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BRPI0616901A2 - composto, formulação farmacêutica, e , uso de um composto - Google Patents

composto, formulação farmacêutica, e , uso de um composto Download PDF

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BRPI0616901A2
BRPI0616901A2 BRPI0616901-5A BRPI0616901A BRPI0616901A2 BR PI0616901 A2 BRPI0616901 A2 BR PI0616901A2 BR PI0616901 A BRPI0616901 A BR PI0616901A BR PI0616901 A2 BRPI0616901 A2 BR PI0616901A2
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mmol
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methyl
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BRPI0616901-5A
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Jolie Anne Bastian
Blas Jesus Andres Blas De
Dios Alfonso De
Kevin John Hudziak
Tiechao Li
Uralde-Garmendia Beatriz Lopez De
Michael Ray Myers
Chuan Shih
Boyu Zhong
Mary Margaret Mader
Mark Andrew Pobanz
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Lilly Co Eli
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Abstract

COMPOSTO, FORMULAçãO FARMACêUTICA, E, USO DE UM COMPOSTO. A presente invenção proporciona inibidores de quinase de Fórmula (1): em que R^ 1^, R^ 2^, X e Z são conforme descrito aqui ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Description

"COMPOSTO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UMCOMPOSTO"
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A quinase p38 é uma quinase de proteína ativada por mitógeno(MAP) que pertence à superfamília de quinase de serina/treonina. Essaquinase é ativada por estresses extracelulares, tais como calor, luz UV eestresse osmótico, bem como por estímulos inflamatórios, tal comolipopolissacarídeo. Quando ativada, a quinase p38 fosforila substratos deproteína intracelulares que regulam a biossíntese das citocinas pró-inflamatórias fator α de necrose de tumor (TNFa) e interleucina-1 β (IL-1 β).Essas citocinas estão envolvidas na patologia de uma série de distúrbiosinflamatórios crônicos (Lee e colaboradores, Ann. Ν. Y. Acad. Sci.. 696, 149-170(1993); Muller-Ladner, Curr. Opin. Rheumatol., 8, 210-220 (1996)), distúrbioscardiovasculares e do sistema nervoso central (Salituro e colaboradores, Current Medicinal Chemistrv. 6, 807-823 (1999)), e distúrbios autoimunes (Pargellis ecolaboradores, Nature Structural Biology. 9(4), 268-272 (2002)). Além disso, aforma fosforilada de quinase de proteína ativada por mitógeno-quinase proteína 2(ou pMAPKAPK2) também é uma quinase na via da MAPK p38 e pode serdiretamente ativada pela MAPK p38. Estudos de inativação com camundongo deMAPKAPK2 mostram uma redução na produção de citocina, sugerindo que aMAPKAPK2 pode ser um regulador chave da resposta inflamatória e tambémpode ser um alvo potencial para terapia anti-inflamatória (WO 2005120509).
Uma série de compostos de uréia (por exemplo, no WO9923091, WO 01012188, WO 04004720, WO 04037789, WO 99/32111, US 2004/0058961, EP 1609789, WO 03072569 e WO 0043384) foramidentificados como inibidores de quinase p38 ou inibidores de citocina.Inibidores de quinase p38 ou inibidores de citocina podem ser caros deproduzir e podem ter problemas de biodisponibilidade e absorção que limitamos efeitos in vivo e uso terapêutico. Portanto, há uma necessidade por novosfármacos supressores de citocina de pequena molécula, isto é, compostos quesão capazes de inibir a quinase p38 com potência aperfeiçoada e maiorbiodisponibilidade.
A presente invenção proporciona novos inibidores de quinasep38 úteis para o tratamento de condições resultantes de produção excessiva decitocina.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona compostos de Fórmula I:
<formula>formula see original document page 3</formula>
onde:
Z é selecionado do grupo consistindo de:
<formula>formula see original document page 3</formula>
X é selecionado do grupo consistindo de:
<formula>formula see original document page 3</formula>
R1 é Ci-C7 alquila opcionalmente substituída por um a seissubstituintes selecionados do grupo consistindo de halo e C1-C4 alquil-halo;C3-C6 cicloalquila opcionalmente substituída por um ou dois substituintesselecionados do grupo consistindo de C1-C4 alquila e trifluorometila; outrimetil-silila;
R é fenila opcionalmente substituída por C1-C4 alquila oupiridinila opcionalmente substituída por C1-C4 alquila;
Y é hidrogênio, C1-C4 alquila, halo ou C1-C4 alquil-halo;R é CrC7 alquila opcionalmente substituída por C3-C6cicloalquila; C1-C4 alcóxi; C1-C4 alquil-halo; C3-C6 cicloalquilaopcionalmente substituída por um a quatro substituintes selecionados dogrupo de CrC4 alquila e trifluorometila; ou piridila, fenila ou tienila, cada umopcionalmente substituído por um primeiro substituinte selecionado do grupoconsistindo de: halo, ciano, Ci-C4 alquila, CrC4 alquil-halo e CrC4 alcóxi eopcionalmente ainda substituído por um segundo substituinte selecionado dogrupo de CrC4 alquila e halo; e
R4 é hidrogênio ou CrC4 alquila; ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.
A presente invenção também proporciona um método deinibição de quinase p38 em um mamífero compreendendo administração, aum mamífero que precisa de tal tratamento, de uma quantidade eficaz de umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
A presente invenção também proporciona um método desupressão da produção de fator α de necrose de tumor (TNPa) em ummamífero compreendendo administração, a um mamífero que precisa de taltratamento, de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.
A presente invenção também proporciona um método desupressão da produção de interleucina-1 β (TNFa) em um mamíferocompreendendo administração, a um mamífero que precisa de tal tratamento,de uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.
A presente invenção ainda proporciona um método detratamento de condições resultantes de produção excessiva de citocina em ummamífero compreendendo administração, a um mamífero que precisa de taltratamento, de uma quantidade para supressão de citocina de um composto deFórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.A presente invenção também proporciona um método deinibição do crescimento de um neoplasma suscetível em um mamíferocompreendendo administração, a um mamífero que precisa de tal tratamento,de uma quantidade para inibição de p38 de um composto de Fórmula I ou umsal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
A presente invenção também proporciona um método deinibição de metástase em um mamífero compreendendo administração, a ummamífero que precisa de tal tratamento, de uma quantidade para inibição dep38 de um composto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
A presente invenção também proporciona um método detratamento de artrite reumatóide em um mamífero compreendendoadministração, a um mamífero que precisa de tal tratamento, de umaquantidade para inibição de p38 de um composto de Fórmula I ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.
A presente invenção também proporciona uma formulaçãofarmacêutica compreendendo um composto de Fórmula I ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um excipiente,veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção também proporciona o uso de umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável para afabricação de um medicamento para a inibição de quinase p38.Adicionalmente, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Iou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para uso na inibição dequinase p38 em mamíferos. Além disso, a presente invenção proporciona umacomposição farmacêutica adaptada para a inibição de quinase p38compreendendo um composto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo em combinação com um ou mais excipientes, veículos oudiluentes farmaceuticamente aceitáveis para o mesmo.A presente invenção também proporciona o uso de umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável para afabricação de um medicamento para a supressão da produção de fator α denecrose de tumor (TNFa). Adicionalmente, a presente invenção proporcionaum composto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmopara uso na supressão da produção de fator α de necrose de tumor (TNFa) emmamíferos. Além disso, a presente invenção proporciona uma composiçãofarmacêutica adaptada para a supressão da produção de fator α de necrose detumor (TNFa) compreendendo um composto de Fórmula I ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo em combinação com um ou maisexcipientes, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis para omesmo.
A presente invenção também proporciona o uso de umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável para afabricação de um medicamento para a supressão da produção de interleucina-1β (IL-1 β). Adicionalmente, a presente invenção proporciona um compostode Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para uso nasupressão da produção de interleucina-ΐβ (IL-1 β) em mamíferos. Além disso,a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica adaptada paraa supressão da produção de interleucina-ΐβ (IL-1 β) compreendendo umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo emcombinação com um ou mais excipientes, veículos ou diluentesfarmaceuticamente aceitáveis para o mesmo.
A presente invenção também proporciona o uso de umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmopara a fabricação de um medicamento para o tratamento de condiçõesresultantes de produção excessiva de citocina. Adicionalmente, a presenteinvenção proporciona um composto de Fórmula I ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo para uso no tratamento de condiçõesresultantes de produção excessiva de citocina em mamíferos. Além disso, apresente invenção proporciona uma composição farmacêutica adaptada para otratamento de condições resultantes de produção excessiva de citocinacompreendendo um composto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo em combinação com um ou mais excipientes, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
A presente invenção também proporciona o uso de umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmopara a fabricação de um medicamento para a inibição de crescimento de umneoplasma suscetível. Adicionalmente, a presente invenção proporciona umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmopara uso na inibição de crescimento de um neoplasma suscetível emmamíferos. Além disso, a presente invenção proporciona uma composiçãofarmacêutica adaptada para inibição do crescimento de um neoplasmasuscetível compreendendo um composto de Fórmula I ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo em combinação com um ou maisexcipientes, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
A presente invenção também proporciona o uso de umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmopara a fabricação de um medicamento para a inibição de metástase.Adicionalmente, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Iou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para uso na inibição demetástase em mamíferos. Além disso, a presente invenção proporciona umacomposição farmacêutica adaptada para inibição de metástasecompreendendo um composto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo em combinação com um ou mais excipientes, veículos oudiluentes farmaceuticamente aceitáveis.
A presente invenção também proporciona o uso de umcomposto de Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmopara a fabricação de um medicamento para o tratamento de artrite reumatóide.
Adicionalmente, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Iou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo para uso no tratamento deartrite reumatóide em mamíferos. Além disso, a presente invençãoproporciona uma composição farmacêutica adaptada para o tratamento deartrite reumatóide compreendendo um composto de Fórmula I ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo em combinação com um ou maisexcipientes, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O termo "quinase p38" é tomado para significar as isoformasde quinase p38a e/ou ρ38β.
O termo "supressão da produção de TNFa (IL-1 β, citocina)" étomado para significar diminuição de níveis excessivos in vivo de TNFa, IL-ou outra citocina em um mamífero para níveis normais ou sub-normais.Isso pode ser obtido através de inibição da liberação de TNFa, IL-I β ou outracitocina in vivo por todas as células, incluindo macrófagos; através de subregulação, a nível genômico, de níveis excessivos in vivo de TNFa, IL-1 β ououtra citocina em um mamífero para níveis normais ou sub-normais; atravésde inibição da síntese de TNFa, IL-I β ou outra citocina como um evento pós-traducional; ou através de uma sub regulação de TNFa, IL-I β ou outracitocina a nível traducional.
Aqueles habilitados apreciarão que determinados compostosde Fórmula I contêm pelo menos um centro quiral. A presente invençãoconsidera todos os enanciômeros ou diastereômeros individuais, bem comomisturas de enanciômeros e diastereômeros dos referidos compostos,incluindo racematos. E preferido que compostos de Fórmula I contendo pelomenos um centro quiral existam como um único enanciômero oudiastereômero. O único enanciômero ou diastereômero pode ser preparadocomeçando com reagentes quirais ou através de técnicas sintéticas estéreo-seletivas ou estéreo-específicas. Alternativamente, o único enanciômero oudiastereômero pode ser isolado de misturas através de técnicascromatográficas quirais ou de cristalização padrões.
Será compreendido pelo leitor habilitado que os compostos dapresente invenção são capazes de formação de sais de adição de ácido. Emtodos os casos, os sais farmaceuticamente aceitáveis de todos os compostosestão incluídos nos nomes dos mesmos, compostos da presente invenção sãoaminas e, conseqüentemente, reagirão com qualquer um de uma série deácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais de adição de ácidofarmaceuticamente aceitáveis. O termo "sal farmaceuticamente aceitável",conforme usado aqui, se refere a sais dos compostos de Fórmula I os quaissão substancialmente não-tóxicos para organismos vivos. Saisfarmaceuticamente aceitáveis típicos incluem aqueles sais preparados atravésda reação dos compostos da presente invenção com um ácido orgânico ouinorgânico farmaceuticamente aceitável. Tais sais incluem os saisfarmaceuticamente aceitáveis listados em Journal of Pharmaceutical Science.66, 2-19 (1977), os quais são conhecidos por aqueles habilitados. Sais demesilato de compostos de Fórmula I são mais preferidos.
Compostos de Fórmula I são inibidores de quinase p38. Assim,a presente invenção também proporciona um método de inibição de quinasep38 em um mamífero que compreende administração, a um mamífero queprecisa do referido tratamento, de uma quantidade para inibição de quinasep38 de um composto de Fórmula I. É preferido que o mamífero a ser tratadoatravés da administração dos compostos de Fórmula I seja um ser humano.
Como inibidores de quinase p38, os compostos da presenteinvenção são úteis para supressão da produção de citocinas pró-inflamatóriasfator α de necrose de tumor (TNFa) e interleucina-ΐβ (IL-1 β) e, portanto,para o tratamento de distúrbios resultantes de produção excessiva de citocina.Portanto, acredita-se que os presentes compostos sejam úteis no tratamento dedistúrbios inflamatórios, incluindo eczema, dermatite atópica, artritereumatóide, osteoartrite, doença inflamatória do intestino e síndrome dechoque tóxico. Também acredita-se que compostos da presente invenção sãoúteis no tratamento de distúrbios cardiovasculares, tais como enfarte agudo domiocárdio, insuficiência cardíaca crônica, aterosclerose, miocardite viral,rejeição a aloenxerto cardíaco e disfunção cardíaca sepsia-associada. Alémdisso, também acredita-se que os compostos da presente invenção são úteispara o tratamento de distúrbios do sistema nervoso central, tais comomeningite meningocócica, mal de Alzheimer, mal de Parkinson e esclerosemúltipla. WO 99/32111, WO 9923091, WO 04004720, WO 03072569.
A maioria dos tumores sólidos aumenta de massa através daproliferação de células malignas e células estromais, incluindo célulasendoteliais. De forma que um tumor cresça mais de 2-3 milímetros dediâmetro, ele deve formar uma vasculatura, um processo conhecido comoangiogênese. Supressão de angiogênese tumor-induzida pela angiostatina eendostatina foi reportada como resultando em atividade anti-tumor (0'Reilly ecolaboradores, Cell. 88, 277-285 (1997)). Foi mostrado que o inibidor seletivode quinase p38 SB22025 inibe a angiogênese (J.R. Jackson e colaboradores, J1Pharmacol. Exp. Therapeutics, 284, 687 (1998)). Em virtude do fato de aangiogênese ser um componente crítico da expansão de massa da maioria dostumores sólidos, o desenvolvimento de novos inibidores de quinase p38 para ainibição desse processo representa uma abordagem promissora para terapiaanti-tumor. Essa abordagem à terapia anti-tumor pode carecer dos efeitoscolaterais tóxicos ou propriedades de indução de resistência a fármaco daquimioterapia convencional (Judah Folkman, Endogenous Inhibitors ofAngiogenesis. The Harvey Lectures, Série 92, páginas 65-82, Wiley-Liss Inc.,(1998)).
Como inibidores de quinase p38, os compostos da presenteinvenção, portanto, também são úteis na inibição do crescimento deneoplasmas suscetíveis. Schultz, R. M. Potential of p38 MAP kinaseinhibitors in the treatment of câncer. Em: E. Jucker (ed.), Progress in DrugResearch, 60, 59-92, (2003). Um neoplasma suscetível é definido como sendoum neoplasma que depende da quinase p38 para sua sobrevivência,crescimento ou metástase. Neoplasmas suscetíveis incluem tumores docérebro, do trato geniturinário, sistema linfático, estômago, laringe e pulmão(Patente U.S. #5.717.100). De preferência, o termo "neoplasmas suscetíveis",conforme usado no presente pedido, inclui cânceres humanos, incluindocarcinoma de pulmão de célula não-pequena (A. Greenberg e colaboradores,Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 26, 558 (2002)), carcinoma de mama (J. Chen ecolaboradores, J. Biol. Chem., 276, 47901 (2001); B. Salh e colaboradores,Int. J. Câncer, 98, 148 (2002); e S. Xiong e colaboradores, Câncer Res. 61,1727 (2001)), carcinoma gástrico (Y.D. Jung e colaboradores, Proc. Am.Assoc. Câncer Res., 43, 9 (2002)), carcinomas cólon-retais (S. Xiong ecolaboradores, Câncer Res., 61, 1727 (2001)) e melanoma maligno (C.Denkert e colaboradores, Clin. Exp. Metastasis, 19, 79 (2002)).
Inibição de angiogênese através de supressão de TNFatambém foi ensinada como sendo úteis na inibição ou prevenção de metástase(Patente U.S. #6.414.150; Patente U.S. #6.335.336). Além disso, supressão deTNFa é indicada para o tratamento e prevenção de caquexia, uma síndromedebilitante experimentada por cerca de metade de todos os pacientes comcâncer (T. Yoneda e colaboradores, J. Clin. Invest. 87, 977 (1991)).
Além disso, inibição de quinase p38 pode ser eficaz notratamento de determinadas condições virais, tais como influenza (K. Kujimee colaboradores, J. Immunology, 164, 3222-3228 (2000)), rinovírus (S.Griego e colaboradores, J. Immunology, 165, 5211-5220 (2000)) e HIV (L.Shapiro e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95, 7422-7426, (1998)).
Conforme usado aqui, o termo "C1-C7 alquila" se refere a umacadeia alifática reta ou ramificada, monovalente, saturada de um a seteátomos de carbono e inclui, mas não está limitado a, metila, etila, propila,isopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila, hexila e heptila. O termo "CrC7 alquila" inclui dentro de sua definição o termo "CrC4 alquila".
Conforme usado aqui, o termo "C1-C4 alcóxi" se refere a umacadeia alquila reta ou ramificada tendo de um a quatro átomos de carbonopresos a um átomo de oxigênio. Grupos CrC4 alcóxi típicos incluem metóxi,etóxi, propóxi, isopropóxi, butóxi, férobutóxi e semelhantes.
Conforme usado aqui, o termo "halo" se refere a um átomo decloro, bromo, iodo ou flúor, a menos que de outro modo especificado aqui.
Conforme usado aqui, o termo "C1-C4 alquil-halo" se refere auma CrC4 alquila substituída por até cinco átomos de halo. Grupos C1-C4alquil-halo típicos incluem metil-halo, trifluorometila, etil-halo,bisfluorometil etila, propil-halo, isopropil-halo, butil-halo, fórc-butil-halo esemelhantes.
Conforme usado aqui, o termo "C3-C6 cicloalquila" significaum anel totalmente saturado compreendendo átomos de carbono e hidrogênioe inclui ciclopropila e ciclobutila.
Determinadas classes de compostos de Fórmula I sãoinibidores de quinase p38 preferidos. O parágrafo a seguir descreve taisclasses preferidas:
a) Z é
<formula>formula see original document page 12</formula>
b) X é
<formula>formula see original document page 12</formula>
c) R4 é hidrogênio;d) Y é metila;
e) R1 é CrC7 alquila;
f) R1 é terobutila;
g) R2 é fenila ou piridinila, cada uma opcionalmentesubstituída por metila;
h) R2 é 4-tolila;
i) R3 é fenila ou tienila, cada uma opcionalmente substituídapor um primeiro substituinte selecionado do grupo consistindo de: halo, ciano,C1-C4 alquila, C1-C4 alquil-halo e Cj-C4 alcóxi e opcionalmente aindasubstituída por um segundo substituinte selecionado do grupo de CrC4alquila e halo;
j) R3 é fenila substituída por um primeiro substituinteselecionado do grupo consistindo de halo e ainda substituída por um segundosubstituinte selecionado do grupo de CrC4 alquila e halo;
k) O composto de Fórmula I é uma base livre;
1) O composto de Fórmula I é um sal;
m) O composto de Fórmula I é o sal de mesilato.
Modalidades preferidas da invenção incluem todas ascombinações de parágrafos a)-m). Outros compostos preferidos de Fórmula Isão aqueles onde X é conforme descrito no parágrafo b); R1 é conformedescrito no parágrafo e); R2 é conforme descrito no parágrafo g); e R4 éconforme descrito no parágrafo c).
Também, é preferido que X seja conforme descrito noparágrafo b); R1 seja conforme descrito no parágrafo f); R2 seja conformedescrito no parágrafo h); R3 seja conforme descrito no parágrafo i); e R4 sejaconforme descrito no parágrafo c).
É particularmente preferido que X seja conforme descrito noparágrafo b); R2 seja fenila substituída na posição A por C1-C4 alquila.
É ainda mais preferivelmente que X seja conforme descrito noparágrafo b).
O composto a seguir é também mais especialmente preferido:
Os compostos da presente invenção podem ser preparadosatravés de uma variedade de procedimentos, alguns dos quais são ilustradosnos Esquemas abaixo. Será reconhecido por aqueles habilitados na técnicaque as etapas individuais nos esquemas a seguir podem ser variadas paraproporcionar os compostos de Fórmula I. A ordem particular de etapasrequeridas para produzir os compostos de Fórmula I é dependente docomposto que está sendo sintetizado em particular, do composto de iniciaçãoe da instabilidade relativa das porções substituídas. Alguns substituintesforam eliminados nos esquemas a seguir para fins de clareza e não sedestinam a limitar o ensinamento dos esquemas de qualquer forma.
Compostos de Fórmula I e intermediários dos mesmos podemser preparados conforme ilustrado no esquema a seguir, em que R1, R2 e Xsão conforme previamente definido:
ESQUEMA 1
<formula>formula see original document page 14</formula>
A amina (a) é reagida com um isocianato ou carbamatoapropriado, tal como carbamato de pirazolil-2,2,2-tricloroetila, paraproporcionar compostos de Fórmula I. Por exemplo, uma solução da amina(1. equiv.), carbamato de tricloroetila (1 equiv.) e uma base adequada, talcomo diisopropiletilamina (2 equiv.) ou carbonato de potássio, em umsolvente adequado, tal como acetonitrila ou sulfóxido de dimetila (DMSO) éaquecida. O composto desejado pode, então, ser isolado e, se necessário edesejado, purificado usando métodos conhecidos na técnica, tal comocromatografia, para proporcionar o composto de Fórmula I. As aminasrequeridas são preparadas conforme ilustrado abaixo no Esquema 2, em que Xé conforme previamente definido:
ESQUEMA 2
<formula>formula see original document page 15</formula>
A porção nitro (b) é reduzida sob condições padrões deredução, por exemplo, com hidrogênio na presença de um catalisador depaládio ou boroidreto de sódio na presença de hexaidrato de cloreto deníquel(II) em um solvente adequado, tal como alcanóis inferiores ou acetatode etila, para proporcionar a amina (a) correspondente. Tais etapas de reduçãosão bem conhecidas e apreciadas nas técnica. Veja Larock, R.,"Comprehensive Organic Transformations.," 412, VCH Publishing, Inc., NewYork, 1989.
Os compostos de nitro requeridos são preparados conformeilustrado no Esquema 3 abaixo, em que Hal é Cl ou F e X1 é C(O)R3 ou umgrupo de proteção PG adequado:
ESQUEMA 3<formula>formula see original document page 16</formula>
2-halo-4-nitro-piridina (e) em um solvente orgânico adequado,tal como THF, é reagido com uma 4-hidróxi piperidina adequada e hidreto desódio e trifenilfosfina para proporcionar a piperidina b(i) substituídacorrespondente. Alternativamente, 2-halo-4-nitro-piridina (e) é reagida comuma piperazina apropriada e uma base, tal como carbonato de potássio, terc-butóxido de lítio ou trietilamina em um solvente polar, tal como acetonitrila,Ν,Ν-dimetilformamida (DMF) ou butanol, para proporcionar a piperazinab(ii) substituída correspondente.
A amina de fórmula b(iii) é preparada através de reação deuma 2-halo-4-nitro-piridina (e) em um solvente adequado, tal como etanol,com uma aminopiperidina apropriada na presença de uma base adequada, talcomo carbonato de sódio.
Aqueles habilitados apreciarão que os procedimentos descritosacima podem ser utilizados na formação de isômeros de piridila consideradosna presente invenção.
Os pirazolil carbamatos requeridos podem ser preparadosconforme descrito no esquema a seguir, onde R1 e R2 são conformepreviamente definido:
ESQUEMA 4<formula>formula see original document page 17</formula>
3-aminopirazóis (m) são formadas através de condições bemconhecidas na técnica; Larock, R., " Comprehensive OrganicTransformations," 79, VCH Publishing, Inc., New York, 1989. Por exemplo,uma α-cianocetona (J) e uma hidrazina ou sal de hidrazina adequado (k) emum solvente orgânico adequado, tal como etanol, são reagidos em temperaturaambiente. A pirazola (m) resultante pode ser purificada usando técnicaspadrões, tal como cromatografia sobre uma coluna de sílica gel.
Cloroformiato de 2,2,2-tricloroetila (n) é reagido com uma 3-aminopirazol (m) apropriadamente substituída e uma base, por exemplo,carbonato de sódio, carbonato de potássio ou piridina, em um solventeadequado, por exemplo, THF ou água/acetato de etila, para proporcionar ocarbamato de 2,2,2-tricloroetila (o) correspondente. Aqueles habilitadosapreciarão que o carbamato correspondente pode ser preparado através dereação de 3- aminopirazol com outros carbonatos ativos.
Compostos de Fórmula I(i) podem ser preparados conformedemonstrado no Esquema 5 abaixo, em que R1, R2, R3 e PG são conformepreviamente definidos, Z é O, N ou uma ligação e R5 é C ou N:
ESQUEMA 5
<formula>formula see original document page 17</formula>
O composto de Fórmula (f) é desprotegido sob condições bemconhecidas na técnica. Por exemplo, quando o grupo de proteção é terc-butóxicarbonila, um composto de Fórmula (f) é dissolvido em um solvente orgânicoadequado ou uma mistura de solvente, tal como diclorometano, e tratado comum ácido, tal como ácido clorídrico em dioxano ou ácido trifluoroacético.Desproteção da uréia substituída N-protegida-piperidina (f) proporciona apiperidina (g) substituída, a qual é reagida com um ácido carboxílicosubstituído sob condições padrões de acoplamento, tal como hidrocloreto deN-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDCI) oudiciclohexilcarbodiimida (DCC), uma quantidade catalítica dedimetilaminopiridina (DMAP) e 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) ouhexafluorofosfato de 0-(7- azabenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio(HATU) ou trietilamina em um solvente adequado, tal como cloreto demetileno ou acetonitrila, para proporcionar a Fórmula I(i). Aqueleshabilitados apreciarão que exemplos de Fórmula I(i) podem ser preparadoscomeçando com outras piperidinas protegidas, incluindo diferentes grupos deN-proteção, tal como formila, os quais podem requerer outros procedimentosde desproteção para formar o intermediário (g).
Um grupo de amino proteção adequado "Pg", tal como umaporção terc-butóxicarbonila (BOC), pode ser utilizado se necessário oudesejado. Técnicas para a introdução desses grupos são bem conhecidas poraqueles habilitados. Aqueles habilitados apreciarão que os grupos de proteçãopodem ser removidos em qualquer ponto conveniente na síntese doscompostos da presente invenção. Métodos para introdução e remoção degrupos de proteção de nitrogênio e oxigênio são bem conhecidos na técnica;veja, por exemplo, Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3aEd., John Wiley and Sons, New York, (1999).
Aqueles habilitados também apreciarão que nem todos ossubstituintes nos compostos de Fórmula I irão tolerar determinadas condiçõesde reação empregadas para sintetizar os compostos. Essas porções podem serintroduzidas em um ponto conveniente na síntese ou podem ser protegidas e,então, desprotegidas conforme necessário ou desejado.
As abreviações, símbolos e termos usados nos exemplos eensaios têm os seguintes significados: «-BuOH = «-butanol, DCC =diciclohexilcarbodiimida, DIEA = N,N-di-isopropiletilamina, DMSO =sulfóxido de dimetila, DMF = Ν,Ν-dimetilformamida, h = hora(s), HOBt = 1-hidroxibenzotriazol, LDA = diisopropilamida de lítio, EDCI = hidrocloreto de1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EtOAc = acetato de etila, EtOH= etanol, Et2O = dietil éter, MeOH = metanol, NaBH(OAc)3 =triacetoxiborohidreto de sódio, TBAF = fluoreto de tetrabutil amônio, Tf2O =anidrido trifluorometano-sulfônico e THF = tetraidrofurano.
PREPARAÇÕES
Preparação 1
2-Cloro-4-metil-5-nitro-piridina
<formula>formula see original document page 19</formula>
Dissolver 4-metil-5-nitro-piridin-2-ilamina (3,0 mmoles, 0,5 g)em 0,5 mL de ácido sulfurico, Adicionar 7,6 mL de água e esfriar a soluçãopara O °C. Adicionar nitrito de sódio (4,5 mmoles, 0,3 g) e agitar a misturadurante duas horas, permitindo atingir a temperatura ambiente. Diluir comágua e adicionar solução aq. de hidróxido de sódio a 10% até um pH básico.
Extrair em acetato de etila e lavar as camadas orgânicas combinadas comsolução saturada aq. de cloreto de sódio. Secar sobre sulfato de sódio, filtrar econcentrar sob pressão reduzida para proporcionar 4- metil-5-nitro-piridin-2-ol. MS(ES): m/z = 155 [M+H].
Adicionar oxicloreto de fósforo (0,6mmoles, 0,05 mL) epentacloreto de fósforo (0,6 mmoles, 0,12 g) sobre 4-metil-5-nitro-piridin-2-ol (1,9 mmoles, 0,3 g). Agitar a 120 °C durante 1,5 horas. Esfriar, adicionarágua gelada e extrair em CH2Cl2j Lavar as camadas orgânicas combinadascom solução saturada aq. de cloreto de sódio. Secar sobre sulfato de sódio,filtrar e concentrar sob pressão reduzida para proporcionar 2-cloro-4-metil-5-nitro- piridina.Preparação 2
2,3-Dicloro-5-nitro-piridina
Colocar 5-nitro-piridin-2-ol (20 g, 143 mmoles) em HClconcentrado (100 mL). Aquecer para 50 °C e, então, adicionar gota a gotaclorato de potássio (6,13 g, 50 mmoles) dissolvido em água (100 mL). Agitara 50°C durante 30 min. Esfriar a reação em um banho de gelo. Filtrar osólido e lavar com água. Secar completamente para proporcionar 21,13 g(85%) de 3-cloro-5-nitro-piridin-2-ol. MS(ES): m/z = 173 [M+H].'
Colocar oxicloreto de fósforo (11,28 mL, 121 mmoles) em umfrasco de fundo redondo e esfriar para 0 °C. Adicionar quinolina (7,15 mL,60,5 mmoles), seguido por 3-cloro-5-nitro-piridin-2-ol (21,13 g, 121 mmoles)aos poucos. Aquecer a reação para 120 0C durante 2 horas. Entornar a reaçãosobre gelo e triturar com água. Filtrar o sólido e lavar com água. Secarcompletamente para proporcionar 19,95 g (86%) do composto do título: 1HRMN δΗ (400 MHz, DMSO) 9,20 (s, 1H), 8.97 (s, 1H).Preparação 3
terc-butil éster de ácido 4-(5-Amino-6-metil-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico
<formula>formula see original document page 20</formula>
Agitar mecanicamente uma mistura de 6-cloro-2-metil-3-nitro-piridina (Asymchem, 25,00 g, 144,9 mmoles), 1-piperazinacarboxilato defórc-butila (29,68 g, 159,4 mmoles) e trietilamina (23,2 mL, 167 mmoles) emK-BuOH (250 mL) a 50 0C sob nitrogênio durante 4 horas, a 65 0C durante 2horas, então, em temperatura ambiente durante a noite. Adicionar mais 1-piperazinacarboxilato de fórc-butila (1,5 g) e aquecer a reação a 65 °C durante4 horas. Esfriar a pasta resultante para 30 0C então, adicionar hexanos (75mL). Esfriar a pasta para a temperatura ambiente durante 1 hora, então,adicionar água (150 mL). Permitir que a pasta descanse durante 45 min,então, filtrar. Lavar o bolo com água (4 χ 100 mL) então, hexanos (100 mL) esecar ao ar durante a noite para proporcionar terc-butil éster de ácido 4-(6-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico como cristais amarelosbrilhantes (46,30 g, rendimento de 99%, MS(ES): m/z = 267 [MH-H-C4H8]).
Misturar uma pasta de terc-butil éster de ácido 4-(6-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (46,00 g, 142,7 mmoles) em THF(750 mL) em temperatura ambiente com Pd/C (5% Aldrich, 3,04 g, 1,43mmoles) então, colocar sob uma atmosfera de hidrogênio (agitador de Parr,40-45 psi (275,8-310,26 kPa)) durante 6 horas. Adicionar MeOH (250 mL) esubmeter a pasta a uma atmosfera de hidrogênio durante 4 horas emtemperatura ambiente. Adicionar mais catalisador (3,04 g), então, colocar amistura sob hidrogênio durante 7 horas. Filtrar a mistura através de umaalmofada de Celite 521®, lavando com THF e MeOH então, concentrar sobpressão reduzida para proporcionar o composto do título um sólido rosa claro.(41,58 g, rendimento de 99%, MS(ES+): m/z = 293 [M+H]).
Preparar os compostos a seguir de uma maneirasubstancialmente análoga aos procedimentos descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 21</column></row><table>
Preparação 6
terc-butil éster de ácido 4-(5-amino-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxflico
Colocar 2-cloro-5-nitro-piridina (1,0 g, 6,31 mmoles), terc-butil éster de ácido piperazina-l-carboxílico (1,76 g, 9,45 mmoles) etrietilamina (1,76 mL, 12,6 mmoles) em rc-butanol (20 mL). Aquecer para 1200C durante 17 horas. Esfriar para a temperatura ambiente e adicionar acetatode etila e água. Separar a camada orgânica e lavar com água e cloreto de sódiosaturado aq. Coletar a camada orgânica, secar sobre Mg2SO4, filtrar econcentrar sob pressão reduzida. Submeter o resíduo à cromatografia emsílica gel eluindo com EtOAc:hexano a 20% para proporcionar 1,14 g (58%)de terc-butil éster de ácido 4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico.MS(ES): m/z = 309 [M+H].
Colocar terc-butil éster de ácido 4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (1,14 g, 3,70 mmoles) em EtOAcrMeOH a 1:1 (20mL). Adicionar Pd sobre carbono a 10% usando EtOAc (5 mL). Purgar areação e, então, adicionar hidrogênio. Repetir a purgação/ciclo de enchimentoduas vezes e colocar a reação sob um balão de hidrogênio e agitar emtemperatura ambiente durante 20 horas. Filtrar a reação através de umaalmofada de Celite® e lavar o bolo no filtro com EtOAc. Coletar o filtrado econcentrar sob pressão reduzida para proporcionar 1,01 g (98%) do compostodo título. MS(ES): m/z = 279 [M+H].
Preparar os compostos a seguir de uma maneirasubstancialmente análoga aos procedimentos descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 22</column></row><table>
Preparação 8terc-butil éster de ácido 4-(5-amino-3-cloro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico
Colocar 2,3-dicloro-5-nitro-piridina (2,0 g, 10,36 mmoles),terc-butil éster de ácido piperazina-l-carboxílico (2,12 g, 11,40 mmoles) ecarbonato de potássio (1,72 g, 12,43 mmoles) em DMF (20 mL). Aquecerpara 80 0C durante 2,5 dias. Esfriar para a temperatura ambiente e adicionaracetato de etila e água. Separar a camada orgânica e lavar com água e cloretode sódio saturado aq.. Coletar a camada orgânica, secar sobre Mg2SO^ filtrare concentrar sob pressão reduzida. Submeter o resíduo à cromatografia emsílica gel eluindo com EtOAc:hexano a 20% para proporcionar 3,29 g (93%)de terc-butil éster de ácido 4-(3-cloro-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico. MS(ES): m/z = 341 [M+H].
Colocar terc-butil éster de ácido 4-(3-cloro-5-nitro-piridinil)-piperazina-l-carboxílico (3,09 g, 9,01 mmoles) em metanol (50 mL).Adicionar hexaidrato de cloreto de níquel(II) (10,7 g, 45,1 mmoles) e esfriar areação para 0 °C. Adicionar boroidreto de sódio (5,11 g, 135,15 mmoles) aospoucos e agitar a 0 0C durante 2 horas. Adicionar CH2Cl2 e filtrar através deuma almofada de Celite®. Lavar o bolo no filtro com CH2Cl2 e coletar ofiltrado. Adicionar solução de bicarbonato de sódio aq. saturado ao filtrado eseparar a camada orgânica. Extrair a camada aquosa com CH2Cl2 (2 χ 30 mL).Combinar os extratos orgânicos, secar sobre Mg2SO4, filtrar e concentrar sobpressão reduzida. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindocom EtOAcihexanos a 0-70% para proporcionar 1,77 g (63%) do compostodo título. MS(ES): m/z = 311,2 [M-H].
Preparação 9
Rac-[(trans)-4-(5-amino-3-metil-piridin-2-il)-2,5-dimetil-piperazin-l-il-ciclopropil-metanona
<formula>formula see original document page 23</formula>
Dissolve íra«.s-2,5-dimetilpiperazina (500 mg, 4,37 mmoles,1,0 equiv) em 15 mL de diclorometano anídrico. Adicionar dicarbonato de di-terc-butila (953 mg, 4,37 mmoles, 1,0 equiv) dissolvido em 5 mL dediclorometano. Agitar em temperatura ambiente durante 20 horas. Filtrar osólido branco para proporcionar 430 mg de N-BOC-trans- 2,5-dimetilpiperazina (rendimento de 50%). 1H RMN (metanol-<i4) δ ppm 4,11(m, 1H); 3,55 (dd, J = 13,6, 1,7 Hz, 1H), 3,23 (dd, J = 13,6, 4,0 Hz, 1H), 3,12(m, 1H), 3,00 (dd, J =12,7, 2,9 Hz, 1H), 2,49 (m, 1H), 1,46 (s, 9H), 1,24 (d, J= 7,6, 3H), 1,15 (d, J = 6,8 Hz, 3H).Dissolver 2-cloro-3-metil-5-nitropiridina (310 mg, 1,82mmoles, 1,0 equiv) e N-BOC-írara-2,5-dimetilpiperazina (397 mg, 2,0mmoles, 1,1 equiv) em 5 mL de DMF anídrica, adicionar carbonato depotássio (251 mg, 1,82 mmoles, 1,0 equiv) e agitar a mistura durante 20 horasa 80 °C. Entornar a solução em uma mistura a 1:1 v/v de EtOAc e águagelada. Extrair a fase aquosa com EtOAc (2 χ 20 mL) e lavar as camadasorgânicas combinadas com água (3 χ 20 mL) e cloreto de sódio saturado aq.(30 mL). Secar a solução orgânica sobre sulfato de sódio e concentrar sobpressão reduzida para obter um terc-butil éster de ácido rac-(frvms)-2,5-dimetil-4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-1 -carboxílico bruto.
MS(ES+): m/z = 251,2 (M+H).
Adicionar HCl a 4 M em dioxano (4,2 mL) ao terc-butil ésterde ácido rac-(írara)-2,5-dimetil-4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-1 -carboxílico (0,15 g, 0,43 mmoles) em temperatura ambiente e agitar. Apósuma hora, concentrar sob pressão reduzida para proporcionar 0,138 g de saldi-hidroclórico de rac-(írara)-2,5-dimetil-1 -(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina como um sólido branco, (quantitativo). MS(ES): m/z = 251,2 [M+H].
Adicionar ácido ciclopropil carboxílico (56 μΐ0,7 mmoles) auma solução de EDCI (0,147 g, 0,77 mmoles), HOBt ( 0,10 g, 0,77 mmoles),sal di-hidroclórico de rac-(írara)-2,5-dimetil-l-(3-metil-5-nitro-pirídin-2-il)-piperazina (0,16 g, 0,64 mmoles) em CH2Cl2 (5 mL), seguido por DIEA (0,22mL, 1,28 mmoles) em temperatura ambiente sob atmosfera de N2. Após umahora, concentrar para proporcionar um resíduo. Submeter o resíduo àcromatografia em sílica gel eluindo com hexano:AcOEt 50-70% paraproporcionar 0,114 g de rac-ciclopropil-[(íra«5)-2,5-dimetil-4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-metanona (rendimento de 56%). MS(ES):m/z — 319,1 [M+H].
Adicionar NH4COOH (0,23 g, 3,5 mmoles) à rac-ciclopropil-[(/ra«s)-2,5-dimetil-4-(3-metil-5-nitro-pm(0,114 g, 0,35 mmoles) e Pd/C a 10 % (0,043 g) em EtOH (5 mL) sobatmosfera de N2 e aquecer a 80 °C. Após 2 horas, deixar a mistura de reaçãoesfriar e filtrar através de Celite®. Concentrar sob pressão reduzida paraproporcionar 0,1 g do composto do título (quantitativo). MS(ES): m/z = 289,3[MH-H].
Preparação 10
l-[4-(5-Amino-4-metil-piridin-2-il)-piperazin-l-ill-2.,2-dimetiI-propan-l-ona
Agitar uma solução de 2-cloro-4-metil-5-nitro-piridina (0,85mmoles, 0,15 g), hidrocloreto de 2,2-dimetil-l-piperazin-l-il-propan-l-ona(0,94 mmoles, 0,16 g) e trietilamina (2,12 mmoles, 0,3 mL) em um tubovedado a 80 0C durante a noite. Esfriar a mistura para a temperatura ambiente,adicionar CH2Cl2 e lavar com cloreto de sódio saturado aq.. Secar sobresulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para proporcionar 2,2-dimetil-1 -[4-(4-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazin-1 -il]-propan-1 -ona.Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com hexanos/acetatode etila em um gradiente (de 30% até 60%). MS(ES): m/z = 307 [M+H].
Adicionar formiato de amônio (1,55 mmoles, 0,1 g) e paládio(carbono) a 10% (0,031 mmoles) sobre uma solução de 2,2-dimetil-l-[4-(4-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-propan-l-ona (0,31 mmoles, 0,09 g)em 2 mL de etanol. Agitar a solução durante uma hora a 90 °C. Esfriar efiltrar através de uma almofada de Celite® e concentrar sob pressão reduzida.
O resíduo pode ser usado sem outra purificação. MS(ES): m/z = 277 [M+H].
Preparar o composto a seguir de uma maneirasubstancialmente análoga ao segundo procedimento descrito acima.
Tabela
<table>table see original document page 25</column></row><table>Preparação 12
l-[4-(5-Amino-4-cloro-piridin-2-iI)-piperazin-l-in-2,2-dimetil-propan-l-ona
<formula>formula see original document page 26</formula>
Etapa A: agitar uma solução de 2,4-dicloro-piridina (6,7mmoles, 1 g), N-Boc piperazina (8,1 mmoles, 1,5 g), terc-butóxido de sódio(9,5 mmoles, 0,9 g), acetato de paládio(II) (0,7 mmoles, 0,15 g) e 2-(di-t-butilfosfino)bifenila (0,7 mmoles, 0,2 g) dissolvida em tolueno sob nitrogênioa 100 0C durante 4 horas. Esfriar para a temperatura ambiente e adicionarágua. Extrair em acetato de etila lavando a camada orgânica com água ecloreto de sódio saturado aq.. Secar a camada orgânica sobre sulfato de sódio,filtrar e concentrar sob pressão reduzida para proporcionar terc-butil éster deácido 4-(4-cloro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico como um resíduo.Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com hexanos /acetato de etila em gradiente (de 10% para 50%). MS(ES): m/z = 298 [M+H].
Etapa B: Tratar uma solução em temperatura ambiente de terc-butil éster de ácido 4-(4-cloro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (0,6 g,1,9 mmoles) em CH2Cl2 (4 mL) com HCl (solução a 4 N em dioxano, 1,5 mL,5,9 mmoles) resultando em um leve exoterma. Agitar a mistura durante 3horas, adicionar mais HCl (solução a 4 N em dioxano, 1,5 mL, 5,9 mmoles) eagitar durante a noite. Concentrar sob pressão reduzida para proporcionarhidrocloreto de l-(4-cloro-piridin-2-il)-piperazina, então, triturar com Et2O(0,43 g). LCMS ES+ (m/z) 198 [M+H]).
Etapa C: Agitar hidrocloreto de l-(4-cloro-piridin-2-il)-piperazina (2,2 mmoles, 0,4 g), trietilamina (7,6 mmoles, 1,1 mL) em 13 mLde CH2Cl2 e cloreto de pivaloíla (2,2 mmoles, 0,3 mL) durante a noite emtemperatura ambiente. Adicionar CH2Cl2 e lavar com cloreto de sódiosaturado aq. e água. Secar sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sobpressão reduzida para proporcionar l-[4-(4-cloro-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-2,2-dimetil-propan-1 -ona. MS(ES): m/z = 282 [M+H].
Etapa D: Dissolver l-[4-(4-cloro-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-2,2-dimetil-propan-l-ona (1,6 mmoles, 0,4 g) em ácido sulfurico (2,3 mL) e esfriar a solução para 0 °C. Adicionar nitrato de potássio (1,6 mmoles, 0,2 g)e agitar a mistura, permitindo atingir a temperatura ambiente durante a noite.Diluir a mistura com água e adicionar hidróxido de sódio a 10% até um pHbásico. Extrair em acetato de etila. Secar sobre sulfato de sódio, filtrar econcentrar sob pressão reduzida para proporcionar um resíduo de l-[4-(4-cloro-5-nitro-piridin-2-il)-piperazin-l-il]- 2,2-dimetil-propan-l-ona. Submetero resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com uma mistura hexanos /acetato de etila como gradiente (de 30% até 60%). MS(ES): m/z = 327[M+H].
Etapa E: Adicionar (4,5 mmoles, 0,8 g) de ditionita de sódiosobre l-[4-(4-cloro-5-nitro-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-2,2-dimetil-propan-l-ona (0,9 mmoles, 0,3 g) em 22 mL de uma mistura a 1:1 de tetraidrofurano eágua e 4 mL de amônia. Agitar a solução durante 2 horas em temperaturaambiente. Concentrar sob pressão reduzida e extrair o resíduo em acetato deetila. Secar sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para proporcionar um resíduo que é usado sem outra purificação. MS(ES):m/z = 297 [M+H].
Preparar o composto a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos às Etapas C-E descritas acima.
Tabela
<table>table see original document page 27</column></row><table><formula>formula see original document page 28</formula>
Carregar ácido acético (5 L) a um frasco de 22 L. Colocar a
reação em um banho de água gelada. Adicionar piperazina (355,00 g, 2,0equiv; 4,06 moles) aos poucos com agitação e aumentar a temperatura para -40 °C. Adicionar mais 5 L de ácido acético. Agitar até a mistura se tornar umasolução. Ajustar o banho de resfriamento para -13 0C. Adicionar cloreto de2,6- difluorobenzoíla (355,00 g, 1,00 equiv; 2,01 moles; 253,39 mL) gota agota durante um período de 2 horas, enquanto se mantém a temperatura dereação em aproximadamente 13 - 15 °C. Agitar durante a noite. Concentrarsob pressão reduzida e dissolver o resíduo em 2 L de água gelada. Esfriar ofrasco em um banho de água gelada. Adicionar NaOH a 5 N para ajustar o pHpara 7,5 enquanto se mantém a reação temperatura abaixo de 30°C. Filtrar a-10 °C. Extrair o produto do filtrado com diclorometano (4x2 L). Remover osolvente sob pressão reduzida. Dissolver o sólido em 1,5 L de metanol emtemperatura ambiente e filtrar. Concentrar a solução de metanol, então, trocaro solvente por 2,0 L de tolueno, proporcionando produto puro. Filtrar paraobter (2,6-difluorofenil)-piperazin-l-il-metanona. Concentrar o filtrado efiltrar novamente para obter produto adicional (total de 400 g).
Carregar (2,6-difluoro-fenil)-piperazin-l-il-metanona (1,07equiv, 1,55 moles, 350,00 g), metanol (37,06 moles, 1,50 L,l,19 kg),trietilamina (1,79 moles, 250,00 mL, 181,50 g), 6-cloro-2- metil-3-nitro-piridina (1,00 equiv, 1,45 moles, 250,00 g) a um frasco de 5 L com agitadoroverhead. Agitar a mistura de reação em temperatura ambiente durante 0,5horas. Aquecer lentamente para 60 0C e continuar a agitar a 60 0C durante anoite. Adicionar água (750 mL) gota a gota enquanto se mantém atemperatura a 60 °C. Permitir que a mistura esfrie para a temperaturaambiente. Filtrar e lavar o bolo com 150 mL de metanol/água a 2:1, então,duas vezes com MTBE. Secar sob pressão reduzida a 45 0C para obter (2,6-difluoro-fenil)-[4-(6-metil-5-nitro-pirídin-2-il)- piperazin-1 -il]-metanonacomo um sólido amarelo (535 g).
Carregar (2,6-difluoro-fenil)-[4-(6-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-metanona (1,00 equiv, 1,44 moles, 520,00 g), metanol (197,66moles, 8,00 L, 6,33 kg) e Paládio sobre carbono a 5% umedecido com THF(75,00 g) a uma autoclave de três galões. Hidrogenar a reação a 50 psi emtemperatura ambiente enquanto se mantém a temperatura abaixo de 30 °C.
Após 0,5 horas, esfriar para 26 0C e manter durante 2 horas. Filtrar econcentrar sob pressão reduzida. Filtrar para obter sólidos, enxaguar commetanol então, heptanos. Uma filtração adicional proporciona um segundolote de [4-(5-amino-6-metil-piridin-2-il)-piperazin-1 -il]-(2,6-difluoro-fenil)-metanona. Secar sob pressão reduzida a 45 0C (445g).
Preparação 15
f4-(5-Amino-3-metil-piridin-2-il)-piperazin-l-iIl-(2,6-diflMoro-fenil)-metanona
Tratar uma pasta de 2-cloro-3-metil-5-nitro-piridina (27,00 g,0,156 moles) e terc-butil éster de ácido piperazina-l-carboxílico (32,03 g,0,172 moles) em DMF anídrica (270 mL) com K2CO3 (34,55 g, 0,250 moles),então, aquecer a mistura de reação a 80 0C sob N2 durante a noite. Entornar amistura de reação resultante em Et0Ac/H20 a 1/1 (3,000 mL), separar ascamadas, então, extrair a camada aquosa com EtOAc (1,000 mL). Lavar osorgânicos combinados com cloreto de sódio saturado aq. (3 X 1,000 mLcada), secar sobre MgS04, filtrar, então, concentrar sob pressão reduzida paraproporcionar um sólido amarelo. Transformar em pasta o sólido amarelo emhexanos/EtOAc, então, recuperar o sólido resultante através de filtração avácuo. Lavar com hexanos e filtrar a vácuo para proporcionar (42,84 g) deterc-butil éster de ácido 4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico como um sólido amarelo. Concentrar o filtrado sob pressãoreduzida para proporcionar um sólido amarelo. Transformar em pasta o sólidoamarelo em hexanos, então, recuperar o sólido resultante através de filtração avácuo, lavando com hexano e secando sob filtração a vácuo para proporcionarmais (5,38 g) de composto terc-butil éster de ácido 4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico como um sólido amarelo (48,22 g, rendimentode 95,9%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,96 (d, 1H), 8,14 (d, 1H), 3,57 (m,4H), 3,41 (m, 4H), 2,36 (s, 3H), 1,48 (s, 9H); TOF-MS [ES+, M+H] Obs. m/z323,1723, Cale. m/z 323,1719; Anal. Cale. para C15H22N4O4: C 55,88; H 6,87;N 17,37. Encontrado: C 55,94; H 6,87; N 17,14.
Adicionar uma solução de HCl a 4M em dioxano (4 equiv) auma solução de terc-butil éster de ácido 4-(3-Metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (7,77 g, 24,13 mmoles) em DCM (73 mL). Agitar amistura em temperatura ambiente durante a noite. Adicionar mais 2 equiv, doHCl em solução de dioxano. Após nenhum material de iniciação ser detectadoatravés de LCMS, filtrar o sólido e secar sob pressão reduzida para obter 6,91g de hidrocloreto de l-(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina como umsólido amarelado (rendimento de 97%). ES+ (m/z): 259 [M+l].
Adicionar trietilamina gota a gota (3 equiv) a uma suspensãode hidrocloreto de l-(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazina (6,91 g, 24,13mmoles) em DCM (120 mL). Adicionar cloreto de 2,6-difluorobenzoíla (1equiv.). Agitar a mistura em temperatura ambiente durante a noite. Adicionarmais cloreto de 2,6-difluorobenzoíla (1,6 mL) e trietilamina (1,5 equiv.) paralevar a reação ao término. Permitir que a reação descanse durante a noite.Diluir com DCM e extrair várias vezes com água. Secar a camada orgânicasobre Na2S2O4, filtrar e remover o solvente sob pressão reduzida. Lavar osólido várias vezes com hexano para obter 8,08 g de (2,6- difluoro-fenil)-4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-metanona (rendimento de 93%).
ES+ (m/z): 363 [M+l].
Adicionar Na2S2O4 (10 equiv.) e amônia aquosa (3mL/mmoles, 32 %) a uma solução de (2,6-difiuoro-fenil)-[4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-metanona (3 g, 8,29 mmoles) em THF/H20 (166mL, 1:1). Agitar durante 30 min., então, separar as camadas. Extrair a camadaaquosa com DCM, EtOAc e álcool isopropílico/EtOAc. Combinar as camadasorgânicas e secar sobre Na2SO^ filtrar e remover o solvente sob pressãoreduzida. Submeter o bruto a uma coluna Varian™ SCX e lavar a coluna comMeOH e, então, submeter o produto a fluxo com NH3 a 2 M em MeOH paraobter 1,2 g de [4-(5-amino-3-metil-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-(2,6- difluoro-fenil)-metanona (rendimento de 44 %). ES+ (m/z): 333 [M+l].
Preparação 16
terc-butil éster de ácido 4-(5-Amino-6-metil-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico
<formula>formula see original document page 31</formula>
Adicionar azodicarboxilato de diisopropila (3,0 mL, 15,5mmoles) gota a gota a uma mistura gelada de 6-metil-5-nitro-piridin-2-ol(1,54 g, 10,0 mmoles), terc-butil éster de ácido 4-hidróxi-piperidina-l-carboxílico (2,05 g, 10,0 mmoles) e trifenilfosfina (4,02 g, 15,3 mmoles) emTHF (25 mL) a 0 °C. Após a adição estar completa, remover o banho deresfriamento e agitar a mistura de reação a 22°C durante a noite. Concentrarsob pressão reduzida. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica geleluindo com hexanos e acetato de etila para proporcionar terc-butil éster deácido 4-(6-Metil-5-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico como umóleo incolor (2,69 g, rendimento de 80%). MS(ES): m/z = 338,2 [M+H].
Agitar uma mistura de terc-butil éster de ácido 4-(6-metil-5-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico (2,69 g, 8,0 mmoles) e paládiosobre carbono a 10% (1,0 g) em etanol (60 mL) a 22 °C sob hidrogêniodurante 2 horas. Filtrar o catalisador de paládio. Concentrar o filtrado paraproporcionar um óleo incolor. Submeter o resíduo à cromatografia em sílicagel eluindo com hexanos e acetato de etila para proporcionar o composto dotítulo. (2,19 g, rendimento de 89%). MS(ES): m/z = 308,2 [M+H].
Preparar o composto a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
Tabela
<table>table see original document page 32</column></row><table>
Preparação 18
terc-butil éster de ácido 4-(5-Amino-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico
Adicionar uma suspensão de NaH pré-lavado (0,1 g, 2,48mmoles, dispersão a 60% em óleo mineral) em THF (2 mL) a uma soluçãogelada de terc-butil éster de ácido 4-hidróxi-piperidina-l-carboxílico (0,5 g,2,48 mmoles) em secar THF (3mL). Permitir que mistura to agitar durante 20minutes, então, adicionar 2-cloro-5-nitro-piridina (0,36 g, 2,26 mmoles) aospoucos. Após adição estar completa, remover o banho de resfriamento e agitara mistura de reação a 22 0C durante a noite. Esfriar a mistura de reação comum banho de gelo e adicionar uma solução aq. saturada de bicarbonato desódio (5 mL). Distribuir a mistura de reação entre acetato de etila (25 mL) eágua destilada (25 mL). Isolar a fase aquosa e extrair com acetato de etila (3 χ35 mL). Secar as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio econcentrar sob pressão reduzida. Submeter o resíduo à cromatografia emsílica gel eluindo com hexanos e acetato de etila para proporcionar terc-butiléster de ácido 4-(5-Nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico como umsólido branco (0,55 g, rendimento de 75%). MS(ES): m/z = 324,2 [M+H].
Agitar uma mistura de terc-butil éster de ácido 4-(5-Nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico (2,7 g, 8,35 mmoles) e paládio sobrecarbono a 10% (0,5 g) em etanol (100 mL) em temperatura ambiente sobhidrogênio durante 4 horas. Filtrar para remover o catalisador de paládio.Concentrar o filtrado e submeter o óleo incolor resultante à cromatografia emsílica gel eluindo com hexanos e acetato de etila para proporcionar ocomposto do título como um sólido branco (2,11 g, 86% (ES+ (m/z) 194,2[M+H-BOC]).
Preparação 19
f4-(5-Amino-3-metil-piridin-2-ilóxi)-piperidin-l-ill-(2-fluoro-fenil)-metanona
<formula>formula see original document page 33</formula>
mmoles, dispersão a 60% em óleo mineral) em THF (20 mL) a uma soluçãogelada de terc-butil éster de ácido 4-hidróxi-piperidina-l-carboxílico (6,41 g,31,87 mmoles) em THF seco (80 mL). Permitir que a mistura agite durante 20minutos, então, adicionar 2-cloro-3-metil-5-nitro piridina (5 g, 28,97 mmoles)aos poucos. Após adição estar completa, remover o banho de resfriamento eagitar a mistura de reação a 22 0C durante a noite. Esfriar a mistura de reaçãocom um banho de gelo e adicionar uma solução de bicarbonato de sódio aq.saturado (50 mL). Distribuir a mistura de reação entre acetato de etila (350mL) e água destilada (150 mL). Isolar a fase aquosa e extrair com acetato deetila (1 χ 100 mL). Combinar as camadas orgânicas e lavar com soluçãosaturada aq. de cloreto de sódio (2 χ 150 mL). Secar as fases orgânicascombinadas sobre sulfato de sódio e concentrar. Submeter o resíduo àcromatografia em sílica gel eluindo com hexanos e acetato de etila paraproporcionar terc-butil éster de ácido 4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico como um sólido branco (6,5 g, rendimento de 67%).MS(ES): m/z = 360,3 [M+Na].
Adicionar ácido trifluoroacético (150 mL) a uma solução
gelada de terc-butil éster de ácido 4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico (10,12 g, 30 mmoles) em diclorometano (450 mL).
Adicionar uma suspensão de NaH pré-lavado (1,27 g, 31,87Agitar a mistura de reação a 22 0C durante 60 min. Após remoção dosolvente, tratar o resíduo com hidróxido de sódio a 1 N (150 mL) e extraircom diclorometano e acetato de etila. Secar as fases orgânicas combinadassobre sulfato de sódio. Remoção do solvente proporciona 3-metil-5-nitro-2-(piperidin-4-ilóxi)-piridina como um sólido amarelo (6,9 g, rendimento de
97%). MS(ES): m/z = 238,2 [M+H].
Adicionar cloreto de 2-fluoro-benzoíla (1,74 g, 11,0 mmoles)gota a gota a uma solução de 3-metil-5-nitro-2-(piperidin-4-ilóxi)-piridina emdiclorometano (50 mL) e trietilamina (1,21 g, 12 mmoles) e agitar sob N2 emtemperatura ambiente durante 2 horas. Lavar a mistura de reação com águadestilada (3 χ 20 mL), seguido por solução saturada aq. de cloreto de sódio (1χ 20 mL). Secar a fase orgânica sobre sulfato de sódio e concentrar paraproporcionar (2-fluoro-fenil)-[4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidin-1 -il]-metanona como um sólido amarelo.
Agitar uma mistura de (2-fluoro-fenil)-4-(3-metil-5-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidin-l-il]- metanona (3,58g, 10 mmoles) e paládio sobrecarbono a 10% (358 mg) em etanol (100 mL) a 22 0C sob hidrogênio durantea noite. Filtrar para remover o catalisador. Concentrar o filtrado paraproporcionar um óleo incolor. Submeter o óleo à cromatografia em sílica geleluindo com hexanos e acetato de etila (1:1), seguido por acetato deetila/hexanos a 70% para proporcionar um sólido amarelo (2,27 g, rendimentode 50%). MS(ES): m/z = 330,2 [M+H].Preparação 20
Terc-butil éster de ácido 4-(4-Amino-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico
Adicionar 100 mL de tolueno a uma mistura purgada comnitrogênio de 2-cloro-4-nitro-piridina (4,32 g, 27,2 mmoles), 4-hidróxi-piperidina carboxilato de terc-butila (11,0 g, 54,5 mmoles), carbonato decésio (13,3 g, 40,8 mmoles), acetato de paládio (122 mg, 0,544 mmoles) e 2-(di-íerc-butilfosfino)-1,1'-binaftila (271 mg, 0,68 mmoles). Agitar a misturaresultante durante a noite em temperatura ambiente, então, dividir entre águae acetato de etila. Extrair a camada aquosa com mais acetato de etila e secar acamada orgânica combinada sobre sulfato de sódio e concentrar sob pressãoreduzida. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com umgradiente de acetato de etila em hexanos a 0 a 20% para proporcionar terc-butil éster de ácido 4-(4-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina- 1-carboxílico comoum sólido ceroso branco (5,37 g, 61%; LCMS ES+ {m/z) 268 [M-tBu]+).
Submeter uma pasta de terc-butil éster de ácido 4-(4-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina-1-carboxílico (3,0 g, 9,28 mmoles) e Pd/C a 5%(151 mg) em EtOAc (150 mL) a uma atmosfera de hidrogênio a 60 psi(agitador de Parr) durante a noite em temperatura ambiente. Filtrar a misturade reação através de uma almofada de Celite® e concentrar sob pressãoreduzida para proporcionar o composto do título como um sólido branco (2,6g, rendimento de 95%). LCMS ES+ {m/z) 294 [M+H].
Preparação 21
f4-(4-Amino-piridin-2-ilóxi)piperidin-l-iIl-(2,6-difluoro-fenil)-metanona
Adicionar 2-Cloro-4-nitropiridina, 3 g (18,9 mmoles), terc-butil éster de ácido 4-hidróxi-piperidina-1-carboxílico, 7,6g (37,8 mmoles),[l,r']binaftalenil-2-il-di-férc-butil-fosfano, 188 mg (0,47 mmoles), acetato depaládio, 85 mg (0,38 mmoles) e carbonato de césio, 9,2 g (28,4 mmoles) a umfrasco de 500 mL e purgar com N2 durante 10 min. Então, adicionar toluenoseco (500 mL) e agitar em temperatura ambiente sob atmosfera de N2 durantea noite. Dividir a reação entre água e EtOAc (500 mL cada). Separar acamada orgânica. Secar sobre MgS04, filtrar e evaporar os solventes.
Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com uma mistura deEtOAciHexanos em um gradiente de EtOAc a 5 a 20% em 10 volumes decoluna para obter 1,2 g (rendimento de 34%) de composto do título, terc-butiléster de ácido 4-(4-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina-1-carboxílico, como umsólido branco (ES+ (m/z) = 324 [M+H].
Adicionar 8 mL de uma solução a 4 M de HCl em Et2O a 1,2 gde terc-butil éster de ácido 4-(4-Nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílicoe agitar a suspensão durante 4 horas. Evaporar o solvente e triturar o sólidorestante com Et2O para proporcionar 1,1 g de dihidrocloreto de 4-nitro-2-(piperidin-4-ilóxi)-piridina como um sólido amarelo claro (rendimento de100%) (ES+ (m/z) = 224 [M+H].
Adicionar trietilamina (2,57 mL, 18,5 mmoles) a umasuspensão de 1,1 g (3,7 mmoles) de dihidrocloreto de 4-nitro-2-(piperidin-4-ilóxi)-piridina em diclorometano seco (50 mL). Então, adicionar cloreto de2,6-difluorobenzoíla, 0,512 mL (4,07 mmoles). Agitar a mistura emtemperatura ambiente durante a noite. Adicionar água (50 mL) e separar acamada orgânica. Secar com MgSÜ4 e filtrar. Evaporar os solventes paraobter 1,22 g (rendimento de 91%) de (2,6-difiuoro-fenil)-[4-(4-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidin-l-il]-metanona como um sólido amarelo (ES+ (m/z) - 364[M+H].
Adicionar ferro em pó (419 mg, 7,5 mmoles) a uma solução de1,1 g (3,0 mmoles) de (2,6-difluoro-fenil)- [4-(4-nitro-piridin-2-ilóxi)-piperidin-l-il]-metanona, em glacial ácido acético (10 mL) e agitar a 80 °C.
Após 15 min, permitir que a mistura atinja a temperatura ambiente e filtraratravés de Celite®. Lavar a almofada de Celite® com Et2O e EtOAc. Lavar acamada orgânica resultante com água, uma solução saturada aquosa NaHCOae uma solução saturada aquosa de cloreto de sódio. Separar a camadaorgânica, secar sobre MgSO4 e evaporar os solventes para proporcionar 831mg (rendimento de 83%) do composto do título como um sólido branco. (ES+(m/z) = 334 [M+H].
Preparação 22
terc-butil éster de ácido 4-(5-Amino-piridin-2-ilamino)-piperidina-l-carboxílico<formula>formula see original document page 37</formula>
Dissolver N-Boc-4-aminopiperidina (0,9 g, 4,8 mmoles) emetanol seco e adicionar carbonato de sódio seco (0,8 g, 7,9 mmoles) a 0 °C,seguido por 2-cloro-5-nitro-piridina (0,6 g, 3,9 mmoles). Agitar a solução emtemperatura ambiente durante a noite, então, aquecer a solução a 9 0C durante6 horas. Agitar em temperatura ambiente durante a noite. Evaporar o solventesob pressão reduzida e dividir a mistura bruta entre EtOH e água. Extrair comEtOAc e lavar a camada orgânica com solução saturada aq. de cloreto desódio. Combinar as camadas orgânicas e secar sobre MgSO^ filtrar e evaporaro solvente de forma a obter terc-butil éster de ácido 4-(5-Nitro-piridin-2-ilamino)-piperidina-1 -carboxílico.
Adicionar SnCl2-H2O (11,8 mmoles, 2,7 g) sobre uma soluçãode terc-butil éster de ácido 4-(5-nitro-piridin-2-ilamino)-piperidina-l-carboxílico (2,4 mmoles, 0,8 g) em 20 mL de acetato de etila. Agitar asolução em temperatura ambiente durante a noite. Adicionar solução aquosade NaHCOs até que o pH da solução esteja básico e extrair com acetato deetila. Filtrar a suspensão através de uma almofada de Celite®. Combinar ascamadas orgânicas e lavar com cloreto de sódio saturado aq., secar sobresulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para proporcionar ocomposto do título. MS(ES): m/z = 293 [M+H].
Preparação 23
1-metilciclohexano carboxilato de metila
Tratar uma solução de ácido 1-metilciclohexano carboxílico(7,11 g, 50,0 mmoles) em MeOH (10 mL) e Et2O (40 mL) gota a gota comtrimetil-silildiazometano (2,0 M/hexanos; 26 mL, 52 mmoles). Agitar amistura de reação em temperatura ambiente durante a noite, então, concentrarsob pressão reduzida para proporcionar o composto do título como um óleoamarelo claro transparente (7,811 g, 50 mmoles; 100%). MS(ES): m/z =156[Μ+Η].
Preparação 24
Benzil éster de ácido 3-hidróxi-2,2-dimetil-propiônico
<formula>formula see original document page 38</formula>
Adicionar hidróxido de potássio (486,7 mmoles, 32,1 g) sobreuma solução de ácido 2,3-diidróxi-2-metil-propiônico (423,2 mmoles, 50 g)em 300 mL de DMF. Agitar a solução durante 1 hora a 100 °C, então,adicionar brometo de benzila. Agitar a solução durante a noite. Esfriar amistura e diluir com acetato de etila. Lavar a camada orgânica com água.Lavar a camada aquosa com acetato de etila várias vezes. Combinar ascamadas orgânicas e secar sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sobpressão reduzida. 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ ppm: 7,36-7,32 (m, 5 H),5,1 (s, 2H), 3,5 (s, 2H), 1,21 (s, 6H).
Preparação 25
Etil éster de ácido 1-Fluorometil-ciclopropanocarboxílico
<formula>formula see original document page 38</formula>
Adicionar AgF ( 4,5 eq, 4,56 g) a uma solução de etil éster deácido 1-Fluoro-ciclobutanocarboxílico (1,6 g, 8 mmoles) em acetonitrila (22mL) e água (274 mL). Aquecer a mistura a 80 0C em um tubo vedado durantehoras enquanto se agita vigorosamente. Permitir que a mistura esfrie efiltrar através de Celite®. Remover o solvente sob pressão reduzida pararoporcionar o composto do título como um óleo (Ό.81 s. rendimento de 61 %)ácido 1-Trifluoro-metil-ciclopropano carboxílico
Adicionar uma solução de diazometano a 2M em hexanos(14,2 mL, 28,45 mmoles) a uma solução de ácido 1-trifluoro-metilciclopropano-l-carboxílico (3,65 g, 23,7 mmoles) em metanol-hexanos(2,5 mL-22,5 mL). Concentrar sob pressão reduzida e destilar o resíduo paraproporcionar o composto do título como um óleo amarelo (2,93 g, rendimentode 73%). MS(ES): m/z = 169,1 [M+H].
Preparação 27
3-Oxo-3-(l-trifluoro-metil-ciclopropil)-propionitrila
Adicionar uma solução de LDA a 2 M em THF (19,15 mL,38,3 mmoles) a uma solução de gelada de acetona seca de metil éster de ácido1-trifluoro-metil-ciclopropano-l-carboxílico (2,93 g, 17,4 mmoles) eacetonitrila (1,43 g mL, 34,8 mmoles) em THF (30 mL). Agitar a mistura dereação a -70 0C durante 1,5 horas e, então, deixar aquecer para 22 0C durante2 horas. Concentrar, adicionar hexanos e filtrar para proporcionar um sólidoamarelo. Lavar com hexanos e tratar com dietil éter (250 mL) então, HCl a 2N (150 mL). Extrair a camada aquosa com dietil éter (4 χ 100 mL). Secar asfases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio. Remoção do solventeproporciona 3-Oxo-3-(l-trifluoro-metil-ciclopropil)-propionitrila (2,99 g,rendimento de 97%). MS(ES-): m/z =176,1 [M+H].
Preparar o composto a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
Tabela
<table>table see original document page 39</column></row><table>
Preparação 30
5-(l-Metil-cicIopropil)-2-(6-metil-piridin-3-in-2H-pirazol-3-ilaminaAquecer uma mistura de 3-Oxo-3-(l-trifluoro-metil-
ciclopropil)-propionitrila (2,66 g, 15,0 mmoles), N-benzilideno-N'-(6-metil-piridin-3-il)-hidrazina (TL, 2002, 43, 2171-2173) (4,31 g, 15,0 mmoles) eácido p-tolil-sulfônico (14,29 g, 75,0 mmoles) em etanol (85 mL) a 90 0C emum tubo vedado durante 18 horas. Após remoção do solvente, submeter oresíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com metanol em diclorometanoa 0-5% para proporcionar um sólido marrom (2,29 g, rendimento de 54%).MS(ES+): m/z = 283,2 [M+H].
Preparação 31
5-Pentafluoroetil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina
<formula>formula see original document page 40</formula>
Aquecer uma mistura de 4,4,5,5,5-pentafluoro-3-oxo-pentanonitrila (4,0 g, 21,4 mmoles) e p-tolil-hidrazina (10 g, 64,1 mmoles) emetanol (20 mL) a 95 0C em um aparelho com tubo vedado durante 15 horas.Após esfriar para a temperatura ambiente, remover o solvente sob pressãoreduzida para proporcionar um sólido amarelo. Distribuir o sólido entrediclorometano (250 mL), água destilada (150 mL) e uma solução debicarbonato de sódio aq. saturado (50 mL). Isolar a fase aquosa e extrair comdiclorometano (100 mL). Secar as fases orgânicas combinadas sobre sulfatode sódio e concentrar para proporcionar um óleo dourado escuro. Submeter oóleo à cromatografia em sílica gel eluindo com acetato de etila e hexanos paraproporcionar um sólido marrom claro (3,24 g, rendimento de 52%).MS(ES+): m/z = 292,1 [M+H].
Preparar o composto a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
Tabela<table>table see original document page 41</column></row><table>
Preparação 34
2,2,2-tricloro-etil éster de ácido [5-(l-Metil-ciclopropil)-2-(6-metil-piridin-3-iD-2H-pirazoI-3-ill-carbâmico
<formula>formula see original document page 41</formula>
Adicionar uma solução de 2,2,2-tricloroetilcloroformiato (1,80g, 8,5 mmoles) em THF (10 mL) gota a gota a uma solução salina gelada de5-(l-trifluoro-metil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina (2,29 g, 8,1mmoles) e piridina (0,9 mL, 11 mmoles) em THF (30 mL) a -15 °C. Agitar a -15 °C durante 0,5 horas e, então, 22 °C durante 1 hora, então, distribuir amistura de reação entre diclorometano (50 mL) e uma solução de bicarbonatode sódio aq. saturado (50 mL). Isolar a fase aquosa e extrair duas vezes comdiclorometano (25 mL cada). Secar as fases orgânicas combinadas sobresulfato de sódio e concentrar. Submeter o resíduo à cromatografia em sílicagel eluindo com hexanos e acetato de etila para proporcionar um sólidobranco (2,46 g, rendimento de 66%). MS(ES+): m/z = 457,2 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
Tabela
<table>table see original document page 41</column></row><table>
Preparação 38
2,2,2-tricloro-etil éter de ácido 5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ill-carbâmico<formula>formula see original document page 42</formula>
Adicionar uma solução saturada de Na2CO3 (2,4 L) a umasolução de 5-ferc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina (400 g, 1,74 moles) emTHF (8 L) e esfriar a mistura para 0 °C. Então, adicionar gota a gotacloroformiato de 2,2,2-tricloroetila (406,77 g, 1,92 moles) e agitar a mistura a0 0C durante 2 horas. Extrair a mistura de reação com acetato de etila (3 χ 6,5L), secar sobre sulfato de magnésio anídrico e concentrar. Dissolver o sólidoem uma quantidade mínima de acetato de etila e adicionar um excesso dehexanos para precipitar. Coletar o sólido através de filtração e secar para obtero composto do título como um sólido acinzentado (586 g, rendimento de83%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,34 (d, 2H), 7,29 (d, 2H), 6,78 (bs,1H), 6,41 (bs, 1H), 4,81 (s, 2H), 2,41 (s, 3H), 1,34 (s, 9H). MS(ES+): m/z =406,1 [M+H].
Preparação 39
2,2,2-tricIoroetil éster de ácido [5-(l-metil-ciclopropil)-2-p-tolil-2-2H-pirazol-3-ill-carbâmico
<formula>formula see original document page 42</formula>
Combinar diisopropilamida de lítio (LDA, 2,0 M/heptanos;Aldrich; 2,2 eq, 88 mmoles, 44 mL) com THF (1,5 mL/mmoles; 60 mL) eesfriar para -78 °C. Combinar 1-metilciclopropano carboxilato de metila (TCIUS; 4,56 g, 40 mmoles) e CH3CN (4,20 mL, 80 mmoles) em THF (10 mL) eadicionar lentamente com agitação. Agitar a mistura a -65 a -78 0C durante 1hora, então, remove o banho e aquecer a mistura para a temperatura ambiente.Concentrar a mistura de reação para uma pasta sob pressão reduzida.Adicionar hexanos (150 mL) para formar um precipitado a partir da pasta.Coletar o sólido através de filtração a vácuo e lavar com hexanos (2x50 mL).substituir o frasco de coleta por um limpo e dissolver o sólido sobre a frita em50 mL de HCl a 2,5 M e coletar no frasco. Enxaguar com 20 mL de HCl a 2,5M, seguido por 200 mL de Et2O. Separar as camadas no filtrado e extrair afase ácida com Et2O (150 mL). Combinar as fases orgânicas de Et2O, secarcom MgS04, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para proporcionar 3-(l-Metil-ciclopropil)-3-oxo-propionitrila como um óleo âmbar claro (3,58 g,29,1 mmoles, 73%). Usar sem purificação na reação com hidrocloreto de tolil-hidrazina (5,23 g, 33,0 mmoles) e etanol (2 mL/mmoles) em refluxo durante20 horas. Esfriar a mistura de reação para a temperatura ambiente econcentrar sob pressão reduzida. Diluir o resíduo com acetato de etila (250mL) e lavar com água (2 χ 60 mL), NaHCO3 aq. saturado (60 mL) e cloretode sódio saturado aq. (60 mL). Secar a fase orgânica com MgSO4, filtrar econcentrar através de evaporação giratória. Submeter o resíduo àcromatografia em sílica gel eluindo com um gradiente de acetato de etila ehexano para proporcionar 5-(l-metil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina (4,2238 g, 18,5 mmoles, 46%). LCMS (ES+): m/z = 228,2 [M+H].
Tratar uma solução gelada (0 0C) da 5-(l-metil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina (5,68 g, 25 mmoles) e piridina (2,2 mL, 27,5mmoles) em THF (3 mL/mmoles) com cloroformiato de 2,2,2-tricloroetila(3,7 mL, 27,5 mmoles). Manter a temperatura de reação a 0 0C e após 2 horas,adicionar pequenas porções de cloroformiato (0,3 mL) e piridina (0,2 mL).
Uma hora depois, diluir a reação com água (150 mL) e extrair com EtOAc (3χ 100 mL). Lavar as fases orgânicas combinadas com água (100 mL),NaHCO3 aq. saturado (50 mL) e cloreto de sódio saturado aq. (50 mL).Recristalizar o xarope bruto a partir de acetato de etila/hexanos paraproporcionar o composto do título como um sólido branco (8,18 g, 20,3mmoles; 81%). LCMS (ES+): m/z = 402,2/404,2 [M+H].
Alternativamente, adicionar gota a gota cloroformiato de2,2,2-tricloroetila (3,0 mL, 23 mmoles) a uma solução de 5-(l-metil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina (4,75 g, 21 mmoles) emtetraidrofurano (105 mL) e carbonato de sódio aquoso saturado (32 mL) a 00C. Agitar nessa temperatura durante 2 horas. Entornar a mistura em água eseparar as fases. Extrair a aquosa com acetato de etila.
Processamento A: Combinar a camada orgânicas e lavar comcloreto de sódio aquoso, secar sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sobpressão reduzida para proporcionar um sólido amarelo. Dissolver o sólido emuma quantidade mínima de acetato de etila e adicionar hexanos até turvaenquanto se agita. Cristalizar o composto do título e filtrar como um sólidobranco. 1H RMN (DMSO): 9,89 (br s, 1H), 7,31 (d, J = 8Hz, 2H), 7,23 (d, J -8Hz, 2H), 6,12 (s, 1H), 4,82 (s, 2H), 2,31 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 0,89 (q, J =4Hz, 2H), 0,71 (q, J = 4Hz, 2H).
Processamento B: Trocar o solvente de acetato de etila porálcool isopropílico (91,56 moles). Agitar a pasta a <0 0C durante 2 horas,filtrar, lavar com álcool isopropílico gelado (13,08 moles) e secar a 40 0C sobpressão reduzida durante a noite para proporcionar o composto do título,como um sólido cristalino branco.
Preparar o composto a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 44</column></row><table>
Preparação 41
2,2,2-tricloro-etil éster de ácido f5-(l-Fluorometil-ciclopropil)2H-pirazol-3-ill-carbâmicoPreparar uma solução de LDA a partir de diisopropilamina(1,7 mL, 2,2 eq, 12,1 mmoles) e n-BuLi (1,6 M em hexanos, 7,5 mL, 2,2 eq,12,1 mmoles), em THF 12 mL a -78 0C durante 30 min sob N2. Adicionar umasolução de etil éster de ácido 1-fluorometil-ciclopropanocarboxílico (0,81 g,5,5 mmoles) em 7 mL de THF. Agitar mistura e deixar aquecer de -78 0C paraa temperatura ambiente e continuar a agitação em temperatura ambientedurante 5 horas.
Adicionar 10 mL de uma solução saturada aquosa de NH4Cl.
Adicionar AcOEt e separar a camada orgânica, lavar com solução saturada aq.de cloreto de sódio. Secar sobre Na2SO4 e remover os solventes paraproporcionar um óleo marrom (0,42 g, rendimento de 54%). Dissolver o óleoem 10 mL de EtOH e adicionar p-tolil-hidrazina (0,47 g, 1 eq, 3 mmoles).
Aquecer a mistura em um tubo vedado a 90 0C durante a noite. Permitir que amistura esfrie e remover o solvente sob pressão reduzida para obter umresíduo. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo comhexano/AcOEt a 15-80 % para proporcionar 0,336 g de 5-(l-fluorometil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina como um óleo. MS (ES+): m/z -246,1 [M+H].
Lentamente adicionar CICO2Ch2CCI3 (1,00 equiv; 717,49[imoles; 152,01 mg) a uma solução de 5-(l-fluorometil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina (176 mg, 0,71 mmoles) e piridina em 4 mL de THF sobnitrogênio a 0 °C. Agitar a mistura de 0 0C para a temperatura ambientedurante 5 horas. Filtrar o insolúvel e remover o solvente do filtrado sobpressão reduzida para proporcionar um óleo. Submeter o óleo à cromatografia(hex/AcOEt a 20-80%) para proporcionar 110 mg do composto do títulocomo um óleo amarelo. MS (ES+): m/z = 420,0 [M+H].
Preparação 42
2,2,2-tricloro-etil éster de ácido (2-p-tolil-5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-il)-carbâmicoColocar trimetil-silil-diazometano (2 M em THF) (25 mL, 50mmoles) em THF (50 mL). Esfriar a reação para -78 °C e adicionardiisopropilamida de lítio (2 M em THF) (25 mL, 50 mmoles) durante 30 min.Adicionar propiolato de metila (4,45 mL, 50 mmoles) e agitar a -78 °Cdurante 2 horas. Aquecer para a temperatura ambiente e agitar durante 18horas. Adicionar acetato de etila, água e HCl a 1 N. Separar a camadaorgânica e extrair a aquosa com acetato de etila (2 χ 25 mL). Combinar osextratos orgânicos, secar sobre Mg2SO4 filtrar e concentrar sob pressãoreduzida. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo comEtOAc:hexano a 0-60% para proporcionar 3,59 g (36%) de metil éster deácido 5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-carboxílico.
Colocar metil éster de ácido 5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-carboxílico (1,60 g, 8,07 mmoles) e ácido 4-metilfenil-l-borônico (1,64 g,12,1 mmoles) em CH2Cl2 (30 mL). Adicionar peneiras moleculares de 4 A(1,50 g), seguido por acetato de cobre (II) (1,61 g, 8,88 mmoles). Então,adicionar trietilamina (8 mL) e agitar em temperatura ambiente durante 2,5dias. Filtrar a reação através de uma almofada de Celite® e lavar com CH2Cl2.Coletar o filtrado e adicionar cloreto de amônio saturado aquoso. Separar acamada orgânica e extrair a camada aquosa com CH2Cl2 (2 χ 20 mL).Combinar os extratos orgânicos, secar sobre Mg2SO4 filtrar e concentrar sobpressão reduzida. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindocom EtOAcihexano a 0-30% para proporcionar 655 mg (29%) de metil ésterde ácido 2-p-tolil-5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-carboxílico. MS(ES+): m/z =289,3 [M+H]).
Colocar metil éster de ácido 2-p-tolil-5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-carboxílico (665 mg, 2,30 mmoles) em metanol (25 mL). AdicionarNaOH a 1 N (10 mL, 10 mmoles) e aquecer para 50 °C durante 4 horas.Esfriar para a temperatura ambiente e concentrar sob pressão reduzida.Adicionar solução de bicarbonato de sódio aq. saturado e CH2Cl2j separar acamada orgânica e extrair a camada aquosa com CH2Cl2 (2 χ 25 mL).
Combinar os extratos orgânicos, secar sobre Mg2SC^, filtrar e concentrar sobpressão reduzida para proporcionar 620 mg (98%) de ácido 2-p-tolil-5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-carboxílico. MS(ES+): m/z = 275,3 [M+H].
Colocar ácido 2-p-tolil-5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-carboxílico (620 mg, 2,26 mmoles) em terc- butanol (5 mL) e tolueno (5 mL).
Adicionar trietilamina (0,378 mL, 2,71 mmoles), seguido por azida de difenilfosforila (0,586 mL, 2,71 mmoles) e aquecer para 60 0C durante 1 hora.
Então, aquecer para 100 0C durante 19 horas. Concentrar a reação sob pressãoreduzida. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo comEtOAc:hexano a 0-30% para proporcionar 504 mg (65%) de terc-butil ésterde ácido (2-p-tolil-5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico. MS(ES+):m/z = 346,4 [M+H].
Colocar terc-butil éster de ácido (2-p-tolil-5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico (504 mg, 1,46 mmoles) em THF (10 mL).
Adicionar HCl a 4 M em dioxano (4 mL, 16 mmoles) e aquecer para 60 0Cdurante 3 horas. Esjfriar a reação para a temperatura ambiente e carregar sobreuma coluna Varian™ SCX. Lavar a coluna com MeOH e, então, submeter oproduto a fluxo com NH3 a 2 M em MeOH. Coletar o filtrado e concentrarsob pressão reduzida para proporcionar 175 mg (49%) de 2-p-tolil-5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-ilamina.
Colocar 2-p-tolil-5-trimetil-silanil-2H-pirazol-3-ilamina (170mg, 0,693 mmoles) em acetato de etila (10 mL). Adicionar carbonato depotássio (191 mg, 1,38 mmoles) e água (2 mL). Agitar a reação e adicionarcloroformiato de tricloroetila (0,114 mL, 0,831 mmoles). Agitar emtemperatura ambiente durante 18 horas. Adicionar água e acetato de etila.
Separar a camada orgânica e lavar com cloreto de sódio saturado aq. Coletar acamada orgânica, secar sobre Mg2SC^, filtrar e concentrar sob pressãoreduzida. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo comEtOAc:hexano a 0-30% para proporcionar 280 mg (96%) do composto dotítulo. MS(ES+): m/z = 420,2 [M+H].Preparação 43
2,2,2-tricloro-etil éster de ácido [5-(2-Fluoro-l-fluorometiI-l-metil-etiI)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ill-carbâmico
Adicionar H2SO4 (4,5 g) a uma suspensão de ácido 3-hidróxi-2-hidroximetil-2-metil-propiônico (100 g) em MeOH (1 L, solvente de grauHPLC) e agitar em temperatura ambiente durante o fim de semana(aproximadamente 70 h). Remover o solvente e dividir o resíduo entre EtOAc(1 L) e H2O (100 mL). Re-extrair a camada aquosa com EtOAc e secar ascamadas orgânicas combinadas sobre MgSO4. Filtrar e concentrar sob pressãoreduzida para proporcionar metil éster de ácido 3-hidróxi-2-hidroximetil-2-metil-propiônico. 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ ppm 3,9 (d, 2H, J = 1,1 Hz),3,76 (s, 3H), 3,71 (d, 2H, J = 1,1 Hz), 2,8 (bs, 2H), 1,1 (s, 3H).
Adicionar Tf2O (80 mL) gota a gota a uma solução gelada (-78°C) de metil éster de ácido 3-hidróxi-2-hidroximetil-2-metil-propiônico (32,5g) em CH2Cl2 (400 mL) e 2,6-lutidina (80 mL). A reação é deixada atingir atemperatura ambiente e agitar até que apenas pontos de produto sejamdetectados através de análise por TLC (aproximadamente 2 h). Diluir comCH2Cl2 (400 mL) e lavar com HCl (solução aquosa a 3%). Secar a camadaorgânica sobre MgSO4, filtrar e concentrar. Submeter o resíduo àcromatografia em sílica gel eluindo com hexanos / acetato de etila 5%, paraproporcionar metil éster de ácido 2-metil-2,3-bis-trifluorometano-sulfonilóxi-propiônico como um óleo incolor. 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ ppm 4,7 (d,2H, J = 10,3 Hz), 4,5 (d, 2H, J = 10,3 Hz), 3,8 (s, 3H), 1,4 (s, 3H).
Adicionar TBAF a 1 M (132 mmoles, 132 mL) sobre umasolução de metil éster de ácido 2-metil-2,3-bis-trifluorometano-sulfonilóxi-propiônico (65,9mmoles, 26,3 g) em 500 mL de THF anídrico esfriada para 0°C. Agitar durante a noite. Concentrar sob pressão reduzida e adicionarCH2Cl2, lavar a camada orgânica com cloreto de sódio saturado aq. Combinaras camadas orgânicas e secar sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sobpressão reduzida para proporcionar metil éster de ácido 3-fluoro-2-fluorometil-2-metil-propiônico. 1H RMN (CDCl3, 300 MHz): δ ppm: 4,7-4,4(m, 4H), 3,5 (s, 3H), 0,98 (t, 3H, J = 1,7Hz).
Adicionar LDA a 2,0 M (62,0 mmoles, 31 mL), seguido poracetonitrila anídrico (56,4 mmoles, 2,9 mL) sobre uma solução de metil ésterde ácido 3-fluoro-2-fluorometil-2-metil-propiônico (28,2 mmoles, 4,3 g) em100 mL de THF anídrico esfriada para -78 °C. Agitar durante duas horas a -78°C e deixar que a solução aqueça para a temperatura ambiente durante anoite. Concentrar sob pressão reduzida e adicionar CH2Cl2j lavar camadaorgânica com cloreto de sódio saturado aq. e HCl aq. a 10%. Combinar ascamadas orgânicas e secar sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sobpressão reduzida para proporcionar um resíduo. Agitar hidrocloreto de p-tolil-hidrazina (15,5 mmoles, 2,5 g) e o resíduo obtido (15,5 mmoles, 2,5g) em 31 mL de etanol a 90 0C durante a noite. Concentrar e dissolver oresíduo em água. Adicionar solução de hidróxido de sódio a 10% eextrair em acetato de etila. Combinar as camadas orgânicas e secar sobresulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida paraproporcionar a 5-(2-fluoro-l-fluorometil-l-metil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica geleluindo com hexanos / acetato de etila (de 15% para 50%). MS(ES+): m/z= 266 [M+H].
Adicionar cloroformiato de 2,2,2-tricloroetila (8,1 mmoles, 1,1mL) e solução aq. de carbonato de sódio (4,8 mL) sobre uma solução de 5-(2-fluoro-l-fluorometil-l-metil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ilamina (7,3 mmoles,1,9 g) em 37 mL de THF. Agitar durante 24 horas. Entornar a solução sobreágua e extrair em acetato de etila. Combinar as camadas orgânicas e lavarcom solução saturada aq. de cloreto de sódio. Secar sobre sulfato de sódio,filtrar e concentrar sob pressão reduzida para proporcionar o composto dotítulo. MS(ES+): m/z = 440 [M+H].
Preparar o composto a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 50</column></row><table>
Preparação 45
Terc-butil éster de ácido 4-(5-{3-í5-(l-Metil-ciclopropin-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ill-ureido}-piridin-2-il)-piperazina-l- carboxílico
<formula>formula see original document page 50</formula>
Aquecer uma solução de terc-butil éster de ácido 4-(5-amino-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (Preparação 4, 1,05 equiv, 0,5845 g),2,2,2-tricloroetil éster de ácido [5-(l-metil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-carbâmico (Preparação 39, 1,0 equiv, 0,8054 g) e diisopropiletilamina (2equiv, 0,7 mL) em DMSO (0,25 M, 8 mL) para 60 0C durante 6 horas. Esfriara mistura resultante para a temperatura ambiente e adicionar água (20 mL).
Extrair com EtOAc (2 χ 25 mL), então, lavar as fases orgânicas combinadascom água (10 mL) e solução saturada aq. de cloreto de sódio (10 mL). Secarsobre MgS04, então, submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindocom um gradiente de amônia-metanol a 2 M em diclorometano. LCMS(ES+):m/z = 532,3 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
Tabela<formula>formula see original document page 51</formula>
Preparação 49
Terc-butil éster de ácido 4-(5-[3-(5-terc-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-iD-ureidol-6-metil-piridin-2-iH-piperazina-l-carboxílico
Aquecer uma solução de terc-butil éster de ácido 4-(5-amino-6-metil-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (Preparação 3, 41,20 g, 140,9mmoles), 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido (5-fórc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico (Preparação 38, 57,03 g, 140,9 mmoles) e DIEA (36,8 mL,211,4 mmoles) em DMSO (500 mL) a 60-65 0C durante 2,5 horas. Adicionarmais DMSO (100 mL) durantes os últimos 30 min à pasta viscosa. Esfriar apasta para a temperatura ambiente e deixar descansar durante a noite.Adicionar dietil éter (600 mL) e agitar a pasta durante 1 hora em temperaturaambiente. Filtrar e lavar com dietil éter (5 χ 300 mL) então, secar ao ar paraproporcionar um sólido branco (68,70 g, rendimento de 89% não corrigidopara DMSO - contém aproximadamente 85 moles % de DMSO.LCMS(ES+): m/z = 548 [M+H].Preparação 50
l-f5-(l-Metil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ill-3-(2-metil-6-piperazin-l-il-piridin-3-iD-uréiaBorbulhar ácido clorídrico aquoso através de uma solução deterc-butil éster de ácido 4-(6-metil-5-{3-[5-(l-metil- ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-ureido}-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (admitindo 2,74mmoles) em acetato de etila:diclorometano a 1:1 (200 mL) durante 3 min paraassegurar saturação. Permitir que a mistura descanse durante 30 min, então,concentrar sob pressão reduzida para um sólido branco. Dissolver o sólido emMeOH e carregar sobre uma coluna 20 g Varian SCX, enxaguando com maisMeOH. Eluir a base livre com amônia a 2M em MeOH:diclorometano a 1:1.Concentrar a solução sob pressão reduzida para proporcionar um sólidobranco (1,21 g, 99% sobre 2 etapas). LCMS(ES+): m/z = 446 [M+H].
Preparar o composto a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 52</column></row><table>
Preparação 52
1-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia
Colocar terc-butil éster de ácido 4-(5-amino-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (200 mg, 0,718 mmoles), diisopropiletilamina (0,125mL, 0,718 mmoles) e 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido (5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico (Preparação 38, 291 mg, 0,718 mmoles) emDMSO (5 mL) e aquecer para 75 0C durante 17 horas. Esfriar para atemperatura ambiente e adicionar EtOAc e água. Separar a camada orgânica elavar com cloreto de sódio saturado aq. (2 χ 20 mL). Coletar a camadaorgânica, secar sobre Mg2SO4 filtrar e concentrar sob pressão reduzida.
Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo comEtOAcrhexanos a 0-70% para proporcionar 328 mg (85%) de terc-butil ésterde ácido 4- { 5 - [3 -(5 -terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3 -il)-ureido] -piridin-2-il} -piperazina-l-carboxílico. MS(ES+): m/z = 534,4 [M+H]).
Colocar terc-butil éster de ácido 4-{5-[3-(5-fórc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-ureido]-piridin-2-il}-piperazina-l-carboxílico (565 mg, 1,06mmoles) em THF (10 mL). Adicionar HCl a 4 M em dioxano (2,65 mL, 10,6mmoles) e aquecer para 60 0C durante 3 horas. Esfriar a reação para atemperatura ambiente e carregar sobre uma coluna Varian™ SCX. Lavar acoluna com MeOH e, então, submeter o produto a fluxo com NH3 a 2 M emMeOH. Coletar o filtrado e concentrar sob pressão reduzida para proporcionar411 mg (89%) do composto do título. MS(ES+): m/z = 434,2 [M+H])
Preparar os compostos a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 53</column></row><table>
Preparação 56
l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(2-metil-6-piperazin-l-il-Piridin-3-il)-uréia
Tratar uma solução a 22 0C de terc-butil éster de ácido 4-{5-[3-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-ureido]-6-metil-piridin-2-il}-piperazina-l-carboxílico (Preparação 49: 63,20 g, 115,4 mmoles) em MeOH(600 mL) com HCl (solução a 4 N em dioxano, 300 mL, 1200 mmoles).Agitar a mistura durante 4 horas então, concentrar sob pressão reduzida(temperatura ambiente, aproximadamente 10 torr, 3 dias) para proporcionardihidrocloreto de 1 -(5-fórc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(2-metil-6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia como um pó acinzentado (62,2 g - contémaproximadamente 45 moles % de dioxano. LCMS(ES+): m/z = 448 [M+H].Carregar uma solução de dihidrocloreto de l-(5-fórc-butil-2-p-tolil-2H^irazol-3-il)-3-(2-metil-6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia (10 g, 19,2mmoles) em MeOH sobre uma coluna Varian SCX de 70 g, enxaguando comMeOH (aproximadamente 300 mL). Eluir a base livre com amônia a 2M emMeOH:diclorometano a 1:1 (150 mL). Concentrar sob pressão reduzida paraproporcionar um sólido branco (6,24 g). LCMS(ES+): m/z = 448 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 54</column></row><table>
Preparação 59
l-(5-terc-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-iI)-3-[2-metiÍ-6-(piperidin-4-ilóxi)-piridin-3-il1 -uréia
<formula>formula see original document page 54</formula>
Borbulhar gás nitrogênio através de uma solução de 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido l-5-férc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico (Preparação 38, 608 mg, 1,5 mmoles) e terc-butil éster de ácido 4-(5-amino-6-metil-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico (453 mg, 1,5 mmoles) emDMSO (3 mL) durante 5 min. Em seguida, adicionar N,N-diisopropiletilamina (500 μΐί, 3,0 mmoles). Agitar a 60 0C durante a noite,então, distribuir a mistura de reação entre acetato de etila (25 mL) e soluçãode bicarbonato de sódio aq. saturado (50 mL). Isolar a fase aquosa e extrairduas vezes com acetato de etila (25 mL cada). Secar as fases orgânicascombinadas sobre sulfato de sódio e concentrar. Submeter o resíduo àcromatografia em sílica gel eluindo com hexanos e acetato de etila paraproporcionar terc-butil éster de ácido 4-{5-[3-(5-fórc-butil-2-p- tolil-2H-pirazol-3-il)-ureido]-6-metil-piridin-2-ilóxi}-piperidina-l-carboxílico comoum sólido marrom (746 mg, rendimento de 88%). MS(ES+): m/z = 563,3[M+H].
Adicionar ácido trífluoroacético (10 mL) a uma solução geladade terc-butil éster de ácido 4-{5-[3-(5-terobutil-2-p- tolil-2H-pirazol-3-il)-ureido]-6-metil-piridin-2-ilóxi}-piperidina-l-carboxílico (746 mg, 1,33mmoles) em diclorometano (20 mL). Agitar a mistura de reação a 22 0Cdurante 25 min. Após remoção do solvente, tratar o resíduo com hidróxido desódio a 1 N (20 mL) e extrair três vezes com diclorometano (20 mL cada).
Secar as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio.Remoção do solvente proporciona um sólido branco (605 mg, rendimento de98%). MS(ES+): m/z = 463,2 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela<table>table see original document page 55</column></row><table>Preparação 68
Hidrocloreto de l-í5-(2-Fluoro-l-fluorometil-l-metil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ill-3-(2-metil-6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia
Adicionar 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido [5-(2-fluoro-l-fluorometil-l-metil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-carbâmico (2,7 mmoles,1,2 g) e DIEA (2,9 mmoles, 0,5 mL) sobre uma solução de terc-butil éster deácido 4-(5-amino-6- metil-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (2,9 mmoles,0,9 g) em 4 mL de DMSO e agitar a 85 0C durante a noite. Esfriar, adicionarágua e extrair com CH2CI2. Combinar as camadas orgânicas e lavar comsolução saturada aq. de cloreto de sódio. Secar sobre sulfato de sódio, filtrar econcentrar sob pressão reduzida para proporcionar terc-butil éster de ácido 4-(5- {3-[5-(2-fluoro-1 -fluorometil-1 -metil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-ureido}-6-metil-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico. Submeter o resíduo àcromatografia em sílica gel eluindo com hexanos / acetato de etila emgradiente (de 10 para 50%). MS(ES+): m/z =584 [M+H]).
Agitar terc-butil éster de ácido 4-(5-{3-[5-(2-fluoro-l-fluorometil-l-metil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-ureido}-6-metil-piridin-2-il)-piperazina-l-carboxílico (1,5 mmoles, 0,9 g). Dissolver em 5 mL deCH2CI2 e cloreto de hidrogênio a 4,0 M em dioxano (7,35 mmoles, 1,8 mL)em temperatura ambiente durante a noite. Concentrar, então, triturar o sólidobranco formado com dietil éter. MS(ES+): m/z = 484 [M+H])
Preparar o composto a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 56</column></row><table>piridin-3-ill-uréia
Adicionar 2,2,2-tricloroetil éster de ácido (5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico (Preparação 38, 2,0 mmoles, 0,8 g) sobreuma solução de terc-butil éster de ácido 4-(5-amino-piridin-2-ilamino)-piperidina-l-carboxílico (2,0 mmoles, 0,6 g) e carbonato de potássio (2,20mmoles, 0,3 g) em acetonitrila (25 mL). Agitar a solução durante 12 horas emtemperatura ambiente. Adicionar água e extrair com CH2Cl2. Combinar ascamadas orgânicas e lavar com cloreto de sódio saturado aq., secar sobresulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para proporcionarum resíduo. Submeter o resíduo à cromatografia em sílica gel eluindo comCH2Cl2: MeOH em gradiente (de 0,5 a 20%) para proporcionar terc-butil ésterde ácido 4- {5- [3 -(5 -ferc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3 -il)-ureido] -piridin-2-ilamino}-piperidina-l-carboxílico. MS(ES+): m/z = 548 [M+H])
Tratar uma solução a 22 0C de terc-butil éster de ácido 4-{5-[3-(5-fórc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-ureido]-piridin-2-ilamino}-piperidina-l-carboxílico (1,1 mmoles, 0,6 g) em Et2O (5 mL) com HCl(solução a 2,0 M em dietil éter, 5 mL, 10 mmoles). Agitar a solução durante anoite em temperatura ambiente. Concentrar sob pressão reduzida paraproporcionar um resíduo, então, submeter o resíduo a um cartucho SCXeluindo com amônia a 2,0 N em metanol. Obter o composto do título como abase livre. MS(ES): m/z = 488 [M+H].Preparação 71
l-(5-terc-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-f2-(piperidin-4-ilóxi)-piridin-4-ill-uréia
<formula>formula see original document page 57</formula>
Aquecer uma solução de terc-butil éster de ácido 4-(4-amino-piridin-2-ilóxi)-piperidina-l-carboxílico (Preparação 20, 1 g, 3,41 mmoles),2,2,2-tricloro-etil éster de ácido (5-férc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico (Preparação 38, 1,38 g, 3,41 mmoles) e diisopropiletilamina (1,2mL, 6,82 mmoles) em DMSO (15 mL) a 60 0C durante 5 d. Esfriar a misturaresultante para a temperatura ambiente e dividir entre água e acetato de etilausando solução saturada aq. de cloreto de sódio para auxiliar na separação defase. Extrair a camada aquosa com acetato de etila, lavar as camadasorgânicas combinadas duas vezes com água, secar sobre sulfato de sódio econcentrar sob pressão reduzida. Submeter o resíduo à cromatografia emsílica gel eluindo com um gradiente de acetato de etila em diclorometano paraproporcionar 877 mg (rendimento de 43 %) de terc-butil éster de ácido 4-{4-[3-(5-terc-butil-2-p4olil-2H-pirazol-3-il)-ureido]-piridin-2-ilóxi}-piperidina-1-carboxílico. LCMS ES+ (m/z) 549 [M+H].
Tratar uma solução de terc-butil éster de ácido 4-{4-[3-(5-te7-?-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-ureido]-piridin-2-ilóxi} -piperidina-1 -carboxílico (877 mg, 1,6 mmoles) em EtOAc:DCM a 1:1 (100 mL) com umacorrente borbulhante de HCl (g) durante 3 min. Permitir que a misturaresultante descanse durante 30 min, então, concentrar sob pressão reduzida.
Dissolver o resíduo em MeOH e carregar sobre uma coluna Varian SCX de20 g, enxaguando bem com MeOH. Eluir a base livre com DCM:amônia a 2M em MeOH a 1: 1. Concentrar a solução sob pressão reduzida paraproporcionar o composto do título em um rendimento quantitativo. LCMSES+ (m/z) 449 [M+H].
Preparar o composto a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
Tabela
<table>table see original document page 58</column></row><table>
EXEMPLO 1l-{6-[4-(2,2-Dimetil-pentanoil)-piperazin-l-il]-piridin-3-il}-3-[5-d-metil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H- pirazol-3-il]-uréia
<formula>formula see original document page 59</formula>
Tratar uma solução ou transformar em pasta a l-[5-(l-metil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-3-(6-piperazin-l-il-piridin-3-il]-uréia(Preparação 5, 1 equiv., 0,1510 g), ácido 2,2-dimetil pentanóico (1,15 equiv.,0,0521 g) e DMAP catalítico (aproximadamente 0,1 equiv., 0,049 g) emdiclorometano (aproximadamente 0,1 M, 5 mL) com hidrocloreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDCI, 15 equiv., 0,0767 g). Agitara mistura resultante em temperatura ambiente durante 48 horas então, lavarcom solução de bicarbonato de sódio aq. saturado. Secar a camada orgânicasobre sulfato de sódio e concentrar sob pressão reduzida. Purificação A:Purificar sobre sílica gel usando um gradiente de amônia a 2 M-metanol emdiclorometano, um gradiente de acetato de etila em diclorometano ouhexanos. Purificação B: Purificar através de fase reversa sobre uma colunaXterra 30 χ 75 mm 5 mícrons MS Cl8 usando um gradiente de bicarbonato deamônio aquoso a 10 mM em acetonitrila para proporcionar o composto dotítulo. LCMS (ES+): m/z = 544, [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 59</column></row><table>EXEMPLO 4
Metano-sulfonato de l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-in-3-(6-[4-(2,2-dimetil-propionil)-piperazin-l-ill-2-metil- piridin-3-il}-uréia
Tratar uma mistura de l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(2-metil-6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia (Preparação 56, 157 mg, 0,35mmoles), ácido trimetilacético (54 mg, 0,53 mmoles) e DMAP catalítico (4mg) em diclorometano (3,5 ml) com hidrocloreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDCI; 101 mg, 0,53 mmoles).Agitar a mistura resultante em temperatura ambiente durante a noite então,lavar com solução de bicarbonato de sódio aq. saturado. Secar a camadaorgânica sobre sulfato de sódio e concentrar sob pressão reduzida. Submeter oresíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com um gradiente de amônia a 2M-metanol em diclorometano para proporcionar o composto do título como abase livre. LCMS(ES+): m/z = 532 [M+H].
Tratar uma solução ou transformar em pasta a amina livre emdiclorometano (5 mL) com ácido metano sulfônico a 2 M em diclorometano(1 equiv.; 0,155 mL). Agitar a mistura resultante, concentrar sob uma correntede nitrogênio e secar sob pressão reduzida para proporcionar o sal.
Preparar os compostos a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>
EXEMPLO 46
l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-{6-[4-(2,6-difluoro-benzoil)-piperazin-l-il]-piridin-3-il}-uréia
Colocar l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia (48 mg, 0,111 mmoles), ácido 2,6-difluorobenzóico (21 mg, 0,133 mmoles) e 4-N,N-dimetilaminopiridina (3mg, 0,022 mmoles) em acetonitrila (5 mL). Adicionar hexafluorofosfato de0-(7-azabenzotriazol-1 -il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HATU) (50 mg, 0,133mmoles) e aquecer para 70 0C durante 19 horas. Esfriar para a temperaturaambiente e adicionar CH2Cl2 e água. Separar a camada orgânica e extrair aaquosa com CH2Cl2 (2 χ 25 mL). Combinar os orgânicos, secar sobreMg2SO4, filtrar e concentrar sob pressão reduzida. Submeter o resíduo àcromatografia em sílica gel eluindo com EtOAc:hexano a 0-60% paraproporcionar o composto do título. LCMS(ES): m/z = 574,2 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
Tabela
<table>table see original document page 64</column></row><table>
EXEMPLO 50
l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(6-[4-(2,2-dimetil-propionin-piperazin-l-il-piridill-3-il}-uréia
Colocar 1 -(5-fórc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia (200 mg, 0,461 mmoles), trietilamina (0,071mL, 0,507 mmoles) e 4-N,N-dimetilaminopiridina (6 mg, 0,051 mmoles) emCH2Cl2 (10 mL). Adicionar cloreto de 2,2-dimetil-propionila (0,062 mL,0,507 mmoles) e agitar em temperatura ambiente durante 17 h. Submeter oresíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com EtOAc:hexano a 0-100%para proporcionar 175 mg (73%) do composto do título. MS(ES+): m/z =518,2 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
<table>table see original document page 64</column></row><table>
EXEMPLO 53
l-(5-terc-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-in-3-í6-í4-(3-metil-pentanoil)-64piperazin-l-ill-piridin-3-il}-uréia
Reagir 1 -(5-fôrc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(6-
piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia (0,20 g, 0,46 mmoles) com ácido 3-metil-pentanóico (0,059 g, 0,51 mmoles), hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (0,06 g,5 0,46 mmoles) e carbodiimida suportada em polímero (0,83 g, 1,0 mmoles),suspender em uma mistura de CH2C12/DMF (18/1, mL). Agitar a mistura emtemperatura ambiente durante a noite e, então, filtrar e lavar a resina comCH2Cl2. Concentrar e purificar o resíduo com um cartucho SCX eluindo comNH4OH/CH3OH a 2N para proporcionar 135 mg (55%) do composto do títulocomo um sólido rosa claro. MS(ES+): m/z = 532 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
<table>table see original document page 65</column></row><table>
EXEMPLO 61
l-(5-terc-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-í6-[4-(2,6-difluoro-benzoil)-piperazin-l-ill-5-metil-piridin-3-iH-uréia
Colocar l-(5-fórc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(5-metil-6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia (300 mg, 0,670 mmoles), hidrocloreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (154 mg, 0,804 mmoles), ácido2,6-difluorobenzóico (127 mg, 0,804 mmoles) e 4-N,N-dimetilaminopiridina(15 mg, 0,134 mmoles) em acetonitrila (10 mL). Aquecer a reação para 60 0Cdurante 18 horas. Esfriar a reação para a temperatura ambiente e adicionarCH2CI2 e água. Separar a camada orgânica e extrair a camada aquosa comH2CI2 (2 χ 20 mL). Combinar as camadas orgânicas, secar sobre Mg2SC^,filtrar e concentrar sob pressão reduzida. Submeter o resíduo à cromatografiaem sílica gel eluindo com EtOAc:hexanos a 10-70% para proporcionar ocomposto do título. MS(ES+): m/z = 588,3 [M+H],
Preparar os compostos a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
<table>table see original document page 66</column></row><table>
EXEMPLO 68
<formula>formula see original document page 66</formula>
Monometano-sulfonato de l-(terc-butil-2-p-toIil-2H-pirazoI-3-in-3-(6í4-(2,6-difluoro-benzoil)-piperazin-l-in-2-metil-piridiii-3-il)-uréia(2,6-difluoro-fenil)-metanona (1,00 equiv, 601,77 mmoles, 200,00 g), 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido 5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico(1,00 equiv, 602,88 mmoles, 244,00 g), N,N-dimetilaminopiridina (60,47mmoles, 7,50 g), diisopropiletilamina (229,36 mmoles, 40,00 mL, 29,64 g),DMSO (1,00 L) a dois frascos com três gargalos de 5 L com agitaçãooverhead. Aquecer lentamente e manter a 60-65 °C. Adicionar DMSO (250mL) e continuar a agitação a -65 0C durante 1 hora. Adicionar MTBE, então,manter a -60 0C durante 0,5 hora. Esfriar para a temperatura ambiente.
Coletar os sólidos através de filtração e combinar. Enxaguar o bolo comMTBE e deixar secar sob pressão reduzida durante a noite. Dissolver omaterial em 9 L de metanol, então, tratar com carvão ativado (65 g) emrefluxo durante 1 hora. Filtrar a mistura através de Celite®. Concentrar ofiltrado, então, trocar o solvente por acetato de etila. Filtrar, enxaguar comacetato de etila, heptanos e secar a 40°C sob pressão reduzida paraproporcionar l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-{6-[4-(2,6-difluoro-benzoil)-piperazin-l-il]-2-metil-piridin-3-il}-uréia (490 g).
Carregar l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-{6-[4-(2,6-difluoro-benzoil)-piperazin-l-il]-2-metil-piridin-3-il}-uréia (1,00 equiv,600,67 mmoles, 353,00 g) e metanol (3,50 L) a um frasco de 5 L. Aquecer amistura para 50-60 °C. Adicionar ácido metano-sulfônico (1,00 equiv, 603,49mmoles, 39,56 mL, 58,00 g) em 250 mL de acetato de etila gota a gota. Agitara solução durante 0,5 hora a -50 0C, então, remover a fonte de aquecimento.
Agitar durante 5 horas, então, filtrar. Concentrar o filtrado sob pressãoreduzida. Adicionar acetato de etila (300 mL) e concentrar sob pressãoreduzida. Adicionar mais 300 mL de acetato de etila e concentrar sob pressãoreduzida. Adicionar 2 L de dietil éter, então, agitar durante 15 minutos.Permitir que descanse durante a noite. Agitar durante 3 horas então, filtrar.Enxaguar com dietil éter e heptano, então, secar sob pressão reduzida a -40 0Cpara proporcionar o composto do título (391,4 g).
EXEMPLO 69l-(5-ferc-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-in-3-[6-((//,a/i5)-4-cicIopropanocarbonil-2,5-dimetil-piperazin-l-in-5-metil-piridin-3-ill-uréia
<formula>formula see original document page 68</formula>
Dissolver o composto de rac- -amino-3 -metil-piridin-2-il)-2,5-dimetil-piperazin-l-il]-ciclopropil-metanona (Preparação 9,0,1 g, 0,35 mmoles) e 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido 5-fórc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico (0,283 g, 0,7 mmoles) em DMSO (3 mL) e DIEA(0,12 mL, 0,7 mmoles). Aquecer em um tubo vedado a 80 0C durante 15horas. Permitir que esfrie e entornar em água gelada. Extrair com AcOEtvárias vezes. Unir os orgânicos e lavar com solução saturada aq. de cloreto desódio, secar sobre Na2SO4 para proporcionar um resíduo. Submeter o resíduoà cromatografia em sílica gel eluindo com AcOEt em hexano a 50-90% paraproporcionar 0,09 g de rac-l-(5-fórc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-[6-((íra«5)-ciclopropanocarbonil-2,5-dimetil-piperazin-l-il)-3-metil-piridin-3-il]-uréia (rendimento de 47%) como um sólido. MS(ES+): m/z = 544,5 [M+H].
Submeter o bruto à decomposição por cromatografia quiralusando uma coluna Chirapack AS eluindo com hexano-DMEA a 0,2%:EtOHa 25%. 13,78 min. MS(ES+): m/z = 544,5 [M+H].
EXEMPLO 70
l-(5-fe/-c-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-in-3-(6-[4-(2,2-dimetil-propionil)-piperazin-l-ilM-metil- piridin-3-il) -uréia
Adicionar 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido (5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-carbâmico (Preparação 38, 0,32 mmoles, 0,1 r) sobreuma solução de l-[4-(5-amino-4-metil-piridin-2-il)-piperazin-l-il]-2,2-dimetil-propan-1 -ona (0,3 mmoles, 0,08 g) e carbonato de potássio (0,3mmoles, 0,05 g) em acetonitrila (3 mL) e agitar a solução durante 4 horas a 80°C. Adicionar água e extrair com CH2Cl2. Combinar as camadas orgânicas elavar com cloreto de sódio saturado aq.. Secar sobre sulfato de sódio, filtrar econcentrar sob pressão reduzida para proporcionar um resíduo. Submeter oresíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com hexanos/acetato de etila emgradiente (de 20% para 80%). MS(ES+): m/z = 532 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
<table>table see original document page 69</column></row><table>
EXEMPLO 74
l-(5-terc-butil-2-p-toliI-2H-pirazol-3-il)-3-{5-cloro-6-[4-(l-metil-ciclopropanocarbonil)-piperazin-l-ill-piridin-3-il}-uréia
Sobre uma solução de hidrocloreto de 1 -(5-fórc-butil-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(5-cloro-6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia (1,6 mmoles,0,7 g), em 5 mL de CH2Cl2, adicionar ácido 1-metil-ciclopropanocarboxílico(1,6 mmoles, 0,2 g), hidrato de 1-hidróxi-lH-benzotriazol (1,8 mmoles, 0,2g), hidrocloreto de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (1,8mmoles, 0,3 g) e trietilamina (4,8 mmoles, 0,7 mL). Agitar a solução durante24 horas em temperatura ambiente. Adicionar água e extrair com CH2Cl2.Combinar as camadas orgânicas e lavar com solução saturada aq. de cloretode sódio, secar sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressãoreduzida para proporcionar um resíduo. Submeter o resíduo à cromatografiaem sílica gel eluindo com hexanos / acetato de etila em gradiente (de 20%para 80%). MS(ES+): m/z = 550 [M+H].Preparar o composto a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
<table>table see original document page 70</column></row><table>
EXEMPLO 76
l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-{6r4-(2,6-difluoro-benzoin-piperidin-4-ilamino]-piridin-3-il}-uréia
<formula>formula see original document page 70</formula>
Agitar 1 -(5 -terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3 -il)-3 - [6-(piperidin-4-ilamino)-piridin-3-il]-uréia (0,22 mmoles, 0,1 g), cloreto de 2,6-difluoro-benzoíla (0,2 mmoles, 0,03 mL) e trietilamina (0,2 mmoles, 0,03mL) em 3 mL de acetonitrila durante a noite em temperatura ambiente.
Adicionar CH2Cl2 e lavar com cloreto de sódio saturado aq. e água. Secarsobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida. Submeter oresíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com CH2Cl2: MeOH emgradiente (de 0,5 a 10%). MS(ES+): m/z = 588 [M+B].
EXEMPLO 77
1-(5-terc-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-(2-metil-6-[l-(l-metil-ciclopropanocarbonil)-piperidin-4-ilóxil-piridin-3-il}-uréia
<formula>formula see original document page 70</formula>
Agitar uma mistura de reação de 4-{5-[3-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-ureido]-6-metil-piridin-2-ilóxi}-piperidina (93 mg, 0,2mmoles), ácido 1-metil ciclopropil-carboxílico (40 mg, 0,4 mmoles), HOBt(30 mg, 0,25 mmoles) e DCC (80 mg, 0,4 mmoles) em diclorometano (2 mL)a 22 0C durante 18 horas. Filtrar, então, submeter à cromatografia em sílicagel eluindo com hexanos e acetato de etila para proporcionar um sólidobranco (111 mg, rendimento de 100%). MS(ES+): m/z = 545,3[M+H].
Preparar os compostos a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
<table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table>
EXEMPLO 99
Mesilato de l-(5-terc-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-in-3-(5-cloro-6-ri-(2-fluoro-benzoiI)-piperidin-4-ilóxil-piridin-3-il)-uréia
<formula>formula see original document page 72</formula>
Preparar a base livre usando um procedimentosubstancialmente análogo ao procedimento acima. Converter ao sal demesilato através de tratamento da solução ou transformar em pasta a aminalivre em diclorometano (1 mL) e MeOH (5 mL) com ácido metano sulfônico(1 equiv., 17,66 mg 0,183 mL). Agitar a mistura resultante, concentrar e secarsob pressão reduzida para proporcionar o sal. MS(ES+): m/z - 605,0 [M+H](como base livre).
Preparar os seguintes sais de mesilato usando umprocedimento substancialmente análogo àquele descrito acima.
<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>
EXEMPLO 117
l-(6-[l-(2-Fluoro-benzoin-piperidin-4-ilóxil-5-metil-piridin-3-in-3-f2-p-TOLIL-5-(2,2,2-ί:ι·ίΑιιοι·ο-1- metil-l-trifluorometil-etin-2H-pirazol-3-in-uréia
<formula>formula see original document page 74</formula>
Borbulhar gás nitrogênio através de uma solução de 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido [2-p-tolil-5-(2,2,2-trifluoro-l-metil-l-trifluorometil-etil)-2H-pirazol-3-il]-carbâmico (Preparação 37, 95 mg, 0,185mmoles) e [4-(5-Amino-3-metil-piridin-2-ilóxi)-piperidin-l-il]-(2-fluoro-fenil)-metanona (Preparação 19, 61 mg, 0,185 mmoles) em DMSO (3 mL)durante 5 min. Em seguida, adicionar N,N-diisopropiletilamina (0,08 mL,0,463 mmoles). Agitar a 70 0C durante a noite, então, entornar em CH2Cl2 (75mL) e lavar sobre uma coluna SCX MegaBond Elute de 10 g. Lavar a colunacom CH2Cl2 (3x35 mL), MeOH (2 χ 50 mL) e NH3 a 2 M em MeOH (3 χ 50mL). Combinar as frações desejadas e concentrar. Submeter o resíduo àcromatografia em sílica gel eluindo com CH2Cl2 e solução de MeOH emCH2Cl2 a 10% a 90% para proporcionar o composto do título como um sólidobranco (69 mg, rendimento de 54 %). MS(ES+): m/z = 693,5 [M+H].
EXEMPLO 118
l-(6-í4-(2,6-Difluoro-benzoin-piperazin-l-il1-2-metil-piridin-3-il)-3-í5-(2-fluoro-l-fluorometil-1- metil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il1-uréia
Agitar hidrocloreto de l-[5-(2-Fluoro-l-fluorometil-l-metil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-3-(2-metil-6-piperazin-l-il-piridin-3-il)-uréia(0,85 mmoles, 0,5 g), cloreto de 2,6-difluorobenzoíla (0,85 mmoles, 0,1 mL)e trietilamina (2,6 mmoles, 0,4 mL) em 5 mL de CH2Cl2 em temperaturaambiente durante a noite. Adicionar água e extrair em CH2Cl2j lavar a camadaorgânica com solução saturada aq. de cloreto de sódio. Secar sobre sulfato desódio anídrico e concentrar sob pressão reduzida. Submeter o resíduo àcromatografia em sílica gel eluindo com usando hexanos / acetato de etila(20%-70%). MS(ES): m/z = 624 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
<table>table see original document page 75</column></row><table>
EXEMPLO 121
Metano-sulfonato de l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-in-3-{6-[4-(2-ciclopentil-acetil)-piperazin-l-ill-piridin-3-il}-uréia
<formula>formula see original document page 75</formula>
Adicionar 0,10 mL de solução de ácido metano-sulfônico emCH2CyMeOH (95/5) a uma solução agitada de l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-{6-[4-(2-ciclopentil-acetil)-piperazin-l-il]-piridin-3-il}-uréiaem 2 mL de CH2Cl2ZMeOH (95/5). Agitar a mistura em temperatura ambientedurante 20 minutos e, então, evaporar os solventes através de fluxo de N2.Triturar o sal com Et2O, filtrar e secar para proporcionar o composto do título.MS(ES+): m/z = 544 [M+H].
Preparar os compostos a seguir usando um procedimentosubstancialmente análogo àquele descrito acima.
<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table>
EXEMPLO 134
Metano-sulfonato de l-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-{2-[l-(2,6-difluoro-benzil)-piperidin-4-ilóxil-piridin-4-il}-uréiaTratar uma solução de 1-(5-terc-butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-[2-(piperidin-4-ilóxi)-piridin-4-il]-uréia (Preparação 71: 179 mg, 400mmoles), ácido 2,6-difluorobenzóico (76 mg, 0,48 mmoles) e DMAPcatalítico (5 mg) em diclorometano (4 ml) com EDCI (92 mg, 0,48 mmoles).Agitar a mistura resultante durante a noite em temperatura ambiente, então,lavar com solução saturada aquosa de bicarbonato de sódio. Secar a camadaorgânica sobre sulfato de sódio e concentrar sob uma corrente de nitrogênio.Triturar o resíduo com uns poucos mililitros de DCM. Após ultra-som, filtraro sólido branco e secar sob pressão reduzida para proporcionar 162 mg docomposto do título como a base livre (rendimento de 69%).
Tratar uma suspensão da amina livre em DCMiMeOH a 3:2 (5mL) com ácido metano sulfônico a 2 M em diclorometano (1 equiv.; 0,138mL). Agitar a mistura resultante até uma solução clara, então, concentrar sobuma corrente de nitrogênio e secar sob pressão reduzida para proporcionar osal do título. (LCMS ES+ (m/z) 589 [M+H]).
Preparar o composto a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
<table>table see original document page 77</column></row><table>
EXEMPLO 136
l-{2-[l-(2,6-Difluoro-bepzoil)-piperidin-4-ilóxi]-piridin-4-il)-3-[5-(2-fluoro-l-fluorometil-1-metil- etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-uréia
Aquecer uma solução de [4-(4-amino-piridin-2-ilóxi)-piperidin-l-il]-(2,6-difluoro-fenil)-metanona (265 mg, 0,80 mmoles), 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido 5-(l-fluorometil-ciclopropil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-carbâmico (350 mg, 0,80 mmoles) e diisopropiletilamina (700 mL) em 4mL de DMSO a 60 °C durante 16 horas. Esfriar a mistura resultante para atemperatura ambiente e adicionar água. Filtrar o precipitado, enxaguar comágua, então, pentano e secar em um forno a vácuo a 60 °C. Submeter oresíduo à cromatografia em sílica gel eluindo com um gradiente de amônia a2M-metanol em diclorometano (0 a 2%) para proporcionar 85 mg de produto.
Preparar os compostos a seguir usando procedimentossubstancialmente análogos àqueles descritos acima.
EXEMPLO Composto MS(ES): m/z [M+H]
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EXEMPLO 139
l-(2-[l-(2,6-Difluoro-benzoil)-piperidin-4-ilóxil-piridin-4-il}-3-[5-(2-fluoro-l-fluorometil-l-metil- etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ill-uréia
Adicionar 0,114 mL (0,114 mmoles) de uma solução a 1 Mrecentemente preparada de MeSOaH em DCM/MeOH (95:5) a uma soluçãode 71 mg (0,114 mmoles) de l-{2-[l-(2,6-Difluoro-benzoil)-piperidin-4-ilóxi]-piridin-4-il}-3-[5-(2-fluoro-l-fluorometil-l-metil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-uréia em 2 mL de uma mistura de DCM/MeOH a 95:5. Agitar amistura durante 20 min em temperatura ambiente, então, evaporar ossolventes sob uma corrente de N2. Triturar o resíduo com Et2O paraproporcionar o composto do título (76 mg, rendimento de 93%) (pureza de100%). ES+(m/z) = 625 [M+H].
Preparar o composto a seguir usando procedimentos
substancialmente análogos àqueles descritos acima.
EXEMPLO Composto MS(ES): m/z [M+H]
<table>table see original document page 78</column></row><table>
EXEMPLO 141
Metano-sulfonato de l-{6-f4-(2,6-Difluoro-benzoil)-piperazin-l-in-5-metil-piridin-3-il}-3-[5-(2-fluoro-l,l-dimetil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-ill-uréia
<formula>formula see original document page 79</formula>
Adicionar DIEA (2 equiv.) a uma solução de [4-(5-amino-3-metil-piridin-2-il)-piperazin-1 -il]-(2,6-difluoro-fenil)-metanona (400 mg,1,205 mmoles) e 2,2,2-tricloro-etil éster de ácido [5-(2-fluoro-l,l-dimetil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-carbâmico (1 equiv) em acetonitrila (12 mL).
Agitar a mistura a 80°C em um tubo vedado. Após 4 dias, remover o solvente.Diluir o bruto com DCM5 extrair com água e secar sobre Na2SO4 filtrar eremover o solvente sob pressão reduzida. Submeter o sólido à cromatografiaem sílica gel, eluindo com hexano/acetona a 3:1 para obter 352 mg de l-{6-[4-(2,6-difluoro-benzoil)-piperazin-1 -il]-5-metil-piridin-3 -il} -3 - [5 -(2-fluoro-l,l-dimetil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-uréia como um sólido branco(rendimento de 48%). ES+(m/z): 606 [M+l].
Dissolver 50 mg (0,083 mmoles) da base livre de l-{6-[4-(2,6-difluoro-benzoil)-piperazin-1 -il] -5 -metil-piridin-3 -il} -3 - [5 -(2-fluoro-1,1-dimetil-etil)-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il]-uréia em DCM (0,5 mL). Adicionar 1equiv de ácido trifluorometano-sulfônico em DCM (1 N). Após 30 min,remover o solvente para proporcionar um sólido branco. Após várias lavagenscom éter/DCM, secar o sólido sob pressão reduzida para obter 55 mg docomposto do título (rendimento de 95%). ES+(m/z): 606 [M+l].
Inibição de quinase P38
Preparo de Solução Padrão
A solução tampão de quinase é preparada através decombinação de 2,5 mL de Tris-HCl a IM (pH de 7,5), 0,1 mL de ditiotreitol a1M, 1,0 mL de cloreto de magnésio e 300 μί de Trixon X-100 a 1% ediluição para 100 mL com água. 84 mL dessa solução tampão de quinase sãocombinados com 16 mL de DMSO para preparar a solução de DMSO a 16%.
A solução de ATP a 200 μΜ é preparada através da adição de102,6 jiL de ATP aquoso a 10 mM, 25 μΐ, de 33P-ATP e 163,5 pL de Peptídeo661-681 de Fator de Crescimento Epidérmico aquoso a 4 mM (Biomol,Catálogo #P-121) em 5 mL de solução tampão de quinase.
A solução de enzima quinase p38 é preparada através dedissolução de 9,5 pL de solução de enzima concentrada (250 ng de enzimap38^L de solução tampão de quinase) em 1536 μΕ de solução tampão dequinase.
Preparo de Amostra
Uma solução a 80 μΜ de cada composto de teste e compostode controle é preparada através de dissolução de 2 μΕ de uma solução deestoque a 10 mM dos respectivos compostos em sulfóxido de dimetila em 248μL da solução de DMSO a 16% em uma lâmina de microtitulação com 96cavidades Costar. A lâmina é colocada sobre o manipulador de líquidoautomático Tecan Gênesis para diluições seriais a 1:3.
Ensaio
μL, de composto serialmente diluído são colocados com ummanipulador de líquido automático com 96 cavidades Beckman Multimek àlâmina de ensaio. 20 de solução de ATP a 200 μΜ são adicionados a ummanipulador de líquido com 8 canais Titertek Multidrop. 10 pL de solução deenzima quinase p38 são transferidos para a lâmina de ensaio usando oMultimek. A mistura é deixada reagir durante 40 minutos a 30 0C e, então, areação é cessada através da adição de 60 μί de AcOH glacial a 5%recentemente preparado com Multidrop. 80 μL dessa solução são transferidospara uma lâmina "MAPH" usando o Multimek. As lâminas são deixadasdescansar durante 30 minutos em temperatura ambiente e, então,lavadas/aspiradas sobre o extrator Titertek MAP com AcOH glacial a 0,5%recentemente preparado (1 χ 300 μΐ,, 2 χ 200 μΙ,). As lâminas foram coradase 100 μΙ, de fluido de cintilação MicroScint-20 (Packard Bioscience) sãoadicionados com o Multidrop. As lâminas são deixadas assentar durante 30min e contadas sobre um contador de cintilação PE/Wallac Microbeta Triluxpara 33P-isótopo.
O composto exemplificado no Exemplo 5 é inicialmentetestado em 10 concentrações (20 μΜ - 1 nM usando diluições seriais a 1:3).Compostos com valores de IC50 de menos de 25 nM são re-testados em umaconcentração inicial de 2 μΜ a 0,1 nM (diluições seriais a 1:3). Valores deIC50 são calculados (software EDBS ActivityBase) para cada compostousando regressão não-linear. O Exemplo 5 é testado essencialmente conformedescrito acima e verificou-se que inibe a enzima quinase p38 com uma IC5o de22 nM.
Inibição de P-MAPKAPK2 in vitro
Células RAW 264.7 (uma linhagem monocítica/macrófago demurino ATCC) são cultivadas em uma densidade de 50.000 células/cavidadeem lâminas com 96 cavidades com meio RPMI-1640 mais soro bovino fetal a10% (FBS) e deixadas assentar e aderir ao fundo da cavidade durante 48horas. Após atingir a confluência, as células são tratadas durante 2 horas com10 diluições seriais de diferentes compostos. Um composto de controle ésempre incluído. Após 2 horas, anisomicina (100 ug/ml) é adicionada e ascélulas são incubadas durante 30 minutos a 37 0C sob uma atmosfera de 5%de CO2. Então, as células são fixadas e tratadas com peróxido de hidrogêniode forma a remover a peroxidase endógena. Finalmente, as lâminas sãobloqueadas com FBS, lavadas e um ensaio ELISA é realizado usando umanticorpo antifosfo- MAPKAPK2 (Thr 334, Cell Signalling, Cat # 3041) e umanticorpo secundário ahP-Conjugado. Essa reação é detectada usandoFEMTO (Pierce), o qual é um substrato ahP quimioluminescente que resultaem rápida produção de luz cinética e uma alta intensidade de sinal.Os compostos exemplificados foram testados essencialmenteconforme descrito acima e verificou-se que tinham valores de IC5o de menosdo que ou igual a 300 nM. Compostos preparados nos Exemplos 111, 113,114, 115, 119 foram testados na presença de soro a 100%, essencialmenteconforme descrito acima e verificou-se que têm valores de IC50 de menos doque ou igual a 500 nM. Os seguintes compostos foram testadosessencialmente conforme descrito acima e verificou-se que tinham a seguinteatividade:
<table>table see original document page 82</column></row><table>
Inibição de TNFa in vitro
Macrófagos peritoneais de camundongo
1 mL de caldo de tioglicolato (5,0 g de extrato de leved, 15,0 gde casitona ou tripticase, 5,0 g de dextrose, 2,5 g de cloreto de sódio, 0,75 gde L-cistina, 0,5 g de tioglicolato de sódio, 1,0 mg de resazurina e 0,75 g deagar em 1,0 L de água destilada) é injetado na cavidade peritoneal decamundongos fêmeas Balb/C. No dia 4 ou 5 pós-injeção, os camundongos sãosacrificados e, então, injetados i.p. com 4 mL de meio RPMI-1640(BioWhittaker) e os macrófagos peritoneais são extraídos com uma seringa.Produção de citocina
Macrófagos peritoneais de camundongo são contados com umhemocitômetro e ajustados para 5 χ IO5 células/cavidade em lâminas com 96cavidades em meio RPMI-1640 com soro bovino fetal a 10%. 200μL/cavidade são colocados em lâminas com 96 cavidades e as célulasdeixadas assentar e aderir ao fundo da cavidade durante pelo menos 3 horas.O composto de teste ou inibidor padrão de quinase p38 é pré-tratado usandouma série de 8 concentrações durante 1 hora a 37 0C (20 fiL/cavidade). Ascélulas são tratadas com uma mistura de 50 ng/mL de lipopolissacarídeo(LPS) e 10 U/mL de interferon-γ durante 18 horas a 37 0C (20 μL/cavidade).
O meio condicionado é coletado e ensaiado com relação à produção de TNFausando o procedimento de detecção Luminex.
Ensaio de Detecção de TNFa/Luminex (Kit Bio-Rad Bio-Plex - Catálogo#171-G12221)
O padrão de TNFa pré-misturado liofilizado (1 tubopadrão/duas lâminas com 96 cavidades) é reconstituído com 50 μΐ, de águaestéril (500.000 pg/mL). As amostras são submetidas a turbilhonamentodurante 5 segundos, incubadas sobre gelo durante 30 minutos e submetidas aturbilhonamento durante 5 segundos antes de uso. Um conjunto de doze tubosde 1,5 mL é rotulado com #1 a #12 e, então, as quantidades de meio de célulamostradas abaixo são adicionadas aos tubos apropriados (concentraçõespadrões são como segue: 50.000; 25.000; 12.500; 6.250; 3.125; 1.562,5;781,3; 390,6; 195,3; 97,7; 48,8; e 24,4 pg/mL). Os glóbulos anti-citocinaconjugados pré-misturados são submetidos a turbilhonamento (25X)vigorosamente durante 30 segundos. Os glóbulos anti-citocina conjugados sãodiluídos para uma concentração de IX usando IX Tampão de Ensaio Bio-Plex. Para cada lâmina, 240 μΐ, dos glóbulos pré-misturados são adicionadosa 5760 μΐ, de Tampão de Ensaio Bio-Plex. Uma lâmina com filtro de 96cavidades Millipore é bloqueada com 100 μL/cavidade de tampão debloqueio. O tampão de bloqueio é filtrado usando um sistema de filtraçãoMillipore e, então, seco com uma toalha. 2 lavagens são realizadas sobre alâmina com filtro com 100 μΐ/cavidade de Tampão de Ensaio Bio-Plex esecos com uma toalha. Os glóbulos anti-citocina conjugados IX sãosubmetidos a turbilhonamento durante 15 segundos e 50 μΐ, adicionados acada cavidade. Esses são filtrados e secos com uma toalha. 2 lavagens sãorealizadas sobre as lâminas com 100 μΐ/cavidade de tampão de lavagem Bio-Plex. Novamente, elas são filtradas e secas. 50 μΙ. de amostra ou padrão sãoadicionados a cada cavidade de amostra. Essas são incubadas durante 60segundos em temperatura ambiente sobre um agitador protegido da luz noajuste 6 e, então, durante 30 minutos no ajuste 3, então, colocadas norefrigerador durante a noite. 3 lavagens são realizadas com tampão delavagem Bio-Plex. Filtrar e secar com uma toalha. O anticorpo de detecção decitocina é preparado (-10 min antes de uso) para cada lâmina e 60 μΙ. doestoque de anticorpo de detecção de citocina pré-misturado são adicionados a5940 μΙ, de Diluente de Anticorpo de Detecção Bio-Plex.
50 uL de anticorpo de detecção de citocina são adicionados eincubados durante 60 segundos em temperatura ambiente sobre um agitadorprotegido da luz no ajuste 6 e, então, durante 30 minutos no ajuste 3. 3lavagens são realizadas com o tampão de lavagem Bio-Plex. Esse é filtrado eseco com uma toalha. Strept-PE (-10 minutos antes de uso) é preparado paracada lâmina e 60 μι a 5940 uL de Tampão de Ensaio Bio-Plex adicionados.50 μΙ, de Estreptavidina-PE são adicionados a cada cavidade e incubadosdurante 60 segundos em temperatura ambiente sobre um agitador protegido daluz no ajuste 6 e, então, durante 10 minutos no ajuste 3. 3 lavagens sãorealizadas com tampão de lavagem Bio-Plex. Esse é filtrado. Os glóbulos sãore-suspensos em 100 μL/cavidade de tampão de Ensaio Bio-Plex. Padrões eamostras são lidos sobre uma máquina Luminex. Essas leituras de intensidadesão, então, convertidas para unidades de picograma/mililitro baseado em umacurva padrão com 12 pontos criada em duplicata usando um método deregressão logística com quatro parâmetros (Bio-Plex Manager 2.0, Bio-Rad) ea IC5O calculada.
O composto exemplificado no Exemplo 5 é testadoessencialmente conforme descrito acima e TNFa suprimido in vitro com umaIC50 de 18 nM.
Inibição de TNFa in vivo
Compostos são administrados p.o. (30, 10, 3 e 1 mg/kg) acamundongos fêmeas Balb/c (6 camundongos/dose). 1 hora apósadministração de composto, 4 doses (P.O. em um volume de 0,1mL/camundongo; veículo:NaCMC a l%/Tween-80 a 0,25% em água); aoscamundongos é fornecida uma injeção IP de LPS a 400 μg/kg. 1,5 horas apósestímulo com LPS, os camundongos são anestesiados com isoflurano esangue é coletado via punção cardíaca. Os níveis de TNFa no plasma sãodeterminados usando o kit ELISA da R&D Systems e a ED50 de dose/respostaé determinada.
O composto exemplificado no Exemplo 5 é testadoessencialmente conforme descrito acima e o TNFa suprimido in vivo comuma TMED50 de 2,24 mg/kg. A Dose Eficaz Mínima Limítrofe (TMED) 50 éa dose na qual uma inibição de 50% de mais do que ou igual a 50% foi obtidae é estatisticamente diferente do controle/placebo.
Exposição Oral
Compostos são selecionados para exposição oral em 344 ratosFischer machos. Os animais são submetidos a jejum durante a noite ecompostos de teste administrados preparados como suspensões emcarboximetil celulose de sódio (1% peso/v) contendo Tween 80 (0,25% v/v) eantiespumante (0,1% peso/v). As suspensões de dose são preparadas a 1mg/mL e administradas a 1 mL/kg através de ingestão oral forçada. Amostrasde sangue são tomadas entre 0,5 h e 7 h após administração da dose e oplasma é preparado através de centrifugação. Amostras de plasma sãoanalisadas usando extração em fase sólida on-line e LC/MS/MS.
O composto exemplificado no Exemplo 5 é testadoessencialmente conforme descrito acima e a Cmax é 9390 ng/mL com umaAUC(0-7h) de 36800 ng.h/mL.
Efeito sobre TNFa induzido por LPS intra-articular
Injeção intra-articular de LPS em tornozelos de rato induz àsíntese de TNFa, o qual pode ser medido em fluido de lavagem sinovial.Altos níveis de TNFa são detectáveis dentro de 2 horas. Uma vez que aarticulação é o local onde a artrite se desenvolve, esse modelo podedeterminar rapidamente se um composto oralmente administrado tem umefeito sobre a resposta inflamatória no sinóvio. Seis ratos Lewis fêmeas (150-200 g) são colocados em cada grupo de tratamento. Aos animais é fornecidoveículo (Na-Carboximetil celulose a 1%-Tween 80 a 0,25%) ou composto deteste (1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg e 30 mg/kg) oralmente. Uma hora depois,μΐ de LPS (10 μg) são administrados intra-articularmente no tornozelodireito de cada rato, enquanto que o tornozelo esquerdo recebe 10 μL desolução salina. Após duas horas, cada tornozelo é lavado com 100 μL desolução salina. A lavagem é coletada e armazenada a -80 0C.
Grupo #1: veículo (NaCMC a 1%-Tween 80 a 0,25%, 1 mL,PO)Grupo#2: Composto de teste (1 mg/kg, 1 mL, PO)Grupo#3: Composto de teste (3 mg/kg, 1 mL, PO)Grupo#4: Composto de teste (10 mg/kg, 1 mL, PO)Grupo#5: Composto de teste (30 mg/kg, 1 mL, PO)TNFa é medido com um kit ELISA comercialmentedisponível (R&D, RTAOO). Tratamento com o composto exemplificado noExemplo 5 produz uma inibição de dose/resposta de síntese de TNFa,conforme medido no fluido de lavagem sinovial com uma TMED50 = 3,57mg/kg.
Ensaio de inibição de fosfo-MAPKAPK2 ex vivo em camundongosanisomicina-estimulados através de citometria de fluxo
Camundongos fêmeas Balb/c de 8-10 semanas de idade sãoadquiridos da Taconic Inc. e dosados p.o. com um volume de 0,2 mL decompostos nas concentrações de 30, 10, 3, 1 mg/kg. Sangue é obtido a partirde punção cardíaca após 2 horas ou outros períodos de tempo indicados ecoletado em tubos contendo EDTA. 100 μι de sangue são incubados a 37 0Cdurante 10 minutos. Sangue inteiro é, então, misturado com mAb Ly-6G anti-camundongo de rato FITC-conjugado (1:250) e mAb CDllb anti-camundongo de rato APC-conjugado (1:100) e estimulado com 10 μg/ml deanisomicina. Os antígenos na superfície celular e estimulação comanisomicina são conduzidos a 37 0C durante 15 min e seguido por tampãoLyse/Fix (BD Biosciences, Cat# 558049) durante 10 min em temperaturaambiente. Amostras de sangue submetidas à Iise são centrifugadas a 600 χ gdurante 8 minutos em temperatura ambiente com uma lavagem adicional com4 mL de PBS. 200 μΐ. de anticorpo anti-fosfo-MAPKAPK-2 (Thr334) diluído(diluição a 1:100) (Cell Signaling, Cat# 3041) e BD Fc Block de camundongo(diluição a 1:100) (BD Biosciences, 553141) em Meio B de permeabilização(Caltag, Cat# GAS002S-5) são adicionados em células sangüíneas eincubados em temperatura ambiente durante 30 minutos. Após a incubação, 3mL de corante/tampão de lavagem são adicionados e as células são dispersasconforme descrito acima com uma lavagem adicional com 3 ml decorante/tampão de lavagem. As células são, então, submetidas a um ensaio decitometria de fluxo usando um Beckman Coulter F500, a fluorescência médiade coloração de fosfono-MapKap-K2 é medida sobre células CDllb+Ly6G-gated. Análise de dados é realizada através do programa JMP. Tratamentocom o composto exemplificado no Exemplo 5 produz uma inibição dedose/resposta de síntese de p-MAPKAPK2 com TMED50 = 2,28 mg/kg.
Modelo de eficácia de artrite induzida por colágeno em rato
Ratos Lewis fêmeas ( « 190 g, Charles River Labs) sãoimunizados com colágeno bovino do tipo 2 (2 mg/mL) emulsificado com umvolume igual de adjuvante (hidróxido de alumínio) são usados. Os ratos sãoimunizados com aproximadamente 0,3 mg da emulsão intradermicamente nascostas próximo da base da cauda. Todos os animais são re-imunizados 7 diasdepois de acordo com o mesmo protocolo. Os ratos começam a desenvolverartrite (caracterizada por inchaço e vermelhidão em um ou ambos ostornozelos) de 12 a 14 dias após a primeira imunização. Os ratos sãoigualmente distribuídos em cinco grupos de tratamento aos primeiros sinais esintomas de artrite e o tratamento é iniciado com cada rato dosado bid durante14 dias.
Grupos de tratamento:
Grupo 1 Veículo (Na-Carboximetilcelulose a 1% + Tween 80a 0,25%) 1 mL, PO, Bid χ 14 dias
Grupo 2 Composto de teste, 5 mg/kg, 1 mL, PO, Bid χ 14
Grupo 3 Composto de teste, 15 mg/kg, 1 mL, PO, Bid χ 14
Grupo 4 Composto de teste, 30 mg/kg, 1 mL, PO, Bid χ 14
Grupo 5 Prednisolona, 10 mg/kg, 1 mL, PO, qd χ 14
O diâmetro do tornozelo é medido com um calibrador 5 dias
por semana e registrado. Os dados são expressos como a área sob a curva(AUC) gerada a partir dos escores de inflamação compostos e análiseestatística realizada. O composto exemplificado no Exemplo 5 exibiu umaTMED 50 = 5 mg/kg bid por histologia.
Administração oral do composto da presente invenção épreferida. Contudo, administração oral não é a única via ou mesmo a únicavia preferida. Por exemplo, administração transdérmica pode ser muitodesejável para pacientes que esquecem de tomar o medicamento ou sãoresistentes a tomar um medicamento oral e a via intravenosa pode serpreferida como uma questão de conveniência ou para evitar complicaçõespotenciais relacionadas à administração oral. Compostos de Fórmula Itambém podem ser administrados através das vias percutânea, intramuscular,intranasal ou intra-retal em circunstâncias particulares. A via de administraçãopode ser variada de qualquer forma, limitada pelas propriedades físicas dosfármacos, a conveniência do paciente e o profissional que faz o atendimento eoutras circunstâncias relevantes (Remington1S Pharmaceutical Sciences. 18aEdição, Mack Publishing Co. (1990)).
As composições farmacêuticas são preparadas de uma maneirabem conhecida na técnica farmacêutica. O veículo ou excipiente pode ser ummaterial sólido, semi-sólido ou líquido que pode servir como um veículo oumeio para o ingrediente ativo. Veículos ou excipientes adequados são bemconhecidos na técnica. A composição farmacêutica pode ser adaptada parauso oral, por inalação, parenteral ou tópico e pode ser administrada aopaciente na forma de tabletes, cápsulas, aerossóis, inalantes, supositórios,soluções, suspensões ou semelhante. O composto da presente invenção podeser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou cápsulasou comprimido em tabletes. Para fins de administração terapêutica oral, oscompostos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma detabletes, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers, gomas demascar e semelhantes. Essas preparações conterão pelo menos 4% docomposto da presente invenção, o ingrediente ativo, mas pode ser variadodependendo da forma em particular e pode, convenientemente, estar entre 4%e cerca de 70% do peso da unidade. A quantidade do composto presente nascomposições é tal que uma dosagem adequada será obtida. Composições epreparações preferidas da presente invenção podem ser determinadas atravésde métodos bem conhecidos por aqueles habilitados.
Os tabletes, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podemtambém conter um ou mais dos seguintes adjuvantes: aglutinantes, tais comopovidona, hidroxipropil celulose, celulose microcristalina ou gelatina;excipientes ou diluentes, tais como: amido, lactose, celulose microcristalinaou fosfato de dicálcio; agentes de desintegração, tais como: croscarmelose,crospovidona, amido glicolato de sódio, amido de milho e semelhantes;lubrificantes, tais como: estearato de magnésio, ácido esteárico, talco ou óleovegetal hidrogenado; agentes de deslizamento, tal como dióxido de silíciocoloidal; agentes de umedecimento, tais como: lauril sulfato de sódio epolisorbato 80; e agentes adoçantes, tais como: sacarose, aspartame ousacarina, podem ser adicionados ou um agente de flavorização, tal como:hortelã-pimenta, salicilato de metila ou flavorizante de laranja. Quando aforma de unidade de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, além dosmateriais do tipo acima, um veículo líquido, tal como polietileno glicol ou umóleo graxo. Outras formas de unidade de dosagem podem conter outros váriosmateriais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo,como revestimentos. Assim, tabletes ou pílulas podem ser revestidos comaçúcar, hidroxipropil metilcelulose, polimetacrilatos ou outros agentes derevestimento. Xaropes podem conter, além dos presentes compostos, sacarosecomo um agente adoçante e determinados conservantes, corantes e colorantese flavorizantes. Materiais usados no preparo dessas várias composiçõesdeverão ser farmaceuticamente puros e não-tóxicos nas quantidades usadas.Uma formulação preferida é preparada através da adição de Na-Carboximetilcelulose a 1%-Tween a 0,25% à dose desejada de um composto de Fórmula I.
Os compostos de Fórmula I são, em geral, eficazes sobre umaampla faixa de dosagem. Por exemplo, dosagens por dia normalmente caemdentro da faixa de cerca de 0,0001 a cerca de 30 mg/kg de peso corporal. Emalguns casos, níveis de dosagem abaixo do limite mínimo da faixa antesmencionada podem ser mais do que adequados enquanto que, em outroscasos, doses ainda maiores podem ser empregadas sem causar qualquer efeitocolateral prejudicial e, portanto, a faixa de dosagem acima não se destina alimitar o escopo da invenção de qualquer forma. Deve ser compreendido quea quantidade do composto realmente administrada será determinada por ummédico, à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada,a via de administração escolhida, o composto ou compostos reaisadministrados, a idade, peso e resposta do paciente individual e a gravidadedos sintomas do paciente.

Claims (11)

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser de Fórmula I:<formula>formula see original document page 91</formula>em que:Z é selecionado do grupo consistindo de:<formula>formula see original document page 91</formula>X é selecionado do grupo consistindo de:<formula>formula see original document page 91</formula>R1 é C1-C7 alquila opcionalmente substituída por um a seissubstituintes selecionados do grupo consistindo de halo e C1-C4 alquil-halo;C3-C6 cicloalquila opcionalmente substituída por um ou dois substituintesselecionados do grupo consistindo de C1-C4 alquila e trifluorometila; outrimetil-silila;R2 é fenila opcionalmente substituída por C1-C4 alquila oupiridinila opcionalmente substituída por C1-C4 alquila;Y é hidrogênio, C1-C4 alquila, halo ou C1-C4 alquil-halo;R3 é C1-C7 alquila opcionalmente substituída por C3-C6cicloalquila; C1-C4 alcóxi; C1-C4 alquil-halo; C3-C6 cicloalquilaopcionalmente substituída por um a quatro substituintes selecionados dogrupo de C1-C4 alquila e trifluorometila; ou piridila, fenila ou tienila, cada umopcionalmente substituído por um primeiro substituinte selecionado do grupoconsistindo de: halo, ciano, C1-C4 alquila, C1-C4 alquil-halo e C1-C4 alcóxi eopcionalmente ainda substituído por um segundo substituinte selecionado dogrupo de CrC4 alquila e halo; e
2. Composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizadopelo fato de que X é:
3. Composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizadopelo fato de que R4 é hidrogênio.-l-(5-fórc-Butil-2-p-tolil-2H-pirazol-3-il)-3-{6-[4-(2,6-difluoro-benzoil)-piperazin-1 -il]-2-metil-piridin-3 -il} -uréiaou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 2 caracterizado pelo fato de que R2 é 4-tolila.
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 3 caracterizado pelo fato de que R1 é CrC7 alquila.
6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 3 caracterizado pelo fato de que R1 é ferobutila.
7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 4 caracterizado pelo fato de que R3 é 2,6-difluorobenzila.
8. Composto, caracterizado pelo fato de ser de Fórmula I:R4 é hidrogênio ou CrC4 alquila; ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.
9. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1-8 em combinação com um excipiente, veículo ou diluentefarmaceuticamente aceitável.
10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 8 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelofato de ser para uso no tratamento de câncer.
11. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 8 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para otratamento de câncer.
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