpo de inteiro compri-mento, para genes de fragmento Fab ou para um gene scFv.Nestas manipulações, um fragmento de ADN codificando VL ouVH é operativamente ligado a um outro fragmento de ADN codi-ficando uma outra proteína, tal como uma região constante deanticorpo ou um ligador flexível. O termo "ligado operativa-mente", como usado neste contexto, é pretendido significarque os dois fragmentos de ADN estão ligados de modo que asseqüências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentosde ADN permanecem em-quadro.

O ADN isolado codificando a região VH pode serconvertido a um gene de cadeia pesada de inteiro comprimentoatravés de ligação operativa de ADN codificando VH a uma ou-tra molécula de ADN codificando regiões constantes de cadeiapesada (CHI, CH2 e CH3) . As seqüências de genes de regiãoconstante de cadeia pesada humana são conhecidas na técnica(ver, por exemplo, Kabat, Ε. A., et al. (1991) Sequences ofProteins Of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. De-partment of Helath and Human Services, NIH Publication No.91-3242) e fragmentos de AND abrangendo estas regiões podemser obtidos através de amplificação PCR padrão. A regiãoconstante de cadeia pesada pode ser uma região constanteIgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas mais pre-ferivelmente é uma região constante de IgG4 ou IgGl. Para umgene de cadeia pesadade fragmento Fab, o ADN codificando VHpode ser operativamente ligado a uma outra molécula de ADNcodificando somente a região constante CH1 de cadeia pesada.

O ADN isolado codificando a região VL pode serconvertido a um gene de cadeia leve de inteiro comprimento(assim como um gene de cadeia leve Fab) através de ligaçãooperativamente de ADN codificando VL e uma outra molécula deADN codificando a região constante de cadeia leve, CL. Asseqüências de genes de região constante de cadeia leve huma-na são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E.A.,et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Inte-rest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de ANDabrangendo estas regiões podem ser obtidos através de ampli-ficação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve po-de ser uma região constante kappa ou lambda, mas mais prefe-rivelmente é uma região constante kappa.

Para criar um gene scFv, os fragmentos ADN codifi-cando VH e VL são operativamente ligados a um outro fragmen-to codificando um ligador flexível, por exemplo, codificandoa seqüência de aminoácidos (Gly4-Ser) 3, de modo que as se-qüências de VH e VL podem ser expressas como uma proteína decadeia simples contígua, com as regiões VL e VH unidas peloligador flexível (ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Sci-ence 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990)348:552-554).

Para expressar os anticorpos, ou porções de anti-corpos usados na invenção, ADNs codificando cadeias leves epesadas parciais ou de inteiro comprimento, obtidas comodescrito acima, são inseridos em vetores de expressão de mo-do que os genes são operativamente ligados a seqüências con-troles transcricionais e traducionais. Neste contexto, otermo "ligado operativamente" é pretendido significar que umgene anticorpo é ligado em um vetor de modo que seqüênciascontroles transcricionais e traducionais dentro do vetorservem sua função pretendida de regulação de transcrição etradução do gene anticorpo. 0 vetor de expressão e seqüên-cias de controle de expressão são escolhidos para serem com-patíveis com a célula hospedeira de expressão usada. 0 genede cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de an-ticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, maistipicamente, ambos genes são inseridos no mesmo vetor de ex-pressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de ex-pressão através de processos padrões (por exemplo, ligaçãode sítios de restrição complementares sobre o fragmento degene de anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade embota-da se nenhum sítio de restrição está presente). Antes de in-serção do D2E7 ou seqüências de cadeia leve e pesada rela-cionadas com D2E7, o vetor de expressão já pode carrear se-qüências de região constante de anticorpo. Por exemplo, umaabordagem para conversão de D2E7 ou seqüências VH e VL rela-cionadas com D2E7 a genes anticorpo de inteiro comprimento éinserir os mesmos em vetores de expressão já codificando re-giões constantes de cadeia pesada e constantes de cadeia le-ve, respectivamente, de modo que o segmento VH seja operati-vãmente ligado ao segmento(s) CH dentro do vetor e o segmen-to VL seja operativamente ligado ao segmento CL dentro dovetor. Adiconalmente ou alternativamente, o vetor de expres-são recombinante pode codificar um peptideo sinal que faci-lita secreção da cadeia anticorpo a partir de uma célulahospedeira. 0 gene de cadeia de anticorpo pode ser clonadono vetor de modo que o peptideo sinal seja ligado em-quadroao terminus amino do gene de cadeia de anticorpo. 0 peptideosinal pode ser um peptideo sinal imunoglobulina ou um pepti-deo sinal heterólogo (isto é, um peptideo sinal de uma pro-teina não-imunoglobulina).

Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os ve-tores de expressão recombinantes da invenção carreiam se-qüências reguladoras que controlam a expressão dos genes decadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. 0 termo "se-qüência reguladora" é pretendido incluir promotores, aper-feiçoadores e outros elementos de controle de expressão (porexemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcri-ção ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Tais se-qüências reguladoiras são descritas, por exemplo, em Goed-dei; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, CA (1990). Será apreciado por a-queles versados na técnica que o desenho do vetor de expres-são, incluindo a seleção de seqüências reguladoras pode de-pender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira aser transformada, o nível de expressão de proteína desejado,etc. Seqüências reguladoras preferidas para expressão em cé-lula hospedeira mamífera incluem elementos virais que dire-cionam altos níveis de expressão de proteína em células ma-míferas, tais como promotores e/ou aperfeiçoadores derivadosde citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor / aperfeiçoa-dor CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como o promotor / aper-feiçoador SV40), adenovírus (por exmeplo, o promotor tardioprincipal adenovírus (AdMLP)) e polioma. Para ainda descri-ção de elementos reguladores virais, e suas seqüências, verpor exemplo, patente US 5 168 062 por Stinski, patente US 4510 245 por Bell et al. e patente US 4 968 615 por Schaffneret al.

Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e se-qüências reguladoras, os vetores de expressão recombinantesusados na invenção podem carrear adicionais seqüências, taiscomo seqüências que regulam replicação do vetor em célulashospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genesmarcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável faci-lita seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foiintroduzido (ver, por exemplo, patentes US 4 399 216, 4 634665 e 5 179 017, todas por Axel et al.). Por exemplo, tipi-camente o gene marcador selecionável confere resistência adrogas, tal como G418, higromicina ou metotrexato, sobre ui-ma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genesmarcadores selecionáveis preferidos incluem o gene diidrofo-lato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr"com seleção / amplificação com metotrexato) e o gene neo(para seleção G418).

Para expressão das cadeias leve e pesada, o ve-tor (es) de expressão codificando as cadeias pesada e leve étransfectado em uma célula hospedeira através de técnicaspadrões. As várias formas do termo "transfecção" são preten-didas abrangerem uma ampla variedade de técnicas comumenteusadas para a introdução de ADN exógeno em uma célula hospe-deira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletropora-ção, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção comDEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja teoricamente possí-vel expressar os anticorpos da invenção em células hospedei-ras procarióticas ou eucarióticas, expressão de anticorposem células eucarióticas, e mais preferivelmente células hos-pedeiras mamíferas, são as mais preferidas porque tais célu-las eucarióticas, e em particular células mamíferas, sãomais prováveis que células procarióticas para montagem e se-creção de um anticorpo propriamente dobrado e imunologica-mente ativo. Expressão procariótica de genes de anticorpofoi reportada ser ineficaz para produção de altos rendimen-tos de anticorpo ativo (Boss, M.A. and Wood, C.R. (1985) Im-munology Today 6:12-13).

Células hospedeiras mamíferas preferidas para ex-pressão de anticorpos recombinantes da invenção incluem cé-lulas CHO (Ovário de Hamster Chinês) (incluindo células CHOdhfr-, descritas em Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecio-nável DHFR, por exemplo, como descrito em R. J. Kaufman andΡ.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mielo-ma NOS, células COS e células SP2. Quando vetores de expres-são recombinantes codificando genes de anticorpos são intro-duzidos em células hospedeiras mamíferas, os anticorpos sãoproduzidos através de cultura de células hospedeiras por umperíodo de tempo suficiente para permitir expressão do anti-corpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, se-creção do anticorpo no meio de cultura no qual as célulashospedeiras são crescidas. Anticorpos podem ser recuperadosdo meio de cultura usando processos padrões de purificaçãode proteína.

Células hospedeiras também podem ser usadas paraprodução de porções de anticorpos intactos, como fragmentosFab ou moléculas scFv. É entendido que variações do procedi-mento acima estão dentro do escopo da presente invenção. Porexemplo, pode ser desejável transfectar-se uma célula hospe-deira com ADN codificando uma cadeia leve ou a cadeia pesada(mas não ambas) de um anticorpo desta invenção. Tecnologiade ADN recombinante também pode ser usada para remover algumou todo ADN codificando uma ou ambas cadeias leve e pesadaque não é necessária para ligação a hTNF alfa. As moléculasexpressas de tais moléculas de ADN truncado também são a-brangidas pelos anticorpos da invenção. Em adição, anticor-pos bifuncionais podem ser produzidos nos quais uma cadeialeve e uma pesada são um anticorpo da invenção e a outra ca-deia pesa e leve são específicas para um antígeno outro quenão hTNF alfa através de reticulação de um anticorpo da in-venção para um segundo anticorpo através de processos de re-ticulação química padrões.

Em um sistema preferido para expressão recornbinan-te de um anticorpo, ou sua porção de ligação de antígeno, dainvenção, um vetor de expressão recombinante codificando am-bas a cadeia pesada de anticorpo e a cadeia leve de anticor-po é introduzido em células dhfr-CHO através de transfecçãomediada com fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressãorecombinante, os genes de cadeia leve e pesada de anticorpoestão cada um operativamente ligado a elementos reguladorespromotor AdMLP / aperfeiçoador CMV para dirigirem altos ní-veis de transcrição dos genes. 0 vetor de expressão recombi-nante também carreia um gene DHFR, que permite seleção decélulas CHO que foram transfectadas com o vetor usando sele-ção / amplificação com metotrexato. As células hospedeirastransformante selecionadas são cultivadas para permitir ex-pressão das cadeias leve e pesada de anticorpo e anticorpointacto é recuperado do meio de cultura. Técnicas padrões debiologia molecular são usadas para preparar o vetor de ex-pressão recombinante, transfectar as células hospedeiras,selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras erecuperar o anticorpo do meio de cultura.

Anticorpos humanos recombinantes da invenção emadição a D2E7 ou uma sua porção de ligação de antígeno, ouanticorpos relacionados a D2E7 aqui mostrados ou uma suaporção de ligação de antígeno, ou anticorpos relacionadoscom D2E7 aqui mostrados podem ser isolados através de sele-ção de uma biblioteca de anticorpo combinatorial recombinan-te, preferivelmente uma biblioteca de mostra de fago scFv,preparada usando ADNcs VL e VH humanos preparados de ARNmderivado de linfócitos humanos. Metodologias para preparaçãoe seleção de tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Emadição a kits comercialmente disponíveis para geração de bi-bliotecas de mostra de fago (por exemplo, o Pharmacia Recom-binant Phage Antibody System, n°" de catálogo 27-9400-(3e oStratagene SurfZAP phage display kit, no. de catálogo240612), exemplos de processos e reagentes particularmentesuscetíveis para uso em geração e seleção de bibliotecas demostra de anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, emLadner et al. patente US 5 223 409; Kang et al. publicaçãoPCT W092/18619; Dower et al. PCT WO 91/17271; Winter et al.PCT WO 92/20791; Markland et al. PCT WO 92/15679; Breitlinget al. PCT WO 93/01288; McCafferty et al. PCT WO 92/01047;Garrard et al. PCT WO 92/09690; Fuchs et al. (1991)Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum AntibodHybridomas 3:81-65; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Mccafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Grif-fiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992)J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 8 9:357 6-3580; Garrardet al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al.(1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas et al. (1991)PNAS 88:7978-7982.

Em uma realização preferida, para isolar anticor-pos humanos com alta afinidade e uma baixa constante de taxafor a para hTNF alfa, um anticorpo anti-hTNF alfa murinotendo alta afinidade e uma baixa constante de taxa de for apara hTNF alfa (por exemplo, MAK 195, o hibridoma para oqual tem número de depósito ECACC 87 050801) é primeiro usa-do para selecionar seqüências de cadeia leve e pesada huma-nas tendo similar atividade de ligação na direção de hTNFalfa, usando os processos de impressão de epitopo descritosem Hoogenboom et al., PCT WO 93/06213. As bibliotecas de an-ticorpos usadas neste processo são preferivelmente bibliote-cas scFv preparadas e selecionadas como descrito em Mccaf-ferty et al., PCT WO 92/01047, Mccafferty et al., Nature(1990) 348:552-554; e Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734. As bibliotecas de anticorpo scFv são selecionadas usan-do TNF alfa humano recombinante como o antigeno.

Uma vez segmentos VL e VH humanos iniciais sejamselecionados, experimentos de "mistura e emparelhamento",nos quais diferentes pares dos segmentos VL e VH inicialmen-te selecionados são separados para a ligação de hTNF alfa,são realizados para seleção de preferidas combinações de parVL/VH. Adicionalmente, para ainda aperfeiçoamento de afini-dade e/ou diminuir a constante de taxa de fora para ligaçãode hTNF alfa, os segmentos VL e VH do par (es) preferido po-dem ser randomicamente mutados, preferivelmente dentro daregião CDR3 de VH e/ou VL, em um processo análogo ao proces-so de mutação somática in vivo responsável por maturação deafinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural.Esta maturação de afinidade in vitro pode ser realizada a-través de amplificação de regiões VH e VL usando iniciadoresde PCR complementares para CDR3 VH ou CDR3 VL, respectiva-mente, cujos iniciadores foram "espetados" com uma misturarandômica das quatro bases nucleotideos em certas posiçõesde modo que os resultantes produtos de PCR codifiquem seg-mentos VH e VL nos quais mutações randômicas foram introdu-zidas nas regiões CDR3 VH e/ou VL. Estes segmentos VH e VLque sofreram mutação randômica podem ser novamente selecio-nados para ligação a hTNF alfa e seqüências que exibem altaafinidade e uma baixa taxa fora para ligação de hTNF alfapodem ser selecionadas.

Seguindo seleção e isolamento de um anticorpo an-ti-hTNF alfa da invenção a partir de uma biblioteca de mos-tra de imunoglobulina recombinante, ácido nucléico codifi-cando o selecionado anticorpo pode ser recuperado da embala-gem de mostra (por exemplo, o genoma de fago) e subclonadoem outros vetores de expressão através de técnicas de ADNrecombinante padrões. Se desejado, o ácido nucléico aindapode ser manipulado para criar outras formas de anticorposda invenção (por exemplo, ligado a ácido nucléico codifican-do adicionais domínios de imunoglobulina, tais como regiõesconstantes adicionais) . Para expressar um anticorpo humanorecombinante isolado através de seleção de uma bibliotecacombinatorial, o ADN codificando o anticorpo é clonado em umvetor de expressão recombinante e introduzido em célulashospedeiras mamíferas, como descrito ainda em detalhes aci-ma .

Processos de isolamento de anticorpos humanos comalta afinidade e uma baixa constante de taxa fora para hTNFalfa também são descritos nas patente US 6 090 382, 6 258562, e 6 509 015, cada uma das quais é aqui incorporada porreferência.

IV.Espondiloartropatias

TNF alfa foi implicado na patof isiologia de umaampla variedade de distúrbios, incluindo doenças inflamató-rias como espondiloartropatias (ver, por exemplo, Moeller etal. (1990) Cytokine 2:162; patente US 5 231 024; publicaçãode patente EP 260 610).

Como aqui usado, o termo "espondiloartropatias" éusado para referir-se a qualquer uma de várias doenças afe-tando as juntas da espinha, onde tais doenças compartilhamcaracterísticas clínicas, radiológicas e histológicas co-muns. Um número de espondiloartropatias compartilham carac-terísticas genéticas, isto é, elas são associadas com o ale-lo HLA-B27. em uma realização, o termo espondiloartropatia éusado para referir-se a qualquer uma de várias doenças afe-tando as juntas da espinha, excluindo espondilite ancilosan-te, onde tais doenças compartilham características clínicas,radiológicas e histológicas comuns. Exemplos de espondiloar-tropatias incluem espondilite ancilosante, artrite / espon-dilite psoriática, artrite enteropática, artrite reativa ousíndrome de Reiter, e espondiloartropatias não-diferenciadas. Exemplos de modelos animais usados para estu-dar espondiloartropatias incluem camundongo transgênicoank/ank, ratos transgênicos HLA-B27 (ver Taurog et al.(1998) The Spondylarthritides. OxfordrOxford UniversityPress).

Os processos da invenção também podem ser usadospara tratamento de sujeitos que têm ou em risco de desenvol-verem uma espondiloartropatia. Exemplos de sujeitos que es-tão em risco de terem espondiloartropatias incluem humanossofrendo de artrite. Espondiloartropatias podem ser associa-das com outras formas de artrite, incluindo artrite reuma-tóide. Em uma realização da invenção, níveis de biomarcado-res de degradação de cartilagem e/ou biomarcadores de sino-vite de um paciente tendo uma espondiloartropatia ou em ris-co de desenvolvimento de uma espondiloartropatia, são deter-minados e usados para avaliar se o paciente está em risco dedesenvolvimento de uma espondiloartropatia. Exemplos de es-pondiloartropatias que podem ser tratadas com um anticorpoTNF alfa, e, da mesma maneira, examinadas usando os proces-sos aqui descritos, são descritos abaixo:

1. Espondilite Ancilosante (AS)

Fator de necrose de tumor foi implicado na patofi-siologia de espondilite ancilosante (AS) (ver Verjans et al.(1991) Arthritis Rheum. 34:486; Verjans et al. (1994) ClinExp Immunol. 97:45; Kaijtzel et al. (1999) Hum Immunol.60:140). AS é um distúrbio inflamatório envolvendo inflama-ção de uma ou mais vértebras. AS é uma doença inflamatóriacrônica que afeta o esqueleto axial e/ou juntas periféricas,incluindo juntas entre as vértebras da espinha e juntas sa-croilíacas e as juntas entre a espinha e a pélvis. AS even-tualmente pode fazer com vértebras afetadas fundam ou cres-çam juntas. Espondiloartropatias, incluindo AS, podem serassociadas com artrite psoriática (PsA) e/ou doença inflama-tória de intestino (IBD), incluindo colite ulcerativa e do-ença de Crohn.Manifestações iniciais de AS podem ser determina-das através de testes radiográficos, incluindo exploraçõesCT e explorações MRI. Manifestações iniciais de AS freqüen-temente incluem escroilite e mudanças nas juntas sacroliacascomo evidenciado pelo embaçamento das margens corticais doosso subcondral, seguido por erosões e esclerose. Fadigatambém foi notada como um sintoma comum de AS (Duffy et al.(2002) ACR 66th Annual Scientific Meeting Abstract) . Da mes-ma maneira, processos da invenção podem ser usados para pro-vimento de tratamento aperfeiçoado para AS através de provi-mento de um processo para determinação de eficácia de umtratamento compreendendo administração de um inibidor deTNF.

Em uma realização, o processo da invenção é usadopara determinar a eficácia de administração de um inibidorde TNF para o tratamento de uma espondiloartropatia, inclu-indo AS, associada com IBD.

AS é freqüentemente tratada com medicações antiin-flamatórias não-esteroidais (NSAIDs), como aspirina ou indo-metacina. Da mesma maneira, os processos da invenção podemser usados para determinar a eficácia de um tratamento com-preendendo um anticorpo TNF alfa administrado em combinaçãocom agentes comumente usados para redução de inflamação edor comumente associados com espondilite ancilosante.

2.Artrite Psoriática

Fator de necrose de tumor foi implicado na patofi-siologia de artrite psoriática (PsA) (Partsch et al. (1998)Ann Rheum Dis. 57:691; Ritchlin et al. (1998) J Rheumatol.25:1544). Como aqui referida, artrite psoriática ou psoriaseassociada com a pele, refere-se a artrite inflamatória crô-nica que é associada com psoriase, que é uma condição de pe-le crônica comum que causa áreas vermelhas sobre o corpo.

Cerca de 1 em 20 indivíduos com psoriase desenvolverá artri-te junto com a condição de pele, e em cerca de 75% de casos,psoriase precede a artrite. PsA se exibe em uma variedade demaneiras, variando de artrite suave a severa, onde a artriteusualmente afeta os dedos e a espinha. Quando a espinha éafetada, os sintomas são similares àqueles de espondiliteancilosante, como descrito acima. Da mesma maneira, a eficá-cia de um anticorpo TNF alfa, ou um seu fragmento de ligaçãode antígeno, para o tratamento de PsA pode ser determinadausando o processo e composições da invenção.

PsA é algumas vezes associada com artrite muti-lans. Artrite mutilans refere-se a um distúrbio que é carac-terizado por excessiva erosão de osso resultando em deformi-dade erosiva, grossa, que mutila a junta. Em uma realização,a eficácia de um anticorpo TNF alfa, ou seu fragmento de Ii-gação de antígeno, para o tratamento de artrite mutilans po-de ser determinada usando o processo e composições da inven-ção .

3.Artrite Reativa / Síndrome de ReiterFator de necrose de tumor foi implicado na patofi-siologia de artrite reativa, que é também referida com sín-drome de Reiter (Braun et al. (1999) Arthritis Rheum.42 (10) :2039) . Artrite reativa (ReA) refere-se a artrite quecomplica uma infecção em qualquer local no corpo, freqüente-mente seguindo infecções entéricas ou urogenitais. ReA éfreqüentemente caracterizada por certos sintomas clínicos,incluindo inflamação das juntas (artrite), uretrite, conjun-tivite, e lesões da pele e membranas de mucosa. Em adição,ReA pode ocorrer seguindo infecção com uma doença transmiti-da sexualmente ou infecção disentérica, incluindo clamídia,campilobacter, salmonella, ou yersinia. Em uma realização, aeficácia de um anticorpo TNF alfa, ou um seu fragmento deligação de antígeno, para o tratamento de ReA pode ser de-terminada usando o processo e composições da invenção.

4.Espondiloartropatias Não-DiferenciadasEm uma realização, anticorpos obtidos usando pro-cessos da invenção são usados para tratar sujeitos sofrendode espondiloartropatias não-diferenciadas (ver Zeidler etal. (1992) Rheum Dis Clin North Am. 18:187). Outros termosusados para descrição de espondiloartropatias não-diferenciadas incluem oligoartrite soronegativa e oligoar-trite não-diferenciada. Espondiloartropatias não-

diferenciadas, como aqui usado, refere-se a um distúrbio on-de o sujeito demonstra somente alguns dos sintomas associa-dos com uma espondiloartropatia. Esta condição é usualmenteobservada em adultos jovens que não t~em IBD, psoríase, ouos sintomas clássicos de AS ou síndrome de Reiter. Em algunsexemplos, espondiloartropatias não-diferenciadas podem seruma inidicação inicial de AS. Em uma realização, a eficáciade um anticorpo TNF alfa, ou sua porção de ligação de antí-geno, para o tratamento de espondiloartropatias não-diferenciadas Poe ser determinada usando o processo e compo-sições da invenção.

V.Composições Farmacêuticas e Administração Farma-cêutica

A.Composições e Administração

Anticorpos, porçõe de anticorpos, e outros inibi-dores de TNF alfa para uso nos processos da invenção, podemser incorporados em composições farmacêuticas apropriadaspara administração a um sujeito. Tipicamente, a composiçãofarmacêutica compreende um anticorpo, porção de anticorpo,ou outro inibidor de TNF alfa da invenção e um carreadorfarmaceuticamente aceitável. Como aqui usado, "carreadorfarmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os sol-ventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibac-terianos e anti-fungos, agentes de retardo de absorção e i-sotônicos, e semelhantes que são fisiologicamente compatí-veis. Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveisincluem um ou mais de água, solução salina, solução salinatamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e seme-lhantes, assim como suas combinações. Em muitos casos, épreferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúca-res, poli álcoois como manitol, sorbitol, ou cloreto de só-dio na composição. Carreadores farmaceuticamente aceitáveisainda podem compreender menores quantidades de substânciasauxiliares como agentes umectantes ou emulsificantes, pre-servativos ou tampões, que aperfeiçoam a vida de prateleirado anticorpo, porção de anticorpo, ou outro inibidor de TNFalfa.

As composições para uso nos processos da invençãopodem estar em uma variedade de formas. Estas incluem, porexemplo, formas de dosagem liquida, semi - sólida e sólida,tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetá-veis e de infusão), dispersões ou suspensões, comprimidos,pílulas, pulverizados, lipossomas e supositórios. A formapreferida depende do modo pretendido de administração e a-plicação terapêutica. Composições preferidas típicas estãona forma de soluções injetáveis e de infusão, tais como com-posições similares àquelas usadas para imunização passiva dehumanos com outros anticorpos ou outros inibidores de TNFalfa. O modo preferido de administração é parenteral (porexemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramus-cular). Em uma realização preferida, o anticorpo ou outroinibidor de TNF alfa é administrado por infusão ou injeçãointravenosa. Em uma outra realização preferida, o anticorpoou outro inibidor de TNF alfa é administrado através de in-jeção intramuscular ou subcutânea.

Composições terapêuticas têm de ser estéreis e es-táveis sob as condições de fabricação e estocagem. A compo-sição pode ser formulada como uma solução, micro-emulsão,dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada apropriadapara alta concentração de droga. Soluções injetáveis esté-reis podem ser preparadas através de incorporação de compos-to ativo (isto é, anticorpo, porção de anticorpo, ou outroinibidor de TNF alfa) na quantidade requerida em um solventeapropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumera-dos acima, como requerido, seguido por esterilização filtra-da. Genericamente, dispersões são preparadas através de in-corporação de composto ativo em um veículo estéril que con-tem um meio de dispersão básico e os outros ingredientes re-queridos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pul-verizados estéreis para a preparação de soluções inejtáveisestéreis, os processos preferidos de preparação são secagemà vácuo e secagem de congelamento que rende um pulverizadodo ingrediente ativo plus qualquer ingrediente desejado adi-cional a partir de uma sua solução previamente filtrada es-téril. A própria fluidez de uma solução pode ser mantida,por exemplo, através de uso de um revestimento tal como Ie-citina, através de manutenção do requerido tamanho de partí-cula no caso de dispersão e através de uso de tensoativos.Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser efe-tuada através de inclusão na composição de um agente que re-tarda absorção, por exemplo, sais mono estearato e gelatina.

Compostos ativos suplementares também podem serincorporados nas composições. Em certas realizações, um an-ticorpo ou porção de anticorpo para uso nos processos da in-venção é co-formulado com e/ou co-administrado com um oumais adicionais agentes terapêuticos, incluindo um inibidorde AS ou antagonista. Por exemplo, um anticorpo anti-hTNFalfa ou porção de anticorpo da invenção pode ser co-formulado ce/ou co-administrado com um ou mais anticorposadicionais que ligam outros alvos associados com distúrbiosrelacionados com TNF alfa (por exemplo, anticorpos que seligam a outras citocinas ou que ligam moléculas de superfí-cie de célula), uma ou mais citocinas, receptor de TNF alfasolúvel (ver, por exemplo, PCT Publication No. WO 94/06476)e/ou um ou mais agentes químicos que inibem produção ou ati-vidade de hTNF alfa (tal como derivados de ciclo hexano ili-deno como descrito em PCT WO 93/19751) ou qualquer combina-ção dos mesmos. Além disso, um ou mais anticorpos da inven-ção podem ser usados em combinação com um ou mais dos agen-tes terapêuticos anteriores. Tais terapias de combinação po-dem vantajosamente utilizar menores dosagens dos agentes te-rapêuticos administrados, assim evitando possíveis efeitoscolaterais, complicações ou baixo nível de resposta pelo pa-ciente associado com as várias monoterapias.

Em uma realização, a invenção inclui composiçõesfarmacêuticas compreendendo uma quantidade efetiva de um i-nibidor de TNF alfa e um carreador farmaceuticamente aceitá-vel, onde a quantidade efetiva do inibidor de TNF alfa podeser efetiva para tratar AS. Em uma realização, o anticorpoou porção de anticorpo para uso nos processos da invenção éincorporado em uma formulação farmacêutica como descrito emPCT/IBO3/04 502 e pedido de patente US 10/222140, aqui incor-porados por referência. Esta formulação inclui uma concen-tração de 50 mg/mL do anticorpo D2E7, onde uma seringa pre-enchida contem 40 mg de anticorpo para injeção subcutânea.Em uma outra realização, a formulação da invenção incluiD2E7.

Os anticorpos, porções de anticorpos, e outros i-nibidores de TNF alfa da presente invenção podem ser admi-nistrados através de uma variedade de processos conhecidosna técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, arota / modo preferido de administração seja injeção subcutâ-nea. Em uma outra realização, administração é via injeção ouinfusão intravenosa. Como será apreciado por aqueles versa-dos na técnica, a rota e/ou modo de administração irá variardependendo de resultados desejados. Em certas realizações, ocomposto ativo pode ser preparado com um carreador que pro-tegerá o composto contra liberação rápida, tal como uma for-mulação de liberação controlada, incluindo implantes, em-plastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencap-sulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem serusados, tais como etileno - acetato de vinila, polianidri-dos, ácido poliglicólico, colágeno, poli orto ésteres, e á-cido poli lático. Muitos processos para a preparação de taisformulações são patenteados ou conhecidos por aqueles versa-dos na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems, Robinson, ed., Dekker, Inc.,New York, 1978.

Os anticorpos de TNF alfa usados na invenção podemser também administrados na forma de formulações de cristalde proteína que incluem uma combinação de cristais de prote-ína encapsulados dentro de um carreador polimérico para for-mação de partículas revestidas. As partículas revestidas daformulação de cristal de proteína podem ter uma morfologiaesférica e serem mi'croesferas de até 500 micrometros em diâ-metro ou elas podem ter alguma outra morfologia e serem mi-cropartículas. A aperfeiçoada concentração de cristais deproteína permite o anticorpo da invenção ser liberado subcu-taneamente. Em uma realização, os anticorpos TNF alfa da in-venção são liberados via um sistema de liberação de proteí-na, onde um ou mais de uma formulação ou composição de cris-tal de proteína, é administrada a um sujeito com um distúr-bio relacionado a TNF alfa. Composições e processos de pre-paração de formulações estabilizadas de cristais de anticor-po inteiros ou cristais de fragmento de anticorpo também sãodescritos em WO 02/072636, que é aqui incorporado por refe-rência. Em uma realização, uma formulação compreendendo osfragmentos de anticorpo cristalizados descritos emPCT/IBO3/04502 e pedido US 10/222140, aqui incorporado porreferência, são usados para tratar artrite reumatóide usandoo processo de tratamento da invenção.

Em certas realizações, um anticorpo, porção de an-ticorpo, ou outro inibidor de TNF alfa da invenção pode seradministrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerteou um carreador comestível assimilável. 0 composto (e outrosingredientes, se desejado) também pode ser encerrado em umacápsula de gelatina de concha dura ou mole, comprimido emcomprimidos, ou incorporado diretamente na dieta do sujeito.Para administração terapêutica oral, os compostos podem serincorporados com excipientes e usados na forma de comprimi-dos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, e-lixires, suspensões, xaropes, wafers, e semelhantes. Paraadministrar um composto da invenção através de outra que nãoadministração parenteral, pode ser necessário revestir ocomposto com, ou co-administrar o composto com, um materialpara prevenir sua inativação.

As composições farmacêuticas da invenção podem in-cluir uma "quantidade terapeuticamente efetiva" ou uma"quantidade profilaticamente efetiva" de um anticorpo ouporção de anticorpo da invenção. Uma "quantidade terapeuti-camente efetiva" refere-se a uma quantidade efetiva, em do-sagens e por períodos de tempo necessários, para obter o de- sejado resultado terapêutico. Uma quantidade terapeuticamen-te efetiva do anticorpo, porção de anticorpo, ou outro ini-bidor de TNF alfa pode variar de acordo com fatores tais co-mo o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e ahabilidade do anticorpo, porção de anticorpo, outro inibidor de TNF alfa para elicitar uma desejada resposta no indiví-duo. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é também uma naqual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo,porção de anticorpoo, ou outro inibidor de TNF alfa são su-perados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quan- tidade profilaticamente efetiva" refere-se a uma quantidadeefetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessários,para obter o desejado resultado profilático. Tipicamente,uma vez que uma dose profilática é usada em sujeitos antesde ou em um estágio inicial de doença, a quantidade profila- ticamente efetiva será menos que a quantidade terapeutica-mente efetiva.

Regimes de dosagens podem ser ajustados para pro-vimento de ótima resposta desejada (por exemplo, uma respos-ta terapêutica ou profilática). Por exemplo, uma pílula grande simples pode ser administrada, várias doses divididaspodem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser pro-porcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas e-xigências da situação terapêutica. É especialmente vantajosoformular composições parenterais em forma de dosagem unitá-ria para facilidade de administração e uniformidade de dosa-gem. Forma de dosagem unitária como aqui usada refere-se aunidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens u-nitárias para os sujeitos mamíferos a serem tratados; cadaunidade contendo uma quantidade predeterminada de compostoativo calculada para produzir o desejado efeito terapêuticoem associação com o requerido carreador farmacêutico. A es-pecificação para as formas de dosagem unitária da invençãosão ditadas por e diretamente dependentes de (a) as caracte-rísticas únicas do composto ativo e o particular efeito te-rapêutico ou profilático a ser obtido, e (b) as limitaçõesinerentes na técnica de composição de um tal composto ativopara o tratamento de sensitividade em indivíduos.

Em uma realização, a invenção provê um processo dedose simples para tratamento de um distúrbio relacionado comTNF alfa, compreendendo administração a um sujeito em suanecessidade de uma dose simples de um inibidor de TNF alfa,tal como um anticorpo humano. Em uma realização, o inibidorde TNF alfa é o anticorpo anti-TNF alfa D2E7. A dose simplesde inibidor de TNF alfa pode ser qualquer quantidade tera-peuticamente ou profilaticamente efetiva. Em uma realização,um sujeito é administrado com 20 mg, 40 mg ou 80 mg em umadose simples de D2E7. A dose simples pode ser administradaatravés de qualquer rota, incluindo, por exemplo, adminis-tração subcutânea. Regimes de dosagem bi-semanal podem serusados para tratar distúrbios nos quais atividade de TNF al-fa é prejudicial, e são ainda descritos em US 10/163657.Processos.de doses variáveis múltiplas de tratamento ou pre-venção também podem ser usados para tratar distúrbios nosquais atividade de TNF alfa é prejudicial, e são ainda des-critos em PCT/US05/12007.

É para ser notado que valores de dosagem podem va-riar com o tipo e severidade da condição a ser aliviada. Épara ser ainda entendido que para qualquer sujeito particu-lar, específicos regimes de dosagem devem ser ajustados como tempo de acordo com a necessidade do indivíduo e o julga-mento profissional da pessoa administrando ou supervisionan-do a administração das composições, e que faixas de dosagensaqui mostradas são somente exemplares e não são pretendidaslimitarem o escopo ou prática da composição reivindicada.

A invenção também pertence a composições farmacêu-ticas embaladas ou kits para administração de anticorpos an-ti-TNF da invenção para tratamento de AS. Em uma realizaçãoda invenção, o kit compreende um inibidor de TNF alfa, talcomo um anticorpo, uma segunda composição farmacêutica com-preendendo um agente terapêutico adicional, e instruções pa-ra administração para tratamento de AS. As instruções podemdescrever como, por exemplo, subcutaneamente, e quando, porexemplo, em semana 0 e semana 2, as diferentes doses de ini-bidor de TNF alfa e/ou o adicional agente terapêutico devemser administrados a um sujeito para tratamento.

Um outro aspecto da invenção pertence a kits con-tendo uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpoanti-TNF alfa e um carreador farmaceuticamente aceitável euma ou mais composições farmacêuticas cada uma compreendendouma droga útil para tratamento de um distúrbio relacionado aTNF alfa e um carreador farmaceuticamente aceitável. Alter-nativamente, o kit compreende uma composição farmacêuticasimples compreendendo um anticorpo anti-TNF alfa, uma oumais drogas úteis para tratamento de uma desordem relaciona-da com TNF alfa e um carreador farmaceuticamente aceitável.Os kits contêm instruções para dosagem das composições far-macêuticas para o tratamento de uma desordem relacionada comTNF alfa. Em uma realização, contem instruções com relação acomo determinar a eficácia do inibidor de TNF para o trata-mento de AS. 0 kit pode incluir qualquer um dos seguintespara realização de processos da invenção: um agente detectá-vel que especificamente reconhece CTX-II e/ou MMP-3; instru-ções para uso; e reagentes para isolamento de uma amostra apartir do paciente.

A embalagem ou kit alternativamente pode conter oinibidor de TNF alfa e ele pode ser promovido para uso, tan-to dentro da embalagem como através de informação acompa-nhante, para os usos ou tratamento dos distúrbios aqui des-critos. Os compostos farmacêuticos embalados ou kits aindapodem incluir um segundo agente (como aqui descrito) embala-do com ou co-promovido com instruções para uso de segundoagente com um primeiro agente (como aqui descrito).

B. Adicionais Agentes Terapêuticos

A invenção pertence a determinação de eficácia deum inibidor de TNF para o tratamento de AS, sozinho ou emcombinação com um adicional agente terapêutico. A combinaçãode agentes usada dentro dos processos e composições farma-cêuticas aqui descritas pode ter um aditivo terapêutico ouum efeito sinergistico sobre a condição(ões) ou doença(s)alvejada para tratamento. A combinação de agentes usada den-tro de processos ou composições farmacêuticas aqui descritastambém pode reduzir um efeito prejudicial associado com pelomenos um dos agentes quando administrado sozinho ou sem ooutro agente (s) da particular composição farmacêutica. Porexemplo, a toxidez de efeitos colaterais de um agente podeser atenuada por um outro agente da composição, assim permi-tindo uma maior dosagem, aperfeiçoando aquiescência de paci-ente, e aperfeiçoando resultado terapêutico. Os efeitos si-nergisticos ou aditivos, benefícios, e vantagens das compo-sições aplicam-se a classes de agentes terapêuticos, classesestruturais ou funcionais, ou a próprios compostos individu-ais.

Compostos ativos suplementares também podem serincorporados nas composições. Em certas realizações, um an-ticorpo ou porção de anticorpo da invenção é co-formuladocom e/ou co-administrado com um ou mais adicionais agentesterapêuticos que são úteis para tratamento de distúrbio re-lacionado com TNF alfa. Por exemplo, um anticorpo anti-hTNFalfa, porção de anticorpo, ou outro inibidor de TNF alfa dainvenção pode ser co-formulado e/ou co-administrado com umou mais anticorpos adicionais que se ligam a outros alvos(por exemplo, anticorpos que se ligam a outras citocinas ouque ligam moléculas de superfície de célula), uma ou maiscitocinas, receptor de TNF alfa solúvel (ver, por exemplo,PCT WO 94/06476) e/ou um ou mais agentes químicos que inibemprodução ou atividade de hTNF alfa (tais como derivados deciclo hexano-ilideno como descrito em PCT WO 93/19751). Alémdisso, um ou mais anticorpos ou outros inibidores de TNF al-fa da invenção podem ser usados em combinação com dois oumais dos agentes terapêuticos anteriores. Tais terapias decombinação podem vantajosamente utilizar menores dosagensdos agentes terapêuticos administrados, assim evitando pos-síveis toxidez ou complicações associadas com as várias mo-noterapias.

Exemplos não-limitantes de agentes terapêuticoscom os quais um anticorpo, porção de anticorpo, ou outro i-nibidor de TNF alfa pode ser combinado em um processo detratamento e avaliado de acordo com os processos da invençãoincluem o seguinte: droga(s) antiinflamatória não-esteroidal(NSAIDs); droga(s) antiinflamatória supressiva de citocina(CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356 (anticorpo anti-TNF alfa huma-nizado; Celltech/Bayer); cA2/infliximab (anticorpo anti-TNFalfa quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/etanercept (proteí-na de fusão IgG receptor de TNF de 75 kD; Immunex, ver, porexemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. In-vest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); TNF-IgG 55 kd (proteína defusão IgG - receptor de TNF de 55 kD; Hoffmann-LaRoche) ;IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticorpo anti-CD4 primatizado não-esgotante; IDEC/SmithKline; ver, por exemplo, Arthritis &Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-11-2 e/ou DAB 389-IL-2 (proteínas de fusão IL-2; Seragen; ver, por exemplo,Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti-Tac (an-ti-IL-2R alfa humanizado; Protein Design Labs / Roche); IL-4(citocina antiinflamatória; DNAX/Schering); IL-10 (SCH52000; IL-10 recombinante, citocina antiinflamatória;DNAX/Schering); IL-4; IL-10 e/ou agonistas de IL-4 (por e-xemplo, anticorpos agonistas); IL-1RA (antagonista de recep-tor de IL-1; Synergen / Amgen); anakinra (Kineret / Amgen);TNF bp/s-TNF (proteína de ligação de TNF solúvel; ver, porexemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (su-plemento), S284; Amer. J. Phisiol. - Heart and CirculatoryPhysiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42); R973401 (inibidor defosfodiesterase Tipo IV; ver, por exemplo,.Arthritis & Rheu-matism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); MK-966 (i-nibidor de COX-2; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism(1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S81); Hoprost (ver, porexemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (su-plemento), S82); metotrexato; talidomida (ver, por exemplo,Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento),S282) e drogas relacionadas com talidomida (por exemplo,Celgen); Ieflunomida (antiinflamatório e inibidor de citoci-na; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39,No. 9 (suplemento), S131; Inflammation Research (1996) Vol.45, pp. 103-107); ácido tranexâmico (inibidor de ativação deplasminogênio; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism(1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284); T-614 (inibidorde citocina; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996)Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); prostaglandina El (ver,por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9(suplemento) S282); Tenidap (droga antiinflamatória não-esteroidal; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996)Vol. 39, No. 9 (suplemento), S280); naproxeno (droga antiin-flamatória não-esteroidal; ver, por exemplo, Neuro Report(1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); Meloxicam (droga antiinfIama-tória não-esteroidal); ibuprofeno (droga antiinflamatórianão-esteroidal); piroxicam (droga antiinflamatória não-esteroidal) ; diclofenaco (droga antiinflamatória não-esteroidal) ; indometacina (droga antiinflamatória não-esteroidal) ; sulfasalazina (ver, por exemplo, Arthritis &Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); azati-oprina (ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol.39, No. 9 (suplemento), S281); inibidor de ICE (inibidor daenzima de conversão de enzima interleucina-1 beta); zap-70e/ou inibidor de Ick (inibidor de tirosina cinase zap-70 oulck) ; inibidor de VEGF e/ou inibidor de VEGF-R (inibidoresde fator de crescimento de célula endotelial vascular ou re-ceptor de fator de crescimento de célula endotelial vascu-lar; inibidores de angiogênese); drogas antiinflamatóriascorcosteróides (por exemplo, SB203580); inibidores de TNF-convertase; anticorpos anti-IL-12; anticorpos anti-IL-18;interleucina-11 (ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism91996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S296); interleucina-13(ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996), Vol. 39,No. 9 (suplemento), S308); inibidores de interleucina-17(ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39,No. 9 (suplemento), S120); ouro; penicilamina; cloroquina;hidroxi cloroquina; clorambucil; ciclosporina; ciclofosfami-da; irradiação de linfóide total; globulina anti-timócito;anticorpos anti-CD4; toxinas CD5; peptideos e colágeno admi-nistrados oralmente; lobenrazit di-sódio; Agentes de Regula-ção de Citocina (CRAs) HP228 e HP466 (Houghten Pharmaceuti-cals, Inc.); ICAM-I fósforotioato oligo desoxinucleotideosanti-sentido (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); recep-tor de complemento solúvel 1 (ΤΡΙΟ; T Cell Sciences, Inc.);prednisona; orgoteína; poli sulfato de glicosaminoglicano;minociclina; anticorpos anti-IL2R; lipideos marinhos e botâ-nicos (ácidos graxos de peixe e semente de planta; ver, porexemplo, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am.21:759-777); auranofina; fenil butazona; ácido meclfenâmico;ácido flufenâmico; imunoglobulina intravenosa; zileuton; a-zaribina; ácido micofenólico (RS-61443); tacrolimus (FK-506) ; sirolimus (rapamicina); amiprilose (terafectina); cla-dribina (2-cloro desoxi adenosina); metotrexato; antivirais;e agentes de modulação imune. Qualquer um dos agentes men-cionados acima pode ser administrado em combinação com o an-ticorpo TNF alfa da invenção para tratar um distúrbio rela-cionado com TNF alfa usando o processo de dose simples oudose variável múltipla de tratamentos da invenção.

Em uma realização, a invenção inclui um artigo defabricação ou um processo de tratamento para determinação deeficácia de um inibidor de TNF em combinação com um dos se-guintes agentes para o tratamento de um distúrbio relaciona-do com TNF alfa onde atividade de TNF alfa é prejudicial:anticorpo anti-IL12 (ABT 874); anticorpo anti-IL18 (ABT325) ; inibidor de molécula pequena de LCK; inibidor de molé-cula pequena de COT; anticorpo anti-ILl; inibidor de molécu-la pequena de MK2; anticorpo anti-CD19; inibidor de moléculapequena de CXCR3; inibidor de molécula pequena de CCR5; ini-bidor de molécula pequena de CCR11; anticorpoi anti-E/L se-lectina; inibidor de molécula pequena de P2X7; inibidor dede molécula pequena de IRAK-4; agonista de molécula pequenade receptor de glucocorticóide; anticorpo receptor de anti-C5a; inibidor de molécula pequena de receptor de C5a; anti-corpo anti-CD32; e CD32 como uma proteína terapêutica.

Ainda em uma outra realização, a invenção incluium artigo de fabricação ou um processo de tratamento paradeterminação de eficácia de um inibidor de TNF em combinaçãocom um agente antibiótico ou antiinfecção. Agentes antiin-fecção incluem aqueles agentes conhecidos na técnica paratratamento de infecções virais, de fungos, parasíticas oubacterianas. 0 termo, "antibiótico", como aqui usado, refe-re-se a uma substância química que inibe o crescimento de,ou elimina, microorganismos. Abrangido s por este termo sãoantibióticos produzidos por um microorganismo, assim comoantibióticos sintéticos (por exemplo, análogos) conhecidosna técnica. Antibióticos incluem, mas não são limitados a,claritromicina (Biaxin), ciprofloxacina (Cipro) e metronida-zol (Flagyl).

Em uma outra realização, a invenção inclui um ar-tigo de fabricação ou um processo de tratamento para deter-minação de eficácia de um inibidor de TNF em combinação comuma droga usada para tratar doença de Crohn ou um distúrbiorelacionado com Crohn. Exemplos de agentes terapêuticos quepodem ser usados para tratar Crohn incluem mesalamina, pred-nisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, budenosida,sulfasalazina, metil prednisolona sod scc, defenoxilato /atrop sulf, cloridrato de loperamida, metotrexato, omepra-zol, folato, ciprofloxacina / dextrose - água, bitartaratode hidrocodona / apap, cloridrato de tetraciclina, fluocino-nida, metronidazol, timerosal / ácido bórico, sulfato de hi-osciamina, colestiramina / sucrose, cloridrato de ciproflo-xacina, cloridrato de meperidina, cloridrato de midazolam,oxicodona hcl / acetaminofeno, cloridrato de prometazina,fosfato de sódio, sulfametoxazol / trimetoprim, celecoxibe,policarbofil, napsilato de propoxifeno, hidrocortisona, mul-tivitaminas, balsalazida di-sódio, fosfato de codeina / a-pap, colesevelam hcl, cianocobalamina, ácido fólico, Ievo-floxacina, natalizumabe, meil prednisolona, interferon gama,e sargramostim (GM-CSF). Em uma realização, metotrexato éadministrado para o tratamento de doença de Crohn em uma do-se de 2,5 mg a 30 mg por semana.

O anticorpo TNF alfa pode ser administrado em com-binação com corticosteróides tópicos, análogos de vitaminaD, e retinóides tópicos e orais, ou suas combinações, para otratamento de psoriase. Em adição, o anticorpo TNF alfa podeser administrado em combinação com um dos seguintes agentesoara o tratamento de psoriase: inibidor de molécula pequenade KDR (ABT-123), inibidor de molécula pequena de Tie-2,calcipotrieno, propionato de clobetasol, triamcinolona ace-tonida, propionato de halobetasol, tazaroteno, metotrexato,fluocinonida, betametasona diprop aumentada, fluocinolona,acetonida, acitretina, xampu de alcatrão, valerato de beta-metasona, furoato de mometasona, cetoconazol, pramoxina /fluocinolona, valerato de hidrocortisona, flurandrenolida,uréia, betametasona, propionato de clobetasol / emoll, pro-pionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, fórmu-la umectante, ácido fólico, desonida, alcatrão de carvão,diacetato de diflorasona, etanercept, folato, ácido lático,metoxsalen, hc/bismuto subgal/znox/resor, acetato de metilprednizolona, prednisona, filtro solar, ácido salicilico,halcinonida, antralina, pivalato de clocortolan, extrato decarvão, alcatrão de carvão / ácido saliciclico, alcatrão decarvão / ácido salicilico / enxofre, desoximetasona, diaze-pam, emoliente, emoliente pimecrolimus, fluocinonida / emo-liente, óleo mineral / óleo de mamona / na lact, óleo mine-ral / óleo de amendoim, petroleum / miristato de isopropila,psoraleno, ácido salicilico, sabão / tribromsalano, timero-sal / ácido bórico, celecoxibe, infliximabe, alefacept, efa-lizumabe, tacrolimus, pimecrolimus, PUVA, UVB e outra foto-terapia, e sulfasalazina.

Em uma realização, o anticorpo TNF alfa da inven-ção é administrado usando um processo de dose variável múl-tipla para o tratamento de AS em combinação com um dos agen-tes mencionados acima para o tratamento de um distúrbio in-testinal. Em uma outra realização, os agentes adicionaismencionados acima são usados em combinação com um anticorpoTNF alfa no processo de dose simples de tratamento da inven-ção. Ainda em uma outra realização, o anticorpo TNF alfa éadministrado em um regime de dosagem bi-semanal.

Qualquer um dos agentes terapêuticos mencionadosacima, sozinho ou em combinação uns com os outros, pode seradministrado a um sujeito sofrendo de um distúrbio relacio-nado com TNF alfa onde TNF alfa é prejudicial, em combinaçãocom o anticorpo TNF alfa usando um regime de tratamento dedose variável múltipla. Em uma realização, qualquer um dosagentes terapêuticos mencionados acima, sozinho ou em combi-nação, pode ser administrado a um sujeito sofrendo de umdistúrbio intestinal em adição a um anticorpo TNF alfa paratratar um outro distúrbio relacionado a TNF alfa, tal comoartrite reumatóide. Deve ser entendido que os agentes tera-pêuticos adicionais podem ser usados em terapia de combina-ção como descrito acima, mas também podem ser usados em ou-tras indicações aqui descritas onde um efeito benéfico é de-sej ado.

A presente invenção é ainda ilustrada pelo exemploque se segue que não deve ser construído como limitante emqualquer maneira.

Exemplo

Exemplo l:Adalimumabe suprime biomarcadores de de-gradação de cartilagem e sinovite em espondilite ancilosanteativa (AS)

O objetivo do estudo que se segue foi analisar po-tenciais biomarcadores de destruição de cartilagem e osso,por exemplo, marcadores de ressorçâo de osso, marcadores dedegradação de colágeno, e marcadores de sinovite, em um ex-perimento controlado de adalimumabe no tratamento de AS mo-derada a severa. 0 estudo também buscou analisar o efeito deum inibidor de TNF, isto é, adalimumabe, sobre a correlaçãode um marcador de ressorçâo de osso, um marcador de degrada-ção de colágeno e um marcador de sinovite para CRP, um mar-cador conhecido para AS, em umq população de estudo de AS.

Processos

Pacientes com AS ativa que tiveram uma respostainadequada a pelo menos uma NSAID ou DMARD foram eleitas pa-ra participação neste estudo. 0 desenho de estudo é mostra-doi na Figura 1. Pacientes foram randomizados para receberemplacebo ou adalimumabe 4 0 mg subcutaneramente (sc) cada ou-tra semana (eow) durante um período inicial de 24 semanas decego - duplo, seguido por um período de 80 semanas de rótuloaberto. Três biomarcadores foram analisados em linha base eapós tratamento com adalimumabe ou plaebo em 12 e 24 sema-nas. Especificamente, o marcador de ressorção de osso, N-telopeptídeos colágeno Tipo-I de soro (NTX), o biomarcadorde degradação de colágeno, telopetídeos-C colágeno Tipo IIurinário (CTX-II urinário), e o biomarcador de sinovite, ma-triz metaloprotease de soro 3 (MMP-3) foram analisados. As-sim, parâmetros de eficácia primários incluíram avaliação emAS (ASAS) critérios de Grupo de Trabalho , o índice de ati-vidade de doença AS Bath (BASDAI) , e CRP. Através de ELISA,concentrações de telopeptídeos-C colágeno Tipo II urinário(CTX-II urinário), telopeptídeos-N colágeno Tipo I de soro(NTX) , e MMP3 de soro foram medidas para cada paciente emlinha base, e 12 e 24 semanas. Diferenças de concentraçõesde linha base em cada grupo de tratamento foram determina-das, assim como correlações entre mudanças nestes biomarca-dores e outros resultados AS.

Os critérios de inclusão de paciente incluíram oseguinte: pacientes ≥ 18 anos de idade; AS ativa, definidapor satisfação de pelo menos 2 dos 3 seguintes critérios:(1) escore BASDAI ≥ 4, (2) escore de Escala Análoga Visual(VAS) para Dor de Costas Total ≥ 4, e (3) Rigidez matinal ≥1 hora; e inadequada resposta para pelo menos uma NSAID.

Critérios de exclusão de paciente incluíram o se-guinte: recebimento prévio de tratamento de anti-TNF; evi-dência radiológica de total ancilose espinhal (espinha bam-bu) ; uso de préias DMARD dentro 4 semanas de linha base (ou-tra que não metotrexato, sulfasalazina ou hidroxi cloroqui-na) ; injeção de junta intra-articular com corticosteróidesdentro de 4 semanas de linha base; e uso de outros compostosbiológicos ou terapia de investigação dentro de 6 semanas delinha base.

Resultados

Um total de 82 pacientes foi arrolado: 44 pacien-tes placebo vs. 38 pacientes de adalimumabe. Do total de 82pacientes, 80 (8%) pacientes completaram o período de 24 se-manas. Os dois pacientes que não completaram o período de 24semanas foram do grupo placebo. Características de linha ba-se foram similares entre grupos de tratamento. Demografiasde linha base são mostradas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1:Demografias de Linha Base

<table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table>

Entre todo os pacientes no estudo, níveis de CRP

foram significantemente correlacionados a níveis de CTX-IIurinário, MMP3 e NTX em linha base. A correlação entre ní-veis de CRP e CTX-II urinário foi maior que a correlação en-tre níveis de CRP e MMP3 e NTX. Correlações de biomarcador eCRP em linha base são mostradas na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2:Correlações de biomarcador e CRP em linhabase

<table>table see original document page 118</column></row><table>R = valor de correlação

N = pacientes

Reduções significantes em concentrações de CTX-IIurinário e MMP3 (mostradas abaixo na Tabela 3) ocorreram emadalimumabe vs. placebo pts em 12 e 24 semanas (p<0,001),mas não existiram diferenças significantes para NTX.

Tabela 3.Reduções significantes em CTX-II urinário

<table>table see original document page 119</column></row><table>

Como mostrado na Figura 2, pacientes de adalimuma-be experimentaram significantes reduções em níveis de CTX-IIurinário versus placebo em semana 12 e semana 24. Pacientesde adalimumabe também experimentaram reduções estatistica-mente significantes em níveis de MMP3 versus pacientes pla-cebo em 12 semanas e 24 semanas, como mostrado na Figura 3.

Níveis de CRP foram significantemente reduzidos em pacientesde adalimumabe comparados a pacientes placebo e, semana 12 esemana 24 (ver Figura 4).

Mudanças em níveis de CRP, CTX-II urinário e MMP-3a partir de linha base para semana 12 foram estatisticamentesignificantemente correlacionadas no grupo de adalimumabe.Significantes correlações foram notadas entre CRP de linhabase e 1) CTX-II urinário (r = 0,71), 2) MMP3 (r = 0,45), e3) NTX (r = 0,37) (p < 0,001), e entre CTX-II urinário e NTX ( r = 0,49; ρ < 0, 0001). Mudanças de semana doze em CTX-IIurinário e MMP3 correlacionaramse significantemente com mu-danças em CRP (r = 0,40 e 0,43, respectivamente) (p <0,005). Em adição, a mudança em semana 12 em CTX-II urináriocorrelacionou significantemente com a mudança em MMP3 (r = 0,41, ρ < 0, 0001) . No grupo adalimumabe, a análise de corre-lação confirma que aperfeiçoamento em níveis de CRP está as-sociado com redução em ambos os níveis de CTX-II urinário eMMP-3. Correlações entre mudança de CRP e biomarcador a par-tir de linha base em semana 12 são mostradas abaixo na Tabe-la 2.

Tabela 4.Correlações entre mudança de CRP e bio-marcador a partir de linha base em semana 12*

<table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table>

Em conclusão, em pacientes com AS moderada a seve-ra, adalimumabe suprimiu significantemente biomarcadores querefletem sinovite e degradação de matriz de cartilagem. Ada-limumabe induziu supressão dos biomarcadores que refletemsinovite (MMP3) e degradação de matriz de cartilagem (CTX-IIurinário), sugerindo que adalimumabe diminui dano estruturalassociado com AS. Em adição, mudanças em CTX-II urinário eMMP3 foram significantemente correlacionadas com mudança emCRP.

Equivalentes

Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serãocapazes de avaliar usando não mais que experimentação de ro-tina, muitos equivalentes para as especificas realizações dainvenção aqui descritas. Tais equivalentes são pretendidosserem abrangidos pelas reivindicações que se seguem. Os con-teúdos de todas as referências, patentes, e pedidos de pa-tente publicados citados por todo este pedido de patente sãoaqui incorporados por referência.

Claims

1. Processo in vitro para determinação da eficáciade um anticorpo TNF-alfa humano, ou uma porção de ligação deantigeno do mesmo, para tratamento de espondilite ancilosan-te (AS) , o dito processo CARACTERIZADO pelo fato de compre-ender comparação de um nivel pré-determinado de um biomarca-dor de degradação de colágeno e/ou um biomarcador de sinovi-te a partir de um paciente tendo AS após tratamento com oanticorpo TNF-alfa humano, com um nivel padrão conhecido dobiomarcador de degradação de colágeno e/ou do biomarcador desinovite associado com o estado de doença; eavaliação se o nivel de biomarcador de sinovitee/ou biomarcador de degradação de colágeno pós-tratamento dopaciente é menor que o nivel padrão conhecido do biomarcadorde degradação de colágeno e/ou biomarcador de sinovite, ondeum menor nivel de biomarcador de degradação de colágeno e/oubiomarcador de sinovite a partir do paciente após tratamentocom o anticorpo TNF-alfa humano em relação ao nivel padrãoconhecido indica eficácia do anticorpo TNF-alfa humano parao tratamento de AS.

2. Processo de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 e 13-15, CARACTERIZADO pelo fato de que o biomar-cador de degradação de colágeno é C-telopeptideo do colágenoTipo II (CTX-II).

3. Processo de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o biomarcador de degradaçãode colágeno é C-telopeptideo do colágeno Tipo II (CTX-II)urinário.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 e 13-15, CARACTERIZADO pelo fato de que o biomar-cador de sinovite é metaloprotease de matriz 3 (MMP3).

5. Processo de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o biomarcador de sinovite émetaloprotease de soro 3 (MMP3).

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 e 13-15, CARACTERIZADO pelo fato de que a eficá-cia do anticorpo TNF-alfa humano, ou de uma porção de Iiga-ção de antigeno do mesmo, para melhora de dano estruturalassociado com AS é determinada.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1-6 e 13-15, CARACTERIZADO pelo fato de compreenderainda comparação do nivel de proteina C-reativa (PCR) do pa-ciente com um nivel padrão conhecido de PCR associado com oestado de doença; eavaliação se o nivel de PCR do paciente é maiorque o nivel padrão conhecido de PCR, onde um menor nivel deproteina C-reativa em relação ao padrão conhecido indica e-ficácia do tratamento.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1-6 e 13-15, CARACTERIZADO pelo fato que o anticor-po TNF-alfa humano, ou sua porção de ligação de antigeno,dissocia do TNF-alfa humano com uma Kd de 1 χ IO-8M ou menose uma constante de taxa KDff de 1 χ IO-3 s_1 ou menos, ambasdeterminadas por ressonância de plasmon de superfície, eneutraliza citotoxidez de TNF-alfa humano em um ensaio L929padrão in vitro com uma IC50 de 1 χ IO-7M ou menos.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1-6 e 13-15, CARACTERIZADO pelo fato que o anticor-po TNF-alfa humano, ou sua porção de ligação de antigeno,tem as seguintes características:a) dissocia do TNF-alfa humano com uma constantede taxa K^off de 1 x 10"3 s"1 ou menos, como determinado porressonância de plasmon de superfície;b) tem um domínio CDR3 de cadeia leve compreenden-do a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou modificadaa partir de SEQ ID NO: 3 através de uma substituição alaninasimples na posição 1, 4, 5, 7 ou 8 ou através de uma a cincosubstituições conservativas de aminoácidos em posições 1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9;c) tem um domínio CDR3 de cadeia pesada compreen-dendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou modifi-cada a partir de SEQ ID NO: 4 por uma substituição alaninasimples na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 ou atravésde uma a cinco substituições conservativas de aminoácidos emposições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ou 12.

10. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1-6 e 13-15, CARACTERIZADO pelo fato que o anti-corpo TNF-alfa humano, ou sua porção de ligação de antigeno,compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) tendoum domínio CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO: 3, ou modificada a partir de SEQ ID NO: 3 por umasubstituição alanina simples na posição 1, 4, 5, 7 ou 8, ecompreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendoum domínio CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO: 4, ou modificada a partir de SEQ ID NO: 4 por umasubstituição alanina simples na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9,-10 ou 11.

11. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1-6 e 13-15, CARACTERIZADO pelo fato que o anti-corpo TNF-alfa humano, ou sua porção de ligação de antigeno,compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) compre-endendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: Ie uma re-gião variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

12. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1-6 e 13-15, CARACTERIZADO pelo fato que o anti-corpo TNF-alfa humano, ou sua porção de ligação de antigeno,é adalimumabe.

13. Processo in vitro para determinação da eficá-cia de um anticorpo TNF-alfa humano, ou uma porção de liga-ção de antigeno do mesmo, para espondilite ancilosante (AS),CARACTERIZADO pelo fato de compreender comparação de um ní-vel pré-tratamento de um biomarcador de degradação de colá-geno e/ou um biomarcador de sinovite obtido de um pacientetendo AS com um nível pós-tratamento do biomarcador de de-gradação de colágeno e/ou do biomarcador de sinovite obtidodo dito paciente, onde um menor nível de biomarcador pós-tratamento indica eficácia do anticorpo TNF-alfa humano, oude uma porção de ligação de antigeno do mesmo.

14. Processo in vitro de monitoração da eficáciade um anticorpo TNF-alfa humano, ou uma porção de ligação deantigeno do mesmo, para diminuição de progressão de dano es-trutural associado com espondilite ancilosante (AS) em umpaciente, o processo sendo CARACTERIZADO pelo fato de com-preender determinação de nível de um biomarcador de degrada-ção de colágeno e/ou um biomarcador de sinovite em um paci-ente e comparando o nível do biomarcador de degradação decolágeno e/ou do biomarcador de sinovite com um nível padrãoconhecido do biomarcador de degradação de colágeno e/ou dobiomarcador de sinovite associado com AS, onde uma diminui-ção no nível do biomarcador indica que o anticorpo TNF-alfa humano, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, é e-ficaz para diminuição de taxa de progressão de dano estrutu-ral associado com AS no paciente.

15. Processo in vitro de previsão da eficácia deum anticorpo TNF-alfa humano, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, para o tratamento de AS em um paciente, odito processo CARACTERIZADO pelo fato de compreender:comparação de um nível pré-determinado de um bio-marcador de degradação de colágeno e/ou um biomarcador desinovite a partir de um paciente após tratamento com um an- ticorpo TNF-alfa humano, ou uma porção de ligação de antíge-no do mesmo, com um nível padrão conhecido do biomarcador dedegradação de colágeno e/ou do biomarcador de sinovite asso-ciado com AS; eavaliação se o nível de biomarcador de degradação de colágeno e/ou de biomarcador de sinovite pós-tratamentodo paciente é menor que o nível padrão conhecido do biomar-cador de degradação de colágeno e/ou do biomarcador de sino-vite, onde um menor nível de biomarcador de degradação decolágeno e/ou de biomarcador de sinovite a partir do pacien-te em relação ao nivel padrão conhecido indica que o anti-corpo TNF-alfa humano, ou uma porção de ligação de antígenodo mesmo, é previsto para ser efetivo para o tratamento deAS no paciente.

16. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1-15, CARACTERIZADO pelo fato que o nível de bi-omarcador é determinado usando ELISA.

17. Kit para realização do processo, conforme de-finido em com qualquer uma das reivindicações 1-15,CARACTERIZADO pelo fato de compreender:a) um agente detectável que reconhece especifica-mente o biomarcador de degradação de colágeno e/ou o biomar-cador de sinovite;b) instruções para uso; ec) opcionalmente, reagentes para isolamento de umaamostra a partir do paciente.

18. Kit de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente detectável reconheceCTX-II urinário ou MMP3 de soro.

19. Processo in vitro de determinação da eficáciade um inibidor de TNF-alfa para o tratamento de AS em um pa-ciente, o dito processo CARACTERIZADO pelo fato de compreen-der:comparação de um nível pré-determinado de CTX-II apartir de um paciente após o tratamento com o inibidor deTNF-alfa com um nível padrão conhecido de CTX-II associadocom o estado de doença; eavaliação se o nível de CTX-II pós-tratamento dopaciente é menor que o nível padrão conhecido de CTX-II, on-de um menor nível de CTX-II a partir do paciente em relaçãoao nível padrão conhecido indica que o inibidor de TNF-alfaé efetivo para o tratamento de AS no paciente.

20. Processo in vitro para determinação da eficá-cia de um inibidor de TNF-alfa para diminuição de dano es-trutural associado com espondilite ancilosante (AS) em umpaciente, o dito processo CARACTERIZADO pelo fato de compre-ender comparação de um nível pré-determinado de CTX-II apartir de paciente tendo AS após tratamento com o inibidorde TNF-alfa com um nível padrão conhecido de CTX-II associa-do com o estado de doença; eavaliação se o nível de CTX-II pós-tratamento dopaciente é menor que o nível padrão conhecido de CTX-II, on-de um menor nível de CTX-II a partir do paciente após trata-mento com o inibidor de TNF-alfa em relação ao nível padrãoconhecido indica que o inibidor de TNF-alfa é efetivo na di-minuição de dano estrutural associado com AS no paciente.

21. Processo in vitro para determinação da eficá-cia de um inibidor de TNF-alfa para o tratamento de AS em umpaciente, o dito processo CARACTERIZADO pelo fato de compre-ender :comparação de um nível pré-determinado, pós-tratamento de CTX-II obtido do paciente com um nível pré-determinado, pré-tratamento de CTX-II obtido do paciente; eavaliação se o nível de CTX-II pós-tratamento émenor que o nível CTX-II pré-tratamento, onde um menor nívelde CTX-II pós-tratamento a partir do paciente em relação aonível de CTX-II pré-tratamento indica que o inibidor de TNF-alfa é efetivo para o tratamento de AS no paciente.

22. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 19-21, CARACTERIZADO pelo fato que o nível deCTX-II pós-tratamento é pelo menos cerca de 9% diminuído emrelação ao nível de CTX-II pré-tratamento.

23. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 19-21, CARACTERIZADO pelo fato que o CTX-II éCTX-II urinário.

24. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 19-21, CARACTERIZADO pelo fato que o nível deCTX-II é determinado usando ELISA.

25. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 19-21, CARACTERIZADO pelo fato que o inibidor deTNF-alfa é selecionado do grupo consistindo em um anticorpoTNF-alfa, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, umaproteína de fusão de TNF, ou uma proteína de ligação de TNFrecombinante.

26. Processo de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão de TNF éetanercept.

27. Processo de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo TNF-alfa ou suaporção de ligação de antígeno, é selecionado do grupo con-sistindo em um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado,um anticorpo humano, e um anticorpo multivalente.

28. Processo de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo TNF-alfa ou suaporção de ligação de antígeno, é selecionado do grupo con-sistindo em infliximabe, golimumabe, e adalimumabe.

29. Processo de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo humano, ou suaporção de ligação de antigeno, dissocia de TNF-alfa humanocom uma Kd de 1x10-8M ou menos e uma constante de taxa K0ffde 1x10-3 s-1 ou menos, ambas determinadas por ressonância deplasmon de superfície, e neutraliza citotoxidez de TNF-alfahumano em um ensaio L929 padrão in vitro com uma IC50 de 1 χ-10-7M ou menos.

30. Processo de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo humano, ou suaporção de ligação de antígeno, tem as seguintes caracterís-ticas:a) dissocia de TNF-alfa humano com uma constantede taxa Koff de IxlO-3 s-1 ou menos, como determinada por res-sonância de plasmon de superfície;b) tem um domínio CDR3 de cadeia leve compreenden-do a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou modificadaa partir de SEQ ID NO: 3 através de uma substituição alaninasimples na posição 1, 4, 5, 7, ou 8 ou através de uma a cin-co substituições conservativas de aminoácidos nas posições-1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9;c) tem um domínio CDR3 de cadeia pesada compreen-dendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou modifi-cada a partir de SEQ ID NO: 4 através de uma substituiçãoalanina simples na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 ouatravés de uma a cinco substituições conservativas de amino-ácidos nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ou 12.

31. Processo de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato que o anticorpo humano, ou sua por-ção de ligação de antigeno, compreende uma região variávelde cadeia leve (LCVR) compreendendo a seqüência de aminoáci-dos de SEQ ID NO: Ie uma região variável de cadeia pesada(HCVR) compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO: 2.

32. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 19-21, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compre-ende comparação de um nivel pré-determinado, pós-tratamentode um biomarcador de sinovite obtido do paciente com um ni-vel padrão conhecido do biomarcador de sinovite associadocom AS; eavaliação se o nivel de biomarcador de sinovitepós-tratamento é menor que o nivel de biomarcador de sinovi-te padrão conhecido, onde um menor nivel de biomarcador desinovite pós-tratamento em relação ao nivel padrão conhecidode biomarcador de sinovite indica que o inibidor de TNF-alfaé efetivo para o tratamento de AS no paciente.

33. Processo de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que o biomarcador de sinovite éMMP-3.

34. Processo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 19-32, CARACTERIZADO pelo fato de que o nivel dobiomarcador é determinado usando ELISA.

35. Kit para realização do processo, conforme de-finido em qualquer uma das reivindicações 19-32,CARACTERIZADO pelo fato de compreender:a) um agente detectável que reconhece especifica-mente CTX-II;b) instruções para uso; ec) opcionalmente, reagentes para isolamento de umaamostra do paciente.

36. Kit de acordo com a reivindicação 35,CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender um agente de-tectável que reconhece especificamente MMP-3.