BRPI0312521B1 - Método para a separação de fibrinogênio de plasminogênio - Google Patents

Abstract

"métodos para a separação e a purificação de fibrinogênio e de pelo menos uma outra proteína e para a co-purificação de fibrinogênio e de fator xiii, uso de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado, fibrinogênio, kit farmacêutico, e, formulações farmacêutica e de fibrinogênio liofilizado". o uso de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado para a separação de fibrinogênio de plasminogênio, para a purificação de fibrinogênio e de pelo menos uma outra proteína, por exemplo plasminogênio, e para a co-purificação de fibrinogênio e fator xiii.

Description

“MÉTODO PARA A SEPARAÇÃO DE FIBRINOGÊNIO DE PLASMINOGÊNIO” A presente invenção refere-se aos processos para a purificação de fibrinogênio, e às preparações de fibrinogênio prontamente solubilizadas. O fibrinogênio é uma proteína de plasma sanguíneo que está relacionada com a formação de coágulo. Ele é convertido em monômero fibrina pela ação da protease de plasma trombina. Os monômeros fibrina agrupam-se juntos para formarem um coágulo fraco e são então reticulados pela ação do fator XIII ativado (isto é fator XHIa) para uma forma de coágulo forte. O fibrinogênio é usado em terapia em combinação com trombina nos denominados vedantes de fibrina para se obter hemostasia, para fechar ferimentos e para a adesão controlada de tecido. Concentrados de fibrinogênio também são usados para tratamento de terapia de substituição de pacientes com deficiência de fibrinogênio (afibrinogenemia) que pode ser herdada ou adquirida.

Para todas as aplicações clínicas, é importante que se tenha fibrinogênio elevadamente puro com o propósito de minimizar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis resultantes de, por exemplo, a presença de proteínas contaminantes não desejadas. Em particular, é desejável que as preparações de fibrinogênio para uso clínico estejam livres de plasminogênio e de plasmina (Blomback B., Blomback M., "Purificarion of human fibrinogen free of plasminogen", Arkiv for Kemi 1956, 57:415-443, e Mosesson M. W., "The preparation of human fibrinogen free of plasminogen", Biochim. Biophys. Acta 1962, 57:204-213). Plasminogênio é o precursor inativo de plasmina, uma enzima fibrinolítica que digere coágulos de fibrina. Portanto a presença de plasminogênio em uma preparação de fibrinogênio intencionada para uso in vivo é indesejável porque qualquer plasmina gerada do plasminogênio no sítio de formação de coágulo pode então desestabilizar o coágulo. O plasminogênio tende a se co-purificar com fibrinogênio e sua remoção pode ser difícil. Algumas preparações de fibrinogênio clínicas portanto contêm agentes antifibrinolíticos para inibir qualquer plasmina ou plasminogênio presente (por exemplo aprotinina, um inibidor proteínico bovino de plasmina; ou ácido tranexâmico, um inibidor de plasmina sintético também associados com efeitos colaterais neurotóxicos). Uma desvantagem da separação de plasminogênio de fibrinogênio é que não há então a necessidade de usar tais inibidores fibrinolíticos na preparação de fibrinogênio clínica.

Em adição, é elevadamente desejável que fibrinogênio derivado de fontes humanas ou animais seja tratado para inativar quaisquer vírus originários do sangue que possam estar presentes, por exemplo vírus da hepatite ou HIV. Vários métodos de inativação viral são conhecidos na arte, incluindo pasteurização, tratamento térmico seco e tratamento com solvente-detergente ("Pathogen Inactivation of Labile Blood Products", Council of Europe Expert Committee and Blood Transfusion Study Group on Phatogen Inactivation in Labile Blood Products, Transfusion Medicine, 2001, 11, 149-175). O tratamento térmico seco é, como se sabe, efetivo para a inativação vírus tanto envelopados quanto não envelopados, enquanto que o tratamento com solvente-detergente é, como se sabe, efetivo para a inativação de vírus envelopados (isto é revestidos de lipídeo) tal como um de hepatite B. Vários métodos para a purificação de fibrinogênio são conhecidos na arte. Contudo, os métodos de purificação da arte anterior sofrem de várias desvantagens. Por exemplo, os métodos de precipitação não permitem a fácil incorporação de uma etapa de inativação de vírus por solvente-detergente (SD), porque a remoção de reagentes SD é muito mais eficientemente efetuada por cromatografia. Os métodos cromatográficos podem não separar fibrinogênio de plasminogênio em uma única etapa, o que pode acarretar a necessidade de cromatografia adicional para adsorver plasminogênio, ou a necessidade de se adicionar um agente antifibrinolítico na preparação de fibrinogênio final para combater o plasminogênio residual. Em adição, nem todos os métodos da arte anterior são adequados para a purificação de fibrinogênio a partir de uma ampla variedade de soluções contendo fibrinogênio (incluindo frações recombinantes e de plasma). US 5.169.936 tem previamente sugerido que cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado (IMAC) pode ser usada na preparação de fibrinogênio humano. Contudo, nenhuns exemplos de um tal método são descritos, nem há qualquer sugestão de que IMAC podería ser utilizada para a separação de fibrinogênio de plasminogênio.

Também é sabido que a dissolução de concentrados de fibrinogênio pode ser difícil, e muitas vezes requer o uso de temperaturas elevadas ou de agitação prolongada (veja US 5.260.420 e EP-A 0804933). Devido à instabilidade das soluções líquidas de fibrinogênio no decorrer do tempo, as preparações de fibrinogênio para uso clínico são comercializadas quer na forma de uma solução profundamente congelada quer como um liofilizado (isto é uma preparação seca por congelamento). Antes do emprego, o produto comercial tem que ser quer descongelado quer reconstituído a partir do liofilizado. Ambas estas medidas requerem temo e esforço significativos.

Portanto seria vantajosa a provisão de métodos alternativos para a purificação de fibrinogênio, em particular de um método que seja aplicável a qualquer material inicial contendo fibrinogênio e que permita a incorporação de uma ou mais etapas de inativação de vírus. Também seria vantajosa a provisão de um método para a separação de fibrinogênio de plasminogênio. Em adição, seria vantajosa a provisão de um concentrado de fibrinogênio liofilizado, e preferivelmente termicamente tratado que possa ser prontamente redissolvido na temperatura ambiente.

Em um aspecto, a presente invenção portanto proporciona um método para a separação e a purificação de fibrinogênio e de pelo menos uma outra proteína que compreende as etapas de: (a) carregar uma solução compreendendo fibrinogênio e pelo menos uma outra proteína para cima de uma matriz de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado sob condições tais que tanto o fibrinogênio quanto a pelo menos uma outra proteína se ligam na matriz, e (b) seletivamente eluir o fibrinogênio e a pelo menos uma outra proteína separadamente da matriz. O fibrinogênio a pelo menos uma outra proteína podem ser coletados separadamente e cada um pode ser processado adicionalmente conforme requerido.

Preferivelmente, a solução compreendendo fibrinogênio é uma fração de plasma contendo fibrinogênio. Preferivelmente, a pelo menos uma outra proteína é plasminogênio.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a separação de fibrinogênio de plasminogênio compreendendo o uso de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado. Preferivelmente, o método compreende as etapas de: (a) carregar uma solução compreendendo fibrinogênio e plasminogênio para cima de uma matriz de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado sob condições tais que pelo menos o fibrinogênio se liga na matriz, e (b) seletivamente eluir o fibrinogênio da matriz. Preferivelmente o plasminogênio também se liga na matriz, e o plasminogênio e o fibrinogênio podem ser seletivamente eluídos separadamente da matriz.

Como aqui usadas, referências à separação e/ou purificação de fibrinogênio incluem a separação e/ou co-purificação juntas de fibrinogênio e fator XIII juntos a partir de materiais iniciais compreendendo ambos fibrinogênio e fator XIII. O material inicial para os métodos da invenção pode ser qualquer solução contendo fibrinogênio, incluindo plasma humano ou animal ou uma fração de plasma, frações de cultura celular de tecnologia recombinante, frações derivadas de leite de animais transgênicos, etc. Os materiais iniciais preferidos são frações de plasma tais como crioprecipitado, precipitado de heparina e precipitado frio. Materiais iniciais mais preferidos incluem crioprecipitado e precipitado de heparina. Outros materiais iniciais preferidos incluem aqueles compreendendo adicionalmente plasminogênio e/ou fator XIII. O material inicial pode ser preparado por qualquer método adequado conhecido na arte, incluindo manipulação via gene, por exemplo em cultura celular ou espécie transgênica. Por exemplo, crioprecipitado pode ser preparado de acordo com o método de Gunson H.H., Bidwell E., Lane R.S., Wensley R.T., Snape T.J., "Variables involved in cryoprecipitate production and their effect on Factor VIII activity", British Journal of Haematology, 1978;43:287 - 295; precipitado de heparina pode ser preparado de acordo com o método de Winkelman L., Owen N.E., Evans D.R., Evans H.E., Haddon M.E., Smith J.K., Prince P.J., Williams J.D., Lane R.S., "Severely heated therapeutic Factor VIII concentrate of high specific activity", Vox Sanguinis, 1989;57:97 - 103; e precipitados frios de acordo com o método de Smith J.K., Evans D.R., Stone V., Snape T.J., "A Factor VIII concentrate of intermediate purity and higher potency", Transfusion, 1979;19:299 - 306.

Contaminantes indesejados no material inicial que podem ser separados do fibrinogênio usando os métodos da invenção podem incluir outras proteínas (por exemplo proteínas de plasma tal como plasminogênio), reagentes de etapas de processamento anteriores (por exemplo elementos de meios de cultura celular ou reagentes solvente-detergente), vírus e príons. E particularmente preferido que plasminogênio seja removido, de modo que a adição de inibidores de plasmina (agentes antifibrinolíticos) no fibrinogênio seja evitada. A solução contendo fibrinogênio é carregada para cima de uma matriz de IMAC. Preferivelmente, a matriz está presente em uma coluna para facilidade de processamento. Qualquer íon de metal adequado pode ser usado, por exemplo cobre, zinco ou níquel, preferivelmente cobre. Géis de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado adequados para uso no processo da invenção incluem gel de metacrilato com ligantes multi-substituídos sobre os espaçadores de cadeia lateral (por exemplo Fractogel EMD Chelate da Merck), gel de metacrilato com grupos quelantes simples sobre o braço espaçador (por exemplo Toyopearl Chelate da Tosoh Biosep) e gel de agarose reticulada (por exemplo, chelating Sepharose FF da Amersham Biosciences). Um gel preferido é Toyopearl AF Chelate 650 (M) da Tosoh Biosep.

As condições de carregamento, incluindo o tampão usado, devem ser escolhidas de tal modo que o fibrinogênio, e qualquer fator XIII se presente, no material inicial sejam ligados no gel. Contaminantes indesejados que não se ligam no gel podem ser então removidos por lavagem. Por exemplo, se o material inicial tiver sido previamente submetido a uma etapa de inativação com solvente-detergente, quaisquer reagentes solvente-detergente restantes não se ligam no gel e são facilmente removidos por lavagem. Altemativamente, se os contaminantes indesejados se ligam no gel podem ser removidos por eluição seletiva antes da eluição do fibrinogênio, ou podem permanecer ligados no gel enquanto o fibrinogênio é seletivamente eluído. Adicionalmente, a lavagem do gel e da(s) proteína(s) ligada(s) também podem ajudar a remover quaisquer vírus que possam estar presentes nas alimentações de cromatografia.

Tem sido verificado que o plasminogênio se liga menos firmemente do que o fibrinogênio ou o fator XIII nos géis de cromatografia de quelato de metal. Qualquer plasminogênio presente no material inicial pode ser portanto removido por lavagem, por eluição seletiva usando uma solução de concentração baixa de composto quelante competitivo de peso molecular baixo, ou pela mudança das condições de modo a reduzir a força de ligação, por exemplo pela redução do pH ou da força iônica, enquanto o fibrinogênio permanece ligado. Compostos quelantes adequados incluem aminoácidos, por exemplo alanina, leucina e lisina, imidazol, sais de citrato, e ácido etileno-diamino-tetraacético (EDTA). Um composto quelante preferido para a eluição de plasminogênio é alanina. A concentração de composto quelante deve ser escolhida de tal modo que os plasminogênio seja eluído enquanto o fibrinogênio permanece ligado no gel. A concentração exata dependerá do eluente usado. Por exemplo, concentrações de < cerca de 20 mM devem remover seletivamente plasminogênio na presença de fibrinogênio ligado. Concentração adequadas para a eluição de plasminogênio incluem < 20 mM de alanina ou leucina, <10 mM de lisina e < 10 mM de imidazol. O fibrinogênio pode ser então eluído usando uma concentração maior de composto quelante igual ou diferente, ou pela redução do pH ou da força iônica. Compostos quelantes preferidos para a eluição de fibrinogênio são aminoácidos, preferivelmente lisina ou arginina, e imidazol. Um eluente mais preferido compreende arginina. Por exemplo, o fibrinogênio pode ser eluído usando uma solução > 20 mM de composto quelante. As condições para a eluição de fibrinogênio (concentração e pH) devem ser escolhidas de tal modo que o fibrinogênio seja removido do gel mas o íon de metal não, com o propósito de minimizar a contaminação do produto com os íons de metal. A remoção do plasminogênio é vantajosa visto que o fibrinogênio pode ser então usado clinicamente sem a necessidade de adição de qualquer agente antifibrinolítico na preparação clínica. Uma outra característica vantajosa é que o plasminogênio que tem sido separado do fibrinogênio por IMAC pode ser então adicionalmente processado para dar um concentração de plasminogênio para uso clínico. IMAC pode portanto ser utilizada para preparar tanto plasminogênio quanto fibrinogênio a partir de uma solução inicial compreendendo ambos plasminogênio e fibrinogênio.

Uma característica vantajosa dos processos da invenção é que qualquer fator XIII no material inicial tende a co-eluir com o fibrinogênio. A presença de fator XIIII mensurável (> 1 u/ml) nas preparações de fibrinogênio finais pode ser benéfica se o fibrinogênio for para ser usado clinicamente. Tem sido mostrado que a concentração de fator XIII possui um efeito em alguns testes in vitro de vedantes de fibrina, embora não haja evidência de que o fator XIII seja requerido para a eficácia clínica, e os produtos vedantes de fibrina sem atividade de fator XIII mensurável têm sido utilizados com efeito clínico. Quando usado em um ambiente sanguíneo (por exemplo para hemostasia), o fator XIII endógeno do paciente estará presente para efetuar a reticulação do coágulo. Onde isto não for o caso é possível que a presença de fator XIII no produto possa ser benéfica. Visto que o fator XIII é uma enzima catalítica ele pode operar efetivamente até mesmo em concentração baixa. A presente invenção portanto adicionalmente proporciona um método para a co-purificação de fibrinogênio e fator XIII compreendendo o uso de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado. Preferivelmente, o método compreende as etapas de: (a) carregar uma solução compreendendo fibrinogênio e fator XIII para cima de uma matriz de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado sob condições tais que ambos o fibrinogênio e o fator XIII se ligam na matriz, e (b) seletivamente co-eluir o fibrinogênio e o fator XIII da matriz.

Opcionalmente, o material inicial contendo fibrinogênio pode ser submetido a um tratamento de inativação de vírus por solvente-detergente antes da cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado. A inativação de vírus por solvente-detergente pode ser realizada usando reagentes e métodos conhecidos na arte (veja por exemplo US 4.481.189, US 4.613.501 e US 4.540.573, todas as quais são por meio desta aqui incorporadas como referências). Solventes apropriados incluem fosfato de tri-n-butila (TnBP), e éter, preferivelmente TnBP. Detergentes adequados incluem polissorbato (Tween) 80, polissorbato (Tween) 20 e Triton X-100. Um detergente preferido é polissorbato 20 e uma combinação particularmente preferida é polissorbato 20 e TnBP. A fração contendo fibrinogênio pode ser agitada com os reagentes solvente e detergente em uma temperatura e por um tempo suficientes para inativar quaisquer vírus envelopados que possam estar presentes. Por exemplo, o tratamento com solvente e detergente pode ser conduzido por cerca de 1 hora a 25°C. O fibrinogênio recuperado da etapa de cromatografia pode ser então adicionalmente processado com o propósito de formulá-lo para uso farmacêutico. Por exemplo, pode ser concentrado por ultrafiltração para uma concentração de aproximadamente 15-30 mg/ml, e/ou submetido a uma outra etapa de redução de patógeno, por exemplo nanofiltração. O concentrado pode então ser formulado pela adição de uma combinação de estabilizadores adequados, por exemplo um aminoácido, um carboidrato, um sal, e um detergente. Particularmente preferivelmente, o produto é formulado sem a adição de quaisquer agentes antifibrinolíticos ou proteínas estabilizadoras tal como albumina. O produto formulado pode ser então esterilizado por filtração e liofilizado (seco por congelamento) para armazenagem de longa duração. Opcionalmente, o produto seco por congelamento pode ser submetido a um tratamento térmico seco em uma outra etapa de inativação de vírus. Por exemplo, pode ser aquecido para cerca de 80°C por cerca de 72 horas ou cerca de 100°C por cerca de 24 horas. A combinação de aminoácido, sal, carboidrato e detergente usada para formular o produto de fibrinogênio ajuda na estabilização dele por meio da etapa de secagem por congelamento e de tratamento térmico terminal. Também facilita a reconstituição do produto seco por congelamento. Em particular, os estabilizadores ajudam a estabilizar qualquer fator XIII presente no produto, que, como se sabe, é elevadamente lábil. O produto termicamente tratado e liofilizado pode ser reconstituído com água na temperatura ambiente em menos do que 15 minutos, preferivelmente menos do que 10 minutos e mais preferivelmente menos do que 5 minutos para proporcionar uma solução de fibrinogênio com uma concentração de pelo menos cerca de 60 mg/ml.

Uma característica vantajosa do processo da invenção é que plasminogênio é removido, evitando assim a necessidade de adição de agentes antifibrinolíticos na preparação de fibrinogênio final.

Como uma outra característica da invenção é portanto proporcionada uma preparação de fibrinogênio liofilizada, preferivelmente termicamente tratada compreendendo fibrinogênio preparado de acordo com um dos métodos da invenção, um carboidrato, um tampão, um sal, um aminoácido e um detergente, e opcionalmente fator XIII, a preparação sendo capaz de dissolução em água na temperatura ambiente em menos de 15 minutos, preferivelmente menos de 10 minutos e com maior preferência menos de 5 minutos para dar uma solução de fibrinogênio. Preferivelmente a concentração de fibrinogênio na solução final é de pelo menos cerca de 60 mg/ml.

Sem o desejo de se ligar a qualquer teoria, acredita-se que a combinação de o sal, o detergente, o aminoácido e o carboidrato facilita a rápida dissolução da preparação. O carboidrato também, como se acredita, ajuda a prevenir a presença qualquer atividade de fator XIII. O tampão controla o pH da formulação. O uso de uma combinação de um carboidrato, um tampão, um sal, um aminoácido e um detergente na preparação também estabiliza o fibrinogênio, e qualquer fator XIII presente, sem a necessidade da adição de quaisquer outros estabilizadores, por exemplo outras proteínas tal como albumina. Isto é vantajoso visto que a adição de outras proteínas pode ser uma fonte de contaminação viral ou de outra contaminação do produto. As preparações de fibrinogênio da invenção estão portanto livres de proteínas estabilizadoras, em particular de albumina. Preferivelmente, as preparações de fibrinogênio da invenção estão portanto livres de agentes antifibrinolíticos.

Aminoácidos adequados incluem arginina, carboidratos incluem sacarose, trealose e rafinose, preferivelmente sacarose, tampões adequados incluem sais de citrato (por exemplo citrato de sódio) e sais de fosfato (por exemplo fosfato de sódio), sais adequados incluem cloreto de sódio e detergentes adequados incluem polissorbato 20.

Preferivelmente, o detergente usado na formulação final é o mesmo detergente empregado para a etapa de inativação de vírus por solvente-detergente anterior, o formulante aminoácido é o mesmo usado para eluir o fibrinogênio da coluna de quelato de metal, e os componentes sal e tampão são iguais àqueles utilizados durante a purificação evitando-se desta maneira a necessidade de remoção de quantidades traço destes componentes do produto. Também é desejável minimizar a exposição do produto a uma multiplicidade de reagentes durante a manufatura, visto que cada reagente usado é uma fonte de possível contaminação ou modificação indesejada do produto. Assim é preferível que os formulantes de produto final sejam reagentes que já tenham sido usados durante o processamento.

Concentrações apropriadas de vários componentes dependerão das exatas natureza e fonte do fibrinogênio e poderão ser determinadas usando experimentos de tentativa e erro rotineiros. Faixas de concentração adequadas antes da secagem por congelamento incluem: carboidrato (preferivelmente sacarose): cerca de 0,5-2,5% p/p; detergente (preferivelmente polissorbato 20): cerca de 0,Ι- Ο,5% p/p; sal (preferivelmente cloreto de sódio): cerca de 50-250 mM, preferivelmente cerca de 50 mM; aminoácido (preferivelmente arginina): cerca de 50-120 mM, preferivelmente cerca de 110 mM.

Tampão suficiente é adicionado para controlar o pH conforme desejado, por exemplo em cerca de pH 7,5.

Formulações preferidas compreendem cerca de 0,5-2,5% p/p de sacarose, cerca de 0,1-0,5% p/p de polissorbato 20, cerca de 50-250 mM, com maior preferência cerca de 50 mM, de cloreto de sódio, e cerca de 50-120 mM de arginina em cerca de pH 7,5.

As preparações de fibrinogênio da invenção são preparadas pela formação de uma solução dos componentes e depois pela liofilização da solução. Após a liofilização, a preparação seca é preferivelmente submetida a uma etapa de tratamento térmico terminal com o objetivo de inativar os vírus envelopados ou não envelopados. Por exemplo, pode ser aquecida para cerca de 80°C por cerca de 72 horas, ou para cerca de 100°C por cerca de 24 horas. O tratamento térmico, como se sabe, é capaz de desnaturar proteínas, o que pode causar agregação e reduzir a solubilidade do produto termicamente tratado. Os outros ingredientes nas preparações da invenção ajudam a estabilizar o fibrinogênio, e qualquer fator XIII presente, durante a etapa de tratamento térmico.

Uma descrição mais detalhada das modalidades preferidas da invenção é agora dada: Recuperação de crioprecipitado do plasma Plasma humano congelado pode ser condicionado a cerca de -11°C, descongelado para entre -0,5°C e 2°C e o crioprecipitado resultante recuperado por centrifugação. O crioprecipitado pode ser lavado a < 4°C e recuperado por centrifugação. O crioprecipitado pode ser armazenado congelado.

Precipitação O crioprecipitado pode ser descongelado com tampão (isto é redissolvido) para recuperar as proteínas contidas nele. O fibrinogênio, a fibronectina e o fator XIII podem ser então precipitados usando um agente químico adequado, por exemplo heparina, polietilenoglicol (PEG) ou etanol, ou pelo ajuste da temperatura e do pH. O precipitado é então recuperado, por exemplo por centrifugação. Este precipitado pode ser armazenado congelado. Ressuspensão do precipitado A heparina ou outro precipitado pode ser então ressuspenso usando um tampão apropriado e misturado por um tempo adequado e em uma temperatura apropriada. A preparação resultante pode ser então clarificada, por exemplo por filtração profunda ou centrifugação, antes da filtração a 0,45 pm ou menor para remover quaisquer agregados que possam estar presentes e que podem proteger vírus dos reagente de inativação solvente-detergente. Tratamento com solvente e detergente O solvente e o detergente podem ser então adicionados no filtrado, e a mistura é agitada em uma temperatura adequada de modo a inativar os vírus envelopados. O solvente é preferivelmente fosfato de tri-n-butila (TnBP), enquanto que o detergente pode ser polissorbato 20, polissorbato 80 ou Triton X-100, preferivelmente polissorbato 20. Cromatografia O material tratado com solvente e detergente pode ser então aplicado diretamente a uma coluna de cromatografia de quelato de metal, onde o íon de metal pode ser cobre ou qualquer outro íon adequado. Condições de tampão e de carregamento são tais que os componentes solvente e detergente não são retidos pelo adsorvente enquanto que o fibrinogênio o é. Qualquer plasminogênio que está ligado pode ser então seletivamente eluído usando uma concentração baixa de um composto quelante de peso molecular baixo, por exemplo alanina. A fração de lavagem de eluato contendo o plasminogênio pode ser então adicionalmente processada para dar um concentrado de plasminogênio que pode ser clinicamente usado. O fibrinogênio pode ser então eluído com rendimento alto usando uma concentração maior de mesmo ou outro agente quelante, por exemplo arginina. Fator XIII é co-eluído com o fibrinogênio. O fibrinogênio está em geral presente no eluato em concentrações de cerca de 3-20 mg/ml. A eluição da coluna pode ser monitorada por qualquer método adequado, por exemplo por absorvância de UV em um comprimento de onda de 280 nanômetros. Isto dá uma medição da concentração de proteína no eluato e pode ser usado para assinalar mudanças de tampão e/ou coleta de fração.

Concentração Opcionalmente, o eluato de fibrinogênio pode ser concentrado usando ultrafiltração para dar concentrações finais de cerca de 15-30 mg/ml, preferivelmente cerca de 20-25 mg/ml.

Formulação O concentrado de fibrinogênio pode ser formulado pela adição de uma combinação de um aminoácido, um carboidrato, um tampão, um sal e um detergente. O produto formulado pode ser então esterilizado por filtração em 0,2 pm e envasado. Tal filtração pode remover ou reduzir vírus e outros patógenos, por exemplo o agente causador de Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (TSE), correntemente sendo, como se acredita, príons. O tampão da formulação (e as condições de secagem por congelamento) são preferivelmente escolhidos de tal maneira que o tampão de fibrinogênio possa ser reconstituído em água na temperatura ambiente em menos do que 10 minutos. Uma formulação preferida é arginina 110 mM, sacarose 1,5% p/p, polissorbato 20 0,1% p/p, NaCI 50 mM, citrato trissódico 10 mM.

Secagem por congelamento e tratamento térmico O produto é seco por congelamento e então opcionalmente termicamente tratado em temperaturas elevadas com o propósito de inativar vírus envelopados e não envelopados. A contaminação microbiana durante o processo é minimizada pela sanitização adequada do meio de IMAC e pela filtração dos tampões para remover a contaminação bacteriana (por exemplo pelo uso de filtros de 0,2 pm). O fibrinogênio preparado usando o processo da invenção pode ser usado clinicamente, quer sozinho quer em combinação com trombina em um kit de vedação de fibrina. A presente invenção portanto também proporciona fibrinogênio obtido de acordo com o processo da invenção, para uso em terapia, e kits farmacêuticos compreendendo fibrinogênio obtido de acordo com o processo da invenção em combinação com trombina. Preferidos são os kits compreendendo fibrinogênio preparado de acordo com o processo da invenção e trombina preparada de acordo com o pedido PCT copendente do requerente de número (desconhecido) intitulado de "Process for the preparation of thrombin" depositado aos 7 de julho de 2003 reivindicando prioridade do pedido de patente UK de número 0216002.6 depositado aos 10 de julho de 2002, cuja descrição é por meio desta aqui incorporada como referência. A invenção será agora adicionalmente ilustrada com referência aos seguintes exemplos não limitantes. O fibrinogênio foi medido usando os seguintes métodos: Ensaio de Precipitação Térmica baseado no método publicado por Desvignes, Ρ. & Bonnet, Ρ., "Direct Determination of Plasma Fibrinogen leveis by Heat Precipitation. A comparison of the Technique against Thrombin Clottable Fibrinogen with Spectrophotometry and Radial Immune Diffusion", Clinica Chimica Acta, 110 (1981), 9-17. Ensaio do tempo de coagulação baseado no método de Clauss (Clauss, A., "Gerinnungsphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des Fibrinogens". Acta Haematol 1957; 17:234-46). Ensaio de Coagulável Total baseado no método de Blomback & Blomback, Arkivfur Chemi., 1956, capítulo 10, 415-443. Fator XIII foi medido por determinação fotométrica (plasma humano normal - padrão). O método baseou-se nas seguintes referências: Fickenscher, K., Aab, A., Stuber, W., "A Photometric Assay for Blood Coagulation Factor XIII", Thromb. Haemostas. 65 (1991), 535-540 e Solleder, E., Demuth, D., Pfeiffer, C., Bombard, M., Mayer, J., Eller, T., Brauer, P., Keller, F., Grun, J., Fickenscher, K., Wagner, C., "Klinische Prufung eines neuen photometrischen Tests zur Bestimmung der Factor XIII Aktivitat im Plasma", Lab Med. 16 (1992), 48-53.

Plasminogênio e fator XIIII foram medidos por ELISA. Exemplo 1: recuperação de crioprecipitado do plasma O plasma foi armazenado abaixo de -30°C até o uso. O peso requerido de plasma foi então condicionado a -11°C antes da remoção da embalagem. A poça de plasma foi então descongelada a < 2,5°C com o propósito de recuperar o crioprecipitado de fibrinogênio, fator XIII, fator de von Willebrand (vWF) e fibrinectina do plasma. Este precipitado foi recuperado por centrifugação e armazenado congelado.

Exemplo 2: precipitação O crioprecipitado preparado de acordo com o Exemplo 1 foi ressuspenso em Tris/HCl 20 mM de pH 6,7 para uma razão de 0,024x o peso líquido de poça de plasma e descongelado por aquecimento para entre 20°C e 40°C por > 20 minutos. O pH foi então ajustado para 6,55 com HC1 0,1 M. Uma solução de heparina de estoque foi então adicionada para dar uma concentração final de 0,88 mg/ml e a mistura resultante foi agitada por > 2 minutos. Isto resultou na precipitação de fibrinogênio e de fibrinectina deixando o fator XIII e vWF em solução. O precipitado de heparina foi então recuperado por centrifugação. Este precipitado pode ser armazenado congelado.

Exemplo 3: ressuspensão do precipitado O precipitado de heparina preparado de acordo com o Exemplo 2 foi ressuspenso em NaH2PO4/Na2HPO4 20 mM, citrato trissódico 10 mM, NaCl 0,5 M de pH 6,0 em uma razão de 1 parte de precipitado para 5 partes de tampão. Esta suspensão foi então aquecida para 40°C e incubada com misturação por > 1 hora. O precipitado de heparina resultante foi então clarificado por filtração através de filtros profundos (Cuno 05SP e Cuno 30LA) e um filtro de membrana (Sartobran 0,65/0,45 pm) para garantir a remoção de agregados que possam proteger os vírus do subseqüente tratamento com solvente e detergente.

Exemplo 4: tratamento com solvente e detergente Uma solução de estoque de detergente e solvente de 20% v/v de polissorbato 20 e 6% v/v de TnBP foi então adicionada no filtrado para dar uma concentração final de 1% v/v de polissorbato 20% v/v e 0,3% v/v de TnBP. A mistura resultante foi então agitada por não menos de 1 hora na temperatura ambiente.

Exemplo 5: cromatografia O precipitado de heparina tratado com solvente e detergente preparado de acordo com o Exemplo 4 foi carregado para cima de uma coluna Toyopearl AF chelate 650 (M) carregada de cobre que havia sido pré-equilibrada com não menos de 5 volumes de leito de tampão 1: (EW1: NaH2PO4/Na2HPO4 20 mM, citrato trissódidolO mM, NaCl 0,5 M de pH 6,0). A coluna foi então carregada com 3 volumes de leito de precipitado de heparina tratado. A velocidade de carregamento foi não maior do que 77 cm/h. O leito foi então lavado com 18 volumes de leito de tampão 1. O plasminogênio ligado foi removido por lavagem usando 15 volumes de leito de tampão 2 (EW2: Na2HPO4 20 mM, alanina 15 mM, NaCI 0,5 M de pH 7,5). O plasminogênio eluído pode ser adicionalmente processado para dar um concentrado que pode ser usado clinicamente. As condições de tampão foram então ajustadas usando 5 volumes de leito de tampão 3 (EW3: citrato trissódico 10 mM, NaCI 50 mM de pH 7,0). O fibrinogênio ligado foi então eluído utilizando volumes de leito suficientes de tampão 4 (EW4: arginina 50 mM, citrato trissódico 10 mM, NaCI 50 mM pH 7,5) de tal modo que a A280nm (absorbância de UV em um comprimento de onda de 280 nm) retomasse para a linha base. Os íons de cobre foram então extraídos da resina usando 5 volumes de leito de Na2HPO4 20 mM, NaCI 0,25 M, EDTA 50 mM de pH 7,0.

Exemplo 6: concentração O fibrinogênio eluído preparado de acordo com o Exemplo 5 foi concentrado usando uma membrana de corte de peso molecular de 100 kDa (Sartocon Sartorius). A membrana foi pré-lavada usando arginina 50 mM, citrato trissódico 10 mM, NaCI 50 mM de pH 7,5. A concentração alvo de fibrinogênio foi de 22 mg/ml.

Exemplo 7: formulação A solução de fibrinogênio concentrada preparada cerca de o Exemplo 6 foi formulada pela adição de arginina 710 mM, sacarose 16,5% p/p, polissorbato 20 1,1% p/p, NaCI 50 mM, citrato trissódico 10 mM de pH 7,5 em uma razão de 1:10. As concentrações de formulação final foram arginina 110 mM, sacarose 1,5% p/p, polissorbato 20 0,1% p/p, NaCI 50 mM, citrato trissódico 10 mM. O produto formulado foi então filtrado em 0,2 pm (Sartobran 0,45/0,2 pm, Sartorius).

Exemplo 8: secagem por congelamento e tratamento térmico O produto do Exemplo 7 foi assepticamente envasado em frascos de vidro a 15 ml por frasco e então seco por congelamento, tampado e selado. Os frascos foram tratados termicamente a 80°C por não menos de 72 horas com o propósito de inativar vírus envelopados e não envelopados. Exemplo 9: cromatografia em escala piloto de concentrado de fibrinogênio 1.274 g de precipitado de heparina (preparado de acordo com o Exemplo 2) foram ressuspensos em um volume de 5 vezes de NaH2PO4/Na2HPO4 20 mM, citrato trissódico 10 mM, NaCl 0,5 M de pH 6,0 a 40°C em um banho de água com agitação constante por mais do que 1 hora. A solução resultante foi filtrada em 0,45 pm com o trem de filtros Cuno 05SP, Cuno 30LA e Sartobran P 0,65/0,45 pm. A mistura de solvente-detergente foi então adicionada para dar concentrações finais de 0,1% v/v de polissorbato 20 e 0,3% v/v de TnBP. A mistura foi então agitada na temperatura ambiente por 1 hora. 6.391 g de precipitado de heparina tratado com solvente e detergente foram carregados para cima de 2.123 ml de resina Toyopearl AF Chelate 650(M) contidos dentro de uma coluna Amicon Vantage 130 para dar uma altura sedimentada de 16 cm. A coluna de cromatografia foi sanitizada usando 5 volumes de leito de 0,5 M de NaOH e equilibrada com aproximadamente 5 volumes de leito de tampão 1: (EW1: NaH2PO4/Na2HPO4 20 mM, citrato trissódico 10 mM, NaCl 0,5 M de pH 6,0). Esta foi lavada com aproximadamente 5 volumes de leito de água destilada. A resina foi então carregada com íons de metal usando aproximadamente 5 volumes de leito de uma solução de sulfato de cobre a 3 mg/ml. Os íons de metal fracamente ligados foram removidos usando aproximadamente 5 volumes de leito de arginina 50 mM, citrato trissódico 10 mM, NaCl 50 mM de pH 7,5 e então aproximadamente 10 volumes de leito de tampão 1. A carga foi então aplicada, e o leito foi então lavado com aproximadamente 18 volumes de leito de tampão 1. O plasminogênio ligado foi removido por lavagem usando aproximadamente 16 volumes de leito de tampão 2 (Na2HPO4 20 mM, alanina 15 mM, NaCI 0,5 M de pH 7,5). As condições de tampão foram então ajustadas usando aproximadamente 5 volumes de leito de tampão 3 (EW3: citrato trissódico 10 mM, NaCI 50 mM de pH 7,0). O fibrinogênio ligado foi então eluído usando aproximadamente 5 volumes de leito de tampão 4 (EW4: arginina 50 mM, citrato trissódico 10 mM, NaCI 50 mM de pH 7,5). Os íons de cobre foram então extraídos da resina usando aproximadamente 5 volumes de leito de Na2HPO4 20 mM, NaCI 0,25 M, EDTA 50 mM de pH 7,0.

As concentrações e os dados de recuperação para fibrinogênio, plasminogênio e Fator XIII são dados na Tabela 1. A eliminação de TnBP e a eliminação de polissorbato 20 são dadas na Tabela 2.

Tabela 1 Abreviações usadas: FT = fluxo; EW1 = lavagem 1 de equilíbrio; EW2 = lavagem 2 de equilíbrio; EW3 = lavagem 3 de equilíbrio; EP1 = pico de eluição 1 (borda anterior de pico de eluição); EP2 = pico de eluição 2 (pico de eluição principal); EP3 - pico de eluição 3 (borda posterior de pico de eluição).

Tabela 2 Abreviações usadas: EP2 = pico de eluição 2 (pico de eluição principal).

Os resultados mostraram que as três proteínas, fibrinogênio, plasminogênio e fator XIII, foram eficientemente capturadas sobre Toyopearl carregada de Cu2+ e então 93% do plasminogênio carregado foi seletivamente removido por lavagem com o tampão de alanina 15 mM (EW2). O produto de fibrinogênio eluído continha 76% e 56% de fibrinogênio e fator XIII aplicados respectivamente. A eliminação de agentes químicos solvente e detergente também foi eficiente: apenas 0,3% e 0,4% de TnBP e de polissorbato 20 aplicados respectivamente, foram deixados no produto após a cromatografia.

Exemplo 10: ultrafiltração em escala piloto de fibrinogênio 2 Dois cassetes de porção Sartorius de polissulfona (0,1 m cada) foram montados em um segurador de membrana Sartorius e submetidos ao fluxo de 7 L de água deionizada. A montagem foi sanitizada com fluxo de 1 L de NaOH 1 M aquecido para 40°C e então com 5 L de NaOH, recirculado por 1 hora. O sistema foi então submetido ao fluxo com 10 L de água deionizada em uma velocidade de fluxo transversal de 880 ml/min. A membrana foi preparada com 5 L de EW4 (arginina 50 mM, citrato trissódico 10 mM, NaCl 50 mM de pH 7,5) sem aplicação de contra-pressão na mesma velocidade de fluxo transversal. 8.960 ml de fração de fibrinogênio eluída foram aplicados em uma concentração de fibrinogênio inicial de 5,24 mg/ml em uma pressão de entrada máxima e pressão de transmembrana de 140.000 Pa e 70.000 Pa respectivamente. A ultrafiltração demorou 1 hora e 36 minutos e deu um retentato de 1.227 ml e 23,8 mg/ml de fibrinogênio. O fluxo médio foi 28,8 L/m /h e concentrações de gelificação preditas foram 31,0 mg/ml.

Exemplo 11: escolha de géis de IMAC para a purificação de fibrinogênio Vários géis de cromatografia com quelato de metal foram testados para sua capacidade de ligar e subseqüentemente liberar fibrinogênio. Estes são descritos na Tabela 3 abaixo: Tabela 3: O material inicial foi crioprecipitado que continha fibrinogênio. Este precipitado foi redissolvido em Tampão I (tampão de fosfato de sódio 20 mM contendo quer cloreto de sódio 250 mM quer cloreto de sódio 500 mM, pH 7). O gel quelante foi carregado com íons de metal (cobre, níquel ou zinco) então equilibrado com Tampão I. O crioprecipitado redissolvido foi aplicado em uma coluna recheada contendo o gel equilibrado, carregado. Após todo o material ter sido aplicado, a coluna foi lavada com Tampão I. O fibrinogênio foi eluído por lavagem da coluna com Tampão II (fosfato de sódio 20 mM, tampão de EDTA 0,05 M contendo quer cloreto de sódio 250 mM quer cloreto de sódio 500 mM, pH 7) ou Tampão III (fosfato de sódio 20 mM, arginina 50 mM, cloreto de sódio 250 mM, pH 7,5) ou Tampão IV (fosfato de sódio 20 mM, arginina 200 mM, cloreto de sódio 250 mM de pH 7,0).

Os resultados são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4 aEluído com Tampão II. b Eluído com Tampão III. c Eluído com Tampão IV.

Os resultados mostram que o fibrinogênio e o fator XIII podem ser isolados de uma solução contendo fibrinogênio usando cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado (IMAC) com uma variedade de íons de metal e químicas de matriz base de IMAC.

Exemplo 12: escolha de materiais iniciais A capacidade da cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado (IMAC) de purificar fibrinogênio de diferentes soluções contendo fibrinogênio foi investigada.

Soluções contendo fibrinogênio: A. Crioprecipitado redissolvido obtido de plasma humano descongelado (preparado de acordo com o Exemplo 1). B. Precipitado de heparina redissolvido obtido do crioprecipitado redissolvido que havia sido misturado com heparina (preparado de acordo com o Exemplo 2). C. Precipitado frio redissolvido obtido pelo resfriamento do crioprecipitado redissolvido. D. Solução contendo fibrinogênio cromatograficamente empobrecida em fator XIII, fator de von Willebrand (vWF) e fibronectina, obtida de plasma humano. O precipitado frio usado em C foi preparado como segue: crioprecipitado, preparado como no Exemplo 1, foi redissolvido em quatro vezes seu peso de solução de cloreto de cálcio 50 μΜ a 28°C. O pH foi ajustado para 6,8 com ácido acético 1 M e a solução foi resfriada para 10°C.

Após misturação por >10 minutos, o precipitado formado foi coletado por centrifugação.

Cada solução A-D, contendo aproximadamente 1-20 mg de fibrinogênio por ml, foi incubada com solvente e detergente para inativar vírus, depois aplicada em uma coluna de resina Toyopearl Chelate IMAC que havia sido carregada com íons de cobre e equilibrada com fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 250 mM pH 7,0. Após carregamento, a resina foi lavada com o mesmo tampão. Fibrinogênio foi eluído pela aplicação de imidazol 25 mM (Tampão X) ou arginina 50 mM, fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 250 mM, pH 7,5 (Tampão Y).

Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 Os resultados mostram que IMAC pode ser usada para preparar fibrinogênio de diferentes materiais iniciais contendo fibrinogênio. Exemplo 13: formulação de fibrinogênio para permitir a rápida redissolução após a secagem por congelamento e o tratamento térmico Fibrinogênio que havia sido eluído da resina de IMAC de acordo com os Exemplos 9 e 10 e concentrado para aproximadamente 15 mg/ml em arginina 50 mM, fosfato 20 mM, pH 7,5 (Tabelas 6 e 8) ou arginina 50 mM, citrato trissódico 10 mM pH 7,5 (Tabela 7) foi formulado com vários compostos adicionados, envasado em fiascos de vidro (20 ml por frasco) e seco por congelamento. Com a completitude da secagem por congelamento, os frascos foram selados sob vácuo, então tratados termicamente a 80°C por 72 horas para inativar os vírus. Os frascos foram então reconstituídos com água (5 ml por frasco) na temperatura ambiente (18°C-25°C). O tempo de redissolução foi medido, como o tempo entre a adição de água e o tempo no qual uma solução homogênea límpida sem matéria sólida residual foi observada.

Os resultados são mostrados nas Tabelas 6, 7 e 8.

Tabela 6 Tabela 7 Tabela 8 Abreviações usadas nas Tabelas 6-8 Arg = arginina Poli. = polissorbato 20 Cit. = citrato Sac. = sacarose Fib. = fibrinogênio Recons. = reconstituição Carb. = carboidrato Fosf. = fosfato.

Os resultados mostraram que as faixas de concentração efetivas de formulantes foram: Sacarose: 0,5-2,5% Polissorbato 20: 0,1-0,5% Cloreto de sódio: 50-250 mM (50 mM para retenção de fator XIII) Arginina: 50-120 mM

Concentrações altas de cloreto de sódio (250 mM) em combinação com arginina, polissorbato 20 e um sal tampão permitiram a reconstituição rápida do fibrinogênio seco por congelamento, termicamente tratado mas a atividade de fator XIII foi perdida. Redução no conteúdo de cloreto de sódio acompanhada pela adição de sacarose permitiu tanto a reconstituição rápida quanto a retenção da atividade de fator XIII.

Combinações seletivas de arginina, polissorbato 20, cloreto de sódio, um sal tampão adequado e um carboidrato proporcionaram uma formulação para fibrinogênio e fator XIII que permitiu a reconstituição rápida de produto seco por congelamento, termicamente tratado na temperatura ambiente, com retenção da atividade de fator XIII e fibrinogênio.

Exemplo 14: ultrafiltração, formulação, secagem por congelamento e tratamento térmico Em quatro experimentos independentes (A-D), um precipitado de heparina foi ressuspenso de acordo com o Exemplo 3 e tratado com solvente e detergente de acordo com o Exemplo 4. A solução resultante foi separada por cromatografia de acordo com o Exemplo 9 para dar um eluato rico em fibrinogênio e fator XIII. Este eluato foi então concentrado de acordo com o Exemplo 10. O concentrado foi formulado para um alvo de arginina 110 mM, sacarose 1,5% p/p, polissorbato 20 0,1% p/p, NaCI 50 mM, citrato trissódico 10 mM e esterilmente filtrado em 0,2 pm de acordo com o Exemplo 7. O concentrado filtrado foi então assepticamente envasado, seco por congelamento e termicamente tratado de acordo com o Exemplo 8 para dar um produto inativado viral duplo.

Os eluatos, concentrados filtrados e produtos foram ensaiados para atividade de fator XIII e proteína coagulável, e os resultados são mostrados na Tabela 9.

Tabela 9 Os resultados mostram que o fibrinogênio pode ser concentrado para aproximadamente 20 mg/ml usando ultrafiltração. Também mostram que as condições de formulação deram um produto com uma concentração de fator XIII de > 1 U/ml de tempos de reconstituição «15 min.

Exemplo 15:0 efeito da concentração de tampão de eluição e do pH sobre a eluição de fibrinogênio e cobre de uma resina de quelato O crioprecipitado foi redissolvido em tampão 1 (tampão fosfato 20 mM contendo NaCl 0,25 M pH 6,0) e tratado com solvente e detergente como no Exemplo 4. A resina de quelato (Toyopearl AF Chelate 650 (M)) foi carregada com íons de cobre, pré-lavada com o tampão de eluição apropriado e então equilibrada com tampão 1. Este material foi carregado para cima de resina carregada de cobre, compactada. Após a aplicação de todo o material, a coluna foi lavada com quinze a vinte volumes de tampão 1. A coluna foi então lavada com cinco a sete volumes de leito de tampão 2 (tampão de fosfato 20 mM contendo NaCl 0,25 M pH 7,0). A coluna foi eluída com um tampão contendo fosfato 20 mM, NaCl 0,25 M e arginina em uma faixa de concentração e pH.

Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10 Os resultados mostraram que uma redução na concentração de arginina no tampão de eluição reduziu a concentração de cobre no eluato de fibrinogênio mas teve um efeito adverso sobre a recuperação de fibrinogênio. Um aumento no pH do tampão de eluição de arginina 50 mM para 7,5 resultou em recuperação alta de fibrinogênio mas os níveis de cobre co-eluído foram substancialmente reduzidos.

Exemplo 16: tratamento de precipitado de heparina Precipitado de heparina congelado foi redissolvido em fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, citrato trissódico 10 mM pH 6,0 em uma razão de 1:5 em peso. Foram comparados dois métodos de redissolução: Método 1: o precipitado de heparina foi adicionado no tampão na temperatura ambiente. A mistura foi então aquecida para 40°C e incubada a 40°C por 1 hora. Método 2: o tampão foi pré-aquecido para 40°C e o precipitado de heparina foi então adicionado em uma velocidade que manteve uma temperatura de > 36°C. Após a adição de todo o precipitado, a mistura foi então incubada por 1 hora a 40°C.

Três bateladas diferentes de precipitado foram testadas. Em cada caso, o Método 2 de redissolução resultou em uma capacidade de filtração significativamente maior. O peso de filtrado final e a concentração de fibrinogênio também foram consistentemente maiores resultando em rendimentos de fibrinogênio melhorados (veja a Tabela 11).

Tabela 11 Notas: 1 Área de filtro de escala de bancada = 0,00173 m2; área de filtro de escala piloto = 0,3 m2. A pressão de ar aplicada inicial foi de 25.000 Pa na escala de bancada e de 10.000 Pa a 20.000 Pa na escala piloto. 2 Capacidade de filtração é calculada como a quantidade máxima de material redissolubilizado filtrada dividida pela área do filtro. Exemplos mostrando capacidades "maiores do que" não bloqueiam o filtro sob as condições experimentais. 3 O rendimento de fibrinogênio é calculado neste caso como o mg de fibrinogênio recuperado do filtro (= concentração recuperada mg ml'1 x ml filtrado coletado) dividido pelo mg de fibrinogênio que estava neste volume de material inicial (= concentração aplicada mg ml'1 x ml de filtrado coletado) x 100 (%).

REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Método para a separação de fibrinogênio de plasminogênio, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) carregar uma solução compreendendo fibrinogênio e plasminogênio para cima de uma matriz de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado sob condições tais que pelo menos o fibrinogênio se liga na matriz, e (b) seletivamente eluir o fibrinogênio da matriz.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o plasminogênio e o fibrinogênio são seletivamente eluídos separadamente da matriz.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa (a), as condições são tais que tanto o fibrinogênio quanto o plasminogênio se ligam na matriz, e, na etapa (b), o fibrinogênio e o plasminogênio são seletivamente eluídos separadamente da matriz.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a solução compreendendo fibrinogênio é uma fração de plasma contendo fibrinogênio.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a solução compreendendo fibrinogênio compreende adicionalmente fator XIII, e o fator XIII é co-eluído com o fibrinogênio da matriz.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de concentrar o fibrinogênio por ultrafiltração a uma concentração de 15 a 30 mg/mL.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreende adicionalmente as etapas de: combinar o fibrinogênio com uma combinação de estabilizadores adequados para formar uma formulação de fibrinogênio; esterilizar o fibrinogênio por filtração; e liofilizar a formulação de fibrinogênio para formar uma formulação de fibrinogênio liofilizada.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os estabilizadores incluem um aminoácido, um carboidrato, um sal e um detergente.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de submeter a formulação de fibrinogênio liofilizada a tratamento térmico a seco.

10. Uso de cromatografia de afinidade com íon de metal imobilizado, caracterizado pelo fato de ser para a separação de fibrinogênio de plasminogênio, para a preparação de fibrinogênio e plasminogênio, ou para a co-purificação de fibrinogênio e fator XIII.