BRPI0318314B1

BRPI0318314B1 - vetor, célula hospedeira de fungo ou bactéria, e método para a produção de uma planta transgênica tolerante ao stress de água.

Info

Publication number: BRPI0318314B1
Application number: BRPI0318314A
Authority: BR
Inventors: Claudio Marcelo Dunan; Carlos Alberto Dezar; Gabriela Marisa Gago; Hector Daniel Gonzalez; Lia Raquel Chan
Original assignee: Carlos Alberto Dezar; Gabriela Marisa Gago; Hector Daniel Gonzalez; Lia Raquel Chan
Priority date: 2003-05-02
Filing date: 2003-05-02
Publication date: 2015-10-27
Also published as: CN101405391B; WO2004099365A9; MXPA05011774A; US20100192252A1; AU2003237161A1; BR122014032137B1; CN101405391A; US8283521B2; US20070180584A1; US7674955B2; BR0318314A; WO2004099365A2; AU2003237161B2

Abstract

"molécula de ácido nucléico isolada que codifica o fator de transcrição hahb-4, vetor, plantas transgênicas, semente, células hospedeiras, método para a produção de uma planta transgênica tolerante ao stress de água, molécula isolada de ácido nucléico, construto de ácido nucléico e método para expressar pelo menos uma proteína de interesse em uma célula, hospedeira". foi caracterizado um novo gene de codificação do fator de transcrição induzido pelo deficit da água ou pelo ácido abscísico de helianthus annuus, que tem um homeodomínio associado a um zíper de leucina. o fator de transcrição é útil para ser clonado em construções de dna para transformar células hospedeiras e plantas. as plantas transgênicas que compreendem o gene do fator de transcrição são tolerantes e resistentes às condições ambientais prejudiciais tais como o stress de água e a salinidade elevada. um ácido nucléico que promove a seqüência também é apresentado, no qual a seqüência é induzida pelo deficit da água ou pelo ácido abscísico. as construções, as células hospedeiras e as plantas transgênicas que compreendem o gene do fator de transcrição são apresentadas.

Description

VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA DE FUNGO OU BACTÉRIA, E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA TOLERANTE AO STRESS DE ÁGUA ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um novo gene que codifica um fator da transcrição induzido por condições de "déficit" de água e pelo ácido abscisico de Helianthus sanuus, que tem um homeodominio associado a um ziper de leucina. 0 fator de transcrição é útil para ser clonado em construtos de DNA para a transformação de células e plantas hospedeiras. As plantas transgênicas que compreendem o fator de transcrição são resistentes às condições ambientais nocivas tais como o stress do déficit de água e a elevada salinidade. Um ácido nucléico que promove a seqüência também é obtido, no qual a seqüência pode ser induzida pelo déficit de água ou pelo ácido abscisico, pelos construtos, pelas células hospedeiras e pelas plantas transgênicas que compreendem a seqüência. 2. Descrição da Técnica Anterior 0 homeodominio é um motivo de 60 aminoácidos presente em uma série de fatores de transcrição eucariótica envolvidos em processos de desenvolvimento (Gehring, Science 236, 1245-1252, 1987) . Os genes que contêm homeocaixas foram isolados de muitos organismos eucarióticos incluindo fungos, mamiferos e plantas (Gehring, W. J., et al. , Annu. Rev. Biochem. 63, 487- 526, 1994) . As homeocaixas de plantas podem ser divididas em diversas familias de acordo com a conservação e a estrutura de seqüência dentro e fora do homeodomínio (Chan, R.L., et al. Biochim. Biophys. Acta 1442 (1), 1-19, 1998). Os membros de uma dessas famílias têm uma característica distinta: eles codificam as proteínas denominadas Hd-Zip, porque eles contêm um homeodomínio associado com um zíper de leucina, uma estrutura de enrolada-de rolo envolvida na dimerização. As proteínas Hd-Zip ligam o DNA eficientemente somente como díraeros (Sessa, G., et al., EMBO J. 12, 3507-3517, 1993; Palena C.M., et al·., Biochem J. 341, 81-87, 1999). Foi sugerido que essas proteínas podem ser envolvidas na regulação dos processos de desenvolvimento associados com a resposta das plantas às condições ambientais (Chan, R.L., et al. Biochim. Biophys. Acta 1442 (1), 1-19, 1998, Carabelli, M., et al., Plant J. 4, 469-479, 1993; Schena, M., et al., Genes Devei. 7, 367-379, 1993). Um dos stresses ambientais mais comuns aos quais as plantas são expostas é a desidratação. Embora muitas sementes tolerem a desidratação extrema, a tolerância é rara em partes vegetativas da planta. As plantas respondem ao stress da água com a expressão de um conjunto específico de genes, que permite que elas se adaptem às condições ambientais alteradas (Bray, E.A. Trends Plant Sei. 2, 48-54, 1997 e Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. Plant Physiol. 115, 327-334, 1997) . 0 hormônio ácido abscísico (ABA) desempenha um papel importante em um subconjunto dessas respostas (Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. Plant Physiol. 115, 327-334, 1997 e Leung, J. and Giraudat, J. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, 199-222, 1998) . A caracterização das regiões de promoção dos genes envolvidos na tolerância ou na resistência ao stress da água revelou a existência de um elemento que responda a ABA, ou seja, ABRE, e um elemento que responde à dessecação, ou seja, DRE. Sõderman et o al. apresentaram [descreveram] os [dois] genes, ATHB-7 e -6 de Arabidopsís que é [são] induzido(s) pelo ácido abscisico e pelo déficit de água (Sõderman E. et al., The Plant Journal 10: 375-381, 1996 e Soderman E. et al. Plant Molecular Biology 40: 1073-1083, 1999). Os autores não mostraram que a super-expressão desses genes confere tolerância ao déficit de água. A patente U.S. n°, 5.981.729 descreve um novo gene que é induzido pelo déficit de água e pelo ácido abscisico e que codifica um fator de transcrição de A. Thalíana. Essa patente não apresenta nenhuma referência às plantas transgênicas que contêm o gene da presente invenção e que resistem às condições de stress da água.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

Portanto, um objetivo da invenção consiste na apresentação de uma molécula isolada de ácido nucléico que codifica o fator de transcrição Hahb-4, um fragmento funcionalmente ativo ou uma variante do mesmo, que tem a seqüência de ácido nucléico da ID SEQ N° 1 ou um fragmento da mesma, em que a molécula do ácido nucléico é derivada de Helianthus annuus, e podem ser um mRNA ou o cDNA da ID SEQ N° 2, em que a molécula tem capacidade de ligação a uma seqüência de DNA 5' -CAAT (A/T) ATTG-3' ou a uma região de regulação da transcrição de desidratação da espécie de planta.

Ainda um outro objetivo da presente invenção consiste na apresentação de um vetor, o qual compreende um promotor ligado de maneira operável à seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que compreende a ID SEQ N° 1, a ID SEQ N° 2 e fragmentos das mesmas, em que o vetor dirige a expressão do fator de transcrição Hahb-4 ou um fragmento funcionalmente ativo ou uma variante do mesmo, e em que o dito fator de transcrição Hahb-4 ou um fragmento funcionalmente ativo ou uma variante do mesmo tem capacidade de ligação a uma região de regulação da transcrição de desidratação da espécie de planta, e em que a expressão do vetor em uma célula hospedeira aumenta a tolerância da célula ao stress ambiental, tal como o stress da água, em comparação a uma variedade do tipo selvagem de tal célula hospedeira.

Um outro objetivo da presente invenção consiste na apresentação de uma planta transgênica transformada estavelmente com uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência selecionada do grupo que compreende a ID SEQ N° 1, a ID SEQ N° 2 ou fragmentos das mesmas, em que a molécula de ácido nucléico codifica o fator de transcrição Hahb-4 ou um fragmento funcionalmente ativo ou uma variante do mesmo, e em que a planta é dotada de uma maior tolerância ao stress ambiental, tal como o stress da estiagem, da salinidade, osmótico, e outros, preferivelmente o stress da água, em comparação a uma variedade do tipo selvagem de tal planta, e em que a planta, que pode ser uma monocotiledônea, uma dicotiledônea ou qualquer outra espécie agronômica, é tolerante ao stress da água através da ligação do fator de transcrição Hahb-4 ou um fragmento funcionalmente ativo ou uma variante do mesmo a uma região de regulação da transcrição de desidratação da planta.

Um objetivo adicional da presente invenção consiste na apresentação de uma semente de planta transformada estavelmente com uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência selecionada do grupo que compreende a ID SEQ N° 1, a ID SEQ N° 2 e fragmentos das mesmas, em que a seqüência de molécula do ácido nucléico codifica o fator de transcrição Hahb-4 ou um fragmento funcionalmente ativo ou uma variante do mesmo.

Um outro objeto ainda da presente invenção consiste na apresentação de uma célula hospedeira que é transformada estavelmente com uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência selecionada do grupo que compreende a ID SEQ N° 1, a ID SEQ N° 2 e fragmentos das mesmas, em que a molécula de ácido nucléico que codifica o fator de transcrição Hahb-4 ou um fragmento funcionalmente ativo ou uma variante do mesmo, em que a célula hospedeira é selecionada do grupo que compreende células bacterianas, fúngicas, de insetos, de plantas e de animais e é preferivelmente uma célula de planta.

Um outro objetivo adicional da presente invenção consiste na apresentação de um método para a produção de uma planta transgênica tolerante ao stress da água, sendo que o método compreende a transformação estável de uma célula de planta ou de uma cultura de células com a seqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que compreende a ID SEQ N° 1, a ID SEQ N° 2 e fragmentos das mesmas, e a regeneração das células ou das culturas de células em plantas.

Um outro objetivo da presente invenção consiste na apresentação de uma molécula isolada de ácido nucléico selecionada do grupo que compreende: (a) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotideo ID SEQ N° 3; (b) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotideo ID SEQ N° 10; (c) uma molécula do ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotideo dos nucleotideos 805 a 1221 da ID SEQ N° 3; (d) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotideo dos nucleotideos 904 a 1221 da ID SEQ N° 3; (e) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotideo dos nucleotideos 1011 a 1221 da ID SEQ N° 3; (f) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos 15 a 622 da ID SEQ N° 3; (g) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos 15 a 409 da ID SEQ N° 10; (h) uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência de nucleotídeo complementar à molécula de ácido nucléico de (a), (b), (c), (d), (e), (f} ou (g); e (i) uma molécula de ácido nucléico que tem um comprimento de pelo menos 150 nucleotídeos e que tem pelo menos 80% de identidade da seqüência em relação à molécula de ácido nucléico de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) ou (h), em que as ditas moléculas de ácido nucléico têm capacidade de promover a expressão de uma molécula heteróloga de ácido nucléico em uma célula ou tecido transformado selecionado do grupo que compreende células de bactérias, fungos, insetos, célula de planta [ou] animal, tecido embriogênico, callus de plantas e sementes de plantas.

Um objetivo adicional da presente invenção consiste na apresentação de um construto de ácido nucléico que compreende uma primeira molécula de ácido nucléico selecionada do grupo que compreende: (a) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotídeo ID SEQ N° 3; (b) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotídeo ID SEQ N° 10; (c) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos 805 a 1221 da ID SEQ N° 3; (d) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos 904 a 1221 da ID SEQ N° 3; (e) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos 1011 a 1221 da ID SEQ N° 3; (f) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos 15 a 622 da ID SEQ N° 3; (g) uma molécula de ácido nucléico que tem a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos 15 a 409 da ID SEQ N° 10, (h) uma molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência de nucleotídeo complementar à molécula de ácido nucléico de (a), (b), (c), (d), (e}, (f) ou (g) ; e (i) uma molécula de ácido nucléico com pelo menos 80% de homologia ou pelo menos 150 nucleotídeos no comprimento em relação à molécula de ácido nucléico de (a), (b) , (c), (d), (e) , (f), (g) ou (h), em que a dita primeira molécula de ácido nucléico é ligada de maneira operável a uma segunda molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de interesse e uma região não-transladada 3’. Preferivelmente, a molécula de ácido nucléico é o promotor que tem a ID SEQ N°3 ou a ID SEQ no. 10. Além disso, são apresentadas as células hospedeiras e as plantas transgênicas transformadas estavelmente com pelo menos um dos construtos mencionados.

Um outro objeto adicional da presente invenção consiste na apresentação de um método para a expressão de pelo menos uma proteína de interesse em uma célula hospedeira, sendo que o método compreende a introdução de um dos construtos acima mencionados em uma célula hospedeira e a produção, por parte da célula hospedeira, de uma proteína de interesse, em que a célula hospedeira é selecionada do grupo que compreende células de bactérias, fungos, insetos, plantas e animais.

Um objetivo adicional da presente invenção consiste na apresentação de um método para a obtenção de uma planta transgênica que expressa pelo menos uma proteína de interesse, sendo que o método compreende a transformação estável de uma célula de planta ou de uma cultura de células cora um dos construtos de ácido nucléico acima mencionados, e a regeneração das células ou das culturas de células em uma planta integral que expressa pelo menos uma proteína, em que a planta transgênica é selecionada do grupo que compreende uma planta monocotiledônea e dicotiledônea.

Um outro objetivo adicional da presente invenção consiste na apresentação de uma planta transgénicas transformada estavelmente com pelo menos um dos construtos acima mencionados, em que a proteína de interesse é o fator de transcrição Hahb-4, que tem a seqüêncía de ácido nucléico selecionada do grupo que compreende a ID SEQ N° 1, a ID 5EQ N° 2 e os fragmentos das mesmas, e em. que a planta é selecionada do grupo que compreende plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, e a dita planta é tolerante ao stress ambiental em situações tais como a estiagem, elevada salinidade, elevada pressão osmótica e outras, e preferivelmente a planta é resistente e tolerante ao déficit de água. Mais preferivelmente, a planta é tolerante ao stress da água mediante a ligação do fator de transcrição Hahb-4 ou um fragmento funcionalmente ativo ou uma variante do mesmo a uma região de regulação da transcrição de desidratação da planta, e a região de regulação de transcrição de desidratação da planta é uma seqüêncía de DNA 5'-CAAT(A/T)ATTG-3'.

Os objetivos, as características e as vantagens acima e outros ainda da presente invenção serão melhor compreendidos quando tomados em relação aos desenhos em anexo e à descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A presente invenção é ilustrada a título de exemplo nos seguintes desenhos, nos quais: A Figura 1 mostra a seqüência genômica que codifica Hahb-4 de girassol da invenção. A seqüência de proteína deduzida do quadro de leitura aberto é indicada abaixo da seqüência de nucleotídeo. 0 homeodomínio é mostrado em negrito; as leucinas do zíper de leucina são mostradas em negrito e sublinhadas. A parte mais inferior da figura mostra um alinhamento do domínio Hd-Zip de Hahb-4 com os aqueles de Athb-1, -6, -7 e -12. As caixas sombreadas indicam aminoácidos idênticos. A figura 2a mostra um esquema de cDNA de Hahb-4 que mostra o comprimento e a polaridade da ribosonda (seta), e a região protegida pelo rnRNA de Hahb-4 (+81 a +429; caixa sombreada). A figura 2b mostra a expressão de Hahb-4 induzida pelo stress de água sujeita a tratamentos diferentes. Brotos cora quatro dias de vida foram tratados tal como segue: 100 μΜ de ABA durante 24 horas; stress de água durante duas horas; 4°C durante 24 horas; 42°C durante duas horas; 0,5M de manitol durante quatro horas. A figura 2c mostra a expressão de Hahb-4 induzida pelo stress de água em órgãos diferentes durante duas horas, e embriões e sementes secas foram analisados. A Figura 3 mostra a dependência temporal da indução de Hahb-4 pelo stress de água nas raízes, nos caules e nas folhas. Os brotos foram sujeitados ao stress da água durante meia hora ou uma hora, ou re-hidratados em horas diferentes depois de um tratamento de estiagem por uma hora. O mesmo filtro foi hibridizado com uma sonda de rRNA como um controle para a carga e a transferência de RNA (painel de baixo). A figura 4 mostra a dependência temporal da resposta de Hahb-4 a ABA. O total de RNA (20 pg) foi isolado dos brotos que não foram tratados ou então tratados com 100 μΜ de ABA por períodos diferentes tal como indicado em cada pista. No painel de baixo, o mesmo filtro foi hibridizado com uma sonda de rRNA como um controle para a carga e a transferência de RNA. A figura 5 mostra a dependência temporal da indução de Hahb-4 pelo stress de água nas raízes, nos caules e nas folhas. 0 RNA foi preparado a partir de órgãos de controle diferentes, plantas com stress de água de 30 minutos (1), 60 minutos (2) ou 90 minutos (3) . Os mesmos filtros foram hibridizados com uma sonda de rRNA como um controle para a carga e a transferência de RNA (painéis da direita). A figura 6 mostra que o ABA e o stress de água induzem a expressão de proteínas nucleares que se ligam especificamente à seqüência alvo de DNA de Hahb-4. Pista 0, só o DNA; pista 1, plantas de controle; pista 2, plantas tratadas com ABA; pista 3, plantas com stress de água; A e B indicam duas faixas deslocadas diferentes observadas com extratos nucleares. A Figura 7 mostra um gráfico que ilustra a estratégia empregada para a clonagem do cDNA que codifica Hahb-4 sob o controle do promotor CaMV35S. O plasmídio p35SHB4 foi construído em E. coli e foi então utilizado para transformar a- cepa CV2260 de A. tumefaciens. A cepa de A. tumefaciens que tem o plasmídio contendo cDNA de Hahb-4 sob o controle do promotor CaMV35S foi denominada ATH4; BD e BI: bordas da direita e da esquerda; Pnos: promotor do gene de nopalina sintetase; Tnos: seqüência de terminação de nopalina sintetase; Kmr: gene de resistência à canamicina; P35S: promotor 35ScaMV; gus: gene de β-g.lucuronidase. A figura 8 é um gráfico que mostra que o tempo de germinação da planta transformada da invenção (barras escuras) e das plantas de controle não transformadas (barras brancas) na porcentagem de plantas germinadas depois de um tratamento 48 a 4°C (n = 22). A figura 9 é um gráfico que mostra o comprimento do caule medido em milímetros das plantas transformadas da invenção (barras escuras) e das plantas de controle não transformadas (barras brancas) dos 28 dias aos 33 dias a partir da germinação. As duas barras da extremidade mostram o comprimento do caule das plantas transgênícas submetidas aos testes de stress de água em que não houve nenhum sobrevivente no grupo de plantas de controle. A figura 10 é um gráfico de barras que mostra a quantidade de cascas formadas durante o desenvolvimento das plantas, das plantas de não transformadas (barras brancas) e das plantas transgênícas (barras escuras). As duas barras da extremidade mostram a quantidade de cascas das plantas transgênícas submetidas aos testes de stress de água e, que não houve nenhum sobrevivente no grupo das plantas de controle. Essas plantas foram irrigadas no final do ciclo e, uma vez recuperados os parâmetros de interesse, foram registradas. A figura 11 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de controle não transformado (barras brancas) e de plantas transgênicas (barras escuras) germinadas em períodos diferentes depois de ter sido rompida a dormência na presença de 50 mM de manitol. A figura 12 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de controle não transformado (barras brancas) e de plantas transgênicas (barras escuras) germinadas em períodos diferentes depois de ter sido rompida a dormência na presença de 200 mM de manitol. A figura 13 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de controle não transformado (barras brancas) e de plantas transgênicas (barras escuras) germinadas em períodos diferentes depois de ter sido rompida a dormência na presença de 300 mM de raanitol. A figura 14 é um gráfico de barras que mostra a percentagem de controle não transformado (barras brancas) e de plantas transgênicas (barras escuras) germinadas em períodos diferentes depois de ter sido rompida a dormência na presença de 50 mM de NaCl. A figura 15 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de controle não transformado (barras brancas) e de plantas transgênicas (barras escuras) germinadas em períodos diferentes depois de ter sido rompida a dormência na presença de 150 mM de NaCl. A figura 16 é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de plantas de controle não transformadas sobreviventes {barras brancas) e de plantas transgênicas (barras escuras) em três testes independentes. No primeiro teste (1) o stress ocorreu quando as plantas eram adultas (estágio reprodutivo). No segundo teste (2) as plantas estavam em um estágio vegetativo avançado (roseta completa). No terceiro teste (3) o stress ocorreu na germinação. A figura 17 mostra os fenótipos das plantas de controle e transgênicas. (a) o fenótipo de plantas transgênicas (primeira e segunda fileiras) e de plantas de controle não transformadas (terceira e quarta fileiras) é observável. Essas plantas foram sujeitadas ao stress de água quando adultas e re-irrigadas no final do ciclo de vida. Em b, o fenótipo das plantas transgênicas (lado esquerdo) e de controle não transformadas (lado direito) é observável. Esse grupo de plantas foi sujeitado ao stress de água quando elas estavam no estágio vegetativo. Em c, o fenótipo das plantas transgênicas (lado esquerdo) e de plantas de controle não transformadas (lado direito) sujeitadas ao stress da água desde a germinação e então re-írrigadas é observável, (d) Em d, é mostrado o fenótipo das plantas transgênicas sujeitadas à estiagem extrema no estágio vegetativo. A figura 18 mostra a sequência de nucleotídeos da região de promotor do gene Hahb-4, observando as sequências que correspondem à caixa TATA, o elemento que responde a stress de água/baíxas temperaturas, às regiões ABRE e às seqüências que indicam os sítios de reconhecimento de Myb e Myc. A figura 19 mostra um esquema do vetor de pBI 101.3 utilizado para a clonagem de vários segmentos do promotor Hahb-4. O gene de β-glucuronidase é indicado, bem como os genes que conferem resistência à canamicina em E, coli e A. tumefacíens. As origens da replicação de E. coli e A. tumefaciens também estão marcadas. A figura 20 mostra uma fotografia que compara os níveis de expressão medidos por histoquímica do gene gus nos brotos com dez dias de vida que contêm os construtos de um promotor da seqüência de 0 a -400 (nucleotídeos 805 a 1221 da ID SEQ N° 3) (lado esquerdo) e da seqüência de 0 a -1015 (alelo pequeno) (lado direito). A figura 21 mostra a expressão de gus nas raízes de A, thaliana. (a) mostra a expressão do gene gus nas raízes com vinte dias de vida das plantas transformadas com construto de 0 a -400. (b) mostra a expressão do gene gus nas raízes com vinte dias de vida das plantas transformadas com construto de 0 a -1015. (c) mostra a expressão do gene gus em raízes com dez dias de vida das plantas transformadas com construto de 0 a -1015. A figura 22 mostra o efeito do tratamento de ABA nos brotos com vinte dias de vida transformados com o construto 0 a -400. No lado esquerdo é mostrada a planta do controle, e no lado direito é mestrado o broto tratado ccm ABA. A figura 23 mostra um esquema da estrutura do gene Hahb-4. No alto: alelos grandes, na base: alelos pequenos. São indicados os oligonucleotideos empregados para o isolamento da região de promotor e para a construção de plasmídios recombinantes e utilizados na transformação da planta.

DESCRIÇÃO DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS

Com referência agora em detalhes à invenção, a mesma refere-se à caracterização de um novo gene Hd-Zip, o gene Hahb-4 de girassol responsivo a condições de stress de água. Dentro do homeodomínio, o Hahb-4 mostra urna homologia parcial com Athb-7 e Athb-12, duas proteínas correlatas de A. thalíana. A proteína Hahb-4 tem o homeodomínio localizado próximo do N-termínal. A invenção apresenta um clone da biblioteca de cDNA. Esse clone representa um membro da família Hd-Zip que foi denominado Hahb-4. As seqüências que correspondem às extremidades 5' e 3' foram obtidas por meio de PCR. A sequência de cDNA completa obtida desta maneira tem um comprimento de 674 bp (ID SEQ N° 2) e contém um quadro de leitura aberto de 177 aminoácidos (Figura 1). A comparação da proteína codificada com outras seqüências de proteína Hd-Zip indica que ela pode ser incluída na subfamília I de proteínas Hd-Zip, compartilhando aminoácidos aproximadamente 50¾ idênticos dentro do homeodomínio com outros membros dessa subfamília, com a exceção de Athb-7 e Athb-12, que têm a identidade de 60% e 53%, respectlvamente, dentro dessa região (Figura 1). Também é digno de nota o fato que o homeodomínio Hahb-4 fica localizado quase na extremidade do terminal amino da proteína (aminoácidos 17 - 76). Consequentemente, Hahb-4 não apresenta o domínio ácido presente em outros membros da família de proteína Hd-Zip adjacente à extremidade do N-terminal do homeodominío. Essa característica também é compartilhada com Athb-7 e Athb-12. A fim de investigar a estrutura genômica do gene Hahb-4, foi amplificado o DNA genòmico (o DNA genômico é a ID SEQ N° 1) com vários oligonucleotideos que compreendem o cDNA inteiro. Um único íntron de 101 bp foi detectado entre os nucleotídeos 381 e 382 (aminoácidos 108 e 109) do cDNA. A análise de transferência Northern indicou que o gene Hahb-4 da invenção é expresso em níveis muito baixos nos pés de girassol cultivados sob condições ambientais controladas e normais. Somente os sinais fracos foram obtidos com o RNA total extraído de vários tecidos e esrágios de desenvolvimento.

Foi analisada a expressão de Hahb-4 sob condições ambientais diferentes (isto é, tansão de água, osmótica, salinidade, frio, calor e oxidante) pela proteção de RNAse, que é mais sensível do que a técnica Northern (Figura 2) . A figura 2b mostra que Hahb-4 não foi detectado nos brotos com quatro dias de vida cultivados sob condições normais. Em brotos com stress de água, entretanto, um sinal forte foi observado. O manitol também incuz a expressão de Hahb-4, embora a níveis mais baixos, refletindo provavelmente a diminuição na atividade da água causada por esse composto (Figura 2b). Um resultado similar foi obtido com NaCl.

Uma vez que muitas respostas ao stress de água são mediadas por ABA, também foi analisado o efeito desse hormônio na expressão. Tal como mostrado na Figura 2b, a indução foi observada depois de 24 horas de tratamento de brotos irrigadsocom 100 μΜ de ABA. Um aumento menor, mas significativo, em níveis de transcrito, também foi observado com 10 μΜ de ABA. Nenhum efeito detectável foi observado quando os brotos foram sujeitados a condições de stress de frio (4°C) ou de calor (420C) (Figura 2b) . Esses resultados indicam que o efeito do stress de água é especifico. A figura 2c mostra que a resposta às condições do stress de água também é observada nas raízes, nos caules e nas folhas de plantas mais velhas (21 dias de vida). 0 nível da indução nas partes aéreas da planta é similar àquele observado nos brotos. As raízes, ao contrário, mostram níveis consideravelmente mais baixos de transcrito sob condições de stress de água.

Uma vez que o ABA também participa do desenvolvimento da semente durante a parte final da embriogênese, a qual envolve um processo de dessecação, foram analisados os níveis de transcrito de Hahb-4 nos embriões de girassol (vinte dias depois da polinização) e em sementes secas. Nenhum sinal foi obtido nas experiências de proteção de RNAse (Figura 2c), indicando que a resposta de Hahb-4 ao stress de água e ao ABA é característica de fases vegetativas , do desenvolvimento. 0 nível elevado de indução observado sob condições de stress de água permitiu que fosse analisado o aumento dependente do tempo em níveis de transcrito por experiências de Northern. A figura 3 mostra que os brotos expostos à estiagem aumentaram significativamente os seus níveis de transcrito de Hahb-4 depois de somente trinta minutos; a resposta alcançou um máximo depois de uma hora de retenção da água. Depois desse período, nenhum incremento adicional em níveis de transcrito de Hahb-4 foi observado. A re-hidratação dos brotos reduziu os níveis de transcrito de Hahb-4 mais lentamente, com somente uma diminuição de aproximadamente 50% depois de duas horas (Figura 3, pistas 4 e 5) . O efeito do tratamento de ABA também dependeu do tempo. Tal como mostrado na figura 4, a resposta ao ABA era detectável dentro de uma hora e alcançava um máximo depois de três a seis horas. Depois disso, os níveis de transcrito diminuiram lentamente, mas ainda estavam significativamente altos depois de 24 horas de tratamento. Os níveis elevados de transcrito de Hahb-4 da invenção são invertidos depois da re-hidratação dos pés de girassol, desse raodo indicando outra vez que o dito gene participa na resposta ao stress de água. A resposta de Hahb-4 ao stress de água em órgãos diferentes de plantas com três semanas de vida cultivadas hidroponicamente também foi rápida. Nas raizes, os níveis de transcrito alcançaram um máximo depois de 60 minutos de tratamento do stress (Figura 5).

Nas folhas e nos caules, uma resposta máxima foi observada depois de tratamentos mais prolongados. Isto pode estar relacionado ao fato que a percepção inicial do stress de água é realizada pela raiz, a qual sintetiza o ABA que é então translocado para as partes aéreas da planta. Isto, conjuntamente com os resultados mostrados anteriormente nas Figuras 2 a 4, indica muito provavelmente que a expressão de Hahb-4 está relacionada aos níveis de ABA endógenos em plantas sob stress de água. A presença de proteínas de ligação de DNA funcionais em núcleos de girassol foi analisada por ensaios de troca de mobilidade eletroforética ao utilizar um oligonucleotídeo de cordão duplo sintético que compreende a seqüência 5'-CAAT(Ά/Τ)ATTG-3', ligado in vitro por Hahb-4 expresso nas bactérias. Os extratos nucleares preparados a partir de brotos com quatro dias de vida mostraram faixas deslocadas distintas, indicando a existência de pelo menos dois complexos de proteínas diferentes que se ligam a essa seqüência (Figura 6) . A quantidade de ambos os complexos foi aumentada significativamente nos extratos obtidos das plantas tratadas com ABA. Por outro lado, somente o complexo de migração mais lenta aumentou quando as plantas foram sujeitadas ao stress de água. A formação de ambos os complexos foi abolida quase que completamente por um excesso do mesmo DNA não etiquetado, mas não por uma quantidade equivalente de um DNA similar contendo a seqüência 5'-CACT(A/T)AGTG-3' (as posições alteradas estão sublinhadas) não ligada por Hahb-4 (Figura 6) . Esse resultado sugere íntensamente que pelo menos uma proteína funcional coiti a mesma especificidade de ligação de DNA que Hahb-4 é sintetizada e translocada ao núcleo na presença de ABA ou sob condições de stress de água. A expressão de Hahb-4 intensa foi detectada somente nas plantas sujeitadas a um stress de água ou a um tratamento com ABA. 0 stress do calor, do frio e oxidante não induz tal expressão. Os sais e os tratamentos osmóticos produzem somente incrementos pequenos em níveis de transcrição de Hahb-4. 0 efeito do stress de água foi totalmente invertido quando as plantas foram re-hidratadas. Essas características sugerem que a expressão de Hahb-4 da invenção responde diretamente à condição hídrica das células vegetais e que a indução não é um efeito dos danos ou do stress geral.

Para obter as plantas transgênicas de Arabídopsis thaliana que super-expressam o Hahb-4 de girassol da invenção, o vetor pBI121 e o método de "mergulho floral" foram utilizados, tal como indicado no Exemplo 3 e na figura 7. Em conseqüência disto, muitas linhagens independentes de plantas transgênicas foram obtidas nas quais as plantas eram tolerantes ou resistentes ao crescimento em um meio com canamícina como reação positiva de PCR com oligonucleotídeos específicos. Das linhagens independentes obtidas, foram selecionadas aquelas que têm uma expressão estável de transgene (o gene Hahb-4 da presente invenção). Subsequentemente, as linhagens de homozigotos F3 foram selecionadas para analisar o fenótipo.

Tal como mostrado na figura 8, as plantas transgênicas de A, thaliana que contêm o gene da invenção germinam mais rapidamente em comparação às plantas de controle não transformadas. Depois de catorze horas, 85% das plantas transformadas de acordo com a invenção germinaram, versus 58% das não transformadas.

Além disso, os caules das plantas transformadas da invenção aumentam mais lentamente e alcançam uma altura máxima que é equivalente a 85% da altura de uma planta de controle que é cultivada nas mesmas condições (com disponibilidade de água normal - figura 9) . Além disso, as plantas transgênicas sujeitadas ao stress de água alcançaram uma altura de caule similar àquela das mesmas plantas transgênicas cultivadas com disponibilidade de água normal, indicando desse modo que o stress de água não afeta o crescimento do caule nas plantas transgênicas da invenção (figura 9) . As plantas transgênicas da invenção são não apenas tolerantes ao stress de água, mas também são normalmente cultivadas em condições com falta de água, sem alterações importantes no fenótipo observado. 0 número de cascas formadas não variou significativamente entre o tipo selvagem e as plantas transgênicas, e esse número é ligeiramente maior nas plantas transgênicas apesar da gordura do pedicel floral (figura 10). Quando as plantas transgênicas cultivadas sob condições de stress de água são comparadas com as mesmas plantas cultivadas em condições normais, o número de cascas formadas é maior naquelas sujeitadas ao stress (figura 10) . Além disso, tal como mostrado na Tabela 1, o peso total das sementes produzidas pelas plantas transformadas de acordo com a invenção era aproximadamente 15% maior comparado com aquele das sementes das plantas de controle não transformadas.

Tabela 1 Uma vez que o produto de Hahb-4 age como um fator de transcrição e a sua expressão ao nível de transcrição parece ser regulado pela disponibilidade ou pela presença/ausência de água, foram realizados estudos para determinar a tolerância ao stress de água nas plantas transformadas que super-expressara o gene Hahb-4 de girassol da invenção.

Primeiramente, foi analisado o processo de germinação, sob condições que imitam a falta de água, tal como a presença de manitol, e outras condições que geram o stress de sal. As Figuras 11, 12 e 13 mostram os tempos de germinação das plantas transformadas de acordo com a invenção em comparação às plantas de controle. A presença do manitol retarda a germinação. Esse efeito é mais marcante a concentrações mais elevadas de carboidratos. Entretanto, as plantas transformadas mantêm uma boa eficiência de germinação até mesmo a concentrações elevadas de manitol.

Quando os testes de germinação foram realizados na presença de concentrações diferentes de NaCl, os resultados obtidos eram similares àqueles no caso do manitol. Conforme pode ser observado nas figuras 14 e 15, a super-expressão de Hahb-4 confere às plantas transformadas uma capacidade maior de germinação em um meio salino.

Deve ser observado que as raizes das plantas transgênicas cultivadas nas diferentes condições de stress testadas ou ensaiadas são maiores do que as raizes das plantas de controle, indicando desse modo um fenótipo que confere tolerância a diversas condições de stress.

Subseqüenteaiente, os testes de estiagem foram realizados em diversos estágios de desenvolvimento de plantas cultivadas no solo. A Figura 16 mostra três testes que mostram a sobrevivência ao stress de água. Evidentemente, uma tolerância maior ao stress de água nas plantas transformadas da invenção é observada quando comparada às plantas de controle não transformadas.

Quando as plantas foram sujeitadas ao stress de água em diferentes estágios de desenvolvimento, as plantas transformadas mostraram uma tolerância maior às condições de stress. A Figura 17 mostra a condição das plantas depois que elas foram sujeitados às condições de falta de água em diferentes estágios de crescimento. Qualquer que seja o estágio no qual a planta é sujeitada ao stress de água, as plantas transgênicas que contêm o gene Hahb-4 da invenção são mais tolerantes e resistentes às condições acima mencionadas.

Resumidamente, a presente invenção apresenta a obtenção de plantas transformadas de Arabidopsís thaliana que super-expressam o gene Hahb-4 de girassol da invenção sob o controle do promotor do vírus de mosaico de couve-flor 35S, a construção mostrada na figura 7. 0 gene da invenção, inicialmente isolado do girassol, codifica uma proteína Hd-Zíp que tem um domínio protéico do tipo homeodomínio associado a um zíper de leucina. Os elementos versados na técnica sabem que qualquer promotor ou construto de ácido nucléico que dirige a expressão do gene da invenção pode ser empregado sem alterar c· caráter e o âmbito da invenção. Além disso, podem ser preparadas construções de ácido nucléico que permitem a expressão do gene da invenção em qualquer célula hospedeira, tais como células de bactérias, levedura, fungos, animais e vegetais. Em uma realização preferida da invenção, o gene é expresso em células e tecidos de plantas.

As plantas transformadas que expressam Hahb-4 têm, era condições de crescimento normais, em média, caules mais curtos. Parece que essa característica é principalmente devida à inibição da expansão celular e não à inibição da divisão celular, tal como indicado por estudos histológiccs.

Além do acima exposto, as folhas adultas das plantas transgênicas são mais arredondadas e menos alongadas em comparação com aquelas de plantas não transformadas. Ambas as características parecem indicar conjuntamente que o produto de gene está agindo como um inibidor da expansão e do alongamento celulares. Essas características fenotípicas (caule curto e folha redonda) devem estar diretamente relacionadas com a capacidade das plantas transgênicas de tolerar e resistir à escassez ou falta de água, como um mecanismo para "economizar água". Por outro lado, as raízes das plantas transgênicas da invenção são mais longas em comparação às raízes de plantas não transformadas. Isso deve indicar a presença de um outro mecanismo vantajoso para a obtenção de água.

As plantas transgênicas da presente invenção são bastante tolerantes ao stress em estágios de crescimento diferentes, tanto na germinação bem como os períodos vegetativos inicial e final, e também no período reprodutivo. A porcentagem de sobrevivência de plantas transgênicas é mais elevada do que aquela observada para as plantas de controle não transformadas quando ambas são sujeitados às condições de estiagem.

Com todos esses resultados, é possível concluir que o gene Hahb-4 está envolvido na resposta da planta ao stress de água e que a sua função específica deve ser a geração de mudanças fenotípicas que aumentam a tolerância da planta à falta de água.

Incrivelmente, nenhuma dessas mudanças fenotípicas afeta negativamente a produção e a germinação das plantas.

Pelo contrário, a produção de sementes (medidas em peso) das plantas transgênicas é maior do que a produção de plantas não transformadas. 0 Hahb-4 da invenção pode ser empregado para produzir as plantas transgênicas que têm um interesse comercial em que as ditas plantas transgênicas têm tolerâncias características para o stress de água. Pode-se esperar que a produtividade das ditas plantas de valor agronômico sujeitadas ao stress de água é similar à produtividade da variedade que é não transformada e não sujeitada a tais condições de stress. Como um exemplo, tais plantas de valor agronômico podem incluir, mas sem ficar a eles restringidas, girassol, trigo, cevada, soja, batata, milho, cana de açúcar cu arroz. t importante observar que não há uma grande variedade de genes que super-expressam quando a planta é sujeitada ao stress de água, e não há nenhuma evidência concreta de que os ditos genes podem conferir a uma planta a tolerância a seca tal como ocorre com o Hahb-4 da invenção .

Os autores da invenção isolaram e caracterizaram a seqüência da região de promoção de Hahb-4 de girassol Hahb-4 de acordo com a invenção. 0 isolamento da região de promoção de Hahb-4 foi executado em três estágios através da técnica PCR inversa, utilizando as informações obtidas em um estágio para projetar o novo par de oligonucleotídeos a serem utilizados no estágio seguinte. Cs fragmentos obtidos da reação de PCR foram clonados no vetor pGEM-Teasy (Promega), e a seqüência da região de promoção foi completada manualmente através da sobreposição das regiões repetidas de cada construção. A seqüência de promotor de Hahb-4 (SEQ do ID N° 3) corresponde a uma seqüência de 1.221 pb, a qual compreende uma caixa TATA localizada 24 pb a montante do sítio de iniciação de transcrição. A comparação dessa seqüêncía com aquelas que existem nos bancos de dados revela a existência de regiões com homología às seqüências que devem estar envolvidas na resposta a diversos fatores ambientais, tais como a luz, o ácido abscisico e hormônios. Como um exemplo, a figura 18 mostra prováveis elementos que respondem a ABA do tipo ABRE, bem como um elemento que responde ao stress de estiagem ou a baixas temperaturas do tipo DRE, As sequências de consenso da junção do fator de transcrição envolvidas na resposta aos fatores de transcrição, tais como as proteínas das famílias Myb e Myc (Abe et al., Plant cell 9: 1859-1868, 1997; Shinozaki e Yamaguchi-Shinozaki, Plant Physol. 115: 327-334, 1997, aqui incorporados a título de referência), também foram icentif1cadas.

Depois do isolamento e do arranjo em seqüêncía do promotor de Hahb-4, as seqüências envolvidas na direção da expressão do gene foram procuradas. Particularmente, fornecendo a especificidade de órgão e as seqüências que respondem ao stress de água e à presença de ABA. Para essa finalidade, pés de A. thaliana com construções que compreendem um gene repórter (gene gus) foram transformados sob o controle da seqüêncía total do dito promotor ou de partes da dita seqüêncía. A seqüêncía completa do promotor foi clonada era uma construtc. Para essa finalidade, dois oligonucleotídeos específicos que hibridizaram nas extremidades da região de promoção foram projetados, e eles foram empregados em uma reação de PCR utilizando o DNA genôraico de girassol como modelo. Como um produto das reações de amplificação, foram obtidas duas faixas de aproximadamente 1.000 e 1.200 bp. Considerando o fato que o material vegetal utilizado para esses testes foi isolado de um híbrido (contiflor 15), a presença de duas faixas parece indicar a existência de dois alelos diferentes presentes no genoma.

Ambos os produtos de PCR foram clonados no vetor pGEM-Teasy (Promega). A seguir eles foram restringidos com BamHI e AindlII e clonados no vetor pBI101.3 (figura 19} tal como indicado no Exemplo 4. Dois construtos, cada um deles compreendendo um dos alelos do promotor, foram obtidos, sendo que os ditos alelos do promotor dirigem a expressão do gene gus.

Subseqüenteraente, fragmentes diferentes do promotor incluindo o sítio de iniciação de transcrição foram clonados no vetor pBI101.3. Para a clonagem dos segmentos do promotor que ficam mais distantes do sítio de iniciação de transcrição, foi utilizado um vetor pBI modificado, e o vetor contém um promotor mínimo (-90 CaMV35S) incluindo a caixa TATA. Os clones obtidos são descritos tal como segue: Clone 416: fragmento que contém a região de 0 a -400 (do sítio de iniciação de transcrição até IPCR4 (ID SEQ N° 4)) do promotor clonado em pBI101.3 HindIII/BamEI. O clone 415 compreende os nucleotídeos 805 a 1221 da ID SEQ N° 3.

Clone 1015: fragmento que contém a região de promoção de 0 -1015 (alelo pequeno) obtido com os nucleotídeos IPCR10 e IPCR8 (ID SEQ IIo 5 e ID SEQ IIo 5, respectivamente) clonado em SalI/BaitiHI de pBI101.3.

Clone 1221: fragmento que contém a região de promoção de 0 -1221 (alelo grande) obtido com os oligonucleotídeos IPCR10 e IPCR8 (ID SEQ N° 5 e ID SEQ N° 6, respectivamente) clonado em SalI/BaniHI de pBI101.3.

Clone 318: fragmento que contém a região de 0 a -300 (do sítio de iniciação de transcrição até IPCR6 (ID SEQ N° 7) amplificado com os oligonucleotídeos IPCR6/IPCR8 (ID SEQ N° 7/SEQ ID M° 5)) do promotor clonado em HindIIl/Bawül de pBI101.3. O clone 318 compreende os nucleotídeos 904 a 1221 da ID SEQ N° 3.

Clone 211: fragmento que contém a região de 0 a -211 (do sítio de iniciação de transcrição até IPCR7 (o ID SEQ N0 8) amplificado com os oligonucleotídeos IPCR7/IPCR8(SEQ ID N° 8/SEQ ID W° 6) do promotor clonado em J?indIII/J5ajnHI de pBI101.3. O clone 211 compreende os nucleotídeos 1011 a 1221 da ID SEQ N° 3.

Clone 608: fragmento de 608 pb (do alelo grande) que corresponde à região do promotor 5' (amplificada com IPCR5/IPCR10 (ID SEQ N° 9/SEQ ID N° 5)) clonado em Sall de pBI -90 com um promotor mínimo. 0 clone 608 compreende os nucleotídeos 15 a 622 da ID SEQ N° 3.

Clone 407: fragmento de 407 pb (do alelo pequeno) que corresponde à região do promotor 5' (amplificada com IPCR5/IPCR10(SEQ ID N° 9/SEQ ID N° 5)) clonado em Sall de pBI -90 com um promotor mínimo. 0 clone 407 compreende os nucleotídeos 15 a 409 da ID SEQ N° 10.

Subsequentemente, as plantas de A. thâlíana foram transformadas com os construtos acima mencionados, as plantas transformadas foram selecionadas e diversas linhagens independentes foram escolhidas para o isolamento, na terceira geração, de sub-linhagens de homozigotos. As plantas selecionadas do homozigoto foram utilizadas para caracterizar os alelos e as regiões diferentes do promotor Hahb-4 por testes de histoquímica e fluorimetria. A região de 0 a -400 do promotor era suficiente para dirigir a expressão do gene gus nos cotilédones de brotos de dois dias de germinação. Tal expressão não era detectável nos brotos novos nos dez dias de germinação.

Quando o construto que inclui o segmento completo do alelo pequeno foi empregado, a expressão do gene gus nas cotilédones de brotos de dois dias de germinação também foi observada. Entretanto, e diversamente da região de 0 a 400, a expressão do gene gus era muito intensa nas folhas e nas raízes dos brotos novos (figura 20). Finalmente, nâo foi detectada nenhuma expressão do gene gus nas plantas durante o estágio reprodutivo.

Esses resultados indicam que quando a expressão ocorre no mesmos órgão ou órgãos, a intensidade de tal expressão é diferente. É possível que na região de -400 a -1015 seqüências importantes da região para a ativação da transcrição possam estar presentes, ao passo que as seqüências necessárias para dirigir a expressão específica nos cotilédcnes e nas folhas estão na região de 0 a -400.

Quando a expressão do gene gus nas raízes das plantas transgênícas foi analisada, foi verificado que a expressão dirigida pelo construto de 0 a -400 nas raizes das plantas cora vinte dias de vida é consístentemente mais forte nos primórdios das raízes laterais e na região intermediária das raízes laterais já desenvolvidas. Além disso, foi observado que nas raízes das plantas transgênícas transformadas com o construto de 0 a -400 a expressão do gene gus também é detectável nas células do cilindro vascular (figura 21) . Dez dias depois da germinação, é observada uma expressão forte em todas as raízes principal e laterais, e até mesmo mais forte na região da base das raízes (figura 21c) .

Os resultados obtidos pelos testes de fluorimetria mostraram que o construto que incluí o segmento completo tem uma atividade de promoção dez vezes maior do que a atividade de promoção do construto de 0 a -400. Além disso, o construto de 0 a -400 tem capacidade de indução por ABA, tal como mostrado na figura 22. A análise de diversas linhagens independentes das plantas transformadas com os construtos que compreendem a região de 0 a -300 ou a região de 0 a -200 mostrou que o gene gus não é expresso nos estágios de desenvolvimento diferentes, em nenhum dos órgãos estudados, e as ditas regiões de promoção não são induzidas por ABA.

Os autores da invenção também apresentam a presença de somente um íntron que interrompe a região da seqüência de codificação de zíper de leucina. Esse íntron tem 101 pb e fica localizado especificamente entre as seqüências que codificam a sexta e a sétimo héptade do domínio do zíper de leucina (aminoácídos 108 e 109) e responde à regra 5'-GT... AG-3' presente nos introns de outros organismos. Um esquema da localização e da seqüência de íntron é mostrado na figura 1.

Portanto, a presente invenção compreende o promotor Hahb-4 (ID SEQ N° 1) e o cDNA do dito gene (ID SEQ N° 2), em que o dito gene codifica uma proteína da família Hd-Zip de girassol. 0 promotor tem dois alelos que foram clonados e arranjados em seqüência, que têm uma região divergente ou não conservada em torno do nucleotídeo -900. 0 alelo grande compreende uma seqüência de 1.221 bp e o alelo pequeno compreende uma seqüência de 1.015 pb (ID SEQ W° 3 e ID SEQ N° 10, respectivamente). A análise das seqüências de nucleotídeo do promotor indicou que há regiões homólogas às seqüências diferentes envolvidas na resposta a diversos fatores ambientais tais como a luz, o ácido abscísico e hormônios. Q promotor da invenção compreende os prováveis elementos rasponsivos a ABA geralmente denominados ABRE, bem como um elemento responsivo ao stress produzido pela falta de água ou baixas temperaturas denominado DRE. As seqüências de consenso que juntam os fatores de transcrição envolvidos na resposta aos fatores ambientais também foram identificadas.

Quando a atividade de regiões diferentes do promotor da invenção foi analisada, os resultados obtidos indicaram que quando há dois prováveis elementos ABRE entre o sitio de iniciação de transcrição e 300 nucleor.ídeos a montante, esse segmento não tem capacidade de dirigir a atividade do gus repórter, mostrando que esse segmento, quando necessário, não é suficiente para ativar a transcrição. Por outro lado, ao tomar os primeiros 400 nucleotídeos adjacentes da posição +1, foi observada a expressão do gene gus nos cotilédones depois de dois dias de germinação e nas raízes. A expressão não é muito forte mas é específica e tem capacidade de ser induzida por ABA.

Por outro lado, o segmento completo da região de promoção produz níveis de expressão que são pelo menos dez vezes maiores do que os níveis gerados pelo segmento de 0 a -400. Por sua vez, essa expressão é evidente em estágios mais antigos de desenvolvimento (plantas de até vinte dias de germinação) e na região central da raiz. O promotor da invenção (ambos os alelos) e os segmentos ou partes dos mesmos podem ser empregados para dirigir a expressão de qualquer gene de interesse. Preferivelmente, o promotor da invenção (ambos os alelos ou segmentos dos mesmos) pode ser empregado em construtos de ácido nucléico úteis para transformar células hospedeiras, em que o dito promotor dirige a expressão de qualquer proteína de interesse. As células hospedeiras podem ser células de bactérias, levedura, animais ou vegetais.

Além disso, um vetor pode ser construído, no qual o promotor da invenção dirige a expressão do gene Hahb-4 da .invenção em células vegetais. As ditas construções são úteis para a obtenção de plantas transgênicas que sâo tolerantes ao stress de água. As plantas transgênicas que contêm o gene Hahb-4 da ínver.ção e o promotor da invenção podem ser plantas comerciais incluindo, embora sem ficar a eles restringidas, girassol, trigo, cevada, soja, batata, milho, cana de açúcar ou arroz. A invenção pode ser melhor compreendida com referência aos seguintes exemplos que não são limitadores nem restritivos do âmbito de proteção. Pelo contrário, deve ficar claramente compreendido que muitas outras realizações, modificações e alterações equivalentes dos elementos da invenção podem ser sugeridas por elementos versados na técnica depois da leitura da presente descrição, sem que se desvie do caráter da presente invenção e/ou do âmbito das reivindicações anexas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: isolamento e caracterização do novo gene Hahb-4 de girassol, o qual é um gene que codifica uma proteína que pertence à família de Hd-Zip I A. Isolamento do cDNA do gene Hahb-4: Para o isolamento dos clones de cDNA parciais contendo seqílências de homeocaixa, uma estratégia baseada em reação em cadeia de polimerase (PCR) foi executada tal como descrito anteriormente (González and Chan, Trends in Genetics 9:231-232, 1993, aqui incorporado a título de referência) no DNA total de uma biblioteca de cDNA de caule de girassol construída em lambda gtlO. As seqüências que representam a extremidade 3' do transcrito de Hahb-4 foram obtidos por meio de PCR utilizando lambda primers de seqüenciamento gtlO e o prímer específico K41 (5'-GGCGGATCCAACAGAAACAACCACCAGG-3' (SEQ ID N° 11)), que combina os nucleotideos 81 - 100 da seqüência de cDNA (ID SEQ N° 2 e Figura 1). A extremidade 5r do transcrito foram obtidas ao aplicar amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE) a polyA + RNA obtidos dos caules de girassol sob stress de água ao utilizar o oligonucleotídeo específico IPCRO 5'-GGCGGATCCCCTGGTGGTTGTTTCTGTT-3' (SEQ ID N° 12) e os primers Qt e Qo (SEQ ID N° 13 e SEQ ID N° 14, respectivamente) de acordo com Frohman (Frohman Cloning PCR Products. Em The Polymerase Chain Reaction, eds. K.B. Mullis, F. Fré, & R.A. Gibas, páginas 14-37. Birkhauser, Boston, MA, USA, 1994, aqui incorporado a título de referência). B. Isolamento da seqüêncía genômica de Hahb-4: A região 5' não transcrita de Hahb-4 foi caracterizada ao utilizar PCR inversa de acordo com Ochman, Ayala & Hartl (em Methods of Enzymology (ed R. Wu) Volume 218, páginas 309-321. Academic Press, San Diego, CA. USA, 1993). 0 DNA genômico do girassol foi digerido parcialmente sob condições controladas com Sau 3A ou ífindIII. A circularização do DNA depois da digestão e da purificação foi executada durante toda a noite na presença de 5 U de ligase de DNA T4 (PromegaCorp., Madison, WI, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Os pares de primers utilizados para a amplificação foram 5'-GGCGGATCCCCTGGTGGTTGTTTCTGTT-3'(SEQ ID N° 12) e 5' -GCCGAATICAGATTGAGCAAGAGTATAAC-3' (SEQ ID N° 15), ou 5' -ACCTTTATAAAGACCACTC-3' (SEQ ID N° 16) e 5'ACGCAATGGTGAGTTGTAC-3' (SEQ ID N° 17). C. Análise da seqüência de DNA: Os produtos de PCR foram clonados em pUC119 ou em pGEM-Teasy (Promega Corp.). A seqüência de nucleotídeo dos enxertos foi obtida pelo método de rerminação de cadeia ao utilizar o sistema de seqüenciamento frnol (Promega Corp.). Exemplo 2: Testes que mostram que o Hahb-4 é induzido pela falta de água A. Material da planta, condições de crescimento e tratamentos com stress de água: Sementes de Helíanthus annuus L. (girassol cv. contiflor 15, da Zeneca, Balcarce, Argentina, ou cv. Sunweed, da Rhône-Poulenc, Lyon, França) foram esterilizadas na superfície e cultivadas em papel de filtro dentro de placas de Petri por um período de quatro dias. Os brotos foram então transferidos para suportes de plástico contendo meio de Hoagland e cultivados até apresentarem seis folhas (aproximadamente três semanas}. O stress de água foi imposto ao transferir os brotos com quatro dias de vida às placas de Petri con papel de filtro seco ou ao remover as plantas da cultura hidropônica. Os tempos do tratamento eram tal como indicado nas figuras. B. Análise de proteção de RNAse: Para a análise de proteção de RNAse, o RNA total (15 pg) preparado tal como descrito (Almoguera C., et. al.; Plant molecular Biology 19: 781-792, 1992) foi hibridizado como uma ribosonda de Hahb-4 específica sintetizada por transcrição in vitro ao utilizar polimerase de RNA T3 e [32p]CTp seguindo as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha). 0 modelo consistia em um enxerto que corresponde à região de codificação entre +81 e +429 (Figura 1 e SEQ ID N° 1) clonada nos sítios Spel/BamHI de pBlue-script SK-. 0 sitio BamHI, não presente no cDNA, é derivado da amplificação com oligonucleotídeo H41 tal como descrito acima. A digestão de restrição desse DNA modelo com BcoRI permite a transcrição de uma sonda de RNA de nucleotídeo 411 que contém 63 nucleotídeos do vetor (do promotor T3 ao sitio Spel no poliligante, e do sítio BamHI ao sítio EcoRI). As condições para a preparação da ribosonda, a hibridização, a digestão com RNAse A e a análise eletroforética subseqüente de fragmentos de RNA protegidos foram tal como descrito anteriormente (Coca Μ: A: et. al.; Plant Molecular Biology 31: 863-876, 1996, aqui incorporado a titulo de referência). C. Análise Northern: 0 RNA total (20 pg) foi desnaturado com formamida e formaldeido, separado em um gel de 1,5% (peso/volume) de agarose/6% de formaldeido, e transferido para membranas de náilon (Hybond N; Amersham-Pharmacia, Buckinghamshire, UK) essencialmente tal como descrito por Sambrook, Fritsch &

Maniatis (1989) . A hibridização foi executada durante toda a noite a 65°C em 6 χ SSC (1 x SSC é 0,15 M de NaCl, 0,015 M de Na3-citrato, pH 7,0), 0,1% (peso/volume) de polivinilpirrolidona, 0,1% (peso/volume) de albumina de soro bovino, 0,11 (peso/volume) de Ficoll, 0,5% (peso/volume) de dodecil sulfato de sódio (SDS). Um fragmento de Spel/FcoRI (de +424 a + 674), que corresponde à região não codificadora 3' do cDNA de Hahb-4 mais os últimos 177 nucleotídeos da região de codificação, que não inclui o domínio de Hd-Zip, foi etiquetado com [32P]dATP (1 χ 108 dpm pg-1) pela aplicação randômica de primers (Sambrook et al., 1989) e utilizado como sonda. Os filtros foram autoradiografafos ao utilizar as películas Bio-Max e transtela (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA) durante toda a noite. Para verificar a quantidade de RNA total carregado em cada pista, os filtros foram verificados novamente com um rRNA 25S de Vicia faba sob condições similares àquelas descritos acima, exceto pelo fato que a hibridização foi executada a 62°C. D. Preparação dos núcleos: Os núcleos de girassol e os extratos nucleares foram preparados a partir dos brotos de controle, sob stress de água, ou tratados com ABA (com quatro dias de vida) de acordo com a técnica descrita em Maliga et al. (Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual, páginas 233-260. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1995, aqui incorporado a título de referência) . Os padrões de proteína foram analisados através de SDS-eletroforese com gel de poliacrilamida (PAGE) e a concentração total da proteína foi medida tal corno descrito por Sedmak J. et. al., Analytical Biochemistry 79: 544-552, 1977. E. Ensaios de ligação de DNA: Para os ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA), alíquotas de proteínas nucleares purificadas (30 pg) foram incubadas com DNA de cordão duplo (0,3 a 0,6 ng, 30 000 c.p.m., etiquetados com [32P]dATP pelo preenchimento das extremidades 3' ao utilizar o fragmento de Klenow de polimerase de DNA) gerado por uma ou outra hibridização dos olígonucleotídeos complementares 5'-AATTCAGATCTCAATAATTGAGAG-3' e 5' -GATCCTCTCAATTATTGAGATCTG-3' (SEQ ID N° 18 e SEQ ID N° 19) (o sítio de ligação para Hahb-4 está sublinhado), As reações de ligação (20 μΐ) que contêm 20 mM de HEPES-NaOH (pH 7,6), 40 mM de NaCl, 0,2 mM de ácido etileno diaraina tetraacético (EDTA), 1,0 mM de ditiotreitol (DTT) , 0,5¾ de Triton X-100, 20¾ de glicerol, e 1,5 pg de poli(dl-dC), foram incubadas por vinte minutos a 25°C, suplementadas com 2,5% (peso/volume) de Ficoll e carregadas imediatamente em um gel de aplicação (5% de acrilamida, 0,08¾ de bis-acrilamida em 0,5 no χ TBE mais 2,5% de glicerol; 1 * TBE é 90 mM de Tris-borato, pH 8,3, 2 mM de EDTA). O gel foi aplicado em 0,5 χ TBE a 30 mA por uma hora e meia e secado antes da autoradiografia.

Exemplo 3; Teste para conferir a tolerância ao stress de água em Arabidopsis thaliana empregando o Hahb-4 de girassol da invenção A. Material Biológico: A cepa DH5a de E. coli e a cepa GV2260 de Agrobacterium tumefaciens foram empregadas. Para a transformação das plantas, foram utilizadas sementes de teste do ecotipo Columbia-0 de Arabidopsis thaliana. B, Clonagem molecular: Para a clonagem de Hahb-4 sob o controle do promotor de CaMV35S, uma reação de PCR foi levada a efeito ao utilizar [como modelo] o clone que corresponde ao cDNA (Gago et al., Plant Cell & Environment 25: 633-640, 2002, aqui incorporado a título de referência) e dois oligonucleotídeos específicos Tl; 5'-GCGGGATCCACCATGTCTCTTCAACAAGTA-3'; (SEQ ID N° 20) e T2: 5' -GCCGAGCTCTTAGAACTCCCAACCACCTTTTG- 3T (SEQ ID N° 21) que hibridízaram em ambas as extremidades da região de codificação. Dessa maneira, as regiões 3' e 5' que não codificam o mensageiro ARN são eliminadas, desse modo diminuindo os efeitos possíveis da regulação pós-transcricional. Esses oligonucleotídeos foram projetados de uma maneira que eles podem ser introduzidos no fragmento amplificado nos sítios SamHI e Saci do plasmídio. Além disso, a seqüência estabelecida como consenso para uma translação ideal foi adicionada ao oligonucleotídeo na extremidade de cDNA 5' (oligonucleotídeo Tl). O produto da reação de PCR foi purificado e digerido com as enzimas acima mencionadas e clonado no vetor pBI 121 ao utilizar E, coli para a transformação. Uma vez que o clone desejado foi obtido, o DNA plasmídícoc foi introduzido em A. tumefaciens de acordo com o método descrito por Hõfgen e Willmitzer (Hõfgen and Willmitzer, Nucleic Acid Research 16: 9977, 1998). A cepa de Agrobacterium que tem o plasmídio pBI 121 onde o gene gus foi substituído por Hahb-4 foi denominada ATH4.

As técnicas de clonagem e verificação foram tiradas de Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. C. Transformação de Arabidopsis thaliana·. O método empregado para transformar Arabidopsis thaliana era aquele que utiliza a imersão (mergulho floral) descrita por Clough e Bent (Clough and Bent, Piant J. 16: 735-743, 1998). As sementes recuperadas do teste de transformação foram esterilizadas e cultivadas em placas de Petri que continham meio MS suplementado com canamicina, 40 mg/1. As plantas resistentes (Fl) foram passadas para o solo e mantidas até serem produzidas as sementes. As linhagens resultantes (F2) foram analisadas quanto à presença do transgene (gene Hahb-4) ao utilizar PCR, e a expressão do transcrito correspondente também foi submetida à análise Northern. As linhagens que expressam o transgene foram reproduzidas até serem obtidas sub-linhagens de homozigotos.

As preparações do RNA total de Arabidopsis thaliana foram executadas de acordo com o método descrito por Carpenter e Simon (Carpenter, C. and Simon, A. (1998) Preparation of RNA. Enln: Methods in Molecular Biology, volume 82: Arabidopsis Protocols. J.M. Martinez-Zapater and J. Salinas (Eds.), Humana Press Inc., Totowa, New Jersey). Para a análise Northern, os processos descritos foram executados (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. (1983) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, N.Y) .

Para analisar as plantas de Arabidopsis thaliana transformadas por meio da técnica de PCR, as preparações do DNA total foram executadas ao empregar um método rápido descrito por Li e Chory (Li, J. and Chory, J. (1998) Preparation of DNA from Arabidopsis. In: Methods in Molecular Biology, vol. 82: Arabidopsis Protocols. J.M. Martinez- Zapater and J. Salinas (Eds.), Humana Press Inc., Totowa, New Jersey) D. Análise Fenotipica: Dl. Análise em placas de Petri: As sementes de Arabidopsis thaliana foram esterilizadas ao serem lavadas com ethanol a 70% (v/v) (1 minuto), cloro a 5%-SDS a 1% (15 minutos) e água destilada estéril (três vezes). A seguir, as sementes foram suspensas em 8 ml de ágar a 0,1% e semeadas em placas de Petri de 150 mm contendo meio MS, com a adição de vitaminas de Gamborg. As placas foram mantidas a 4°C durante dois dias e colocadas então em uma câmara de cultura com luz e temperatura controladas (16 horas sob iluminação a 24°C e oito horas na escuridão a 21°C). As condições requeridas para a iluminação (150-200 μΕ/m2) foram obtidas artificialmente ao manter as plantas a uma distância de 25 cm de seis tubos fluorescentes, intercalando a luz branca e tubos Grolux (da Sylvania) posicionados adjacentes. A manipulação do material da planta foi feita em condições estéreis. O meio de cultura MS foi esterilizado em uma autoclave e as vitaminas foram adicionadas subseqüentemente por meio de filtração. D2: Testes no solo: Os testes no solo foram realizados em vasos de 12 cm de diâmetro e 10 cm de altura. Dependendo do teste, cada vaso foi semeado com aproximadamente uma a três sementes de Arabídopsís distribuídas eqüidistantemente. A bandeja foi coberta com material de plástico transparente até o aparecimento do broto, e então o plástico foi removido. Cada 16 vascs foram colocados em uma bandeja de plástico, e o crescimento das plantas foi seguido em uma câmara de cultura sob as mesmas condições de iluminação indicadas acima. A água da irrigação foi suplementada nas bandejas de plástico.

Para realizar os testes de stress de água, a bandeja foi suplementada a partir do início com 1, 1,5 ou 2 litros de água. Em todos os casos nenhuma água adicional foi adicionada até o final do ciclo reprodutivo. Essas condições de irrigação, ao manter a câmara da cultura sob condições de umidade muito baixa, geram nas plantas um stress de água quando elas têm dois pares de folhas, a roseta completa ou flores desenvolvidas, respectivamente. O stress de água pode ser visualizado a partir da secura e da rachadura do solo, da perda de turgência nas folhas e finalmente da morte das plantas.

Exemplo 4: Isolamento e caracterização do promotor de hahb-4, construtos que contêm fragmentos diferentes do promotor e plantas transgênicas de A. Thaliana que contêm os ditos construtos A. Material vegetal, condições de cultivo e tratamento: Foram empregadas sementes de girassol da cultura Contiflor 15 (Helianthus annuus L.) (Zeneca). Para os testes de transformação da planta, foram utilizadas sementes de Arabídopsis thaliana do ecotipo Columbia-0.

As sementes de Arabídopsis thaliana foram esterilizadas ao serem lavadas em etanol 70% (v/v) {1 minuto), cloro a 5%-SDS a 1% (15 minutos) e água destilada estéril (três vezes). Subseqüentemente, as sementes foram resuspensas em 8 ml de ágar a 0,1% e foram semeadas em placas de Petri de 150 mm contendo o meio MS, com a adição de vitaminas de Gamborg. As placas foram mantidas a 4°C por dois dias e então colocadas em uma câmara de cultura com luz e temperatura controladas (16 horas sob iluminação a 24°C e oito horas na escuridão a 21°C), O cultivo das plantas de Arabídopsis thaliana foi realizado em uma câmara com luz e temperatura controladas (16 horas sob iluminação a 24°C e oito horas na escuridão a 21°C). As condições requeridas para a iluminação (150-200 μΕ/m2) foram obtidas artificialmente ao manter as plantas a uma distância de 60 cm de seis tubos fluorescentes, intercalando tubos de luz branca e tubos Grolux (da Sylvania) posicionados adjacentes. B. Purificação do DNA da planta: Para extrair o DNA total das plantas, foi empregado o método descrito por Doyle e Doyle (Doyle, J.J. and Doyle, J.L. (1987). Um procedimento de isolamento rápido do DNA para quantidades pequenas a partir de tecido fresco da folha.

Phytochemical Bulletin 19, 11-15) foi executado. C. Plasmidios, cepas e métodos de clonagem molecular empregados: 0 plasmídío de pGEM.-Teasy (Promega) foi utilizado para clonar os produtos das reações de amplificação com Taq DMA polimerase (Promega). 0 plasmídío pBHOl (Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901-3907, 1987) também foi utilizado, e o plasmídío é um derivado do vetor binário pBIN19. Ele contém o gene que codifica β-glucuronidase de E, coli igus) com o sinal de poliadenilação de nopalina sintetase (nos). Ele também contém o gene nptIII que confere resistência a canamicina nas plantas. Outras seqüências que são relevantes no vetor incluem o gene que confere resistência à canamicina nas bactérias e em uma origem de replicação de bactérias RK2. Esse plasmídío foi utilizado para clonar fragmentos diferentes do promotor de girassol Hahb-4 em Arabidopsis thaliana, em sítios de restrição singulares localizados a montante do gene gus.

Os construtos de clonagem no vetor I-easy ou pBI foram obtidos primeiramente ao utilizar células hospedeiras competentes de DH5oí de E. coli seguindo os protocolos de transformação ou eletroporação tal como descrito em Sambrook (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y) . Para preparar células competentes de A. tumefaciens e ainda a transformação das mesmas, foi seguido o método descrito por Hõfgen e Willmitzer (Hõfgen, R. and Willmítzer, L. (1988). A armazenagem de células competentes de Agrobacterium para a transformação foi executada de acordo com Nucleic Acids Res. 16, 1977) . D. Clonagem molecular de fragmentos do DNA: Para clonar a região de promoção do gene da invenção, foi empregada a estratégia de PCR inversa descrita por Ochman et al. (Ochman, H., Ayala, F.J. and Hartl, D.L. (1993) O uso da reação em cadeia de polimerase para amplificar os segmentos fora dos limites de seqüências conhecidas, em: Methods in Enzimology, volume 218. R. Wu (Ed.), Academic Press, San Diego, CA), foi efetuado tal como segue. A extração do DNA genômico do girassol foi feita tal como descrito acima, empregando 5 pg de DNA, e foram utilizados 1-3 U de SauIIIA ou HindIII (Promega) por micrograma do DNA. Uma vez que a digestão foi verificada (ao semear uma alíquota em gel de agarose a 0,7% (p/v)), os fragmentos foram precipitados através da adição de 1/10 volume de NaAc 3M (pH 5,2) e dois volumes de etanol absoluto.

Para realçar a religaçâo dos fragmentos de restrição, as reações foram executadas em um volume final de 100 μΐ. Foram empregados 2, 10 e 20 ng dos fragmentos obtidos em cada reação e 5U de T4 DNA ligase (Promega) . As reações foram executadas por 16 horas a 14°C. Os fragmentos foram precipitados e purificados para serem utilizados como modelo em uma reação de PCR.

As reações de PCR na primeira etapa foram executadas ao utilizar como um modelo o DNA da reciclagem dos fragmentos digeridos com SauIIIA, com oligonucleotídeos IPCR0/IPCR1 (SEQ ID N° 12/SEQ ID N°15) , e no caso do DNA digerido com HindIII, os oligonucleotídeos empregados eram IPCR2/IPCR3 (SEQ ID N° Ιβ/SEQ ID N° 17) . Os fragmentos obtidos foram clonados no vetor pGEM®-Teasy (Promega), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Uma vez que a clonagem foi verificada, a seqüência correspondente foi determinada e os oligonucleotídeos necessários para a etapa seguinte foram projetados. A seqüência e a posição dos oligonucleotídeos utilizados nas etapas seguintes de clonagem são mostradas na figura 23: IPCRO [5'-GGCGGATCCCCTGGTGGTTGTTTCTGTTG-3'] 1PCR1 [ 5' -GCCGAATTCAGATTGAGCAAGAGTATMC-3 ' ] IPCR2 [5'-ACCTTTATAAAGACCACTC-3'] IPCR3 [5'-ACGCAATGGTGÃGTTGTAC-3'] IPCR4 [5’-GCGAAGCTTGATGCGAACGAGTGGTTTA] IPCR5 [5'-ATTTCGCAAGTAGTCCATT-3'] IPCR6 [5'-CCCAAGCTTAACCTAAGTCCGCCTTTG-3'] IPCR7 [51 -GGCAAGCTTATCTCAACCGAMGTGAC-3] Finalmente, uma vez que essa técnica é apta para a clonagem segmentada, o conhecimento da sequência para amplificar o segmento completo utilizando o DNA genômico do girassol como molde [modelo], foram utilizados a reação em cadeia de polimerase e dois oligonucleotídeos projetados de uma tal maneira a hibr.ídizar as extremidades opostas (IPCR10: GCGGTCGACACCTGGCACATCGTATCT (SEQ ID N° 5) e IPCR8: CGCGGATCCGAGGGTTTGATAAGTGAT (SEQ ID N° 6)). 0 produto da amplificação foi clonado no vetor pGEM-Teasy e a sua sequência foi determinada subseqüentemente. A estratégia utilizada para a PCR inversa, bem como para a construção de plasmídios recombinantes utilizados na transformação das plantas é mostrada na figura 23.

Os fragmentos diferentes do promotor incluindo o sítio de iniciação de transcrição foram clonados posteriormente no vetor pBI101.3. A.lternativamente, para estudar os segmentos do promotor que ficam distantes do sítio de iniciação de transcrição, foi empregado um vetor pBI modificado que contém um promotor mínimo (-90 C&MV35S) incluindo a caixa TATA. Esse vetor também contém o gene gus como um repórter, permitindo dessa maneira medir a atividade de promoção de cada segmento clonado. E. Clonagem do intron de Hahb-4: Para clonar o intron de Hahb-4, uma reação de PCR foi executada ao utilizar como modelo o DNA genômico do girassol e os oligonucleotídeos IPCR1 (5'~ GCCGAATTCAGATTGAGCMGAGTATAAC-3 (SEQ ID N° 15) e NI (51-GCGGGATCCGTCTGGCAGTTGTTCTTC-3’SEQ ID N" 22)). 0 produto obtido foi digerido com EcoRI e 5amKI (sítios fornecidos pelos nucleotídeos) e clonado subsequentemente no plasmídio pUC119 digerido previaraente cora as mesmas enzimas. Uma vez que foi verificada a presença do enxerto que tem o tamanho previsto em algumas das colônias obtidas brancas, a sua sequência foi determinada tal como descrito abaixo. F, Transformação das plantas de Arabidopsis thaliana com os construtos obtidos no estágio anterior. 0 método empregado para transformar as plantas de Arabidopsis thaliana fci o método da imersão (mergulho floral) descrito por Clough e Bent (Clough, S.J. and Bent, A.F. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterlum-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735-743) .

Para cada construto, dez a doze vasos que têm um diâmetro de 10 cm foram preparados com terra e cobertos com um tecido de fibra. 0 pano foi fixado de uma maneira a ficar bem aderido à superfície do solo. Em seguida, as sementes foram bem espalhadas no solo e os vasos foram colocados em uma bandeja coberta com papel de náilon transparente. As plantas foram cultivadas sob as condições acima mencionadas; depois de uma semana, o papel de náilon foi removido e as plantas mais resistentes foram selecionadas.

As plantas foram cultivadas até o estágio de florescência (aproximadamente quatro semanas). Quando os pedicelos da flor estavam irrompendo (1-2 cm da roseta), as inflorescências foram cortadas ao tomar cuidado para não danificar as folhas caulinares. Quatro a seis dias depois do corte acima mencionado, novas inflorescências irromperam., Foi esperado até que todas as inflorescências tivessem pelo menos quatro flores ainda não abertas e então a transformação foi executada.

Para preparar a transformação, as células da suspensão de A. tumefaciens foram cultivadas em três frascos contendo 10 ml de meio LB suplementado com 50 mg/1 de rifampicina e 50 mg/1 de canamicina por 24 horas a 28cC com agitação. Essas culturas foram utilizadas para a inoculação de três frascos Erlenmeyers contendo 200 ral do mesmo meio, e foram cultivadas até o estágio estacionário (12 a 16 horas a 28°C, com agitação) . As células foram colhidas através de centrifugação a 5.500 x g por vinte minutos. As pelotas foram resuspensas em um litro de uma solução de sacarose a 5% contendo 300 μΐ de Silwet L-77 (OSI Specialties, Inc.), e a suspensão foi colocada em um vidro de precipitação com um agitador magnético. As plantas foram submersas por 10 a 60 segundos, tentando impedir que o líquido entrasse em contato com o solo. Os vasos foram colocados então em uma posição horizontal em uma bandeja, foram cobertos por um papel de náilon e colocados na câmara da cultura. Os vasos foram colocados no dia seguinte era uma posição normal, foi adicionada água à bandeja, e as plantas foram deixadas crescendo até as sementes ficarem maduras (quatro a cinco semanas).

Finalmente, as sementes foram coletadas de cada vaso separado, e as cascas e o solo foram limpados manualmente. As sementes foram mantidas em um refrigerador para uma análise adicional.

Para selecionar as plantas transformadas, as sementes coletadas nos testes da transformação forara esterilizadas e semeadas em placas de Petri contendo o meio MS suplementado com 40 mg/1 de canamicina tal como indicado acima. Durante os primeiros dias na câmara de cultura, a maior parte das sementes germinou (95%-99%) .

Em aproximadamente dez dias, os cotilédones das plantas sensíveis ficaram amarelos, ao passo que os cotilédones das plantas transformadas permaneceram verdes. As placas foram mantidas na câmara por mais sete dias, e durante esse período folhas muito verdes e reais eram visíveis somente nas plantas transformadas. As plantas não transformadas morreram. As plantas resistentes foram transferidas para vasos de flores com terra. Para impedir que a umidade diminuísse de repente, os vasos foram colocados em uma bandeja com água e cobertos com papel de náilon transparente por uma semana. Depois desse período de tempo onde o papel foi removido para descobrir a bandeja e as plantas foram cultivadas até o amadurecimento das sementes, as sementes foram coletadas e colocadas em um refrigerador para uma análise adicional. Além de selecionar as plantas quanto à sua resistência à canamicina, a presença do transgene foi verificada por meio de PCR específica.

Finalmente, as linhagens de homozigotos da terceira geração da planta foram selecionadas através de semeadura nas placas com canamicina e ao observar a tolerância de 100¾ em diversas sublinhagens. G. Análise histoquímica da atividade de β-glucuronidase nas plantas transformadas da invenção.

As plantas da invenção de A, thaliana que ficaram 'resistentes à canamicina na seleção e na reação de PCR foram sujeitadas ao teste histoquímico da atividade de β-glucuronidase. Os embriões e os órgãos testados foram lavados com 50 mm de tampão de Na2HP04, pH 7. Eles foram transferidos então para uma solução de 50 mM de NazHPOu, pH 7, 0,1% de Triton X-100, 2 mM de X-gluc (5Abromo-4-cloro-3-indolil-3-D-gluc.uronídeo), sujeitados ao vácuo por cinco minutos e incubados a 37°C na escuridão entre duas e doze horas. Depois da incubação, eles foram fixados em uma solução de 10% de formaldeído, 50% de etanol e 5% de ácidc acético por dez mir.utos à temperatura ambiente. O formaldeído foi removido, etaanol a 70% fci adicionado, e conservado a 4°C. A análise histoquímica realizada em brotos com 2, 10 e 20 dias de vida cultivados em placas de Petri contendo o meio MS e 0,8% de ágar, e as plantas adultas foram cultivadas em vasos de flores contendo terra. H. Análise fluorométrica da atividade de β-glucuronidase nas plantas transformadas da invenção: As plantas transformadas que ficaram resistentes ao antibiótico, confirmadas como linhagens positivas pela reação de PCR, e que expressaram histoquimicamente a enzima β-glucuronidase, foram utilizadas para estudar a regulação da regi]ao de promoção por testes fluorométricos. Entre 30 e 50 sementes de cada linhagem foram cultivados em placas de Petri de 30 mm com meio MS-ágar. Depois de um crescimento apropriado, as plantas foram transferidas aos tubos com o meio líquido MS suplementado ou não com ABA e incubadas por períodos de tempo diferentes tal como detalhado mais abaixo. Depois da incubação, as plantas foram mantidas em nitrogênio líquido até o seu processamento. O extrato de proteína foi obtido através da homogeneização do material vegetal (aproximadamente 2-5 mg) até ser obtido un pó fino. A seguir, 500 μΐ de tampão de extração (50 mM de Ν&2ΗΡ04, pH 7, 10 mM de EDTA, 0,1% de SDS, 10 mM de β-mercaptoetanol, 1% de Tritón X-100) foram adicionados. A suspensão foi transferida para um tubo Eppendorf e centrifugada a 13.000 xg por dez minutos a 4°C. 0 sobrenadante foi removido e a pelota foi mantida em gelo. A reação fluorométrica foi executada de acordo com o método de Jefferson (Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. and Bfivan, M.W. (1987} Gus fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatíle gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907). 100 μΐ do extrato de proteína foram adicionados a 100 μΐ de metanol e 300 μΐ de substrato MUG (4-metil umbeliferil β-D-glucuronídeo). Uma alíquota de 100 μΐ foi extraída e uma medição flurométrica foi feita imediatamente no tempo 0. Os 400 μΐ restantes foram incubados a 37°C em água em ebulição e as alíquotas de 100 μΐ foram removidas nos tempos de 30, 60 e 120 minutos. Para parar a reação, foi utilizado 0,9 ml de Na2C03 0,2 M. Os valores das reações fluorométricas foram expressos em pmoles de produto/mg de proteínas totais por minuto de acordo com uma curva padrão de RFU como uma função da concentração do produto 4-MU (7-hidróxi-4 metil umbeliferona).

As medições fluorométricas foram feitas em um equipamento VersaFluorTM Fluorometer System, da Bio-Rad (filtros EM 460/10 e EX 360/40) em placas de 1 ml. I. Quantificação das proteínas totais: A concentração das proteínas solúveis dos extratos de proteína foi determinada ao empregar o método descrito por Sedmak e Grossberg (Sedmak, J. and Grossberg, S. (1977) A rapid, sensitive, and versatíle essay for protein using Coomassie brilliant blue G-250. Anal. Biochem. 79, 544-552). Λ albumina de soro bovino (BSA) foi utilizada como padrão. J. Determinação e análise das seqüências: Para determinar a seqüência do DNA dos construtos obtidos, foi utilizado um equipamento comercial T7 Sequencing kit (Amersham Biosciences), e o método é baseado no método de Sanger (Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chaín-terminatíng inhibitors. Proc. Natl. Acad. Scí. USA 74, 5463-5467), combinando extensão/terminação de DNA em somente uma etapa. Além disso, essas seqüências foram confirmadas em um sequenciador automático (Service given High Complexity Laboratory, INTA, Castelar, Bs. As. Argentina), Para identificar as seqüências reguladoras dentro das regiões de promoção, foram utilizados os bancos de dados PLACE (Hígo, K.( Ugawa, Y., Iwamoto, M. and Korenaga, T. (1999) Plant cis-acting regulatory DNA eleraents (PLACE) database: 1999. Nucleic Acids Res. 27, 297-300) e PlantCARE (Rombauts, S., Dehais, P., Van Montagu, M. and Rouze, P. (1999) PlantCARE, a plant cis-acting regulatory element database. Nucleic Acids Res. 27, 295-296) .

Quando a técnica empregada não foi especificada, foram empregados os protocolos clássicos descritos por Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., e Ausubel, F.M., Brent, R., Kíngston., R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. e Struhl, K. (1983) Current Protocols in Molecular Biology. John Wíley & Sons, N.Y.

Embora as realizações preferidas da presente invenção tenham sido ilustradas e descritas, será óbvio aos elementos versados na técnica que várias mudanças e modificações podem ser feitas na mesma sem que se desvie do âmbito da invenção tal como definido nas reivindicações anexas.

Claims

1. VETOR, caracterizado por compreender um promotor heterólogo operacionalmente ligado a uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo uma SEQ ID No. 2.

2. CÉLULA HOSPEDEIRA DE FUNGO OU BACTÉRIA, caracterizada por ter sido estavelmente transformada com o vetor, conforme definido na reivindicação 1.

3. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA TOLERANTE AO STRESS DE ÁGUA, caracterizado por compreender: a transformação estável de uma célula da planta ou uma cultura de células com o vetor, conforme definido na reivindicação 1; e a regeneração das células ou das culturas de células em plantas.

4. VETOR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo promotor heterólogo ser CaMV35S.