BRPI0614885A2

BRPI0614885A2 - planta produtora de ácido hialurÈnico

Info

Publication number: BRPI0614885A2
Application number: BRPI0614885-9A
Authority: BR
Inventors: Hiroaki Kitazawa; Shigeo Shibatani; Atsushi Sogabe
Original assignee: Toyo Boseki
Priority date: 2005-08-25
Filing date: 2006-08-10
Publication date: 2011-04-19
Also published as: JP4935359B2; US8003851B2; WO2007023682A1; JPWO2007023682A1; CA2620210A1; EP1932909A1; EP1932909A4; US20090260108A1

Abstract

PLANTA PRODUTORA DE áCIDO HIALURÈNICO. A presente invenção proporciona, aprimorando um método conhecido para produzir ácido hialurónico em uma planta, uma planta ou algumas células vegetais cultivadas as quais podem produzir ácido hialurónico em um menor custo e um rendimento maior do que antes adicional, um método para preparar as mesmas, um vetor de expressão para transformação, um método para produzir ácido hialurónico usando a planta ou as células vegetais cultivadas e semelhantes. é proporcionado o método para produzir ácido hialurónico compreendendo obter ácido hialurónico por coexpressão de uma proteína com atividade de ácido hialurónico sintase e uma proteína exógena com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase em uma célula vegetal ou uma planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTAPRODUTORA DE ÁCIDO HIALURÔNICO".

DESCRIÇÃO

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se de modo geral, a um método paraproduzir ácido hialurônico em plantas, células de plantas transgênicas ouplantas transgênicas tendo a capacidade de produzir ácido hialurônico, emétodos para produzir estas células transgênicas e plantas transgênicas.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

Ácido hialurônico é um glicosaminoglicano (mucopolissacarídeo)isolado do corpo vítreo de um globo ocular bovino por Meyer e Palmer em1934 (Meyer, K. and Palmer, J. W. (1934) J. Biol. Chem., 107, 629-634). Áci-do hialurônico de alto peso molecular tem sido usado para o tratamento deosteoartrite, um auxiliar cirúrgico para oftalmologia, prevenção de adesão,aceleração da cura de ferimento e semelhantes. Também foi reportado queácido hialurônico de baixo peso molecular tem efeitos fisiologicamente ati-vos. Espera-se que sejam descobertos novos usos para o ácido hialurônicocomo um biomaterial ou em uma aplicação medicinal.

Até agora, o ácido hialurônico tem sido produzido por extraçãode tecidos de mamíferos ou fermentação microbiana. No entanto, o risco decontaminação com, por exemplo, encefalopatias espongiformes transmissí-veis (príons) ou transmissão de vírus para humanos tem sido motivo de pre-ocupação na extração dos tecidos de mamíferos. As células de mamíferossão caras de cultivar e manter. Necessitam de meios de crescimento caros ecrescem lentamente. Entretanto, as fermentações microbianas têm proble-mas tais como a a necessidade de meio de crescimento contendo açúcar einstalações caras. Em Escherichia coli, há problemas em que proteínas nãosão processados, pode ser formado corpo de inclusão, proteínas são degra-dadas por proteases, e semelhantes. (Petrides, D. et al., (1995) Biotecnol.Bioeng., 48, 529). Quando substâncias terapêuticas são produzidas em mi-cro-organismos, os custos de purificação se tornam extremamente caros demodo a evitar contaminação por endotoxinas.Pelo contrário, as plantas são sistemas ideais para produzir car-boidrato com baixa carga de energia, nas quais carboidratos são produzidosfotossintética-mente a partir de água e dióxido de carbono. A invenção reve-lada no Documento de Patente 6 mostra que o ácido hialurônico pode serproduzido introduzindo um gene de ácido hialurônico sintase em plantas oucélulas vegetais.

Documento de Patente 1: Pedido de Patente Japonesa Não Examinado N01993-125103

Documento de Patente 2: Publicação de Patente Japonesa Não ExaminadaN0 1983-056692

Documento de Patente 3: Pedido de Patente Japonesa Não Examinado N01997-319579

Documento de Patente 4: Pedido de Patente Japonesa Não Examinado N01994-319580

Documento de Patente 5: Pedido de Patente Japonesa Não Examinado N01997-056394

Documento de Patente 6: WO 05/012529

Documento Não Patente 1: Meyer, K. and Palmer, J. W., J. Biol. Chem., 107:629-634, 1934

Documento Não Patente 2: Petrides, D. et al., Biotecnol. Bioeng., 48: 529, 1995

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra análise SDS-PAGE de AtUGD antes e depoisde purificação.

A figura 2 mostra análise SDS-PAGE de cvUGD antes e depoisde purificação.

A figura 3 mostra GFAT expressado usando PROTEIOS (marcaregistrada).

A figura 4 mostra medição da atividade de GFAT usando o méto-do de Reissig.

A figura 5 mostra o nível de produção de ácido hialurônico deplantas de tabaco transgênicas nas quais o gene cvHAS-cvGFAT e o genecvHAS são introduzidos respectivamente.

A figura 6 mostra o nível de produção de ácido hialurônico deplantas de tabaco transgênicas nas quais foram introduzidos múltiplos genes.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

O objetivo primário da presente invenção é proporcionar plantase células vegetais que podem produzir ácido hialurônico de modo mais efi-caz aprimorando métodos previamente conhecidos para produzir ácido hialu-rônico em plantas, os métodos para produzir as mesmas, e os vetores deexpressão recombinantes para esse fim.

MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS

Em conseqüência de estudo extensivo para resolver os proble-mas acima, o presente inventor descobriu que o ácido hialurônico é produzi-do extensivamente nas plantas transformando plantas e células vegetaiscom genes que codificam proteínas tendo atividade enzimática para produzirácido hialurônico e genes que codificam proteínas tendo atividade enzimáti-ca de sintetização de nucleotídeos de açúcar, e estudo extensivamente adi-cional atingiu a presente invenção.

Isto é, a presente invenção refere-se aos seguintes itens.

1. Um método para produzir ácido hialurônico, compreendendocoexpressar uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase e umaproteína exógena com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase em umacélula vegetal ou uma planta.

2. Um método para produzir ácido hialurônico, contendo as eta-pas de:

(1) transformar uma célula vegetal ou uma planta usando um vetor de ex-pressão recombinante, o vetor de expressão recombinante tendo DNAcodificando uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase eDNA codificando uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcarsintase sob controle de um ou mais promotores capazes de funciona-mento em plantas;(2) cultivar um transformante obtido pela transformação; e

(3) isolar ácido hialurônico produzido pelo transformante.

3. O método para produzir ácido hialurônico de acordo com oItem 2, em que o promotor é um promotor órgão-específico ou um tecido-específico.

4. O método para produzir ácido hialurônico de acordo com oItem 2 ou 3, em que o DNA codificando uma proteína com atividade de ácidohialurônico sintase é DNA de (a) ou (b) abaixo:

(a) DNA consistindo em uma seqüência de nucleotídeos representada pelaSEQ ID NO: 1 o 3; ou

(b) DNA hibridizando à seqüência de nucleotídeos complementar ao DNAconsistindo na seqüência de nucleotídeos de (a) sob condições estrin-gentes, e o DNA codificando uma proteína com atividade de ácido hia-lurônico sintase.

5. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 1 a 3, em que a proteína com atividade de ácido hia-lurônico sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:

(a) uma proteína consistindo em uma seqüência de aminoácidos represen-tada pela SEQ ID NO: 2 ou 4; ou

(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a pro-teína tendo atividade de ácido hialurônico sintase.

6. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 1 a 5, em que o nucleotídeo de açúcar é uridin-5'-difosfo(UDP)-N-acetilglucosamina e/ou ácido UDP-glucurônico.

7. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 1 a 6, em que a proteína com atividade de nucleotí-deo de açúcar sintase é no mínimo uma proteína selecionada entre o grupoconsistindo em glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase, UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosamina mutase, glucosami-na-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1 -fosfato N-acetiltransferase,fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase, hexoquinase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquinase e glucuronato-1-fosfato uridil transferase.

8. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 1 a 6, em que a proteína com atividade de nucleotí-deo de açúcar sintase é no mínimo uma proteína selecionada entre o grupoconsistindo em UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosa-mina mutase, glucosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1-fosfato N-acetiltransferase, fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase,hexoquinase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase,UDP-glucose-1 -fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquina-se e glucuronato-1-fosfato uridil transferase, e glutamina:frutose-6-fosfatoamidotransferase.

9. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 1 a 6, em que uma proteína com atividade de nucleo-tídeo de açúcar sintase é glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase e/ouUDP-glucose desidrogenase.

10. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 2 a 9, em que o DNA codificando uma proteína comnucleotídeo de açúcar sintase atividade é DNA derivado de vírus chlorellae/ou Arabidopsis thaliana.

11. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 2 a 10, em que o DNA codificando uma proteína comatividade de nucleotídeo de açúcar sintase é DNAde (a) ou (b) abaixo:

(a) DNA consistindo em uma seqüência de nucleotídeos representada pelaSEQ ID NO: 5, 7 ou 9; ou

(b) DNA hibridizando à seqüência de nucleotídeos complementar ao DNAconsistindo na seqüência de nucleotídeos de (a) sob condições estrin-gentes, e o referido DNA codificando uma proteína com atividade deglutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase.

12. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 1 a 10, em que a proteína com atividade de nucleotí-deo de açúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:

(a) uma proteína consistindo em uma seqüência de aminoácidos represen-tada pela SEQ ID NO: 6, 8 ou 10; ou

(b) uma proteína consistindo na seqüência de aminoácidos de (a) com umou uns poucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, ea proteína tendo atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransfe-rase.

13. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 2 a 10, em que o DNA codificando uma proteína comatividade de nucleotídeo de açúcar sintase é DNA de (a) ou (b) abaixo:

(a) DNA consistindo em uma seqüência de nucleotídeos representada pelaSEQ ID NO: 11, 13, 17, 19, ou 21; ou

(b) DNA hibridizando à seqüência de nucleotídeos complementar ao DNAconsistindo na seqüência de nucleotídeos de (a) sob condições estrin-gentes, e o DNA codificando uma proteína com atividade de UDP-glucose desidrogenase.

14. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 1 a 10, em que a proteína com atividade de nucleotí-deo de açúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:

(a) uma proteína consistindo em uma seqüência de aminoácidos represen-tada pela SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ou 22; ou(b) uma proteína consistindo na seqüência de aminoácidos de (a) com umou uns poucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, ea proteína tendo atividade de UDP-glucose desidrogenase.

15. O método para produzir ácido hialurônico de acordo comqualquer um dos Itens 1 a 14, em que a planta é selecionada entre o grupoconsistindo em angiospermas, gimnospermas, pteridófitos e briófitas.

16. O método para produzir ácido hialurônico de acordo com oItem 3, em que os órgãos são selecionados entre o grupo consistindo emraízes, caules, tuberosidades de caules, folha, órgãos florais, raízes tubero-sas, sementes e ápices dos brotos.

17. O método para produzir ácido hialurônico de acordo com oItem 3, em que um ou mais tecidos são selecionados entre o grupo consis-tindo em epiderme, floema, tecidos moles, xilema e feixes vasculares.

18. Uma célula de planta transgênica ou uma planta transgênicatendo a capacidade de produzir ácido hialurônico por coexpressão de umaproteína com atividade de ácido hialurônico sintase e uma proteína exógenacom atividade de nucleotídeo de açúcar sintase, ou uma progênie das mes-mas, ou um órgão ou um tecido das mesmas tendo a mesma natureza quena planta.

19. Uma célula de planta transgênica ou uma planta transgênicatendo a capacidade de produzir ácido hialurônico, sendo transformada comum vetor de expressão recombinante contendo DNA codificando uma proteí-na com atividade de ácido hialurônico sintase e DNA codificando uma prote-ína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase sob controle de um pro-motor capaz de funcionamento em plantas; uma progênie tendo a mesmanatureza das mesmas; ou um órgão ou um tecido das mesmas.

20. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com o Item 19, em que o promotor é um promotor órgão-específico ou um tecido-específico.

21. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com o Item 19 ou 20, em que o DNA codificando umaproteína com atividade de ácido hialurônico sintase é DNA de (a) ou (b) a-baixo:

(a) DNA consistindo em uma seqüência de nucleotídeos representada pelaSEQ ID NO: 1 o 3; ou(b) DNA hibridizando à seqüência de nucleotídeos complementar ao DNAconsistindo na seqüência de nucleotídeos de (a) sob condições estrin-gentes, e o DNA codificando uma proteína com atividade de ácido hia-lurônico sintase.

22. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica deacordo com qualquer um dos Itens 18 a 20, em que a proteína com atividadede ácido hialurônico sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:

(b) uma proteína consistindo na seqüência de aminoácidos de (a) com umou uns poucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, ea proteína tendo atividade de ácido hialurônico sintase.

23. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 18 a 22, em que o nucleotí-deo de açúcar é UDP-N-acetilglucosamina e/ou ácido UDP-glucurônico.

24. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica deacordo com qualquer um dos Itens 18 a 23, em que a proteína com atividadede nucleotídeo de açúcar sintase é no mínimo uma proteína selecionadaentre o grupo consistindo em, glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase,UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosamina mutase, glu-cosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1-fosfato N-acetiltransferase, fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase, hexoqui-nase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquinase eglucuronato-1 -fosfato uridil transferase.

25. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 18 a 23, em que a proteínacom atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é no mínimo uma proteínaselecionada entre o grupo consistindo em UDP-N-acetilglucosamina difosfo-rilase, fosfoacetil glucosamina mutase, glucosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1-fosfato N-acetiltransferase, fosfoglucomuta-se, N-acetilglucosamina quinase, hexoquinase, N-acetilglucosamina acetila-se, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase,inositol oxigenase, glucuronoquinase e glucuronato-1-fosfato uridil transfera-se, e glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase.

26. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 18 a 23, em que a proteínacom atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é glutamina:frutose-6-fosfatoamidotransferase e/ou UDP-glucose desidrogenase.

27. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 19 a 26, em que DNA codifi-cando uma proteína com nucleotídeo de açúcar sintase atividade é derivadode vírus chlorella e/ou Arabidopsis thaliana.

28. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica; aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas; ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 19 a 27, em que DNA codifi-cando uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é DNAde (a) ou (b) abaixo:

(b) DNA hibridizando à seqüência de nucleotídeos complementar ao DNAconsistindo na seqüência de nucleotídeos de (a) sob condições estrin-gentes, e o DNA codificando uma proteína com atividade de glutami-na:frutose-6-fosfato amidotransferase.

29. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 18 a 27, em que a proteínacom atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b)abaixo:

30. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 19 a 27, em que o DNA codi-ficando uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é DNAde (a) ou (b) abaixo:

(a) DNA consistindo em uma seqüência de nucleotídeos representada pelaSEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, or21; ou

(b) DNA hibridizando a DNA consistindo na seqüência de bases comple-mentar à seqüência de bases de (a) sob condições estringentes, e oDNA codificando uma proteína com atividade de DP-glucose desidro-genase.

31. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 18 a 27, em que a proteínacom atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b)abaixo:

(a) uma proteína consistindo em uma seqüência de aminoácidos represen-tada pela SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ou 22; ou

(b) uma proteína consistindo na seqüência de aminoácidos de (a) com umou uns poucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, ea referida proteína com atividade de UDP-glucose desidrogenase.

32. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 18 a 31, em que a planta équalquer planta selecionada entre o grupo consistindo em gimnospermas,pteridófitos e briófitas.

33. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica; aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas; ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 18 a 31, em que o órgão éum ou mais órgãos selecionados entre o grupo consistindo em raízes, cau-les, tuberosidades de caules, folhas, órgãos florais, raízes tuberosas, se-mentes e ápices dos brotos.

34. A célula de planta transgênica ou a planta transgênica, aprogênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer um dos Itens 18 a 31, em que o tecido éum ou mais tecidos selecionados entre o grupo consistindo em epiderme,floema, tecidos moles, xilema e feixes vasculares.

35. Extratos vegetais obtidos da célula de planta transgênica ouda planta transgênica, da progênie tendo a mesma natureza das mesmas,ou do órgão ou do tecido das mesmas de acordo com qualquer um dos Itens18 a 34.

36. O extrato vegetal de acordo com o Item 35, em que o extratovegetal contém ácido hialurônico.

37. Um vetor de expressão recombinante, compreendendo DNAcodificando uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase e DNAcodificando uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintasesob controle de um promotor capaz de funcionamento em plantas.

38. O vetor de expressão recombinante de acordo com o Item37, em que o promotor é um promotor órgão-específico, ou um tecido-específico.

39. O vetor de expressão recombinante de acordo com o Item 37ou 38, em que o DNA codificando uma proteína com atividade de ácido hia-lurônico sintase é DNA de (a) ou (b) abaixo:

(b) DNA hibridizando a DNA consistindo na seqüência de nucleotídeoscomplementar à seqüência de nucleotídeos de (a) sob condições es-tringentes, e o DNA codificando uma proteína com ácido hialurônico a-tividade.

40. O vetor de expressão recombinante de acordo com o Item 37ou 38, em que a proteína com atividade de ácido hialurônico sintase é umaproteína de (a) ou (b) abaixo:

(a) uma proteína consistindo em uma seqüência de aminoácidos represen-tada pela SEQ ID NO: 2 ou 4; ou(b) uma proteína consistindo na seqüência de aminoácidos de (a) com umou uns poucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, ea proteína tendo atividade de ácido hialurônico sintase.

41. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualquerum dos Itens 37 a 40, em que o nucleotídeo de açúcar é UDP-N-acetilglucosamina e/ou ácido UDP-glucurônico.

42. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualquerum dos Itens 37 a 41, em que a proteína com atividade de nucleotídeo deaçúcar sintase é no mínimo uma proteína selecionada entre o grupo consis-tindo em glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase, UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosamina mutase, glucosami-na-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1-fosfato N-acetiltransferase,fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase, hexoquinase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquinase e glucuronato-1-fosfato uridil transferase.

43. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualquerum dos Itens 37 a 41, em que a proteína com atividade de nucleotídeo deaçúcar sintase é no mínimo uma proteína selecionada entre o grupo consis-tindo em UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosamina mu-tase, glucosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1-fosfato N-acetiltransferase, fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase, hexoqui-nase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquinase eglucuronato-1-fosfato uridil transferase, e glutamina:frutose-6-fosfato amido-transferase.

44. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualquerum dos Itens 37 a 41, em que a proteína com atividade de nucleotídeo deaçúcar sintase é glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase e/ou UDP-glucose desidrogenase.

45. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualquerum dos Itens 37 a 41, em que o DNA codificando uma proteína com nucleo-tídeo de açúcar sintase atividade é DNA derivado de vírus chlorella e/ou A-rabidopsis thaliana.

46. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualquerum dos Itens 37 a 44, em que o DNA codificando uma proteína com nucleo-tídeo de açúcar sintase atividade é DNA de (a) ou (b) abaixo:

(b) DNA hibridizando a DNA consistindo na seqüência de nucleotídeoscomplementar à seqüência de nucleotídeos de (a) sob condições es-tringentes, e o referido DNA codificando uma proteína com atividade deglutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase.

47. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualquerum dos Itens 37 a 44, em que a proteína com atividade de nucleotídeo deaçúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:

48. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualquerum dos Itens 37 a 44, em que o DNA codificando uma proteína com nucleo-tídeo de açúcar sintase atividade é DNA de (a) ou (b) abaixo:

(a) DNA consistindo em uma seqüência de nucleotídeos representada pelaSEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, ou 21; ou

(b) DNA hibridizando a DNA consistindo na seqüência de nucleotídeoscomplementar à seqüência de nucleotídeos de (a) sob condições es-tringentes, e o referido DNA codificando uma proteína com atividade deUDP-glucose desidrogenase.

49. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualquerum dos Itens 37 a 44, em que a proteína com atividade de nucleotídeo deaçúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:

(a) uma proteína consistindo em uma seqüência de aminoácidos represen-tada pela SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ou 22; ou(b) uma proteína consistindo na seqüência de aminoácidos de (a) com umou uns poucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, ea referida proteína tendo atividade de UDP-glucose desidrogenase.

50. Um método para produzir célula de planta transgênica ou aplanta transgênica tendo a capacidade de produzir ácido hialurônico, o mé-todo compreendendo transformar uma célula vegetal ou uma planta usandoqualquer vetor de acordo com os Itens 37 a 49.

51. Uma composição cosmética contendo ácido hialurônico co-mo um agente ativo, em que o ácido hialurônico é obtido por qualquer umdos métodos para produzir ácido hialurônico de acordo com os Itens 1 a 17.

EFEITOS DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, ácido hialurônico, o qualnão é produzido naturalmente em plantas, é produzido em plantas. De acor-do com a presente invenção, um gene codificando uma proteína com ativi-dade de ácido hialurônico sintase e um gene codificando uma proteína comatividade de nucleotídeo de açúcar sintase são expressados em plantas, demodo que ácido hialurônico é altamente produzido em plantas. Podem serproporcionadas plantas ou células vegetais cultivadas capazes de produzirmais ácido hialurônico do que por métodos convencionais, um método domesmo, e um vetor de expressão recombinante do mesmo. Portanto, a pre-sente invenção pode proporcionar ácido hialurônico seguro produzido porplantas em baixo custo.

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

Uma característica da presente invenção é um método para pro-duzir ácido hialurônico, contendo coexpressão de uma proteína com ativida-de de ácido hialurônico sintase e uma proteína exógena com atividade denucleotídeo de açúcar sintase em células vegetais ou plantas de modo a ob-ter ácido hialurônico.

Outra característica da presente invenção é um método paraproduzir ácido hialurônico contendo:

(1) transformar células vegetais ou plantas usando um vetor de expressãorecombinante que contém DNA codificando uma proteína com atividadede ácido hialurônico sintase e DNA codificando uma proteína com ativi-dade de nucleotídeo de açúcar sintase sob o controle de um ou maispromotores capazes de funcionamento em plantas;

(2) cultivar o transformante obtido pela transformação; e(3) isolar ácido hialurônico produzido nos transformantes.

Ainda outra característica da presente invenção é composiçõescosméticas que contêm ácido hialurônico como um agente ativo, em que oácido hialurônico é obtido pelo método para produzir ácido hialurônico acima.

Ainda outra característica da presente invenção é um vetor deexpressão recombinante para produzir ácido hialurônico, em que o vetor deexpressão recombinante contém DNA codificando uma proteína com ativida-de de ácido hialurônico sintase e DNA codificando uma proteína com ativi-dade de nucleotídeo de açúcar sintase sob o controle de um ou mais promo-tores capazes de funcionamento em plantas.

Algumas características da presente invenção são células deplantas transgênicas ou plantas transgênicas, as progênies tendo a mesmanatureza das mesmas, ou os órgãos ou os tecidos das mesmas, em que ostransformantes obtiveram a capacidade de produzir ácido hialurônico porcoexpressão de uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase euma proteína exógena com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase.

Uma característica da presente invenção é células de plantastransgênicas ou plantas transgênicas, as progênies tendo a mesma naturezadas mesmas, ou os órgãos ou os tecidos das mesmas, em que os transfor-mantes são transformadas usando um vetor de expressão recombinantecontendo DNA codificando uma proteína com atividade de ácido hialurônicosintase e DNA codificando uma proteína com atividade de nucleotídeo deaçúcar sintase sob o controle de um ou mais promotores capazes de funcio-namento em plantas.

Outra característica da presente invenção é um método paraproduzir células de plantas transgênicas ou plantas transgênicas que têm acapacidade de produzir ácido hialurônico. O método inclui transformar célu-las vegetais ou plantas usando um vetor de expressão recombinante quecontém DNA codificando uma proteína com atividade de ácido hialurônicosintase e DNA codificando uma proteína com atividade de nucleotídeo deaçúcar sintase sob o controle de um ou mais promotores capazes de funcio-namento em plantas.

O seguinte explica a presente invenção em detalhes.

Ácido Hialurônico Sintase

Na presente invenção, células vegetais ou plantas são transfor-madas usando DNA codificando uma proteína com atividade de ácido hialu-rônico sintase e DNA codificando uma proteína com atividade de nucleotídeode açúcar sintase sob o controle de um ou mais promotores capazes de fun-cionamento em plantas.

Na presente invenção, uma proteína com atividade de ácido hia-lurônico sintase sintetiza ácido hialurônico usando ácido UDP-glucurônico eUDP-N-acetilglucosamina como substratos. O ácido hialurônico tem umaestrutura polimérica consistindo em unidades repetidas de ácido glucurônicoe N-acetilglucosamina.

Na presente invenção, uma proteína com atividade de ácido hia-lurônico sintase, uma vez que a proteína tenha a natureza mencionada aci-ma, não é particularmente limitada. Pode ser usada ácido hialurônico sintase(nas partes que se seguem ocasionalmente abreviada como HAS) derivadade animais, micro-organismos, vírus e semelhantes. Particularmente, podeser usada ácido hialurônico sintase derivada de vertebrados tais como hu-manos, camundongos, coelhos, galinhas, gado e Xenopus laevis, micro-organismos tais como Streptococcus e Pasteurella, vírus tais como vírus c-hlorella e semelhantes.

Mais especificamente, exemplos da proteína com atividade deácido hialurônico sintase são HAS (A98R) derivada de vírus chlorella PBCV-1; HAS1, HAS2 e HAS3 da ácido hialurônico sintase (hHAS) derivada dehumanos; HAS1, HAS2 e HAS3 da ácido hialurônico sintase derivada decamundongo (mHAS); HAS1, HAS2 e HAS3 da ácido hialurônico sintasederivada de galinha (gHAS); HAS2 da ácido hialurônico sintase derivada derato (rHAS); HAS2 da ácido hialurônico sintase derivada de gado (bHAS);HAS1, HAS2 e HAS3 da da ácido hialurônico sintase derivada de Xenopuslaevis (xHAS); a ácido hialurônico sintase derivada de Pasteurella multocida(pmHAS); a da ácido hialurônico sintase derivada de Streptococcus pyoge-nes (spHAS); e o gene de ácido hialurônico sintase (seHAS) derivada deStreptococcus equisimilis. Há vários tipos de genes de ácido hialurônico sin-tase (HAS) tais como HAS1, HAS2 e HAS3, no entanto, o tipo não é particu-larmente limitado. Pode ser usado qualquer um dos HAS descritos acima,entre os quais o HAS derivado de vírus chlorella é preferencial, HAS deriva-do de vírus chlorella os quais são mostrados por uma proteína consistindoem uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 ou 4 émais preferencial.

A proteína consistindo em uma seqüência de aminoácidos re-presentada pela SEQ ID NO: 2 ou 4 pode ser uma proteína tendo um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, uma vez que aatividade de ácido hialurônico sintase não seja perdida. Por exemplo, a se-qüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 ou 4 pode ter umaeliminação de no mínimo um aminoácido, preferencialmente 1 a 10 aminoá-cidos, mais preferencialmente 1 a 5 aminoácidos, uma adição de no mínimoum aminoácido, preferencialmente 1 a 10 aminoácidos, mais preferencial-mente 1 a 5 aminoácidos, ou uma substituição de no mínimo um aminoáci-do, preferencialmente 1 a 10 aminoácidos, mais preferencialmente 1 a 5 a-minoácidos por outros aminoácidos. No entanto, mutações não estão Iimita-das às acima. As mutações referidas incluem mutações artificiais diferentesde mutações que ocorrem naturalmente. Por exemplo, é reportado que ácidohialurônico sintase derivada de Pasteurella multocida tem atividade de ácidohialurônico sintase mesmo se cerca de 270 aminoácidos no domínio ligado àmembrana putativo e o domínio transmembrana putativo forem eliminados(Jing et al., 2000, Glycobiology, 10, 883-889). O número de aminoácidos mu-tados não é limitado, uma vez que a atividade de ácido hialurônico sintasenão seja perdida. HAS pode ser uma proteína consistindo em uma parte daseqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 ou 4, tendo ati-vidade de ácido hialurônico sintase.

As atividades de ácido hialurônico sintase são determinadascomo se segue. Para a reação, as amostras são incubadas em 0,2 ml detampão Tris-HCI a 50 mM (pH 7,0) contendo ditiotreitol a 1 mM, cloreto demagnésio a 20 mM, etileno glicol bis (éter b-aminoetílico)-N,N,N,N-tetra-acético ácido a 1 mM, 15% de glicerol, ácido uridina-5'-difosfoglucurônico a0,5 mM (nas partes que se seguem abreviado como UDP-GIcA), uridina-5'-difosfo-N-acetilglucosamina a 0,5 mM (nas partes que se seguem abreviadocomo UDP-GIcNAc abaixo), UDP-[14C]GlcA, 0,24 μΜ de UDP-[3H]GlcNAc a0,1 μΜ, e 125 μg de ácido glucurônico por 1 hora. Depois da incubação, areação é terminada por ebulição por 10 minutos. A mistura da reação é divi-dida em duas, 0,5 unidade de hialuronidase (Seikagaku Corporation) deriva-das de Streptococcus dysgalactiae é adicionada a uma das soluções, e emseguida incubada a 30°C por 4 horas. Em seguida a solução da reação éfervida por 10 minutos para inativar a hialuronidase. A mistura da reação éfracionada por 0,5 ml usando cromatografia de coluna de Superdex PeptideHR10/30 (produzido pela Amarsham Pharmacia Biotech Inc.) (elutriado: ace-tato de amônio a 0,2 M). Cada fração é medida por radioatividade. Em con-seqüência, a atividade de ácido hialurônico pode ser determinada a partir damistura da reação da amostra com base nas quantidades de produtos debaixo peso molecular digeridos pela hialuronidase.

A atividade de ácido hialurônico sintase também pode ser deter-minada usando o método de sanduíche, no qual o ácido hialurônico produzi-do é medido usando proteínas de ligação de ácido hialurônico.

De acordo com a presente invenção, o DNA codificando umaproteína com ácido hialurônico sintase e é DNA codificando uma proteínaque sintetiza ácido hialurônico a partir de ácido UDP-glucurônico e UDP-N-acetilglucosamina como substratos, em que o ácido hialurônico tem umaestrutura polimérica consistindo em unidades repetidas de ácido glucurônicoe N-acetilglucosamina.

De acordo com a presente invenção, o DNA codificando umaproteína com atividade de ácido hialurônico sintase, uma vez que a proteínatenha as propriedades mencionadas acima, não é particularmente limitada.Podem ser usados genes de ácido hialurônico sintase (nas partes que seseguem occasionalmente abreviados como HAS) derivados de animais, mi-cro-organjsmos, vírus e semelhantes. Por exemplo, pode ser usado o genede ácido hialurônico sintase derivado de vertebrados tais como humanos,camundongos, coelhos, galinhas, gado e Xenopus laevis, microorganismostais como Streptococcus e Pasteurella1 e vírus tais como vírus chlorella esemelhantes.

Mais especificamente, genes HAS (A98R) derivados de víruschlorella cepa PBCV-1; HAS1, HAS2 e HAS3 do gene de ácido hialurônicosintase derivado de humanos (hHAS); HAS1, HAS2 e HAS3 do gene de áci-do hialurônico sintase derivado de camundongo (mHAS); HAS1, HAS2 eHAS3 do gene de ácido hialurônico sintase derivado de galinha (gHAS);HAS2 do gene de ácido hialurônico sintase derivado de rato (rHAS) gene;HAS2 do gene de ácido hialurônico sintase derivado de gado (bHAS); HAS1,HAS2 e HAS3 do gene de ácido hialurônico sintase derivado de Xenopuslaevis (xHAS); o gene de ácido hialurônico sintase derivado de Pasteurellamultocida (pmHAS); o gene de ácido hialurônico sintase derivado de Strep-tococcus pyogenes (spHAS) gene; o gene de ácido hialurônico sintase (se-HAS) derivado de Streptococcus equisimilis e semelhantes são incluídos. Hávários tipos de genes de ácido hialurônico sintase (HAS) tais como HAS1,HAS2 e HAS3, no entanto, o tipo não é particularmente limitado.

Pode ser usado qualquer um dos HAS descritos acima, entre osquais o gene HAS derivado de vírus chlorella é preferencial, genes HAS de-rivados de vírus chlorella os quais são mostrados por DNA consistindo emuma seqüência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 1 ou 3 sãomais preferenciais.

O DNA pode ser DNA que hibridiza com DNA consistindo na se-quência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeos repre-sentada pela SEQ ID NO: 1 ou 3 sob condições estringentes, e codifica umaproteína com atividade de ácido hialurônico sintase.O termo "condições estringentes" acima significa condições nasquais somente uma seqüência de nucleotídeos codifica um polipeptídeo ten-do atividade de ácido hialurônico sintase que é equivalente à de ácido hialu-rônico sintase tendo uma seqüência de nucleotídeos representada pela SEQID NO: 1 ou 3 forma um híbrido com a seqüência particular (que é um híbri-do específico), ao passo que uma seqüência de nucleotídeos que cocificaum polipeptídeo tendo atividade não-equivalente não forma um híbrido coma seqüência particular (que é um híbrido não-específico). Pessoas versadasna técnica podem escolher facilmente as condições referidas alterando astemperaturas da reação de hibridização e lavagem, e as concentrações desais de soluções de reação de hibridização e soluções de lavagem, e seme-lhantes. Especificamente, um exemplo das condições estringentes da pre-sente invenção são as condições nas quais a hibridização é realizada em6*SSC (NaCI a 0,9 M, citrato trissódico a 0,09 M) ou 6xSSPE (NaCI a 3 M,NAH2PO4 a 0,2 M, EDTA · 2Na a 20 mM, pH 7,4) a 42°C, e lavagem adicio-nal é realizada usando 0,5*SSC a 42°C, no entanto, as condições estringen-tes não estão Iimitadsa a semelhantes condições.

As condições estringentesa são preferencialmente condiçõesaltamente estringentes. As condições altamente estringentes não são parti-cularmente limitadas, uma vez que um gene codificando A98R não hibridize.Por exemplo, as condições altamente estringentes são condições nas quaisé realizada lavagem em concentrações de sais equivalentes às de 0,1*SSCou 0,1% de SDS a 60 °C.

Nucleotídeo de Açúcar

Exemplos de nucleotídeos de açúcar úteis são UDP-N-acetilglu-cosamina, ácido UDP-glucurônico, UDP-N-acetilgalactosamina, UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-xilose, GDP-fucose, GDP-manose, ácidoCMP-neuramínico, e semelhantes, no entanto, o nucleotídeo de açúcar nãoestá limitado a estes. Entre estes nucleotídeos de açúcar, açúcar UDP é pre-ferencial, UDP-N-acetilglucosamina e ácido UDP-glucurônico são mais pre-ferenciais.

Melhorando os níveis de produção de semelhantes nucleotídeosde açúcar, as quantidades de ácido UDP-glucurônico e UDP-N-acetilglucosamina que são substratos para ácido hialurônico sintase sãoaumentadas em células vegetais ou plantas. Para melhorar os níveis de pro-dução de semelhante nucleotídeo de açúcar, uma enzima do caminho bios-sintético do nucleotídeo de açúcar, isto é, uma proteína com atividade denucleotídeo de açúcar sintase é introduzida em células vegetais ou plantas.

Além disso, na presente invenção, é visto que a introdução si-multânea de uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase emcélulas vegetais ou plantas possibilita aumento da síntese de ácido hialurô-nico usando o ácido UDP-glucurônico e UDP-N-acetilglucosamina aumenta-dos como substratos, em que o ácido hialurônico tem uma estrutura polimé-rica consistindo em unidades repetidas de ácido glucurônico e N-acetilglucosamina.

Enzimas Associadas com Caminho de Biossíntese de Nucleotídeos de Açú-çar

De acordo com a presente invenção, células vegetais ou plantassão transformadas com DNA codificando uma proteína com atividade de áci-do hialurônico sintase e DNA codificando uma proteína com atividade de nu-cleotídeo de açúcar sintase sob o controle de um ou mais promotores capa-zes de funcionamento em plantas.

Podem ser usadas proteínas com atividade de nucleotídeo deaçúcar sintase tais como UDP-N-acetilglucosamina, ácido UDP-glucurônico,UDP-N-acetilgalactosamina, UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-xilose,GDP-fucose, GDP-manose e ácido CMP-neuramínico. Proteínas tendo ativi-dade de sintase dirigida para, entre estes nucleotídeos de açúcar, UDP-N-acetilglucosamina, ácido UDP-glucurônico, UDP-N-acetilgalactosamina,UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-xilose são preferenciais. Proteínas tendoatividade de nucleotídeo de açúcar sintase dirigida para açúcares, UDP-N-acetilglucosamina e ácido UDP-glucurônico são mais preferenciais.

A proteína tendo atividade de nucleotídeo de açúcar sintase dapresente invenção pode ser uma enzima catalisando as reações que sãoassociadas com caminhos de biossíntese de nucleotídeo de açúcar. Exem-pios das enzimas são glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase, UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosamina mutase, glucosami-na-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1 -fosfato-N-acetiltransferase,fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase, hexoquinase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquinase, glucuronato-1-fosfato uridil transferase e semelhantes. No mínimo uma proteína selecio-nada entre o grupo consistindo em semelhantes proteínas com atividade denucleotídeo de açúcar sintase pode ser expressada em células vegetais ouplantas.

Como uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sin-tase, no mínimo glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase também podeser selecionada, e expressada em combinação com uma proteína tendo ou-tra atividade de nucleotídeo de açúcar sintase em células vegetais ou plan-tas. Exemplos de outras proteínas tendo atividade de nucleotídeo de açúcarsintase diferente de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase são no mí-nimo uma proteína de aminoácido selecionada entre o grupo consistindo emUDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosamina mutase, glu-cosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1-fosfato N-acetiltransferase, fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase, hexoqui-nase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1 -fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquinase,glucurônico ácido-1-fosfato uridil transferase e semelhantes.

Para obter os efeitos pretendidos da presente invenção, no mí-nimo, glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase é selecionada como umaproteína tendo a atividade de nucleotídeo de açúcar sintase, deste modo éobtido um efeito melhor do que o de métodos convencionais. Mais preferen-cialmente, tanto a glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase (nas partesque se seguem ocasionalmente abreviada como GFAT) e UDP-glucose de-sidrogenase (nas partes que se seguem ocasionalmente abreviada comoUGD) são selecionadas. O único uso de UDP-glucose desidrogenase tam-bém mostra efeitos mais reforçados do que o de métodos convencionais.Glutamina: Frutose-6-Fosfato Amidotransferase

A proteína tendo atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amido-transferase da presente invenção é uma proteína que sintetiza glucosamina-6-fosfato a partir de L-glutamina e frutose-6-fosfato como substratos.

A proteína tendo atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amido-transferase da presente invenção, uma vez que a proteína tenha a naturezamencionada acima, não é particularmente limitada. Exemplos de semelhan-tes proteínas são GFAT derivadas de eucariotas, procariotas, vírus e seme-lhantes. Podem ser usadas GFAT derivadas de eucariotas tais como huma-nos, camundongos, milhos, Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans eSaccharomyces eerevisiae, GFAT derivadas de procariotas tais como Baeil-lus subtiiis e Eseheriehia eoli, e GFAT derivadas de vírus tais como chlorellavírus, no entanto, a proteína não é limitada a estas.

A GFAT acima pode ser usada preferencialmente, entre as quaisa GFAT derivada de vírus chlorella ou Arabidopsis thaliana é mais preferen-cial. A GFAT derivada de vírus chlorella apresentada por uma proteína con-sistindo na seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6 ou8, e a GFAT derivada de Arabidopsis thaliana apresentada por uma proteínaconsistindo em uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID

NO: 10 são especialmente preferenciais.

A proteína também pode ser uma proteína consistindo na se-qüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6, 8 ou 10, ou a pro-teína com um ou uns poucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adi-cionados a sua seqüência de aminoácidos uma vez que a atividade de glu-tamina:frutose-6-fosfato amidotransferase não seja perdida. Por exemplo, aseqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6, 8 ou 10 podeter uma eliminação de no mínimo um aminoácido, preferencialmente 1 a 10aminoácidos, e mais preferencialmente 1 a 5 aminoácidos. A seqüência deaminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6, 8 ou 10 pode ter uma adiçãode no mínimo um aminoácido, preferencialmente 1 a 10 aminoácidos, maispreferencialmente 1 a 5 aminoácidos. A seqüência de aminoácidos represen-tada pela SEQ ID NO: 6, 8 ou 10 pode ter uma substituição de no mínimoum aminoácido, preferencialmente 1 a 10 aminoácidos, mais preferencial-mente 1 a 5 aminoácidos, e mais preferencialmente 1 a 5 aminoácidos, comoutros aminoácidos. No entanto, mutações não estão limitadas aos exem-plos mencionados acima. As referidas mutações incluem mutações artificiaisdiferentes de mutações que ocorrem naturalmente. O número de aminoáci-dos mutados, uma vez que a atividade de GFAT não seja perdida, não é par-ticularmente limitado. Um exemplo de mutações que ocorrem naturalmente éo GFAT derivado de vírus chlorella cepa Hirosaki e tendo uma seqüência deSEQ ID NO: 5 que diverge da GFAT conhecida de vírus chlorella cepaPBCV-1 e K2I no mínimo por 2% em suas seqüências de aminoácidos devi-do a mutação. A proteína pode ser uma proteína tendo uma parte da se-qüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6, 8 ou 10, e tendoatividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase.

A atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase po-de ser avaliada adicionando a solução enzimática à mistura da reação (pH7,0) contendo frutose-6-fosfato (15 mM), L-glutamina (15 mM), EDTA (1mM), DTT (1 mM) e KH2PO4 (60 mM), e em seguida incubando a 37°C poruns poucos horas, e subseqüentemente medindo a quantidade de glucosa-mina-6-fosfato ou ácido glutâmico produzido. Especificamente, exemplosdos métodos são o método de Reissig (J.Biol.Chem, 1955, 217(2), 959-66),o qual é uma versão modificada do método de Morgan & Elson para medirglucosamina-6-fosfato; análise enzimática (J Biochem Biophys Methods,2004, 59(3), 201-8) para medir ácido glutâmico usando ácido glutâmico de-sidrogenase; e semelhantes.

DNA codificando uma proteína com atividade de glutami-na:frutose-6-fosfato amidotransferase da presente invenção é DNA codifi-cando uma proteína que tem atividade enzimática para sintetizar glucosami-na-6-fosfato a partir de L-glutamina e frutose-6-fosfato como substratos.

DNA codificando uma proteína com atividade de glutami-na:frutose-6-fosfato amidotransferase da presente invenção, uma vez que asproteínas tenham as propriedades mencionadas acima, não é particularmen-te limitado. Exemplos de semelhantes genes GFAT são genes GFAT deriva-dos de eucariotas, procariotas, vírus e semelhantes. Podem ser usados ge-nes GFAT derivados de eucariotas tais como humanos, camundongos, mi-lhos, Arabidopsis thaiiana, Caenorhabditis eiegans e Saccharomyces cerevi-siae, genes GFAT derivados de procariotas tais como Bacillus subtilis e Es-cherichia coli, genes GFAT derivados de vírus tais como vírus chlorella esemelhantes. Há vários tipos de genes GFAT tais como GFAT1 e GFAT2, noentanto, o tipo não é particularmente limitado.

Os genes GFAT descritos acima podem ser usados preferenci-almente, entre os quais o gene GFAT derivado de Chlorella vírus ou derivadode Arabidopsis thaiiana é mais preferencial. O gene GFAT derivado de Chlo-rella vírus e consistindo na seqüência de nucleotídeos representada pelaSEQ ID NO: 5 ou 7, ou o gene GFAT derivado de Arabidopsis thaiiana e con-sistindo na seqüência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 9 éespecialmente preferencial.

O DNA também pode ser DNA hibridizando com uma seqüênciade nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeos representadapela SEQ ID NO: 5, 7 ou 9 sob condições estringentes, e codificando umaproteína com atividade de GFAT.

O termo "condições estringentes" acima significa condições nasquais somente uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeocom uma atividade de glutamina: frutose-6-fosfato amidotransferase equiva-lente à atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase represen-tada pela SEQ ID NO: 5, 7 ou 9 forma um híbrido com a seqüência particular(isto é, um híbrido específico), ao passo que uma seqüência de nucleotídeoscodificando um polipeptídeo com atividade não-equivalente forma um híbridocom a particular seqüência (isto é, um híbrido não-específico). Pessoas ver-sadas na técnica podem escolher facilmente as condições referidas alteran-do as temperaturas para a reação de hibridização e lavagem, concentraçõesde sal de soluções de reação de hibridização e soluções de lavagem, e se-melhantes. Um exemplo das condições estringentes da presente invençãosão condições nas quais é realizada hibridização usando 6*SSC (NaCIa a0,9 M, citrato trissódico a 0,09 M) ou 6*SSPE (NaCI a 3M, NAH2PO4 a 0,2Μ, EDTA · 2Na a 20 mM, pH 7,4) a 42°C, e subseqüentemente é realizadalavagem usando 0,5*SSC a 42°C, no entanto, as condições estringentesnão são limitadas a estas.

As condições estringentes são preferencialmente condições al-tamente estringentes. As "condições altamente estringentes" são, por exem-plo, condições nas quais é realizada lavagem em concentrações de sal equi-valentes às de 0,1 xSSC e 0,1 % de SDS a 60°C.

UDP-GIucose Deidrogenase

A proteína tendo atividade de UDP-glucose desidrogenase dapresente invenção pode ser uma proteína que sintetiza ácido UDP-glucurônico a partir de UDP-glucose como um substrato.

A proteína tendo atividade de UDP-glucose desidrogenase dapresente invenção, uma vez que a proteína tenha a natureza mencionadaacima, não é particularmente limitada. Exemplos das proteínas são UGDderivado de eucariotas, procariotas, vírus e semelhantes. Pode ser usadoUGD derivado de eucariotas tais como UGD derivado de humanos, gado,camundongos, choupos, canas-de-açúcar e Arabidopsis thaliana, UGD deri-vado de procariotas tais como Escherichia coli, Pasteurella multocida e Lac-tobacillus lactis, e UGD derivado de vírus tal como chlorella vírus, no entan-to, a proteína da invenção não é limitada a estes.

O UGD descrito acima pode ser usado preferencialmente, entreos quais UGD derivado de vírus chlorella ou Arabidopsis thaliana é mais pre-ferencial. UGD derivado de vírus chlorella e mostrado por uma proteína con-sistindo em uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:12 ou 14, ou UGD derivado de Arabidopsis thaliana mostrado por uma prote-ína consistindo em uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQID NO: 16, 18, 20 ou 22 é particularmente preferencial.

A proteína pode ser uma proteína consistindo na seqüência deaminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20, ou 22, ouuma proteína tendo uma mutação tal como uma eliminação de um ou unspoucos aminoácidos, uma substituição, ou uma adição uma vez que a ativi-dade de UDP-glucose desidrogenase não seja perdida. Por exemplo, a se-quência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20,ou 22 pode ter uma eliminação de no mínimo um aminoácido, preferencial-mente 1 a 10 aminoácidos, e mais preferencialmente 1 a 5 aminoácidos. Aseqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20,ou 22 pode ter uma adição de no mínimo um aminoácido, preferencialmente1 a 10 aminoácidos, e mais preferencialmente 1 a 5 aminoácidos. A seqüên-cia de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20, ou 22também pode ter uma substituição de no mínimo 1 aminoácido, preferenci-almente 1 a 10 aminoácidos, e mais preferencialmente 1 a 5 aminoácidospor outros aminoácidos. No entanto, as mutações não estão limitadas àsacima. As mutações referidas também incluem mutações artificiais diferentesde mutações que ocorrem naturalmente. O número de aminoácidos mutadosnão é particularmente limitado, uma vez que a atividade de UGD náo sejaperdida. A proteína também pode ser uma proteína tendo uma parte da se-quência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20,ou 22, e tendo UDP-glucose desidrogenase.

A atividade de UDP-glucose desidrogenase é avaliada adiciona-do a solução enzimática à mistura da reação (pH 8,0) contendo UDP-glucose (4 mM), NAD+ (1 mM), EDTA (1 mM) e Tris-HCI (20 mM), realizandoa reação a 37°C, e subseqüentemente medindo o ácido UDP-glucurônico ouNADH produzido. Especifiacamente, NADH pode ser medido de acordo como relatório de Tenhaken e Thulke (Plant Physiol. 1996, 112:1127-34).

O DNA codificando uma proteína com atividade de UDP-glucosedesidrogenase da presente invenção é DNA codificando uma proteína quetem atividade enzimática para sintetizar ácido UDP-glucurônico a partir deUDP-glucose como um substrato.

O DNA codificando uma proteína com atividade de UDP-glucosedesidrogenase da presente invenção, uma vez que a proteína tenha a natu-reza mencionada acima, não é particularmente limitado. Exemplos do DNAsão genes UGD derivados de eucariotas, procariotas, vírus e semelhantes.Podem ser usados genes UGD derivados de eucariotas tais como humanos,gado, camundongos, choupos, canas-de-açúcar e Arabidopsis thaliana, ge-nes UGD derivados de procariotas tais como Escherichia coli, Pasteurellamultocida e Lactobacillus lactis, e genes UGD derivados de vírus tais comovírus chlorella e semelhantes, no entanto, os genes UGD não estão limitadosa estes.

Os genes UGD descritos acima podem ser usados preferencial-mente, entre os quais gene UGD derivado de vírus chlorella ou Arabidopsisthaliana é mais preferencial, gene UGD derivado de vírus chlorella e tendouma seqüência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 11, ou 13 ougene UGD derivado de Arabidopsis thaliana tendo uma seqüência de nu-cleotídeos representada pela SEQ ID NO: 15, 17, 19 ou 21 é particularmentepreferencial.

O DNA pode ser DNA hibridizando com DNA consistindo emuma seqüência de nucleotídeos complementar às seqüências de nucleotí-deos representada pela SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, ou 21 sob condiçõesestringentes, e codificando uma proteína com atividade de UDP-glucose de-sidrogenase.

As "condições estringentes" descritas acima são condições nasquais somente uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeocom a atividade equivalente à de UDP-glucose desidrogenase representadapela SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, ou 21 forma um híbrido particular com aseqüência particular (isto é, um híbrido específico), ao passo que uma se-qüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo com atividade não-equivalente não forma um híbrido com a seqüência particular (isto é, um hí-brido não-específico). Pessoas versadas na técnica podem facilmente esco-Iher as condições referidas alterando as temperaturas para reação de hibri-dização e lavagem, ajustando as concentrações de sal das soluções da rea-ção de hibridização e soluções de lavagem, e semelhantes. Um exemplo decondições estringentes são condições nas quais a hibridização é realizadausando 6*SSC (NaCI a 0,9 M, citrato trissódico a 0,09 M) ou 6*SSPE (NaCIa 3 M, NAH2PO4 a 0,2 M, EDTA a 20 mM) · 2Na, pH7,4) a 42°C, e em se-guida é realizada lavagem usando 0,5*SSC. No entanto, as condições es-tringentes não estão limitadas a estas.As condições estringentes são preferencialmente condições al-tamente estringentes. Condições altamente estringentes são, por exemplo,condições nas quais lavagem é realizada em concentrações de sal equiva-lentes às de 0,1 xSSC ou 0,1 % de SDS a 60°C.

Um Vetor de Expressão Recombinante e Transformação

Células vegetais transgênicas ou plantas transgênicas capazesde produzir ácido hialurônico, progênies, ou órgãos ou tecidos das mesmastendo a mesma natureza das mesmas podem ser obtidas transformandohospedeiros usando um vetor de expressão recombinante. Vetor de expres-são recombinante contém DNA codificando uma proteína com atividade deácido hialurônico sintase e DNA codificando uma proteína com atividade denucleotídeo de açúcar sintase sob o controle de um ou mais promotores ca-pazes de funcionamento em plantas.

Uma proteína tendo atividade de ácido hialurônico sintase e umaproteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase são expressadasnas células de plantas transgênicas ou nas plantas transgênicas acima, asprogênies, ou os órgãos ou os tecidos das mesmas tendo a mesma naturezadas mesmas.

"Uma proteína exógena com atividade de nucleotídeo de açúcarsintase" é, ao contrário de uma proteína endógena, uma proteína estranhatendo atividade de nucleotídeo de açúcar sintase e sendo introduzida recen-temente em células vegetais ou plantas de fora. Um exemplo de um métodopara "introduzir recentemente um gene semelhante de fora" inclui transfor-mação usando um vetor de expressão recombinante e semelhantes. "Intro-duzir recentemente um gene de fora" inclui transformar um gene endógenode fora da célula usando um vetor de expressão recombinante. Uma vez quenão foram encontradas proteínas com atividade de ácido hialurônico sintaseem células vegetais e plantas, é óbvio que a proteína é exógena sem a des-crição.

As células de plantas transgênicas ou plantas transgênicas aci-ma, as progênies, ou os órgãos ou tecidos das mesmas tendo a mesma na-tureza das mesmas possibilitam alto nível de produção de ácido hialurônico.Isto é demonstrado abaixo.

Na presente invenção, os hospedeiros significam quaisquerplantas inteiras, sementes, órgãos de plantas (por exemplo, pétalas, raízes,caules, tuberosidades de caules, folhas, órgãos florais, raízes tuberosas,sementes, ápices dos brotos e semelhantes), tecidos de plantas (por exem-plo, epiderme, floema, tecidos moles, xilema, feixes vasculares e semelhan-tes), ou células vegetais cultivadas.

Na presente especificação, plantas significam quaisquer plantasmulticelulares inclusive espermatófitos, gimnospermas, pteridófitos, briófitos,líquens e semelhantes, e incluem quaisquer plantas inteiras, sementes, ór-gãos de plantas (por exemplo, pétalas, raízes, caules, tuberosidades de cau-les, folhas, órgãos florais, raízes tuberosas, sementes, ápices dos brotos esemelhantes), tecidos de plantas (por exemplo, epiderme, floema, tecidosmoles, xilema, feixes vasculares e semelhantes), ou células vegetais cultivadas.

Também pode ser produzido ácido hialurônico deste modo culti-vando os transformantes resultantes da transformação, e isolando o ácidohialurônico produzido desse modo.

Vetores que são usados de modo geral para produzir células deplantas transgênicas ou plantas transgênicas podem ser usadas como veto-res de expressão recombinantes.

Os vetores referidos não são particularmente limitados uma vezque os vetores compreendam uma seqüência de promotor capaz de sertranscrida em células vegetais e um sítio de poliadenilação requerido paraestabilização de transcriptos. Por exemplo, podem ser usados vetores taiscomo "ρΒΙ121, "pBI221", "ρΒΙ101" e "plG121Hm".

Quando células vegetais cultivadas são usadas como hospedei-ros, a transformação pode ser realizada introduzindo um vetor de expressãorecombinante para produzir ácido hialurônico em células vegetais cultivadaspelo método de eletroporação, o método do vetor binário de Agrobacteriumou o método de Bombardeamento de Partículas. Vetor inclui DNA codifican-do uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase e DNA codifi-cando uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase coloca-do sob o controle de um ou mais promotores capazes de funcionamento emplantas. As células vegetais nas quais o vetor de expressão foi introduzidosão, por exemplo, selecionadas com base na resistência a antibióticos taiscomo canamicina e semelhantes. As células vegetais transformadas podemser usadsa para cultura celular, cultura de tecido e cultura de órgãos. Tam-bém é possível regenerar plantas usando um método de cultura de tecidovegetal previamente conhecido.

Exemplos de células vegetais submetidas à transformação in-cluem células BY-2 e células T-13 derivadas de tabaco, células kurodagosunderivadas de cenouras, células VR e células VW derivadas de uvas, célulasPAR, células PAP e células PAW derivadas de Phytolacca americana L., cé-lulas T87 derivadas de Arabidopsis thaliana, células Asp-86, células A. per,células A. pas e células A. pio derivadas de aspargos, células Cba-1 deriva-das de melancias, células Sly-1 derivadas de tomates, células 1-Mar deriva-das de hortelã-pimenta, células CRA e células V208 derivadas de pervincasde Madagascar, células Spi-WT, células Spi-l-1 e células Spi-12F derivadasdo espinafre, células Lcy-1, células LcyD6 e células LcyD7 derivadas de cu-curbitáceas, células OS-1 derivadas de Oryza sativa, células Vma-1 deriva-das de Vinca rosea, células PSB, células PSW e células PSG derivadas degergelim, e células ZE3 derivadas de Zinnia elegans.

Quando células vegetais cultivadas são usadas como hospedei-ros, é realizada transformação introduzindo um vetor de expressão recombi-nante para produzir ácido hialurônico na planta pelo método do vetor bináriode Agrobacterium, o método de Bombardeamento de Partículas ou o métodode eletroporação em protoplastos, onde o vetor inclui DNA codificando umaproteína com atividade de ácido hialurônico sintase e DNA codificando umaproteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase sob o controle deum ou mais promotores capazes de funcionamento em plantas, e em segui-da isolando os tecidos tumorais, brotos, raízes filamentosas e semelhantesresultantes da transformação.

Tecidos tumorais, brotos, raízes filamentosas e semelhantes ob-tidos conforme descrito acima podem ser usados diretamente para culturacelular, cultura de tecido ou cultura de órgãos. Estes transformantes tambémpodem ser regenerados em plantas por métodos de cultura de tecido deplantas previamente conhecidos, aplicando hormônios vegetais em concen-trações apropriadas e semelhantes.

Para regenerar uma planta de uma célula na qual foi introduzidoum gene de ácido hialurônico sintase, uma célula vegetal semelhante podeser cultivada sobre um meio de regeneração, um meio MS livre de hormô-nios ou semelhante. O enraizamento da planta jovem resultante pode serplantado no solo e cultivado. Os métodos para regeneração diferem depen-dendo do tipo de célula vegetal, mas é possível usar um método previamen-te conhecido para plantar cultura de tecido.

Por exemplo, o método de Fujimura et al. (Fujimura et al. (1955),Plant Tissue Culture Lett., Vol. 2: p. 74) pode ser usado para Oryza sativa, ométodo de Shillito et al. (Shillito et al. (1989), Bio/Technology, Vol. 7: p. 581,e Gorden-Kamm (1990), Plant Cell, 2, 603) pode ser usado para milho, e ométodo de Visser et al. (Visser et al. (1989), Theor. Appl. Genet, Vol. 78: ρ589) pode ser usado para batatas. O método de Nagata et al. (Nagata et al.(1971), Planta 99, 12) pode ser usado para tabaco, e o método de Akama et120 al. (Akama et al. (1992), Plant Cell Rep., Vol. 12: p. 7) pode ser usado paraArabidopsis thaliana.

Plantas produzidas por semelhantes métodos, ou as progênies;por exemplo, plantas regeneradas de sementes, tuberosidades de caules,mudas e semelhantes) tendo a mesma natureza das mesmas, também sãoobjetos da presente invenção.

De modo a produzir uma proteína com atividade de ácido hialu-rônico sintase e uma proteína tendo atividade para sintetizar nucleotídeo deaçúcar em plantas, e adicionalmente para produzir e acumular ou secretarácido hialurônico, DNA codificando uma proteína com atividade de ácido hia-lurônico sintase e DNA codificando uma proteína com atividade de nucleotí-deo de açúcar sintase são preferencialmente colocados sob o controle deum ou mais promotores capazes de funcionamento em plantas, de modoque o DNA é especificamente expressado nos tecidos ou órgãos desejados.

Para a expressão ser controlada deste modo, um promotor teci-do-específico ou um promotor órgão-específico pode ser adicionalmente in-serido em um vetor de expressão recombinante.

Se ao invés for usado um promotor de estágio específico, umgene-alvo pode ser expressado somente durante um período em particular.Portanto, a produtividade pode ser aprimorada somente durante o períodoem particular. Por exemplo, o uso de um promotor específico do estágio ve-getativo melhora a produtividade somente durante o estágio vegetativo.

Exemplos de promotores órgão-específicos são promotores es-pecíficos de raízes, promotores específicos de tubérculos, promotores espe-cíficos de folhas, promotores específicos de sementes, promotores específi-cos de caules e semelhantes.

Exemplos de promotores tecido-específicos são promotores es-pecíficos de tecidos verdes e semelhantes.

Mais especificamente, promotores úteis incluem promotoresconstitutivamente de alta expressão tais como um promotor CaMV35S, oqual é um promotor do RNA do vírus do mosaico da couve-flor 35S, e seme-lhantes. Promotores específicos de tecidos verdes incluem, por exemplo, umpromotor rbs para um gene codificando a proteína de pequena subunidadede ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase, um promotor CAB para um gene codi-ficando a proteína de ligação de clorofila a/b, e um promotor GapA para umgene codificando a proteína de subunidade A de gliceraldeído-3-fosfato desi-drogenase. Promotores específicos de sementes incluem um promotor LOXdo gene da lipoxigenase, um promotor Psl do gene da lectina, um promotorAmyIA do gene da amilase, e semelhantes. Promotores específicos de raí-zes incluem um promotor A6H6H do gene da hiosciamina 6b-hidroxilase, umpromotor PMT da putrescina N-metiltransferase, e semelhantes. Promotoresespecíficos para caule incluem um promotor Sus4 da sucrose sintase, umpromotor de patatina para um gene codificando a glicoproteína, e semelhantes.

Também é concebível controlar a expressão de DNA codificandouma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase e DNA codificandouma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase usando umpromotor induítvel. Exemplos dos promotores de indução são descritos abaixo.

Exemplos de promotores indutíveis incluem um PR1a promotor,o qual é um promotor de um gene relacionado com resistência a doença cujonível de expressão é reforçado por lesão ou uma adição de ácido salicílico, eum rd29A promotor cujo nível de expressião é reforçado por secagem, baixatemperatura, alta concentração de sal, adição de ácido abscísico e seme-lhantes. Exemplos de promotores cuja expressão é induzida por compostosusados como químicos agrícolas incluem um GST-27 promotor para um ge-ne codificando uma subunidade de proteína de 27 KDa de glutation-S-transferase e é induzido por protetores de herbicida, um promotor de quina-se e alguns PR promotores para genes sendo induzidos por éster S-metílicode ácido benzo(1,2,3)-tiadiazol-7-carbotióico (BTH). Além disso, de modo aexpressar de modo mais estável DNA codificando uma proteína com ativida-de de ácido hialurônico sintase e DNA codificando uma proteína com ativi-dade de nucleotídeo de açúcar sintase em células vegetais, podem ser utili-zados isolantes, um peptídeo de sinal pode ser adicionado para localizar auma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase e uma proteína comatividade de nucleotídeo de açúcar sintase em uma organela-alvo, uma partede ácido hialurônico sintase pode ser substituída ou eliminada, e semelhantes.

As plantas submetidas a transformação incluem quaisquer plan-tas nas quais é possível transferência de gene.

As plantas ou os os corpos das plantas da presente invençãoincluem monocotiledôneas e dicotiledôneas de angiospermas, e gimnosper-mas. As plantas referidas incluem opcionalmente plantas úteis, particular-mente plantas de colheitas, plantas de vegetais, plantas de flores e plantaslenhosas.

As plantas ou os corpos das plantas da presente invenção tam-bém incluem pteridófitos e briófitas.Exemplos de espécies de plantas úteis na presente invençãoespecificamente incluem plantas pertencentes às famílias das Solanáceas,Gramíneas, Crucíferas, Rosáceas, Leguminosas, Cucurbitáceas, Labiadas,Liliáceas, Quenopodiáceas, Umbeliferas1 Mirtáceas, Convolvuláceas, e se-melhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Solanáceas incluem asplantas pertencentes ao gênero Nicotiana, Solanum1 Datura, Lycopersion ouPetunia1 e, por exemplo, incluem tabaco, berinjelas, batatas, tomates, chilipeppers, petúnias e semelhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Gramíneas incluem asplantas pertencentes ao gênero Oryza1 Hordeum, Secale, Saccharum1 Echi-nochloa ou Zea, e, por exemplo, incluem Oryza sativa, cevada, centeio, pilri-teiro (cockspur), sorgos, milho, cana-de-açúcar e semelhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Crucíferas incluem asplantas pertencentes ao gênero Raphanus, Brassica1 Arabidopsis, Wasabiaou Capsella, e, por exemplo, incluem rabanete japonês (Raphanus sativuslongipinnatus), colza, Arabidopsis thaliana, rábano silvestre japonês, She-pherd's Purse e semelhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Rosáceas incluem asplantas pertencentes ao gênero Orunus, Malus1 Pynus1 Fragaria ou Rosa1 e,por exemplo, incluem damascos japoneses, pêssegos, maçãs, peras, mo-rango, rosas e semelhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Leguminosas incluem asplantas pertencentes ao gênero Glycinia1 Vigna, Phaseolus, Pisum, Vicia,Arachis, Trifolium1 Alfalfa ou Medicago1 e, por exemplo, incluem feijões-soja,feijões azuki, feijões-manteiga, ervilhas, favas, amendoins, trevos e seme-lhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Cucurbitáceas incluem asplantas pertencentes ao gênero Luffa, Cucurbita ou Cucumis1 e, por exem-pio, incluem cucurbitáceas, abóboras-morangas, pepino, melões e seme-lhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Labiadas incluem as plan-tas pertencentes ao gênero Lavadula, Mentha ou Perilla1 e, por exemplo,incluem lavanda, menta, manjericão japonês e semelhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Liliáceas incluem as plan-tas pertencentes ao gênero Allium, Lilium ou Tulipa, e, por exemplo, incluemcebolas galesas, alho, lírios, tulipas e semelhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Quenopodiáceas incluemas plantas pertencentes ao gênero Spinacia, e, por exemplo, incluem beter-rabas, espinafre e semelhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Umbelíferas incluem asplantas pertencentes ao gênero Angélica, Daucus, Cryptotaenia ou Apitum,e, por exemplo, incluem shishiudos, cenouras, ceratófilos, aipos e semelhantes.

Exemplos de plantas pertencentes às Convolvuláceas incluemas plantas pertencentes ao gênero Ipomoea, e, por exemplo, incluem bata-tas-doces e semelhantes.

As progênies tendo a mesma natureza que as plantas transgêni-cas acima, ou os órgãos ou tecidos das mesmas também são os objetos dapresente invenção.

As células de plantas transgênicas as quais produzem uma pro-teína com atividade de ácido hialurônico sintase e uma proteína tendo umaatividade de nucleotídeo de açúcar sintase são incluídas na presente inven-ção. As plantas transgênicas as quais produzem uma proteína tendo ativida-de de ácido hialurônico sintase e uma proteína tendo atividade de nucleotí-deo de açúcar sintase, as progênies tendo a mesma natureza das mesmas,ou os órgãos ou tecidos das mesmas, também são incluídos.

Extração de Ácido Hialurônico

Abaixo está um exemplo de métodos para isolar ou obter ácidohialurônico por coexpressão de uma proteína com atividade de ácido hialu-rônico sintase e uma proteína exógena tendo uma atividade de sintetizar onucleotídeo de açúcar, e extrair ácido hialurônico das células de plantastransgênicas ou das plantas transgênicas que adquiriram a capacidade paraproduzir ácido hialurônico, progênies, ou os órgãos ou tecidos das mesmastendo a mesma natureza das mesmas.

As células de plantas transgênicas ou as plantas transgênicassão cultivadas ou desenvolvidas, o ácido hialurônico é produzido, e subse-qüentemente, o ácido hialurônico é opcionalmente extraído das células deplantas transgênicas ou das plantas transgênicas por um método conhecido.

Os extratos são verificados para ácido hialurônico.

Por exemplo, as plantas transgênicas, as progênies tendo amesma natureza das mesmas, os órgãos ou os tecidos das mesmas, ousemelhantes podem ser subseqüentemente secos, triturados e em seguidaextraídos por um solvente orgânico apropriado. O extrato contendo o ácidohialurônico é filtrado, e é obtido um filtrado contendo ácido hialurônico e ne-nhuma célula vegetal. Este filtrado é purificado por diafiltração para removerimpurezas de baixo peso molecular. É possível separar o ácido hialurônicopela diafiltração do filtrado contendo ácido hialurônico dissolvido com águapura seguida por descartando continuamente o filtrado. Quando ácido hialu-rônico é usado em produtos farmacêuticos, pode ser adicionalmente realiza-da uma etapa de precipitação de ácidos nucléicos da solução. Esta etapapode ser realizada, por exemplo, adicionando tensoativo de cátion tal comocompostos de amônio quaternário de cloreto de cetilpiridínio.

Ácido hialurônico acumulado nas células vegetais transformadastambém pode ser purificado por métodos conhecidos para a separação.

Uso de Ácido Hialurônico

Ácido hialurônico adquirido pela presente invenção pode ser uti-lizado de modo útil para composições cosméticas e farmacêuticas, ou bio-materiais. Especificamente, ácido hialurônico pode ser usado como umacomposição umidificante em cosméticos, um agente terapêutico para artrite,reumatismo crônico, queimaduras e cortes, ou um componente em gotasoculares.

Ácido hialurônico obtido pelo método de produção da presenteinvenção pode ser usado como um agente ativo para preparar composiçõescosméticas. Por exemplo, ácido hialurônico pode ser aplicado em formaslíquidas tais como soluções aquosas, soluções de óleo, emulsões e suspen-sões, em formas semi-sólidas tais como géis e cremes, e em formas sólidastais como pós, grânulos, cápsulas, microcápsulas e sólidos. Ácido hialurôni-co pode ser preparado nestas formas usando métodos conhecidos, e prepa-rados na formulação de loções, emulsões, géis, cremes, pomadas, emplas-tros, cataplasmas, aerossóis, supositórios, injeções, pós, grânulos, compri-midos, pílulas, xaropes, trociscos e semelhantes. As formulações referidaspodem ser aplicadas por aplicação, por fixação, pulverizando, ingestão esemelhantes. Particularmente entre estas formulações, loções, emulsões,cremes, pomadas, emplastros, cataplasmas, aerossóis e semelhantes sãoadequados para aplicações na pele. Para cosméticos, ácido hialurônico po-de ser usado para cosméticos para tratamento da pele tais como loções, so-ros, emulsões, cremes e máscaras, cosméticos para maquilagem tais comoloções de base de maquilagem, cremes de maquilagem, bases em emul-sões, formas de creme e unguento, batons, sombras para os olhos e blu-shes, cosméticos para tratamento corporal tais como cremes para as mãos,cremes para as pernas, loções para o corpo e semelhantes, essências parabanho, cosméticos para tratamento oral e cosméticos para tratamento doscabelos. Ácido hialurônico pode ser produazido em semelhantes formula-ções de acordo com o método geral para fabricar cosméticos.

Exemplos

Os seguintes Exemplos ilustram a presente invenção em deta-lhes adicionais, mas não se pretende que limitem o âmbito da invenção.

Exemplo 1 Isolamento do Gene UGD derivado de Arabidopsis thaliana

Um gene de UDP-glucose desidrogenase (BT006380:AtUGD1,SEQ ID NO: 15) foi isolado de Arabidopsis thaliana e foi demonstrado quetem atividade (Plant J. 2000 21(6):537-46). Adicionalmente, o banco de da-dos NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) mostra três tipos degenes derivados de Arabidopsis thaliana que são previstos para codificarUGD (AF424576:AtUGD2 (SEQ ID NO: 17), AY056200:AtUGD3 (SEQ IDNO: 19), e AY070758:AtUGD4 (SEQ ID NO: 21)). Estes quatro tiipos de ge-nes UGD foram clonados para confirmar sua atividade de UGD.

RNA foi extraído de Arabidopsis thaliana de acordo com o proto-colo RNeasy (QIAGEN). Para uma reação de transcrição reversa, 2 μς deRNA total foi dissolvido em 5,5 μΙ_ de água estéril, misturado com 1 μΙ_ oligoiniciador d(T) 10 μΜ, e termicamente desnaturado a 70°C por 10 minutos.Depois de rápido esfriamento, a reação de transcrição reversa foi realizadausando um kit ReverTraAce (Toyobo), a 42°C por 30 minutos e a 99°C por 5minutos.

Para amplificação por PCR dos genes UGD derivados de Arabi-dopsis thaliana, foram designados iniciadores de PCR com base nas quatroseqüências de nucleotídeos no banco de dados. Sítios de clivagem de enzi-ma de restrição que são necessários para introdução no vetor de expressãopMAL-c2 (NewEngIand Biolab) foram adicionados aos iniciadores. EcoRI ouHindlll (SEQ ID NO: 23 ou 24) foram adicionados a AtUGDI; EcoRI ou Pstl(SEQ ID NO: 25 ou 26) a AtUGD2; EcoRI ou Pstl (SEQ ID NO: 27 ou 28) aAtUGD3; e EcoRI ou Xbal (SEQ ID NO: 29 ou 30) a AtUGD4. Foi realizadareação de PCR usando uma KOD -plus- DNA polimerase (Toyobo) e umprograma de reação de 1 ciclo de 94°C por 2 minutos, 3 ciclos de 94°C por15 segundos, 45°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto, e 30 ciclos de94°C por 15 segundos, 55°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto. Um mi-crolitro de produto de reação de transcrição reversa foi usado como modelode DNA. Uma análise por eletroforese por gel agarose apresentou bandasamplificadas por PCR com tamanho previsto. Cada fragmento amplificadopor PCR foi clivado com enzimas de restrição (AtUGDI: EcoRI e Hindlll; A-tUGD2 e AtUGD3: EcoRI e Pstl; AtUGD4: EcoRI e Xbal), e clonado empMAL-c2 digerido com as mesmas enzimas de restrição, usando LigationHigh (Toyobo). Usando a mistura da ligação, a cepa JM109 de Escherichiacoli foi transformada pelo método conhecido mencionado acima, e os trans-formantes foram aplicados a meio de ágar de Luria-Bertani (LB) (10 g/L debactotriptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de cloreto de sódio, 15 g/Lde ágar) contendo ampicilina (50 mg/mL), e cultivado de um dia para o outroa 37°C. O plasmídeo foi extraído das colônias cultivadas de transformantesusando um método conhecido. As seqüências de nucleotídeos dos fragmen-tos inseridos foram determinadas usando um sequenciador de DNA, e foiconfirmado que os genes amplificados foram aqueles representados pelaSEQ ID NOS: 15, 17, 19, e 21. Deste modo, foram construídos os plasmí-deos pMAL-c2/AtUGD1, pMAL-c2/AtUGD2, pMAL-c2/AtUGD3, e pMAL-c2/AtUGD4.

O acima demonstra que, além de AtUGDI, o qual já foi reporta-do, três tipos de genes UGD são expressados em Arabidopsis thaliana.

As cepas JM109 de Escherichia coii carregando os plasmídeosde expressão acima foram cultivadas de um dia para o outro em meio líquidoLB contendo ampicilina (50 mg/mL) a 37°C. Meio LB (30 ml) contendo ampi-cilina (50 mg/mL) e 0,2% de glucose foi inoculado com 300 μL da pré-culturae cultivado a 37°C por 2 horas. A temperatura foi em seguida reduzida para25°C, foi adicionado isopropil-b-tiogalactopiranosídeo (IPTG) em uma con-centração final de 0,3 mM, e foi induzida expressão das proteínas recombi-nantes por 24 horas.

As células foram recuperadas de 1 μL do meio de cultura porcentrifugação e rompidas por desintegração ultrassônica para preparar umextrato bruto. Proteínas de fusão MBP foram purificadas usando MagExtrac-tor-MBP- (Toyobo).

A figura 1 mostra a análise SDS-PAGE das proteínas de fusãoMBP expressadas. Uma banda do tamanho previsto foi observada em todasas soluções enzimáticas dos clones.

A atividade de UGD das proteínas de fusão MBP obtidas foi me-dida de acordo com o método reportado por Tenhaken e Thulke (Plant Phy-siol. 1996, 112:1127-34). No método, o aumento em NADH causado por rea-ção de UGD é detectado como um aumento em Abs340. Especificamente,15 μL da solução enzimática (proteína de fusão MBP-UGD) foi adicionado auma mistura de reação (pH 8.0) contendo UDP-glucose (4 mM), NAD+ (1mM), EDTA (1 mM), e Tris-HCI (20 mM); uma reação foi realizada a 37°C; ea absorvência (Abs340) da mistura da reação foi medida com o tempo. ATabela 1 mostra a atividade enzimática das proteínas de fusão de MBP

Tabela 1

<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>

Os resultados demonstram que todas as soluções enzimáticasde AtUGDI, AtUGD2, AtUGD3, e AtUGD4 têm atividade de UGD1 indicandoque, em Arabidopsis thaliana, os genes AtUGD2, AtUGD3, e AtUGD4, bemcomo o gene AtUGDI já reportado, todas codificam UGD.

Exemplo 2 Isolamento de Gene UGD Derivado de Chlorella Vírus

Para isolamento do gene UDP-glucose desidrogenase derivadode vírus chlorella (cvUGD) por PCR1 os iniciadores de SEQ ID NOS: 31 e 32foram designados com base na informação de seqüência conhecida de víruschlorella cepa PBCV-1. Para introdução no vetor de expressão pMAL-c2, ossítios EcoRI e Pstl foram adicionados aos iniciadores de extremidade 5' eextremidade 3', respectivamente. Foi realizada reação de PCR usando umaKOD -plus- DNA polimerase e um programa de reação de 1 ciclo de 94°Cpor 2 minutos e 30 ciclos de 94°C por 15 segundos, 60°C por 30 segundos,e 68°C por 1 minuto. O DNA genômico de vírus chlorella cepa Hirosaki (Ο-VHI1) e cepa Kakunodate (CVKA1) foi usado como modelo de DNA. Umaanálise por eletroforese por gel agarose mostrou bandas amplificadas porPCR com tamanho previsto. Cada fragmento amplificado por PCR foi clivadocom EcoRI e Pstl, e clonado em pMAL-c2 digerido com as mesmas enzimasde restrição, usando Ligation High. Usando a mistura de ligação, a cepaJM109 de Escherichia coii foi transformada de acordo com o método conhe-cideo mencionado acima, e os transformantes foram aplicados a meio ágarLB contendo 50 mg/mL de ampicilina, e cultivados de um diua para o outro a37°C. O plasmídeo foi extraído das colônias cultivadas dos transformantesusando um método conhecido.

As seqüências de nucleotídeos dos fragmentos inseridos foramdeterminadsa usando um sequenciador de DNA, e novos genes UGD deri-vados das cepas CVHI1 e CVKA1 foram obtidos e denominados "genecvUGD-HI" e "gene cvUGD-KA". As seqüências de nucleotídeos dos genescvGFAT-HI e cvUGD-KA são mostradas nas SEQ ID NOS: 11 e 13. Destemodo, foram construídos os plasmídeos pMAL-c2/cvUGD-HI e pMAL-c2/cvUGD-KA.

Proteínas de fusão de MBP foram expressadas e purificadas namesma maneira que no Exemplo 1. A figura 2 mostra a análise SDS-PAGEdas proteínas de fusão de MBP obtidas. Uma banda do tamanho previsto foiobservada em todas as soluções enzimáticas dos clones.

As atividades de UGD das proteínas de fusão de MBP expres-sadas foram medidas na mesma maneira que no Exemplo 1. A Tabela 1mostra a atividade enzimática das proteínas de fusão de MBP

A medição da atividade de UGD pelo método acima demonstrouque tanto cvUGD-HI quanto cvUGD-KA codificam enzimas funcionais.Exemplo 3 Isolamento de Gene GFAT Derivado de Arabidopsis thaliana

Como um gene GFAT derivado de plantas, foi reportado que umgene GFAT derivado de milhos (No. de Acesso AY106905) é isolado (publi-cação de patente internacional N0 WO 00/11192), mas não foram isoladosgenes GFAT de outras espécies de plantas. O banco de dados NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) mostra um gene GFAT derivado deArabidopsis thaliana (No. de Acesso NM_113314), o qual é altamente homó-loga ao gene conhecido. A seqüência de nucleotídeos do gene GFAT deriva-do de Arabidopsis thaliana é mostrada na SEQ ID NO: 9 na Listagem de Se-qüência.

RNAfoi extraído de Arabidopsis thaliana de acordo com o proto-colo RNeasy (QIAGEN). Para uma reação de transcrição reversa, 2 μg deRNA total foi dissolvido em 5,5 μί de água estéril, misturado com 1 μΙ deoligo d(T) iniciador a 10 μΜ, e termicamente desnaturado a 70°C por 10 mi-nutos. Depois de rápido esfriamento, a reação de transcrição reversa foi rea-lizada usando um kit ReverTraAce (Toyobo), a 42°C por 30 minutos e a 99°Cpor 5 minutos.

Para amplificação por PCR do gene GFAT derivado de Arabi-dopsis thaliana, os iniciadores de SEQ ID NOS: 33 e 34 foram designadoscom base nas seqüências de nucleotídeos no banco de dados. Para introdu-ção em um vetor de expressão pEU-NII livre de células (Toyobo), um sítioSall foi adicionado ao iniciador de extremidade 3'. Foi realizada reação dePCR usando uma KOD -plus- DNA polimerase e um programa de reação de1 ciclo de 94°C por 2 minutos, 3 ciclos de 94°C por 15 segundos, 45°C por30 segundos, e 68°C por 1 minuto, e 30 ciclos de 94°C por 15 segundos,55°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto. Um microlitro de produto dereação de transcrição reversa foi usado como modelo de DNA. Uma análisepor eletroforese por gel agarose mostrou bandas amplificadas por PCR comtamanho previsto. O fragmento amplificado por PCR foi clivado com umaenzima de restrição Sall, e clonado em pEU-NII digerido com enzimas derestrição EcoRV e Sall, usando Ligation High. Usando a mistura de ligação,a cepa JM109 de Escherichia coli foi transformada de acordo com o métodoconhecido mencionado acima, e os transformantes foram aplicados ao meiode ágar LB contendo 50 mg/mL de ampicilina, e cultivados de um dia para ooutro a 37°C. O plasmídeo foi extraído das colônias cultivadas dos transfor-mantes usando um método conhecido. Deste modo, foi construído o plasmí-deo pEU-NII/AtGFAT.

A seqüência de nucleotídeos do fragmento inserido foi determi-nada usando um sequenciador de DNA, e foi confirmado que o fragmentoamplificado foi o gene representado pela SEQ ID NO: 9. O acima revela queo gene GFAT é expressado em Arabidopsis thaliana.

Usando PROTEIOS (uma marca registrada de Toyobo), foi ex-pressada a proteína reconmbinante do AtGFAT. Especificamente, foi realiza-da uma reação a 37°C por 4 horas usando 5 μg do plasmídeo pEU/AtGFATcomo um modelo e uma T7 RNA Polimerase, para sintetizar RNAm. Depoisdisso, 6 μg de RNAm foi misturado com extrato de germe de trigo, e foi reali-zada uma reação a 26°C por 24 horas pelo método de bicamada. A misturada reação foi suspendida em tampão da amostra (Tris-HCI a 50 mM (pH6,8), 2% de SDS, 10% de glicerol, 0,6% de b-mercaptoetanol) e fervida por 5minutos, e em seguida a proteína expressada foi analisada por SDS-PAGE.Foi observada uma banda do tamanho previsto (cerca de 75 kDa), indicandoa expressão da proteína AtGFAT (figura 3).

A solução de expressão de proteína foi submetida a reação deGFAT. Especificamente, 50 μΙ_ da solução de expressão de proteína foi adi-cionado a uma solução (pH 7,0) contendo frutose-6-fosfato (15 mM), L-glutamina (15 mM), EDTA (1 mM), DTT (1 mM), e KH2PO4 (60 mM), e reagi-da a 37°C por 4 horas. Glucosamina-6-fosfato na misura da reação foi medi-da usando o método de Reissig (J. Biol. Chem1 1955, 217 (2), 959-66), oqual é um aprimoramento do método de Morgan e Elson, para avaliar a ati-vidade de GFAT. A figura 4 mostra os resultados. Glucosamina-6-fosfato nãofoi detectado em pEU-NII/DHFR usado como um controle, ao passo que umaumento de glucosamina-6-fosfato foi observado em pEU-NII/AtGFAT, de-monstrando que uma enzima GFAT ativa estava presente na solução de ex-pressão de proteína.

O acima revela que o gene AtGFAT codifica uma enzima funcio-nal em Arabidopsis thaliana.

Exemplo 4 Isolamento de Gene GFAT Derivado de Chlorella Vírus

Primers de PCR foram preparados para isolar o gene de gluta-mina-frutose-6-fosfato amidotransferase derivado de vírus chlorella (cvGFAT)k 20 por PCR. Com base em informação de seqüência de nucleotídeos já repor-tada da cepa de vírus chlorella PBCV-1, os iniciadores de SEQ ID NOS: 35 e36 foram designados de modo a amplificar a partir de 100 bp fora da regiãode GFAT putativa. Foi realizado PCR usando uma KOD -plus- DNA polime-rase e um programa de reação de 1 ciclo de 94°C por 2 minutos e 30 ciclosde 94°C por 15 segundos, 60°C por 30 segundos, é 68°C por 1 minuto. ODNA genômico de vírus chlorella cepas Hirosaki (CVHI1) e Kakunodate(CVKA1) foi usado como modelo de DNA. Os fragmentos amplificados porPCR foraom clonados em um vetor de clonagem pPCR-Script Amp SK(+)(Stratagene). As seqüências de nucleotídeos dos fragmentos inseridos fora-mo determinadas usando um sequenciador de DNA, e novos genes GFAT1 derivados das cepas cvHM e cvKA1 foram identificados e denominados "ge-ne cvGFAT-HI" e "gene cvGFAT-KA". As seqüências de nucleotídeos dosgenes cvGFAT-HI e cvGFAT-KA são mostradas nas SEQ ID NOS: 5 e 7.

As regiões do quando de leitura aberta dos genes cvGFAT-HI ecvGFAT-KA representadas pelas SEQ ID NOS: 5 e 7 foram clonadas em ve-tores para síntese de proteína livre de células para expressar proteínas.

Foi realizada reação de PCR sob as condições mencionadasacima usando vetor de clonagem pPCR-Script Amp SK(+) contendo o genecvGFAT-HI como um modelo e os iniciadores representados pelas SEQ IDNOS: 37 e 38. Foi realizada reação de PCR sob as condições mencionadasacima usando vetor de clonagem pPCR-Script Amp SK(+) contendo o genecvGFAT-KA como um modelo e os iniciadores representados pelas SEQ IDNOS: 37 e 39. Para o PCR, uma KOD -plus- DNA polimerase, e um ciclo dereação de 1 ciclo de 94°C por 2 minutos e 30 ciclos de 94°C por 15 segun-dos, 60°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto, foram usados. Cada frag-mento amplificado por PCR foi clivado com Xbal e clonado nos sítios EcoRVe Xbal do vetor pEU-NII. Usando a mistura de ligação, a cepa de Escherichiacoli DH5 foi transformada de acordo com o método conhecido mencionadoacima, e os transformantes foram aplicados ao meio de ágar LB contendo50 mg/mL de ampicilina, e cultivados de um dia para o outro a 37°C. Oplasmídeo foi extraído das colônias cultivadsa dos transformantes usandoum método conhecido. Deste modo, foram construídos os plasmídeos pEU-NII/cvGFAT-HI e pEU-NII/cvGFAT-KA.

Usando pEU-NII/cvGFAT-HI e pEU-NIΙ/cvGFAT-KA e PROTEIOS(marca registrada), foram expressadas proteínas na mesma maneira que noExemplo 3. Análise SDS-PAGE das proteínas expressadas confirmarambandas dos tamanhos previstos (cerca de 65 kDa), indicando a expressãode proteínas cvGFAT (figura 3).

A solução de expressão de proteína foi submetida a reação deGFAT na mesma maneira que no Exemplo 3. Afigura 4 mostra os resultados.Glucosamina-6-fosfato não foi detectado em pEU/DHFR usado como umcontrole, ao passo que foi observado um aumento em glucosamina-6-fosfatoem pEU/cvGFAT-HI, confirmando que uma enzima GFAT ativa estava pre-sente na solução de expressão de proteína.Exemplo 5 Clonagem de Gene HAS Derivado de Chlorella Vírus em pBI121

Para a clonagem de um gene de ácido hialurônico sintetase de-rivado de vírus chlorella (cvHAS, SEQ ID NO: 1) no vetor de transformaçãode planta (nas partes que se seguem também referido como "vetor de ex-pressão") pBI121 (Jefferson et al„ 1987, EMBO J1 6, 3901-3907), foram pre-parados os iniciadores representados pelas SEQ ID NOS: 40 e 41. Foi reali-zada reação de PCR usando DNA de plasmídeo contendo cvHAS como ummodelo, uma KOD -plus-DNA polimerase, e um programa de reação de 1ciclo de 94°C por 2 minutos, 3 ciclos de 94°C por 15 segundos, 45°C por 30segundos, e 68°C por 1 minuto, e 30 ciclos de 94°C por 15 segundos, 55°Cpor 30 segundos, e 68°C por 1 minuto. Fragmento amplificado por PCR foipurificado e clivado com BamHI e Dral. Subseqüentemente, cvHAS foi inse-rido no vetor de expressão pBI121 como se segue: pBI121 foi digerido com aenzima de restrição Saci, neutralizado (blunted) com Blunting High (Toyobo),e digerido com BamHI; e em seguida foi clonado o gene cvHAS digerido comuma enzima de restrição. Usando a mistura de ligação, a cepa de Escheri-chia coli DH5 foi transformada de acordo com o método conhecido mencio-nado acima, e os transformantes foram aplicados a meio de ágar LB conten-do 50 mg/mL de ampicilina, e cultivados de um dia para o outro a 37°C. Oplasmídeo foi extraído das colônias cultivadas dos transformantes usandoum método conhecido. Deste modo, foi preparado pBI121/cvHAS (nas par-tes que se seguem referido algumas vezes como ρΒΙΗΑ) contendo cvHAS.

Exemplo 6 Clonagem de Gene GFAT Derivado de Chlorella Vírus em pBI121

Foi realizada reação de PCR usando os iniciadores representa-dos pelas SEQ ID NOS: 42 e 38 e DNA de plasmídeo contendo cvGFAT-HIcomo um modelo. Para o PCR, KOD -plus- e um programa de reação de 1ciclo de 94°C por 2 minutos, 2 ciclos de 94°C por 15 segundos, 50°C por 30segundos, e 68°C por 1 minuto, e 28 ciclos de 94°C por 15 segundos, 60°Cpor 30 segundos, e 68°C por 1 minuto, foram usados. O fragmento amplifi-cado por PCR foi digerido com BamHI. Subseqüentemente, cvGFAT-HI foiinserido no vetor de expressão ppBI121 como se segue: pBI121 foi digeridocom Saci, neutralizado com Blunting High1 e digerido com BamHI, e em se-guida o gene cvGFAT-HI digerido com as enzimas de restrição acima foi clo-nado. Usando a mistura de ligação, a cepa de Escherichia coli DH5 foi trans-formada de acordo com o método conhecido mencionado acima, e os trans-formantes foram aplicados ao meio de ágar LB contendo 50 mg/mL de ampi-cilina e cultivados de um dia para o outro a 37°C. O plasmídeo foi extraídodas colônias cultivadas dos transformantes usando um método conhecido.Deste modo, foi preparado pBI121/cvGFAT-HI (nas partes que se seguemreferido algumas vezes como pBIGF) contendo cvGFAT-HI.

Exemplo 7 Subclonagem do Gene GFAT Derivado de Chlorella Vírus e GeneHAS em pBluescript

pBIHAfoi digerido com as enzimas de restrição Pvull e Pstl, nes-ta ordem, e subclonado nos sítios Pstl e Smal de pBluescript para obter p-Bluescript/35S-cvHAS-NOS (nas partes que se seguem referido algumasvezes como pBSHA).

pBIGF foi digerido com as enzimas de restrição Pvull e Sphl,nesta ordem. Depois de neutralização com Blunting High (Toyobo), pBIGF foisubclonado no sítio EcoRV de pBluescript para obter pBluescript/35S-cvGFAT-NOS (nas partes que se seguem referido algumas vezes comopBSGF).

pBSGF foi digerido com as enzimas de restrição Kpnl e Notl,nesta ordem. Depois de neutralização com Blunting High (Toyobo), 35S-cvGFAT-NOS foi subclonado em pBSHA digerido previamente com Spel,neutralização, e defosforilação, nesta ordem, para obter pBluescript/cvHAS-cvGFAT (nas partes que se seguem referido algumas vezes como pBSHG).

Exemplo 8 Clonagem de Gene GFAT Derivado de Chlorella Vírus e GeneHAS em pBI121

pBSHG foi digerido com as enzimas de restrição Kpnl e Notlnesta ordem, e o cassete de expressão de cvHAS-cvGFAT foi clivado e neu-tralizado. Em seguida, cvHAS-cvGFAT foi inserido no vetor de expressãopBI121 como se segue: pBI121 foi digerido com as enzimas de restrição Sa-ci e HindlII, e neutralizado com Blunting High, e em seguida o gene cvHAS-cvGFAT digerido com as enzimas de restrição acima foi clonado. Usando amistura de ligação, a cepa DH5 de Escherichia coli foi transformada de acor-do com o método conhecido mencionado acima, e os transformantes foramaplicados a meio de ágar LB contendo 50 mg/mL de ampicilina, e cultivadosde um dia para o outro a 37°C. O plasmídeo foi extraído das colônias culti-vadas dos transformantes usando um método conhecido. Deste modo, foipreparado pBI121/cvHAS-cvGFAT (nas partes que se seguem referido algu-mas vezes como pBIHG) contendo cvHAS-cvGFAT.

Exemplo 9 Preparação de Células eletrocompetentes

Cinco mililitros de meio LB foi inoculado com uma única colôniade Agrobacterium LBA4404 (Cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens),e submetido a cultura em agitação de um dia para o outro a 28°C. O meio decultura foi inoculado cm 500 μί de meio LB e submetido a cultura em agita-ção a 28°C até a turvação a 600 nm se tornar 0,5. O meio de cultura foi co-lhido por centrifugação (5000 rpm, 10 min, 4°C); o sobrenadante foi removi-do; 500 mL de água estéril foi adicionado para suspender e lavar as células;foi realizada centrifugação (5000 rpm, 10 min, 4°C) novamente para colheras células; e o sobrenadante foi removido. Depois de realizar o procedimen-to acima duas vezes, os precipitados foram suspendidos em 20 μί de solu-ção resfriada de glicerol a 10%, as células foram colhidas por centrifugação(5000 rpm, 10 min, 4°C), e o sobrenadante foi removido. Os precipitadosforam suspendidos em 3 mL de solução resfriada de glicerol a 10%, e alí-quotas de 40 μί da suspensão foram colocadas dentro de tubos de centrífu-ga de 1,5 mL, congeladas com nitrogênio líquido, e armazenadas a -80°C.

Exemplo 10 Introdução de pBIHG em Cepa LBA4404 de Agrobaeterium

Uma suspensão obtida misturando 1 μί do plasmídeo de ex-pressão pBIHG (200 mg/ml) com 40 μί de células eletrocompetentes de A.tumefaciens LBA4404 (Invitrogen) foi vertida em uma tina (distância entre oseletrodos: 1 mm) previamente esfriada sobre gelo, e foi aplicado um campoelétrico pulsátil (1,8 kV, 25 μΡ 200 W). Imediatamente depois disso, 500 μίde SOC foi adicionado, e a mistura resultante foi incubada a 28°C por 3 ho-ras. As células incubadas foram em seguida aplicadas a meio de placa LBcontendo canamicina, e cultivadas a 25°C por 3 dias para obter células deAgrobacterium carregando pBIHG.

Exemplo 11 Infecção de Tabaco com Agrobacterium tumefacince CepaLBA4404 contendo pBIHG

Tabaco (Nicotiana tabacum SR-1) foi transformado de acordocom o método de disco de folhas usando Agrobacterium ("Plant Biotechno-logy II" editado por Yasuyuki Yamada e Yoshimi Okada, Tokyo Kagaku Dojin,1991). Discos de folhas de tabaco foram immersos por 3 minutos em ummeio de cultura de Agrobaeterium carregando pBIHG ou pBIHA previamentecultivado de um dia para o outro a 28°C em 5 μl de meio LB contendo 50mg/L de canamicina. As células em excesso foram em seguida removidassobre papel-filtro. Os discos de folhas foram colocados em um meio de dife-renciação preparado adicionando 3% de sucrose, vitamina B5, 1 mg/L debenzilaminopurina, 1 mg/L de ácido acético de naftaleno, e 0,3% de gomagelano a sal inorgânico MS (Murashige and Skoog) (Murashige and Skoog,1962, Physiol. Plant., 15, 473) e ajustando o pH para 5,7, e foram deixadasem repouso no escuro a 28°C por 2 dias. Os discos de folhas infectados fo-ram lavados três vezes com água estéril, e o excesso de umidade foi remo-vido sobre papel-filtro. Os discos de folhas foram em seguida deixados emrepouso no meio de diferenciação contendo canamicina (100 mg/L) e cefota-xima (250 mg/L) como antibióticos, e foi induzida a formação de calo a 25°Csob condições de 16 horas de luz. Três semanas depois de iniciar a indução,brotos morfologicamente normais foram selecionadas, cortadas em umaforma contendo caules e folhas, e transferidas para um meio de enraizamen-to (sal inorgânico MS, 3% de sucrose, vitamina B5 e 0,3% de goma gelano,pH 5,7) contendo canamicina (100 mg/L) e cefotaxima (250 mg/L) para indu-zir enraizamento a 25°C sob condições de 16 horas de luz. Depois de duassemanas, brotos enraizados foram transferidos para um meio de cultura deenraizamentoo recente para obter linhagens com caules e folhas em cresci-mento.

Exemplo 12 Quantificação de Ácido Hialurônico Produzido por Tabaco Trans-formado

Cerca de 100 mg de folhas de tabaco transformado obtidas pelainfecção com Agrobacterium descrita acima foi transferido para um tubo de 2ml_, e suspendido em 200 μΙ_ de tampão (contendo Tris-HCI a 20 mM a pH7,5, NaCI a 0,2 M, EDTA a 1 mM, e 2-ME a 10 mM), e 400 mg de contas deaço inoxidável (diâmetro: 4,8 mm) foram adicionados. As folhas de tabacoforam pulverizadas sacudindo e agitando o tubo usando Bead Smash (Wa-kenyaku, BS-12) (4.000 rpm, 2 minutos). O líquido depois da pulverização foicentrifugado (15.000 rpm, 10 minutos), e o sobrenadante foi recuperado co-mo um extrato bruto. O extrato bruto foi diluído com água e usado como umaamostra de medição. A quantificação do ácido hialurônico foi realizada usan-do uma lâmina de ácido hialurônico "Chugai" (Fujirebio, Inc.). Afigura 5 mos-tra os resultados. O tabaco transformado no qual o gene cvHAS-cvGFATtinha sido introduzido teve produtividade de ácido hialurônico significativa-mente aumentada comparado com o tabaco transformado no qual o genecvHAS tinha sido introduzido.

Exemplo 13 Clonatem de Gene UGD Derivado de Chlorella Vírus em pBI121Foi realizada reação de PCR usando os iniciadores representa-dos pela SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44 e DNA de plasmídeo contendocvUGD-HI como um modelo. Para o PCR, KOD -plus-, e um programa dereação de 1 ciclo de 94°C por 2 minutos, 2 ciclos de 94°C por 15 segundos,50°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto), e 28 ciclos de 94°C por 15 se-gundos, 60°C por 30 segundos, e 68°C por 1 minuto, foram usados. O frag-mento amplificado por PCR foi digerido com BamHI e Saci. Subseqüente-mente, cvUGD-HI foi inserido no vetor de expressão pBI121 como se segue:pBI121 foi digerido com Sacl e em seguida com.BamHI1 e o gene cvUGD-HIdigerido com as enzimas de restrição mencionadas acima foi clonado empBI121. Usando a mistura de ligação, a cepa de Escherichia coli DH5 foitransformada de acordo com o método conhecido mencionado acima, e otransformante foi aplicado ao meio de ágar LB contendo 50 mg/ml de ampici-lina, e cultivado de um dia para o outro a 37°C. O plasmídeo foi extraído dascolônias cultivadas dos transformantes usando um método conhecido. Destemodo, foi preparado cvUGD-HI contendo pBIUG.

Exemplo 14 Subclonagem de Gene UGD Derivado de Chlorella Vírus empBluescript

pBIUG foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e Hindlll,subclonado nos sítios EcoRI e Hindlll de pBluescript para preparer pBSUG.

pBSUG foi digerido com Spel e neutralizado com Blunting Highpara destruir o sítio Spel. Subseqüentemente, pBSHA foi digerido com Notl1neutralizado, e digerido com Kpnl para cortar 35S-cvHAS-NOS. pBSUG foidigerido com Xhol, neutralizado, e digerido com Kpnl; e 35S-cvHAS-NOS, oqual tinha sido cortado, foi ligado para produzir pBSHU. pBSGF foi digeridocom Sall, neutralizado, e digerido com Notl para cortar 35S-cvGFAT-NOS.pBHU foi digerido com Spel, neutralizado, e digerido com Notl, e 35S-cvGFAT-NOS, o qual tinha sido cortado, foi ligado para produzir pBSHUG.Exemplo 15 Clonagem de Gene UGD Derivado de Chlorella Vírus, GeneGFAT, e Gene HAS, em pBI121

Usando DNA sintético, foi produzido pBI121 modificado no qualum sítio Smal tinha sido adicionado a jusante do sítio Hindlll de pBI121, eum sítio Kpnl tinha sido adicionado a montante do sítio EcoRI. pBSHUG foidigerido com Notl, neutralizado, e digerido com Kpnl; os cassetes de ex-pressão de HAS, UGD e GFAT encadeados foram cortados e clonados nopBI121 modificado clivado com Smal e Kpnl. Usando a mistura de ligação, acepa de Escherichia coli DH5 foi transformada de acordo com o método co-nhecido mencionado acima, e os transformantes foram aplicados ao meio deágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina, e cultivados de um dia para o ou-tro a 37°C. O plasmídeo foi extraído das colônias cultivadas dos transfor-mantes usando um método conhecido. Deste modo, foram preparados cas-setes de expressão de HAS, UGD e GFAT contendo pBIHUG.

Exemplo 16 Preparação de Tabaco Transformado, no qual pBIHUG tinhasido Introduzido, e Análise Quantitativa de Ácido Hialurônico

Usando o plasmídeo de expressão pBIHUG e seguindo os pro-cedimentos mostrados nos Exemplos 10 e 11, pBIHUG foi introduzido emcepa LBA4404 de Agrobacterium, e discos de folhas de tabaco foram infec-tados com cepa LBA4404 de Agrobacterium contendo pBIHUG. Em conse-qüência, foram obtidas 20 linhagens de tabaco nas quais a introdução dosgenes HAS1 UGD1 e GFAT tinha sido confirmada. Depois do procedimentomostrado no Exemplo 12, foram preparados extratos brutos e o ácido hialu-rônico foi quantificado. A figura 6 mostra os resultados. O tabaco transforma-do no qual os genes HAS1 UGD e GFAT tinham sido introduzidos apresentouprodutividade de ácido hialurônico significaticamente aumentada comparadocom o tabaco transformado no qual o gene cvHAS tinha sido introduzido e otabaco transformado no qual o gene cvHAS-cvGFAT tinha sido introduzido.

Exemplo 17 Análise Quantitativa de Ácido Hialurônico Produzido por TabacoTransformado (geração T1)

Foram colhidas sementes do tabaco transformado do Exemplo12, no qual o gene cvHAS-cvGFAT tinha sido introduzido, e inoculado emmeio de diferenciação MS contendo canamicina (100 mg/L). Um extrato bru-to foi obtido do tabaco transformado cultivado (geração T1) na mesma ma-neira que no Exemplo 12, e o ácido hialurônico foi quantificado, demonstran-do o nível de produção de ácido hialurônico equivalente ao da geração TO.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

De acordo com a presente invenção, um gene de ácido hialurô-nico sintetase é expressado em uma planta, e em particular, ácido hialurôni-co é produzido em um alto rendimento em uma planta. A presente invençãoproporciona uma planta ou células vegetais cultivadas que são capazes deproduzir ácido hialurônico em um maior rendimento do que a técnica anteri-or; um método para produzir a planta ou células vegetais cultivadas; e umvetor de expressão. Como ácido hialurônico seguro produzido em uma plan-ta pode ser proporcionado em um baixo custo, espera-se que a presenteinvenção contribua muito para a indústria.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> TOYO BOSEKI KABUSHIKI KAISHA<120> Planta Produtora de Ácido Hialurônico<130> 060044PC1<160> 44

<170> PatentIn version 3.1<211> 1707

<212> DNA

<213> Vírus Chlorella

<400> 1

atgggtaaaa atataatcat aatggtttcg

gcggttggag gagcctctct aatcttggct

aatattgctc tctcgacaat ctggggagta

ttccttgcac aagttttatt ttcagaactg

ctcagaccta agggttggaa tgatgtccgt

gatccctata tgttccaaaa gtgtctcgag

gctcgtctca tttgtgttat tgacggcgat

tacaagacga tctacaacga taatatcaag

gacaaggaag gtgaacgcat cgactctgat

caccgtggca agagggagtg tctctatact

gtcaacgccg tcgttttgat tgacagcgat

gttgtatacc cacttgcatg cgatcctgag

tggaacacag acactctttt gagtcttctc

gtggagagga gtgcccagtc ttttttcagg

gcctacaaga ttgatatcat taaggagatt

ggtcagaagt gtacttacgg tgacgaccgc

aaaaaggttg tgttcactcc atttgctgtt

cgatacatcg ttcagcagac ccgctggagt

ctcttcgccg cgtggaagca cggtttgtct

caaattacat acttcttcct cgtgatttac

cctcgctccc agacagccac agtgattgtg

tatttttcat tccgagccaa ggatattcgg

tactttttct gtatgattcc ggccagggtt

tggggtactc gcggtggaaa cgagaagcct

aagcaatatc tcattgcata tatgtggtgg

atcgtccata actggatgtt cgattggaat

atttgttctt acattgtttt tattactatt

acgacttgga atttcacgaa gcttcagaag

tggtacacca tcataacttc aaatctaatc 60

ccagcaatta ctgggtatat tctacattgg 120

tcagcttatg gtattttcgt ttttggtttt 180

aacaggaaac gtcttcgcaa gtggatttct 240

ttggctgtga tcattgctgg ataccgcgaa 300

tcagtgcgtg actctgacta cggtaacgtt 360

gacgacgctg atatgaagat gtccgatgtt 420

aagcccgagt ttgtcttgtg tgagtcagac 480

ttctctcgcg acatttgtgt tctccagcct 540

ggtttccaac ttgcaaagat ggaccccagt 600

actgttctcg agaaggatgc tattctggaa 660

atccaagccg tcgcaggtga gtgtaagatt 720

gtcgcttggc ggtactattc tgcgttttgt 780

actgttcagt gcgttggggg cccgctgggt 840

aaggacccct ggatttccca gcgctttctt 900

cggctaacca acgagatctt gatgcgtggt 960

ggttggtctg acagtccgac caatgtgttt 1020

aagtcgtggt gccgcgaaat ttggtacacc 1080

ggaatttggc tggcctttga atgtttgtat 1140

ctcttttctc gcctagccgt tgaggccgac 1200

agcaccacgg ttgcattgat taagtgtggg 1260

gctttttact ttgtgcttta tacatttgtt 1320

actgcaatga tgacgctttg ggacattggc 1380

tccgttggca cccgggtcgc tctgtgggca 1440

gccgcggttg ttggcgctgg agtttacagc 1500

tctctttctt atcgttttgc tttggttggt 1560

gtgctggtga tttatttcac cggcaaaatt 1620

gagctaatcg aggatcgtgt tctgtacgat 1680gcatctacca atgctcagtc tgtgtga 1707

<210> 2<211> 568<212> PRT<213> Vírus Chlorella<400> 2

Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr1 5 10 15

Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala10 20 25 30

Ile Thr Gly Tyr Ile Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp

35 40 45

Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln50 55 60

15 Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser65 70 75 80

Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala

85 90 95

Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val20 100 105 110

Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp

115 120 125

Gly Asp Asp Asp Ala Asp Met Lys Met Ser Asp Val Tyr Lys Thr Ile130 135 140

25 Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp145 150 155 160

Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys

165 170 175

Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe30 180 185 190

Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp195 200 205Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro

210 215 220

Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile225 230 235 240

Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr

245 250 255

Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val

260 265 270

Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys

275 280 285

Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys

290 295 300

Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly305 310 315 320

Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro

325 330 335

Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser

340 345 350

Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly

355 360 365

Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr

370 375 380

Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp385 390 395 400

Pro Arg Ser Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu

405 410 415

Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe

420 425 430

Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala

435 440 445

Arg Val Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg450 455 460Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala465 470 475 480

Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala485 490 495

Gly Val Tyr Ser Xle Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu500 505 510

Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile

515 520 525

Thr Ile Val Leu Val Ile Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn530 535 540

Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp545 550 555 560

Ala Ser Thr Asn Ala Gln Ser Val565

<210> 3

<211> 1707<212> DNA

<213> Vírus Chlorella<400> 3

atgggtaaaa atataatcat aatggtttcg tggtacacca tcataacttc aaatctaatc 60

gcggttggag gagcctctct aatcttggct ccagcaatta ctggatatat tctacattgg 120

aatattgctc tctcgacaat ctggggagta tcagcttatg gtattttcgt ttttggtttt 180

ttccttgcac aagttttatt ttcagaactg aacaggaaac gtcttcgcaa atggatttct 240

ctcagaccta agggttggaa tgatgtccgt ttggctgtga tcattgctgg ataccgcgaa 300

gatccctata tgttccaaaa gtgtctcgag tcagtgcgtg actctgacta cggtaacgtt 360

gctcgtctca tttgtgttat tgacggcgat gacgacgctg atatgaagat gtccgatgtt 420

tacaagacga tctacaacga taatatcaag aagcccgagt ttgtcttgtg tgagtcagac 480

gacaaggaag gtgaacgcat cgactctgat ttctctcgcg acatttgtgt tctccagcct 540

caccgtggca agagggagtg tctctatact ggtttccaac ttgcaaagat ggaccccagt 600

gtcaacgccg tcgttttgat tgacagcgat actgttctcg agaaggatgc tattctggaa 660

gttgtatacc cacttgcatg cgatcctgag atccaagccg tcgcaggtga gtgtaagatt 720

tggaacacag acactctttt gagtcttctc gtcgcttggc ggtactattc tgcgttttgt 780gtggagagga gtgcccagtc ttttttcagg actgttcagt gcgttggggg cccgctgggt 840 gcctacaaga ttgatatcat taaggagatt aaggacccct ggatttccca gcgctttctt 900 ggtcagaagt gtacttacgg tgacgaccgc cggctaacca acgagatctt gatgcgtggt 960 aaaaaggttg tgttcactcc atttgctgtt ggttggtctg acagtccgac caatgtgttt 1020 cgatacatcg ttcagcagac ccgctggagt aagtcgtggt gccgcgaaat ttggtacacc 1080 ctctttgccg cgtggaagca cggtttgtct ggaatttggc tggcctttga atgtttgtat 1140 caaattacat acttcttcct cgtgatttac ctcttttctc gcctagccgt tgaagccgac 1200 cctcgctccc agacagccac agtgattgtg agcaccacgg ttgcattgat taagtgtggg 1260 tatttttcat tccgagccaa ggatattcgg gctttttact ttgtgcttta tacatttgtt 1320 tactttttct gtatgattcc ggccagggtt actgcaatga tgacgctttg ggacattggc 1380 tggggtactc gcggtggaaa cgagaagcct tccgttggca cccgggtcgc tctgtgggca 1440 aagcaatatc tcattgcata tatgtggtgg gccgcggttg ttggcgctgg agtttacagc 1500 atcgtccata actggatgtt cgattggaat tctctttctt atcgttttgc tttggttggt 1560 atttgttctt acattgtttt tattactatt gtgctggtga tttatttcac cggcaaaatt 1620 acgacttgga atttcacgaa gcttcagaag gagctaatcg aggatcgtgt tctgtacgat 1680 gcatctacca atgctcagtc tgtgtga 1707 <210> 4 <211> 568 <212 > PRT <213> Vírus Chlorella <400> 4 Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr 1 5 10 15 Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala 20 25 30 Ile Thr Gly Tyr Ile Leu His Trp Asn Ile Alá Leu Ser Thr Ile Trp 35 40 45 Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln 50 55 60 Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu . Arg Lys Trp Ile Ser 65 70 75 80 Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile AlaGly Tyr Arg Glu100

Arg Asp Ser Asp115

Gly Asp Asp Asp130

Tyr Asn Asp Asn145

Asp Lys Glu Gly

Val Leu Gln Pro180

Gln Leu Ala Lys195

Ser Asp Thr Val210

Leu Ala Cys Asp225

Trp Asn Thr Asp

Ser Ala Phe Cys260

Gln Cys Val Gly275

Glu Ile Lys Asp290

Thr Tyr Gly Asp305

Lys Lys Val ValThr Asn Val Phe

85

Asp Pro Tyr Met

Tyr Gly Asn Val120

Ala Asp Met Lys135

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Glu Arg Ile Asp165

His Arg Gly Lys

Met Asp Pro Ser200

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Val Glu Arg Ser

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Arg Tyr Ile Val

90

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Met Ser Asp Val140

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Val Asn Ala Val

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Leu Leu Val Ala250

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Ala Tyr Lys Ile

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Gln Gln Thr Arg

95

Leu Glu Ser Val110

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Val Leu Ile Asp205

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Gly Gln Lys Cys

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Trp Ser Lys Ser340

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Leu Ser Gly Ile Trp370

Phe Phe Leu Val Ile385

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<210> 5<211> 1788<212> DNA

345

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Leu Ala Phe Glu Cys Leu375

Tyr Leu Phe Ser Arg Leu390 395

Ala Thr Val Ile Val Ser410

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350

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Ala Val Glu Ala Asp400

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Ala Val Val Gly Ala495

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<400> 5

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attcagaagc tagaatatcg tgggtatgat tcgtgcggta ttgcgtatac agatgggggt 120

gcgattgagc gtatacggtc ggttgacggt attgacgatc tgcgtaagaa aacaatcaca 180

gaatcatcac cagtggccat tgctcactcg cggtggagca ccactggaat tccatcagtg 240

gtgaacgcac atcctcatat ttctcgcgga accagtgggt gtgagtctcg tatcgcggta 300

gtccacaacg gtatcattga aaactatcag cagatccgaa aatatctcat caatctcggt 360

tatacgtttg atagtcaaac ggacacagag gtcattgcac atttgatcga ttctcagtac 420

aatgggaata tcttgcacac cgtccaaatg gctgtcaagc acctgaaggg ctcttatgcc 480

attgcagtta tgtgtcataa agagtctggt aaaatagtcg tggcgaaaca gaagtcaccc 540

ctcgtacttg gaatcggctc agatggtgct tactacatcg cttcggacgt gctggcgctg 600

ccgacaaata aagttgttta tatttcagat ggtttctctg cagaactatc tccagggagt 660

atgtccattt acgatcctga tggaaatgaa gtggaatatg aagtagagga cgttgaaatg 720

gaacaaacta gtatgtctct tgataacttt gatcattaca tgattaagga aattaatgag 780

caaccáatca gtatcctaaa cactataaaa aataaagggt tttatgcaga aatattcggc 840

gatttggcgc atgaaatctt ccaaaaaata gacaacatcc tgatactggc ttgtggtaca 900

agttatcacg ccggtcttgt aggaaaacag tggatagaga ccattgcgag aatccccgtg 960

gatgttcaca tcgcgagcga atacgaacct acaattccga gagcgaacac attggtaatc 1020

actatttcac agtcgggtga aactgcggac acgatagcgg ctttgcaacg ggcccaaaac 1080

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agcgttatga agtacataac gaaatgtggg tctgaggtgt cagtagcatc aacgaaggcg 1200

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ctaaacgcac cagttgcctt tgagggagcg ctgaagctca aagaaatctc ttacattcat 1440

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ataattcaca ctatcccgat gcaactgctt tcgtattacg tggcaattaa gcttgggaag 1740

aacgttgaca aaccaaggaa tcttgcaaaa tccgtgacca ccttttaa 1788<210> 6<211> 595<212> PRT

<213> VIrus Chlorella<400> 6

Met Cys Gly Ile Phe Gly Ala Val Ser Asn Asn Asn Ser Ile Glu Val15 10 15

Ser Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Cys

20 25 30

Gly Ile Ala Tyr Thr Asp Gly Gly Ala Ile Glu Arg Ile Arg Ser Val

35 40 45

Asp Gly Ile Asp Asp Leu Arg Lys Lys Thr Ile Thr Glu Ser Ser Pro

50 55 60

Val Ala Ile Ala His Ser Arg Trp Ser Thr Thr Gly Ile Pro Ser Val65 70 75 80

Val Asn Ala His Pro His Ile Ser Arg Gly Thr Ser Gly Cys Glu Ser

85 90 95

Arg Ile Ala Val Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn Tyr Gln Gln Ile

100 105 110

Arg Lys Tyr Leu Ile Asn Leu Gly Tyr Thr Phe Asp Ser Gln Thr Asp

115 120 125

Thr Glu Val Ile Ala His Leu Ile Asp Ser Gln Tyr Asn Gly Asn Ile

130 135 140

Leu His Thr Val Gln Met Ala Val Lys His Leu Lys Gly Ser Tyr Ala145 150 155 160

Ile Ala Val Met Cys His Lys Glu Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Lys

165 170 175

Gln Lys Ser Pro Leu Val Leu Gly Ile Gly Ser Asp Gly Ala Tyr Tyr

180 185 190

Ile Ala Ser Asp Val Leu Ala Leu Pro Thr Asn Lys Val Val Tyr Ile

195 200 205

Ser Asp Gly Phe Ser Ala Glu Leu Ser Pro Gly Ser Met Ser Ile Tyr210

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220

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Leu Asn Ala ProSer Tyr Ile His465 470 475 480

Ala Glu Gly Phe Leu Gly Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu

485 490 495

Leu Asp Asp Lys Ile Pro Val Ile Val Thr Val Ala Asp His Ala Tyr500 505 510

Leu Asp His Ile Lys Ala Asn Ile Asp Glu Val Leu Ala Arg Asn Val

515 520 525

Thr Val Tyr Ala Ile Val Asp Gln Tyr Val Asn Ile Glu Pro Gln Glu530 535 540

Arg Leu Arg Val Val Lys Val Pro Phe Val Ser Lys Glu Phe Ser Pro545 550 555 560

Ile Ile His Thr Ile Pro Met Gln Leu Leu Ser Tyr Tyr Val Ala Ile

565 570 575

Lys Leu Gly Lys Asn Val Asp Lys Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val580 585 590

Thr Thr Phe595

<210> 7<211> 1788<212> DNA

<213> Vírus Chlorella<400 > 7

atgtgtggca tctttggagc agtgtcaaac aacaactcta tcgaggtgtc aatcaagggt 60

attcagaagc tagaatatcg tgggtatgat tcgtgcggta ttgcgtatac agatgggggt 120gcgattgagc gtatacggtc ggttgacggt attgacgatc tgcgtaagaa aacaatcaca 180gaatcatcac cagtagccat tgctcactcg cggtggagca ccactggaat tccatcagtg 240gtgaacgcac atcctcatat ttctcgcgga accagtgggt gtgagtctcg tatcgcggta 300gtccacaacg gtatcattga aaactatcag cagatccgaa aatatctcat caatctcggt 360tatacgtttg atagtcaaac ggacacagag gtcattgcac atttgatcga ttctcagtac 420aatgggaata tcttgcacac cgtccaaatg gctgtcaagc acctgaaggg ctcttatgcc 480attgcagtta tgtgtcataa agagtctggt aaaatagtcg tggcgaaaca gaagtcaccc 540ctcgtacttg gaatcggctc agatggtgct tactacatcg cttcggacgt gctggcgctg 600ccgacaaata aagttgttta tatttcagat ggtttctctg cagaactatc tccagggagt

660

atgtccattt acgatcctga tggaaatgaa gtggaatatg aagtagagga cgttgaaatg 720

780840900

gaacaaacta gtatgtctct ctataacttt gatcattaca tgattaagga aattaatgagcaaccaatca gtatcctaaa cactataaaa aataaagggt tctatgcaga aatattcggtgatttggcge atgaaatctt ccaaaaaata gacaacatcc tggtactggc ttgtggtaca

agttatcacg ccggtctcgt cgggaaacag tggatagaga ccatcgcgaa aatccccgtg 960

aatgttcata tcgcaagtga atacgaaccc accattccta aagcgaacac attggtaatc 1020

actatttcac aatcgggtga aactgcggac acgatagcgg ctttgcaacg agcccaaaac 1080

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aatgttgata aaccgaggaa tcttgcgaaa tctgtgacca ccttttaa 1788<210> 8<211> 595<212> PRT

<213> Vírus Chlorella

<400> 8

Met Cys Gly Ile Phe Gly Ala Val Ser Asn Asn Asn Ser Ile Glu Val15 10 15

Ser Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Cys20 25 30

Gly Ile Ala Tyr Thr Asp Gly Gly Ala Ile Glu Arg Ile Arg Ser Vali 3 5 4 0 4 5

Asp Gly Ile Asp Asp Leu Arg Lys Lys Thr Ile Thr Glu Ser Ser Pro50 55 60

Val Ala Ile Ala His Ser Arg Trp Ser Thr Thr Gly Ile Pro Ser Val65 70 75 80

Val Asn Ala His Pro His Ile Ser Arg Gly Thr Ser Gly Cys Glu Ser

85 90 95

Arg Ile Ala Val Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn Tyr Gln Gln Ile

100 105 110

Arg Lys Tyr Leu Ile Asn Leu Gly Tyr Thr Phe Asp Ser Gln Thr Asp

115 120 125

Thr Glu Val Ile Ala His Leu Ile Asp Ser Gln Tyr Asn Gly Asn Ile

130 135 140

Leu His Thr Val Gln Met Ala Val Lys His Leu Lys Gly Ser Tyr Ala145 150 155 160

Ile Ala Val Met Cys His Lys Glu Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Lys

165 170 175

Gln Lys Ser Pro Leu Val Leu Gly Ile Gly Ser Asp Gly Ala Tyr Tyr

180 185 190

Ile Ala Ser Asp Val Leu Ala Leu Pro Thr Asn Lys Val Val Tyr Ile

195 200 205

Ser Asp Gly Phe Ser Ala Glu Leu Ser Pro Gly Ser Met Ser Ile Tyr

210 215 220

Asp Pro Asp Gly Asn Glu Val Glu Tyr Glu Val Glu Asp Val Glu Met225 230 235 240

Glu Gln Thr Ser Met Ser Leu Tyr Asn Phe Asp His Tyr Met Ile Lys

245 250 255

Glu Ile Asn Glu Gln Pro Ile Ser Ile Leu Asn Thr Ile Lys Asn Lys

260 265 270

Gly Phe Tyr Ala Glu Ile Phe Gly Asp Leu Ala His Glu Ile Phe Gln

275 280 285

Lys Ile Asp Asn Ile Leu Val Leu Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala

290 295 300

Gly Leu Val Gly Lys Gln Trp Ile Glu Thr Ile Ala Lys Ile Pro Val305

Asn Val His Ile

Thr Leu Val Ile340

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Ile Cys Asn Ser370

Tyr Ile Thr Lys385

Phe Thr Ser Gln

Asn Lys Thr Asp420

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Ala Glu Gly Phe

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Ile Ile His Thr

310

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Thr Ile Ser Gln

Arg Ala Gln Asn360

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Cys Gly Ser Glu390

Leu Val Val Leu405

Asp Leu Leu Gly

Thr Ser Asp Glu440

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315

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Ser Thr Lys Ala400

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Thr Thr Phe

<210> 9<211> 2034<212> DNA

<213> Arabidopsis thalíana<400> 9

atgtgtggaa tcttcgcgta tctgaatttt cacgcgaaca aagagagacg atacattctc 60

gatgttctct tcaatggtct tcgtcgtctt gaatacagag gctacgattc tgctggaatc 120

gccattgata attcttctcc ttcttcttct cctctcgtgt ttcgtcaagc aggaaacatt 180

gaatcacttg ttaattccgt taacgaagag attacgaata cggatttgaa tctagacgaa 240

gttttctact ttcatgctgg aattgcacat acgaggtggg ctactcatgg tgagccagct 300

ccaaggaata gtcatcctca atcttctggt cctggagatg attttttggt ggttcataat 360

ggtgttatca ctaactatga ggtattgaaa gaaacgttag tgaggcatgg atttactttt 420

gaatcggaca cagatactga agtaattcct aagcttgcta agtttgtttt tgacaaagct 480

aatgaagaag gtggacaaac tgttacattc tgtgaagttg tgtttgaagt gatgaggcat 540

cttgaaggag cttatgctct tatatttaaa agctggcatt atccgaatga gttaattgcg 600

tgcaagcttg gtagtccatt gcttttaggt gttaaagagc tagatcaagg tgagagcaat 660

agtcatgttt tccaagatgc tcactttcta tctaagaatg accatcccaa ggagtttttc 720

ctatcaagtg atccacatgc tcttgttgag cacacaaaga aagttttggt gattgaagat 780

ggcgaagttg tcaatctcaa ggatggaggt gtatcaatac ttaagtttga aaatgagagg 840

ggaaggtgta atggtttatc gagacctgct tcagtggaac gtgccttatc tgttctagag 900

atggaggtag agcaaataag caagggaaaa tatgatcatt acatgcaaaa ggaaatccac 960

gagcagccag aatctttaac tactacaatg agaggccgac ttatacgcgg tggttcacgt 1020

aaaacgaaaa ccgtcctctt aggtgggctg aaagatcacc taaagaccat aagacgcagc 1080

cggcgtatag tttttattgg atgtgggaca agttacaatg ccgctcttgc atcaagacct 1140

atccttgaag aactctctgg tataccagtc agtatggaga ttgctagtga tctatgggac 1200

cggcaaggtc caatatacag agaagatacc gcggtgtttg tgagtcagtc tggtgaaact 1260

gcagatacac tacttgcttt ggactatgct cgagaaaacg gtgcattatg tgtcggcata 1320actaacaccg ttgggagctc catagctaga aaaacacact gtggtgtcca tataaacgca 1380ggagctgaga ttggtgtcgc aagtacaaag gcatatacaa gtcagattgt ggtaatggta 1440atgctagctt tagcaatagg aagtgacaca atctccagcc aaaagagacg ggaagctata 1500atcgatggac tacttgattt gccgtataag gttaaggaag tactaaagct agacgatgaa 1560atgaaagatc tcgcgcaact cttgatagac gagcagtcac tgctagtgtt tggcagagga 1620tacaactacg caacagcttt agaaggagca ttaaaagtaa aagaagtagc acttatgcac 1680agtgaaggaa tacttgcagg agaaatgaaa catggacctt tagctttggt tgatgagaat 1740ctccccatag ctgtgattgc cactcgtgat gcttgtttca gtaaacaaca atctgtgatt 1800cagcaacttc acgcacgcaa agggagacta atagtaatgt gctcaaaagg tgatgctgca 1860tcggtaagct cgagtggttc ttgtcgagct atcgaagttc ctcaagttga agattgttta 1920caacctgtta ttaatatagt gccattacag ttgttggctt atcatctgac tgttttgaga 1980ggtcacaatg ttgatcaacc gaggaatctg gcaaagagtg tgactactca atag 2034

<210> 10<211> 677<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 10

Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu Asn Phe His Ala Asn Lys Glu Arg1 5 10 15

Arg Tyr Ile Leu Asp Val Leu Phe Asn Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr

20 25 30

Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Ile Ala Ile Asp Asn Ser Ser Pro Ser

35 40 45

Ser Ser Pro Leu Val Phe Arg Gln Ala Gly Asn Ile Glu Ser Leu Val25 50 55 60

Asn Ser Val Asn Glu Glu Ile Thr Asn Thr Asp Leu Asn Leu Asp Glu65 70 75 80

Val Phe Tyr Phe His Ala Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His85 90 95

30 Gly Glu Pro Ala Pro Arg Asn Ser His Pro Gln Ser Ser Gly Pro Gly

100 105 110

Asp Asp Phe Leu Val Val His Asn Gly Val Ile Thr Asn Tyr Glu Val115 120 125

Leu Lys Glu Thr Leu Val Arg His Gly Phe Thr Phe Glu Ser Asp Thr

130 135 140

Asp Thr Glu Val Ile Pro Lys Leu Ala Lys Phe Val Phe Asp Lys Ala145 150 155 160

Asn Glu Glu Gly Gly Gln Thr Val Thr Phe Cys Glu Val Val Phe Glu

165 170 175

Val Met Arg His Leu Glu Gly Ala Tyr Ala Leu Ile Phe Lys Ser Trp

180 185 190

His Tyr Pro Asn Glu Leu Ile Ala Cys Lys Leu Gly Ser Pro Leu Leu

195 200 205

Leu Gly Val Lys Glu Leu Asp Gln Gly Glu Ser Asn Ser His Val Phe

210 215 220

Gln Asp Ala His Phe Leu Ser Lys Asn Asp His Pro Lys Glu Phe Phe225 230 235 240

Leu Ser Ser Asp Pro His Ala Leu Val Glu His Thr Lys Lys Val Leu

245 250 255

Val Ile Glu Asp Gly Glu Val Val Asn Leu Lys Asp Gly Gly Val Ser

260 265 270

Ile Leu Lys Phe Glu Asn Glu Arg Gly Arg Cys Asn Gly Leu Ser Arg

275 280 285

Pro Ala Ser Val Glu Arg Ala Leu Ser Val Leu Giu Met Glu Val Glu

290 295 300

Gln Ile Ser Lys Gly Lys Tyr Asp His Tyr Met Gln Lys Glu Ile His305 310 315 320

Glu Gln Pro Glu Ser Leu Thr Thr Thr Met Arg Gly Arg Leu Ile Arg

325 330 335

Gly Gly Ser Arg Lys Thr Lys Thr Val Leu Leu Gly Gly Leu Lys Asp

340 345 350

His Leu Lys Thr Ile Arg Arg Ser Arg Arg Ile Val Phe Ile Gly Cys

355 360 365

Gly Thr Ser Tyr Asn Ala Ala Leu Ala Ser Arg Pro Ile Leu Glu Glu370 375 380

Leu Ser Gly Ile Pro Val Ser Met Glu Ile Ala Ser Asp Leu Trp Asp385 390 395 400

Arg Gln Gly Pro Ile Tyr Arg Glu Asp Thr Ala Val Phe Val Ser Gln 405 410 415

Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu Leu Ala Leu Asp Tyr Ala Arg Glu

420 425 430

Asn Gly Ala Leu Cys Val Gly Ile Thr Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile435 440 445

Ala Arg Lys Thr His Cys Gly Val His Ile Asn Ala Gly Ala Glu Ile450 455 460

Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser Gln Ile Val Val Met Val465 470 475 480

Met Leu Ala Leu Ala Ile Gly Ser Asp Thr Ile Ser Ser Gln Lys Arg

485 490 495

Arg Glu Ala Ile Ile Asp Gly Leu Leu Asp Leu Pro Tyr Lys Val Lys

500 505 510

Glu Val Leu Lys Leu Asp Asp Glu Met Lys Asp Leu Ala Gln Leu Leu515 520 525

Ile Asp Glu Gln Ser Leu Leu Val Phe Gly Arg Gly Tyr Asn Tyr Ala530 535 540

Thr Ala Leu Glu Gly Ala Leu Lys Val Lys Glu Val Ala Leu Met His545 550 555 560

Ser Glu Gly Ile Leu Ala Gly Glu Met Lys His Gly Pro Leu Ala Leu 565 570 575

Val Asp Glu Asn Leu Pro Ile Ala Val Ile Ala Thr Arg Asp Ala Cys

580 585 590

Phe Ser Lys Gln Gln Ser Val Ile Gln Gln Leu His Ala Arg Lys Gly595 600 605

Arg Leu Ile Val Met Cys Ser Lys Gly Asp Ala Ala Ser Val Ser Ser610 615 620

Ser Gly Ser Cys Arg Ala Ile Glu Val Pro Gln Val Glu Asp Cys Leu625Gln P

Thr V

Ser V

<210><211><212><213><400>

atgtcacgaa tcgcagtcgt tggttgtggt tacgtcggaa ccgcttgtgc agtacttctt 60gctcaaaaaa acgaagtcac cgtgcttgat attagcgaag accgtgttca gctaatcaag 120

aacaagaaga gtccaatcga ggacaaggaa atcgaagagt ttctcgaaac gaaagacctg 180

aacctgaccg cgacgactga caaggttctt gcatacgaaa acgccgaatt tgtcatcatc 24 0

gcaaccccga ctgactatga cgtggttact aggtatttta acacgaaatc tgtggaaagc 300

gttatcgggg atgtgatcaa aaatacacgg acccagccaa ctattgtgat taaatctacc 360

atccccattg gatttgttga taaggttcgt gagcaattca actacagcaa cattatattc 420

tctccggagt ttctgcgaga aggtagggca ttgtatgata atctctatcc atcgcgtatt 480

atcgtaggag atgattcccc cattgcgctt aagttcgcaa accttctcgt tgaaggttct 540

aaaaccccac ttgcacctgt cctgacgatg gggactcgtg aagccgaggc cgtcaaacta 600

ttctctaaca cgtatcttgc gatgcgagtt gcatatttca acgaactaga tacgtttgca 660

ttgtctcatg gtatgagtgc gaaagaaatc attgacggtg tgactctgga gcctcgaatt 720

ggtcagggtt actcaaaccc ttcgttcggt tacggagctt attgcttccc aaaggatacg 780

aagcaacttc tggctaactt tgagggggtg cctcaaaata tcatcggggc aattgtagaa 840

tcaaatgaaa ctcgcaagga agcgattgta agtgaagtag aaaatcgttt tcccacgact 900

gttggtgtgt ataagctcgc tgctaaagcg ggttctgata attttaggag ttctgcaatt 960

gtagacataa tggagcgact tgcaaacagg ggttatcaca ttaagatttt cgaaccaact 1020

gtggaacaat tcgaaaactt tgaagttgat aacaacctga caacatttgc gactgagagc 1080

gatgtaatta tcgcaaacag agttcccgtt gaacatcgca ttctctttgg taaaaaattg 1140

atcacacgtg atgtatatgg cgataactaa 1170

630 635 640

Val Ile Asn Ile Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Leu

645 650 655

ral Leu Arg Gly His Asn Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys

660 665 670

ai Thr Thr Gln67511

1170DNA

Vírus Chlorella11<210> 12<211> 389<212> PRT

<213> VIrus Chlorella<400> 12

Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys15 10 15

Ala Val Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Thr Val Leu Asp Ile Ser20 25 30

Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp35 40 45

Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala

50 55 60

Thr Thr Asp Lys Val Leu Ala Tyr Glu Asn Ala Glu Phe Val Ile Ile65 70 75 80

Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Val Val Thr Arg Tyr Phe Asn Thr Lys

85 90 95

Ser Val Glu Ser Val Ile Gly Asp Val Ile Lys Asn Thr Arg Thr Gln100 105 110

Pro Thr Ile Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Val Asp Lys115 120 125

Val Arg Glu Gln Phe Asn Tyr Ser Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe

130 135 140

Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile145 150 155 160

Ile Val Gly Asp Asp Ser Pro Ile Ala Leu Lys Phe Ala Asn Leu Leu

165 170 175

Val Glu Gly Ser Lys Thr Pro Leu Ala Pro Val Leu Thr Met Gly Thr180 185 190

Arg Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Met195 200 205

Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Phe Ala Leu Ser His Gly210 215 220

Met Ser Ala Lys Glu Ile Ile Asp Gly Val Thr Leu Glu Pro Arg Ile225 230 235 240

Gly Gln Gly Tyr Ser Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Ala Tyr Cys Phe 245 250 255

Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Phe Glu Gly Val Pro Gln

260 265 270

Asn Ile Ile Gly Ala Ile Val Glu Ser Asn Glu Thr Arg Lys Glu Ala275 280 285

Ile Val Ser Glu Val Glu Asn Arg Phe Pro Thr Thr Val Gly Val Tyr290 295 300

Lys Leu Ala Ala Lys Ala Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ser Ser Ala Ile305 310 315 320

Val Asp Ile Met Glu Arg Leu Ala Asn Arg Gly Tyr His Ile Lys Ile 325 330 335

Phe Glu Pro Thr Val Glu Gln Phe Glu Asn Phe Glu Val Asp Asn Asn340 345 350

Leu Thr Thr Phe Ala Thr Glu Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val355 360 365

Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp370 375 380

Val Tyr Gly Asp Asn

385

<210> 13<211> 1170<212> DNA<213> Vírus Chlorella<400> 13

atgtcacgaa tcgcagtcgt tg3ctgtggt tacgtcggaa ccgcttgtgc agtacttctt 60

gctcaaaaaa acgaagtcac cgtgcttgat attagtgaag accgtgttca gctaatcaag 120

aacaagaaga gtccaatcga ggacaaggaa atcgaagagt ttctcgaaac gaaagacctg 180

aacctgaccg cgacgactga caaggttctt gcatacgaaa acgccgaatt tgtcatcatc 240gcaaccccga ctgactatga cgtggttact aggtatttta acacgaaatc tgtggaaagc 300gttatcgggg atgtgatcga aaatacacgg acccagccaa ctattgtgat taaatctacc 360

atcacacgtg atgtatatgg cgataactaa<210 > 14<211> 389<212> PRT<213> Vírus Chlorella<400> 14

Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys1 5 10 15

Ala Val Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Thr Val Leu Asp Ile Ser20 25 30

Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp

35 40 45

Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala50 55 60

Thr Thr Asp Lys Val Leu Ala Tyr Glu Asn Ala Glu Phe Val Ile Ile65 70 75 80

Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Val Val Thr Arg Tyr Phe Asn Thr Lys

420480

atccccattg gatttgttga taaggttcgt gagcaattca actacagcaa cattatattctctccggagt ttctgcgcga aggtagggca ttgtatgata atctctatcc atcgcgtatt

atcgtaggag atgattcccc cattgcgctt aagttcgcaa accttctcgt tgaaggttct 540

aaaactccgc ttgcccctgt cctgacgatg ggaactcgcg aagccgaggc cgtcaaacta 600

ttctctaaca cgtatcttgc aatgcgagtt gcatacttca acgaactaga tacattcgca 660

atgtctcatg gtatgaatgc gaaagaaatc attgacggtg tgactttgga gcctcgcatt 720

ggtcaggggt actcaaaccc ttcgttcggt tatggagctt attgctttcc gaaggatacg 780aagcaactgc tggctaattt cgagggggtg cctcaagata taatcggggc aattgtagaatcaaatgaaa ctcgcaagga agcgattgta agtgaagtag aaaatcgttt tcccacgact

gttggtgtgt ataagctcgc tgctaaagcg ggttctgata attttagaag ttctgcaatt 960

gtagacataa tggagcgact tgcaaacagg ggttatcaca ttaagatttt cgaaccaact 1020

gtggaacaat tcgaaaactt tgaagttgat aacaacctga caacatttgc gactgatagc 1080

gatgtaatta tcgcaaacag agttcccgtt gaacatcgca ttctctttgg taaaaaattg 1140

840900

1170Ser Val Glu Ser100

Pro Thr Ile Val115

Val Arg Glu Gln130

Leu Arg Glu Gly145

Ile Val Gly Asp

Val Glu Gly Ser180

Arg Glu Ala Glu195

Arg Val Ala Tyr210

Met Asn Ala Lys225

Gly Gln Gly Tyr

Pro Lys Asp Thr260

Asp Ile Ile Gly275

Ile Val Ser Glu290

Lys Leu Ala Ala305

Val Asp Ile MetPhe Glu Pro Thr

85

Val Ile Gly Asp

Ile Lys Ser Thr120

Phe Asn Tyr Ser135

Arg Ala Leu Tyr150

Asp Ser Pro Ile165

Lys Thr Pro Leu

Ala Val Lys Leu200

Phe Asn Glu Leu215

Glu Ile Ile Asp230

Ser Asn Pro Ser245

Lys Gln Leu Leu

Ala Ile Val Glu280

Val Glu Asn Arg295

Lys Ala Gly Ser310

Glu Arg Leu Ala325

Val Glu Gln Phe

75

90

Val Ile Glu Asn105

Ile Pro Ile Gly

Asn Ile Ile Phe140

Asp Asn Leu Tyr155

Ala Leu Lys Phe170

Ala Pro Val Leu185

Phe Ser Asn Thr

Asp Thr Phe Ala220

Gly Val Thr Leu235

Phe Gly Tyr Gly250

Ala Asn Phe Glu265

Ser Asn Glu Thr

Phe Pro Thr Thr300

Asp Asn Phe Arg315

Asn Arg Gly Tyr330

Glu Asn Phe Glu

95

Thr Arg Thr Gln110

Phe Val Asp Lys125

Ser Pro Glu Phe

Pro Ser Arg Ile160

Ala Asn Leu Leu175

Thr Met Gly Thr190

Tyr Leu Ala Met205

Met Ser His Gly

Glu Pro Arg Ile240

Ala Tyr Cys Phe255

Gly Val Pro Gln270

Arg Lys Glu Ala285

Val Gly Val Tyr

Ser Ser Ala Ile320

His Ile Lys Ile335

Val Asp Asn AsnLeu Thr Thr Phe Ala Thr Asp Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val

Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp

Val Tyr Gly Asp Asn385

<210> 15

<211> 1443

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 15

atggtgaaga tctgttgtat tggagctgga tatgtaggag gaccaacaat ggcagtgatt 60

gcattgaaat gtccagatat tgaagtggca gttgttgata tctctgttcc tagaatcaac 120

15 gcttggaaca gtgatcagct tccgatttac gagccaggtc ttgacgatat cgttaagcaa 180

tgcagaggaa agaatctttt cttcagtact gatgtggaga aacatgttag agaagctgat 240

attgtctttg tctctgttaa cacaccgact aaaacgactg gtcttggagc tgggaaagct 300

gctgatctca cttattggga gagtgctgct cgtatgatcg cggatgtatc ggtttctgac 360

aagattgttg ttgagaaatc gactgttccg gtgaagacag ctgaagctat tgagaagatt 420

ttgatgcata acagtaaagg aatcaagttt cagattcttt cgaatccgga gtttcttgct 480

gaaggaactg ctatcgctga tctttttaac cctgaccgtg ttttgatcgg agggcgagaa 540

acacctgaag gattcaaagc tgttcagaca cttaaagagg tttatgctaa ttgggttcct 600

gaaggtcaga tcatcacaac taatctctgg tctgctgagc tttctaagtt agctgcaaat 660

gctttcttgg ctcagaggat ttcatcagtc aatgccatgt ctgcactttg tgaatccact 720

ggtgctgatg ttactcaagt gtcttacgct gttggtactg attcaagaat cggttccaaa 780

ttcttgaacg ctagtgttgg attcggaggt tcttgtttcc agaaggacat tctgaatctc 840

gtctacatct gtcaatgcaa cggacttcca gaagtggcgg aatactggaa acaagtgatc 900

aagatcaacg attaccaaaa gaaccggttc gtgaacagaa tcgtgtcctc tatgttcaac 960

actgtctcca acaagaaggt tgcgattctt ggattcgcat tcaagaaaga cactggtgac 1020

acaagggaaa cacctgccat tgatgtgtgt aaaggtctat taggagacaa agcacagatc 1080

agtatctatg atcctcaagt cacagaggaa cagattcaga gagatctctc gatgaaaaag 1140

ttcgactggg accatcctct tcacttgcag ccaatgagtc caaccacagt gaaacaagtg 1200agtgtgactt gggacgcata tgaagctaca aaagacgcac acgcggtttg cgttttgact 1260gagtgggacg agtttaagtc gttagattac cagaagatct tcgacaacat gcagaaaccg 1320gcttttatct tcgacggaag aaacattatg aatgttaaca agttaagaga gattggtttc 1380attgtttact ccattggtaa gccacttgac ccatggctca aggacatgcc tgcctttgtc 1440taa 1443

<210> 16<211> 480<212 > PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 16

Met Val Lys Ile Cys Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Val Gly Gly Pro Thr1 5 10 15

Met Ala Val Ile Ala Leu Lys Cys Pro Asp Ile Glu Val Ala Val Val20 25 30

Asp Ile Ser Val Pro Arg Ile Asn Ala Trp Asn Ser Asp Gln Leu Pro35 40 45

Ile Tyr Glu Pro Gly Leu Asp Asp Ile Val Lys Gln Cys Arg Gly Lys

50 55 60

Asn Leu Phe Phe Ser Thr Asp Val Glu Lys His Val Arg Glu Ala Asp65 70 75 80

Ile Val Phe Val Ser Val Asn Thr Pro Thr Lys Thr Thr Gly Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Lys Ala Ala Asp Leu Thr Tyr Trp Glu Ser Ala Ala Arg Met100 105 110

Ile Ala Asp Val Ser Val Ser Asp Lys Ile Val Val Glu Lys Ser Thr115 120 125

Val Pro Val Lys Thr Ala Glu Ala Ile Glu Lys Ile Leu Met His Asn

130 135 140

Ser Lys Gly Ile Lys Phe Gln Ile Leu Ser Asn Pro Glu Phe Leu Ala145 150 155 160

Glu Gly Thr Ala Ile Ala Asp Leu Phe Asn Pro Asp Arg Val Leu Ile165 170 175Gly Gly Arg Glu Thr Pro Glu Gly Phe Lys Ala Val Gln Thr Leu Lys

180 185 190

Glu Val Tyr Ala Asn Trp Val Pro Glu Gly Gln Ile Ile Thr Thr Asn195 200 205

Leu Trp Ser Ala Glu Leu Ser Lys Leu Ala Ala Asn Ala Phe Leu Ala210 215 220

Gln Arg Ile Ser Ser Val Asn Ala Met Ser Ala Leu Cys Glu Ser Thr225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Thr Gln Val Ser Tyr Ala Val Gly Thr Asp Ser Arg245 250 255

Ile Gly Ser Lys Phe Leu Asn Ala Ser Val Gly Phe Gly Gly Ser Cys260 265 270

Phe Gln Lys Asp Ile Leu Asn Leu Val Tyr Ile Cys Gln Cys Asn Gly275 280 285

Leu Pro Glu Val Ala Glu Tyr Trp Lys Gln Val Ile Lys Ile Asn Asp290 295 300

Tyr Gln Lys Asn Arg Phe Val Asn Arg Ile Val Ser Ser Met Phe Asn305 310 315 320

Thr Val Ser Asn Lys Lys Val Ala Ile Leu Gly Phe Ala Phe Lys Lys325 330 335

Asp Thr Gly Asp Thr Arg Glu Thr Pro Ala Ile Asp Val Cys Lys Gly340 345 350

Leu Leu Gly Asp Lys Ala Gln Ile Ser Ile Tyr Asp Pro Gln Val Thr355 360 365

Glu Glu Gln Ile Gln Arg Asp Leu Ser Met Lys Lys Phe Asp Trp Asp370 375 380

His Pro Leu His Leu Gln Pro Met Ser Pro Thr Thr Val Lys Gln Val385 390 395 400

Ser Val Thr Trp Asp Ala Tyr Glu Ala Thr Lys Asp Ala His Ala Val405 410 415

Cys Val Leu Thr Glu Trp Asp Glu Phe Lys Ser Leu Asp Tyr Gln Lys420 425 430Ile Phe Asp Asn Met Gln Lys Pro Ala Phe Ile Phe Asp Gly Arg Asn

Ile Met Asn Val Asn Lys Leu Arg Glu Ile Gly Phe Ile Val Tyr Ser

<210> 17<211> 1443<212> DNA<213> Arabidopsis thaliana<400> 17

atggtgaaga tatgttgtat tggagctggg tatgttggtg gaccaacaat ggcagtgatt 60

gcattgaaat gtccagacgt tgaagtagcg gttgttgata tctctgtacc acgtatcaac 120

gcttggaaca gtgacacgct tccgatttac gagcctggtc ttgatgatgt tgtgaagcaa 180

tgccgtggca agaacctttt ctttagtact gatgttgaga aacatgttag ggaagctgat 240

attgtgtttg tttctgtcaa cacaccgact aagactagag gtcttggtgc tggtaaagct 300

gcggatctta cgtactggga gagcgctgcg cgtatgatcg ctgatgtttc ggtatcggat 360

aagattgtcg ttgagaaatc gactgttccg gttaaaacag ctgaagctat tgagaagatt 420

ttgacacata acagtaaagg gattaagttt cagattcttt cgaatcccga gtttttggcg 480

gaaggaaccg cgattaagga cctatttaat ccggaccgtg ttcttatcgg agggcgggaa 540

accccagaag ggtttaaagc ggtgcagact ctcaagaatg tgtatgcaca ctgggttcct 600

gaaggccaaa tcataacaac caatctctgg tctgctgagc tgtccaagct tgcggcaaac 660

gctttcttgg ctcaaaggat ttcatcagtg aatgctatgt cggctctgtg tgaagccaca 720

ggcgcagatg tcacgcaagt gtcttacgcg gttggtacag actcaaggat tggtcccaag 780

ttcttgaact cgagtgttgg attcggtggt tcgtgtttcc agaaggacat tctgaatctt 840

gtctacatct gtgagtgcaa cggactcccg gaagtggcag agtactggaa gcaagtcatc 900

aagatcaatg actaccagaa gagccggttc gtgaaccgtg ttgtttcctc catgttcaac 960

tctgtatcaa acaagaagat tgcggttctc ggtttcgcat tcaagaaaga caccggtgac 1020

acaagggaga ctccagccat cgatgtgtgc aagggtcttt tagaagacaa agcaaggcta 1080

agcatttacg acccacaagt gactgaggat cagatccaga gggatttatc catgaacaag 1140

ttcgactggg accatcctct acatttgcag ccaatgagcc caacaacagt gaaacaagtg 1200

accgttactt gggacgcata cgaagcaact aaggacgctc acggtatctg catcatgacc 1260gagtgggatg agttcaagaa ccttgatttc cagaagatct ttgacaacat gcagaaacca 1320

gctttcgtgt tcgatggaag aaacattatg aatctgcaaa agctaaggga gattggtttc 1380

attgtttact ccattggtaa gcctctcgac gactggctca aggacatgcc tgccgttgcc 1440

taa 1443

<210> 18

<211> 480<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 18

Met Val Lys Ile Cys Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Val Gly Gly Pro Thr1 5 10 15

Met Ala Val Ile Ala Leu Lys Cys Pro Asp Val Glu Val Ala Val Val

20 25 30

Asp Ile Ser Val Pro Arg Ile Asn Ala Trp Asn Ser Asp Thr Leu Pro35 40 45

Ile Tyr Glu Pro Gly Leu Asp Asp Val Val Lys Gln Cys Arg Gly Lys

50 55 60

Asn Leu Phe Phe Ser Thr Asp Val Glu Lys His Val Arg Glu Ala Asp65 70 75 80

Ile Val Phe Val Ser Val Asn Thr Pro Thr Lys Thr Arg Gly Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Lys Ala Ala Asp Leu Thr Tyr Trp Glu Ser Ala Ala Arg Met

100 105 110

Ile Ala Asp Val Ser Val Ser Asp Lys Ile Val Val Glu Lys Ser Thr115 120 125

Val Pro Val Lys Thr Ala Glu Ala Ile Glu Lys Ile Leu Thr His Asn

130 135 140

Ser Lys Gly Ile Lys Phe Gln Ile Leu Ser Asn Pro Glu Phe Leu Ala145 150 155 160

Glu Gly Thr Ala Ile Lys Asp Leu Phe Asn Pro Asp Arg Val Leu Ile165 170 175

Gly Gly Arg Glu Thr Pro Glu Gly Phe Lys Ala Val Gln Thr Leu Lys180 185 190

Asn Val Tyr Ala His Trp Val Pro Glu Gly Gln Ile Ile Thr Thr Asn

195 200 205

Leu Trp Ser Ala Glu Leu Ser Lys Leu Ala Ala Asn Ala Phe Leu Ala

210 215 220

Gln Arg Ile Ser Ser Val Asn Ala Met Ser Ala Leu Cys Glu Ala Thr225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Thr Gln Val Ser Tyr Ala Val Gly Thr Asp Ser Arg

245 250 255

Ile Gly Pro Lys Phe Leu Asn Ser Ser Val Gly Phe Gly Gly Ser Cys

260 265 270

Phe Gln Lys Asp Ile Leu Asn Leu Val Tyr Ile Cys Glu Cys Asn Gly

275 280 285

Leu Pro Glu Val Ala Glu Tyr Trp Lys Gln Val Ile Lys Ile Asn Asp

290 295 300

Tyr Gln Lys Ser Arg Phe Val Asn Arg Val Val Ser Ser Met Phe Asn305 310 315 320

Ser Val Ser Asn Lys Lys Ile Ala Val Leu Gly Phe Ala Phe Lys Lys

325 330 335

Asp Thr Gly Asp Thr Arg Glu Thr Pro Ala Ile Asp Val Cys Lys Gly

340 345 350

Leu Leu Glu Asp Lys Ala Arg Leu Ser Ile Tyr Asp Pro Gln Val Thr

355 360 365

Glu Asp Gln Ile Gln Arg Asp Leu Ser Met Asn Lys Phe Asp Trp Asp

370 375 380

His Pro Leu His Leu Gln Pro Met Ser Pro Thr Thr Val Lys Gln Val385 390 395 400

Thr Val Thr Trp Asp Ala Tyr Glu Ala Thr Lys Asp Ala His Gly Ile

405 410 415

Cys Ile Met Thr Glu Trp Asp Glu Phe Lys Asn Leu Asp Phe Gln Lys

420 425 430

Ile Phe Asp Asn Met Gln Lys Pro Ala Phe Val Phe Asp Gly Arg AsnIle Met Asn Leu Gln Lys Leu Arg Glu Ile Gly Phe Ile Val Tyr Ser

Ile Gly Lys Pro Leu Asp Asp Trp Leu Lys Asp Met Pro Ala Val Ala

<210> 19<211> 1443<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana<400> 19

atggtgaaga tttgctgcat tggagctgga tatgttggtg gtccaaccat ggctgtcatt 60

gctctaaagt gtccatctgt tgaagtagct gttgttgata tctctgtgcc aaggatcaat 120

gcctggaaca gtgatcagtt accgatctat gagcctggtc ttgatgatgt cgttaagcag 180

tgccgtggaa agaatctctt cttcagcacc gatgttgaga aacatgtgag agaggctgac 240

attgtttttg tgtctgtcaa cacccctact aagacccgtg gtcttggagc tggcaaagct 300

gcggatttga cttactggga gagcgctgct cgtatgattg ccgatgtttc ggtttccgac 360

aagattgttg ttgagaaatc aactgttcct gtcaaaaccg cagaggcaat tgagaagatt 420

cttacacaca acagcaaagg aatcaaattc cagattctgt caaaccctga gttccttgct 480

gaaggaaccg ctattgaaga ccttttcatg cctgaccgtg tcctcatcgg tggtcgtgaa 540

acaactgaag gctttgcagc cgtcaaagcc ttgaaagaca tttatgccca atgggtccct 600

gaagagagaa tcctcaccac caatctatgg tctgccgagc tttccaagct tgcagctaat 660

gccttcctag cccagagaat ctcatcagtc aatgcaatgt ccgctctctg tgaggcaact 720

ggcgccaatg tctcagaggt ctcttatgct gtgggcaaag actctcgtat tggtcccaag 780

ttcttgaact ctagtgttgg gttcggagga tcttgtttcc agaaagatat tctcaactta 840

gtctacatct gcgaatgcaa cggcttaccc gaagttgctg agtactggaa acaagtcatc 900

aagatcaacg actaccagaa aacccgattt gttaaccgca ttgtctcttc aatgtttaac 960

acagtctcca acaaaaagat tgcggttctc ggcttcgctt tcaagaaaga cactggagac 1020

actagagaga ctccagccat tgatgtctgc aaaggtctgt taggtgacaa ggctcgtctc 1080

agcatctacg acccacaagt cactgaagag cagatccaaa gagacttaac catgaacaaa 1140

ttcgactggg accacccact tcatctccag cccatgagcc ccaccactgt gaagcaagtc 1200

tcagtcgctt gggacgcata cactgcaacc aaagacgccc acggtatctg cattttaacc 1260

gagtgggacg agttcaagaa acttgatttc cagcggatct ttgagaatat gcagaaaccg 1320gcttttgttt ttgacggtag aaacgtggtc gacgctgata aactcaggga gattgggttt 1380attgtttact ccattggtaa gccattggac cagtggctca aggacatgcc tgctcttgcc 1440taa 1443

<210> 20<211> 480

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 20

Met Val Lys Ile Cys Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Val Gly Gly Pro Thr1 5 10 15

Met Ala Val Ile Ala Leu Lys Cys Pro Ser Val Glu Val Ala Val Val

20 25 30

Asp Ile Ser Val Pro Arg Ile Asn Ala Trp Asn Ser Asp Gln Leu Pro35 40 45

Ile Tyr Glu Pro Gly Leu Asp Asp Val Val Lys Gln Cys Arg Gly Lys50 55 60

Asn Leu Phe Phe Ser Thr Asp Val Glu Lys His Val Arg Glu Ala Asp65 70 75 80

Ile Val Phe Val Ser.Val Asn Thr Pro Thr Lys Thr Arg Gly Leu Gly85 90 95

Ala Gly Lys Ala Ala Asp Leu Thr Tyr Trp Glu Ser Ala Ala Arg Met

100 105 110

Ile Ala Asp Val Ser Val Ser Asp Lys Ile Val Val Glu Lys Ser Thr115 120 125

Val Pro Val Lys Thr Ala Glu Ala Ile Glu Lys Ile Leu Thr His Asn130 135 140

Ser Lys Gly Ile Lys Phe Gln Ile Leu Ser Asn Pro Glu Phe Leu Ala145 150 155 160

Glu Gly Thr Ala Ile Glu Asp Leu Phe Met Pro Asp Arg Val Leu Ile165 170 175

Gly Gly Arg Glu Thr Thr Glu Gly Phe Ala Ala Val Lys Ala Leu Lys180 185 190Asp Ile Tyr Ala Gln Trp Val Pro Glu Glu Arg Ile Leu Thr Thr Asn

195 200 205

Leu Trp Ser Ala Glu Leu Ser Lys Leu Ala Ala Asn Ala Phe Leu Ala210 215 220

Gln Arg Ile Ser Ser Val Asn Ala Met Ser Ala Leu Cys Glu Ala Thr225 230 235 240

Gly Ala Asn Val Ser Glu Val Ser Tyr Ala Val Gly Lys Asp Ser Arg

245 250 255

Ile Gly Pro Lys Phe Leu Asn Ser Ser Val Gly Phe Gly Gly Ser Cys 260 265 270

Phe Gln Lys Asp Ile Leu Asn Leu Val Tyr Ile Cys Glu Cys Asn Gly

275 280 285

Leu Pro Glu Val Ala Glu Tyr Trp Lys Gln Val Ile Lys Ile Asn Asp290 295 300

Tyr Gln Lys Thr Arg Phe Val Asn Arg Ile Val Ser Ser Met Phe Asn305 310 315 320

Thr Val Ser Asn Lys Lys Ile Ala Val Leu Gly Phe Ala Phe Lys Lys

325 330 335

Asp Thr Gly Asp Thr Arg Glu Thr Pro Ala Ile Asp Val Cys Lys Gly 340 345 350

Leu Leu Gly Asp Lys Ala Arg Leu Ser Ile Tyr Asp Pro Gln Val Thr

355 360 365

Glu Glu Gln Ile Gln Arg Asp Leu Thr Met Asn Lys Phe Asp Trp Asp370 375 380

His Pro Leu His Leu Gln Pro Met Ser Pro Thr Thr Val Lys Gln Val385 390 395 400

Ser Val Ala Trp Asp Ala Tyr Thr Ala Thr Lys Asp Ala His Gly Ile

405 410 415

Cys Ile Leu Thr Glu Trp Asp Glu Phe Lys Lys Leu Asp Phe Gln Arg 420 425 430

Ile Phe Glu Asn Met Gln Lys Pro Ala Phe Val Phe Asp Gly Arg Asn

435 440 445Val Val Asp Ala Asp Lys Leu Arg Glu Ile Gly Phe Ile Val Tyr Ser

Ile Gly Lys Pro Leu Asp Gln Trp Leu Lys Asp Met Pro Ala Leu Ala

<210> 21<211> 1446<212> DNA<213> Arabidopsis thaliana<400> 21

atggtgaaga tatgctgcat aggagctggt tatgtgggtg gtccaaccat ggcggtgatg 60

gctcttaagt gtcctgagat tgaagtagtc gttgtggata tctctgaacc aaggatcaat 120

gcttggaaca gtgataggct tcctatttac gagccgggat tggaagatgt ggtgaaacaa 180

tgcagaggga aaaacctctt ctttagcaca gacgtggaga aacatgtatt tgagagtgat 240

attgtatttg tctcagttaa cactccaacc aaaacacaag gtcttggtgc tggcaaagct 300

gctgatctta cttactggga gagtgctgct cggatgatcg ctgatgtctc caaatctagc 360

aaaatcgttg ttgagaaatc cacggttcct gtgaggacag cagaggctat tgaaaagata 420

ctgacacata acagcaaagg catagagttt cagattctct ctaaccctga atttcttgct 480

gagggtactg caattaagga tctttataac ccagaccgtg tgttgattgg tggtagggat 540

actgcagcag ggcaaaaggc tattaaagct ttaagagatg tttatgctca ttgggttcca 600

gtggaacaaa tcatttgcac gaacctgtgg tccgctgagc tctctaagct tgcagcaaat 660

gcattcttag ctcagaggat atcatctgtc aatgccatgt cagctctatg tgaggcaact 720

ggcgctgatg ttacacaagt tgcgcatgcc gtgggtacag atactagaat tggtccaaag 780

ttcttgaatg ctagtgttgg ttttggtgga tcatgtttcc aaaaggacat cctaaatctt 840

atctatattt gtgaatgcaa cggcttgccc gaagcagcta attactggaa acaagtcgta 900

aaggtgaacg actatcagaa aatacggttt gcaaaccggg ttgtttcttc aatgtttaac 960

acagtctcgg gcaagaaaat cgcgatcctc ggttttgcct tcaagaagga cacaggtgac 1020

acgagagaga ctccagcgat tgatgtttgt aacagattag ttgcagacaa ggccaagctg 1080

agcatatacg acccacaagt tcttgaagaa cagatcagaa gagatctttc catggctagg 1140

tttgactggg accaccctgt tcctcttcag cagattaaag ctgaaggtat ctcagagcaa 1200

gtgaatgtcg tctcagatgc ttacgaggca actaaagatg cgcacggcct atgtgtctta 1260

accgaatggg atgagtttaa atccttggac ttcaagaaaa tctttgacaa tatgcagaaa 1320

ccagcttttg tgttcgatgg taggaatgtt gttgatgcag tgaagctgcg tgagatcggt 1380ttcatcgtct actccattgg taaaccgctt gattcatggc tcaaggatat gcctgctgtg 1440gcatga 1446

<210> 22<211> 481<212> PRT

<213> Arabídopsis thaliana<400> 22

Met Val Lys Ile Cys Cys Ile Gly Ala Gly Tyr Val Gly Gly Pro Thr1 5 10 15

Met Ala Val Met Ala Leu Lys Cys Pro Glu Ile Glu Val Val Val Val20 25 30

Asp Ile Ser Glu Pro Arg Ile Asn Ala Trp Asn Ser Asp Arg Leu Pro

35 40 45

Ile Tyr Glu Pro Gly Leu Glu Asp Val Val Lys Gln Cys Arg Gly Lys50 55 60

Asn Leu Phe Phe Ser Thr Asp Val Glu Lys His Val Phe Glu Ser Asp65 70 75 80

Ile Val Phe Val Ser Val Asn Thr Pro Thr Lys Thr Gln Gly Leu Gly85 90 95

Ala Gly Lys Ala Ala Asp Leu Thr Tyr Trp Glu Ser Ala Ala Arg Met100 105 110

Ile Ala Asp Val Ser Lys Ser Ser Lys Ile Val Val Glu Lys Ser Thr

115 120 125

Val Pro Val Arg Thr Ala Glu Ala Ile Glu Lys Ile Leu Thr His Asn130 135 140

Ser Lys Gly Ile Glu Phe Gln Ile Leu Ser Asn Pro Glu Phe Leu Ala145 150 155 160

Glu Gly Thr Ala Ile Lys Asp Leu Tyr Asn Pro Asp Arg Val Leu Ile165 170 175

Gly Gly Arg Asp Thr Ala Ala Gly Gln Lys Ala Ile Lys Ala Leu Arg180 185 190

Asp Val Tyr Ala His Trp Val Pro Val Glu Gln Ile Ile Cys Thr Asn195 200 205

Leu Trp Ser Ala Glu Leu Ser Lys Leu Ala Ala Asn Ala Phe Leu Ala

210 215 220

Gln Arg Ile Ser Ser Val Asn Ala Met Ser Ala Leu Cys Glu Ala Thr225 230 235 240

Gly Ala Asp Val Thr Gln Val Ala His Ala Val Gly Thr Asp Thr Arg

245 250 255

Ile Gly Pro Lys Phe Leu Asn Ala Ser Val Gly Phe Gly Gly Ser Cys

260 265 270

Phe Gln Lys Asp Ile Leu Asn Leu Ile Tyr Ile Cys Glu Cys Asn Gly

275 280 285

Leu Pro Glu Ala Ala Asn Tyr Trp Lys Gln Val Val Lys Val Asn Asp

290 295 300

Tyr Gln Lys Ile Arg Phe Ala Asn Arg Val Val Ser Ser Met Phe Asn305 310 315 320

Thr Val Ser Gly Lys Lys Ile Ala Ile Leu Gly Phe Ala Phe Lys Lys

325 330 335

Asp Thr Gly Asp Thr Arg Glu Thr Pro Ala Ile Asp Val Cys Asn Arg

340 345 350

Leu Val Ala Asp Lys Ala Lys Leu Ser Ile Tyr Asp Pro Gln Val Leu

355 360 365

Glu Glu Gln Ile Arg Arg Asp Leu Ser Met Ala Arg Phe Asp Trp Asp

370 375 380

His Pro Val Pro Leu Gln Gln Ile Lys Ala Glu Gly Ile Ser Glu Gln385 390 395 400

Val Asn Val Val Ser Asp Ala Tyr Glu Ala Thr Lys Asp Ala His Gly

405 410 415

Leu Cys Val Leu Thr Glu Trp Asp Glu Phe Lys Ser Leu Asp Phe Lys

420 425 430

Lys Ile Phe Asp Asn Met Gln Lys Pro Ala Phe Val Phe Asp Gly Arg

435 440 445

Asn Val Val Asp Ala Val Lys Leu Arg Glu Ile Gly Phe Ile Val Tyr450 455 460

Ser Ile Gly Lys Pro Leu Asp Ser Trp Leu Lys Asp Met Pro Ala Val465 470 475 480

Ala <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> The sequence of designed polynucleotide <400> 23

gggaattcgt gaagatctgt tgtattggag ct 32

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do PolinucleotIdeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 1

<400> 24

cagaagcttt tagacaaagg caggcatgtc ctt 33

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 1

<400> 25

ggaattcgtg aagatatgtt gtattggagc 30

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 1

<400> 26

aactgcagtt aggcaacggc aggcatgtcct 31

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 1

<400> 27

ggaattcgtg aagatttgct gcattggagc 30

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 1

<400> 28

aactgcagtt aggcaagagc aggcatgtcc t 31

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 1

<400> 29

ggaattcgtg aagatatgct gcataggagc 30

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do PolinucleotIdeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 1

<400> 30

gatctagatc atgccacagc aggcatatcct 31

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 2

<400> 31

ggaattctca cgaatcgcag tcgttggttg 30

<210> 32

<211> 32

<212 > DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 2

<400> 32

gactgcagtt agttatcgcc atatacatca cg 32

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 3

<400> 33

gagagtcgac ctattgagta gtcacactct ttgccagatt 40

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 3<400> 34

atgtgtggaa tcttcgcgta tctgaatttt cacgc 35

<210> 35

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 4

<400> 35

tctgtacgat gcaactacca atgctcagt 29

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<22 0 >

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 4

<400> 36

tatcttacct gggtcaaatg acgaacataa 30

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 4

<400> 37

atgtgtggca tctttggagc actgtcaaac aac 33

<210> 38

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do PolinucleotIdeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 4

<400> 38

aactgcagtt aaaaggtggt cacggatttt gcaagattc 39

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotideo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 1

<400> 39

aactgcagtt aaaaggtggt cacagatttc gcaagattc 39

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do PolinucleotIdeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 5

<400> 40

ccggatccat gggtaaaaat ataatcataa 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Seqüência do PolinucleotIdeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo 5

<400> 41

tatatttaaa tcacacagac tgagcattgg 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo

<400> 42

aaggatccga tgtgtggcat ctttggagca 30

<210> 43

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo

<400> 43

aaggatccat gtcacgaatc gcagtcgttg gtt 33

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do Polinucleotídeo Desenvolvido de acordo com o Exemplo

<400> 44

ccgagctctt agttatcgcc atatacatca cgtgt 35

Claims

1. Método para produzir ácido hialurônico, compreendendo co-expressar uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase e umaproteína exógena com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase em umacélula vegetal ou uma planta e uma proteína exógena tendo nucleotídeo deaçúcar sintase atividade em uma célula vegetal ou uma planta.

2. Método para produzir ácido hialurônico, contendo as etapasde:(1) transformar uma célula vegetal ou uma planta usando um vetor de ex-pressão recombinante, o vetor de expressão recombinante tendo DNAcodificando uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase eDNA codificando uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcarsintase, cada DNA referido estando sob controle de um promotor vege-tal;(2) cultivar um transformante obtido pela transformação; e(3) isolar ácido hialurônico produzido pelo transformante.

3. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com a rei-vindicação 2, em que o promotor é um promotor órgão-específico ou um te-cido-específico.

4. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com a rei-vindicação 2 ou 3, em que o DNA codificando uma proteína com atividade deácido hialurônico sintase é DNA de (a) ou (b) abaixo:(a) DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos representada pela SEQ IDNO: 1 o 3; ou(b) DNA hibridizando de modo complementar à seqüência de nucleotídeosde (a) sob condições estringentes, e o DNA codificando uma proteínacom atividade de ácido hialurônico sintase.

5. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 3, em que a proteína com atividade de áci-do hialurônico sintase é uma proteína de (a) ou (b):(a) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada pelaSEQ ID NO: 2 ou 4; ou(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a pro-teína tendo atividade de ácido hialurônico sintase.

6. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 5, em que o nucleotídeo de açúcar é uridin--5'-difosfo(UDP)-N-acetilglucosamina ou ácido UDP-glucurônico.

7. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 6, em que a proteína com atividade de nu-cleotídeo de açúcar sintase é no mínimo uma proteína selecionada entre ogrupo consistindo em glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase, UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosamina mutase, glucosami-na-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1 -fosfato N-acetiltransferase,fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase, hexoquinase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquinase e glucuronato--1-fosfato uridil transferase.

8. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 6, em que a proteína com atividade de nu-cleotídeo de açúcar sintase é no mínimo uma proteína selecionada entre ogrupo consistindo em UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glu-cosamina mutase, glucosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina--1-fosfato N-acetiltransferase, fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quina-se, hexoquinase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogena-se, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucurono-quinase e glucuronato-1-fosfato uridil transferase, e glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase.

9. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 6, em que uma proteína com atividade denucleotídeo de açúcar sintase é glutamina:frutose-6-fosfato amidotransfera-se ou UDP-glucose desidrogenase.

10. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 2 a 9, em que DNA codificando uma proteínacom nucleotídeo de açúcar sintase atividade é DNA derivado de vírus chlo-rella ou Arabidopsis.

11. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 2 a 10, em que DNA codificando uma proteínacom atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é DNA de (a) ou (b) abaixo:(a) DNAtendo uma seqüência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 5, 7 ou 9; ou(b) DNA hibridizando de modo complementar à seqüência de nucleotídeosde (a) sob condições estringentes, e o referido DNA codificando umaproteína com atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransfera-se.

12. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 10, em que a proteína com atividade denucleotídeo de açúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:(a) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada pelaSEQ ID NO: 6, 8 ou 10; ou(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a pro-teína tendo atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase.

13. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 2 a 10, em que DNA codificando uma proteínacom atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é DNA de (a) ou (b) abaixo:(a) DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos mostrada pela SEQ IDNO: 11, 13, 17, 19, ou 21; ou(b) DNA hibridizando de modo complementar à seqüência de nucleotídeosde (a) sob condições estringentes, e o DNA codificando uma proteínacom atividade de UDP-glucose desidrogenase.

14. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 10, em que a proteína com atividade denucleotídeo de açúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:(a) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada pelaSEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ou 22; ou(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a pro-teína tendo atividade de UDP-glucose desidrogenase.

15. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com qual-quer uma das reivindicações 1 a 14, em que uma planta é selecionada entreo grupo consistindo em angiospermas, gimnospermas, pteridófitos e briófi-tas.

16. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com a rei-vindicação 3, em que um ou mais órgãos são selecionados entre o grupoconsistindo em raízes, caules, tuberosidades de caules, folha, órgãos florais,raízes tuberosas, sementes e ápices dos brotos.

17. Método para produzir ácido hialurônico de acordo com a rei-vindicação 3, em que um ou mais tecidos são selecionados entre o grupoconsistindo em epiderme, floema, tecidos moles, xilema e feixes vasculares.

18. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica ten-do a capacidade de produzir ácido hialurônico por coexpressão de uma pro-teína com atividade de ácido hialurônico sintase e uma proteína exógenacom atividade de nucleotídeo de açúcar sintase, uma progênie da mesma,ou um órgão ou um tecido da mesma.

19. Célula de planta transgênica ou uma planta transgênica sen-do transformada com um vetor de expressão recombinante contendo DNAcodificando uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase e DNAcodificando uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase,cada DNA referido estando sob controle de um promotor vegetal; uma pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas; ou um órgão ou um tecido dasmesmas.

20. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com a reivindicação 19, em que o promotor é um promo-tor órgão-específico ou um tecido-específico.

21. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em que o DNAcodificandouma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase é DNA de (a) ou (b)abaixo:(a) DNAtendo uma seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1 5 ou 3; ou(b) DNA hibridizando de modo complementar à DNA tendo a seqüência denucleotídeos de (a) sob condições estringentes, e o DNA codificandouma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase.

22. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica de a-cordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, em que a proteína comatividade de ácido hialurônico sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:(a) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada pelaSEQ ID NO: 2 ou 4; ou(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a pro-teína tendo atividade de ácido hialurônico sintase.

23. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, em que onucleotídeo de açúcar é UDP-N-acetilglucosamina ou ácido UDP-glucurônico.

24. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica de a-cordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, em que a proteína comatividade de nucleotídeo de açúcar sintase é no mínimo uma proteína sele-cionada entre o grupo consistindo em, glutamina:frutose-6-fosfato amido-transferase, UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosaminamutase, glucosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1 -fosfato N-acetiltransferase, fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase, hexoqui-nase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquinase eglucuronato-1-fosfato uridil transferase.

25. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, em que aproteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é no mínimo umaproteína selecionada entre o grupo consistindo em UDP-N-acetilglucosaminadifosforilase, fosfoacetil glucosamina mutase, glucosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1 -fosfato N-acetiltransferase, fosfoglucomuta-se, N-acetilglucosamina quinase, hexoquinase, N-acetilglucosamina acetila-se, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase,inositol oxigenase, glucuronoquinase e glucuronato-1 -fosfato uridil transfera-se, e glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase.

26. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, em que aproteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase e/ou UDP-glucose desidrogenase.

27. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 26, em queDNA codificando uma proteína com nucleotídeo de açúcar sintase atividadeé derivado de chlorella vírus, Arabidopsis, ou vírus chlorella e Arabidopsis.

28. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica de a-cordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 27, em que DNA codifican-do uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é DNA de(a) ou (b) abaixo:(a) DNAtendo uma seqüência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 5, 7 ou 9; ou(b) DNA hibridizando de modo complementar à seqüência de nucleotídeosde (a) sob condições estringentes, e o DNA codificando uma proteínacom atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase;a progênie tendo a mesma natureza das mesmas; ou o órgão ou o tecidodas mesmas.

29. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 27, em que aproteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é uma proteína de(a) ou (b) abaixo:(a) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada pelaSEQ ID NO: 6, 8 ou 10; ou(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a pro-teína tendo atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase.

30. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 27, em queDNA codificando uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sin-tase é DNA de (a) ou (b) abaixo:(a) DNAtendo uma seqüência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO:11, 13, 15, 17, 19, ou 21; ou(b) DNA hibridizando de modo complementar à seqüência de nucleotídeosde (a) sob condições estringentes, e o DNA codificando uma proteínacom atividade de DP-glucose desidrogenase.

31. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 27, em que aproteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase é uma proteína de(a) ou (b) abaixo:(a) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada pelaSEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ou 22; ou(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a refe-rida proteína com atividade de UDP-glucose desidrogenase.

32. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 31, em que aplanta é qualquer planta selecionada entre o grupo consistindo em gimnos-permas, pteridófitos e briófitas.

33. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas; ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 31, em que oórgão sendo um ou mais órgãos selecionados entre o grupo consistindo emraízes, caules, tuberosidades de caules, folhas, órgãos florais, raízes tubero-sas, sementes e ápices dos brotos.

34. Célula de planta transgênica ou a planta transgênica, a pro-gênie tendo a mesma natureza das mesmas, ou o órgão ou o tecido dasmesmas de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 31, em que otecido é um ou mais tecidos selecionados entre o grupo consistindo em epi-derme, floema, tecidos moles, xilema e feixes vasculares.

35. Extrato vegetal obtido da célula de planta transgênica ou daplanta transgênica, da progênie tendo a mesma natureza das mesmas, oudo órgão ou do tecido das mesmas como definidos em qualquer uma dasreivindicações 18 a 34.

36. Extrato vegetal de acordo com a reivindicação 35, em que oextrato vegetal contém ácido hialurônico.

37. Vetor de expressão recombinante, compreendendo DNA co-dificando uma proteína com atividade de ácido hialurônico sintase e DNAcodificando uma proteína com atividade de nucleotídeo de açúcar sintase,cada DNA referido estando sob controle de um promotor vegetal.

38. Vetor de expressão recombinante de acordo com a reivindi-cação 37, em que o promotor é um promotor órgão-específico ou um tecido-específico.

39. Vetor de expressão recombinante de acordo com a reivindi-cação 37 ou 38, em que o DNA codificando uma proteína com atividade deácido hialurônico sintase é DNA de (a) ou (b) abaixo:(a) DNAtendo uma seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1ou 3; ou(b) DNA hibridizando de modo complementar a seqüência de nucleotídeosde (a) sob condições estringentes, e o DNA codificando uma proteínacom ácido hialurônico atividade.

40. Vetor de expressão recombinante de acordo com a reivindi-cação 37 ou 38, em que a proteína com atividade de ácido hialurônico sinta-se é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:(a) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada pelaSEQ ID NO: 2 ou 4; ou(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a pro-teína tendo atividade de ácido hialurônico sintase.

41. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualqueruma das reivindicações 37 a 40, em que o nucleotídeo de açúcar é UDP-N-acetilglucosamina ou ácido UDP-glucurônico.

42. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualqueruma das reivindicações 37 a 41, em que a proteína com atividade de nucleo-tídeo de açúcar sintase é no mínimo uma proteína selecionada entre o grupoconsistindo em glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase, UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosamina mutase, glucosami-na-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1 -fosfato N-acetiltransferase,fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase, hexoquinase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase, UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquinase e glucuronato--1-fosfato uridil transferase.

43. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualqueruma das reivindicações 37 a 41, em que a proteína com atividade de nucleo-tídeo de açúcar sintase é no mínimo uma proteína selecionada entre o grupoconsistindo em UDP-N-acetilglucosamina difosforilase, fosfoacetil glucosa-mina mutase, glucosamina-6-fosfato N-acetiltransferase, glucosamina-1 -fosfato N-acetiltransferase, fosfoglucomutase, N-acetilglucosamina quinase,hexoquinase, N-acetilglucosamina acetilase, UDP-glucose desidrogenase,UDP-glucose-1-fosfato uridiltransferase, inositol oxigenase, glucuronoquina-se e glucuronato-1-fosfato uridil transferase, e glutamina:frutose-6-fosfatoamidotransferase.

44. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualqueruma das reivindicações 37 e 41, em que a proteína com atividade de nucleo-tídeo de açúcar sintase é glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase ouUDP-glucose desidrogenase.

45. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualqueruma das reivindicações 37 a 41, em que o DNA codificando uma proteínacom nucleotídeo de açúcar sintase atividade é DNA derivado de chlorellavírus, Arabidopsis, ou vírus chlorella e Arabidopsis.

46. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualqueruma das reivindicações 37 a 44, em que o DNA codificando uma proteínacom nucleotídeo de açúcar sintase atividade é DNA de (a) ou (b) abaixo:(a) DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 5, 7 ou 9; ou(b) DNA hibridizando de modo complementar à seqüência de nucleotídeosde (a) sob condições estringentes, e o referido DNA codificando umaproteína com atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransfera-se.

47. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualqueruma das reivindicações 37 a 44, em que a proteína com atividade de nucleo-tídeo de açúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:(a) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada pela SEQID NO: 6, 8 ou 10; ou(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a prote-ína tendo atividade de glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase.

48. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualqueruma das reivindicações 37 a 44, em que o DNA codificando uma proteínacom nucleotídeo de açúcar sintase atividade é DNA de (a) ou (b) abaixo:(a) DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos mostrada pela SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, ou 21; ou(b) DNA hibridizando de modo complementar à seqüência de nucleotídeosde (a) sob condições estringentes, e o referido DNA codificando umaproteína com atividade de UDP-glucose desidrogenase.

49. Vetor de expressão recombinante de acordo com qualqueruma das reivindicações 37 a 44, em que a proteína com atividade de nucleo-tídeo de açúcar sintase é uma proteína de (a) ou (b) abaixo:(a) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos mostrada pelaSEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ou 22; ou(b) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de (a) com um ou unspoucos aminoácidos eliminados, substituídos ou adicionados, e a refe-rida proteína tendo atividade de UDP-glucose desidrogenase.

50. Método para gerar a célula de planta transgênica ou a plantatransgênica compreendendo transformar uma célula vegetal ou uma plantausando qualquer vetor como definido nas reivindicações 37 a 49, em que acélula de planta transgênica ou a planta transgênica têm a capacidade deproduzir ácido hialurônico.

51. Composição cosmética contendo ácido hialurônico como umagente ativo, em que o ácido hialurônico é obtido por qualquer um dos mé-todos para produzir ácido hialurônico como definido nas reivindicações 1 a-17.