KR101598296B1 - Dna 복제수 변이를 이용한 강직성 척추염 발병 고위험도 예측용 조성물 및 이를 이용한 예측 방법 - Google Patents
Dna 복제수 변이를 이용한 강직성 척추염 발병 고위험도 예측용 조성물 및 이를 이용한 예측 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 DNA 복제수 변이(DNA copy number variants)를 이용하는 강직성 척추염 발병 위험도 예측방법에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머를 이용하여, 강직성 척추염 발병 위험도를 효과적으로 예측할 수 있으며, 단일염기 다형성(SNP) 측정결과를 접목시킴으로써 상기 예측의 민감도와 특이도를 증진시킬 수 있음을 확인하였는바, 강직성 척추염의 예방 및 치료에 있어서 보다 근본적으로 접근할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 강직성 척추염 발병 위험도 예측 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 특정 염색체 위치의 DNA 복제수 변이(copy number variants, CNV)를 확인하여, 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis, AS) 발병 위험도를 예측하는 방법에 관한 것이다.
강직성 척추염(ankylosing spondylitis, AS)은 척추 관절염( spondyloarthroaphy, SpA)이 중증화한 질환의 한 형태로서, 보통 10대 후반에서 20대 초반에 시작하여 30, 40대에 전형적인 척추강직을 보이며 천장관절 및 척추의 만성 염증 및 말초관절 혹은 눈, 심장, 장관 침범을 특징으로 하는 만성 진행성 전신질환이다. 척추관절염의 유병률은 국가마다 다르지만, 보통 1~2% 정도로 알려져 있으며, 운동성 제한으로 인해 환자 및 사회에 사회적 경제적으로 악영향을 미친다.
질병의 원인은 뚜렷하게 밝혀지지 않았지만 류마티스 관절염이나 전신성 홍반성 루푸스 같은 전신성 류마티스성 질환과 유사하게 유전적 이상, 감염, 면역염증 반응이 발병에 관여할 것으로 추정한다. 유전적으로는 "HLA-B27"이라는 조직적합성 항원 유전자가 발병에 관여하는 것으로 추정하고 있으며, 최근 연구에서는 ERAP1(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1)와 IL23R(interleukin 23 receptor) 유전자가 관계한다는 것이 시사되고 있다. 강직성 척추염으로 인한 허리와 엉치의 통증은 서서히 시작하고, 경우에 따라서는 무릎, 발목 등에도 간헐적으로 관절염이 동반된다. 증상이 모호하고 악화와 호전을 반복하여 일반적인 요통이나 비특이적인 관절통과 구별하기 어렵다. 유럽의 연구에 의하면 척추관절염의 증상 발현에서 강직성 척추염 진단까지 평균 10년이 걸린다고 한다. 따라서 환자는 질병이 어느 정도 진행된 상태에서 전문의를 찾게 되며, 그 때는 이미 초기 치료시점을 놓친 경우가 빈번하다.
최근 이 질환에 대한 경과와 치료에 대해 새로운 지식들이 축적되면서 조기치료가 질환의 치료와 경과를 저해함에 있어서 효과적임이 밝혀지고 있는바, 발병의 조기 진단 및 예측이 중요하게 대두되고 있다. 따라서, 강직성 척추염의 발병을 예측하는 것이 주요한 과제의 대상이 되고 있으며, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2008-0072643), 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 강직성 척추염 발병 위험도 예측 방법에 대해 연구 노력한 결과, 강직성 척추염의 발병과 특정 염색체 위치의 DNA 복제수 변이와 연관성이 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 본 발명은 DNA 복제수 변이를 이용한 강직성 척추염 발병 위험 예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 DNA 복제수 변이를 이용한 강직성 척추염 위험도 예측방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머를 포함하는 강직성 척추염 발병 위험도 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머를 포함하는 강직성 척추염 발병 위험도 예측용 키트를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 염색체상의 1q32.2위치, 2q31.2위치, 6p21.32위치, 13q13.1위치 및 16p13.3위치의 유전자 마커 조합을 포함하는, 강직성 척추염 발병 위험 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로서, 상기 마커 조성물은 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 마커 rs10865331 및 rs27044의 조합을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 (a) DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트(primer set)를 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR을 수행하는 단계, (b) 상기 수행된 PCR 결과물을 시퀀싱하는 단계 및 (c) 상기 시퀀싱 결과로부터 검체가 DNA 복제수 변이가 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 강직성 척추염 발병 위험도 예측방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로서, 상기 (a) 단계의 프라이머 세트는 서열번호 1의 정방향 프라이머(forward primer) 및 서열번호 2의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진, 염색체상의 1p34.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 1q32.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 2q31.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 6p21.32위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 11q22.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 13q13.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 14q24.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 16p13.3위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 22q11.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 1q32.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 13q13.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 14q24.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (a) 단계의 PCR은 게놈 정량적 PCR(genomic quantitative PCR) 또는 결실 타이핑 PCR (deletion-typing PCR)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 염색체상의 1p34.2위치, 11q22.1위치, 14q24.2위치 및 22q11.1위치로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 DNA 복제수 변이가 있는 경우, 강직성 척추염 발병 저위험군으로 예측하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 염색체상의 1q32.2위치, 2q31.2위치, 6p21.32위치, 13q13.1위치 및 16p13.3위치로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 DNA 복제수 변이가 있는 경우, 강직성 척추염 발병 고위험군으로 예측하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, (d) 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism) 검출용 프라이머 세트를 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 (e) 상기 수행된 PCR 결과물로부터 단일염기 다형성이 있는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 강직성 척추염 (Ankylosing spondylitis) 발병 위험도 예측 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (d) 단계의 프라이머 세트는 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs10865331)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs27044)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 염색체상의 rs10865331 및 rs27044로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 단일염기 다형성이 있는 경우, 강직성 척추염 발병 고위험군으로 예측하는 것일 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머(forward primer) 및 서열번호 2의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진, 염색체상의 1p34.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 1q32.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 2q31.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 6p21.32위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 11q22.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 13q13.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 14q24.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 16p13.3위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 22q11.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 1q32.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 13q13.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 14q24.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 강직성 척추염 발병 위험도 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로서, 상기 조성물은 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs10865331)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs27044)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 강직성 척추염 발병 위험도 예측용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 DNA 복제수 변이여부를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 DNA 복제수 변이가 발생한 군에서, 강직성 척추염 발병도와의 관련성을 확인하였다. 또한, 단일염기 다형성(SNP) 측정결과를 DNA 복제수 변이와 접목시킴으로써, 강직성 척추염 발병도 예측의 민감도와 특이도를 증진시킬 수 있음을 확인하였는 바, 대표적인 현대인의 질병이라고 할 수 있는 강직성 척추염의 발병을 조기에 예측하여 효과적으로 예방 및 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 lq32.2 영역의 array-CGH에서 신호강도의 비율을 log2 ratio로 나타낸 결과이다.
도 2는 lq32.2 영역의 array-CGH에서 신호강도 비율을 색으로 나타낸 결과이다.
도 3은 lq32.2 영역의 DNA 복제수 변이를 genomic quantitative PCR을 통하여 검증한 결과이다.
도 4는 lq32.2(a), 2q31.2(b), 6p21.32(c), 13q13.1(d), 16q13.3(e) CNV 구역들 (CNV region, CNVRs)의 복제수(<2n, 2n, >2n)변이에 따른 AS 발병률의 Odd ratio값을 나타낸 결과이다.
도 5는 (a) deletion typing PCR을 수행을 위한 모식도, (b) deletion typing PCR 결과물의 전기영동겔의 영상 및 (c) 시퀀싱에 의한 결실지점 주변의 DNA 서열을 나타낸 결과이다.
도 6은 Deletion typing PCR에서 1q32.2, 13q13.1, 14q24.2 영역의 복제수(HOM, HET, ≥2n)변이에 따른 AS 발병률의 Odd ratio을 나타낸 결과이다.
도 7은 AS 발병률을 증가시키는 CNVRs의 복제수 변이가 동시에 하나 이상 발생한 대상에 대한 AS 발병률의 Odd ratio값을 나타낸 결과이다.
도 8은 AS 발병률을 감소시키는 CNVRs의 복제수 변이가 동시에 하나 이상 발생한 대상에 대한 AS 발병률의 Odd ratio값을 나타낸 결과이다.
도 9는 AS 발병률을 증가시키는 5종의 CNVRs를 이용한 AS 발병률 예측 세트의 ROC(Receiver-Operating Characteristic) curve를 나타낸 결과이다.
도 10은 AS 발병률을 증가시키는 5종의 CNVRs와 5종의 SNPs(rs27037, rs27434, rs10865331, rs27044, rs30187)를 이용한 AS 발병률 예측 세트의 ROC curve를 나타낸 결과이다.
도 11은 AS 발병률을 증가시키는 5종의 CNVRs와 4종의 SNPs(rs27434, rs10865331, rs27044, rs30187)를 이용한 AS 발병률 예측 세트의 ROC curve를 나타낸 결과이다.
도 12는 AS 발병률을 증가시키는 5종의 CNVRs와 2종의 SNPs(rs10865331, rs27044)를 이용한 AS 발병률 예측 세트의 ROC curve를 나타낸 결과이다.
도 13은 5종의 CNVRs 및 2종의 SNPs 마커 조합에 대해 HLA-B27 양성인 개체만을 대상으로 (AS환자 501명, 대조군 30명) ROC 커브분석을 실시한 결과이다.
도 2는 lq32.2 영역의 array-CGH에서 신호강도 비율을 색으로 나타낸 결과이다.
도 3은 lq32.2 영역의 DNA 복제수 변이를 genomic quantitative PCR을 통하여 검증한 결과이다.
도 4는 lq32.2(a), 2q31.2(b), 6p21.32(c), 13q13.1(d), 16q13.3(e) CNV 구역들 (CNV region, CNVRs)의 복제수(<2n, 2n, >2n)변이에 따른 AS 발병률의 Odd ratio값을 나타낸 결과이다.
도 5는 (a) deletion typing PCR을 수행을 위한 모식도, (b) deletion typing PCR 결과물의 전기영동겔의 영상 및 (c) 시퀀싱에 의한 결실지점 주변의 DNA 서열을 나타낸 결과이다.
도 6은 Deletion typing PCR에서 1q32.2, 13q13.1, 14q24.2 영역의 복제수(HOM, HET, ≥2n)변이에 따른 AS 발병률의 Odd ratio을 나타낸 결과이다.
도 7은 AS 발병률을 증가시키는 CNVRs의 복제수 변이가 동시에 하나 이상 발생한 대상에 대한 AS 발병률의 Odd ratio값을 나타낸 결과이다.
도 8은 AS 발병률을 감소시키는 CNVRs의 복제수 변이가 동시에 하나 이상 발생한 대상에 대한 AS 발병률의 Odd ratio값을 나타낸 결과이다.
도 9는 AS 발병률을 증가시키는 5종의 CNVRs를 이용한 AS 발병률 예측 세트의 ROC(Receiver-Operating Characteristic) curve를 나타낸 결과이다.
도 10은 AS 발병률을 증가시키는 5종의 CNVRs와 5종의 SNPs(rs27037, rs27434, rs10865331, rs27044, rs30187)를 이용한 AS 발병률 예측 세트의 ROC curve를 나타낸 결과이다.
도 11은 AS 발병률을 증가시키는 5종의 CNVRs와 4종의 SNPs(rs27434, rs10865331, rs27044, rs30187)를 이용한 AS 발병률 예측 세트의 ROC curve를 나타낸 결과이다.
도 12는 AS 발병률을 증가시키는 5종의 CNVRs와 2종의 SNPs(rs10865331, rs27044)를 이용한 AS 발병률 예측 세트의 ROC curve를 나타낸 결과이다.
도 13은 5종의 CNVRs 및 2종의 SNPs 마커 조합에 대해 HLA-B27 양성인 개체만을 대상으로 (AS환자 501명, 대조군 30명) ROC 커브분석을 실시한 결과이다.
본 발명은 염색체상의 1q32.2위치, 2q31.2위치, 6p21.32위치, 13q13.1위치 및 16p13.3위치의 유전자 마커 조합을 포함하는, 강직성 척추염 발병 위험 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "발병 위험 예측용 마커"란 정상 대조군 개체에 비하여 강직성 척추염 발병 위험도가 높은 개체에서 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
또한, 상기 마커 조성물에서, 강직성 척추염 발병 위험도 예측의 민감도 및 특이도를 높이기 위하여 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 마커 rs10865331 및 rs27044의 조합을 더 포함하는, 강직성 척추염 발병 위험 예측용 마커 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)"이란 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A,T,G,C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이로서, 인구집단에서 1%이상의 빈도로 존재하는 2개 이상의 대립 염기서열이 발생하는 위치를 의미하며, 상기 DNA 복제수 변이여부 결과와 단일염기 다형성(SNP) 측정결과를 접목시킴으로써, 강직성 척추염 발병도 예측의 민감도와 특이도를 증진시킬 수 있다.
본 발명은 (a) DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트(primer set)를 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR을 수행하는 단계, (b) 상기 수행된 PCR 결과물을 시퀀싱하는 단계 및 (c) 상기 시퀀싱 결과로부터 검체가 DNA 복제수 변이가 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis, AS) 발병 위험도 예측 방법을 제공한다.
(a) 단계에서는 강직성 척추염 발병 위험도를 예측하기 위하여 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트(primer set)를 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR을 수행한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "DNA 복제수 변이(DNA Copy number variation; CNV)"는 1kb 이상의 특정 염기서열이 결실(0n 또는 1n)되거나, 증폭(3n 또는 그 이상)되는 것으로, 삽입, 결실, 전위, 증폭, 전좌 등과 더불어 유전자의 구조적 변이 중 하나이다. 일반적으로 1kb 또는 그 이상의 크기를 가지는 DNA 단편의 증폭 또는 결실을 의미한다. 최근 CNV 연관 분석 연구를 실시한 WTCCC(Wellcome Trust Case Control Consortium)결과에 따르면 전체 CNV 유전자형 중 40%정도만이 연관성 분석에 사용할 수 있는 유전자형 분석이 가능한 CNV로 보고 하고 있다. 또한 SNP 분석과는 달리 CNV 연구는 신호대 잡음비가 좋지 않기 때문에 WTCCC연구의 경우 CNV 유전자형을 예측하기 위해 유전자형을 정확하게 하기 위한 통계적인 방법을 사용한 바 있다. 최근 WTCCC 연구의 경우에는 CNV 유전자형 예측을 위한 대체방법으로써 신호강도(signal intensity)를 사용할 것을 권장하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "PCR(Polymerase Chain Reaction)"은 특정 DNA 영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머와 DNA 합성효소에 의한 DNA 합성반응을 시험관내에서 반복하여, 특정 DNA 영역을 수십만배로 증폭하는 방법을 말한다. 일반적으로, PCR 공정의 한 사이클은 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 분리(denaturing)하는 단계, 분리된 단일가닥 DNA에 표적영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머를 어닐링(annealing)시키는 단계, 프라이머를 연장하여 표적영역에 상보적인 서열을 합성(extention)하는 단계로 이루어진다. PCR 방법에서, 이중가닥 분리는 고온(heating)(90℃이상)에서 이루어지고, 프라이머 결합(50~60℃) 및 DNA 합성(70~76℃)은 상대적으로 저온(cooling)에서 이루어진다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 이용되는 표적 핵산에 인접해 있는 5'말단 서열 및 3'말단 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
상기 (a) 단계에서 사용되는 프라이머 세트는 DNA 복제수 변이가 있는 특정 염색체 위치에 결합하기 위한 것으로서, 바람직하게는 서열번호 1의 정방향 프라이머(forward primer) 및 서열번호 2의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진, 염색체상의 1p34.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 1q32.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 2q31.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 6p21.32위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 11q22.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 13q13.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 14q24.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 16p13.3위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 22q11.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 1q32.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 13q13.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 14q24.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 (a) 단계에서 PCR은 게놈 정량적 PCR 또는 결실 타이핑 PCR인 것이 바람직하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "게놈 정량적 PCR(genome quantitive Polymerase Chain Reaction, qPCR)"은 미량의 DNA를 측정하는 방법으로서, 반응의 각각 사이클에서 PCR반응에 의해 생성되는 형광 신호를 측정을 하는 방법이다. qPCR반응으로 도입되는 테스트 서열의 양은 사이클링 동안 생성되는 신호의 강도를 결정할 것이고, 이러한 신호를 알려진 표준으로부터 수록된 신호와 비교함으로써 DNA는 광법위한 농도에 걸쳐 정확하게 정량될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "결실 타이핑 PCR(deletion-typing Polymerase Chain Reaction, PCR)"은 결실서열의 정확한 크기와 중지점(deletion breakpoint)을 찾아내기 위한 방법으로서, 결실 예상구역을 포함하는 PCR을 시행한 후, 시퀀싱에 의하여 확인된 결실부위와 비교한다. 결실이 없는 경우, 예상한 크기의 PCR 증폭물이 확인되는 반면, 결실이 존재하면, 그 크기만큼 길이가 감소한 PCR 증폭물이 확인된다.
(b) 단계에서는, 강직성 척추염 발병 위험도를 예측하기 위하여 상기 (a) 단계에 의해서 얻은 PCR 결과에 대한 시퀀싱을 실시한다.
(c) 단계에서는, 강직성 척추염 발병 위험도를 예측하기 위하여 상기 (b) 단계에 의해서 얻은 시퀀싱 결과로부터 검체가 DNA 복제수 변이가 있는지 여부를 결정한다.
보다 구체적으로, 염색체상의 1p34.2위치, 11q22.1위치, 14q24.2위치 및 22q11.1위치로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 DNA 복제수 변이가 있는 경우, 강직성 척추염 발병 저위험군으로 예측할 수 있다.
상기 DNA 복제수 변이는 동시에 하나 이상 발생할 수 있으며, 1p34.2위치, 11q22.1위치, 14q24.2위치 및 22q11.1위치에서 결실된 CNVR의 수가 증가할수록 강직성 척추염 발병률이 감소한다.
또한, 염색체상의 1q32.2위치, 2q31.2위치, 6p21.32위치, 13q13.1위치 및 16p13.3위치 중 어느 하나 이상에서 DNA 복제수 변이가 있는 경우, 강직성 척추염 발병 고위험군으로 예측할 수 있다.
상기 DNA 복제수 변이는 동시에 하나 이상 발생할 수 있으며, 1q32.2위치, 2q31.2위치, 6p21.32위치, 13q13.1위치 및 16p13.3위치에서 결실된 CNVR의 수가 증가할수록 강직성 척추염 발병률이 증가한다.
또한, 상기 방법에서, 강직성 척추염 발병 위험도 예측의 민감도 및 특이도를 높이기 위하여 (d) 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism) 검출용 프라이머 세트를 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 (e) 상기 수행된 PCR 결과물로부터 단일염기 다형성이 있는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서는 rs10865331 및 rs27044로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 단일염기 다형성이 있는 경우, 강직성 척추염 발병 고위험군으로 예측할 수 있다. 또한, 단일염기 다형성여부를 측정하기 위한 (d) 단계의 프라이머세트는 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs10865331)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs27044)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, array-CGH 분석과 qPCR을 실시하여 AS와 관련된 10개의 CNVRs (AS 발병 위험도를 증가시키는 5개의 CNVR 및 AS 발명 위험도를 감소시키는 5개의 CNVR)를 결정 및 검증하였으며, 이후, qPCR을 실시하여 독립적인 검증을 통해 강직성 척추염과 CNVRs의 복제수 변이와 관련성을 다시 확인하였다(실시예 1 내지 실시예 3). 또한, deletion-typing PCR 을 실시하여, CNVRs의 정확한 크기와 경계를 확인하였으며, 동형접합 결실과 이형 접합 결실간의 AS 발병률간의 관련성을 확인하였다(실시예 4 내지 5). 아울러, 상기 실시예 3에서 확인한 AS 발병 위험도를 증가시키는 5개의 CNVR의 복제수 변이가 중복적으로 발생할수록, AS 발병 위험도가 크게 증가함을 확인하였으며(실시예 6), CNVRs의 복제수 변이 뿐만 아니라 AS 발병위험과 관련이 있는 단일염기 다형성(SNP)을 동시 가지는 경우, 발병위험도가 더욱 증가한다는 사실을 확인하고, 상기 결과를 바탕으로 우수한 민감도와 특이도를 갖는 AS 발병 위험도 예측방법을 규명하였다(실시예 7 내지 8).
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머(forward primer) 및 서열번호 2의 역방향 프라이머(reverse primer)로 이루어진, 염색체상의 1p34.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 1q32.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 2q31.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 6p21.32위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 11q22.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 13q13.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 14q24.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 16p13.3위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 22q11.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 1q32.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 13q13.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 이루어진, 염색체상의 14q24.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 강직성 척추염 발병 위험도 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 강직성 척추염 발병 위험도 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, PCR 반응용 버퍼 및 DNA 중합효소를 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 더 포함할 수 있으며, 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
또한, 상기 키트/ 조성물에서, 강직성 척추염 발병 위험도 예측의 민감도 및 특이도를 높이기 위한 수단으로서, 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs10865331)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs27044)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. array-CGH 분석을 통한 CNVRs의 규명
1-1. 연구 대상 및 통계적 분석
모든 연구 대상은 한국인으로 구성되었다.
Array-CGH(Comparative genomic hybridization) 분석을 위해, 309명의 AS환자(남자 278명, 여자 31명, 연령 22.2±8.3세)를 한양대학교 병원의 류머티스병원으로부터 모집하여 AS 발병위험과 연관된 복제수변이를 발굴(discovery)하는 군(group)으로 사용하였다. 비교분석을 위한 정상대조군 309명도 (남자 214명, 여자 95명, 연령 35.3±13.6세) 동 병원에서 모집하였다. 이 환자들은 1984 the Modified New York Criteria에 의해 AS로 진단된 환자들이다. 이 연구는 institutional review board(CUMC11U199)의 승인 하에 수행되었으며, 서면 동의하에 이루어졌다. 이 발굴 (discovery) 단계의 연구 대상자들에 대한 특성은 하기 표 1에 나타내었다.
통계적 분석은 Stata software(version 10.0; Stata Corporation, College station, TX)와 SPSS for Windows(version 11.5; SPSS, Chicago, IL)를 이용하여 수행되었다. P value가 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 보았다.
1-2. 실험방법
Agilent 180K SurePrint G3 Human CNV Microarray을 이용하여 Whole-genome array-CGH을 실시하였다. 상기 array는 유전자 변이의 자료와 1000 genome 프로젝트에 의하여 분류된 DNA 복제수 변이 지역을 스크리닝 하기 위하여 실시되었다. 환자와 대조군으로부터 분리한 genomic DNA는 Cy5-dCTP(PerkinElmer, Waltham, MA)로 표지하고, 정상 대조 (reference) DNA인 NA1085 DNA는 Cy3-dCTP (PerkinElmer)로 표지하였다. 표지된 DNA는 혼성화된 완충용액, human Cot-1 DNA (HybMasker, ConnectaGen, Seoul, Korea)와 함께 Agilent 180K array 상에서 교잡반응이 실시되었다. Array 슬라이드를 65℃에서 24시간 동안 배양한 후, 상기 array 슬라이드를 세척하고 스캔닝한 후, Feature Extraction Software (Agilent Technologies)를 통하여 영상을 분석하였다.
UCSC genome browser (Human NCBI36/hg18)를 통하여 Probe mapping이 수행되었다. 데이터의 품질은 CGH-QCTM-Sep09 QC metric set 에 의하여 평가하였으며, 모든 데이터는 상기 품질 평가를 만족하였다.
1-3. CNVs(Copy number variants)의 검출
log2 ratios에 기초하여, 약간의 수정(minimum log2 ratio=3, minimum number of consecutive probes in a CNV=4)을 가한 기본 설정하의 Genomic Workbench 7.0 software에서 ADM2 algorithm를 이용하여 CNVs를 검출하였다.
618개의 샘플로부터 전체 629,186 CNVs가 확인되었다. 개개의 genome 마다 확인된 CNVs 수의 중간값은 999(488~1515의 범위)이며, CNVs의 중간 크기는 2.0Kb(101bp~5.9Mp)이었으며, 확인된 CNVs의 일반적인 특성은 하기 표 2에 나타내었다.
1-4. AS 발병위험과 관련된 CNVRs(Copy number variants regions)의 규명
CNV 추출 이후에, CNVRuler software를 사용하여 618명으로부터 얻은 CNV들간에 겹치는 부분을 합쳐서 CNV 영역(CNV regions, CNVR)을 규명하였다.
총 3,706개의 CNVRs이 규명되었으며, 이 중 5%이상의 빈도를 보이는 1,357개의 CNVR을 대상으로 AS발병위험과의 연관성을 분석하였다. 연관성 분석은 로지스틱 회귀 분석을 통해 실시하였으며, 이를 통해 연령과 성별에 따라 실험 결과가 다르게 나타나는 것을 방지하였다. 다중 비교의 문제를 해결하기 위해 false discovery rate(FDR) 방법을 사용하였다. 본 연구에서는 P<0.05, FDR<0.2인 CNVRs을 유의성 있는 것으로 보았다.
상기한 AS 발병위험 연관 CNVR 발굴(discovery) 단계를 통해 1,357 CNVRs 중 227 CNVRs가 P<0.05, FDR<0.2기준에 부합하는, 즉 AS 발병과 관련하여 상당한 연관성이 인정됨을 확인하였다.
실시예 2. Genomic qPCR을 이용한 AS발병위험 연관 CNVRs의 검증(Validation)
실시예 1에서 발굴한 227개의 AS발병위험 연관성 CNVR에 대한 array-CGH 신호 강도를 관찰한 결과, 신호강도가 상대적으로 명확한 79 CNVR을 대상으로 정량적 PCR(qPCR)검증을 준비하였다. 정량적 PCR(qPCR)검증의 첫 단계로 각 CNVR 좌위(locus)별로 정량적 PCR(qPCR) Primer를 설계한바, 79 좌위 중 57 좌위의 Primer set가 본 연구진의 기준인 r2=0.99, 증폭효율 (amplification efficiency) 90~110%를 충족하였기에 이 57 좌위를 대상으로 정량적 PCR(qPCR)검증을 실시하였다. 정량적 PCR(qPCR) 검증은 discovery군 중 22개의 시료를 무작위로 선택하여 실시하였다.
이러한 과정을 통하여, array-CGH 결과와 qPCR 결과가 80% 이상 일치하는 일관적인 결과가 도출된 10개의 가장 신뢰할 만한 염색체 영역이 독립적인 복제 실시를 위하여 선택되었으며, 선택된 10개의 염색체 영역은 하기 표 3에 나타내었다.
qPCR로 검증된 10개의 CNVRs 중 9개는 결실(deletion) 형태였고 1개는 획득(gain) 형태였다. 이 중 1q32.2 (HHAT), 2q31.2 (PRKRA), 6p21.32 (HLA-DPB1), 13q13.1 (EEF1DP3), 16p13.3 영역의 CNVRs를 가지는 대상자는 대조군에 비하여 AS의 발병률이 유의하게 높은 반면, 1p34.2 (BMP8A), 6p24.3 (BMP6), 11q22.1 (CNTN5), 14q24.2 (RGS6), 22q11.1 (IL17RA) 영역의 CNVRs를 가지는 대상자는 대조군에 비하여 낮은 AS의 발병률을 확인하였다. 1q32.2영역의 CNVR Array-CGH profile 과 qPCR의 검증 결과는 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
도 1 내지 도 3에 나타난 바와 같이, 1q32.2영역의 신호 강도의 비율을 log2 ratio값과 색으로 결실을 확인(음수 값 및 녹색)하였으며, qPCR을 통하여 복제수의 감소를 검증하였다.
실시예 3. genomic qPCR을 이용한 AS발병위험 연관 CNVRs의 독립적인 검증(independent replication)
3-1. 연구 대상 및 통계적 분석
모든 연구 대상은 한국인 민족으로 구성되었다.
발굴한 10종의 AS발병위험 연관 CNVR에 대해 2단계의 독립적 검증을 실시하였다. 1단계 독립검증은 AS환자 491명과 정상대조군 671명 을 대상으로 하였고 2단계 독립검증은 AS환자 134명과 정상대조군 274명을 대상으로 하였다. 1,2단계 독립검증군 대상자들은 모두 한양대학교 류머티스병원과 을지대학병원으로부터 모집하였고 해당 좌위에 대한 qPCR을 실시하였다. 이 연구는 institutional review board(CUMC11U199)의 승인 하에 수행되었으며, 서면 동의하에 이루어졌다. replication 단계의 연구 대상자들에 대한 특성은 하기 표 4에 나타내었다.
통계적 분석은 Stata software(version 10.0; Stata Corporation, College station, TX)와 SPSS for Windows(version 11.5; SPSS, Chicago, IL)를 이용하여 수행되었다. P value가 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 보았다.
3-2. genomic qPCR을 실시하기 위한 프라이머 세트의 제조
발굴한 10종의 AS발병위험 연관 CNVR에 대한 genomic quantitative PCR(qPCR)을 위해 각 좌위 (locus)에 특이적인 증폭용 프라이머 세트를 디자인하였으며, 이를 이용해 discovery 단계에서 AS와 관련성이 높은 것으로 밝혀진 CNVRs에 대한 독립적 복제를 수행하고자 하였다.
본 실험에서 사용한 프라이머에 대한 정보는 하기 표 5에 나타내었다.
quantitative PCR은 Viia7 system (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 수행되었으며, NA10851 sample은 calibrator로서 사용되었다. 각 대상에 대한 복제 수 변이는 2-△ CT로 정의되었으며, △Ct는 확인하고자 하는 샘플에서 reference gene(HS6ST3)와 calibrator DNA(개인/calibrator)로부터 얻은 수치에 대한 역치 사이클의 차이를 말하며, 비율 수치는 가장 가까운 정수로 반올림하였다. qPCR에서 대조군의 품질 판정 기준 Ct 수치가 0.3보다 작은 경우로 정의하였다.
3-3. AS와 관련된 CNVRs의 독립적인 검증 결과
10개 CNVRs의 2단계에 걸친 독립검증군 qPCR 결과는 표 6에 나타내었다.
1단계 독립검증 결과(491의 실험군과 617 대조군), 10개의 CNVR중 9개의 CNVR이 일관되게 유의한 결과를 보였으며, Odd ratio의 방향(direction)도 discovery 단계와 동일(다섯 CNVR은 위험도 증가이고 다섯 CNVR은 위험도 감소; five risk-increasing and four protective CNVRs)한 결과를 확인하였다. 반면, 1개(6p24.3)의 CNVRs는 discovery군에서의 유의성이 독립검증군에서 확인되지 않았다.
2단계 독립검증(134의 실험군과 274 대조군)에서는, 4개의 CNVR이 discovery군과 일관되게 유의한 결과를 보였으며, Odd ratio의 방향(direction)도 discovery 단계 및 1단계 독립검증과 동일한 결과를 나타내었다(표 3 참조). 즉, 1q32.2, 2q31.2, 6p21.32, 16p13.3 영역의 CNVRs는 세 단계 set 모두에서 일관적으로 유의성을 나타내었다.
또한, 이번 독립검증에서는 qPCR의 reference DNA로 NA10851외에 해당 CNVR좌위가 2n인 사람을 reference로 사용한 분석도 실시하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, discovery 단계에서 발병률을 증가시키는 것으로 발굴된 1q32.2(A), 2q31.2(B), 6p21.32(C), 13q13.1(D), 16p13.3(E)영역 CNVRs의 결실(deletion) 복제수 변이를 갖는 개인은 2n을 갖는 개인에 비하여 높은 AS 발병률을 나타내었다. Odd ratio는 복제수가 감소함에 따라 증가하였으며, 복제수 감소정도에 유의하게 의존하는 결과를 보여주었다 (r2=0.944 ~ 0.999).
discovery 단계에서 발병률을 감소시키는 것으로 발굴된 1p34.2, 11q22.1, 14q24.2, 22q11.1 영역의 CNVRs의 복제수 변이를 갖는 개인은 2n을 갖는 개인에 비하여 낮은 AS 발병률을 나타내었다. 다만, Odd ratio는 복제수에 유의하게 의존한 결과를 나타내지 않았다.
discovery, 1단계 독립검증, 2단계 독립검증군의 결과를 모두 합친 통합(combined)분석 결과, 상기한 9종의 CNVR이 (높은 AS 발병연관성 CNVR: 1q32.2, 2q31.2, 6p21.32, 13q13.1, 16p13.3; 낮은 AS 발병연관성 CNVR: 1p34.2, 11q22.1, 14q24.2, 22q11.1) 모두 AS와 유의하게 나타났으며, 모두에서 개별적인 discovery, 1단계 독립검증, 2단계 독립검증에 비해 유의성이 높았다 (표 6의 combined 컬럼).
실시예 4. deletion-typing PCR을 이용한 CNVRs의 크기와 경계 확인
4-1. 실험방법
검증된 9개의 CNVR중 결실(deletion) CNVR 8종에 대해 결실의 정확한 크기와 경계를 확인하기 위해, 본 발명자들은 deletion-typing PCR을 수행하였다. 첫 단계로 위한 deletion-typing Primer를 설계한 바, 8개 CNVR 중 3개의 CNVRs(1q32.2, 13q13.1 and 14q24.2)에서 PCR로 결실확인이 가능함을 확인하였다. 이후 이 3개의 CNVR에 대한 Primer쌍을 이용하여 deletion-typing PCR을 수행하였다. 결실된 대립유전자들의 증폭물(amplicon)은 PCR-direct sequencing을 이용해 시퀀싱하였다.
결실 부위를 찾기 위한 프라이머 세트는 추정된 결실 부위의 측면 서열(flanking sequence) 내에서 디자인했다. 실험 전략은 도 5의 (a)에 나타내었으며, 프라이머에 대한 정보는 하기 표 7에 나타내었다.
도 5의 (a)의 실험 전략을 요약하면, 결실 예상구역을 포함하는 PCR을 시행하면 결실이 없는 경우 예상한 크기의 PCR 증폭물이 나타나는 반면, 결실이 존재하면 그 크기만큼 길이가 감소한 PCR 증폭물이 나타나게 된다는 원리이다. 도 5의 (a)에서 내측의 하얀색 box는 결실 예상 영역, 외측의 하얀색 box는 실제 결실 영역, 파란 화살표는 결실을 탐색하기 위한 프라이머 세트, 검은 수직의 막대는 microhomology sequences를 나타낸다.
4-2. CNVRs의 크기와 경계 확인
도 5의 (b) 및 (c)에 나타낸 바와 같이, 1q32.2 영역에서, deletion typing PCR에 의해 확인된 결실 부위의 길이는 ~2.4Kb이며, 시퀀싱에 의하여 확인된 결실 부위의 길이는 2,412bp로서, 거의 동일하게 관찰되었으며, CNVRs의 메카니즘은 2bp microhomology(AT)에 의한 nonhomologous end joining (NHEJ)였다.
13q13.1영역에서, deletion typing PCR에 의해 확인된 결실 부위의 길이는 ~6.2Kb이며, 시퀀싱에 의하여 확인된 결실 부위의 길이는 6.161bp로서, 거의 동일하게 관찰되었으며, CNVRs의 메카니즘은 4bp microhomology (GGCT)에 의한 NHEJ였다.
14q24.2 영역에서, deletion typing PCR에 의해 확인된 결실 부위의 길이는 ~5.1Kb이며, 시퀀싱에 의하여 확인된 결실 부위의 길이는 5.129bp로서 거의 동일하게 관찰되었으며, CNVRs의 메카니즘은 7bp microhomology(AAAAGTA)에 의한 NHEJ였다. 도 5의 (b)에서 HOM은 homozygous deletion, HET는 heterozygous deletion을 나타내며, 도 5의 (c)에서 노란색 막대는 microhomology sequence, 빨간색 box는 deleted sequences를 나타낸다.
실시예 5. 결실에 따른 AS 발병률 및 동형접합 결실과 이형 접합 결실간의 AS 발병률의 비교
총 849례의 AS환자와 922례의 정상대조군을 대상으로 3개의 CNVRs(1q32.2, 13q13.1 및 14q24.2)에 대한 deletion-typing PCR 및 PCR-direct sequencing 수행의 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
deletion-typing PCR을 이용하여 1q32.2, 13q13.1, 14q24.2영역의 CNVRs를 확인한 대상과 reference로서 ≥2n을 갖는 대상간 AS 발병률을 비교하였으며, 1q32.2, 13q13.1, 14q24.2영역의 CNVRs를 확인한 대상내에서도 동형접합결실과 이형접합결실간 AS 발병률을 비교하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 1q32.2영역의 결실 CNVRs를 갖는 대상은 ≥2n을 갖는 대상에 비해 높은 AS 발병률을 보였으며(OR=1.43, 95% CI 1.17-1.75, P=4.9x10-4), 동형접합 결실의 경우, 이형접합 결실에 비해 높은 발병률 보였다(OR=2.21, P=3.1x10-5 in HOM versus OR=1.29, P=0.020 in HET).
13q13.1영역의 결실 CNVRs를 갖는 대상은 ≥2n을 갖는 대상에 비해 높은 AS 발병률을 보였으며(OR=1.26, 95% CI 1.03-1.54, P=0.023), 동형접합 결실의 경우, 이형접합 결실에 비해 높은 발병률을 보였다(OR=1.59, P=9.3x10-4 in HOM versus OR=1.09, P=0.473 in HET).
14q24.2영역의 결실 CNVRs를 갖는 대상은 ≥2n을 갖는 대상에 비해 낮은 AS 발병률을 보였으며(OR=0.62, 95% CI 0.41-0.95, P=0.027), Odd ratio는 투여용량과 상관성이 없었다.
실시예 6. 동시적인 CNVRs의 복제수 변이와 AS 발병률간의 관련성 확인
AS 발병을 증가시키는 CNVRs의 복제수 변이가 동시에 하나 이상 발생한 대상 또는 AS 발병을 감소시키는 CNVRs의 복제수변이가 동시에 하나 이상 발생한 대상과 CNVRs의 결실이 발생하지 않은 대상간의 AS 발병률을 비교하였다. AS 발병위험 증가에 대해서는 5종의 CNVRs,(1q32.2, 2q31.2, 6p21.32, 13q13.1, 16p13.3), AS 발병위험 감소에 대해서는 3종의 CNVRs (1p34.2, 11q22.1, 14q24.2)의 복제수 변이 여부와의 관련성을 규명하고자 하였다.
도 7 및 표 9에 나타낸 바와 같이, AS 발병위험을 증가시키는 CNVRs의 복제수 변이를 4개 또는 그 이상 갖는 대상은 CNVRs의 복제수 변이가 없는 대상에 비해 약 18배의 높은 발병률을 보였다(OR=17.98, 95% CI 6.02-53.70, P=2.3x10-7). Odd ratio는 발병위험 증가 CNVRs의 수가 증가함에 따라 증가하였다(r2=0.999).
또한, 도 8 및 표 10에 나타낸 바와 같이, AS 발병위험을 감소시키는 CNVRs의 복제수 변이를 2 개 또는 그 이상 갖는 대상은 CNVRs의 복제수 변이가 없는 대상에 비해 5.2배 낮은 발병률을 보였다(OR=0.19, 95% CI 0.12-0.32, P=4.0x10-10). Odd ratio는 발병위험 감소 CNVRs의 수가 증가함에 따라 감소하였다(r2=0.9849).
상기 결과는 특정 CNVRs의 복제수 변이여부 결과를 이용하여, 강직성 척추염발병여부를 보다 정확하게 예측할 수 있음을 의미한다.
실시예 7. 단일염기 다형성(SNP)과 AS 발병률간의 관련성 확인
7-1. 실험방법
SNP(single nucleotide polymorphism) 분석의 대상은 강직성 척추염 발병률을 증가시키는 5종의 CNVRs 검사를 실시했던 강직성 척추염환자 및 대조군 중 DNA가 있는 701명 (환자 339명, 대조군 362명)으로 하였다.
한국인에서 강직성 척추염 발병률을 증가시키는 SNP marker 5종(rs27037, rs27434, rs10865331, rs27044, rs30187)을 선별하였으며, 상기 5종의 SNP marker에 특이적인 primer 및 probe를 사용하여 qPCR반응을 수행하였으며, 반응의 각 사이클에서 PCR 반응에 의해 생성되는 형광신호를 바탕으로 각 SNP marker의 genotype을 분석하였다. 본 분석에 사용된 SNP marker 특이적인 primer 및 probe는 Life Technologies사에서 구입하였으며 사용한 마커에 대한 정보는 하기 표 11에 나타내었다.
7-2. AS와 관련된 단일염기 다형성(SNP)의 독립적인 검증
5종의 SNP marker 각각에 대한 genotype 결과로 강직성 척추염 발병 위험도를 평가하였으며, 상기 genotype 결과는 하기 표 12에 나타내었다.
표 12에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 이용된 5종의 SNPs 중, 4종 (rs27434, rs10865331, rs27044, rs30187)의 SNPs에서 genotype과 AS 발병률간의 유의한 관련성을 확인하였다.
실시예 8. CNVRs 및 단일염기 다형성(SNP)을 이용한 AS 발병률 예측의 정확도의 검증.
AS와 관련된 실시예 6에서 확인한 5종의 CNVRs와 실시예 7에서 확인한 5종의 SNPs 결과를 바탕으로 Receiver-Operating Characteristic (ROC) curve 분석을 실시하였다. 본 실시예에서는 이를 통하여 우수한 민감도와 특이도를 갖는 AS 발병 위험도 예측 모델을 규명하고자 하였다.
ROC 분석은 하기 표 13에 나타낸 바와 같이, 5종의 CNVRs를 사용한 세트, 5종의 CNVRs와 5종의 SNPs 모두 이용한 세트, 5종의 CNVRs와 4종의 SNPs를 이용한 세트(rs27434, rs10865331, rs27044, rs30187), 및 5종의 CNVRs와 P<0.01을 만족하는 2종의 SNPs(rs10865331, rs27044)를 이용한 세트에 대하여 실시하였다.
표 14 및 도 9 내지 도 12에 나타낸 바와 같이, CNVRs만 사용한 경우보다(Area값; 0.632) SNPs을 함께 사용한 경우(Area값; 0.652, 0.667, 0.684) 우수한 예측 결과를 확인하였다. 특히, SNPs의 독립적 검증 결과에서 P<0.01로 확인된 2종의 SNPs와 기존 5종의 CNVRs을 함께 사용한 경우(ROC-Set3)가 가장 우수한 결과를 나타냈다.
추가적으로, 가장 우수한 결과를 보인 set3 마커 조합(5종의 CNVRs + 2종의 SNPs)에 대해 HLA-B27 양성인 개체만을 대상으로 (AS환자 501명, 대조군 30명) ROC 커브분석을 실시한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 분석대상 전체에서의 결과(Area=0.684)보다 더 우수한 결과(Area=0.707)를 나타내었다.
상기 결과는 CNVRs의 복제수 변이여부 결과만으로 예측하는 방법과 비교하여 CNVRs의 복제수 변이여부 및 단일염기 다형성(SNP) 결과를 조합함으로써, 강직성 척추염발병여부를 보다 정확하게 예측할 수 있음을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다
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<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1p34.2 reverse primer
<400> 2
cccttctcct cacacctaaa c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1q32.2 forward primer
<400> 3
acctgtgaag gatggattgg caga 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1q32.2 reverse primer
<400> 4
tggcctttga gcactgactg acta 24
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<212> DNA
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<223> 2q31.2 forward primer
<400> 5
taaaggcctg ttagtgctgt ccct 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 2q31.2 reverse primer
<400> 6
gcgacagtct ttcttactgg tgct 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6p21.32 forward primer
<400> 7
attgcttggc tccattgctg aagg 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6p21.32 reverse primer
<400> 8
tttcagtgag ctcaggaacc ctgt 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 11q22.1 forward primer
<400> 9
tctcttcctg gtctctccac ttca 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 11q22.1 reverse primer
<400> 10
aatgaagggc tgctgtatcg tggt 24
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<212> DNA
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<220>
<223> 13q13.1 forward primer
<400> 11
ccaagcctgg acatcaatga gcta 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 13q13.1 reverse primer
<400> 12
atgccatagg ctttccaaga tgcc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 14q24.2 forward primer
<400> 13
tgtgaaaggc tctctcattg ccct 24
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 14q24.2 reverse primer
<400> 14
atctgctctg catgggacag aagt 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16p13.3 forward primer
<400> 15
tcaacatcca gcatcccaca ctca 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16p13.3 reverse primer
<400> 16
acttgatggg aggagaaacc caca 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 22q11.1 forward primer
<400> 17
ccctgtgagc tggtttctat t 21
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<220>
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<400> 18
tgaccggtgt atttggtgtc 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 19
tgagtgaagt tccctgaacg agca 24
<210> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6p24.3 reverse primer
<400> 20
atatggcctg aaagacctcg cact 24
<210> 21
<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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agtgctttaa gggtgcgttg ttgg 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1q32.2 reverse primer(2)
<400> 22
actttcacag cacctccaca gact 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 13q13.1 forward primer(2)
<400> 23
aggcattccc acatgcacaa acag 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 13q13.1 reverse primer(2)
<400> 24
agttcactgc agtcaccctt ggaa 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 25
aacccacaag cagaggaagg agaa 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 26
atgtgtgtgg tgctgacatt gctg 24
<210> 27
<211> 51
<212> DNA
<213> SNP marker_rs27037
<400> 27
attattatta ttacaattgt tagggttgtt ttttctttta gaaattcaaa g 51
<210> 28
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<400> 28
agtgtgaatg agcttatacc tggtgggcca gttcatgggc cacagtcatt g 51
<210> 29
<211> 51
<212> DNA
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actgactttg gtgccgtatc taccaggtgg tcaagctgat gccattgcaa g 51
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tgcacacagg cgaggagtag tagttgactc cgcagcattc gctctgagac t 51
<210> 31
<211> 51
<212> DNA
<213> SNP marker_rs30187
<400> 31
tgtgatggtt attaggggaa aacccttctg cagtgtccaa gtgttcatca t 51
Claims (13)
- 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트 또는 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트로 이루어진, 염색체상의 1q32.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트;
서열번호 5 및 6의 프라이머 세트로 이루어진, 염색체상의 2q31.2위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트;
서열번호 7 및 8의 프라이머 세트로 이루어진, 염색체상의 6p21.32위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트;
서열번호 11 및 12의 프라이머 세트 또는 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트로 이루어진, 염색체상의 13q13.1위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트; 및
서열번호 15 및 16의 프라이머로 이루어진, 염색체상의 16p13.3위치의 DNA 복제수 변이 검출용 프라이머 세트로 이루어지는 강직성 척추염 발병 위험 예측용 마커 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs10865331)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트; 및
서열번호 30의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs27044)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 강직성 척추염 발병 위험 예측용 마커 조성물.
- 하기 단계를 포함하는, 강직성 척추염 (Ankylosing spondylitis) 발병 위험도 예측 방법:
(a) 1항 또는 2항의 마커 조성물을 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
(b) 상기 수행된 PCR 결과물을 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 및
(c) 상기 시퀀싱 결과로부터 검체가 DNA 복제수 변이가 있는지 여부를 결정하는 단계.
- 삭제
- 제 3항에 있어서,
상기 (a)단계의 PCR은 게놈 정량적 PCR(genomic quantitative PCR) 또는 결실 타이핑 PCR (deletion-typing PCR)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 삭제
- 제 3항에 있어서,
상기 방법은 염색체상의 1q32.2위치, 2q31.2위치, 6p21.32위치, 13q13.1위치 및 16p13.3위치로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 DNA 복제수 변이가 있는 경우, 강직성 척추염 발병 고위험군으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 3항에 있어서,
하기 단계를 더 포함하는, 방법:
(d) 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 검출용 프라이머 세트를 검체 게놈 DNA 시료에 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
(e) 상기 수행된 PCR 결과물로부터 단일염기 다형성이 있는지 여부를 결정하는 단계.
- 제 8항에 있어서,
상기 (d) 단계의 프라이머 세트는
서열번호 29의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs10865331)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트; 및
서열번호 30의 염기서열로 이루어진 SNP 마커(rs27044)에 특이적으로 결합하는 단일염기 다형성 검출용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 방법은 염색체상의 rs10865331 및 rs27044로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 단일염기 다형성이 있는 경우, 강직성 척추염 발병 고위험군으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는, 강직성 척추염 발병 위험도 예측용 키트.
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